!HU000008250T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 008 250
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12N 5/10
(21) Magyar ügyszám: E 07 732142 (22) A bejelentés napja: 2007. 03. 27. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20070732142 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1999254 A1 2007. 10. 04. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1999254 B1 2010. 04. 07.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0606112 2006. 03. 28.
(73) Jogosult: Clasado Inc., Panama (PA)
GB
(72) Feltalálók: TZORTZIS, Georgios, Berkshire RG2 7 RR (GB); GOULAS, Athanasios, K., RG6 6AP (GB); GOULAS, Theodoros, RG6 6AP (GB) (54)
(2006.01) C12N 9/38 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07110619 PCT/GB 07/001081
(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Transzgalaktoziláló aktivitású béta-galaktozidáz
(57) Kivonat
HU 008 250 T2
A találmány tárgyát transzgalaktoziláló aktivitású, új b¹galaktozidáz képezi, amely képes laktózt galaktooligoszacharidok keverékévé átalakítani. Közelebbrõl,
a találmány tárgyát a Bifidobacterium bifidum egy közelmúltban leírt törzsébõl izolált b¹galaktozidáz képezi.
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala nem vizsgálta.
1
HU 008 250 T2
A találmány tárgyát transzgalaktoziláló aktivitású, új b¹galaktozidáz képezi, amely képes laktózt galaktooligoszacharidok keverékévé átalakítani. Közelebbrõl, a találmány tárgyát a Bifidobacterium bifidum egy közelmúltban leírt törzsébõl izolált b¹galaktozidáz képezi. Még közelebbrõl, a találmány tárgyát képezik izolált, új b¹galaktozidáz enzimet kódoló DNS-szekvenciák, az ilyen DNS-szekvencia által kódolt enzim, és a DNS-szekvenciát tartalmazó vagy a DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektort tartalmazó gazdasejt. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a DNS-szekvencia által kódolt enzim vagy a DNS-szekvenciát vagy a rekombináns vektort tartalmazó gazdasejt alkalmazása galaktooligoszacharidok elõállítására.
5
10
15 A találmány háttere A bifidobaktériumok a természetben a béltraktus alsó szakaszát kolonizálják, olyan környezetben, amely mono- és diszacharidokban szegény, mivel ezeket a cukrokat a gazda és a gyomor-bél traktus felsõ szakaszában jelen lévõ mikroorganizmusok felhasználják. Ahhoz, hogy a gyomor-bél traktus alsó szakaszában életben maradhassanak, a bifidobaktériumok különbözõ exo- és endoglikozidázokat termelnek felszínhez kötött és/vagy extracelluláris formában, miáltal képessé válnak különbözõ szénhidrátok felhasználására. Hidrolázaktivitáson felül a bifidobaktériumokból származó egyes enzimek transzferázaktivitást is mutatnak. A glikozidázok ezen transzgalaktoziláló aktivitását kiterjedten hasznosítják különbözõ oligoszacharidok enzimatikus szintézisére, amelyek bifidobaktériumok számára szaporodást elõsegítõ faktoroknak bizonyultak. Ismert, hogy bifidobaktériumok egyes tagjai b¹galaktozidáz enzimeket termelnek, amelyek részt vesznek a laktóz bakteriális metabolizmusában. Møller P. L. és munkatársai [Appl & Environ. Microbial. 62(5), 2276–2283 (2001)] három b¹galaktozidáz gén izolálását és karakterizálását írják le egy Bifidobacterium bifidum törzsbõl. Azt találták, hogy mindhárom b¹galaktozidáz képes volt béta-kötésû galaktooligoszacharidok képzésének katalizálására transzgalaktozilálással. Dumortier és munkatársai [Carbohydrate Research 201, 115–123 (1990)] béta-kötésû galaktooligoszacharidok elõállítását írják le transzgalaktoziláló reakcióval, laktózhidrolízis során, Bifidobacterium bifidum DSM 20456 jelzésû törzs alkalmazásával. Az elõállított oligoszacharidkeverék struktúrájának analízise azt mutatta, hogy a kötések b¹(1®3)¹, b¹(1®6)- és b¹(1®4)-D-galaktozil-kötések. Dumortier felvetette, hogy a Bifidobacterium bifidum által elõállított vegyületek szerepet játszhatnak a baktérium vastagbélhez történõ adherenciájában. A WO 01/90 317 számú nemzetközi közzétételi iratban új b¹galaktozidázt ismertetnek Bifidobacterium bifidumból, közelebbrõl, az enzim egy magas transzgalaktoziláló aktivitású csonkított változatát. Olyan Bifidobacterium bifidum törzset találtak, amely képes galaktozidáz enzim aktivitást elõállítani, amely a laktózt galaktooligoszacharidok új keverékévé
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
alakítja, amely nem várt módon akár 35% diszacharidot, ezen belül galabiózt [Gal(a 1–6)-Gal] tartalmaz. Errõl a diszacharidról ismert, hogy antiadhezív hatású, és képes toxinok, például Shigella toxin, és kórokozók, mint például E. coli tapadását meggátolni a bél falához [lásd Paton J C és Paton A W: Clin. Microbiol. Revs. 11, 450–479 (1998); Carlsson K A: Ann. Reviews Biochem. 58, 309–350 (1989)]. Ezt a Bifidobacterium bifidum törzset 2003. március 31.¹én, NCIMB 41171 számon letétbe helyezték a National Collection of Industrial & Marine Bacteria gyûjteményében (Aberdeen, Egyesült Királyság). A törzs leírása megtalálható továbbá az UK 2 412 380 számú szabadalmi leírásban. Azóta kimutatták, hogy ez a B. bifidum több b¹galaktozidázt termel, ezen belül egy új b¹galaktozidázt. Ez az enzim számos különbözõ oligoszacharidot állít elõ, amelyek b¹kötésûek. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi DNS-szekvencia, amely a 2. azonosító számú aminosavszekvenciájú proteint kódol. A DNS-szekvencia az 1. azonosító számú szekvencián megadott szekvencia, vagy tartalmazhatja annak fragmentumát vagy degeneratív variánsát. A leírás szerinti értelemben a „degeneratív variáns” kifejezés alatt75–95%-ban homológ DNS-szekvenciát értünk. Ilyen DNS-szekvencia tartalmazhat nukleotidszubsztitúciókat, ¹addíciókat vagy ¹deléciókat, amelyek kevesebb mint 25% változást okoznak a 2. azonosító számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciában. Nukleotidszubsztitúciók eredményezhetnek konzervatív aminosavszubsztitúciókat. A találmány egy második szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a fenti DNS-szekvencia által kódolt enzim. Ilyen enzim tartalmazhatja a 2. azonosító számú szekvencia szerinti aminosavszekvenciát vagy annak fragmentumát. A találmány egy harmadik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi rekombináns vektor, elõnyösen expressziós vektor, amely a fenti DNS-szekvenciát tartalmaz. Ilyen vektor gazdasejtbe juttatható, például baktérium¹, élesztõ- vagy gombasejtbe. Más eljárás szerint a DNS-szekvencia ilyen gazdasejtbe építhetõ. Alkalmas gazdasejt az alább felsoroltak közül van kiválasztva: Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus, például Bacillus subtilis vagy Bacillus circulans, Escherichia és Aspergillus, például Aspergillus niger. Laktózt alkalmazva szubsztrátként a fenti DNSszekvencia által kódolt enzim oligoszacharidok keverékét képezi, amely tartalmaz diszacharidokat, mint például Gal (b1–3) Glc, Gal (b1–3) Gal, Gal (b1–6) Gal és Gal (a1–6) Gal, triszacharidokat és tetraszacharidokat, mint például Gal (b 1–6) Gal (b 1–4) Glc, Gal (b 1–3) Gal (b 1–4) Glc és Gal (b 1–6) Gal (b 1–6) Gal (b 1–4) Glc. A fenti enzim vagy gazdasejt alkalmazható galaktooligoszacharidok elegyének elõállítására, amelyek a bél egészségének javítását célzó termék részét képezhetik. Ilyen termék lehet az alábbi csoportból válasz-
1
HU 008 250 T2
tott: tejtermékek (például folyékony tej, szárított tejpor, például teljes tejpor, fölözött tejpor; zsírral dúsított tejporok, savóporok, csecsemõknek szánt tejek, csecsemõtápszerek, jégkrém, joghurt, sajt, fermentált tejtermékek), italok, például gyümölcslevek, bébiételek, gabonakészítmények, kenyerek; kekszek, desszertek, sütemények, étrend-kiegészítõk, diétás kiegészítõk; állati tápok, baromfitápok, vagy bármilyen más élelmiszer vagy ital. A galaktooligoszacharidok jelenléte ilyen termékekben azzal az elõnnyel jár, hogy elõsegíti az egészséget javító Bifidobacterium szaporodását a termékben, vagy a termék elfogyasztását követõen a fogyasztó bélflórájában; vagy mindkét elõny érvényesül. További lehetõség szerint az így elõállított oligoszacharidok alkalmazhatók gyógyszer elõállítására, például tabletta vagy kapszula formájában, kórokozók vagy kórokozók által termelt toxinok bélfalhoz történõ adhéziójának megakadályozására. A gyógyszer beadható a betegnek, például antibiotikumkezelést követõen, amely gyakran vezet a normális, egészséges bélflóra megváltozásához vagy akár elpusztításához. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi eljárás a fent definiált enzim elõállítására, amely tartalmazza a fenti gazdasejt tenyésztését megfelelõ tenyésztõ tápközegben, az enzim expresszióját lehetõvé tevõ körülmények mellett, és a keletkezõ enzim vagy enzimtermékek kinyerését a tenyészetbõl. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás galaktooligoszacharidok elegyének elõállítására, amely tartalmazza a fent definiált enzim érintkeztetését laktózt tartalmazó anyaggal, olyan körülmények mellett, amelyek a galaktooligoszacharidok elegyének keletkezéséhez vezetnek. Alkalmas laktóztartalmú anyag kereskedelmi forgalomban lévõ laktóz, részben fölözött tej, teljes tej, fölözött tej, savó, zsírral dúsított tej és savópermeátum közül választható. Ilyen tejtermékek származhatnak tehenekbõl, bivalyokból, birkákból vagy kecskékbõl. Zsírral dúsított tejen olyan teljes tejet értünk, amelyet a tejzsír eltávolítására lefölöztek, majd amelyben az eltávolított zsírt növényi zsír vagy olaj hozzáadásával helyettesítették.
5
10
15
20
25
30
35
40
45 Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat Az 1. ábra a találmány szerinti, Bifidobacterium bifidum b¹galaktozidáz nukleotidszekvenciát mutatja (1. azonosító számú szekvencia). A 2. ábra az 1. ábra szerinti nukleotidszekvenciának megfelelõ aminosavszekvenciát mutatja (2. azonosító számú szekvencia). A 3. ábrán látható grafikon a galaktooligoszacharidszintézis során, b¹galaktozidáz, és szubsztrátként 0,1 mol/l foszfátpufferben oldott40 tömeg% laktóz közt, 6,0¹es pH mellett végbemenõ reakciót mutatja az idõ függvényében.
2
A 4. ábra a B. bifidum NCIMB 41171 törzsbõl származó b¹galaktozidáz által, szubsztrátként 0,1 mol/l foszfátpufferben oldott 40 tömeg% laktóz alkalmazásával, 6,0¹es pH mellett szintetizált galaktooligoszacharidkeverék nagy teljesítményû anioncserélõ kromatogramját mutatja (Glc=glükóz; Gal=galaktóz; Lac=laktóz, a(1–6)=galaktobióz; DP=polimerizációfok). Genomi DNS¹t izoláltunk a Bifidobacterium bifidum törzsbõl (NCIMB 41171) Lawson és munkatársai eljárásával [Fems Microbiol Letters 65(1–2), 41–45 (1989)]. A DNS¹t restrikciós enzimekkel emésztettük, és a maximálisan 15 kilobázispár (kbp) méretû fragmentumokat ugyanazon restrikciós enzimekkel emésztett pSP72-vektorba ligáltuk. A B. bifidumból származó, Pstl, EcoRI, BamHI, KpnI, SmaI vagy HindIII enzimekkel emésztett kromoszomális DNS¹t tartalmazó inszerciókat tartalmazó vektorral E. coli-sejteket transzformáltunk, b¹galaktozidázaktivitású klónokat szelektáltunk p¹nitro-fenil, X¹b-Gal (5¹bróm-4-klór-3-indolil-b-Dgalaktozid) és izopropil-b-D-tiogalaktozid (IPTG) tartalmú Luria-Bertani agarlemezeken. Pstl-emésztett kromoszomális DNS-sel készült ligációs elegyek tizenhárom b¹galaktozidáz-pozitív klónt eredményeztek, amelyek egyikét pP2-klónnak neveztük. Az inszertált P2 DNS-fragmentum DNS-szekvenálását Sanger didezoxi-láncterminációs eljárásával végeztük [Russel P.: Genetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187–189 (2002)] a BigDye Terminator V.3.O. Cycle szekvenálókészlet alkalmazásával (Applied Biosystems, USA). A P2 DNS-szekvenciáját az 1. ábra mutatja (1. azonosító számú szekvencia). A nyitott leolvasási fázist („open reading frame”; ORF) az NCBI (National Center of Biotechnology-Information) oldalán található ORF-finder (nyitott leolvasási fázis keresõ) program alkalmazásával lokalizáltuk. Az 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotidszekvenciát mind a hat lehetséges leolvasási fázisban transzláltuk, és egy 738 aminosavból álló, feltételezett b¹galaktozidázt kódoló nyitott leolvasási fázist azonosítottunk. A transzlációt a 2. ábra mutatja (2. azonosító számú szekvencia). A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a következõ példákra történõ hivatkozással szemléltetjük.
1. példa Anyagok és módszerek A vizsgálatok során felhasznált valamennyi vegyszer és tápközegkészítmény a Sigma (Dorset, Egyesült Királyság), Invitrogen (Paisley, Egyesült Királyság), Oxoid (Basingstoke, Egyesült Királyság), Qiagen (West 55 Sussex, Egyesült Királyság) és Promega (Southampton, Egyesült Királyság) cégektõl származott. 50
Baktériumtörzsek A Bifidobacterium bifidum törzset (NCIMB 41171) 60 fagyasztógyöngyökön tartottuk fenn Microbanc csövek3
1
HU 008 250 T2
ben, –70 °C¹on. A késõbbi kísérletekhez a törzset Wilkinson Chalgren (WC) agaron (Oxoid, Egyesült Királyság) és TPY tápközegben (triptikáz phytone élesztõkivonat tápleves) és anaerob körülmények mellett (CO2 és N2 összetételû, 80% és 20% arányban), 37 °C¹on, 48 órán át ismét felszaporítottuk. Ellenõriztük a telepmorfológiát és Gram-festéssel a kontaminánsok hiányát. E. coli törzsek A kísérletekben alkalmazott DH5a Escherichia colitörzset szokásosan aerob körülmények mellett inkubáltuk 37 °C¹on, Luria Bertani (LB) agaron vagy táplevesben [Sambrook J. és Russell W. D.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)], szükség szerint antibiotikumokkal (100 mg/ml ampicillin és/vagy 15 mg/ml kloramfenikol) és 40 ml 2%¹os X¹P-Gal-val, 7 ml 20%¹os (izopropil-b-D-tiogalaktozid) IPTG-vel kiegészítve, mely utóbbiakat az elkészített 90 mm átmérõjû agarlemez felszínére vittünk fel. A DH5a Escherichia coli-törzs (Invitrogen, Paisley, UK) [genotípus: F¹ j80lacZDM D(lacZYAargF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk¹, mk¹) phoA supE44 thi¹1 gyrA96 relA1l¹] egy a¹galaktozidáz-pozitív törzs, és azt alkalmaztuk az expressziós kísérletekben és egyéb génmanipulációs vizsgálatokban. Genomi DNS extrakciója Bifidobacterium bifidum törzsbõl Genomi DNS¹t izoláltunk Bifidobacterium bifidum törzsbõl (NCIMB 41171) az alábbi eljárással, amelyben kromoszomális DNS¹t 100 ml WC anaerob táplevesbõl kiülepített sejtüledékbõl állítottunk elõ. A sejteket 10 ml TES-pufferben (10 mmol/l Tris-HCl, 10 mmol/l EDTA, 10 mmol/l NaCl, pH=8) újraszuszpendáltuk, és 30 percig, 37 °C¹on, 200 ml lizozim/mutanolizin eleggyel kezeltük (4:1; lizozim 10 mg/ml, mutanolizin 1 mg/ml). Ezután a sejteket 200 ml proteináz-K-val (20 mg/ml koncentrációban) és 200 ml RNáz-zal (10 mg/ml koncentrációban) kezeltük, és egy órán át, 65 °C¹on inkubáltuk. Végül a sejteket 2 ml 10% SDS-sel kezeltük, és 15 percig 65 °C¹on inkubáltuk. Ehhez 12 ml fenol/kloroform elegyet adtunk, és az extrakciót addig ismételtük, amíg a vizes fázis könnyen elválasztható volt az interfázistól. A genomi DNS¹t izopropanollal precipitáltuk, és 10 mmol/l Tris-HCl – 1 mmol/l EDTA (pH=8) pufferben újraszuszpendáltuk. Ezután a genomi DNS¹t restrikciós enzimekkel emésztettük, ugyanazon enzimekkel emésztett pSP72-vektorba ligáltuk, és alkalikus foszfatázzal kezeltük. B. bifidum genomi DNS emésztését EcoRI, PstI, BamHI, SmaI és KpnI enzimek alkalmazásával végeztük. Ligációs elegyek alkalmazásával E. coli DH5a sejteket transzformáltunk, és b¹galaktozidáz-pozitív telepeket kék szín alapján azonosítottunk X¹Gal-tartalmú lemezeken. Vektor-DNS elõállítása A kísérletek során klónozásra és expresszáltatásra alkalmazott vektor a pSP72 volt (Promega, Egyesült
5
10
15
20
25
30
35
40
2
Királyság) [Krieg, P. A. és Melton, D. A.: In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 155, 397–415 (1987)]. Erre a vektorra azért esett a választás, mivel hiányzik belõle a b¹galaktozidáz a¹fragmentumának komplementáló aktivitása, amely a pSP72-ben nem kódolt. Ez a vektor nem hordozza az E. coli DNS szabályozó szekvenciáját tartalmazó rövid szegmenst és a b¹galaktozidáz elsõ 146 aminosavát kódoló információt, és a b¹galaktozidáz karboxiterminális részét expresszáló E. coli-törzsekkel (azaz DH5a) kombinálva aktív b¹galaktozidázt eredményez (a-komplementáció). A vektort a következõ restrikciós enzimekkel emésztettük: PstI, BamHI, HindIII, SmaI, KpnI és EcoRI, a gyártó utasításai szerint eljárva, az enzimet a DNS-hez képest tízszeres feleslegben alkalmazva (enzimegységek:mg DNS arány: tíz egység enzim/egy mg plazmid-DNS; vagy tíz enzim egység/0,5 pmol plazmid-DNS). Miután az enzimet hõvel inaktiváltuk (20 perc, 65 °C¹on), a restrikciós mintázatot horizontális gélelektroforézissel analizáltuk. Egyetlen fragmentum jelenléte a gélen a vektor teljes emésztését jelezte, és annak egyetlen restrikciós enzimmel történõ hasítására utalt. A vektor megfelelõ emésztését oly módon is ellenõriztük, hogy nem ligált molekulákkal kompetens E. coli DH5A sejteket transzformáltunk. Az ampicillinnel (100 mg/ml) kiegészített LB¹agarlemezeken képzõdõ telepek számát az emésztetlen molekulák indikátorának és a várható háttérnek tekintettük a további kísérletek során. A vektorokat ezután borjúbél alkalikus foszfatázzal („calf intestinal alkaline phosphatase”, CIAP; Promega, Southampton, Egyesült Királyság) defoszforileztük a gyártó utasításai szerint eljárva. A kezelés hatékonyságát ligálással (bakteriofág T4 DNS-ligázzal, a gyártó utasításai szerint), majd DH5a-sejtek transzformációjával ellenõriztük. A képzõdõ telepek száma az újból cirkulárissá alakult molekulák (nem klónozott vektorok) számának felelt meg, és a fenti számot a CIAP vektor kezelés nélkül képzõdött telepek számából kivonva következtethetünk a nem defoszforilezett vektorok számára.
45 Genomi DNS-könyvtár létrehozása Genomi DNS¹t részlegesen emésztettünk hat restrikciós enzimmel, amelyek gyakran elõforduló hexanukleotidszekvenciákat ismernek fel prokarióta DNS50 ben. Az EcoRI, BamHI, Pstl, Kpnl, SmaI és HindIII II¹es típusú restrikciós endonukleázok, amelyek specifikus módon az 5’G/AATTC’3, 5’G/GATCC’3, 5’CTGCA/C’3, 5’GGTAC/C3’, 5’CCC/GGG3’ és 5’A/AGCTT’3’ szekvenciákat ismerik fel, és a fenti szekvenciákban kettõs 55 szálú hasításokat eredményeznek, EcoRI, BamHI és HindIII enzimek esetében négy nukleotidból álló, AATT, GATC, illetve AGCT szekvenciájú, túllógó (tapadós) 5’¹végekkel; PstI és KpnI enzimek esetében ACGT, illetve GTAC szekvenciájú, túllógó 3’¹végekkel; 60 és SmaI esetben tompa végekkel. 4
1
HU 008 250 T2
Valamennyi fenti enzim csak divalens magnéziumionok jelenlétében aktív és képes DNS hasítására. Kofaktorként csak ezekre az ionokra volt szükség. DNS restrikciós emésztése A genomi DNS-minták valamennyi restrikciós emésztéséhez azokat2 órán át, 37 °C¹on inkubáltuk, végül 20 percig, 65 °C¹on hõvel inaktiváltuk. Ezután a reakciókat szobahõmérsékletre hûtöttük, és a megfelelõ mennyiségû futtatópuffert hozzáadtuk, majd lezárt üvegkapillárissal óvatosan elkevertük. Ezt követõen az oldatokat 0,8% agarózgél zsebeibe töltöttük (4–5 volt/cm térerõ, 14–16 órán át), és az emésztett DNS méretét 1 kilobázispár (kbp) DNS-standardokkal történõ összehasonlítás alapján megbecsültük [Sambrook J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)]. A restrikciós emésztést követõen keletkezett fragmentumok tisztítása A fragmentumokat a reakcióelegyekbõl és az agarózgélekbõl a Qiagen cégtõl származó QIAEX gél extrakciós készlet alkalmazásával végeztük (West Sussex, Egyesült Királyság). Az eljárás részletes leírása megtalálható a gyártó használati útmutatójában. DNS-ligálás és transzformáció Miután a DNS-fragmentumokat a Qiaex gél extrakciós készlettel tisztítottuk, azokat CIAP-kezelt pSP72vektorral ligáltuk. A ligáláshoz megfelelõ mennyiségû DNS¹t mértünk steril, 0,5 ml térfogatú mikrocentrifugacsövekbe, az 1. táblázatban bemutatottak szerint. 1. táblázat Ligációs elegyek. Az A csõ önmagával ligálódott vektor-DNS¹ek számát mutatja, amelyet a transzformációt követõen a transzformánsok teljes számából ki kell vonni. A B csõ a DNSfragmentumokkal ligált vektort mutatja, és a C csõ a kontrollt mutatja transzformáció hatékonyságának kiszámításához Csõ
DNS
A
Vektor (15 fmol [~29,7 ng])
B
Vektor (15 fmol [~29,7 ng DNS]) plusz inszert (idegen 15 fmol, ~69,3 ng)
C
pUC-kontroll (0,056 fmol [~100 pg])
A ligációs reakcióban a plazmid DNS-vektor és inszert-DNS moláris arányának ~1,1-nek kell lennie. A végsõ DNS-koncentrációnak ~10 ng/ml-nek kell lennie.
Mindegyik ligálás elõtt a DNS-fragmentumokat 5 percig 45 °C¹ra melegítettük, a fragmentumok elõkészítése során esetlegesen újra összekapcsolódott kohezív végek szétválasztására. Valamennyi ligációs reakcióhoz vektor:DNS moláris arányként 1:1 arányt választottunk, és a reakció összeállítását a Promega utasításai szerint végeztük.
5
10
15
20
25
2
Az A és B csövekhez 1,0 ml 10X ligációs puffert és 0,5 Weiss egység T4 DNS-ligázt (Promega, Egyesült Királyság) adtunk, és a ligációs térfogatot molekuláris biológiai vizsgálatokhoz elõírt tisztaságú vízzel 10 ml¹re egészítettük ki. A DNS-fragmentumokat a vízzel együtt a csövekhez adtuk, majd 5 percig, 45 °C¹ra melegítettük az elõkészítés során esetlegesen újra összekapcsolódott kohezív végek szétválasztására. Mielõtt a ligációs reakció többi összetevõjét hozzáadtuk, a DNS¹t 0 °C¹ra hûtöttük, és a reakcióelegyeket egy éjszakán át, 16 °C¹on inkubáltuk [Sambrook és Russell: (2001)]. Miután a ligált fragmentumokat etanollal precipitáltuk és tisztítottuk (a transzformáció hatékonyságát csökkentõ ligációs elegy eltávolítására), transzformációt végeztünk Hanahan leírása szerint. Körülbelül 50 ng ligált DNS¹t adtunk 5 ml oldatban 100 ml kompetens DH5a-sejthez. Hõkezelést és az ampicillinrezisztencia-gén expresszióját követõen a sejteket ampicillin (100 mg/ml), X¹b-Gal (40 ml 2%¹os X¹b-Gal) és IPTG (7 ml 20%¹os IPTG) tartalmú LB¹lemezek felszínére szélesztettük. A transzformások számát mindegyik ligációs reakció esetében meghatároztuk. A C csõbõl rendszerint 2×105–1×106 cfu/mg, az A csõbõl 500–600 cfu/mg transzformánst kaptunk. Az A csõbõl kapott transzformánsok száma a vektor-DNS kezelésének hatékonyságára utalt. A B csõ esetében kapott transzformánsok száma 2–4×104cfu/mg tartományba esett.
30 Transzformánsok száma PstI-emésztett kromoszomális DNS ligációs elegye 13 b¹galaktozidáz-pozitív klónt eredményezett ~2500 szûrt transzformánsból, míg a BamHI-emésztés 35 7 pozitív klónhoz vezetett (~1500 szûrt transzformánsból), az EcoRI 3 pozitív klónt eredményezett (~1300 szûrt transzformánsból), a KpnI 7 pozitív klónt eredményezett (~2000 szûrt transzformánsból), a SmaI 3 pozitív klónt eredményezett (~1600 szûrt 40 transzformánsból), és a HindIII 2 pozitív klónt eredményezett (~1200 szûrt transzformánsból). Pozitív klónok emésztése A különbözõ b¹galaktozidáz gének azonosítására a 45 pozitív klónokból izolált plazmidokat a következõ táblázatban megadottak szerint emésztettük. Minták
50
1. emésztés
pB1, pB2, pB3, pB4, pB5, pB6, pB7
BamHI
2. emésztés
pP1, pP2, pP3, pP4, pP5, pP6, pP7, pP8, pP9, pP10, pP11
PstI
3. emésztés
pP12, pP13, pP14
PstI
4. emésztés
pE1, pE2, pE3
EcoRI
55
60 5
Enzimek
1
HU 008 250 T2
2. táblázat (folytatás) Minták
Enzimek
5. emésztés
pP1, pP12, pB1, pP2, pE1, pE2, pE3…
PstI és EcoRI
6. emésztés
pS1, pS2, pS3
SmaI
7. emésztés
pP1, pP12, pB1, pP2, pS1, pS2, pS3
PstI és SmaI
8. emésztés
pK1, pK2, pK3, pK4, pK5, pK6, pK7
KpnI
9. emésztés
pP1, pP12, pB1, pP2, pK1, pK2, pK3, pK4, pK5, pK6, pK7
PstI és KpnI
Az elsõ betû (p) plazmidot és az inszert gént jelenti, míg a második betû (P, B, E, S, K) azt a restrikciós enzimet jelöli, amelyet alkalmaztunk a megfelelõ klón genomi DNS-bõl történõ izolálásához.
Emésztést követõen a kapott fragmentumok gélelektroforézis-analízise azt mutatta, hogy a pB1, pP1, pP2 és pP11 plazmidok különbözõ b¹galaktozidázokat kódoló inszerteket tartalmaznak. A P2¹inszertet tartalmazó klónokat választottuk további vizsgálatokra. DNS-szekvenálás DNS-szekvenálást Sanger didezoxi-láncterminációs eljárásával végeztük, a BigDye Terminator V.3.O. Cycle szekvenálókészlet alkalmazásával (Applied Biosystems, USA), és az ABI Prism 3100 berendezéssel, egy fluoreszcenciaalapú, kapilláris elektroforézist magában foglaló DNS-analízis-rendszerrel analizáltuk. Az inszertált DNS-fragmentumok 5’¹ és 3’¹végeit vektorspecifikus primerek segítségével szekvenáltuk. Az inszerteket Genome Priming System (GPS¹1) (New England Biolabs, Egyesült Királyság) rendszerrel is szekvenáltuk. A GPS¹1 TN7-transzpozon alapú in vitro rendszer, amely TnsABC Transzpozáz alkalmazásával, random módon transzpozont inszertál a célzott DNS¹be. Az 1:4 donor/cél-DNS tömegarányt a gyártó utasításai szerint választottuk. A Transprimer célplazmidba történõ inszercióját követõen szekvenálásra kiválasztott izolált plazmidok száma 25 volt. Ezt a számot a gyártó utasításai szerint határoztuk meg, 5¹szörös lefedettséget feltételezve. A pP2-plazmid hosszú nukleotidszekvenciáját figyelembe véve, amelyen P2¹protein kódolt, csak a b¹galaktozidáz gént tartalmazó részt választottuk szekvenálásra. Az a tény, hogy az enzim a transzpozáz-inszert a szekvenált fragmentum 172. bp relatív pozíciójába történõ inszertálódását követõen inaktiválódott, arra utalt, hogy a startkodon ettõl a pozíciótól 5’¹irányban (upstream) volt. Hasonlóképp, inszert inszerciója a 2882 bp pozícióba teljesen megszüntette az enzimaktivitást, jelezve, hogy a stopkodon ettõl a pozíciótól 3’¹irányba (downstream) esik. Ezenfelül az enzimaktivi-
2
tás teljesen megszûnt, amennyiben inszert az elsõ szekvenált nukleotidhoz képest 262 bp, 331 bp, 375 bp, 621 bp, 866 bp, 1348 bp, 1358 bp, 1394 bp, 1513 bp, 1704 bp, 2128 bp, 2519 bp pozíciókba inszer5 tálódott. Az N¹terminális domén analízise Signally and PSORT programcsomaggal nem igazolta szignálpeptid jelenlétét, arra utalva, hogy a P2 nem szekretálódik extracellulárisan. A szekvenáló reakcióelegy körülbelül 400–600 ng 10 plazmid-DNS¹t, 3,2 mmol/l primer oldatot és 4 ml BigDye Terminator oldatot tartalmazott. Nyitott leolvasási fázis azonosítása A P2 nyitott leolvasási fázisát (ORF) az NCBI weboldalán található „ORF finder” (nyitott leolvasási fázis keresõ) programjával lokalizáltuk (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). A bakteriális genetikai kódot alkalmaztuk, és a keret hosszát 100 bázis20 párban határoztuk meg. A nukleotidszekvenciát hat lehetséges leolvasási fázisban transzláltuk, és egy 738 aminosavból álló, feltételezett b¹galaktozidázt kódoló nyitott leolvasási fázist azonosítottunk. A transzlációt a 2. ábra mutatja (a transzlációt a 2. ábra mutatja). 25 2. példa Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 törzsbõl izolált, klónozott b¹galaktozidáz enzim szintézise E. coli gazdasejtekben (DH5a törzsben) Az alábbiakban ismertetett szintézist, hacsak kifeje30 zetten másképp nem kötjük ki, teljes E. coli DH5a gazdasejtek alkalmazásával végeztük, miután az E. coli biomasszát (amelyet 10 000 g¹n végzett centrifugálással gyûjtöttünk össze) a sejtpermeabilitás növelésére, 35 és egyúttal a citoplazmamembrán roncsolásával a sejtek életképességének megszüntetésére 2000 ppm („parts per million”) koncentráció mellett toluollal kezeltük. Az E. coli biomasszát az 1. példában, „E. coli-törzsek” pont alatt ismertetettek szerint állítottuk elõ. 40 Szintézis klónozott enzimmel A b¹galaktozidázzal szintézist 40 tömeg% kiindulási laktóz-szubsztrátkoncentráció mellett végeztünk. A szintézisoldatot 1 g/l Tween-80-detergenst [poli(oxi45 etilén)(20)-szorbitán-monooleátot] is tartalmazó 0,1 mol/l foszfátpufferben (pH=6,0) készítettük. A szintézist 40 °C¹on végeztük, 150 rpm¹en rázatott vízfürdõben. A specifikus enzim pH¹optimumát specifikus enzimkészítmény különbözõ pH¹értékek mellett végzett 50 aktivitásmérések alapján választottuk (o¹nitro-fenil-b-Dgalaktopiranozid szubsztrát alkalmazásával). A galaktooligoszacharidszintézishez 2 ml sejtlizátum-felülúszót alkalmaztunk (az E. coli-sejtek Frenchsajtóban történt roncsolását követõen) 8 g 50 tömeg% 55 laktózzal, hogy 40 tömeg% szubsztrát-végkoncentrációt kapjunk. Ez az enzimkészítmény 735 U/ml aktivitású volt. A szintézis során az elegyben jelen lévõ különbözõ cukrok koncentrációját a 3. ábra mutatja. A B. bifidum 60 NCIMB 41171 törzsbõl klónozott b¹galaktozidázzal 15
6
1
HU 008 250 T2
2
kromatogramjait mutatja a 4. ábra. A galaktooligoszacharidkeverék cukorkoncentrációit az optimális szintézis idõpontjában az 1. táblázatban adtuk meg.
szintetizált galaktooligoszacharidkeverék pulzáló amperometriás detektálással kapcsolt nagy teljesítményû anioncserélõ kromatográfiával (HPAEC-PAD) kapott
1. táblázat Galaktooligoszacharidszintézis szénhidrát-összetétele 40 tömeg% kiindulási laktózkoncentráció mellett, a megfigyelt maximális oligoszacharidkoncentráció idõpontjában Szintézis kezdete Szubsztrát
GOS DP³3
Tömeg%
40
GOS DP=2
Lac
Glc
Gal
Koncentráció (összes cukor százalékában)
8,82
16,25
39,40
20,76
14,85
Lac: laktóz; Glc: glükóz; Gal: galaktóz; DP: polimerizációfok („degree of polymerisation”)
Szekvencialista <110> MCDONALD, Sarah C <120> Product and Process <130> 14011:KG <150> GB 0606112.1 <151> 2006–03–28 <160> 2 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 4395 <212> DNA <213> Bifidobacterium bifidum <220> <221> Beta-galactosidase <222> (1)..(4395) <400> 1
tcctttagat ctttttgaaa cagaccccgt gctgcttgca taccaactct ttctagtgta tcgctctgct ggttggactc cgtgcacaca agctatgaga gcagggtcgg atagtcctgt gggggcggag gctggccttt ttaccgcctt cagtgagcga cgattcatta ccggcagatc acctgcagaa ggagggccag tagcggctgg atgcgggctg atgcgacggt acgcagaaag cggtgattac gaagaaggcc ggaggaaggc gggcatcgct
tggattgaaa atttcatgac agaaaagatc aacaaaaaaa ttttccgaag gccgtagtta aatcctgtta aagacgatag gcccagcttg aagcgccacg aacaggagag cgggtttcgc cctatggaaa tgctcacatg tgagtgagct ggaagcggaa atgcaggtta tgatatcatc gtactggcag tgtccgcttg ccctccctac gcgcgatatg tcggccgggg cacagtcggc aatcccgacc ggcgtcaacc aagtacgatt gtagacctcg
acttcctttt caaaaatccc aaaggatctt cccccgctac gtaactggct ggccaccact ccagtggctg ttaccggata gagcgaacga ctteccgaag cgcacgaggg cacctctgac aacgccagca ttctttcctg gataccgctc gagcgcccaa acctggctta gatgaattcg tccggcctcg cagcatgcgt ggaacatgta gcaccagccc cgtcagacaa cgcagccgct aatggccgga ttgtatcagt tcgactggct cctccgccac
tttatgtaaa cttaacgtga cttgagatcc cagcggtggt tcagcagagc tcaagaactc ctgccagtgg aggcgcagcg cctacaccga ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt cgttatcccc gccgcagccg tacgcaaacc tcgaaattaa agctcggtac ccgccggcgc cacgttcgtc tatgatatgg gcatcgcatg tgaacaagta gaagggcgcc ggaggtctgg cggcatcttc ggaccgtgcc cgcctccccg 7
aggatattcg gttttcgttc tttttttctg ttgtttgccg gcagatacca tgtagcaccg cgataagtcg gtcgggctga actgagatac ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc tgattctgtg aacgaccgag gcctctcccc tacgactcac ccggggatcc cgtcaaggag tgacggtctt agggacgctc tcacagttga atggagcgga gaatcccgtc gacgatgata tcatgggcga atcgataagc ccgatgtggc
gggaaattcc cactgagcgt cgcgtaatct gatcaagagc aatactgttc cctacatacc tgtcttaccg acggggggtt ctacagcgtg ccggtaagcg tggtatcttt tgctcgtcag ctggcctttt gataaccgta cgcagcgagt gcgcgttggc catagggaga tctagagtcg tgatctcgcg gacgtgcgcc accgtgtgcg tttttcgtcg atatgagtaa tctggtatgg tccgtctgat agatcgagcc tcggcaaggc tgacccaggc
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680
HU 008 250 T2
ccatccggag gcattggcgt ggccgagcac ctgccacaac gaagcgctac gcacatgaac gaacccgggc catcgccgaa catggtgtct cgtctccaac cgcgtcgctg ctccgcggtg ctccctcgcg caaggccggc gatcttccgt gatgggcacc ggccaccgag ttggttccgc ttgggattcc ccgcagggtt attgagcgac cgtcggcgtg tcacctcgac ggccgacacg ggtgccggcc tctgggccgt ggacctcgcc ccgcttcgag ggccatcgcg tgttgtcgtg gtatgtttgc ggctgcggcg gaagcaggaa gtggccaagg gggcgacaag caactactac ggccagtgcg cccgaaggtc ccagaagctg atcagggcta aatacggtga ggccttcaca tcccgacaca tgcacctgca agcgcgccgc actctgatcg
gtgctgtgga ccgacgagcc tataagggca cgcttcgact aagaccatcg gatttctccg aagctgctcg cgtgacgtgc gccggcggct gaccactact atggacggca aattggcgtc caggtcgcta gcggagaagt gatgtgtgcg aagacggtca tacaccgcga gcgcttgccg tacgagattg cgggagttcg gagaacgacc cgcgtcgaag ctggacaatg tccacggtac atcgtggcca caggggcttg ggtgatggcc ttcgtgttca gcttcgctcg ctcaggcgat ggtgacacgc atgctggtca ggcgacgtca acttcaaaaa acctgggacg atcacgtccg acgctgttct aaggcccgcg agcgatggcg caccgtcaag ccttcggtca tatctgcccc tcgagcacgc tatctttgtg cggacacgcg ccaat
aggacgagcg ctgtgttccg acccatacgt actcggacga acgcggtgaa agatcatccc actacaagcg tggagtccat cgatgcttga tcacgccggg tttcacgcaa cgatcaacta tgggcgccga ggcactcctc agctgggcgc agtccaaggt acccgaccca acaacggcat ccgtgctgcc tggcgaacgg acatctggct agttcgcccc gcacggtggc tggcctccta acgggtatgg cgaagagcct gcgtgctgcg accgcaccca cgcatgtcga aatcgttgga gacatacgcc gcgtcgctgc aggaaatcac aggagaccgg agttctatca acaccggtgt ccaccgaagg gtatcttcgg tcgccgcttt taaccttcgc tcccttcctc tgttgcaacg taaggagatg ttgctcaaga caccctcatc
cggcgacacc cgagtacgcg ggtggcctgg cgccatgcgc cgaggcctgg gcctcgctac gttcagctcc cacgccgggt ctatgacgac cgaggaccat ggaaccgtgg ccgtgcggag tgccatctgc gatggtgccg cgatctggga cgccgtcgtg gcaggtcgat caccgccgac gtgcgtgtat cggcaagttg tggcggctac gatgggcaac gcatgacttt taaggcggaa cgacgggcgg gccggcgatg tgtcgaacgc tgaaccggtg cgacgggcgg aacactgggc ttatgggaaa gtgcggcaac cgtgtgggct catcaatgtc ggacgccaag cgccggcttc cgagacggtc cgactacctt gggaacaggc agtcaagcaa gtgtgaaggc cgcgtgtaaa acatgacgat tctgtgagat accgaatgga
gtgtggccgg ctgaacctgt cacgtgagca gccttccaga ggaacagcgt atcggtgacg gacgcgctca ctgccgctga tggggtgcgg ttcgacgagg ttccagatgg ccgggctcgg tatttccagt catgcgggcg cgtctgtccg ttcgactacg cattggaccg gtggttccgg ttgctgtccg ttcgtgacgt ccgggctcga gacatgccgg gccgacgtga cgctggaccg accgtatatg ctgggttcca gccgacgccg accgtcgacg gccaccatcg tgtaagggct gaaggcgctg tcaagcagca tggggcctac aacctggtga aagattcaca tacgactcga accattaacc ggcaagtcct tctgaaggac tctggcgtgg ccctcccctc ctctacgatg atcggcacgg gacactggca cgggggacca
gtgcccgtga gccgtcgtat acgaatacgg agtggtgcaa tctgggccca gcaacttcat aggagctcta ccaccaattt aggtcgattt ttgcgtacgc agcattccac tcgtgcgcga ggcgacagtc aggattcgca acgagggtct agtcccagtg agccgttgga tgcggtccga aagagacgag actacaccgg ttcgtgacgt gcgcattgga tcacgcccac gcatgaacga tcggatgccg tggggctgtc cggcggcgag ttgaagggga atccgacggg taggaaaggc gcgcttaccg gctccgctcc gctgactcag acaccggcca cccttggcga tgacctggct tgactggcgc acaccggcaa tacgcgaagg taatgaccgg aacagggagg agcgaattct ttgtggcggc gcacgcctcc tatcatgacg
<210> 2 <211> 738 <212> PRT <213> Bifidobacterium bifidum <220> <221> Beta-galactosidase <222> (1)..(738) <400> 2
Met Tyr Met Ile Trp Arg Asp Ala His Arg Val Arg Cys Gly Leu Ala 1 5 10 15 Arg Tyr Gly Thr Ser Pro His Arg Met Ser Gln Leu Ile Phe Arg Arg 20 25 30 8
1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4395
HU 008 250 T2
Cys Asp Gly Ser Ala Gly Ala Ser Asp Asn Glu Gln Val Met Glu Arg 35 40 45 Asn Met Ser Lys Arg Arg Lys His Ser Trp Pro Gln Pro Leu Lys Gly 50 55 60 Ala Glu Ser Arg Leu Trp Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp 65 70 75 80 Pro Glu Glu Val Trp Asp Asp Asp Ile Arg Leu Met Lys cys Ala Gly 85 90 95 Val Asn Leu Val Ser Val Gly Ile Phe Ser Trp Ala Lys Ile Glu Pro 100 105 110 Glu Glu Gly Lys Tyr Asp Phe Asp Trp Leu Asp Arg Ala Ile Asp Lys 115 120 125 Leu Gly Lys Ala Gly Ile Ala Val Asp Leu Ala Ser Ala Thr Ala Ser 130 135 140 Pro Pro Met Trp Leu Thr Gln Ala His Pro Glu Val Leu Trp Lys Asp 145 150 155 160 Glu Arg Gly Asp Thr Val Trp Pro Gly Ala Arg Glu His Trp Arg Pro 165 170 175 Thr Ser Pro Val Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Asn Leu Cys Arg Arg Met 180 185 190 Ala Glu His Tyr Lys Gly Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Val Ser 195 200 205 Asn Glu Tyr Gly Cys His Asn Arg Phe Asp Tyr Ser Asp Asp Ala Met 210 215 220 Arg Ala Phe Gln Lys Trp Cys Lys Lys Arg Tyr Lys Thr Ile Asp Ala 225 230 235 240 Val Asn Glu Ala Trp Gly Thr Ala Phe Trp Ala Gln His Met Asn Asp 245 250 255 Phe Ser Glu Ile Ile Pro Pro Arg Tyr Ile Gly Asp Gly Asn Phe Met 260 265 270 Asn Pro Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Lys Arg Phe Ser Ser Asp Ala Leu 275 280 285 Lys Glu Leu Tyr Ile Ala Glu Arg Asp Val Leu Glu Ser Ile Thr Pro 290 295 300 Gly Leu Pro Leu Thr Thr Asn Phe Met Val Ser Ala Gly Gly Ser Met 305 310 315 320 Leu Asp Tyr Asp Asp Trp Gly Ala Glu Val Asp Phe Val Ser Asn Asp 325 330 335 His Tyr Phe Thr Pro Gly Glu Asp His Phe Asp Glu Val Ala Tyr Ala 340 345 350
9
HU 008 250 T2
Ala Ser Leu Met Asp Gly Ile Ser Arg Lys Glu Pro Trp Phe Gln Met 355 360 365 Glu His Ser Thr Ser Ala Val Asn Trp Arg Pro Ile Asn Tyr Arg Ala 370 375 380 Glu Pro Gly Ser Val Val Arg Asp Ser Leu Ala Gln Val Ala Met Gly 385 390 395 400 Ala Asp Ala Ile Cys Tyr Phe Gln Trp Arg Gln Ser Lys Ala Gly Ala 405 410 415 Glu Lys Trp His Ser Ser Met Val Pro His Ala Gly Glu Asp Ser Gln 420 425 430 Ile Phe Arg Asp Val Cys Glu Leu Gly Ala Asp Leu Gly Arg Leu Ser 435 440 445 Asp Glu Gly Leu Met Gly Thr Lys Thr Val Lys Ser Lys Val Ala Val 450 455 460 Val Phe Asp Tyr Glu Ser Gln Trp Ala Thr Glu Tyr Thr Ala Asn Pro 465 470 475 480 Thr Gln Gln Val Asp His Trp Thr Glu Pro Leu Asp Trp Phe Arg Ala 485 490 495 Leu Ala Asp Asn Gly Ile Thr Ala Asp Val Val Pro Val Arg Ser Asp 500 505 510 Trp Asp Ser Tyr Glu Ile Ala Val Leu Pro Cys Val Tyr Leu Leu Ser 515 520 525 Glu Glu Thr Ser Arg Arg Val Arg Glu Phe Val Ala Asn Gly Gly Lys 530 535 540 Leu Phe Val Thr Tyr Tyr Thr Gly Leu Ser Asp Glu Asn Asp His Ile 545 550 555 560 Trp Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Ser Ile Arg Asp Val Val Gly Val Arg 565 570 575 Val Glu Glu Phe Ala Pro Met Gly Asn Asp Met Pro Gly Ala Leu Asp 580 585 590 His Leu Asp Leu Asp Asn Gly Thr Val Ala His Asp Phe Ala Asp Val 595 600 605 Ile Thr Ser Thr Ala Asp Thr Ser Thr Val Leu Ala Ser Tyr Lys Ala 610 615 620 Glu Arg Trp Thr Gly Met Asn Glu Val Pro Ala Ile Val Ala Asn Gly 625 630 635 640 Tyr Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr Val Gly Cys Arg Leu Gly Arg Gln 645 650 655 Gly Leu Ala Lys Ser Leu Pro Ala Met Leu Gly Ser Met Gly Leu Ser 660 665 670
10
1
HU 008 250 T2
2
Asp Leu Ala Gly Asp Gly Arg Val Leu Arg Val Glu Arg Ala Asp Ala 675 680 685 Ala Ala Ala Ser Arg Phe Glu Phe Val Phe Asn Arg Thr His Glu Pro 690 695 700 Val Thr Val Asp Val Glu Gly Glu Ala Ile Ala Ala Ser Leu Ala His 705 710 715 720 Val Asp Asp Gly Arg Ala Thr Ile Asp Pro Thr Gly Val Val Val Leu 725 730 735 Arg Arg SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. b¹galaktozidázt kódoló DNS-szekvencia, ahol a szekvencia az 1. azonosító számú szekvencia, annak fragmentuma vagy degeneratív variánsa közül van kiválasztva, ahol a variáns 75–95%-ban homológ. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol a szekvencia nukleotidszubsztitúciókat, ¹addíciókat vagy ¹deléciókat tartalmaz, amelyek kevesebb mint 25% változást okoznak a 2. azonosító számú aminosavszekvenciában. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol a szekvencia konzervatív aminosavszubsztitúciókat eredményezõ nukleotidszubsztitúciókat tartalmaz. 4. b¹Galaktozidáz enzim, amelyet az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvencia kódol. 5. b¹Galaktozidáz enzim, amely 2. azonosító számú aminosavszekvenciát tartalmaz. 6. Rekombináns vektor, amely az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz. 7. A 6. igénypont szerinti vektor, amely vektor expressziós vektor. 8. Gazdasejt, amely élesztõsejt, gombasejt vagy Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus és Aspergillus közül kiválasztott bakteriális sejt, és 1–3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz. 9. Gazdasejt, amely 6. vagy 7. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a sejt Bacillus subtilis, Bacillus circulans és Aspergillus niger közül van kiválasztva.
20
25
30
35
40
45
11
11. A 4. vagy 5. igénypont szerinti enzim vagy a 8–10. igénypontok bármelyike szerinti sejt alkalmazása oligoszacharidkeverék elõállítására. 12. A 4. vagy 5. igénypont szerinti enzim vagy a 8–10. igénypontok bármelyike szerinti sejt alkalmazása tejtermékek, például folyékony tej, szárított tejpor, csecsemõknek szánt tejek, csecsemõtápszer, jégkrém, joghurt, sajt, fermentált tejtermékek, italok, például gyümölcslevek, bébiételek, gabonakészítmények, kenyerek; kekszek, desszertek, sütemények, étrend-kiegészítõk, diétás kiegészítõk, probiotikus ehetõ termékek, prebiotikus ehetõ termékek, állati tápok, baromfitápok és gyógyszerek közül kiválasztott termék részét képezõ oligoszacharidkeverék elõállítására. 13. A 8–10. igénypontok bármelyike szerinti gazdasejt alkalmazása tejtermékek, például folyékony tej, szárított tejpor, csecsemõknek szánt tejek, csecsemõtápszer, jégkrém, joghurt, sajt, fermentált tejtermékek, italok, például gyümölcslevek, bébiételek, gabonakészítmények, kenyerek; kekszek, desszertek, sütemények, étrend-kiegészítõk, diétás kiegészítõk, probiotikus ehetõ termékek, prebiotikus ehetõ termékek, állati tápok, baromfitápok és gyógyszerek közül kiválasztott termék elõállítására. 14. Eljárás a 4. vagy 5. igénypont szerinti enzim elõállítására, amely tartalmazza 8–10. igénypontok bármelyike szerinti gazdasejt tenyésztését megfelelõ tenyésztõ tápközegben, az enzim expresszióját lehetõvé tevõ körülmények mellett, és a kapott enzim kinyerését a tenyészetbõl.
HU 008 250 T2 Int. Cl.: C12N 5/10
12
HU 008 250 T2 Int. Cl.: C12N 5/10
13
HU 008 250 T2 Int. Cl.: C12N 5/10
14
HU 008 250 T2 Int. Cl.: C12N 5/10
15
HU 008 250 T2 Int. Cl.: C12N 5/10
Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
