!HU000008119T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 119
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0329684 2003. 12. 22. 0329711 2003. 12. 22.
(73) Jogosult: GLAXO GROUP LIMITED, Greenford, Middlesex UB6 0NN (GB)
GB GB
(72) Feltalálók: Ellis, Jonathan Henry, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY (GB); Eon-Duval, Alexandre, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY (GB); Grundy, Robert Ian, GlaxoSmithKline, Harlow, Essex CM19 5AW (GB); Hussain, Farhana, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY (GB); McAdam, Ruth, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY (GB); Plumpton, Christopher, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY (GB); Prinjha, Rabinder Kumar, GlaxoSmithKline, Harlow, Essex CM19 5AW (GB); Wilson, Paul Alexander, Stevenage, Hertfordshire SG1 2NY (GB) (54)
HU 008 119 T2
C07K 16/22
(21) Magyar ügyszám: E 04 806128 (22) A bejelentés napja: 2004. 12. 20. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040806128 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1711530 A1 2005. 07. 07. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1711530 B1 2009. 08. 26.
(2006.01) A61P 25/00 (2006.01) A61P 25/28 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05061544 PCT/GB 04/005325
(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
NogoA neutralizáló immunglobulinok neurológiai betegségek kezelésére
A leírás terjedelme 82 oldal (ezen belül 45 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 008 119 T2
Ismertetés A találmány alkalmazási területe A találmány tárgyát képezik immunglobulinok, közelebbrõl olyan ellenanyagok, amelyek NogoA-hoz kötõdnek és annak aktivitását neutralizálják, ilyen ellenanyagokat kódoló polinukleotidok, ilyen ellenanyagokat tartalmazó gyógyhatású készítmények, valamint ilyen ellenanyagok alkalmazása neurológiai betegségek kezelésére és/vagy megelõzésére. A találmány további szempontjait, célkitûzéseit és elõnyeit az alábbi ismertetés illusztrálja. A találmány háttere A nyugati világban a stroke a halálozások és rokkantság fõ okozója. Stroke kezelésére nincs más jóváhagyott terápia, mint szöveti plazminogén („tissue plasminogen”, t¹PA) beadása, amelyet vérzés kizárása céljából végzett számítógépes tomográfiát („computer tomography”, CT) követõen, a stroke kialakulását követõ 3 órán belül kell beadni. Napjainkig az akut stroke kezelését (azaz neuroprotekciót) célzó terápiás ágensek többsége elsõsorban glutamátreceptorokat és azok lefelé irányuló szignálozó anyagcsereútjait célozzák meg, amelyekrõl ismert, hogy szerepet játszanak az akut sejthalálban. Ezek a stratégiák azonban klinikai kipróbálások során sikertelennek bizonyultak, és gyakran asszociálódtak dózist korlátozó mellékhatásokkal [Hill és Hachinski: The Lancet 352, (suppl III) 10–14 (1998)]. Ennek megfelelõen, igény mutatkozik véráramlás leállását követõ sejthalál javítását célzó, új megközelítésekre. A neuroprotekció egy adott kezelés azon tulajdonsága, hogy megelõzi vagy javítja az inzultusra vagy kórfolyamatra adott válaszként jelentkezõ idegsejtvesztést. Ez elérhetõ a neuronok közvetlen vagy közvetett megcélzásával, gliasejtvesztés (beleértve oligodendrocitavesztést) megakadályozása révén. Stroke fellépését követõen, számos betegben bizonyos fokú spontán funkcionális javulás figyelhetõ meg, ami arra utal, hogy károsodást követõen az agynak van (bár korlátozott mértékû) képessége javításra és/vagy újramodellezésre. Ennek megfelelõen, az olyan ágensek, amelyek képesek elõsegíteni ezt a javulást, lehetõvé teszik a beavatkozást hosszú idõvel (esetleg napokkal) a cerebralis ischaemia kialakulását követõen. Az olyan ágensek, amelyek egyidejûleg akut neuroprotekciót nyújtanak és elõsegítik a funkcionális javulást, jelentõs elõnyt biztosítanak a jelenlegi potenciális neuroprotektív stratégiákkal szemben. Az Alzheimer-kórt („Alzheimer’s disease”, AD) két, diagnosztikai értékû patológiai tulajdonság jelenléte jellemzi. Ezek az aggregált béta-amiloid-peptidbõl (Ab40 és Ab42) álló amiloid plakkok és erõsen foszforilezett tau-ból álló neurofibrilláris kötegek [Dawbarn és Allen: „Neurobiology of Alzheimer’s Disease” OUP (2001)]. Egy átfogó vizsgálat betegekben szoros összefüggést mutatott ki béta-amiloid-akkumuláció és kognitív hanyatlás között [Naslund és munkatársai: JAMA, 283(12), 1571–1577 (2000 március 22/29)]. Ez egyet-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
értésben van azon genetikai és epidelógiai vizsgálatokkal, amelyek arra utalnak, hogy az APP- és preszenilingének bizonyos mutációi prediszponálhatják az AD korai kialakulását, és amely mutációk fokozzák továbbá az Ab40 és Ab42 peptidek szintjeit, beleértve azok arányát. A béta-amiloid-peptid képzõdéséhez az I. típusú transzmembrán amiloid proteinnek („amyloid precursor protein”, APP) béta- és gamma-szekretáznak nevezett két különbözõ proteáz által történõ hasítása szükséges. Megerõsítést nyert, hogy a béta-szekretáz molekulárisan azonos az Asp2/BACE1 aszpartil-proteázzal [Hussain és munkatársai: Mol Cell NeuroSci 16, 609–619 (2000); Vassar és munkatársai: Science 286(5440), 735–741 (1999 okt. 22)]. A gamma-szekretáz természete még némi vita tárgyát képezi, és valószínûleg nagy molekulatömegû komplex, amely legalább az alábbi proteineket tartalmazza: preszenilineket, Aph1, Pen2 és nikasztrin proteineket [lásd összefoglalva Medina és Dotti: Cell Signaling 15(9), 829–41 (2003)]. Az APP központi idegrendszeren („central nervous system”, CNS) belüli feldolgozása valószínûleg számos sejttípusban történik, beleértve neuronokat, oligodendrocitákat, asztrocitákat és mikrogliát. Az APP feldolgozásának általános sebességét ezekben a sejtekben az APP, BACE1/Asp2, preszenilin¹1 és –2, Aph1, Pen2 és nikasztrin expresszálódásának a relatív szintje befolyásolja. Ezen túlmenõen, az APP szubcelluláris lokációját szabályozó további tényezõk szintén befolyásolják az APP feldolgozását, amint azt az a megfigyelés mutatja, hogy az APP citoplazmadoménban a YENP-motívum mutációja, amely blokkolja az APP endocitózisát, csökkenti a béta-amiloid termelõdését [Perez és munkatársai: J Biol Chem 274(27), 18851–6 (1999)]. Az APPbéta-CTF retenciója az endoplazmatikus retikulumban KKQN retenciós motívum hozzáadásával elegendõ ahhoz, hogy transzfektált sejtekben csökkentse az amiloid termelõdését [Maltese és munkatársai: J Biol Chem 276(23), 20 267–20 279 (2001)]. Ezzel szemben, az endocitózis fokozása Rab5 erõs expresszáltatásával elegendõ ahhoz, hogy az amiloid szekréciója fokozódjon a transzfektált sejtekbõl [Grbovic és munkatársai: J Biol Chem 278(33), 31 261–31 268 (2003)]. Ezen megfigyelésekkel egyetértésben, további vizsgálatok kimutatták, hogy a celluláris koleszterinszint (amely közismert AD rizikófaktor) csökkenése mérsékelte a béta-amiloid képzõdését. Ez a változás módosult endocitózistól függött, amint azt domináns negatív dinamin mutánsok (K44A) alkalmazásával és Rab5 GTPázt aktiváló RN¹Tre protein erõs expresszáltatásával kimutatták [Ehehalt és munkatársai: J Cell Biol 160(1), 113–123 (2003)]. Koleszterinben gazdag mikrodomének, vagy „raftok” szintén fontos celluláris helyei a béta-amiloid termelõdésének és APP-ról, BACE1-rõl és a gammaszekretáz komplex összetevõirõl mind kimutatták, hogy átmenetileg elõfordulnak a raftokon belül. APP és BACE1 ellenanyaggal történõ keresztkapcsolása kolesz-
1
HU 008 119 T2
terinben gazdag raftok irányába, képes volt fokozni a béta-amiloid termelõdését [Ehehalt és munkatársai: J Cell Biol 160(1), 113–123 (2003)]. GPI-hez horgonyzott BACE1 expresszálódása, amely kizárólag a lipid raftokat célozza meg, hasonlóképpen képes fokozni APP hasítását és béta-amiloid termelõdését [Cordy és munkatársai: PNAS 100(20), 11 735–11 740 (2003)]. A funkcionális javulás mögött álló mechanizmusok jelenleg nem ismertek. A károsodott vagy nem károsodott axonok sarjadzását javasolták ilyen lehetséges mechanizmusként. Azonban, bár in vivo vizsgálatok kimutatták, hogy gerincvelõ-károsodás vagy stroke kezelése neurotrop faktorokkal bizonyos mértékû axonsarjadzást és fokozott funkcionális javulást eredményezett, ezek nem bizonyítottak közvetlen összefüggést az axonsarjadzás mértéke és a funkcionális javulás mértéke között [Jakeman és munkatársai: Exp Neurol 154, 170–184 (1998); Kawamata és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8179–8184 (1997); Ribotta és munkatársai: J. Neurosci. 20, 5144–5152 (2000)]. Ezen túlmenõen, axonsarjadzáshoz élõ neuron szükséges. Olyan betegségekben, mint a stroke, amelyek kiterjedt sejtpusztulással járnak, adott ágens által nyújtott, fokozott funkcionális javulás tehát axonsarjadzáson kívül más mechanizmusokon keresztül valósulhat meg, például endogén õssejtek differenciálódásában, redundáns anyagcsereutak aktiválódásában, receptorok eloszlásában történõ változásokban vagy neuronok vagy glia ingerelhetõségében [Fawcett és Asher: Brain Res Bulletin 49, 377–391 (1999); Horner és Gage: Nature 407, 963–970 (2000)]. Feltételezik, hogy a központi idegrendszer („central nervous system”, CNS) korlátozott képessége károsodást követõ javításra részben a CNS környezetén belüli, olyan molekuláknak tulajdonítható, amelyek gátlóhatást fejtenek ki axonsarjadzásra (neuritkinövésre). Úgy gondolják, hogy a CNS mielinje gátlómolekulákat tartalmaz [Schwab M. E. és Caroni P.: J. Neurosci. 8, 2381–2193 (1988)]. Két mielinproteint klónoztak és azonosítottak, mint a neuritkinövés feltételezett gátlóit: a mielinasszociált glikoproteint („myelin-associated glycoprotein”, MAG) és a NOGO mielinproteint [Sato S. és munkatársai: Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473–1480 (1989); McKerracher L. és munkatársai: Neuron. 13, 805–811 (1994); Mukhopadhyay G. és munkatársai: Neuron 13, 757–767 (1994); Torigoe K. és Lundborg G.: Exp. Neurology 150, 254–262 (1997); Schafer és munkatársai: Neuron 16, 1107–1113 (1996); WO9522344; WO9701352; Prinjha R. és munkatársai: Nature 403, 383–384 (2000); Chen M. S. és munkatársai: Nature 403, 434–439 (2000); GrandPre T. és munkatársai: Nature 403, 439–444 (2000); US005250414A számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO200005364A1 és WO0031235 számú nemzetközi közzétételi iratok]. A humáneredetû Nogo három formáját azonosították: NogoA¹t, amely 1192 aminosavcsoportból áll (GenBank nyilvántartási száma: AJ251383); NogoB¹t, egy hasítási variánst, amelybõl hiányzanak a 186–1004 csoportok a feltételezett extracelluláris do-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
ménból (GenBank nyilvántartási száma: AJ251384) és egy rövidebb hasítási variánst, NogoC¹t, amelybõl szintén hiányzanak a 186–1004 csoportok, továbbá kisebb, alternatív aminoterminális domént hordoz (GenBank nyilvántartási száma: AJ251385) [Prinjha és munkatársai. (2000), lásd fentebb]. Olyan, CNS-eredetû gátlóproteinek gátlása, mint például a Nogo, terápiás eszközt biztosíthatnak idegsejt-károsodás javítására és elõsegíthetik az idegsejtek kijavítását és szaporodását, ezáltal segítve a felépülést olyan idegsejt-károsodásból, mint amilyen stroke esetében fennáll. Ilyen Nogo gátlókra példák lehetnek kis molekulák, peptidek és ellenanyagok. Az ellenanyagok jellemzõen két, diszulfidkötésekkel összekapcsolt nehéz láncot, valamint két könnyû láncot tartalmaznak. Az egyes könnyû láncok diszulfidkötésekkel kapcsolódnak a megfelelõ nehéz lánchoz. Mindegyik nehéz lánc az egyik végén egy variábilis domént hordoz, amelyet számos konstans domén követ. Mindegyik könnyû lánc egyik végén variábilis domént, másik végén konstans domént hordoz. A könnyû lánc variábilis domén igazodik a nehéz lánc variábilis doménjával. A könnyû lánc konstans doménja igazodik a nehéz lánc elsõ konstans doménjához. A könnyû és nehéz láncok konstans doménjai közvetlenül nem vesznek részt az ellenanyag antigénhez történõ kötõdésében. A könnyû és nehéz láncok egyes párjainak a variábilis doménjai képezik az antigénkötõ helyet. A könnyû és nehéz láncokon levõ variábilis doménok azonos általános szerkezetet mutatnak és mindegyik domén négy régióból álló keretet tartalmaz, amelyek szekvenciái viszonylag konzerváltak, és amelyeket három, komplementeritást determináló régió („complementarity determining region” CDR) kapcsol össze, amelyeket gyakran hipervariábilis régióknak neveznek. A négy keretrégió nagyjából béta-lemez-konformációt mutat és a CDR¹ek hurkokat képeznek, amelyek összekötik a béta-lemezszerkezetet, és bizonyos esetekben annak részét képezik. A CDR-eket a keretrégiók szoros közelségben tartják, és a másik domén CDR-jeivel együtt hozzájárulnak az antigénkötõ hely kialakításához. Ellenanyagok CDRjei és keretrégiói meghatározhatók Kabat és munkatársai által ismertetettek szerint [„Sequence of proteins of immunological interest”, US Dept. of Health and Human Services, US Goverment Printing Office (1987)]. Felismerték, hogy MAG elleni, egéreredetû monoklonális ellenanyagok, amelyeket ismertettek [Poltorak és munkatársai: Journal of Cell Biology 105, 1893–1899 (1987); DeBellard és munkatársai: Mol. Cell Neurosci. 7, 89–101 (1996); Tang és munkatársai: Mol. Cell. Neurosci. 9, 333–346 (1997); Torigoe K. és Lundborg G.: Exp. Neurology 150, 254–262 (1997)] és kereskedelmi forgalomba hoztak [MAB1567 (Chemicon)], amikor patkányban kiváltott fokális cerebralis ischaemiát (amely egy stroke modell) követõen akár közvetlenül az agyba, akár intravénásan beadtak, neuroprotekciót biztosított és fokozta a funkcionális javulást (PCT/EP03/08749). Ennek megfelelõen, a MAG elleni ellenanyagok egyaránt potenciális terápiás ágensek akut neuroprotekció biztosítására, valamint stroke¹ot követõ funkcionális ja-
1
HU 008 119 T2
vulás elõsegítésére. Ez az ellenanyag egéreredetû ellenanyag. Bár egéreredetû ellenanyagokat gyakran alkalmaznak diagnosztikai ágensként, hasznosságukat terápiás ágensként mindössze néhány esetben bizonyították. Korlátozott alkalmazhatóságuk részben annak tulajdonítható, hogy egéreredetû monoklonális ellenanyag embernek történõ ismételt beadása általában humáneredetû immunválaszt vált ki ezen molekulák ellen. Abból a célból, hogy az egéreredetû monoklonális ellenanyagok ezen, természetükbõl eredõ, nem kívánt tulajdonságait kiküszöböljék, humáneredetû ellenanyagok régióit magukban foglaló, „módosított” ellenanyagokat fejlesztettek ki, amelyek szakember számára jól ismertetek. Például, az adott humanizált ellenanyag nem humáneredetû, komplementaritást determináló régiókat („CDR”) tartalmaz, míg a szerkezet fennmaradó részének a többsége humáneredetû ellenanyagból származik. Beszámoltak továbbá arról, hogy az IN–1 egéreredetû monoklonális ellenanyag, amelyet NI–220/250 mielinprotein ellen állítottak elõ (amely erõteljesen gátolja neuritok növekedését és amelyrõl késõbb kimutatták, hogy a NogoA fragmense), elõsegíti axonok regenerációját [Caroni, P. és Schwab, M. E.: Neuron 1, 85–96 (1988); Schnell, L. és Schwab, M. E. Nature 343, 269–272 (1990); Bregman, B. S. és munkatársai: Nature 378, 498–501 (1995); és Thallmair, M. és munkatársai: Nature Neuroscience 1, 124–131) (1998)]. Beszámoltak továbbá arról, hogy az IN–1 által felismert antigén a NogoA [Chen és munkatársai: Nature 403, 434–439 (2000)]. IN–1 Fab fragmens vagy humanizált IN–1 beadása gerincvelõ-átmetszésen átesett patkányoknak elõsegítette a javulást [Fiedler, M. és munkatársai: Protein Eng. 15, 931–941 (2002); Brosamle, C. és munkatársai: J. Neuroscience 20, 8061–8068 (2000)]. A szakirodalomban azonban napjainkig nincs bizonyíték, amely arra utalna, hogy IN–1 vagy humanizált formája kötõdik humáneredetû NogoA-hoz és azt gátolja, ami pedig szükséges elvárás olyan monoklonális ellenanyaggal szemben, amely elõnyösen alkalmazható Nogo-közvetítette betegségek és rendellenességek, például stroke és neurodegeneratív betegségek kezelésére emberekben. A 7B12 ellenanyag egéreredetû monoklonális ellenanyag, amelyet patkányeredetû N:R–G ellen állítottak elõ, amely utóbbi a patkányeredetû Nogo¹A mieloprotein 1–979 aminosavcsoportjainak felel meg. Beszámoltak róla, hogy 7B12 beadása javítja a viselkedési kimenetelt és a kortikospinális plaszticitást patkány sroke modellekben [Wiessner C. és munkatársai: Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 23, 154–165 (2003)]. Kívánt célkitûzés maradt olyan terápiásan elõnyös monoklonális ellenanyag izolálása és kifejlesztése, amely kötõdik humáneredetû Nogohoz és annak aktivitását gátolja. Neurodegenerációs folyamat számos neurológiai betegség és rendellenesség hátterében húzódik, a korlátozás szándéka nélkül ide sorolva olyan akut betegségeket, mint például a stroke (ischaemiás vagy haemorrhágiás), vagy traumás agy- és gerincvelõ-károsodás, valamint krónikus betegségeket, mint például az Alzheimer-kór, frontotemporális de-
2
menciák (tauopátiák), perifériás neuropátia, Parkinsonkór, Creutzfeldt–Jakob-kór (CJD), skizofrénia, amiotrof laterális szklerózis (ALS), sclerosis multiplex, Huntington-kór, sclerosis multiplex és zárványtest miozitisz. Következésképpen, megfelelõ anti-Nogo monoklo5 nális ellenanyag elõnyös lehet ezen betegségek és/vagy rendellenességek kezelésében. A találmány tárgyát képezik a fenti betegségek és/vagy rendellenességek kezelésére alkalmas ellenanyagok, és azo10 kat az alábbiakban részletesen ismertetjük. A találmány rövid összefoglalása A találmány tárgyát képezi az 1. igénypont szerinti ellenanyag. A leírásban ismertetjük továbbá a 2A10/3, 15 2C4/1 és 15C3/3 függetlenül izolált ellenanyagokat. A CDR-eket Kabat és munkatársai, szerint azonosítottuk [Kabat és munkatársai: „Sequences of proteins of immunological interest” 5. kiadás, US Department of Health and Human Services, NIH publikáció száma: 20 91–3242 (1991)]. A CDR¹ek Kabat szerint definiáltuk, azonban a proteinszerkezet és hajtogatódás elveit Chlothia és Lesk szerint követve [Clothia és munkatársai: „Conformations of immunglobulin hypervariable regions” Nature 342, 877–883 (1989)], további csoportok 25 tekinthetõk az antigénkötõ régió részének, és ezáltal a találmány oltalmi körébe tartozónak. 1. táblázat 2A10/3 („2A10”) ellenanyag könnyû lánc CDR¹ek 30
CDR
Kabat szerint
L1
RSSKSLLYKDGKTYLN (SEQ ID NO 1)
L2
LMSTRAS (SEQ ID NO 2)
L3
QQLVEYPLT (SEQ ID NO 3)
35 2. táblázat 2A10/3 („2A10”) ellenanyag nehéz lánc CDR¹ek CDR
40
45
H1
SYWMH (SEQ ID NO 4)
H2
NINPSNGGTNYNEKFKS (SEQ ID NO 5)
H3
GQGY (SEQ ID NO 6)
3. táblázat 2C4/1 („2C4”) ellenanyag könnyû lánc CDR¹ek CDR
50
Kabat szerint
Kabat szerint
L1
RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO 7)
L2
KVSNRFS (SEQ ID NO 8)
L3
SQSTHVPLT (SEQ ID NO 9)
4. táblázat 2C4/1 ellenanyag nehéz lánc CDR¹ek 55
60 4
CDR
Kabat szerint
H1
FSCYAMS (SEQ ID NO 10)
H2
SISDGGSYTYYPDNVKG (SEQ ID NO 11)
H3
ELLFDY (SEQ ID NO 12)
1
HU 008 119 T2
5. táblázat 15C3/3 („15C3”) ellenanyag könnyû lánc CDR¹ek CDR
Kabat szerint
L1
RSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID NO 13)
L2
RMSNLAS (SEQ ID NO 14)
L3
MQHLEYPLT (SEQ ID NO 15)
6. táblázat 15C3/3 ellenanyag nehéz lánc CDR¹ek CDR
Kabat szerint
H1
SYWMN (SEQ ID NO 16)
H2
QIYPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO 17)
H3
RFDY (SEQ ID NO 18)
Az ellenanyag lehet kiméra, teljesen humáneredetû, vagy humanizált. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti ellenanyag epitópját az 586–785 régió tartalmazza (NogoA aminosavszámozás, GenBank AJ251383 nyilvántartási szám), elõnyösebben az epitópot az 586–685 régió tartalmazza. Adott antigén epitópjainak a térképezésére kompetitív gátlási vizsgálatokat alkalmaznak. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi továbbá NogoA elleni ellenanyag, amely 586–685 aminosavak között kötõdik humáneredetû NogoA-hoz, valamint neutralizálja NogoA aktivitását. Ilyen ellenanyag az alábbi eljárásokkal állítható elõ. Kiméra ellenanyagok A találmány szerinti ellenanyag lehet kiméra. A kiméra ellenanyag elõnyösen egéreredetû és humáneredetû szekvenciákat tartalmaz (például egéreredetû variábilis régiót és humáneredetû konstans régiót). Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi kiméra ellenanyag, amely tartalmazza a 2. táblázat szerinti CDR¹ek mindegyikét tartalmazó nehéz lánc variábilis régiót és az 1. táblázat szerinti CDR¹ek mindegyikét tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót. Humanizált ellenanyagok A találmány további megvalósítási módja szerint az ellenanyag humanizált. Közelebbrõl, a találmány tárgyát képezi humanizált ellenanyag, amely tartalmazza a 2. táblázat szerinti CDR¹ek mindegyikét tartalmazó nehéz lánc variábilis régiót és az 1. táblázat szerinti CDR¹ek mindegyikét tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót. Jellemzõ megvalósítási módok szerint, a találmány szerinti ellenanyagok, függetlenül attól, hogy kimérák, humanizáltak vagy teljesen humáneredetûek, IgG osztályba, elõnyösen humáneredetû IgG1 vagy IgG4 osztályba tartoznak, humáneredetû k¹típusú könnyû lánccal. További szempont szerint, a találmány tárgyát képezi gyógyászati készítmény, amely tartalmazza a találmány szerinti, NogoA elleni ellenanyagot, vagy an-
2
nak fragmensét, gyógyászatilag elfogadható hígítószerrel vagy hordozóval együtt. Egy további szempont szerint, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti NogoA elleni ellenanyag, 5 funkcionális fragmense vagy analógja alkalmazása stroke (elsõsorban ischaemiás stroke) és az alábbiak szerinti más neurológiai betegségek, elsõsorban Alzheimer-kór kezelésére alkalmas gyógyszer elõállításra. Egy még további szempont szerint, a találmány tár10 gyát képezi a találmány szerinti anti-NogoA ellenanyag, funkcionális fragmense vagy analógja alkalmazása olyan gyógyszer elõállítására, amely alkalmazható stroke-ban és/vagy más, alábbiakban ismertetett neurológiai betegségben, elsõsorban Alzheimer-kór15 ban szenvedõ, vagy azok kockázatának kitett humán betegben neurodegeneráció gátlása és/vagy funkcionális javulás elõsegítése céljára. A találmány további szempontjai és elõnyös megvalósítási módjai az alábbi részletes ismertetésben ta20 lálhatók.
25
30
35
40
45
50
55
60 5
Az ábrák ismertetése Az 1. ábra GST-NOGO-A56 fúziós protein neurit növekedésére kifejtett gátlóhatását mutatja. Az Y tengely neuritok átlagos hosszát (NUN) mutatja neuritonként, önkényes egységekben. A 2. ábra a 2A10 hibridóma felülúszójának a blokkoló hatását mutatja NOGO-A56 (GSTNogo5&6) fúziós protein neurit növekedését gátló aktivitására. Az Y tengely az 1. ábra szerinti. A 3. ábra a 2C4 hibridóma felülúszójának a blokkolóhatását mutatja NOGO-A56 (GSTNogo5&6) fúziós protein neurit növekedését gátló aktivitására. Az Y tengely az 1. ábra szerinti. A 4. ábra a 15C3 hibridóma felülúszójának a blokkoló hatását mutatja NOGO-A56 (GSTNogo5&6) fúziós protein neurit növekedését gátló aktivitására. Az Y tengely az 1. ábra szerinti. Az 5. ábra a 12G3 kontroll hibridóma felülúszóját mutatja, amelynek nincs NOGOA56 blokkoló aktivitása. Az Y tengely az 1. ábra szerinti. A 6. ábra tisztított 2A10 négy koncentrációjának NOGO-A56 proteinre kifejtett blokkolóhatását mutatja. Az Y tengely az 1. ábra szerinti. A 7. ábra azt mutatja, hogy a rekombináns IN–1 monoklonális ellenanyag nem mutat blokkolóhatást NOGO-A56 (GST-Nogo5&6) proteinnel szemben. Az Y tengely az 1. ábra szerinti. Az 1–7. ábrák esetében a kontroll önmagában alkalmazott GST protein volt. A 8. ábra 2A10, 2C4 és 15C3 monoklonális ellenanyagok kötõdését mutatja humáneredetû NOGO-A56 proteinhez. Az Y ten-
1
HU 008 119 T2
gely 450 nm hullámhosszon mért optikai denzitást mutatja, amely kvantitatív mértéke a vályulatokban befogott ellenanyagnak. Az X tengely az egyes adatpontok esetében alkalmazott ellenanyag koncentrációját (ng/ml) mutatja. A 9. ábra a lézió térfogatát mutatja a teljes agytérfogat százalékában különbözõ koncentrációk mellett, a 10. példa szerinti vizsgálatot követõen. A 10. ábra a 10. példa szerinti neuropontszám adatokat mutatja (átlag ±a középérték közepes hibája, „standard error of the mean”, SEM). 11A., 11B., 11C. és 11D. ábra. A 10. példa szerinti hengertesztek adatai (átlag ±SEM) A) mindkét mancs, B) bal mancs, C) jobb mancs esetében és D) jobb mancs adatai szétválasztva olyan patkányokra, amelyek 15 mg anti-NogoA ellenanyag 3 dózisát, valamint 15 mg anti-NogoA ellenanyag 4 dózisát kapták. A 12. ábra a 10. példa szerinti mellsõ végtag botlásokat mutatja (átlag±95% konfidenciaintervallum). A 13. ábra a 10. példa szerinti hátsó végtag botlásokat mutatja (átlag ±95% konfidenciaintervallum). A 14A. ábra a testtömegeket mutatja (átlag ±SEM). Az ellenanyag 15 mg-jának az adagolása az állatok testtömegének a növekedését eredményezi a 24. órában, az 1. héten és a 3. héttõl a vizsgálat befejezéséig minden idõpontban. A 14B. ábra a testtömegeket mutatja a 15 mg ellenanyagot kapott állatok esetében, szétválasztva olyan patkányokra, amelyek 15 mg anti-NogoA ellenanyag 3 dózisát, valamint 15 mg anti-NogoA ellenanyag 4 dózisát kapták. *P<0,05, ismételt mérések, ANOVA. A 14C. ábra a testtömegeket mutatja a 15 mg ellenanyagot kapott állatok esetében, szétválasztva olyan patkányokra, amelyek 15 mg anti-NogoA ellenanyag 3 dózisát, valamint 15 mg anti-NogoA ellenanyag 4 dózisát kapták. Összehasonlítás olyan állatokkal, amelyek 5 mg ellenanyagot kaptak, valamint amelyek kontroll ellenanyagot kaptak (átlag ±95% konfidenciaintervallum). *P<0,05, ismételt mérések, ANOVA. A 15. ábra a 11. példa szerinti léziók térfogatát mutatja a teljes agytérfogat százalékában. A 16. ábra a 11. példa szerinti neuropontszámadatokat mutatja (átlag ±SEM). A 17A., 17B. és 17C. ábra. A 11. példa szerinti hengertesztadatok (átlag ±SEM) A) mindkét mancs. B) bal mancs és C) jobb mancs esetében.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
A 18. ábra a 11. példa szerinti ék alakú pallóteszt („tapered beam”) mellsõ végtag botlásait mutatja (átlag ±SEM). A 19. ábra a 11. példa szerinti ék alakú pallóteszt hátsó végtag botlásait mutatja (átlag ±SEM). A 20. ábra a hátsó végtag botlásait mutatja (átlag ±SEM) (’a pallón áthaladás idõtartama’ teszt). 21. ábra. NogoA transzfekció Ab40 peptid szintjeinek az emelkedését okozza SHSY5YAPPwt sejtekben. 22. ábra. NogoA transzfekció Ab42 peptid szintjeinek az emelkedését okozza SHSY5YAPPwt sejtekben. 23. ábra. NogoA expresszálódásának hatása Ab40 peptidszintekre. 24. ábra. NogoA expresszálódás hatása Ab42 peptidszintekre. 25. ábra. NogoA, NogoB és NogoC expresszálódás hatása Ab40 és Ab42 peptidekre. 26. ábra. 2A10¹BR anti-NogoA ellenanyag gátolja Ab szekretálódását SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. 27. ábra. Kontroll IgG1 hatása Ab szekretálódására SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. 28. ábra. Kontroll IgG1 hatása Ab szekretálódására SHSY5Y-APPswe sejtekbõl. 29. ábra. 6D5 kontroll anti-NogoA (funkciót nem blokkoló) ellenanyag hatása Ab szekretálódására SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. 30. ábra. 6D5 kontroll anti-NogoA (funkciót nem blokkoló) ellenanyag hatása Ab szekretálódására SHSY5Y-APPswe sejtekbõl. 31. ábra. Funkciót blokkoló 2A10 anti-NogoA monoklonális ellenanyag gátolja Ab szekretálódását SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. 32. ábra. Funkciót blokkoló 2A10 anti-NogoA monoklonális ellenanyag gátolja Ab szekretálódását SHSY5Y-APPswe sejtekbõl. 33. ábra. Funkciót blokkoló 2C4 anti-NogoA monoklonális ellenanyag gátolja Ab szekretálódását SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. 34. ábra. Anti-NogoA, sztatikus tenyészetbõl származó ellenanyag-készítmények és további, kontroll ellenanyagok hatása Ab szekretálódására SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. A 2A10, 2C4 és 15C3 ellenanyagok sztatikus tenyészetbõl származó ellenanyagok. Az összes többi BR¹ban (bioreaktorban) tisztított, vagy kereskedelmi forgalomból beszerzett kontroll. A 35A–35C. ábrák a H1L11 humanizált ellenanyag versus kiméra (HcLc) ellenanyag dózisfüggõ kötõdését mutatják humáneredetû NOGO-A56 proteinhez, ELISA vizs-
1
36. ábra.
HU 008 119 T2
gálattal. Az Y tengely a mért optikai denzitásokat (OD) mutatja 490 nm hullámhosszon, amely a vályulatokban befogott ellenanyag kvantitatív mértéke. Az X tengely az ellenanyag egyes adatpontokhoz tartozó koncentrációját (mg/ml) mutatja. A fokozott NogoA expresszálódás dózisfüggõ módon emeli az Ab-szinteket. Az ábra Y tengelye Ab40 százalékos emelkedését mutatja. Az X tengely myctoldott NogoA cDNS növekvõ koncentrációját mutatja. Az ábra fölött egy gél mutatja a NogoA protein expresszálódásának a fokozódását, Western-blot-vizsgálattal és anti-NogoA ellenanyaggal kimutatva.
A találmány részletes ismertetése A találmány szerinti ellenanyagok jellemzõen monoklonális ellenanyagok (mAb), és elõnyösen kiméra, humanizált, teljesen humán vagy átalakított („reshaped”) ellenanyagok. Ezek közül a humanizált és teljesen humán ellenanyagok az elõnyösek. A találmány szerinti ellenanyagok jellemzõen természetes ellenanyag vagy annak funkcionális fragmense szerkezetét mutatják. Ennek megfelelõen, az ellenanyag tartalmazhat teljes hosszúságú ellenanyagot, (Fab’)2 fragmenst, Fab fragmenst, könnyû lánc dimert vagy nehéz lánc dimert. Az ellenanyag lehet IgG1, IgG2, IgG3 vagy IgG4; vagy IgM; IgA, IgE vagy IgD vagy azok módosított variánsai. Az ellenanyag nehéz lánc konstans doménja ennek megfelelõen választott. A könnyû lánc konstans domén lehet kappa vagy lambda konstans domén. Ezen túlmenõen, az ellenanyagok minden osztályra vonatkozó módosításokat tartalmazhatnak, például lehetnek IgG dimerek, vagy Fc mutánsok, amelyek nem kötõdnek Fc receptorokhoz, vagy nem mediálnak C1q kötõdést. Az ellenanyag lehet továbbá a WO86/01533 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett típusú, kiméra ellenanyag,
5
10
15
20
25
30
35
40
amely antigénkötõ régiót és nem immunglobulin régiót tartalmaz. Az antigénkötõ régió lehet ellenanyag könnyû lánc variábilis domén vagy nehéz lánc variábilis domén. Az antigénkötõ régió jellemzõen tartalmazza mind a könnyû, mind a nehéz lánc variábilis doménokat. A nem immunglobulin régiót C¹terminális végénél fúzionáltatták az antigénkötõ régióhoz. A nem immunglobulin régió jellemzõen nem immunglobulin protein, és lehet ismert kötõdési specificitású enzim, toxin vagy protein. Az ilyen típusú kiméra ellenanyag két régiója hasítható linkerszekvencián át kapcsolódhat egymáshoz. A fentebb ismertetett CDReket hordozó immunadhezinek szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. A konstans régiót a kívánt funkcionalitás szerint választhatjuk meg. IgG1 ellenanyag általában lítikus tulajdonságot hordoz komplementkötés révén, és/vagy ADCC¹t mediál („antibody dependent cell cytotoxocoty”, ellenanyagfüggõ sejtes citotoxicitás). IgG4 az elõnyös, ha nem citotoxikus blokkoló ellenanyagra van igény. IgG4 ellenanyagok azonban instabil termelõdést mutathatnak, ezért elõnyösebb módosítani az általában stabilabb IgG1 ellenanyagot. Javasolt módosításokat ismertet az EP0307434 számú európai szabadalmi bejelentés, elõnyös módosítások például a 235–237 pozíciók közötti módosítások. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti ellenanyag lítikus és nem lítikus formája. Ennek megfelelõen, a találmány elõnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti ellenanyag teljes hosszúságú (azaz H2L2 tetramer), nem lítikus ellenanyag, amely a fent ismertetett CDR-eket hordozza. A találmány egyik leginkább elõnyös megvalósítási módja szerint, a találmány tárgyát képezi teljes hosszúságú, nem lítikus IgG1 ellenanyag, amely a SEQ ID NO 1–6 szerinti CDR-eket tartalmazza. A találmány tárgyát képezi továbbá CDR-eket kódoló polinukleotidok. Például az 1–6. táblázatok szerinti CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 és CDRL3 aminosavszekvenciákat kódoló polinukleotidok. Elõnyös polinukleotidszekvenciákat ismertetnek az alábbi 7–12. táblázatok.
7. táblázat 2A10/3 ellenanyag könnyû lánc CDR¹ek CDR L1
AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATG GGAAGACATACTTGAAT (SEQ ID NO 19)
L2
TTGATGTCCACCCGTGCATCA (SEQ ID NO 20)
L3
CAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACG (SEQ ID NO 21)
8. táblázat 2A10/3 ellenanyag nehéz lánc CDR¹ek CDR H1
AGCTACTGGATGCAC (SEQ ID NO 22)
H2
AATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTAC AATGAGAAGTTCAAGAGC (SEQ ID NO 23)
H3
GGACAGGGCTAC (SEQ ID NO 24)
7
2
1
HU 008 119 T2
2
9. táblázat 2C4/1 ellenanyag könnyû lánc CDR¹ek CDR L1
AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATG GAAACACCTATTTACAT (SEQ ID NO 25)
L2
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT (SEQ ID NO 26)
L3
TCTCAGAGTACACATGTTCCGCTCACG (SEQ ID NO 27)
10. táblázat 2C4/1 ellenanyag nehéz lánc CDR¹ek CDR H1
TTCAGTTGCTATGCCATGTCT (SEQ ID NO 28)
H2
TCCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT CCAGACAATGTAAAGGGC (SEQ ID NO 29)
H3
GAACTACTTTTTGACTAC (SEQ ID NO 30)
11. táblázat 15C3/3 ellenanyag könnyû lánc CDR¹ek CDR L1
AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGG CAACACTTACTTGTAT (SEQ ID NO 31)
L2
CGGATGTCCAACCTTGCCTCA (SEQ ID NO 32)
L3
ATGCAACATCTAGAATATCCGCTCACG (SEQ ID NO 33)
12. táblázat 15C3/3 ellenanyag nehéz lánc CDR¹ek CDR H1
AGCTACTGGATGAAC (SEQ ID NO 34)
H2
CAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTAC AACGGAAAGTTCAA GGGC (SEQ ID NO 35)
H3
CGCTTTGACTAT (SEQ ID NO 36)
A 2A10/3, 2C4/1 és 15C3/3 anti-NogoA ellenanyagok olyan nehéz lánc variábilis régiót tartalmaznak, 40
amely az alábbi aminosavszekvenciák egyikét tartalmazza:
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNY NEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO 37); vagy
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSCYAMSWVRQTPEKRLEWVAS ISDGGSYTYY PDNVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCAKEL LFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO 38); vagy
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSYWNNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDGDTNY NGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAVRF DYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO 39). A 2A10/3, 2C4/1 és 15C3/3 anti-NogoA ellenanyagok olyan könnyû lánc variábilis régiót tartalmaznak, 55
amely az alábbi aminosavszekvenciák egyikét tartalmazza:
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRA SGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO 40) vagy 8
1
HU 008 119 T2
2
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO 41) vagy
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLA SGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYP LTFGAGTKLELK (SEQ ID NO 42) Egy további szempont szerint, a találmány tárgyát képezi NogoA elleni ellenanyag vagy funkcionális frag- 10 mense, amely kötõdik humáneredetû NogoA-hoz és annak aktivitását neutralizálja, és amely ellenanyag együtt tartalmazza: a) a SEQ ID NO 37 szerinti nehéz lánc variábilis régiót és a SEQ ID NO 40 szerinti aminosavszekvenciát 15 tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót.
A találmány tárgyát képezik továbbá a SEQ ID NO 37–39 szerinti aminosavszekvenciákat tartalmazó nehéz lánc variábilis régiót és a SEQ ID NO 40–42 szerinti aminosavszekvenciákat tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót kódoló polinukleotidok. A SEQ ID NO 37 szerinti aminosavszekvenciát kódoló elõnyös polinukleotidszekvencia az alábbi:
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGG CCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTAC AATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAG GGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO 43) A SEQ ID NO 38 szerinti aminosavszekvenciát kódoló elõnyös polinukleotidszekvencia az alábbi:
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTC CCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTTGCTATGCCA TGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCC ATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGA GCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAAGGAACTA CTTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO 44) A SEQ ID NO 39 szerinti aminosavszekvenciát kódoló elõnyös polinukleotidszekvencia az alábbi:
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGATTTCCTGCAAAGCTTCTGGCTACGCATTCAGTAGCTACTGGA TGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGAAAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAG ATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAACGGAAAGTTCAAGGGCAA GGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA GCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAGTACGCTTT GACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO 45) A SEQ ID NO 40 szerinti aminosavszekvenciát kódoló elõnyös polinukleotidszekvencia az alábbi:
50
GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGA ATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATG GGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAG CTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTT TAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGA AGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO 46) 9
1
HU 008 119 T2
2
A SEQ ID NO 41 szerinti aminosavszekvenciát kódoló elõnyös polinukleotidszekvencia az alábbi:
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGA TCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATG GAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAG CTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTT CAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGG AGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAGAGTACACATGTTCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO 47) A SEQ ID NO 42 szerinti aminosavszekvenciát kódoló elõnyös polinukleotidszekvencia az alábbi:
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGA GTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATG GCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAG CTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGG AGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO 48) A 2A10 anti-NogoA ellenanyag a SEQ ID NO 37 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó nehéz lánc variábilis régiót és a SEQ ID NO 40 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót tartalmaz. A 2C4 anti-NogoA ellenanyag a SEQ ID NO 38 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó nehéz lánc variábilis régiót és a SEQ ID NO 41 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót tartalmaz. A 15C3 anti-NogoA ellenanyag a SEQ ID NO 39 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó nehéz lánc variábilis régiót és a SEQ ID NO 42 szerinti aminosavszekvenciát tartalmazó könnyû lánc variábilis régiót tartalmaz. A leírásban „Nogo” kifejezés alatt bármely Nogo polipeptidet értünk, variáns formákat beleértve. A korlátozás szándéka nélkül idetartozik a NogoA, amely 1192 aminosavcsoportból áll (GenBank nyilvántartási száma: AJ251383); NogoB, egy hasítási variáns, amelybõl hiányzanak a 186–1004 csoportok a feltételezett extracelluláris doménból (GenBank nyilvántartási száma: AJ251384) és egy rövidebb hasítási variáns, NogoC, amelybõl szintén hiányzanak 186–1004 csoportok, továbbá kisebb, alternatív aminoterminális domént hordoz (GenBank nyilvántartási száma: AJ251385) [Prinjha és munkatársai. (2000), lásd fentebb]. A „Nogo” kifejezésre történõ minden utalás magában foglalja a Nogo bármely és minden variáns formáját, mint például a NogoA¹t és ismertetett hasítási variánsait, kivéve, ha egy speciális formára utalunk. A leírásban „neutralizálás” és nyelvtani variációi alatt Nogo-funkciók, például neuronokhoz kötõdés és neuritnövekedés teljes, vagy részleges gátlását értjük. A leírásban „módosított ellenanyag” kifejezés alatt módosított immunglobulinkódoló régió által kódolt pro-
25
30
35
40
45
50
55
60 10
teint értünk, amelyet kiválasztott gazdasejtben történõ expresszáltatással lehet elõállítani. Ilyen módosított ellenanyagok közé tartoznak génsebészetileg átalakított ellenanyagok (például kiméra, átalakított, humanizált vagy irányított ellenanyagok), vagy ellenanyag fragmensek, amelyekbõl az immunglobulin konstans régió részben vagy teljesen hiányzik, például Fv, Fab vagy F(ab’)2 fragmensek és hasonlók. A leírásban „módosított immunglobulinkódoló régió” alatt módosított ellenanyagot kódoló nukleinsavszekvenciát értünk. Amikor a módosított ellenanyag CDRgraftolt vagy humanizált ellenanyag, a nem humáneredetû immunglobulinból származó, komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-eket) kódoló szekvenciákat humáneredetû variábilis keretszekvenciákat tartalmazó, elsõ immunglobulin-partnerbe inszertáljuk. Más megoldás szerint, az elsõ immunglobulin-partnert operatív módon egy második immunglobulin-partnerhez kapcsoljuk. A leírásban „elsõ immunglobulin-partner” kifejezés alatt humáneredetû keretet vagy humáneredetû immunglobulin variábilis régiót kódoló nukleinsavszekvenciát értünk, amelyben a natív (vagy természetben elõforduló) CDR-kódoló régiókat a donor ellenanyag CDR-kódoló régióival helyettesítjük. A humáneredetû variábilis régió lehet immunglobulin nehéz lánc, könnyû lánc (vagy mindkét lánc), analóg vagy azok funkcionális fragmensei. Az ilyen CDR-régiók, amelyek ellenanyagok (immunglobulinok) variábilis régióiban találhatók, szakember számára ismert eljárásokkal meghatározhatók. Például Kabat és munkatársai, ismertetnek szabályokat CDR¹ek meghatározásához [„Sequence of proteins of immunological interest”, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health, US Government Printing Office (1987)]. Ezen túlmenõen, ismertek számítógépes programok, ame-
1
HU 008 119 T2
lyek elõnyösen alkalmazhatók CDR-régiók és struktúrák azonosítására. A leírásban „második immunglobulin-partner” kifejezés alatt olyan proteint vagy peptidet kódoló másik nukleotidszekvenciát értünk, amelyhez az elsõ immunglobulin-partnert keretbe fúzionáltattuk, vagy adott esetben egy szokásos kapcsolószekvenciával („linker”) hozzákapcsoltuk (azaz operatív módon kapcsoltuk). Ez elõnyösen immunglobulingén. A második immunglobulinpartner tartalmazhat olyan nukleinsavszekvenciát, amely ugyanazon (azaz homológ – az elsõ és második módosított ellenanyag ugyanabból a forrásból származnak) vagy eltérõ (azaz heterológ) kérdéses ellenanyag teljes konstans régióját kódolja. Ez lehet immunglobulin nehéz lánc vagy könnyû lánc (vagy egyetlen polipeptid részeként mindkét lánc). A második immunglobulinpartner nem korlátozódik adott immunglobulinosztályra vagy izotípusra. Ráadásul, a második immunglobulinpartner tartalmazhatja egy immunglobulin konstans régió részét, amely megtalálható például Fab vagy F(ab’)2 fragmensekben (azaz megfelelõ humáneredetû konstans régió vagy keretrégió körülhatárolt részében). Az ilyen második immunglobulin partner tartalmazhat továbbá gazdasejt külsõ felszínén megjelenõ, integrált membránproteint kódoló szekvenciát, például fágbemutató könyvtár részeként, vagy analitikai vagy diagnosztikai detektálásra alkalmas proteint, például tormaperoxidázt, b¹galaktozidázt és hasonlókat kódoló szekvenciát. Az Fv, Fc, Fd, Fab vagy F(ab’)2 kifejezéseket szokásos jelentésükkel alkalmazzuk [lásd például Harlow és munkatársai: „Antibodies, A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. A leírásban „génsebészetileg átalakított ellenanyag” kifejezés alatt módosított ellenanyag, azaz teljes hosszúságú, szintetikus ellenanyag (például kiméra, átalakított vagy humanizált ellenanyag, szemben ellenanyagfragmenssel) olyan típusát értjük, amelyben a kiválasztott akceptor ellenanyag könnyû és/vagy nehéz lánc variábilis doménjainak egy részét egy vagy több olyan donor ellenanyag analóg részeivel helyettesítettük, amelyek specificitást mutattak a kiválasztott epitóppal szemben. Ezek a molekulák lehetnek például olyan ellenanyagok, amelyeket humanizált nehéz lánccal asszociált, nem módosított könnyû lánc (vagy kiméra könnyû lánc) jellemez, vagy fordítva. Génsebészetileg átalakított ellenanyagokat jellemezheti továbbá a akceptor ellenanyag könnyû és/vagy nehéz lánc variábilis domén keretrégióit kódoló nukleinsavszekvenciák módosítása abból a célból, hogy a donor ellenanyag kötési specificitását megtartsuk. Ezek az ellenanyagok tartalmazhatják a akceptor ellenanyag egy vagy több (elõnyösen valamennyi) CDR-ének a leírásban ismertetett donor ellenanyagok egyikének CDR-jével történõ helyettesítését. A leírásban „kiméra ellenanyag” kifejezés alatt génsebészetileg átalakított ellenanyag olyan típusát értjük, amely donor ellenanyagból származó, természetben elõforduló variábilis régiót (könnyû láncot és nehéz láncot) tartalmaz akceptor ellenanyagból származó könnyû és nehéz lánc konstans régiókkal asszociáltan.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
A leírásban „humanizált ellenanyag” kifejezés alatt génsebészetileg átalakított ellenanyag olyan típusát értjük, amelynek CDR-jei nem humáneredetû donor immunglobulinból származnak, míg a molekula fennmaradó, immunglobulin-eredetû részei egy (vagy több) humáneredetû immunglobulinból származnak. Ezen túlmenõen, módosíthatók a keretet tartó csoportok abból a célból, hogy fenntartsuk a kötõdési affinitást [lásd például Queen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10 029–10 032 (1989); Hodgson és munkatársai: Bio/Technology 9, 421 (1991)]. Megfelelõ humáneredetû akceptor ellenanyag lehet szokásos adatbázisból, például KABAT® adatbázisból, Los Alamos adatbázisból és Swiss Protein adatbázisból választott ellenanyag, a donor ellenanyag nukleotid- és aminosavszekvenciájával való homológia alapján. A donor ellenanyag keretrégióival való homológiával (aminosavalapon) jellemzett humáneredetû ellenanyag alkalmas lehet arra, hogy nehéz lánc konstans régiót és/vagy nehéz lánc variábilis keretrégiót adjon a donor CDR inszertálásához. Megfelelõ akceptor ellenanyag kiválasztása, amely képes könnyû lánc konstans vagy variábilis keretrégiók befogadására, hasonló módon történhet. Megjegyezzük, hogy a akceptor ellenanyag nehéz és könnyû láncainak nem kell feltétlenül ugyanabból a akceptor ellenanyagból származniuk. A technika korábbi állása szerint számos eljárást ismertetnek ilyen humanizált ellenanyagok elõállítására, lásd például az EP–A–0239400 és EP–A–054951 számú európai szabadalmi bejelentéseket. A leírásban „átalakított humáneredetû ellenanyagok” kifejezés alatt olyan módosított ellenanyagot értünk, amelyben egy elsõ humáneredetû monoklonális donor ellenanyagban levõ, minimálisan legalább egy CDR¹t egy második, humáneredetû akceptor ellenanyag CDR¹je helyére helyettesítjük be. Elõnyösen mind a hat CDR¹t helyettesítjük. Elõnyösebben, az elsõ humáneredetû donor monoklonális ellenanyag teljes antigénkötõ régióját [például Fv, Fab vagy F(ab’)2 régióját] helyettesítjük be a második humáneredetû befogadó monoklonális ellenanyag megfelelõ régiójába. Legelõnyösebben, az elsõ humáneredetû donor Fab régióját operatív módon kapcsoljuk a második humáneredetû akceptor ellenanyag megfelelõ konstans régióihoz abból a célból, hogy teljes hosszúságú monoklonális ellenanyagot állítsunk elõ. A leírásban „vektorozott ellenanyag” kifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amelyhez olyan ágenst kapcsoltunk, amely javítja a vér-agy barrieren („blood brain barrier”, BBB) való átjutást [összefoglalásért lásd Partridge: Advanced Drug Delivery Review 36, 299–321 (1999)]. Az ágens kapcsolása történhet kémiai úton, vagy más megoldás szerint, génsebészeti úton vihetõ be az ellenanyagba. Az egyik megoldás szerint kimérát állítunk elõ agyi kapilláris endotélsejt-receptor ellen irányuló ellenanyaggal, például inzulinreceptor elleni vagy transzferrinreceptor elleni ellenanyaggal [Saito és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10 227–31 (1995); Pardridge és munkatársai: Pharm. Res. 12, 807–816 (1995); Broadwell és munkatársai: Exp. Neu-
1
HU 008 119 T2
rol. 142, 47–65 (1996); Bickel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2618–2622 (1993); Friden és munkatársai: J. Pharm. Exp. Ther. 278, 1491–1498 (1996); US 5,182,107, US 5,154,924, US 5,833,988, US 5,527,527 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírások]. A receptorhoz történõ kötõdést követõen a bispecifikus ellenanyag mindkét komponense transzcitózis révén átjut a vér-agy barrieren (BBB¹n). Más megoldás szerint, az ágens lehet olyan ligandum, amely olyan sejtfelszíni receptorokat köt, mint például inzulin¹, transzferrin- vagy alacsony denzitású lipoproteinreceptorokat [Descamps és munkatársai: Am. J. Physiol. 270, H1149–H1158 (1996); Duffy és munkatársai: Brain. Res. 420, 32–38 (1987); Dehouck és munkatársai: J. Cell Biol. 1997 877–889 (1997)]. Alkalmazhatók továbbá a természetben elõforduló olyan peptidek, amelyekrõl ismert, hogy javítják a szállítást BBB¹n keresztül [Rouselle és munkatársai: Mol. Pharm. 57, 679–686 (2000); és Rouselle és munkatársai: Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124–131 (2001)]. A leírásban „donor ellenanyag” alatt olyan (monoklonális és/vagy rekombináns) ellenanyagot értünk, amely variábilis régiója, CDR¹je vagy azok más funkcionális fragmentje vagy analógja aminosavszekvenciáit hozzáadja egy elsõ immunglobulin-partnerhez abból a célból, hogy módosított immunglobulint kódoló régiót képezzen és módosított ellenanyag expresszálódását eredményezze, a donor ellenanyagra jellemzõ antigénspecificitással és neutralizálóaktivitással. A leírásban „akceptor ellenanyag” kifejezés alatt a donor ellenanyaggal heterológ, olyan (monoklonális vagy rekombináns) ellenanyagot értünk, amely nehéz és/vagy könnyû lánc keretrégiói és/vagy nehéz és/vagy könnyû lánc konstans régiói aminosavszekvenciájának egészét (bármekkora részét, azonban elõnyösen az egészét) hozzáadja az elsõ immunglobulin-partnerhez. A akceptor ellenanyag elõnyösen humáneredetû ellenanyag. A leírásban a „CDR” kifejezést úgy definiáljuk, mint adott ellenanyag komplementaritást meghatározó régiójának aminosavszekvenciái, amelyek az immunglobulin nehéz és könnyû láncok hipervariábilis régióit képezik [lásd például Kabat és munkatársai: „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 4. kiadás, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health (1987)]. Adott immunglobulin variábilis régiójában három nehéz lánc CDR és három könnyû lánc CDR (vagy CDR-régió) található. Ennek megfelelõen, a leírásban „CDR-ek” kifejezés alatt mindhárom nehéz lánc CDR¹t vagy mindhárom könnyû lánc CDR¹t értjük (vagy ahol helyénvaló, az összes nehéz és könnyû lánc CDR¹t). Az ellenanyag szerkezete és proteinhajtogatódása jelentheti azt, hogy további csoportok tekinthetõk az antigénkötõ régió részének, és ez szakember számára érthetõ. [Lásd például Chothia és munkatársai: „Conformations of immunglobulin hypervariable regions” Nature 342, 877–883 (1989).] Célszerûségbõl a SEQ ID NO 37–42 szerinti, Kabat szerint definiált CDR-eket dobozokkal jelöltük.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
CDR¹ek képezik az érintkezési csoportok nagy részét, amellyel az ellenanyag kötõdik az antigénhez vagy epitóphoz. A találmány szerinti CDR-eket donor ellenanyag variábilis nehéz és könnyû lánc szekvenciákból származtattuk, és idetartoznak a természetben elõforduló CDR¹ek analógjai, amely analógok osztják vagy megtartják ugyanazt az antigénkötõ specificitást és/vagy neutralizálótulajdonságot, mint a donor ellenanyag, amelybõl származnak. „Funkcionális fragmens” kifejezés alatt olyan részleges nehéz vagy könnyû lánc variábilis szekvenciát értünk (például kisebb deléciók az immunglobulin variábilis régiójának amino- vagy karboxiterminális végébõl), amely megtartja ugyanazt az antigénkötõ specificitást és ugyanazt vagy hasonló neutralizálótulajdonságot, mint az ellenanyag, amelybõl a fragmenst származtattuk. A leírásban „analóg” kifejezés alatt legalább egy aminosavában módosított aminosavszekvenciát értünk, ahol a módosítás lehet kémiai, vagy lehet néhány aminosav (azaz nem több mint például 10 aminosav) helyettesítése vagy átrendezése, amely módosítás az aminosavszekvencia esetében megengedi, hogy megtartsa a nem módosított szekvencia biológiai jellemzõit, például antigénspecificitását és magas affinitását. Szubsztitúciók révén konstruálhatók például (néma) mutációk, ahol CDR-kódoló régiókon belül vagy környezetükben endonukleáz restrikciós helyeket alakítunk ki. A találmány oltalmi körébe tartozik a találmány szerinti ellenanyag analógjainak az alkalmazása. Jól ismert, hogy aminosav- vagy nukleinsavszekvenciákban történõ kisebb változtatások például az eredeti protein allélikus formájához vezethetnek, amely lényegében hasonló tulajdonságokat tart meg. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti ellenanyag analógjai közé tartoznak olyan ellenanyagok, amelyekben a nehéz és könnyû lánc hipervariábilis régiók legalább 80%¹os, elõnyösen legalább 90%¹os és még elõnyösebben legalább 95%¹os homológiát mutatnak az 1–6. táblázatok szerinti CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 és CDRL3 szerinti CDR-ekkel, valamint megtartják NOGO¹t neutralizáló aktivitásukat. Aminosavszekvenciák akkor mutatnak legalább 80%¹os homológiát, ha 80% azonos aminosavcsoportot tartalmaznak azonos pozícióban, a szekvenciák optimális összerendezése mellett, és a hiányokat és inszertált részeket nem számítjuk azonos csoportoknak. Ennek megfelelõen, a találmány szerinti ellenanyag analógjai közé tartoznak olyan ellenanyagok, amelyekben a keretrégiók legalább 80%¹os, elõnyösen legalább 90%¹os és még elõnyösebben legalább 95%¹os homológiát mutatnak a SEQ ID NO 37–42 szerinti keretrégiókkal. Aminosavszekvenciák akkor mutatnak legalább 80%¹os homológiát, ha 80% azonos aminosavcsoportot tartalmaznak azonos pozícióban, a szekvenciák optimálisan összerendezése mellett, és a hiányokat és inszertált részeket nem számítjuk azonos csoportoknak. Analógok elõfordulhatnak továbbá, mint allélikus variációk. Adott „allélikus variáció vagy módosulás” nukleinsavszekvenciában történõ változást jelent. Ilyen
1
HU 008 119 T2
variációkat vagy módosulásokat okozhat a genetikai kód degenerációja, vagy azok elõidézhetõk génsebészeti úton, kívánt jellemzõk elõállítása céljából. Ezek a variációk vagy módosulások vagy okozhatnak eltéréseket az adott, kódolt aminosavszekvenciában, vagy nem. A leírásban „effektor ágensek” kifejezés alatt nem protein hordozó molekulákat értünk, amelyekhez a módosított ellenanyagok, és/vagy a donor ellenanyag természetes vagy szintetikus könnyû vagy nehéz láncai vagy más fragmensei szokásos eljárással asszociálhatók. Ilyen nem protein hordozók közé tartoznak a diagnosztika területén alkalmazott, szokásos hordozók, például polisztirén vagy más mûanyag gyöngyök, poliszacharidok, például amilyet a BIAcore (Pharmacia) rendszer alkalmaz, vagy más, nem protein anyagok, amelyek egészségügyi területen elõnyösen alkalmazhatók és biztonságosan beadhatók embernek és állatnak. További effektor ágensek lehetnek nehézfématomok kelátképzésére alkalmas makrogyûrûk, vagy radioizotópok. Az ilyen effektor ágensek, például a polietilénglikolok alkalmasak lehetnek továbbá a módosított ellenanyagok felezõdési idejének a meghosszabbítására. Más megoldás szerint, ellenanyagok, módosított ellenanyagok vagy fragmensek elõállíthatók úgy, hogy nem humán fajt (például szarvasmarhát, birkát, majmot, csirkét, rágcsálót, például egeret és patkányt) immunizálunk kívánt immunglobulin generálása céljából bármely fajból, például emberbõl vagy csirkébõl származó, natív Nogo prezentálásával, amely elleni ellenanyagok keresztreagálnak humáneredetû Nogoval. Szokásos hibridóma eljárások alkalmazhatók Nogo elleni, nem humáneredetû monoklonális ellenanyagot szekretáló hibridóma sejtvonal elõállítására. Az ilyen hibridómákat ezt követõen kötõdésre nézve szûrjük Nogoval fedett, 384 vagy 96 vályulatú lemezeken, streptavidinnal fedett lemezhez kötött, biotinezett Nogo alkalmazásával, vagy biotinezett Nogot alkalmazó, homogén európium-APC kapcsolt immunvizsgálat („homogenous europiumAPC linked immunoassay”) alkalmazásával. Natív, humáneredetû ellenanyag állítható elõ „humán ellenanyag egérben”, például „Xenomouse™” (Abgenix) egérben, ahol az egér immunglobulingéneket eltávolították, és a humán immunglobulinokat kódoló géneket inszertálták az egéreredetû kromoszómába. Az egereket szokásosan immunizálják, és olyan immunválaszt váltanak ki, amely emberi génekbõl ered. Az egér tehát humáneredetû ellenanyagokat termel, ami fölöslegessé teszi a pozitív hibridómák szelektálását követõ humanizálást [Lásd Green L. L.: J. Immunol. Methods 231(1–2), 11–23 (1999)]. A találmány tárgyát képezi továbbá Nogo ellen irányuló monoklonális ellenanyagokból származtatott Fab fragmensek vagy F(ab’)2 fragmensek alkalmazása. Az Fab fragmens teljes könnyû láncot és a nehéz lánc aminoterminális részét tartalmazza, míg az F(ab’)2 fragmenst diszulfidkötéssel kapcsolt két Fab fragmens alkotja. Fab és F(ab’)2 fragmensek szokásos eljárások-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
kal állíthatók elõ, például adott monoklonális ellenanyag megfelelõ proteolitikus enzimekkel, papainnal és/vagy pepszinnel történõ hasításával, vagy rekombináns eljárásokkal. Az Fab és F(ab’)2 fragmensek önmagukban elõnyösek terápiás vagy profilaktikus ágensként, valamint alkalmazhatók a találmány szerinti rekombináns vagy humanizált ellenanyagok elõállításához szükséges variábilis régiókat és CDR-szekvenciákat tartalmazó szekvenciák donorjaiként. Fab és F(ab’)2 fragmensek elõállíthatók továbbá kombinatoriális fág könyvtár [lásd például Winter és munkatársai: Ann. Rev. Immunol. 12, 433–455 (1994)] vagy immunglobulinlánc-keveréses [„shuffling”; lásd például Marks és munkatársai: Bio/Technology 10, 779–783 (1992)] eljárásokkal, amely szakirodalmi helyek teljes egészükben a kitanítás részét képezik. Ennek megfelelõen, Nogo iránt specifikus, humáneredetû ellenanyagfragmensek (Fv, scFv, Fab) izolálhatók humán ellenanyagfragmens fágprezentációs könyvtár („phage display library”) alkalmazásával. Humáneredetû ellenanyagfragmens proteineket bemutató bakteriofág részecskék könyvtárát összevetjük a Nogo proteinnel. Azokat a fágokat, amelyek Nogohoz kötõdõ ellenanyagfragmenseket mutatnak be, klonálisan amplifikáljuk. A humáneredetû ellenanyaggéneket ezt követõen kivágjuk a specifikus bakteriofágból és humáneredetû IgG konstans régiókat tartalmazó humáneredetû IgG-expressziós konstrukciókba inszertáljuk abból a célból, hogy Nogo iránt specifikus, izolált bakteriofágból származó variábilis régiókat tartalmazó, intakt, humáneredetû IgG-molekulát állítsunk elõ. A donor ellenanyagok szekvenciákat, például variábilis nehéz és/vagy könnyû lánc peptidszekvenciákat, keretszekvenciákat, CDR-szekvenciákat, azok funkcionális fragmenseit és analógjait, valamint azokat kódoló nukleinsavszekvenciákat adhatnak át, amelyek elõnyösen alkalmazhatók különbözõ olyan ellenanyagok tervezéséhez és elõállításához, amelyeket a donor ellenanyag antigénkötõ specificitása jellemez. A genetikai kód degenerációját figyelembe véve, különbözõ kódolószekvenciák konstruálhatók, amelyek olyan variábilis nehéz és könnyû lánc aminosavszekvenciákat, CDR-szekvenciákat, valamint azok funkcionális fragmenseit és analógjait kódolják, amelyek osztják a donor ellenanyag antigénkötõ specificitását. Variábilis lánc peptidszekvenciákat vagy CDR-eket kódoló, izolált nukleinsavszekvenciák, vagy azok fragmensei alkalmazhatók módosított ellenanyagok, például kiméra vagy humanizált, vagy génsebészetileg átalakított más ellenanyagok elõállítására, ha azokat operatív módon második immunglobulin-partnerrel kombináljuk. Módosított immunglobulin-molekulák kódolhatnak módosított ellenanyagokat, amelyek lehetnek génsebészetileg átalakított ellenanyagok, például kiméra vagy humanizált ellenanyagok. Kívánt módosított immunglobulin-kódoló régió olyan CDR-kódoló régiókat tartalmaz, amelyek Nogo elleni ellenanyag antigénkötõ specificitását mutató peptideket kódolnak, amely ellenanyag elõnyösen nagy affinitású és amelyet egy elsõ immunglobulin-partnerbe (humáneredetû keretbe vagy
1
HU 008 119 T2
humáneredetû immunglobulin variábilis régióba) inszertáltunk. Elõnyösen, az elsõ immunglobulin-partner operatív módon kapcsolt egy második immunglobulin-partnerhez. A második immunglobulin-partnert fentebb definiáltuk, és tartalmazhat egy második elõnyös ellenanyag-régiót kódoló szekvenciát, például Fc¹régiót kódoló szekvenciát. Második immunglobulin-partnerek tartalmazhatnak továbbá másik immunglobulint kódoló szekvenciákat, amelyekhez a könnyû vagy nehéz lánckonstans régiót keretbe fúzionáltattuk, vagy kapcsoló(linker¹) szekvenciával kapcsoltuk. A Nogo funkcionális fragmensei vagy analógjai ellen irányuló, génsebészetileg átalakított ellenanyagok tervezhetõk úgy, hogy fokozott kötõdést mutassanak. A második immunglobulin-partner asszociálódhat továbbá a fentebb ismertetett effektor ágensekkel, például nem protein hordozó molekulákkal, amelyekhez a második immunglobulin-partner szokásos eljárásokkal operatív módon kapcsolt lehet. Fúzió vagy kapcsolódás a második immunglobulinpartnerek, például ellenanyag-szekvenciák és az effektor ágens között bármely módon lehetséges, például szokásos kovalens vagy ionos kötésekkel, protein fúziókkal vagy heterobifunkcionális keresztkötõ reagensekkel, például karbodiimiddel, glutáraldehiddel és hasonlókkal. Ilyen eljárások szakember számára jól ismertek és szokásos kémiai és biokémiai kézkönyvekben megtalálhatók. Ezen túlmenõen, a szokásos kapcsolószekvenciák, amelyek egyszerûen kívánt távolságot tartanak a második immunglobulin-partner és az effektor ágens között, szintén beépíthetõk a módosított immunglobulinkódoló régióba. Ilyen kapcsolószekvenciák tervezése szakember számára jól ismert. A találmány további szempontjai szerint, a találmány tárgyát képezik diatestek (bivalens vagy bispecifikus) („diabodies, bivalent or bispecific), triatestek, tetratestek és más multivalens scFV proteinfajták, amelyek a fentebb ismertetett egy vagy több CDR¹t hordozzák, amelyek a Nogohoz kötõdnek és funkcióját neutralizálják. Egy további megvalósítási mód szerint, a találmány szerinti ellenanyaghoz további ágenst kapcsolhatunk. Például, rekombináns DNS-eljárást alkalmazhatunk a találmány szerinti, génsebészetileg átalakított olyan ellenanyag elõállítására, amelyben a teljes hosszúságú ellenanyag-molekula Fc fragmensét vagy CH2–CH3 doménjét enzim, vagy más detektálható molekula helyettesíti (azaz polipeptid effektor- vagy riportermolekula). A második immunglobulin-partner továbbá operatív módon kapcsolódhat olyan nem immunglobulin peptidhez, proteinhez vagy azok fragmenséhez, amely heterológ a Nogo elleni ellenanyag antigénkötõ specificitását mutató CDR¹t tartalmazó szekvenciával. Expresszálódást követõen, az így kapott protein egyaránt mutathatja a Nogo antigén elleni specificitást és a nem immunglobulin peptid jellemzõit. A fúziós partner jellemzõje lehet például funkcionális jellemzõ, például további kötõ- vagy receptordomén, vagy terápiás jellemzõ, ha
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
fúziós partner maga is terápiás protein, vagy további antigénhatású jellemzõ. A találmány szerinti, további elõnyös protein tartalmazhat teljes hosszúságú ellenanyag-molekulát, amely teljes hosszúságú nehéz és könnyû láncokat, vagy azok bármely elkülönült fragmensét hordozza, például Fab vagy F(ab’)2 fragmenseket, nehéz lánc dimert, vagy azok bármely minimális rekombináns fragmensét, például Fv¹régiót vagy egyláncú ellenanyagot („single-chain antibody”, SCA), vagy bármely más molekulát, amely azonos specificitású a kiválasztott monoklonális ellenanyaggal. Az ilyen protein alkalmazható módosított ellenanyag formájában, vagy alkalmazható nem fuzionált formájában. Minden esetben, amikor a második immunglobulinpartnert a donor ellenanyagtól eltérõ ellenanyagból származtattuk, például bármely izotípusú vagy osztályú immunglobulin keretrégióból vagy konstans régióból, génsebészetileg átalakított ellenanyagot kapunk. Génsebészetileg átalakított ellenanyagok tartalmazhatnak egyik forrásból, például akceptor ellenanyagból származó immunglobulin (Ig) konstans régiókat és variábilis keretrégiókat, és egy vagy több (elõnyösen mind) CDR¹t a donor ellenanyagból. Ezen túlmenõen, a befogadó monoklonális ellenanyag könnyû és/vagy nehéz lánc variábilis domén keretrégióján vagy a donor CDRrégiókon módosítások, például deléciók, szubsztitúciók vagy hozzáadások végezhetõk el nukleinsav- vagy aminosavszinten abból a célból, hogy megtartsuk a donor ellenanyag antigénkötõ specificitását. Az ilyen, génsebészetileg átalakított ellenanyagokat úgy tervezzük meg, hogy a Nogo elleni monoklonális ellenanyag variábilis nehéz és/vagy könnyû láncai egyikét (vagy mindkettõt), vagy a nehéz vagy könnyû lánc CDR-jei közül egyet vagy többet igénybe vegyünk. Amint azt fentebb ismertettük, a génsebészetileg átalakított ellenanyagok lehetnek neutralizáló hatásúak. Az ilyen, génsebészetileg átalakított ellenanyagok közé tartozhatnak Nogo elleni ellenanyag funkcionális fragmenseihez fúzionáltatott, kiválasztott humáneredetû immunglobulin vagy immunglobulin-szubtípus keretrégióit tartalmazó, humanizált ellenanyag, vagy humáneredetû nehéz és könnyû lánc konstans régiókat tartalmazó kiméra ellenanyag. Megfelelõ humáneredetû (vagy más állati eredetû) akceptor ellenanyag lehet szokásos adatbázisból, például KABAT® adatbázisból, Los Alamos adatbázisból és Swiss Protein adatbázisból választott ellenanyag, a donor ellenanyag nukleotid- és aminosavszekvenciájával való homológia alapján. A donor ellenanyag keretrégióival való homológiával jellemzett (aminosavak alapján), humáneredetû ellenanyag alkalmas lehet arra, hogy nehéz lánc konstans régiót és/vagy nehéz lánc variábilis keretrégiókat biztosítson a donor CDR¹ek inszertálása céljára. Könnyûlánc konstans vagy variábilis keretrégiók átadására alkalmas, megfelelõ akceptor ellenanyag hasonló módon választható. Meg kell jegyezzük, hogy a akceptor ellenanyag nehéz és könnyû láncai nem kell, hogy azonos akceptor ellenanyagból származzanak.
1
HU 008 119 T2
Elõnyösen, a heterológ keret- és konstans régiókat humáneredetû immunglobulin-osztályokból és izotípusok közül választjuk, például IgG (1–4 szubtípusok), IgM, IgA és IgE izotípusok közül. A akceptor ellenanyag azonban nem kell, hogy kizárólag humáneredetû immunglobulin proteinszekvenciákat tartalmazzon. Konstruálhatunk például gént, amelyben a humáneredetû immunglobulinlánc egy részét kódoló DNS-szekvenciát nem immunglobulin aminosavszekvenciát, például polipeptid effektor- vagy riportermolekulát kódoló DNS-szekvenciához fúzionáltatjuk. Elõnyösen, adott humanizált ellenanyagban a humáneredetû nehéz és könnyû láncok variábilis doménjeit egy vagy több CDR helyettesítésével génsebészetileg átalakítjuk. Lehetséges mind a hat CDR alkalmazása, vagy hatnál kevesebb CDR különbözõ kombinációinak az alkalmazása. Elõnyösen mind a hat CDR¹t helyettesítjük. Lehetséges a CDR¹ek helyettesítése kizárólag a humáneredetû nehéz láncban, és a humáneredetû, akceptor ellenanyagból származó, nem módosított könnyû lánc alkalmazása könnyû láncként. Más megoldás szerint, választható kompatibilis könnyû lánc más humáneredetû ellenanyagból, szokásos ellenanyag adatbázisok igénybevételével. A génsebészetileg átalakított ellenanyag fennmaradó része bármely megfelelõ befogadó humáneredetû immunglobulinból származtatható. A génsebészetileg átalakított, humanizált ellenanyag így elõnyösen a természetes humáneredetû ellenanyag szerkezetét, és a tulajdonságok olyan kombinációját mutatja, amely a hatékony terápiás alkalmazáshoz szükséges. Szakember számára érthetõ, hogy adott, génsebészetileg átalakított ellenanyag tovább módosítható a variábilis domén aminosavjainak a változtatásával anélkül, hogy szükségszerûen befolyásolnánk a donor ellenanyag (azaz egy analóg) specificitását és magas affinitását. Elõrebocsátjuk, hogy nehéz és könnyû lánc aminosavak helyettesíthetõk mind a variábilis domén keretekben, mind a CDR-ekben, vagy akár mindkettõben. Ezen túlmenõen, a konstans régió változtatható oly módon, hogy a találmány szerinti molekulák szelektív tulajdonságait fokozzuk vagy csökkentsük. Ilyenek például a dimerizáció, Fc¹receptorokhoz való kötõdés vagy a komplementkötés és ¹aktiválás tulajdonsága [lásd például Angal és munkatársai: Mol. Immunol. 30, 105–108 (1993); Xu és munkatársai: J. Biol. Chem. 269, 3469–3474 (1994); Winter és munkatársai: EP 307 434 B számú európai szabadalmi bejelentés]. Az olyan módosított ellenanyag, amely kiméra ellenanyag, abban különbözik a fentebb ismertetett, humanizált ellenanyagoktól, hogy a teljes, nem humáneredetû donor ellenanyag nehéz és könnyû lánc variábilis régiókat biztosítja, a keretrégiókat is beleértve, más fajból származó, elõnyösen minkét lánc esetében humáneredetû immunglobulin konstans régiókkal asszociáltan. Elõnyösen, megfelelõ donor monoklonális ellenanyagok variábilis könnyû és/vagy nehéz lánc szek-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 15
2
venciáit és CDR-jeit, és azok kódoló szekvenciáit alkalmazzuk a találmány szerinti módosított ellenanyagok, elõnyösen humanizált ellenanyagok elõállításához, az alábbi eljárás szerint. Ugyanezen vagy hasonló eljárások alkalmazhatók a találmány további megvalósítási módjainak az eléréséhez is. Kiválasztott donor monoklonális ellenanyagot szekretáló hibridómát szokásos eljárással klónoztunk, majd nehéz és könnyû lánc variábilis régiójuk DNS¹ét szakember számára ismert eljárásokkal kaptuk meg, például Sambrook és munkatársai, által ismertetett eljárásokkal [„Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]. Legalább a CDR¹t kódoló régiókat, valamint a befogadó monoklonális ellenanyag nehéz és/vagy könnyû lánc variábilis domén keretrégióknak a donor monoklonális ellenanyagkötõ specificitásának a megtartásához szükséges részeit tartalmazó variábilis nehéz és könnyû lánc régiókat, továbbá a humáneredetû immunglobulinból származó ellenanyaglánc fennmaradó, immunglobulin-eredetû részeit polinukleotid láncindító és vissza transzkriptáz alkalmazásával kaptuk meg. A CDR¹t kódoló régiót ismert adatbázis alkalmazásával és más ellenanyagokhoz történõ hasonlítással azonosítottuk. Ezt követõen, egér/humán kiméra ellenanyag állítható elõ és vizsgálható kötõdési tulajdonságára nézve. Az ilyen kiméra ellenanyag tartalmazza a teljes, nem humáneredetû donor ellenanyag VH és VL régióit, mindkét lánc esetében humáneredetû Ig konstans régiókkal asszociáltan. Humaneredetû ellenanyagból származó nehéz lánc variábilis régió homológ keretrégiói azonosíthatók számítógépes adatbázisok, például KABAT® adatbázis alkalmazásával, és a donor ellenanyaggal homológiát mutató egyik humáneredetû ellenanyagot választjuk ki akceptorellenanyagként. Megfelelõ könnyû lánc variábilis keretrégió hasonló módon tervezhetõ. Humanizált ellenanyag származtatható kiméra ellenanyagból, vagy elõnyösen, elõállítható szintetikusan oly módon, hogy a nehéz és könnyû láncokból származó, donor mAb eredetû, CDR-kódoló régiókat megfelelõen inszertáljuk a kiválasztott nehéz és könnyû lánc kereten belül. Más megoldás szerint, humanizált ellenanyagok elõállíthatók szokásos mutageneziseljárásokkal. Ennek megfelelõen, az így kapott humanizált ellenanyag humáneredetû keretrégiókat és donor mAb eredetû, CDR-kódoló régiókat tartalmaz. Elõfordulhat a keret csoportjainak ezt követõ manipulálása. Az így kapott humanizált ellenanyag expresszáltatható rekombináns gazdasejtekben, például COS¹, CHO- vagy mielómasejtekben. Szokásos expressziós vektort vagy rekombináns plazmidot állítunk elõ úgy, hogy az ellenanyagot kódoló szekvenciákat gazdasejtbe helyezzük, szokásos szabályozó kontrollszekvenciákkal operatív módon asszociáltan, amely kontrollszekvenciák irányítani képesek azok expresszióját és/vagy szekrécióját a gazdasejtben. Ilyen szabályozószekvenciák közé tartoznak promoterszekvenciák, például CMV promoter, és szignál-
1
HU 008 119 T2
szekvenciák, amelyek származtathatók más, ismert ellenanyagokból. Hasonlóképpen, elõállítható egy második expressziós vektor, amely olyan DNS-szekvenciát hordoz, amely komplementer ellenanyag nehéz vagy könnyû láncot kódol. Elõnyösen, a második expressziós vektor a kódolószekvenciákat és a szelekciós markereket nem számítva azonos az elsõvel, hogy a lehetõség szerint biztosítsuk, hogy mindegyik polipeptidlánc funkcionálisan expresszálódjon. Más megoldás szerint, a módosított ellenanyag nehéz és könnyû láncait kódoló szekvenciákat egyetlen vektor hordozza. Kiválasztott gazdasejtet szokásos eljárásokkal kotranszfektáltunk az elsõ és második vektorokkal (vagy egyszerûen csak egyetlen vektorral) abból a célból, hogy elõállítsuk mindkét, rekombináns vagy szintetikus nehéz és könnyû láncot tartalmazó transzfektált gazdasejtet. A transzfektált sejtet ezt követõen szokásos eljárásokkal tenyésztettük abból a célból, hogy elõállítsuk a találmány szerinti, génsebészetileg átalakított ellenanyagot. A tenyészetet megfelelõ vizsgálattal, például ELISA vagy RIA vizsgálattal szûrjük a rekombináns nehéz és/vagy könnyû láncot asszociáltan tartalmazó ellenanyagra nézve. Hasonló, szokásos eljárások alkalmazhatók más módosított ellenanyagok és molekulák elõállítására. Szakember kiválaszthatja a találmány szerinti készítmények elõállításához és a találmány szerinti eljárásokhoz alkalmazott klónozási és szubklónozási lépések céljára alkalmas, megfelelõ vektorokat. Alkalmazható például a szokásos pUC klónozási vektor sorozat. A pUC19 jelû egyik vektor kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ például az Amersham (Buckinghamshire, Egyesült Királyság) vagy Pharmacia (Uppsala, Svédország) cégektõl. Klónozáshoz bármely vektor alkalmazható, amely könnyen replikálódik, számos klónozóhelyet és szelektálható gént (például antibiotikumrezisztencia-gént) hordoz, és könnyen manipulálható. Ennek megfelelõen, a klónozási vektor kiválasztása a találmány megvalósítása során nem korlátozó tényezõ. Hasonlóképpen, szakember számos szokásos vektor közül választhatja ki az ellenanyagok expresszáltatása céljából alkalmazott vektorokat. A vektorok tartalmaznak továbbá választott szabályozószekvenciákat (például CMV vagy RSV promotereket), amelyek heterológ DNS-szekvenciák replikálódását és expresszálódását irányítják a választott gazdasejtben. Ezek a vektorok tartalmazzák az ellenanyagot vagy módosított immunglobulint kódoló, fenti DNS-szekvenciákat. Ezen túlmenõen, a vektorok tartalmazhatnak olyan választott immunglobulin-szekvenciákat, amelyeket kívánt restrikciós helyek inszertálásával módosítottunk, a célszerû manipulálhatóság érdekében. Az expressziós vektorokat jellemezhetik továbbá olyan gének, amelyek alkalmasak a heterológ DNSszekvenciák expresszálódásának az amplifikálására, mint például az emlõseredetû dihidrofolát-reduktáz gén (DHFR). További elõnyös vektorszekvencia lehet poli¹A szignálszekvencia, amely származhat például szarvasmarha-eredetû növekedési hormonból („bovine growth hormone”, BHG) vagy a bétaglobin promoter-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 16
2
szekvencia (betaglopro). A találmány szerint elõnyösen alkalmazható expressziós vektorok szakember számára jól ismert eljárásokkal szintetizálhatók. Az ilyen vektorok összetevõi, például replikonok, szelekciós gének, enhancerek, promoterek, szignálszekvenciák és hasonlók beszerezhetõk kereskedelmi vagy természetes forrásból, vagy ismert eljárásokkal szintetizálhatók, rekombináns DNS-termékének, választott gazdában történõ expresszáltatása és/vagy szekretáltatása céljából. Választhatók továbbá más megfelelõ expressziós vektorok, amelyek számos típusa szakember számára jól ismert, például emlõsben, baktériumban, rovarban, élesztõben és gombában történõ expresszáltatás céljára. A találmány tárgyát képezi továbbá az ellenanyagokat vagy azok módosított immunglobulin-molekuláit kódoló szekvenciákat tartalmazó, rekombináns plazmiddal transzfektált sejtvonal. Klónozásra és más manipulációkra alkalmas klónozóvektorok szintén a szokásosak. Legelõnyösebben azonban különbözõ E. coli-törzsek sejtjei alkalmasak klónozóvektorok replikációjára és a találmány szerinti módosított ellenanyagok elõállításának a lépéseihez. A találmány szerinti ellenanyagok expresszáltatására megfelelõ gazdasejtek vagy gazdasejtvonalak elõnyösen olyan emlõssejtek, mint például NSO¹, Sp2/0, CHO- (például DG44), COS¹, fibroblaszt sejtek (például 3T3) és mielómasejtek, és elõnyösebben CHO- vagy mielómasejtek. Alkalmazhatók humáneredetû sejtek, amelyek lehetõvé teszik a molekula módosítását humán glikozilezési mintázattal. Más megoldás szerint, alkalmazhatók további eukarióta sejtek. Megfelelõ emlõseredetû gazdasejtek kiválasztása és eljárások transzformálásukra, tenyésztésükre, amplifikálásukra, szûrésükre, valamint termékük elõállítására és tisztítására a szakirodalomban hozzáférhetõk. Lásd például Sambrook és munkatársai, amelyet fentebb idéztünk. A találmány szerinti rekombináns Fab-molekulák expresszáltatására alkalmas gazdasejtekként elõnyösen alkalmazhatók baktériumsejtek [lásd például Plückthun A.: Immunol. Rev. 130, 151–188 992)]. Azonban, mivel baktériumsejtekben expresszálódott proteinek hajlamosak nem hajtogatódott, helytelenül hajtogatódott, vagy nem glikozilezett formában termelõdni, baktériumban elõállított minden Fab terméket szûrni kell antigénkötõ tulajdonságának megtartására nézve. Ha a baktériumsejtben expresszált molekula helyesen hajtogatódva termelõdött, az a baktériumsejt elõnyös gazdának minõsül. Például, expresszáltatásra alkalmazott, különbözõ E. coli-törzsek jól ismertek mint gazdasejtek a biotechnológia területén. A találmány szerinti eljárásban alkalmazhatók továbbá például B. subtilis vagy Streptomyces organizmusok, valamint más bacillusok és hasonlók. Kívánt esetben, szakember számára ismert élesztõsejtek is hozzáférhetõk, mint gazdasejtek, valamint rovarsejtek, például Drosophila és Lepidoptera sejtek, továbbá virális expressziós rendszerek. Lásd például Miller és munkatársai: Genetic Engineering 8,
1
HU 008 119 T2
277–298 Plenum Press (1986), és az abban idézett irodalomjegyzéket. Az általános eljárások, amelyek révén a vektorok elõállíthatók, a találmány szerinti gazdasejtek elõállításához szükséges transzfekciós eljárások és a találmány szerinti ellenanyag ilyen sejtekben történõ elõállításához szükséges tenyésztési eljárások mindegyike szokásos eljárás. A találmány szerinti tenyésztési eljárás jellemzõen szérummentes tenyésztési eljárás, amely sejtek szérummentes közegben, szuszpenzióban történõ tenyésztését jelenti. Hasonlóképpen, a találmány szerinti ellenanyagok, elõállításukat követõen, a technika állása szerinti, szokásos eljárásokkal tisztíthatók a sejttenyészet tartalmából, például ammóniumszulfátos kicsapással, affinitásoszlopokon, oszlopkromatográfiás, gélelektroforézis és hasonló eljárásokkal. Az ilyen eljárások szakember számára ismertek, és nem korlátozzák a találmány gyakorlatba vételét. Módosított ellenanyagok elõállítását ismertetetik például a WO 99/58679 és WO 96/16990 számú nemzetközi közzétételi iratok. Ellenanyagok expresszáltatásának egy további eljárása transzgén állatban történõ expresszáltatást alkalmaz, például amint azt az US 4 873 316 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti. Ez a szabadalmi leírás az állat kazeinpromoterét alkalmazó expressziós rendszert ismertet, amely transzgenikusan emlõsbe inszertálva lehetõvé teszi, hogy adott nõstény állat a kívánt rekombináns proteint tejével szekretálja. Kívánt eljárással történõ expresszáltatást követõen, az ellenanyag megfelelõ vizsgálat alkalmazásával ellenõrizhetõ in vitro aktivitásra nézve. Jelenleg szokásos ELISA vizsgálatok alkalmazhatók az ellenanyag Nogo-proteinhez történõ kvalitatív és kvantitatív kötõdésének az értékelésére. Ezen túlmenõen, további in vitro vizsgálatok alkalmazhatók a neutralizálás hatékonyságának az igazolására, mielõtt emberekben klinikai kipróbálást végeznénk annak értékelése céljából, hogyan perzisztál az ellenanyag a szervezetben, a szokásos kiürülési mechanizmusok ellenére. A találmány szerinti terápiás ágensek beadhatók megelõzés céljából akár a stroke eseményt, akár a klinikai tünetek megjelenését követõen, vagy ahogy a szükség kívánja. A kezelés dózisa és idõtartama a találmány szerinti molekulák emberi keringésben való relatív fennmaradásától függ, és azt szakember a beteg általános állapotának és a kezelt állapotnak megfelelõen állíthatja be. Feltételezhetõ, hogy maximális terápiás hatékonyság hosszú idõtartam alatt (például 4–6 hónap) végzett ismételt beadás (például hetente egyszer vagy kéthetente egyszer) során érhetõ el. A találmány szerinti terápiás ágens beadási módja bármely úton történhet, amely alkalmas arra, hogy az ágenst a gazdába juttassa. A találmány szerinti antagonisták és ellenanyagok, valamint gyógyászati készítmények elõnyösen parenterális beadásra alkalmasak, azaz szubkután, intratekális, intraperitoneális, intramuszkuláris, intravénás, intranazális alkalmazásra, amelyek közül különösen elõnyös az intravénás beadás.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 17
2
A találmány szerinti terápiás ágensek elõállíthatók gyógyászati készítményként, amelyek aktív hatóanyagként a találmány szerinti ellenanyag hatékony mennyiségét tartalmazzák, gyógyászatilag elfogadható vivõanyagban. A találmány szerinti profilaktikus készítmény esetében elõnyös a génsebészetileg átalakított ellenanyagot tartalmazó, injektálásra kész formájú vizes szuszpenzió vagy oldat, elõnyösen fiziológiás pH¹értékre pufferezve. A parenterális beadásra alkalmas készítmények általában tartalmazzák a találmány szerinti ellenanyag oldatát vagy annak gyógyászatilag elfogadható vivõanyagban, elõnyösen vizes hordozóban oldott elegyét. Számos vizes hordozó alkalmazható, például 0,9%¹os konyhasóoldat, 0,3%¹os glicin és hasonlók. Ezek az oldatok sterilek és általában szemcsés anyagtól mentesek. Az oldatok szokásos, jól ismert eljárásokkal sterilezhetõk (például szûréssel). A készítmények szükség szerint tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható, kiegészítõ anyagokat a fiziológiai körülmények beállításához, például pH¹t beállító és pufferezõágenseket és hasonlókat. Az ilyen gyógyhatású készítményben a találmány szerinti antagonista vagy ellenanyag koncentrációja nagymértékben változhat, tömeg szerint lehet például kevesebb mint 0,5%¹os, általában legalább 1%¹os vagy 1%¹os körüli, vagy akár 15–20%¹os, és a koncentráció megválasztása elsõsorban folyadéktérfogatoktól, viszkozitásoktól és hasonlóktól függ, a választott beadási módnak megfelelõen. Ennek megfelelõen, intramuszkuláris injektálás céljára kiszerelt, találmány szerinti gyógyászati készítmény 1 ml steril pufferezett vizet és körülbelül 1 ng–100 mg, például körülbelül 50 ng–30 mg, vagy elõnyösebben körülbelül 5–25 mg találmány szerinti ellenanyagot tartalmaz. Hasonlóképpen, intravénás injektálás céljára kiszerelt, találmány szerinti gyógyászati készítmény körülbelül 250 ml steril pufferezett Ringeroldatot és körülbelül 1 ng–100 mg, például körülbelül 1–30 mg, vagy elõnyösebben körülbelül 5–25 mg találmány szerinti, génsebészetileg átalakított ellenanyagot tartalmaz. Parenterálisan beadható készítmények elõállítására alkalmas jelenlegi eljárások jól ismertek és szakember számára nyilvánvalóak, és ilyeneket részletesen ismertet például a „Remington’s Pharmaceutical Science” kiadvány, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. A találmány szerinti, intravénásan beadható ellenanyag-készítmények elõállítását lásd például Lasmar U. and Parkins D.: „The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci. Tech. Today, 3, 129–137, (2000 április 3.); Wang W.: „Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm. 185, 129–188 (1999); „Stability of Protein Pharmaceuticals” A és B kötet, szerk: Ahem T. J., Manning M. C., New York, N. Y. Plenum Press (1992); Akers M. J.: „Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J. Pharm. Sci. 91, 2283–2300 (2002); Imamura K. és munkatársai: „Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci. 92, 266–274 (2003); Izutsu, Kkojima S: „Excipient crystalinity and its proteinst-
1
HU 008 119 T2
ructure-stabilizing effect during freeze-drying”, J. Pharm. Pharmacol., 54, 1033–1039 (2002); Johnson R.: „Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization”, J. Pharm. Sci. 91, 914–922 (2002); Ha E., Wang W., Wang Y. j „Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J. Pharm. Sci. 91, 2252–2264, (2002), amely szakirodalmi helyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik, és amelyeket különösen az olvasó figyelmébe ajánlunk. Elõnyös, ha a gyógyászati készítményben kiszerelt, találmány szerinti terápiás ágens dózis-egység adagban van jelen. A megfelelõ, terápiásan hatékony dózist szakember könnyen meghatározhatja. Stroke vagy más, alábbiakban ismertetett emberi neurológiai betegségek hatékony kezelésére a találmány szerinti ellenanyag legfeljebb 700 mg¹ját kell adagolni, 70 kg testtömegre vonatkoztatva, parenterálisan, elõnyösen intravénásan (iv.) vagy intramuszkulárisan (i.m). Szükség esetén ez az adag, az orvos belátása szerint, megfelelõ idõközönként ismételhetõ. Amint azt a példákban ismertetjük, funkcionális javulásra gyakorolt pozitív hatást tudtunk kimutatni patkánymodellben, amikor a találmány szerinti ellenanyagokat intravénásan adagoltuk. A leírásban ismertetett ellenanyagok tárolás céljából liofilezhetõk, majd az alkalmazás elõtt megfelelõ vivõanyagban rekonstituálhatók. Ez az eljárás szokásos immunglobulinok esetében hatékonynak mutatkozik, és a technika állása szerinti liofilezési és rekonstituálási eljárások alkalmazhatók. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók neurotróf faktorral, például ideg növekedési faktorral („nerve growth factor”, NGF), például agyeredetû neurotróf faktorral („brain derived neurotroph factor”, BDNF), gyulladásgátló ágensekkel, például kortikoszteroidokkal és/vagy tPA-val kombinálva (azaz szimultán, egymást követõen vagy külön). A találmány szerinti NogoA elleni ellenanyag és például tPA kombinációja értékelhetõ az alább ismertetett példa szerinti, középagyi artériaelzáródás („middle cerebral artery occlusion”, MCAO) modellben. Egy további szempont szerint, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti NogoA elleni ellenanyagot, vagy funkcionális fragmensét vagy analógját, továbbá gyógyászatilag elfogadható hígítószert vagy vivõanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény. A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti NogoA elleni ellenanyagot, vagy funkcionális fragmensét, továbbá gyógyászatilag elfogadható hígítószert vagy vivõanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény, stroke vagy más neurológiai betegségben szenvedõ, vagy azok kockázatának kitett humán betegekben neurodegeneráció gátlására és/vagy funkcionális javulás elõsegítésére. A találmány szerinti funkcionális ellenanyagfragmens és/vagy analógja alkalmazható emberben stroke (elsõsorban ischaemiás stroke) és más, alább ismertetett neurológiai betegségek/rendellenességek, elsõsorban Alzheimer-kór kezelési és megelõzési eljárásában, amely eljárás tartalmazza NogoA elleni ellenanyag vagy funkcionális fragmense vagy analógja hatékony
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 18
2
mennyiségének a beadását arra rászoruló egyénnek. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók kezelési eljárásokban Alzheimer-kór kialakulásának és/vagy progressziójának a megállítására vagy lassítására azon túlmenõen (vagy annak alternatívájaként), hogy alkalmasak már kialakult betegség kezelésére humán betegben. A találmány tárgyát képezi továbbá NogoA elleni ellenanyag vagy funkcionális fragmense vagy analógja alkalmazása stroke és más, alább ismertetett neurológiai betegségek/rendellenességek, elsõsorban Alzheimer-kór kezelésére és megelõzésére alkalmas gyógyszer elõállítására. A találmány szerinti funkcionális ellenanyagfragmens és/vagy analógja alkalmazható emberben stroke (elsõsorban ischaemiás stroke) és más, alább ismertetett neurológiai betegségek/rendellenességek, elsõsorban Alzheimer-kór esetében neurodegeneráció gátlásának és/vagy funkcionális javulás elõsegítésének az eljárásában, amely eljárás tartalmazza NogoA elleni ellenanyag vagy funkcionális fragmense vagy analógja hatékony mennyiségének a beadását arra rászoruló egyénnek. Ezen túlmenõen, a találmány tárgyát képezi NogoA elleni ellenanyag vagy funkcionális fragmense vagy analógja alkalmazása gyógyszer elõállítására, amely gyógyszer alkalmas stroke (elsõsorban ischaemiás stroke) és más, alább ismertetett neurológiai betegségekben/rendellenességekben, elsõsorban Alzheimerkórban szenvedõ, vagy azok kockázatának kitett humán betegek esetében neurodegeneráció gátlására és/vagy funkcionális javulás elõsegítésére. A fenti neurológiai betegségek és rendellenességek közé tartoznak a korlátozás szándéka nélkül a traumás agy- és gerincvelõ-károsodás, frontotemporális demenciák (tauopátiák), perifériás neuropátia, Parkinsonkór, Huntington-kór, sclerosis multiplex, és különösen az Alzheimer-kór. A találmány tárgyát képezi továbbá in vitro eljárás axonsarjadzás elõsegítésére, amely eljárás tartalmazza humáneredetû axon érintkeztetését NogoA elleni ellenanyaggal. A leírásban „funkcionális javulás” kifejezés alatt motorikus és/vagy érzékelõ és/vagy viselkedési javulást értjük adott alanyban, ischaemiás eseményt vagy károsodást vagy klinikai tünetek fellépését követõen. Emberben a funkcionális javulás értékelése elemi neurológiai funkciók, mint például motorikus erõ, érzékelés és koordináció, kognitív funkciók, például memória, nyelvhasználat és utasítások követése, és funkcionális készségek, például a napi életvitel alapvetõ aktivitásai vagy eszközhasználat mérésére tervezett eszközökkel lehetséges. Elemi neurológiai funkciók javulása mérhetõ olyan eszközökkel, mint például a NIH Stroke Scale (NIHSS), kognitív funkció javulása mérhetõ neurofiziológiai tesztekkel, mint például a Boston Naming Test, Trail-making Test és California Verbal Learning Test, és a napi életvitelbeli aktivitások mérhetõk olyan eszközökkel, mint például az ADCS/ADL („Alzheime’s Disease Clinical Studies/Activities of Daily Living”) táblá-
1
HU 008 119 T2
zat vagy a Bristol Activities of Daily Living Scale, amely tesztek szakember számára mind jól ismertek. Az alábbi példák a korlátozás szándéka nélkül illusztrálják a találmányt. Példák 1. példa: Hibridómák elõállítása és szelektálása A NogoA elleni monoklonális ellenanyagokat hibridómák állítják elõ, amelyek egéreredetû mielómasejtek és a célantigénnel immunizált egerekbõl származó B¹limfociták fúziójának az eredménye. A hibridómasejtet a mielóma fúziós partner immortalizálja, míg az ellenanyagtermelés tulajdonságot a B¹limfocita partner biztosítja. Mindegyik hibridómasejt kizárólag egy, egyedi specificitású, egyedi ellenanyagot állít elõ, innen ered a monoklonális kifejezés. SJL egereket immunizáltunk 10 mg összes proteinnel [1:1 arányban humáneredetû NogoA szakasz (186–1004 aminosavak) és patkányeredetû NogoA szakasz (173–975 aminosavak), amelyet GST fúziós protein formájában állítottunk elõ E. coli BL21-ben], szubkután úton, CFA és RIBI adjuvánsok alkalmazásával. Ezt követõen az egereket 4 és 8 nap elteltével ugyanezen proteinek 5 mg-jával emlékeztetõ oltásban részesítettük, RIBI adjuváns alkalmazásával. További három nap elteltével, immunsejteket gyûjtöttünk a regionális nyirokcsomókból, és PEG 1500 alkalmazásával fuzionáltattuk azokat mielómasejtekkel, abból a célból, hogy hibridómákat állítsunk elõ. Az egyedi hibridóma-sejtvonalakat határhígításos eljárással kétszer klónoztuk. Azáltal, hogy az egereket humáneredetû és patkányeredetû NogoA-val egyaránt immunizáltuk, olyan ellenanyagokat kaptunk, amelyek jó kötõdési specificitást és/vagy kötõdési affinitást mutattak mind patkányeredetû, mind humáneredetû NogoA ellen. Ez lehetõvé tette az ellenanyagok értékelését patkányban és/vagy rágcsálómodellben, mielõtt azt embernek beadjuk. A hibridóma ellenanyagok kezdeti szelektálása mikrotitrálólemezeken Nogo protein(ek)hez történõ kötõdés alapján történt. Ezt követõen körülbelül 60 hibridómát választottunk ki oldott protein (GST félrõl Prescission™ proteázzal lehasított, humáneredetû NogoA) azon tulajdonsága alapján, hogy ELISA vizsgálatban verseng a fenti kötõdéssel.
2
2. példa: A variábilis régiók klónozása A kiválasztott 2A10/3, 2C4/1 és 15C3/3 hibridómasejtekbõl teljes RNS¹t vontunk ki, majd ezt követõen vissza transzkripció és polimeráz-láncreakció (RT5 PCR) révén kivontuk a nehéz és könnyû lánc variábilis domén cDNS-szekvenciákat. Az RT¹PCR eljáráshoz az elõre láncindító oligonukleotid egéreredetû immunglobulingén vezetõszekvenciákra specifikus, degenerált láncindító oligonukleotidok elegye volt, míg a 10 vissza láncindító oligonukleotid a konstans régiók ellen irányuló, izotípusra specifikus ellenanyag volt. A PCRláncindító oligonukleotidokat úgy terveztük meg, hogy 5’ restrikciós enzim felismerõ helyeket hordozzanak, amelyek lehetõvé teszik, hogy azokat szekvenálás cél15 jából pUC19 vektorba klónozzuk. RNS kivonása A teljes RNS¹t az egyes hibridóma klónok 106 sejtet tartalmazó üledékébõl vontuk ki SV Total Isolation Sys20 tem (Promega) alkalmazásával, a gyártó utasításait követve.
25
30
35
40
Vissza transzkripció Az RNS¹t vissza transzkripcióval átírtuk abból a célból, hogy elõállítsuk a nehéz és könnyû lánc variábilis doménok cDNS¹ét, az egéreredetû vezetõszekvenciákra specifikus elõre láncindító oligonukleotidok, valamint egéreredetû IgGK konstans régiók ellen irányuló vissza láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. A 2C4/1 és 15C3/3 hibridómák esetében IgGg1 vissza láncindító oligonukleotidot, a 2A10/3 esetében IgGg2b vissza láncindító oligonukleotidot alkalmaztunk. A elõre láncindító oligonukleotidok 5’¹végükön egy SalI restrikciós enzim felismerõ helyet hordoznak, amelyhez 5’¹irányban négy további nukleotid van toldva a hatékony restrikciós emésztés érdekében. Ezeket a láncindító oligonukleotidokat Jones S. T. és Bending M. M. nyomán alkalmaztuk [Biotechnology 9, 88–89 (1991)]. A vissza láncindító oligonukleotidok 5’¹végükön XmaI restrikciós enzim felismerõ helyet és további négy fölös nukleotidot hordoznak.
Láncindító oligonukleotidok: Egéreredetû VH vezetõszekvencia elõre láncindító 45 oligonukleotidok:
AG77: 5’-ACT AGT CGA CAT GAA ATG CAG CTG GGT CAT STT CTT C-3’ (SEQ ID NO 51)
AG78: 5’-ACT AGT CGA CAT GGG ATG GAG CTR TAT CAT SYT CTT-3’ (SEQ ID NO 52)
AG79: 5’-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GTT AAA CTG GGT TTT T-3’ (SEQ ID NO 53)
AG80: 5’-ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT-3’ (SEQ ID NO 54)
AG81: 5’-ACT AGT CGA CAT GGA CTC CAG GCT CAA TTT AGT TTT CCT T-3’ (SEQ ID NO 55)
AG82: 5’-ACT AGT CGA CAT GGC TGT CYT RGS GCT RCT CTT CTG C-3’ (SEQ ID NO 56)
AG83: 5’-ACT AGT CGA CAT GGR ATG GAG CKG GRT CTT TMT CTT-3’ (SEQ ID NO 57) 19
1
HU 008 119 T2
2
AG84: 5’-ACT AGT CGA CAT GAG AGT GCT GAT TCT TTT GTG-3’ (SEQ ID NO 58)
AG85: 5’-ACT AGT CGA CAT GGM TTG GGT GTG GAM CTT GCT ATT CCT G-3’ (SEQ ID NO 59)
AG86: 5’-ACT AGT CGA CAT GGG CAG ACT TAC ATT CTC ATT CCT G-3’ (SEQ ID NO 60)
AG87: 5’-ACT AGT CGA CAT GGA TTT TGG GCT GAT TTT TTT TAT TG-3’ (SEQ ID NO 61)
AG89: 5’-ACT AGT CGA CAT GAT GGT GTT AAG TCT TCT GTA CCT G-3’ (SEQ ID NO 62) Egéreredetû VL vezetõszekvencia elõre láncindító oligonukleotidok:
AG90: 5’-ACT AGT CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT G-3’ (SEQ ID NO 63)
AG91: 5’-ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT-3’ (SEQ ID NO 64)
AG92: 5’-ACT AGT CGA CAT GAG TGT GCT CAC TCA GGT CCT GGC GTT G-3’ (SEQ ID NO 65)
AG93: 5’-ACT AGT CGA CAT GAG GRC CCC TGC TCA GWT TYT TGG MWT CTT G-3’ (SEQ ID NO 66)
AG94: 5’-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C-3’ (SEQ ID NO 67)
AG95: 5’-ACT AGT CGA CAT GAG GTK CYY TGY TSA GYT YCT GRG G-3’ (SEQ ID NO 68)
AG96: 5’-ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCW GG-3’ (SEQ ID NO 69)
AG97: 5’-ACT AGT CGA CAT GTG GGG AYC TKT TTY CMM TTT TTC AAT TG-3’ (SEQ ID NO 70)
AG98: 5’-ACT AGT CGA CAT GGT RTC CWC ASC TCA GTT CCT TG-3’ (SEQ ID NO 71)
AG99: 5’-ACT AGT CGA CAT GTA TAT ATG TTT GTT GTC TAT TTC T-3’ (SEQ ID NO 72)
AG100: 5’-ACT AGT CGA CAT GGA AGC CCC AGC TCA GCT TCT CTT CC-3’ (SEQ ID NO 73)
MKV12: 5’-ACT AGT CGA CAT GAA GTT TCC TTC TCA ACT TCT GCT C-3’ (SEQ ID NO 74) Egéreredetû g1 konstans régió vissza láncindító oligonukleotid:
40
AG102: 5’-GGA TCC CGG GCC AGT GGA TAG ACA GAT G-3’ (SEQ ID NO 75) Egéreredetû g2b konstans régió vissza láncindító oligonukleotid:
AG104: 5’-GGA TCC CGG GAG TGG ATA GAC TGA TGG-3’ (SEQ ID NO 76) Egéreredetû k konstans régió vissza láncindító oligonukleotid:
AG101: 5’-GGA TCC CGG GTG GAT GGT GGG AAG ATG-3’ (SEQ ID NO 77) Az egéreredetû V H vagy VL vezetõszekvencia elõre láncindító oligonukleotidok elegyeit 50 mmol/l koncentrációban állítottuk elõ. Az egéreredetû g
60
20
vagy k konstans régió vissza láncindító oligonukleotidokat szintén 50 mmol/l koncentrációban állítottuk elõ.
1
HU 008 119 T2
Reverz transzkriptáz PCR (RT-PCR) A nehéz és könnyû lánc variábilis régiókat kódoló RNS vissza transzkripcióval történõ átírását két párhuzamossal végeztük Access RT¹PCR System (Promega) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. Körülbelül 200 ng RNS¹t alkalmaztunk 50 ml reakcióelegyben, amely a készlettel szállított RT¹PCR puffert, 0,2 mmol/l dNTP reagenseket, az egyes láncindító oligonukleotid sorozatok 1 mmol/l mennyiségét, 1 mmol/l MgSO4-reagenst és AMV Reverz transzkriptáz és Tfl DNS-polimeráz egyenként 5 E mennyiségét tartalmazta. Az alábbi RT¹PCR-ciklust alkalmaztuk: 1. 48 °C, 45 percen át, 2. 94 °C, 2 percen át, 3. 94 °C, 30 másodpercen át, 4. 50 °C, 1 percen át, 5. 68 °C, 2 percen át, 6. 68 °C, 7 percen át. A 3–5. lépéseket harmincszor ismételtük. pUC19 klónozás A variábilis régió RT¹PCR termékeket Qiagen MinElute Qiagen PCR Purification készlet alkalmazásával tisztítottuk az utasítások szerint, majd ezt követõen XmaI és SalI (New England Biolabs) enzimekkel emésztettük a gyártó utasításai szerint. A mintákat ezt követõen 0,5% etídium-bromidot tartalmazó, 1%¹os preparatív agarózgélre vittük fel és TAE-puffer-közegben futtattuk 50 mA mellett, 1 órán át, majd a V¹régió csíkokat ultraibolya fény alatt kivágtuk. A gélbõl a DNS-fragmenseket MinElute Gel (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk, a gyártó utasításai szerint. pUC19 vektorkarokat úgy állítottunk elõ, hogy pUC19 vektort SalI és XmaI enzimekkel emésztettünk, majd MinElute Reaction Clean Up készlet (Qiagen) alkalmazásával megtisztítottuk és Shrimp alkalikus foszfatázzal (USB) defoszforileztük, a gyártó utasításai szerint. A vektorkarok és a V¹régió fragmensek
5
2
koncentrációját 1%¹os agaróz/etídium-bromid analitikai gélen történõ becsléssel határoztuk meg, 1:2 moláris arányban elegyítettük és Promega Quick Ligation készlet alkalmazásával ligáltuk, a gyártó utasításainak megfelelõen. A ligáit plazmidokat DH5a sejtekbe (Invitrogen) transzformáltuk, a forgalmazó utasításai szerint. DNS-szekvencia-vizsgálat céljára ampicillint (100 mg/ml) tartalmazó L¹agar-lemezeken kinõtt telepeket szelektáltunk
10
15
20
25
30
35
Variábilis régió szekvenálása A telepeket éjszakán át, 37 °C¹on tenyésztettük ampicillinnel (100 mg/ml) kiegészített, 5 ml LB tápközegben, majd a plazmid-DNS¹t QIAprep Spin Miniprep készlet (Qiagen) alkalmazásával vontuk ki, a gyártó utasításai szerint. A VH és VL régiókat szokásos M13 elõre és vissza láncindító oligonukleotidok alkalmazásával szekvenáltuk. A szekvenciameghatározások eredményét a SEQ ID NO 43–48 szerinti szekvenciák mutatják. 3. példa: NogoA elleni rekombináns ellenanyagok Egéreredetû 2a/k konstans régiót hordozó rekombináns ellenanyagokat tudtunk tisztítani egéreredetû IgG2a/k konstans régió génszegmensekbe klónozott nehéz és könnyû lánc variábilis régiókat tartalmazó plazmidokkal transzfektált sejtekbõl. A klónozott, egéreredetû V¹régiókat PCR-eljárással amplifikáltuk abból a célból, hogy olyan restrikciós helyeket vigyünk be, amelyek Rld és Rln emlõseredetû expressziós vektorokban történõ klónozásukhoz szükségesek. Hind III és Spe I hasítási helyeket terveztünk keretbe VH doménnal abból a célból, hogy lehetõvé váljon a klónozás egéreredetû g2a konstans régiót tartalmazó, módosított Rld vektorban. Hind III és BsiW I hasítási helyeket terveztünk keretbe VL doménnal abból a célból, hogy lehetõvé váljon a klónozás egéreredetû k konstans régiót tartalmazó, módosított Rln vektorban.
PCR-láncindító oligonukleotidok 2A10 VH elõre láncindító oligonukleotid:
5’-ACTCATAAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAG-3’ (SEQ ID NO: 78) VH vissza láncindító oligonukleotid:
5’-ACTATGACTAGTGTGCCTTGGCCCCAGTAG-3’ (SEQ ID NO 79) VL elõre láncindító oligonukleotid:
5’-ACTCATAAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTG-3’ (SEQ ID NO 80) VL vissza láncindító oligonukleotid
5’-ACTATGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG-3’ (SEQ ID NO 81) A PCR-eljárást Hercules készülékkel (Stratagene) végeztük a gyártó utasításai szerint, 50 ml térfogatban, amely V¹régiót tartalmazó pUC19 miniprep készítmény körülbelül 10 ng mennyiségét, 2% DMSO-reagenst, 400 mmol/l dNTP reagenseket, az egyes láncin- 60 21
dító oligonukleotidok 1 mmol/l mennyiségét és a szállított puffert tartalmazta. Az alábbi PCR-ciklust alkalmaztuk: 1. 95 °C, 2 percen át, 2. 95 °C, 1 percen át,
1
HU 008 119 T2
3. 56 °C, 1 percen át, 4. 72 °C, 1 percen át, A 2–4. lépéseket harmincszor ismételtük. Klónozás expressziós vektorokba A PCR-termékeket MinElute PCR Purification készlet (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk, a gyártó utasításai szerint. A VH PCR-terméket és Rld (IgG2a) emlõseredetû expressziós vektort Hind III és Spe I enzimekkel emésztettük. A VL PCR-terméket és Rln (k) emlõseredetû expressziós vektort Hind III és BsiW I enzimek-
5
10
kel (NEB) emésztettük, a gyártó utasításai szerint. Az inszertekhez a vektorokat 2:1 moláris arányban ligáltuk, Promega Quick Ligation készlet alkalmazásával. A ligációs elegyeket DH5a sejtekbe transzfektáltuk, ampicillinre szelektálás mellett tenyésztettük, és a kinõtt telepek DNS-szekvenciáját ellenõriztük. Rekombináns. 2A10/3 NogoA elleni ellenanyag szekvenálása A 2A10 nehéz lánc szekvenciája a Hind III és EcoRI klónozóhelyek között az alábbinak adódott:
AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGC AGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAAC TGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTAC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGG CCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACA ATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTA TTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACCG TCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTG TGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGG TTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTC AGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCAC CTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTG AGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCA CCTAACCTCCTGGGTGGCCCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAA GGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGG ATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAAC GTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAG TACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGA GTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCC ATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGT ATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTC TGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGG ACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCT GGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGA AGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGT CTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATG AGAATTC (SEQ ID NO 49) A 2A10 nehéz lánc szekvenciája a Hind III és EcoRI klónozóhelyek között az alábbinak adódott:
45
AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTT CTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCT CCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT AAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCA GAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTG CATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTG TCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGG AGCTGAAACGTACGGATGCTGCACCGACTGTATCCATCTTCCCACCATCC AGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAA CTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAAC GACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGC ACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACG 22
2
1
HU 008 119 T2
2
ACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCA TTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAAGAATTC (SEQ ID NO: 50) A 2A10 egyik kiméráját szintén elõállítottuk, amelyre a leírásban HcLc néven utalunk.
5
4. példa: Egéreredetû, NogoA elleni ellenanyag kötõdik humáneredetû NOGO-A56 proteinhez GST-humáneredetû NOGO-A56 fúziós proteinnel 10 (50 mg/ml, 10 mmol/l Tris-pufferben, pH=9,5) fedtünk Nunc Immunosorp lemezeket (100 ml/vályulat), éjszakán át, 4 °C¹on. A vályulatokat egyszer mostuk PBSpufferrel, majd egy órán át, szobahõmérsékleten inkubáltuk 1%¹os BSA-oldattal, a nemspecifikus kötõhelyek 15 blokkolása céljából. Az ellenanyagokat PBS-pufferrel 2 mg/ml koncentrációra állítottuk be, majd ebbõl háromszoros tovafutó hígítást állítottunk elõ. Az ellenanyagokat három párhuzamossal bemértük a vályulatokba és éjszakán át, 4 °C¹on inkubáltuk. A lemezeket három- 20 szor mostuk, majd tormaperoxidázzal jelölt, egéreredetû Ig elleni konjugátummal („Anti-Mouse-HRPO”, 1:1000) inkubáltuk 1 órán át. A lemezeket ötször mostuk PBS-pufferrel, majd 10 percen át TMB-szubsztrát-
tal (Sigma, 100 ml/vályulat) inkubáltuk. A színreakciót 50 ml tömény sósavval állítottuk le. Az optikai denzitást 450 nm hullámhosszon mértük, lemezleolvasó készüléken. Az ellenanyagot nem tartalmazó vályulatok háttérértékeit kivontuk. A 8. ábra mindhárom, 2A10, 2C4 és 15C3 monoklonális ellenanyag dózisfüggõ kötõdését mutatja humáneredetû NOGO-A56 fúziós proteinhez, ELISA-eljárással. Az Y tengely a 450 nm hullámhosszon mért optikai denzitást (OD) mutatja, amely a vályulatokban befogott ellenanyag kvantitatív jellemzõje. Az X tengely az alkalmazott ellenanyag koncentrációját (ng/ml) mutatja az adott mérési pontban. Adott koncentrációtartományban a 2A10 ellenanyag mutatja a legerõsebb szignált, ami humáneredetû NogoA elleni magasabb affinitásra utal. 5. példa: Gátló hatású NogoA-fragmens (NOGOA56, SEQ ID NO 87) elõállítása A humáneredetû NogoA 586–785 aminosavjait kódoló cDNS-szekvenciát
[MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSV NYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKE TKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETV MLVKESLTETSFESMIEYENKE (SEQ. ID. NO.: 87)] pGEX-6P1 plazmid BamHI–XhoI helyeibe klónoztuk abból a célból, hogy GST-toldalékkal ellátott fúziós proteint állítsunk elõ, amelyet NOGO-A56-nak neveztünk el. A plazmidot 100 mg/ml ampicillinnel kiegészített 2XTY tápközegben tenyésztett BL21-sejtekben expresszáltattuk, IPTG-vel történt indukciót követõen (0,5 mmol/l, 37 °C¹on, 3 órán át). A sejtüledékeket ultrahangos kezeléssel lizáltuk és a fúziós proteint Glutathion-sepharose (Amersham Pharmacia) gyanta alkalmazásával tisztítottuk, a gyártó utasításai szerint. A tisztított proteint redukált glutationnal eluáltuk, alaposan dializáltuk PBS-sel szemben, mennyiségét BSA standardokkal szemben, BioRad coomassie-alapú proteinmeghatározó készlettel megmértük, majd kis adagokban –80 °C¹on tároltuk. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi ellenanyag vagy funkcionális fragmense, amely NogoA-hoz, közelebbrõl humáneredetû NogoA-hoz kötõdik, ahol a fenti ellenanyag vagy funkcionális fragmense neutralizálja a SEQ ID NO 87 által kódolt polipeptidet tartalmazó Nogo protein aktivitását, ahol a fenti ellenanyag kötõdik a fenti protein SEQ ID NO 87 szerinti részéhez. Jellemzõ formájukban, a találmány szerinti ellenanyagok a humáneredetû NogoA 586–785 közötti aminosavjaihoz kötõdnek és neutralizálják a NogoA aktivitását.
35
40
45
50
55
6. példa: Neuritkinövés vizsgálata Kontroll GST proteint önmagában vagy GST-NOGOA56 fúziós proteint olvasztottunk jégen és hígítottunk szövettenyésztési minõségû, 0,5×PBS-ben 3 pl/ml kon- 60 23
centrációra. A szövettenyésztõ fülkében poli-D-lizinnel fedett, 96 vályulatú BD¹Biocoat lemezek vályulatainak a közepére 5 ml-nyi cseppeket szárítottunk. Szárítás után a tisztított ellenanyagoknak, a hibridóma-szövettenyészet kondicionált felülúszójának vagy a vegyületeknek elkészítettük a hígítását HBSS közegben (Life Technologies) és ezeket bemértük a vályulatokba 50 ml mennyiségben, 4–8 párhuzamossal. GST proteint önmagában és GST-NOGO-A56 fúziós proteint tartalmazó kontroll vályulatokat kiegészítés nélküli HBSS közeggel kezeltük. Két órán át, 37 °C¹on történõ elõkezelést követõen, 8 napos patkányok agyából származó, tisztított, sejtjeire disszociált kisagyi granulum neuronokat mérünk be, vályulatonként 20–40 000 neuront, 100 ml térfogatban, majd 24 órán át, 37 °C¹on inkubáltuk. A tenyészeteket 4% formaldehidet és 10% szacharózt tartalmazó PBSpufferrel fixáltuk egy órán át, majd a neuritokat béta-IIItubulin elleni poliklonális ellenanyaggal festettük. A neuritkinövés kvantitatív meghatározását automatizált képrögzítéssel és Cellomics Arrayscan rendszeren való analízissel végeztük. Az eredményeket az 1–6. ábrák mutatják. Az 1. ábra a NOGO-A56 fúziós protein neurit-kinövésre gyakorolt gátló hatását mutatja, összehasonlítva az önmagában alkalmazott GST kontrollprotein hatásával. A 2–5. ábrák a 2A10/3, 2C4/1 és 15C3/3 NogoA elleni ellenanyagok funkciót gátló azonosítását mutatják, szemben egy funkciót nem blokkoló, 12G3 kontroll ellenanyaggal. A 12G3 ellenanyag kötõdik NOGO56 pro-
1
HU 008 119 T2
teinhez, azonban nem gátolja neuritok kinövését. Az ábrák a neuritok átlagos hosszát mutatják tisztítatlan ellenanyagoknak (felülúszóknak) kitett tenyészetekben. Az adatok a 2A10/3, 2C4/1 és 15C3/3 NogoA elleni ellenanyagok blokkoló hatását mutatják a NOGOA56 neuritkinövést gátló aktivitására. A kontroll önmagában alkalmazott GST volt. A 6. ábra tisztított 2A10/3 ellenanyag blokkolóhatását mutatja a NOGO-A56 neuritkinövést gátló aktivitására.
5
10 7. példa: IN–1 nem mutat blokkolóaktivitást humáneredetû NogoA ellen Az 5. példa szerinti neuritkinövés-vizsgálat az IN–1 ellenanyaggal elvégezve azt mutatja, hogy az IN–1 nem blokkolja a humáneredetû NogoA gátlóaktivitását (7. ábra). 8. példa: A 2A10 ellenanyag humanizálása Humanizált VH és VL konstrukciókat úgy állítottunk elõ de novo, hogy Rld és Rln emlõseredetû exp-
2
ressziós vektorokba történõ klónozáshoz restrikciós helyeket, valamint humáneredetû szignálszekvenciát tartalmazó, átfedõ oligonukleotidokat építettünk fel. Hind III és Spe I restrikciós helyeket vittünk be abból a célból, hogy keretezzék a CAMPATH–1 H szignálszekvenciát tartalmazó VH domént, a humáneredetû g1 mutált konstans régiót tartalmazó Rld vektorba történõ klónozáshoz. Hind III és BsiW I restrikciós helyeket vittünk be abból a célból, hogy keretezzék a CAMPATH–1 H szignálszekvenciát tartalmazó VL domént, a humáneredetû kappa konstans régiót tartalmazó Rln vektorba történõ klónozáshoz. CAMPATH–1 H szignálszekvencia szekvenciája: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO 82).
15
20
Nehéz lánc A 2A10 VH szekvenciával 66%¹os azonosságot mutató, humáneredetû csíravonal-szekvenciát azonosítottunk. Az U84162 keretszekvenciát választottuk humanizálás céljára:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSY AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGQWLVIINFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 83). A 93¹as és 94¹es pozíciókat azonosítottuk a CDRkonformáció fenntartásához potenciálisan fontos csoportokként.
Pozíció (Kabat)
2A10 VH
U84162
93–94
EL
AR
Megfigyeltük, hogy ebben a pozícióban az EL motívum szokatlan. Az alábbi humanizált konstrukciót terveztük:
35
H1 humanizált VH konstrukció:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNY NEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO 84). Könnyû lánc A 2A10 VL szekvenciával 66%¹os azonosságot mu- 45 tató, humáneredetû csíravonal-szekvenciát azonosítot-
tunk. A CAA85593 keretszekvenciát választottuk humanizálás céljára: Keret: CAA85593 szekvencia
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQGLVYSDGDTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRD SGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO 85). A keret alábbi csoportjait azonosítottuk az affinitás fenntartásához potenciálisan fontos csoportjaiként:
Pozíció (Kabat)
2A10 VL
AAK94811
4
I
M
45
R
Q
46
R
L
24
1
HU 008 119 T2
2
Humanizált VL konstrukciót terveztünk: Konstrukció
L11
Kerettemplát
Pozíció (Kabat)
CAA85593
Aminosav Humán
Egér
4
M
I
45
R
Q
45
R
L
L11 humanizált VL konstrukció:
DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRA SGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO 86) A SEQ ID NO 84 és 86 szerinti szekvenciákat kódoló plazmidokat átmenetileg CHO-sejtekbe kotranszfektáltuk és kis léptékben expresszáltattuk abból a célból, hogy H1L11 ellenanyagot állítsunk elõ. A SEQ ID NO 92 és 86 szerinti szekvenciák szintén átmenetileg kot- 20 ranszfektálhatók és kis léptékben expresszáltathatók voltak CHO-sejtekben H7L11 ellenanyag elõállítása céljából. Ennek megfelelõen, a találmány tárgyát képezi humanizált ellenanyag, amely humáneredetû NogoA pro- 25 teinhez kötõdik és neutralizálja annak aktivitását, és amely humanizált ellenanyag a SEQ ID NO 84 szerinti nehéz lánc variábilis régiót és a SEQ ID NO 86 szerinti könnyû lánc variábilis régiót tartalmazza. A találmány szerint, a találmány tárgyát képezi No- 30 goA elleni ellenanyag, amely specifikusan kötõdik hu-
máneredetû NogoA proteinhez és neutralizálja annak aktivitását, és amely ellenanyag a SEQ ID NO 88 szerinti nehéz láncot és a SEQ ID NO 89 szerinti könnyû láncot tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti ellenanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint humán beteg, közelebbrõl stroke által (például ischaemiás stroke által) vagy Alzheimer-kór által érintett beteg kezelésére alkalmas eljárások. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a SEQ ID NO 88 és SEQ ID NO 89 szerinti szekvenciák rendre bármely feldolgozást (például gazdasejt által közvetített feldolgozást) megelõzõ nehéz láncot és könnyû láncot képviselnek, szignálszekvencia eltávolítása céljából. Jellemzõen, a SEQ ID NO 88 feldolgozott formája a 20. pozíciótól, a SEQ ID NO 89 feldolgozott formája a 20. pozíciótól kezdõdik.
SEQ ID NO 88:
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAP GQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQG YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LUSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVNHEALHNHYTQKSLSLSPGK. SEQ ID NO 89:
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWF QQRPGQSPQLLIYIMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPL TFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. A SEQ ID NO 88 szerinti szekvenciát kódoló polinukleotidot mutat a SEQ ID NO 90:
AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCT TCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTG AGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCA CCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAA ATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCA TGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGG ACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCA CAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGA GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCC 25
1
HU 008 119 T2
2
TACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGA AAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAC TCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGA AAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC (SEQ ID NO 90) A SEQ ID NO 89 szerinti szekvenciát kódoló polinukleotidot mutat a SEQ ID NO 91:
AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTG GTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGT CACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGA AGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATG TCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACT GAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATC CGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTC ATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTC GCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGAATTC (SEQ ID NO 91) 9. példa: H1L11 anti-NOGO monoklonális 35 ellenanyag BiaCore vizsgálata A NogoA elleni monoklonális ellenanyag kötõdési kinetikáját vizsgáltuk rekombináns eljárással expresszált, humáneredetû NogoA (hNogo) proteinnel szemben, Biacore3000 bioszenzor alkalmazásával. 40 Eljárás hNogo proteint immobilizáltunk CM5 chipre primer aminokötéssel, célzott immobilizációs szintekre tervezett Biacore Wizard program alkalmazásával. A CM5 szenzor felszínét úgy aktiváltuk, hogy 50 mmol/l 45 N¹hidroxi-szukcinimid (NHS) és 200 nmol/l N¹etil-N’dimetil-amino-propil-karbonid (EDC) elegyét áramoltattunk át. Ezt követõen, 300 nmol/l hNogo oldatot (5 mmol/l nátrium-acetát, pH=5,0) alkalmazva, 50¹ 200 rezonanciaegység koncentrációtartományban 50 hNogo proteint immobilizáltunk. Az immobilizálódás befejezõdését követõen, a még fennmaradó, aktivált szabad észtereket 1 mol/l etanol-amin-hidroklorid (pH=8,5) injektálásával blokkoltuk. A H1L11 monoklonális ellenanyagot (lásd a 8. pél- 55 dát) HBS¹EP pufferben (10 mmol/l HEPES, pH=7,4, 150 mmol/l NaCl, 3 mmol/l EDTA és 0,005% P–20 felületaktív ágens) hígítottuk és a kötési vizsgálatokat 0,1–100 nmol/l koncentrációtartományban végeztük. Kinetikai vizsgálatok céljára 60 ml/ml átfolyási sebessé- 60 26
get alkalmaztunk, ahol nem tapasztaltunk tömegtranszfer hatást. Minden koncentrációt két párhuzamossal vizsgáltunk, véletlenszerû sorrendben, puffer vak minták (kontrollok) közbeiktatásával. A regenerálást 15 ml 50 mmol/l NaOH önmagában történõ, lökésszerû injektálásával, vagy 15 ml H3PO4 injektálását követõen 15 ml 50 mmol/l NaOH injektálásával végeztük. Mindkét regenerálási eljárást 30 ml/perc átfolyási sebesség mellett végeztük, és mindkét eljárás a kötött H1L11 teljes eltávolítását eredményezte, de nem járt a hNogo szenzor-felszín kötési kapacitásának bármely mértékû csökkenésével. Minden futtatást blank szenzor-felszínnel szemben végeztünk (amelyet a fentiek szerint aktiváltunk és blokkoltunk, azonban nem adtunk hozzá ligandumot). A kötés vizsgálatát BIAevaluation kinetikus analízis szoftver 4.1 verziója alkalmazásával végeztünk. A találmány szerinti többi ellenanyag Biacore vizsgálatát lényegében a fenti eljárás szerint végeztük. Eredmények Ellenanyag
ka (1/Ms)
kd (1/s)
KD (nM)
HcLc
2,23×106
2,49×10–3
1,26
H1L11
1,0×106
2,15×10–2
22,16
Egér 2A10
2,9×106
1,84×10–3
0,8
1
HU 008 119 T2
Táblázat (folytatás) Ellenanyag
ka (1/Ms)
kd (1/s)
KD (nM)
Egér 2C4
8,09×106
6,44×10–4
8
Egér 15C3
4,07×104
8,28×10–4
17,5
5
Hasonló vizsgálatot végeztünk patkányeredetû NogoA alkalmazásával.
2
Az elzárást követõ javulás Az MCA-elzárást követõen az anesztéziát abbahagytuk és engedtük, hogy az állatok 1 órán át, inkubátorban (23–25 °C¹on), szigorú megfigyelés alatt visszanyerjék eszméletüket és helyzet-helyreállító reflexüket. Az állatokat ezt követõen egyedi posztoperációs lábadozó ketrecekbe helyeztük, ahol egészségi állapotukat gondosan monitoroztuk a túlélési periódus teljes idõtartama alatt.
10 Ellenanyag
ka (1/Ms)
kd (1/s)
KD (nM)
Egér 2C4
1,62×105
5,33×10–4
3,9
Egér 15C3
4,6×104
8,7×10–4
24,9
Egér 2A10
1,26×106
1,01×10–3
1
10. példa: NogoA elleni ellenanyag (2C4) hatása tMCAO¹t követõ lézió térfogatára és a funkcionális javulásra Célkitûzés A vizsgálat célkitûzése intracerebroventrikulárisan (ICV) beadott, NogoA elleni monoklonális ellenanyag hatékonyságának a vizsgálata volt középagyi artéria átmeneti elzáródását („transient middle cerebral artery occlusion”, tMCAO) követõ lézió térfogatára és a funkcionális javulásra patkányokban. Henger-tesztet, ék alakú pallótesztet és neurológiai pontszám feladatokat alkalmaztunk a 90 percen át tartó átmeneti ischaemiát követõ, hosszú távú funkcionális javulás értékelésére, valamint az agyakat eltávolítottuk a regenerációs folyamatok immunhisztokémiai vizsgálata és a léziók térfogatának meghatározása céljából. Eljárások Sebészeti elõkészítés A vizsgálatokhoz hím, 300–350 g tömegû Sprague–Dawley-patkányokat (Charles River) alkalmaztunk. Általános érzéstelenítés mellett intracerebroventrikuláris (ICV) kanült helyeztünk a bal oldalsó agykamrába. A sebészeti beavatkozást követõen legalább négy nap lábadozási idõt hagyva, a kanül megfelelõ behelyezését ICV adagolt angiotenzin II beadásával ellenõriztük. Fokális ischaemia kiváltása Minden állat tMCAO beavatkozáson esett át, halotán/oxigén/nitrogén-oxid anesztézia mellett, Longa és munkatársai, által ismertetett eljárás szerint [Stroke 20, 84–91 (1989)]. A sebészeti beavatkozás alatt a testhõmérsékletet rektális hõmérõvel monitoroztuk, és az állatokat a hõmérõ által szabályozott fûtõtakaróval tartottuk normál hõmérsékleten (37 ±0,5 °C¹on). A bal középsõ agyi artéria („middle cerebral artery”, MCA) elzárása és a reperfúzió idõpontjában az aktuális maghõmérsékleteket feljegyeztük. Kilencven perccel az MCA elzárását követõen, a patkányokat ismét anesztetizáltuk és a szálat lassan és teljesen visszahúztuk, hogy lehetõvé váljon a reperfuzió. Az artériametszést diatermiával zártuk, a hemosztázist újra ellenõriztük, majd a nyaki sebet varrással zártuk.
Viselkedési feladatok 1. Neurológiai értékelés Az MCA zárását követõ motorikus és viselkedési változásokat 28 pontos pontozóskálán értékeltük az 15 MCA zárását követõ 1. óra és 24. óra elteltével, majd 8 héten át hetente. Az alkalmazott neurológiai értékelés (neuropontszám, „neuroscore”) részletezése MCAO állatok neuropontszáma a vizsgálatban 20 részt vevõ más patkányokkal összehasonlítva – maximális pontszám: 28 pont Mancs ráhelyezése Az állatot hosszirányban az asztal széle mentén 25 tartjuk, kézzel átfogva a feje mögött, majd a mancsokat egyenként az asztal peremén túl helyezzük. Figyeljük a mancs visszahúzását és visszahelyezését az asztalra. Pontszám: a mancs minden sikeres helyezéséért 1 pont (maximális pontszám: 4). 30 Helyreállító reflex Az állatot határozottan megfogjuk és tengelye körül elforgatjuk, amíg tenyerünkön a hátán fekszik. Engedünk a fogáson és figyeljük, hogy az állat helyreállítja¹e 35 testhelyzetét. Pontszám: 1 pont a sikeres helyreállításért. Horizontális rúd Az állat mellsõ mancsait bordázott rúdra helyezzük, 40 és hagyjuk függeszkedni. Pontszám: 3 pont, ha mindkét hátsó végtag a rúdhoz emelkedik, 2 pont, ha az egyik hátsó végtag a rúdhoz emelke45 dik, 1 pont, ha az állat csak függeszkedik, és 0 pont, ha az állat leesik (kapaszkodás hiányában).
50
Lejtõs felület Ketrecfedõt tartunk 45°¹os szögben. Az állatot a lejtés irányában a fedõre helyezzük.
Pontszám: 3 pont, ha az állat 15 másodpercen belül az emel55 kedõ irányába fordul, 2 pont, ha ez 15–30 másodpercen belül történik, 1 pont, ha ez több, mint 30 másodperc után történik, és 0 pont, ha az állat leesik a fedõrõl gyenge vagy 60 hiányzó fogás miatt, vagy a lejtés irányában marad. 27
1
HU 008 119 T2
Kontralaterális rotálás Az állatot megfogjuk a farka tövénél és az óramutató járásával megegyezõ, majd ellenkezõ irányban forgatjuk. Figyeljük az állat azon képességét, hogy a forgatás irányával szemben próbál forogni. Pontszám: 1 pont az egyes irányokért (maximális pontszám: 2). Vizuális elsõ mancs kinyúlás Az állatot megfogjuk a farka tövénél úgy, hogy a feje éppen az asztal lapjának a szintje alatt legyen. Közelítünk az asztalhoz, amíg a bajsza majdnem hozzáér. Az állatnak homorítania kell, és megpróbálni mellsõ mancsait az asztal felszínére helyezni. Pontszám: 1 pont a mancs egyes sikeres elhelyezéséért (maximális pontszám: 2). Körbe forgás Az állatot a padlóra helyezzük és figyeljük a körbe forgást. Pontszám: 4 pont, ha nincs körbe forgás, 3 pont, ha egyik oldal felé húz, 2 pont nagy körökért (>50 cm¹es sugár), 1 pont közepes körökért (>15<50 cm¹es sugár), 0 pont pörgésért vagy kis körökért (<15 cm¹es sugár). Kontralaterális reflex Az állatot a farka tövénél tartjuk. Pontszám: 0 pont a reflexért, 1 pont a reflex hiányáért. Fogás erõssége Az állatot hagyjuk kizárólag mellsõ mancsaival kapaszkodni a ketrec rácsába. Az állatot farkánál fogva visszahúzzuk. Pontszám: 2 pont normál fogási erõsségért, 1 pont gyenge fogásért, 0 pont, ha nincs fogás.
5
2. Hengerteszt Az állatokat hetente értékeltük a mellsõ mancs ráhelyezés hengertesztjével. Az állatokat 20 cm átmérõjû és 30 cm magas, átlátszó Perspex® hengerbe helyeztük 3 perc idõtartamra. Ez idõtartam alatt a bal és jobb mancsok ráhelyezésének a számát értékeltük. A tesz15 tet vörös fényben végeztük.
20
25
30
35
40
45
50
Általános állapot Pontszám: 3 pont, ha normális (szõrzet megfelelõ állapotú, éber, mozgékony, súlygyarapodás normális),
2 pont, ha nagyon jó, de súlygyarapodás elmarad a normálistól, 1 pont, ha jó, 0 pont, ha gyenge (például szennyezett szõrzet, nem tartja magát tisztán, agresszív, gyenge izomtónus). Maximális pontszám (azaz normál patkány): 28 pont
10
Motilitás Megfigyeljük az állatot a padlón, körözõaktivitás alatt. Pontszám: 3 pont normál mozgásért, 2 pont, ha élénk, de körözik, 1 pont, ha bizonytalan, 0 pont, ha vonakodik mozogni.
2
3. Ék alakú pallón haladás A teszthez minden patkányt vörös fénnyel megvilágított szobában megtanítottunk áthaladni egy körülbelül 1 m hosszú, ék alakú pallón, amely körülbelül 40 fokos szögben vezet fel a lakóketrecéhez. Amint az állat felfelé halad, ez a feladat fokozatosan nehezebbé válik, mivel a palló szélessége csökken. A pallót úgy jelöltük be, hogy 3 részre osztottuk, a legszélesebb részét (6 cm) könnyûnek minõsítettük, a legnehezebbnek pedig az ék alakú végét (2 cm). Az operációt megelõzõ idomítás alatt minden egyes patkányt kivettünk a lakóketrecébõl és növekvõ távolságra a pallóra helyeztük (körülbelül összesen négyszer). Minden patkányt, amely jutalmazás nélkül és kevés elvétett lépéssel végig tudott haladni a pallón, betanítottnak tekintettünk. A rosszul teljesítõket kizártuk a vizsgálatból. Teszteléskor, minden patkányt egy teszt során háromszor ráhelyeztük a pallóra és manuálisan feljegyeztük, majd átlagoltuk az áthaladásra fordított idõt, a botlások számát, amelyet úgy definiáltunk, mint a lábak olyan helyezését, amely nem érintkezett a palló felszínével (mellsõ és hátulsó végtagok). Az 1. csoport esetében az 5. héten és a 2. csoport esetében a 4. héten a vizsgálatot a teszt videokamerás rögzítésére változtattuk. Ezt követõen a felvételen rögzített tesztet elemeztük az érzékenység fokozása érdekében. A MCAO állatokon a tesztet a sebészeti beavatkozás elõtt, az operációt követõ 7. napon, majd az állatok 8. héten történõ feláldozásáig hetente végeztük. Dozírozási rend Az ellenanyagot az artéria elzárását követõen 1 óra múlva, 24 óra múlva, egy hét múlva és két hét múlva adtuk be.
Csoportok: IgG1 kontroll (5 mg) (D csoport). 2C4 ellenanyag (5 mg) (F csoport). 2C4 ellenanyag (15 mg) (E csoport). Minden készítményt steril fiziológiás konyhasóoldatban állítottunk elõ. Az állatokat a beadás elõtt vakon csoportosítottuk. 60 55
28
1
HU 008 119 T2
Az alkalmazott patkányok sorrendje által bevitt torzítás elkerülése érdekében Latin-négyzet-elrendezést alkalmaztunk. Az ellenanyagokat 5 ml térfogatban (1 mg/ml és 3 mg/ml) adtuk be, 2 percen át, infúziós pumpa alkalmazásával (2,5 ml/perc). Az injektálást követõen a kanült további két percen át a helyén hagytuk. Neuropatológia és az ischaemiás károsodás mennyiségi meghatározása Nyolc héttel az MCA-elzárást követõen a patkányokat jéghideg, 4%¹os paraformaldehid perfúziójával fixáltuk. Az állatokat ezt követõen dekapitáltuk, és az agyakat in situ tároltuk jéghideg, 4%¹os paraformaldehidben, a boncolás, paraffin beágyazáshoz elõkészítés és immunhisztokémiai vizsgálat elõtt. Az agyak térfogatának a vizsgálatához, paraffin elõkészítés céljából, az agyakat 2 mm¹es közönként sorozatszeleteltük az elülsõ pólustól a kisagyig, agymátrix alkalmazásával. Az agyakat ezt követõen paraffinnal elõkészítettük és viaszba ágyaztuk. Négy mikron vastagságú metszeteket gyûjtöttünk, amelyek megfeleltek a koponyatetõhöz viszonyított elülsõ +3 mm és –7,5 mm közötti, sztereotaktikailag elõre meghatározott koronális (koponyatetõi) síkoknak. A metszeteket polilizinnel bevont tárgylemezekre vittük fel, majd hematoxilinnal és eozinnal megfestettük. A metszeteket egy számítógépes képelemzõ rendszer alkalmazásával (Datacell hardver, Optimas szoftver) értékeltük a lézió térfogatára és a duzzadásra nézve. A károsodott területeket olyan szövet alkotta, amely nem festõdött hematoxilinnal és eozinnal. A léziókat úgy mértük, hogy körberajzoltuk a károsodott terület határait, és azt az agy nem károsodott, ellenoldali területével összehasonlítva, százalékos értékben fejeztük ki.
5
2
állatokat és a négyszer dozírozott állatokat a kontrollokhoz hasonlítva, kizárólag a négyszer dozírozott állatok különböztek szignifikáns mértékben a kontroll-ellenanyaggal dozírozott állatoktól. Megjegyezzük, hogy a vizsgálat alatt számos patkány elhullott, feltehetõen fertõzésben. Ennek következtében, a legmagasabb dózisú csoportban (E csoport) három állat egy dózissal kevesebbet kapott, mint az ebbe csoportba tartozó többi állat.
10
15
20
25
30
Eredmények: Az E csoportba (magas dózisú ellenanyag csoport) tartozó három állat egy dózissal kevesebbet kapott, mint a csoportba tartozó többi állat. Az adatok analízisét elvégeztük ezen állatokkal és ezen állatok nélkül egyaránt, és az analízis nem mutatott ki szignifikáns hatást az eredményekre, kivéve, ha azt a leírásban külön jelezzük. A 9. ábra a károsodott térfogatot mutatja a teljes agytérfogat százalékában, a kontroll, 5 mg és 15 mg ellenanyagot kapott vizsgálati csoportok esetében. A kontrollcsoporttal összehasonlítva, az ellenanyagnak nem volt hatása a károsodott térfogatra. A 10. ábra neuropontszám-adatokat mutat (átlag ±SEM). A megfigyelt adatok széles körének köszönhetõen, a parametrikus analízist érvényesnek tekintettük. Szignifikáns különbségek mutatkoztak a 15 mg dózist kapott, és a kontroll csoport között az 1., 4., 7. és 8. héten. Az analízis ilyen módja szerint szignifikáns különbségek mutatkoztak a 15 mg dózist kapott, és a kontrollcsoport között a 7. és 8. héten.
Hengerteszt Lásd a 11A., 11B., 11C. és 11D. ábrát. A hengerteszt adatait (átlag ±SEM) az alábbiak szerint adtuk meg: A) mindkét mancs, B) bal mancs, C) jobb mancs és D) jobb mancs, olyan állatokra bontva, amelyek 15 mg NogA elleni ellenanyag 3 dózisát, vagy 4 dózisát 40 kapták. Az ellenanyag 15 mg¹os dózisa szignifikáns mértékben fokozta a jobb mancs használatát. Amikor a magas dózisú csoportot olyan csoportokra bontottuk, amelyek mind a négy dózist megkapták, 45 szemben az ellenanyag mindössze három dózisát kapott állatokkal, a két alcsoport között nem mutatkozott szignifikáns eltérés. Amint azonban a 11D. ábra mutatja, amikor a 4 dózisú csoportot a kontrollcsoporthoz hasonlítottuk, szignifikáns különbség mutatkozott, amely 50 nem látszott, amikor a 3 dózisú csoportot hasonlítottuk a kontroll csoporthoz. A statisztikai analízis a Fischerféle LSD-tesztet alkalmazta ismételt méréses adatokon. 35
Statisztikai analízis A neuropontszám- és testtömegadatokat ismételt méréses ANOVA (varianciaanalízis) megközelítés alkalmazásával analizáltuk, az ismételt mérés az idõ volt. A károsodott térfogatot egytényezõs ANOVA és ANCOVA (variancia-kovariancia elemzés) megközelítéssel, a károsodott területet ismételt méréses ANCOVA megközelítéssel analizáltuk. Csoporthatást keresve, a botlási adatokat külön analizáltuk a mellsõ és a hátsó végtagok esetében, ismételt méréses ANOVA megközelítés alkalmazásával, ahol az ismételt mérések a vizsgálati hét és a palló nehézségi foka volt. Mellsõ és hátsó végtagok között különbségeket keresve, a botlási adatokat szintén analizáltuk ismételt méréses ANOVA megközelítéssel, ahol az ismételt mérések a vizsgálati hét és a végtag voltak, a nehézségi fokra átlagolva. Az E csoportból (magas dózisú ellenanyag csoport) három állat egy dózissal kevesebbet kapott, mint a csoportba tartozó többi állat (lásd alább). Bár az analízist elvégeztük ezen állatokkal és ezen állatok nélkül egyaránt, az analízis nem mutatott ki szignifikáns hatást az eredményekre, és ezért az állatokat bevettük az analízisbe, fontos megjegyezni, hogy a hengerteszt és a testtömegprofilok esetében, a háromszor dozírozott
Ék alakú palló Lásd a 12. ábrát. A 12. ábra a mellsõ végtag botlásait mutatja (átlag ±95% konfidenciaintervallum). *A 6. héten az F csoportban, amely 5 mg dózist kapott, a mellsõ végtag botlásainak száma emelkedett a 60 D kontrollcsoporthoz képest (p=0,0305). 55
29
1
HU 008 119 T2
Bár nem mutatjuk, a mellsõ végtag botlásainak száma a palló fokozódó nehézségi fokának megfelelõen növekedett. Lásd a 13. ábrát. A 13. ábra a hátsó végtag botlásainak a számát mutatja (átlag ±95% konfidenciaintervallum). *Az F csoportban, amely 5 mg dózist kapott, a hátsó végtag botlásainak száma emelkedett a D kontrollcsoporthoz képest (p=0,0488) a vizsgálat tartama alatt. A 6. és 7. héten az F csoportban a hátsó végtag botlásainak száma emelkedett a D kontrollcsoport botlásaihoz képest (rendre p=0,0098 és p=0,0370). Bár nem mutatjuk, a mellsõ végtag botlásainak száma a palló fokozódó nehézségi fokának megfelelõen növekedett. A pallón áthaladás idõtartamának az adatai azt mutatják, hogy amint az állatok javulnak, a kiindulási hét idõtartama rövidül, azonban nem figyeltük meg a kezelés hatását. A 14A. ábra testtömegeket mutat (átlag ±SEM). Az állatok kezelése 15 mg ellenanyaggal a testtömeg növelését eredményezi a 24. órában, az 1. héten, valamint minden idõpontban a 3. héttõl a vizsgálat befejezésig. 14B. ábra. Az ábra a 15 mg ellenanyagot kapott csoport testtömegét mutatja olyan állatokra bontva, amelyeket háromszor, vagy négyszer dozíroztunk. Az adatokat átlag ±konfidenciaintervallum értékekben fejeztük ki. *p=0,05, ismételt méréses ANOVA. Bár a többi csoporthoz képest nem szignifikáns mértékben, a magas dózisú csoportból az állatok magas aránya esett ki eutanázia vagy elhullás miatt. Ez a kontrollcsoporthoz képest emelkedett átlagos testtömeg miatt fordulhatott elõ. Következtetések A vizsgálat az 1. órában, 24. órában, az 1. héten és a 2. héten ICV beadott, 2C4 NogoA elleni ellenanyag két dózisának a hatását vizsgálta a lézió térfogatára és a funkcionális javulásra, 90 percen át tartó tMCAO beavatkozást követõen. – Az ellenanyag-kezelésnek nem volt hatása a lézió térfogatára. – Az ellenanyag-kezelésnek mérsékelt, de szignifikáns hatása volt a neurológiai pontszámra a 15 mg¹os, legmagasabb ICV-dózis mellett. Ez az adag szignifikáns mértékben emelte a neurológiai pontszámot az 1., 4., 7. és 8. héten, átlag pontszámot alkalmazva (amely az adatok széles tartományára terjedt ki, ezáltal igazolva a parametrikus analízist). – Az ellenanyag-kezelésnek szignifikáns hatása volt a jobb mancs használatára a hengertesztben a 15 mg¹os, legmagasabb ICV-dózis mellett. Ez az adag a vizsgálat teljes tartama alatt szignifikáns mértékben fokozta a jobb mancs használatát a kontrollokhoz képest, a jobb mancs használata különösen a 2. és 6. héten szintén szignifikáns mértékben fokozódott. – Az ellenanyag-kezelésnek nem volt pozitív hatása az ék alakú pallón áthaladás teszt teljesít-
2
ményre. Úgy tûnik azonban, hogy az alacsony dózisú ellenanyag csoportban (5 mg ICV) emelkedett a botlások száma, különösen a 6. héten. Nem tapasztaltunk azonban különbséget sem akkor, amikor a botlások számát a szakasz nehéz5 ségi foka összefüggésében analizáltuk, sem amikor a pallón áthaladás idõtartamát analizáltuk. – Az ellenanyag-kezelésnek szignifikáns hatása volt a testtömegre a 15 mg¹os, legmagasabb ICVdózis mellett. Ez a csoport a kontrollokhoz képest 10 szignifikáns mértékben emelkedett testtömeget mutatott a 3. héttõl kezdve. Bár nem funkcionális kimenetel, a testtömeg jól tükrözi az általános jó közérzetet, és jelezheti a tMCAO-beavatkozást követõ fokozott élettani javulást. 15 A magasabb dózisú ellenanyagot kapott csoportban az utolsó 3 patkány a fenti okok miatt nem kapta meg negyedik és utolsó ellenanyagdózisát. Abból acélból, hogy meghatározzuk ezen utolsó dózis jelen20 tõségét, összehasonlítást végeztünk ebben a csoportban a 3 dózist kapott, és a 4 dózist kapott állatok között. A dozírozás idõtartama A négyszer dozírozott állatokban szignifikáns mértékben emelkedett a jobb mancs ráhelyezések száma, míg a háromszor dozírozottakban nem. Ezen túlmenõen úgy tûnik, hogy a 2. heti dozírozás felgyorsítja a testtömeg gyarapodását, szemben a háromszor dozí30 rozott állatokkal. Továbbá, a négyszeri dozírozás szignifikáns mértékben fokozza testtömeg gyarapodását a kontrollokhoz viszonyítva, míg a háromszori dozírozás nem. A dozírozás nem érintette a lézió térfogatát, a neu35 rológiai pontszámot vagy az ék alakú pallón áthaladás teszt teljesítményt. 25
Összefoglalás Összefoglalva, bár a kezelésnek nem volt hatása a 40 léziók térfogatára, a 2C4 NogoA elleni ellenanyag legmagasabb dózisának (15 mg) 3 vagy 4 adagját követõen pozitív hatása volt a funkcionális javulásra a fent ismertetett neuropontszám alapján, valamint 4 adagját követõen a mancs ráhelyezésre és a testtömeg-gyara45 podásra. 11. példa: Intravénásan beadott, NogoA elleni monoklonális ellenanyag hatása a léziók térfogatára és a funkcionális javulásra, tMCAObeavatkozást követõen 50 Célkitûzés A vizsgálat célkitûzése intravénásan (IV) beadott, 2A10 és 2C4 NogoA elleni monoklonális ellenanyagok hatékonyságának a vizsgálata volt, középagyi artéria 55 átmeneti elzáródását („transient middle cerebral artery occlusion”, tMCAO) követõ lézió térfogatára és a funkcionális javulásra patkányokban. Hengertesztet, ék alakú palló tesztet és neurológiai pontszám feladatokat alkalmaztunk a 90 percen át tartó, átmeneti ischaemiát 60 követõ, hosszú távú funkcionális javulás értékelésére, 30
1
HU 008 119 T2
valamint az agyakat eltávolítottuk a regenerációs folyamatok immunhisztokémiai vizsgálata és a léziók térfogatának meghatározása céljából. Fokális ischaemia kiváltása Minden állat tMCAO-beavatkozáson esett át, halotán/oxigén/nitrogén-oxid anesztézia mellett, Longa és munkatársai, által ismertetett eljárás szerint [Stroke 20, 84–91 (1989)]. A sebészeti beavatkozás alatt a testhõmérsékletet rektális hõmérõvel monitoroztuk, és az állatokat a hõmérõ által szabályozott fûtõtakaróval tartottuk normál hõmérsékleten (37 ±0,5 °C¹on). A bal középsõ agyi artéria („middle cerebral artery”, MCA) elzárása és a reperfúzió idõpontjában az aktuális maghõmérsékleteket feljegyeztük. Kilencven perccel az MCA elzárását követõen, a patkányokat ismét anesztetizáltuk és a szálat lassan és teljesen visszahúztuk, hogy lehetõvé váljon a reperfúzió. Az artériametszést diatermiával zártuk, a hemosztázist újra ellenõriztük, majd a nyaki sebet varrással zártuk. Az elzárást követõ javulás Az MCA elzárását követõen az anesztéziát abbahagytuk és engedtük, hogy az állatok 1 órán át, inkubátorban (23–25 °C¹on), szigorú megfigyelés alatt visszanyerjék eszméletüket. Az állatokat ezt követõen egyedi, posztoperációs lábadozó ketrecekbe helyeztük, ahol egészségi állapotukat gondosan monitoroztuk a túlélési periódus teljes idõtartama alatt. Viselkedési feladatok 1. Neurológiai értékelés Az MCA zárását követõ motorikus és viselkedési változásokat 28 pontos pontozóskálán („neuropontszám”) értékeltük az MCA elzárását követõ 1. óra és 24. óra elteltével, majd 8 héten át hetente. 2. Hengerteszt Az állatokat hetente értékeltük a mellsõ mancs ráhelyezés hengertesztjével. Az állatokat 20 cm átmérõjû és 30 cm magas, átlátszó Perspex® hengerbe helyeztük 3 perc idõtartamra. Ez idõtartam alatt a bal és jobb mancsok ráhelyezésének a számát értékeltük, amint az állat ágaskodva igyekezett környezetét felfedezni. A tesztet vörös fényben végeztük. 3. Áthaladás ék alakú pallón A teszthez minden patkányt vörös fénnyel megvilágított szobában megtanítottunk áthaladni egy körülbelül 1 m hosszú, ék alakú pallón, amely körülbelül 40 fokos szögben vezet fel a lakóketrecéhez. Amint az állat felfelé halad, ez a feladat fokozatosan nehezebbé válik, mivel a palló szélessége csökken. Az operációt megelõzõ tréning alatt, 2 napon át, minden egyes patkányt kivettünk a lakóketrecébõl és növekvõ távolságra a pallóra helyeztük (körülbelül összesen négyszer). Minden patkányt, amely jutalmazás nélkül és kevés elvétett lépéssel végig tudott haladni a pallón, betanítottnak tekintettünk. A rosszul teljesítõket kizártuk a vizsgálatból.
2
Teszteléskor, minden patkányt egy teszt során háromszor ráhelyeztük a pallóra és az áthaladásra fordított idõt, a botlások számát, amelyet úgy definiáltunk, mint a lábak olyan ráhelyezését, amely nem érintkezett 5 a palló felszínével (mellsõ és hátulsó végtagok) videokamerával rögzítettük, késõbb értékeltük és az átlagokat feljegyeztük. Az MCAO-állatokon a tesztet a sebészeti beavatkozás elõtt, az operációt követõ 7. napon, majd az állatok 8. héten történõ feláldozásáig hetente 10 végeztük. Dozírozási rend (IV) Az ellenanyagot az artéria elzárását követõen 1 óra múlva, 24 óra múlva, egy hét múlva és két hét múlva 15 adtuk be IV. Csoportok A – 2C4 3 mg/kg (4,7 mg/kg a kik molekulatömegû frakciók miatt), B – 2A10 3 mg/kg, 20 C – kontroll IgG2a 3 mg/kg, D – 2A10 10 mg/kg. Minden készítményt steril fiziológiás konyhasóoldatban állítottunk elõ. Az állatokat a beadás elõtt vakon csoportosítot25 tuk. Az alkalmazott patkányok sorrendje által bevitt torzítás elkerülése érdekében Latin-négyzet-elrendezést alkalmaztunk. Az állatokat véletlenszerûen csoportosí30 tottuk, és a vizsgálatot végzõk a kezeléseket vakon végezték.
35
40
45
50
55
60 31
Neuropatológia és az ischaemiás károsodás mennyiségi meghatározása Nyolc héttel az MCA-elzárást követõen a patkányokat jéghideg, 4%¹os paraformaldehid perfúziójával fixáltuk. Az állatokat ezt követõen dekapitáltuk, és az agyakat in situ tároltuk jéghideg, 4%¹os paraformaldehidben a boncolás, paraffinbeágyazáshoz elõkészítés és immunhisztokémiai vizsgálat elõtt. Az agyak térfogatának a vizsgálatához, paraffinelõkészítés céljából, az agyakat 2 mm¹es közönként sorozatszeleteltük az elülsõ pólustól a kisagyig, agymátrix alkalmazásával. Az agyakat ezt követõen paraffinnal elõkészítettük és viaszba ágyaztuk. Négy mikron vastagságú metszeteket gyûjtöttünk, amelyek megfeleltek a koponyatetõhöz viszonyított elülsõ +3 mm és –7,5 mm közötti, sztereotaktikailag elõre meghatározott koronális (koponyatetõi) síkoknak. A metszeteket polilizinnel bevont tárgylemezekre vittük fel, majd hematoxilinnal és eozinnal megfestettük. A metszeteket egy számítógépes képelemzõ rendszer alkalmazásával (Datacell hardver, Optimas szoftver) értékeltük a lézió térfogatára nézve. A károsodott területeket olyan szövet határolta, amely csökkent hematoxilin- és eozinfestõdést mutatott. A léziókat úgy mértük, hogy körberajzoltuk a károsodott terület határait, és azt az agy nem károsodott, ellenoldali területével összehasonlítva, százalékos értékben fejeztük ki.
1
HU 008 119 T2
Statisztikai analízis A neuropontszám- és testtömegadatokat ismételt méréses ANOVA (varianciaanalízis) megközelítés alkalmazásával analizáltuk, az ismételt mérés az idõ volt. A károsodott térfogatot egytényezõs ANOVA és ANCOVA (variancia-kovariancia elemzés) megközelítéssel, a károsodott területet ismételt méréses ANCOVA megközelítéssel analizáltuk. Csoporthatást keresve, a botlási adatokat külön analizáltuk a mellsõ és a hátsó végtagok esetében, ismételt méréses ANOVA megközelítés alkalmazásával, ahol az ismételt mérések a vizsgálati hét és a palló nehézségi foka volt. Mellsõ és hátsó végtagok között különbségeket keresve, a botlási adatokat szintén analizáltuk ismételt méréses ANOVA megközelítéssel, ahol az ismételt mérések a vizsgálati hét és a végtag voltak, a nehézségi fokra átlagolva. Eredmények A 15. ábra a léziók térfogatát mutatja a teljes agytérfogat százalékában. Az ellenanyagnak nem volt hatása a léziók térfogatára a kontrollcsoporttal összehasonlítva. Neuropontszámok A 16. ábra neuropontszám-adatokat mutat (átlag ±SEM). A megfigyelt adatok széles körének köszönhetõen, a parametrikus analízist érvényesnek tekintettük. *p<0,05, a kontroll-ellenanyaggal összehasonlítva, ismételt méréses ANOVA. Hengerteszt Lásd a 17A., 17B. és 17C. ábrát. A hengerteszt adatait (átlag ±SEM) az alábbiak szerint adtuk meg: A) mindkét mancs, B) bal mancs, C) jobb mancs. *p<0,05, **p<0,01 a kontroll-ellenanyaggal szemben, ismételt méréses ANOVA. Ék alakú palló Mellsõ végtag botlások A 18. ábra a mellsõ végtag botlásait mutatja (átlag ±SEM). *p<0,05, **p<0,01 a kontroll-ellenanyaggal szemben, ismételt méréses ANOVA. Hátsó végtag botlások A 19. ábra a hátsó végtag botlásait mutatja (átlag ±SEM). *p<0,05 a kontroll-ellenanyaggal szemben, ismételt méréses ANOVA. A pallón áthaladás idõtartama A 20. ábra a hátsó végtag botlásait mutatja (átlag ±SEM). *p<0,05 a kontroll-ellenanyaggal szemben, ismételt méréses ANOVA. Következtetések: – Az ellenanyag-kezelésnek nem volt hatása a lézió térfogatára. – Az ellenanyag-kezelésnek szignifikáns hatása volt a neurológiai pontszámra, a 2A10 ellenanyag legmagasabb dózisánál (10 mg/kg), a 24. óra idõpontban.
5
10
15
2
– A 2A10 ellenanyaggal történõ kezelésnek (3 mg/kg) szignifikáns hatása volt a jobb mancs használatára a henger-tesztben, különösen az 1. és 2. héten. – A 2A10 ellenanyag (3 mg/kg) egyértelmûen csökkentette a mellsõ végtag botlásainak számát a tMCAO-beavatkozást követõ 1. és 2. héten, a 2A10 ellenanyag (10 mg/kg) csökkentette a hátsó végtag botlásainak számát a tMCAO-beavatkozást követõ 2. héten, és a 2A10 ellenanyag mindkét koncentrációja csökkentette a pallón áthaladás idõtartamát a tMCAO-beavatkozást követõ 1. héten. A 2C4 ellenanyag (3 mg/kg) csökkentette a mellsõ végtag botlásait a tMCAO-beavatkozást követõ 3. héten.
Összefoglalás Összefoglalva, bár a kezelésnek nem volt hatása a léziók térfogatára, a 2A10 és 2C4 monoklonális ellen20 anyagok mindegyikének intravénás injektálása pozitív hatást mutatott a funkcionális javulásra a neurológiai pontszámok értékelése alapján, valamint a mancs ráhelyezésre és az ék alakú pallón áthaladásra, elsõsorban a tMCAO-beavatkozást követõ elsõ hetekben. 25 12. példa: Nogo cDNS transzfektálása SHSY5YAPP sejtekbe Az SHSY5Y-APPwt sejteket a transzfektálást megelõzõ napon tripszineztük, megszámoltuk és vályula30 tonként 2×105–1×106 sejtet újratelepítettünk 6 vályulatú tenyésztõlemezre (Nunc). A Nogot expresszáló konstrukciót [FLAG-toldott NogoA cDNS a pCDNA3 (Invitrogen) plazmidban] komplexbe vittük Plus™ reagenssel úgy, hogy a DNS¹t szérummentes tápközeg35 ben (OptiMEM–1) hígítottuk, Plus™ reagenst adtunk hozzá, megkevertük, majd szobahõmérsékleten 15 percen át inkubáltuk (6 ml Plus™ reagenst adtunk vályulatonként 2 mg DNS¹t tartalmazó, összesen 100 ml térfogatú OptiMEM–1 közeghez). Egy másik csõben LipofectAMINE™ reagenst hígí40 tottunk szérummentes tápközegben (OptiMEM–1) és megkevertük (4 ml lipofektamin, 100 ml térfogatban, vályulatonként). Az elõzetesen (a fentiek szerint) komplexbe vitt 45 DNS¹t érintkeztettük a hígított lipofektamin reagenssel, megkevertük, majd 15 percen át, szobahõmérsékleten inkubáltuk. Ezalatt a sejteket szérummentes tápközegben (OptiMEM–1) mostuk, majd a sejtekhez friss szérummen50 tes tápközeget adtunk (vályulatonként 800 ml¹t). Ezt követõen, a DNS-Plus-LipofectAMINE reagens komplexet hozzáadtuk a sejtekhez (200 ml), óvatosan megkevertük, majd a sejteket 5% parciális CO2-nyomás mellett, 37 °C¹on, 5 órán át inkubáltuk. Öt óra elteltével, szérumot tartalmazó tenyésztõ 55 tápközeg 1 ml¹ét adtuk a sejtekhez, és a sejteket éjszakán át, vagy 2 órán át inkubáltuk. Tizennégy (vagy 2 óra) elteltével az összes tápközeget eltávolítottuk és vályulatonként 1 ml OptiMEM–1 tápközeggel helyette60 sítettük. 32
1
HU 008 119 T2
Negyvennyolc óra kondicionálás elteltével, a tápközeget összegyûjtöttük és amiloidtartalomra nézve vizsgáltuk, amint azt a 13. példában ismertetjük. 13. példa: A b¹peptid detektálása IGEN ELISA eljárással Humaneredetû APPwt (amiloid prekurzor protein vad típusú variáns, „Amyloid Precursor Protein wild type”) vagy APPswe (amiloid prekurzor protein svéd variáns, „Amyloid Precursor Protein Swedish variant”) variáns szekvenciát erõsen expresszáló SHSY5Y sejteket helyeztünk 6 vagy 96 vályulatú Nunc lemezekre, a kívánt sûrûségben. Huszonnégy óra elteltével a vizsgálandó reagenseket (például ellenanyagot, peptideket, vegyületeket és hasonlókat) hozzáadtuk a sejtekhez 120 ml végsõ térfogatban, majd a sejteket 24 órán át inkubáltuk. A tápközeget eltávolítottuk a sejtekrõl és 50 ml térfogatot Ab x–40 vizsgálatára, 50 ml térfogatot Ab x–42 vizsgálatára alkalmaztunk, éjszakán át tartó ORIGEN immunvizsgálattal, az Ab C¹terminális végére specifikus ellenanyagok alkalmazásával. Röviden, az Ab peptideket biotinezett 6E10 (Signet Labs) alkalmazásával befogtuk. Oritoldalékkal jelölt, az Ab C¹terminális végére specifikus ellenanyagokat alkalmaztunk az Ab x–40 és Ab x–42 változatok detektálására. Az ellenanyag-Ab komplexeket streptavidinnel fedett Dynabead® mikrogömbökkel fogtuk be és IGEN M8 analizálókészülékkel vizsgáltuk. A sejtek viabilitását MTT reagenssel [3¹(4,5-dimetiltiazol-2¹il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid; tiazolil kék] ellenõriztük. Röviden, az MTT reagenst (5 mg/ml foszfáttal pufferezett fiziológiás konyhasóoldatban) 1:10 arányban hígítottuk tápközegben, majd 100 ml¹t adtunk a vályulatokhoz. Négy órán át, 37 °C¹on történõ inkubálást követõen 100 ml szolubilizálóoldatot (20% SDS/50% dimetil-formamid) mértünk be. A lemezek abszorbanciáját 590 nm hullámhosszon olvastuk le, Delfia Wallac lemez-leolvasó készüléken. Az eredményeket a 21–34. ábrák mutatják. A SHSY5Y-APPwt sejtek vad típusú APP¹t expresszálnak. A SHSY5Y-APPswe sejtek az APP svéd mutáns formáját expresszálják. 14. példa: NogoA expresszálódásának a hatása a szekretált Ab40 és Ab42 peptidek szintjeire Amikor NogoA proteint expresszáló expressziós konstrukciót viszünk be SHSY5Y-APPwt sejtekbe vagy SHSY5Y-APPswe sejtekbe, az Ab40 és Ab42 peptidek szintjei jelentõsen emelkednek, ami arra utal, hogy a NogoA valamilyen formában, közvetlenül vagy közvetve, modulálja az APP proteolitikus feldolgozását, és/vagy az Ab peptidek lebontását. Az a tény, hogy a módosított APP-feldolgozás terméke az Ab40 peptid, arra utalhat, hogy a Nogo hatása a b¹szekretáz-aktivitás modulálásának a szintjén történhet. A 21. ábra a szekretált Ab40 szintjének az emelkedését mutatja, amikor adott expressziós vektorból expresszálódik. A két, bal oldali oszlop kontrollokat mutat
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 33
2
[vektort önmagában, valamint kontrollproteint, azaz zöld fluoreszcens proteint („green fluorescent protein”, GFP)], amelyek az Ab40 háttértermelõdését mutatják ebben a sejtvonalban. A fennmaradó oszlopok azt mutatják, hogy az Ab40 peptid szignifikáns mértékben emelkedett szintjét detektáljuk, amikor a sejtben FLAG peptiddel fuzionált NogoA expresszálódik, és azt is, hogy hasonló, bár kevésbé jelentõs emelkedés figyelhetõ meg, amikor myc-hez fuzionált NogoB expresszálódik. Ugyanezt a kísérletet megismételtük Ab42 peptidre specifikus ELISA alkalmazásával. Az eredmények a szekretált Ab42 peptid szintjének hasonló emelkedését mutatták, mint az Ab40 peptidet alkalmazó, korábbi ELISA vizsgálatban. A NogoB ezúttal is fokozta az Ab42 peptid szekretálódását, és a fokozás ismét kevésbé jelentõs volt, mint NogoA esetében. Az eredményeket a 22. ábra mutatja. NogoA-val transzfektált sejtekbõl szekretált peptid szintjét az önmagában pCDNA3 vektorral összehasonlító, ismételt vizsgálatok eredményét mutatják a 23. (Ab40 esetében) és 24. (Ab42 esetében) ábra. A szekretált Ab40 és Ab42 peptidek szintjének a közvetlen összehasonlítását mutatja a 25. ábra. A 25. ábra 3–5 egyedi vizsgálat eredményének az átlagát mutatja, hogy megerõsítsük a Nogo szerepét. 15. példa: NogoA elleni ellenanyag gátolja az Ab40 és Ab42 peptidek szekrécióját SHSY5YAPPwt és SHSY5Y-APPswe sejtekbõl A 26. ábra endogén NogoA¹t expresszáló SHSY5YAPPwt sejtekbõl szekretált Ab40 és Ab42 peptidek szintjének a drámai csökkenését mutatja, amikor a tenyésztõközegbe 2A10 NogoA elleni ellenanyagot vittünk be. A hatás dózisfüggõnek tûnt, 30 mg/ml koncentrációnál a gátlás majdnem 90%¹os volt. Az Ab40 peptidre és az Ab42 peptidre kifejtett hatás között nem volt látható különbség (rendre a fehér és fekete oszlopok a 26. ábrán), más szavakkal, a NogoA elleni ellenanyag APP feldolgozásra kifejtett bármely hatása nem részesíti elõnyben sem az Ab40 peptidet, sem az Ab42 peptidet. A 27. ábra ugyanazt a vizsgálatot mutatja, mint a 26. ábra, azonban egy össze nem függõ (kontroll) IgG1 ellenanyagot alkalmaztunk. Az ábrán világosan látszik, hogy az össze nem függõ (nem NogoA elleni) monoklonális ellenanyagnak nincs gátló hatása az Ab40 és Ab42 peptidek sejtekbõl történõ szekretálódására. A 28. ábra azt mutatja, hogy ugyanaz az össze nem függõ (nem NogoA elleni) IgG1 ellenanyag alig, vagy egyáltalán nem mutat gátló hatást Ab40 és Ab42 peptidek szekretálódására NogoA¹t expresszáló SHSY5YAPPswe sejtekbõl. Hasonlóképpen, a 29. ábra a 26. ábrán ismertetettel azonos vizsgálat eredményét mutatja, azonban olyan monoklonális ellenanyagot alkalmaztunk, amely kötõdik NogoA-hoz, de funkcióját nem blokkolja (6D5). A funkciót nem blokkoló, NogoA elleni monoklonális ellenanyagnak minimális hatása volt (10%-nál kisebb) az
1
HU 008 119 T2
Ab40 és Ab42 peptidek szekretálódására NogoA¹t expresszáló SHSY5Y-APPwt sejtekbõl. Ez az eredmény arra utal, hogy a 26. ábra szerinti eredmények a Nogo funkcionális aktivitásának NogoA elleni ellenanyag által történõ gátlásán alapulnak. A 30. ábra a 29. ábrán ismertetettel azonos vizsgálat eredményét mutatja, funkciót nem blokkoló, NogoA elleni monoklonális ellenanyaggal (6D5), azonban endogén NogoA¹t expresszáló SHSY5Y-APPswe sejteket alkalmazva. Mint fentebb (29. ábra), ezen sejtek által szekretált Ab40 és Ab42 peptidek szintjére is minimális, 10%-nál kisebb hatás volt megfigyelhetõ. A 31. ábrán olyan vizsgálat eredménye látható, amely kiterjeszti a 26. ábra szerinti vizsgálat eredményeit. A 31. ábra mutatja, hogy a 2A10/3 ellenanyag funkciót blokkoló, koncentrációtól függõ hatása magasabb koncentrációnál folytatódik, 50 mg/ml ellenanyagkoncentrációnál 90%-nál nagyobb mértékû gátlás értetõ el. A 32. ábra a 31. ábrán ismertetettel azonos vizsgálat eredményét mutatja azzal a különbséggel, hogy SHSY5Yswe sejteket alkalmaztunk. A 2A10/3 ellenanyag koncentrációtól függõ gátló hatása itt is látható az 50 mg/ml¹es magasabb koncentrációnál. A 33. ábra egy másik, funkciót blokkoló, NogoA elleni ellenanyag, a 2C4 ellenanyag hatását mutatja Ab40 és Ab42 peptidek szekretálódására SHSY5YAPPwt sejtekbõl. Az eredmények koncentrációtól függõ gátló hatást mutatnak az Ab40 és Ab42 peptidek szekretálódására, amely 20 mg/ml ellenanyag-koncentráció mellett 36% szintre esik. A hatás ismét megfigyelhetõ mind az Ab40, mind az Ab42 peptidek esetében. A 34. ábra a funkciót blokkoló 2A10, 2C4 és 15C3 ellenanyagok (az ábrán feltüntetett koncentrációban), valamint 10A4, IgG2b és 14D12 kontroll-ellenanyagok hatását hasonlítja össze. Az ábra azt mutatja, hogy az Ab40 és Ab42 peptidek szekretálódásának a gátlása specifikus a funkciót blokkoló, NogoA elleni monoklonális ellenanyagokra.
5
10
15
20
2
16. példa: Fokozott NogoA-expresszió dózisfüggõen emeli az Ab-szinteket Abból a célból, hogy vizsgáljuk a NogoA expresszálódásának a hatását az Ab-szintekre, SHSY5Y-APPwt sejteket átmenetileg transzfektáltunk C¹terminálisan myc-toldalékkal ellátott, NogoA cDNS emelkedõ mennyiségeivel. A cDNS összes mennyisége (5 mg) a pcDNA3.1 myc cDNS¹t alkalmazó egyes transzfektálások esetében állandó volt. Negyvennyolc órával a transzfektálást követõen, a tápközeget eltávolítottuk és vizsgáltuk Ab40 peptidre nézve. Ezen túlmenõen, a sejteket összegyûjtöttük és 1% Triton X–100 reagenst és Complete proteázgátlókat (Roche) tartalmazó, 10 mmol/l Tris-pufferben lizáltuk. A sejtlizátumokat 10%¹os Novex Tris-glicin géleken elválasztottuk, majd Western-blot-vizsgálatnak vetettük alá, NogoA elleni ellenanyag alkalmazásával. A NogoA cDNS koncentrációjának az emelkedése szerint, a NogoA protein expresszálódásának a fokozódását figyeltük meg. Ez összhangban volt az Ab40-szintek megfelelõ emelkedésével a sejtek felülúszójában. Ennek megfelelõen, a NogoA expresszálódásának a fokozódása az Ab40szintek dózisfüggõ emelkedését okozza. Lásd a 36. ábrát.
25
30
35
17. példa: Kiméra 2A10 ellenanyag (HcLc) Humaneredetû IgG1/k vad típusú C¹régióra graftolt, szülõi egéreredetû V¹régiókat tartalmazó kiméra ellenanyagot terveztünk abból a célból, hogy referenciaként alkalmazható legyen humanizált konstrukciók tesztelésére. Egéreredetû rekombináns Rld plazmidban levõ Nogo 2A10 VH domént Hind III-Spe I helyen hasítottunk és hCgwt¹t tartalmazó Rld vektorba ligáltuk. Egéreredetû rekombináns Rln plazmidban levõ Nogo 2A10 VL domént Hind III-BsiW I helyen hasítottunk és hCk¹t tartalmazó Rln vektorba ligáltuk. A SEQ ID NO 92 ismerteti a HcLc nehézlánc-szekvenciáját:
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRP GQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQG YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTSSLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO 92). A SEQ ID NO 92 szerinti szekvenciát kódoló polinukleotidszekvenciát ismerteti a SEQ ID NO 93:
AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTACAGGT GTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCA GTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTG AAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGT ACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAA CTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG 34
1
HU 008 119 T2
2
GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAC AAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC TCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC (SEQ ID NO 93). A HcLc ellenanyag könnyû láncának aminosavszekvenciáját a SEQ ID NO 94 ismerteti:
20
MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNW FLQRPGQSPQLLIYIMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYP LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO 94). A SEQ ID NO 94 szerinti szekvenciát kódoló polinukleotidszekvenciát a SEQ ID NO 95 ismerteti:
30
AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCT GGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGA GAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACA TACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGAT GTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTG TCAACAACTT GTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGG AGCTGAAACGTACGGTGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCT GTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAC AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG GGAGAGTGTTAGGAATTC (SEQ ID NO: 95). 18. példa: Humanizált, NogoA elleni ellenanyagok kötõdnek humáneredetû Nogohoz GST-humáneredetû NOGO–56 fúziós proteinnel (1 mg/ml, 50 mmol/l Tris-pufferben, pH=9,5) fedtünk 50 Nunc Immunosorp lemezeket (vályulatonként 100 ml¹t) éjszakán át, 4 °C¹on. A vályulatokat egy alkalommal öblítettük 0,05% Tween-reagenst tartalmazó TBS-oldattal, majd 2% BSA proteint és 0,05% Tween-reagenst tartalmazó TBS-oldattal inkubáltuk 1 órán át, szobahõmér- 55 sékleten abból a célból, hogy blokkoljuk a nemspecifikus kötõhelyeket. Az ellenanyagokat 2% BSA proteint és 0,05% Tween-reagenst tartalmazó TBS-oldatban 10 mg/ml koncentrációra hígítottuk, és ezekbõl felezõ tovafutó hígításokat állítottunk elõ. Az ellenanyagokat két 60 35
párhuzamossal mértük a vályulatokba és szobahõmérsékleten, 1 órán át inkubáltuk. A vályulatokat háromszor mostuk 0,05% Tween-reagenst tartalmazó TBS-oldattal, majd 1 órán át, humáneredetû kappa lánc elleni, peroxidázzal jelölt konjugátummal (1:2000) inkubáltuk. Háromszor mostuk 0,05% Tween-reagenst tartalmazó TBS-oldattal, majd vályulatonként 100 ml OPD peroxidázszubsztráttal (Sigma) inkubáltuk 10 percen át. A színreakciót 25 ml tömény kénsavval állítottuk le. Az optikai denzitást 490 nm hullámhosszon mértük meg, lemezleolvasó készülék alkalmazásával. Az ellenanyag nélküli vályulatokhoz tartozó háttérértékeket kivontuk. A 35A–35C. ábrák a H1L11 humanizált ellenanyag versus HcLc kiméra ellenanyag dózisfüggõ kötõdését
1
HU 008 119 T2
mutatja humáneredetû NOGO-A56 proteinhez ELISA eljárással. Az Y tengely a 490 nm hullámhosszon mért optikai denzitást (OD) mutatja, amely a vályulatokban befogott ellenanyag mennyiségi értékmérõje. Az X tengely az egyes adatpontokban alkalmazott ellenanyag koncentrációját (mg/ml) mutatja. A H1L11 és HcLc ellenanyagok rendre 0,118 mg/ml és 0,022 mg/ml EC50értékeket adtak.
5
10 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Ellenanyag, amely az alábbi CDR¹ek mindegyikét tartalmazza: a SEQ ID NO 1, 2 és 3 szerinti könnyû lánc CDReket, a SEQ ID NO 4, 5 és 6 szerinti nehéz lánc CDReket, vagy azok funkcionális fragmensét vagy analógját, ahol az ellenanyag, funkcionális fragmense vagy analógja humáneredetû NogoA-hoz kötõdik és azt neutralizálja. 2. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amely humáneredetû NogoA proteinhez az 586–785 aminosavak közötti régióban kötõdik. 3. Az 2. igénypont szerinti ellenanyag, amely humáneredetû NogoA proteinhez az 586–685 aminosavak közötti régióban kötõdik. 4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amely monoklonális ellenanyag. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amely humanizált vagy kiméra ellenanyag. 6. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amelyben a nehéz lánc variábilis régió tartalmazza a SEQ ID NO 37 szerinti aminosavszekvenciát. 7. Az 1. vagy 6. igénypont szerinti ellenanyag, amelyben a könnyû lánc variábilis régió tartalmazza a SEQ ID NO 40 szerinti aminosavszekvenciát. 8. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amely a SEQ ID NO 37 szerinti szekvenciát tartalmazó nehéz lánc variábilis fragmenst, valamint egy humáneredetû nehéz lánc konstans részét vagy annak fragmensét tartalmazza; tartalmazza továbbá a SEQ ID NO 40 szerinti szekvenciát tartalmazó könnyû lánc variábilis fragmenst és egy humáneredetû könnyû lánc kons-
15
20
25
30
35
40
45
36
2
tans részét vagy annak fragmensét; vagy azok funkcionális fragmensét vagy analógját. 9. Gyógyászati készítmény, amely az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti, NogoA elleni ellenanyagot vagy annak funkcionális fragmensét vagy analógját, gyógyászatilag elfogadható hígítószerrel vagy vivõanyaggal együtt tartalmazza. 10. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti, NogoA elleni ellenanyag, funkcionális fragmense vagy analógja, stroke, traumás agykárosodás, gerincvelõ-károsodás, Alzheimer-kór, frontotemporális demenciák (tauopátiák), perifériás neuropátia, Parkinson-kór, Huntington-kór vagy sclerosis multiplex kezelési eljárásában történõ alkalmazásra emberben. 11. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti, NogoA elleni ellenanyag, funkcionális fragmense vagy analógja alkalmazása emberben stroke, traumás agykárosodás, gerincvelõ-károsodás, Alzheimer-kór, frontotemporális demenciák (tauopátiák), perifériás neuropátia, Parkinson-kór, Huntington-kór vagy sclerosis multiplex kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 12. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti, NogoA elleni ellenanyag, funkcionális fragmense vagy analógja stroke-ban, traumás agykárosodásban, gerincvelõkárosodásban, Alzheimer-kórban, frontotemporális demenciákban (tauopátiákban), perifériás neuropátiában, Parkinson-kórban, Huntington-kórban vagy sclerosis multiplexben szenvedõ, vagy azok kockázatának kitett humán páciensben neurodegeneráció gátlására és/vagy funkcionális javulás elõsegítésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazásra. 13. Az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti, NogoA elleni ellenanyag, funkcionális fragmense vagy analógja alkalmazása stroke-ban, traumás agykárosodásban, gerincvelõ-károsodásban, Alzheimer-kórban, frontotemporális demenciákban (tauopátiákban), perifériás neuropátiában, Parkinson-kórban, Huntington-kórban vagy sclerosis multiplexben szenvedõ, vagy azok kockázatának kitett humán páciensben neurodegeneráció gátlására és/vagy funkcionális javulás elõsegítésére alkalmas gyógyszer elõállítására. 14. In vitro eljárás axonsarjadzás elõsegítésére, amelyben humáneredetû axont érintkeztetünk az 1–8. igénypontok bármelyike szerinti, NogoA elleni ellenanyaggal.
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
37
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
38
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
39
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
40
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
41
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
42
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
43
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
44
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
45
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
46
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
47
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
48
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
49
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
50
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
51
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
52
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
53
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
54
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
55
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
56
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
57
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
58
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
59
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
60
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
61
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
62
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
63
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
64
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
65
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
66
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
67
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
68
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
69
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
70
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
71
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
72
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
73
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
74
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
75
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
76
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
77
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
78
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
79
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
80
HU 008 119 T2 Int. Cl.: C07K 16/22
81
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
