(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000007240T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 007 240

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 04 810510 (22) A bejelentés napja: 2004. 11. 04. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040810510 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1682180 A2 2005. 05. 19. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1682180 B1 2009. 11. 04.

(51) Int. Cl.: A61K 39/395 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05044854 PCT/US 04/037152

(30) Elsõbbségi adatok: 565710 P 2004. 04. 27. 517337 P 2003. 11. 04. 525579 P 2003. 11. 26.

(73) Jogosult: Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville, CA 94608 (US)

US US US

(72) Feltalálók: LONG, Li, Emeryville, CA 94662-8097 (US); LUQMAN, Mohammad, Emeryville, CA 94662-8097 (US); YABANNAVAR, Asha, Emeryville, CA 94662-8097 (US); ZAROR, Isabel, Emeryville, CA 94662-8097 (US); CHEN, Bao-Lu, Emeryville, CA 94662-8097 (US); LU, Xiaofeng, Emeryville, CA 94662-8097 (US); LEE, Sang, Hoon, Emeryville, CA 94662-8097 (US); HURST, Deborah, Emeryville, CA 94662-8097 (US)

HU 007 240 T2

(54)

(74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Antagonista anti–CD40 monoklonális ellenanyagok és eljárások azok alkalmazására

A leírás terjedelme 98 oldal (ezen belül 16 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 007 240 T2

A találmány területe A találmány tárgyát CD40 kötésére képes humán ellenanyagok képezik, valamint eljárások az ellenanyagok alkalmazására, és eljárások olyan betegségek kezelésére, amelyeket CD40-jeltovábbításának stimulálása közvetít CD40¹et expresszáló sejteken. A találmány háttere A B¹sejtek fontos szerepet játszanak a normál in vivo immunválaszban. Egy idegen antigén kötõdik specifikus B¹sejtek felszíni immunglobulinjaihoz, ami olyan események láncolatát váltja ki, mint például MHC II¹es osztályú molekulákon processzált peptidek endocitózisa, processzálása, prezentálása, és a B7 antigén felülszabályozása a B¹sejtek felszínén. Azután egy specifikus T¹sejt kötõdik a B¹sejthez az MHC II¹es osztályú molekulán prezentált processzált antigén T¹sejt-receptor (TCR) általi felismerése révén. A TCR útján történõ stimulálás aktiválja a T¹sejtet és iniciálja a T¹sejt citokintermelését. Egy második szignál ami tovább aktiválja a T¹sejtet a T¹sejt felszínén található CD28-antigén kölcsönhatása a B¹sejt felszínén található B7 antigénnel. Amikor a fent említett szignálokat megkapja, a CD40-ligandum (CD40L vagy CD154) – amely nem expresszálódik nyugalomban lévõ humán T¹sejteken – felülszabályozódik a T¹sejt felszínén. A CD40-ligandum kötõdése a B¹sejt felszínén található CD40-antigénhez stimulálja a B¹sejtet, ami a B¹sejt megérését eredményezi oldható immunglobulin magas koncentrációját szekretáló plazmasejtté. A CD40 egy 55 kDa méretû sejtfelszíni antigén, amely egyaránt jelen van normál neoplasztikus humán B¹sejtek, dendritikus sejtek, antigénprezentáló sejtek (APC¹k), endoteliális sejtek, monociták és epitéliális sejtek felszínén. Az alacsony és magas fokozatú B¹sejtes limfómás, B¹sejtes akut limfoblasztikus leukémiás, többszörös mielómás, krónikus limfocitikus leukémiás és Hodgkin-kóros páciensekbõl származó transzformált sejtek expresszálnak CD40¹et. A CD40-expressziót detektálták az akut mieloblasztikus leukémiás esetek kétharmadában és az AIDS-hez kapcsolódó limfómák 50%-ában. A B¹sejtes leszármazási vonalból származó számos daganat rosszindulatú B¹sejtjei magas szinten expresszálnak CD40¹et, és a túlélésük és proliferációjuk látszólag függ a CD40-jeltovábbítástól. Az immunoblasztikus B¹sejtes limfómák gyakran alakulnak ki immunkompromittált személyekben, mint például allograft recipiensekben és más, hosszú távú immunszuppresszív terápiát kapó személyekben, AIDS-páciensekben, és olyan páciensekben, akiknek elsõdleges immundeficiencia szindrómájuk van, mint például X¹kapcsolt limfoproliferatív szindróma vagy Wiscott–Aldrich-szindróma [Thomas és munkatársai (1991) Adv. Cancer Res. 57:329. oldal; Straus és munkatársai (1993) Ann. Intern. Med 118:45. oldal]. A CD40-antigén a humán idegi növekedési faktor (NGF) receptor, tumornekrózisfaktor¹a (TNF¹a) receptor és Fas rokona, ami arra utal, hogy a CD40 a B¹sejtek aktiválása fontos funkciókkal rendelkezõ ligandumának receptora. A CD40 APC-ken való expressziója fontos

2

kostimuláns szerepet játszik a T¹segítõ és citotoxikus T¹limfociták aktiválásában egyaránt. A CD40-receptor aktivált T¹sejteken, aktivált vérlemezkéken és begyulladt vaszkuláris simaizomsejteken expresszálódik. A CD405 receptorok megtalálhatók eozinofil sejteken, ízületi membránokon reumatoid arthritiszben, dermális fibroblasztokon és más nem limfoid sejteken is. A CD40L-nek a CD40-receptorhoz való kötõdése stimulálja a B¹sejtproliferációt és ¹differenciációt, az ellenanyag-termelést, 10 az izotípusváltást és a B¹sejt-memória képzõdését. A WO 01/83755 és WO 02/28904 számú nemzetközi közzétételi iratok CD40 kötésére képes ellenanyagokat ismertetnek, valamint eljárásokat ilyen ellenanyagok elõállítására és eljárásokat azok alkalmazására. Ellmark és munkatársai (Immunology 2002, 106, 15 456–463. oldal) beszámolnak a CD40–CD40 ligandum kölcsönhatás modulálásáról humán anti-CD40 egyláncú ellenanyagfragmensek alkalmazásával. 20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

A találmány rövid összefoglalása A találmány tárgya humán monoklonális ellenanyag, amely képes specifikusan kötõdni humán CD40¹et expresszáló sejt felszínén expresszált humán CD40-antigénhez, amely monoklonális ellenanyagmentes szignifikáns agonista aktivitástól, miáltal amikor a monoklonális ellenanyag kötõdik a sejt felszínén expresszált CD40-antigénhez, a sejt növekedése vagy differenciálódása gátolt, ahol az ellenanyag a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: a) monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely képes a CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag kötésére, amely az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5542 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ, vagy a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag kötésére, amely az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5543 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ; b) monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a 10. vagy 12. azonosító számú szekvencián bemutatott CD40-szekvencia 82–87. oldalláncait; c) monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a 10. vagy 12. azonosító számú szekvencián bemutatott CD40-szekvencia 82–89. oldalláncait; és d) monoklonális ellenanyag, amely kompetitív kötési vizsgálati eljárásban verseng a CHIR–5.9 monoklonális ellenanyaggal, amely az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5542 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ, vagy a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal, amely az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5543 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ. A találmány tárgyát képezi izolált nukleinsavmolekula is, amely olyan polinukleotidot tartalmaz, amely bármelyik elõzõ igénypont szerinti monoklonális ellenanyagot kódol. A találmány tárgyát képezi olyan hibridóma sejtvonal is, amely képes találmány szerinti monoklonális ellenanyagot termelni.

1

HU 007 240 T2

A találmány tárgyát képezi találmány szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása normál humán B¹sejtek növekedésének vagy differenciációjának gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. A találmány tárgyát képezi in vitro eljárás is normál humán B¹sejtek növekedésének vagy differenciációjának gátlására, amely eljárás magában foglalja a B¹sejt érintkeztetését találmány szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. A találmány tárgyát képezi találmány szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása is normál humán B¹sejtek proliferációjának gátlására szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a proliferációt fokozza a CD40-ligandum kölcsönhatása a B¹sejt felszínén expresszált CD40-antigénnel. A találmány tárgyát képezi in vitro eljárás is normál humán B¹sejtek proliferációjának gátlására, ahol a proliferációt fokozza a CD40-ligandum kölcsönhatása a B¹sejt felszínén expresszált CD40-antigénnel, amely eljárás magában foglalja a B¹sejt érintkeztetését találmány szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. A találmány tárgyát képezi találmány szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag vagy fragmense hatásos mennyiségének alkalmazása is B¹sejtek humán páciensben való ellenanyag-termelésének gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. A találmány tárgyát képezi találmány szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása B¹sejt leszármazási vonalba tartozó ráksejtek növekedésének gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. A találmány tárgyát képezi in vitro eljárás is B¹sejt leszármazási vonalba tartozó ráksejtek növekedésének gátlására, amely eljárás magában foglalja a ráksejtek érintkeztetését találmány szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. A találmány tárgyát képezi találmány szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása is CD40 expressziójával jellemzett rák kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. A találmány tárgyát képezi találmány szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása CD40-ligandum által közvetített jeltovábbítási útvonal CD40¹et expresszáló humán sejtben történõ gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. A találmány tárgyát képezi in vitro eljárás is CD40ligandum által közvetített jeltovábbítási útvonal CD40¹et expresszáló humán sejtben történõ gátlására, amely eljárás magában foglalja a sejt érintkeztetését találmány szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. A találmány tárgyát képezi in vitro eljárás is CD40¹et expresszáló sejtek iránti antagonista aktivitást mutató ellenanyag azonosítására, amely eljárás magában foglalja kompetitív kötési vizsgálati eljárás végrehajtását a találmány szerinti monoklonális ellenanyag alkalmazásával.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

A találmány tárgyát képezi gyógyászati készítmény is, amely találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. A találmány egyéb aspektusait a mellékelt igénypontokban ismertetjük. A következõ leírás azon aspektusai, amelyek nem specifikusan kapcsolódnak az igényelt találmányhoz, összehasonlításra és szemléltetésre szolgálnak. A találmány rövid összefoglalása Készítményeket és eljárásokat tárunk fel CD40¹et expresszáló sejtek CD40-jeltovábbításának stimulálása által közvetített betegségek, beleértve limfómák, autoimmun betegségek és transzplantátumkilökõdés kezelésére. A készítmények közé tartoznak CD40¹et expresszáló humán sejt felszínén található CD40-antigénhez kötõdni képes monoklonális ellenanyagok, ahol a kötõdés megakadályozza a sejt növekedését vagy differenciálódását. A készítmények közé tartoznak olyan monoklonális ellenanyagok is, amelyek képesek specifikusan kötõdni CD40¹et expresszáló humán sejt felszínén expresszált humán CD40-antigénhez, amely monoklonális ellenanyagmentes szignifikáns agonista aktivitástól, ahol a monoklonális ellenanyag beadása szignifikánsan kisebb daganattérfogatot eredményez, mint az IDEC–C2B8 anti-CD20 kiméra monoklonális ellenanyag hasonló koncentrációja kétlépcsõs („staged”) csupasz egér xenograft daganatmodellben a Daudi humán B¹sejtes limfómasejtvonal alkalmazásával. A készítmények közé tartoznak ezen monoklonális ellenanyagok antigénkötõ fragmensei, az ezeket az ellenanyagokat termelõ hibridóma sejtvonalak, és az ezen monoklonális ellenanyagok aminosavszekvenciáit kódoló izolált nukleinsavmolekulák is. A leírásban feltárunk gyógyászati készítményeket is, amelyek ezeket az anti-CD40 ellenanyagokat tartalmazzák gyógyászatilag elfogadható hordozóban. A találmányban eljárásokat feltárunk CD40-jeltovábbítás stimulálása által közvetített betegség megelõzésére vagy kezelésére is, amely eljárás magában foglalja a páciens kezelését olyan anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével, amely mentes szignifikáns agonista aktivitástól, amikor CD40¹et expresszáló humán sejten expresszálódó CD40-antigénhez kötõdik. A CD40¹et expresszáló sejtek stimulálása által közvetített betegségek közé tartoznak autoimmun betegségek, rákok, és szerv- és szövetgraft kilökõdése. A leírásban feltárt eljárással kezelhetõ vagy megelõzhetõ limfómák közé tartoznak nem Hodgkin-limfómák (magas fokozatú limfómák, közepes fokozatú limfómák és alacsony fokozatú limfómák), Hodgkin-szindróma, akut limfoblasztikus leukémiák, mielómák, krónikus limfocitikus leukémiák és mieloblasztikus leukémiák. A leírásban feltárt eljárások alkalmazásával kezelhetõ autoimmun betegségek közé tartozik a szisztémás lupus erythematosus (SLE), reumatoid arthritisz, Crohn-betegség, pszoriázis, autoimmun thrombocytopenic purpura, sclerosis multiplex, merevedõ csigolyagyulladás, myasthenia gravis és pemphigus vulgaris.

1

HU 007 240 T2

Az ilyen ellenanyagok alkalmazhatók szerv- vagy szövetgraftok kilökõdésének megakadályozására is az autoimmun reakciók szuppresszálása révén, limfómák kezelésére a rosszindulatú B¹limfociták CD40 általi aktiváló szignáljának megvonása révén, és toxinok CD40¹et hordozó sejtekhez való specifikus eljuttatására. A leírásban feltárunk eljárásokat humán B¹sejtek növekedésének, differenciálódásának és/vagy proliferációjának gátlására és B¹sejtek ellenanyag-termelésének gátlására humán páciensben, valamint eljárásokat B¹sejt leszármazási vonalba tartozó ráksejtek növekedésének gátlására. A leírásban feltárunk eljárások olyan ellenanyagok azonosítására is, amelyek antagonista aktivitásúak CD40¹et expresszáló sejtek iránt. A találmány szerinti monoklonális ellenanyagoknak nagy az affinitása a CD40 iránt és legalább 10–6 M, elõnyösen legalább körülbelül 10–7 M és körülbelül 10–8 M közötti, elõnyösebben legalább körülbelül 10–8 M és körülbelül 10–12 M közötti az egyensúlyi disszociációs állandójuk (KD). A leírásban feltárt eljárásokban történõ alkalmazásra alkalmas monoklonális ellenanyagok és antigénkötõ fragmenseik képesek humán sejt felszínén expresszált humán CD40-antigénhez való specifikus kötõdésre. Azok mentesek szignifikáns agonista aktivitástól, de antagonista aktivitást mutatnak, amikor kötõdnek a CD40-antigénhez humán sejteken. Egy megvalósítási mód szerint az anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense antagonista aktivitást mutat, amikor kötõdik normál humán B¹sejtek felszínén található CD40-antigénhez. Egy másik megvalósítási mód szerint az anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense antagonista aktivitást mutat, amikor kötõdik rosszindulatú humán B¹sejtek felszínén található CD40-antigénhez. Az alkalmas monoklonális ellenanyagoknak humán konstans régiói vannak; elõnyösen azoknak teljesen vagy részlegesen humanizált vázrégióik vannak; és legelõnyösebben azok teljesen humán ellenanyagok vagy azok antigénkötõ fragmensei. Ilyen monoklonális ellenanyag példái a leírás szerinti CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagok; a 131.2F8.5.9 hibridóma sejtvonal (a leírás szerint 5.9 jelû sejtvonal) és a 153.8E2.D10.D6.12.12 (a leírás szerint 12.12 jelû sejtvonal) által termelt monoklonális ellenanyagok; olyan monoklonális ellenanyag, amely a 6. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 7. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 8. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 6. és 7. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia és a 6. és 8. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmaz; olyan monoklonális ellenanyag, amely a 2. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 4. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, az 5. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 2. és 4. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia és a 2. és 5. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmaz; olyan monoklonális ellenanyag, amely az 1. azonosító számú

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

szekvencián bemutatott szekvencia, a 3. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia és az 1. és 3. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekula által kódolt aminosavszekvenciát tartalmaz; és ezen monoklonális ellenanyagok olyan antigénkötõ fragmensei, amelyek megtartják a humán CD40-hez való specifikus kötõdés képességét, és amelyek mentesek szignifikáns agonista aktivitástól, de antagonista aktivitást mutatnak, amikor kötõdnek a CD40-antigénhez humán sejteken. Az ilyen monoklonális ellenanyagok példái közé tartozik olyan monoklonális ellenanyag is, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely képes a 12.12 hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyag kötésére; olyan monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a 10. vagy 12. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvencia 82–87. oldalláncait; olyan monoklonális ellenanyag, amely verseng a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal kompetitív kötési vizsgálati eljárásban; és olyan monoklonális ellenanyag, amely a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag vagy bármely elõbbi monoklonális ellenanyag antigénkötõ fragmense, ahol a fragmens megtartja a humán CD40-antigénhez való specifikus kötõdés képességét. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a leírásban feltárt antagonista ellenanyagok és ezen ellenanyagok antigénkötõ fragmensei közé tartoznak olyan ellenanyagok és fragmenseik, amelyek rekombináns módon vannak elõállítva a szakterületen jól ismert és alább ismertetett eljárások alkalmazásával, és ezek közé tartoznak például a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok, amelyek teljesen rekombináns módon lettek elõállítva. Egy leírásban feltárt megvalósítási mód szerint a kezelési eljárások alkalmas antagonista anti-CD40 ellenanyagokat vagy antigénkötõ fragmenseiket tartalmazó gyógyászati készítmény terápiásan hatásos dózisának páciensnek történõ beadását foglalják magukban. Az anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisa a körülbelül 0,01 mg/kg és körülbelül 40 mg/kg, körülbelül 0,01 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 0,1 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 1 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 25 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg, körülbelül 5 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg vagy körülbelül 7 mg/kg és körülbelül 12 mg/kg közötti tartományba esik. Nyilvánvaló, hogy a kezelési eljárás magában foglalhatja az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos dózisának egyszeri beadását vagy terápiásan hatásos dózisának többszöri beadását. A leírás szerinti eljárásokban alkalmasnak azonosított leírásban feltárt antagonista anti-CD40 ellenanyagok módosítva lehetnek. Ezen antagonista antiCD40 ellenanyagok módosításainak nem korlátozó példái közé tartoznak kiméra anti-CD40 ellenanyagok, humanizált anti-CD40 ellenanyagok és immunológiailag aktív egér anti-CD40 ellenanyagok.

1

HU 007 240 T2

Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötõdését mutatja be limfómasejtvonal (Ramos) felszínén található CD40-hez. A 2A. és 2B. ábra a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális anti-CD40 ellenanyagok CD40-ligandumhoz viszonyított kötési tulajdonságait szemlélteti. A 2A. ábra azt mutatja be, hogy a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötõdése sejtfelszíni CD40-hez megakadályozza az azt követõ CD40-ligandum-kötõdést. A 2B. azt mutatja be, hogy a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötõdése képes kompetícióban leszorítani a sejtfelszíni CD40-hez elõzõleg hozzákötõdött CD40-ligandumot. A 3A. és 3B. ábra a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagjelöltek ADCC aktivitását mutatja be nem Hodgkin-limfómás (NHL) páciensek nyirokcsomóiból származó ráksejtek ellen. Normál önkéntesekbõl származó dúsított NK¹sejteket – akár frissen izolálás után (3A. ábra), akár éjszakán keresztül 37 °C¹on történõ tenyésztés után (3B. ábra) – alkalmaztunk effektorsejtekként ebben a vizsgálati eljárásban. Mivel az NHL sejtek CD20¹at is expresszálnak, ami a rituximab (Rituxan ® ) célantigénje, a monoklonális ellenanyagjelöltek ADCC aktivitását összehasonlítottuk a rituximabéval. A 4. ábra a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok in vivo daganatellenes aktivitását demonstrálja, összehasonlítva a rituximabéval, egylépcsõs („unstaged”) csupasz egér xenograft B¹sejtes limfóma (Namalwa) modell alkalmazásával. Az 5. ábra a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok in vivo daganatellenes aktivitását demonstrálja, összehasonlítva a rituximabéval, egylépcsõs csupasz egér xenograft B¹sejtes limfóma (Daudi) modell alkalmazásával. RC, daganatos kihívás elleni rezisztencia. A 6. ábra a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok in vivo daganatellenes aktivitását demonstrálja, összehasonlítva a rituximabéval, kétlépcsõs csupasz egér xenograft B¹sejtes limfóma (Daudi) modell alkalmazásával. CR, komplett regresszió. A 7. ábra a Namalwa és Daudi-sejteken található CD20- és CD40-molekulák számának meghatározására alkalmazott protokollt mutatja be. A 8. ábra a CHIR–12.12 és rituximab monoklonális ellenanyagok Daudi-limfómasejtek elleni összehasonlító ADCC-jét mutatja be. A 9. ábra a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag könnyû és nehéz láncának aminosavszek-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

venciáját mutatja be. A könnyû lánc vezetõ (a 2. azonosító számú szekvencia 1–20. oldalláncai), variábilis (a 2. azonosító számú szekvencia 21–132. oldalláncai) és konstans (a 2. azonosító számú szekvencia 133–239. oldalláncai) régióit a 9A. ábrán mutatjuk be. A nehéz lánc vezetõ (a 4. azonosító számú szekvencia 1–19. oldalláncai), variábilis (a 4. azonosító számú szekvencia 20–139. oldalláncai) és konstans (a 4. azonosító számú szekvencia 140–469. oldalláncai) régióit a 9B. ábrán mutatjuk be. A CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag nehéz láncának 9B. ábrán bemutatott alternatív konstans régiója egy szerin szubsztitúciót tartalmaz a 4. azonosító számú szekvencia 153. pozíciójában található alanin helyett. A CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag nehéz lánca ezen variánsának teljes szekvenciáját az 5. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. A 10. ábra CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag könnyû láncának (10A. ábra; 1. azonosító számú szekvencia) és nehéz láncának (10B. ábra; 3. azonosító számú szekvencia) kódolószekvenciáját mutatja be. A 11. ábra a CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag könnyû és nehéz láncának aminosavszekvenciáját mutatja be. A könnyû lánc vezetõ (a 6. azonosító számú szekvencia 1–20. oldalláncai), variábilis (a 6. azonosító számú szekvencia 21–132. oldalláncai) és konstans (a 6. azonosító számú szekvencia 133–239. oldalláncai) régióit a 11A. ábrán mutatjuk be. A nehéz lánc vezetõ (a 7. azonosító számú szekvencia 1–19. oldalláncai), variábilis (a 7. azonosító számú szekvencia 20–144. oldalláncai) és konstans (a 7. azonosító számú szekvencia 145–474. oldalláncai) régióit a 11B. ábrán mutatjuk be. A CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag nehéz láncának 11B. ábrán bemutatott alternatív konstans régiója egy szerin szubsztitúciót tartalmaz a 7. azonosító számú szekvencia 158. pozíciójában található alanin helyett. A CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag nehéz lánca ezen variánsának teljes szekvenciáját az 8. azonosító számú szekvencián mutatjuk be. A 12. ábra mutatja be a humán CD40 rövid izoformájának (12A. ábra; 9. azonosító számú szekvencia) (az aminosavszekvenciát a 12B. ábrán mutatjuk be; 10. azonosító számú szekvencia), és a humán CD40 hosszú izoformájának (12C. ábra; 11. azonosító számú szekvencia) (az aminosavszekvenciát a 12.D ábrán mutatjuk be) kódolószekvenciáját. A 13. ábra a CHIR¹12.12 olvadási hõmérsékletét mutatja be különbözõ pH¹jú kiszerelésekben differenciális szkennelõ kalorimetriával (DSC) mérve.

1

HU 007 240 T2

Részletes leírás A leírás szerint a „daganat” kifejezés alatt az összes neoplasztikus sejtnövekedést és proliferációt értjük, akár rosszindulatú, akár jóindulatú, és az összes rák-elõtti és rákos sejtet és szövetet. A „rák” és „rákos” kifejezések alatt emlõsök olyan fiziológiás állapotát értjük, amelyet tipikusan szabályozatlan sejtnövekedés jellemez. A rákok nem korlátozó példái közé tartozik a limfóma és leukémia. Az „ellenanyagok” és „immunglobulinok” (Ig¹k) azonos kémiai szerkezeti jellegzetességekkel bíró glikoproteinek. Míg az ellenanyagok kötõspecifitást mutatnak antigénhez, az immunglobulinok közé tartoznak mind az ellenanyagok, mind más olyan ellenanyagszerû molekulák, amelyeknek nincs antigénkötõ specifitása. Ez utóbbi típusú polipeptidet például alacsony szinten termeli a nyirokrendszer és fokozott szinten a mielómák. Az „ellenanyag” kifejezést a legtágabb értelmezésében alkalmazzuk és magában foglal teljesen összeállított ellenanyagokat, antigént kötni képes ellenanyagfragmenseket [például Fab’, F(ab)2, Fv, egyláncú ellenanyagok, diatestek], és a fentieket tartalmazó rekombináns peptideket. A „monoklonális ellenanyag” kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben lényegében homogén ellenanyagok populációjából nyert ellenanyagot értünk, azaz a populációt alkotó egyedi ellenanyagok azonosak, kivéve természetben elõforduló lehetséges mutációkat, amelyek kismértékben jelen lehetnek. A „natív ellenanyagok” és „natív immunglobulinok” általában megközelítõleg 150 000 Da molekulatömegû heterotetramer glikoproteinek, amelyek két azonos könnyû láncból (L) és két azonos nehéz láncból (H) állnak. Mindegyik könnyû lánc egy kovalens diszulfidkötéssel kapcsolódik nehéz lánchoz, míg a diszulfidkötések száma változik a különbözõ immunglobulin izotípusok nehéz láncai között. Mindegyik nehéz láncban és könnyû láncban szabályos közönként láncon belüli diszulfidhidak is vannak. Mindegyik nehéz láncnak az egyik végén variábilis domén (VH) van, amelyet több állandó domén követ. Mindegyik könnyû láncnak egy variábilis domén (VL) van az egyik végén és egy állandó domén a másik végen; a könnyû lánc állandó doménje egymás mellett helyezkedik el a nehéz lánc elsõ állandó doménjével, és a könnyû lánc variábilis doménje egymás mellett helyezkedik el a nehéz lánc variábilis doménjével. Úgy gondolják, hogy bizonyos aminosavoldalláncok határfelületet alkotnak a könnyû lánc és nehéz lánc variábilis domének között. A „variábilis” kifejezés arra a tényre utal, hogy a variábilis domén bizonyos részletei nagymértékben eltérnek az ellenanyagok szekvenciái között, amelyek az egyes adott ellenanyagok kötését és specifitását határozzák meg az adott antigénnel szemben. Azonban a variabilitás nem egyenletesen oszlik el az ellenanyagok variábilis doménjeiben. Három szegmensre koncentrálódik, amelyeket komplementaritást meghatározó régióknak (CDR¹ek) vagy hipervariábilis régiónak neveznek a könnyû lánc és nehéz lánc variábilis do-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

ménjeiben egyaránt. A variábilis domének erõsebben konzervált részleteit vázrégióknak (FR) nevezik. A natív nehéz láncok és könnyû láncok variábilis doménjei egyaránt négy FR¹régiót tartalmaznak, amelyek nagyjából b¹redõ konfigurációjúak, amelyeket három CDR köt össze, amelyek a b¹redõs szerkezetet kötik össze, és egyes esetekben azok részét képezik. Az egyes láncok CDR-jei szoros közelségben vannak az FR¹régiók révén, és a másik lánc CDR-jeivel együtt hozzájárulnak az ellenanyagok antigénkötõ helyének a kialakításához [lásd Kabat és munkatársai (1991) NIH Publ. No. 91–3242, Vol. 1, 647–669. oldal]. Az állandó domének nem vesznek részt közvetlenül az ellenanyag antigénhez történõ kötésében, de különféle effektorfunkciókat mutatnak, mint például Fc¹receptor (FcR) kötés, részvétel az ellenanyagfüggõ sejtes toxicitásban, opszonizációban, komplementfüggõ citotoxicitás iniciálásában és a hízósejt-degranulációban. A „hipervariábilis régió” kifejezés alatt a leírás szerinti értelemben az ellenanyag olyan aminosav-oldalláncait értjük, amelyek az antigénkötésért felelõsek. A hipervariábilis régió „komplementaritást meghatározó régió” vagy „CDR” eredetû aminosav-oldalláncokat tartalmaz [azaz a 24–34. (L1), 50–56. (L2) és 89–97. (L3) oldalláncokat a könnyû lánc variábilis doménben és a 31–35. (H1), 50–65. (H2) és 95–102. (H3) oldalláncokat a nehéz lánc variábilis doménben; Kabat és munkatársai (1991) „Sequences of Proteins of Immunological Interest” (5. kiadás, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD] és/vagy a „hipervariábilis hurok” oldalláncait [azaz a 26–32. (L1), 50–52. (L2) és 91–96. (L3) oldalláncok a könnyû lánc variábilis doménben és a 26–32. (H1), 53–55. (H2) és 96–101. (H3) oldalláncok a nehéz lánc variábilis doménben; Clothia és Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901–917. oldal]. A „vázrégió” vagy „FR” oldalláncok azok a variábilis domén oldalláncok, amelyek nem az itt definiált hipervariábilis régió oldalláncok. Az „ellenanyagfragmensek” a teljes hosszúságú ellenanyag egy részletét tartalmazzák, elõnyösen az intakt ellenanyag antigénkötõ vagy variábilis régióját. Az ellenanyagfragmensek példái közé tartoznak az Fab, Fab’, F(ab’)2 és Fv fragmensek; diatestek („diabodies”); lineáris ellenanyagok [Zapata és munkatársai (1995) Protein Eng. 8(10): 1057–1062. oldal]; egyláncú ellenanyag-molekulák; és ellenanyagfragmensekbõl álló multispecifikus ellenanyagok. Az ellenanyagok papaines emésztése két azonos antigénkötõ fragmenst hoz létre, amelyeket „Fab” fragmenseknek nevezünk, amelyek mindegyike egyetlen antigénkötõ helyet tartalmaz, és egy reziduális „Fc” fragmenst, amelynek a neve a könnyû kristályosodási képességére utal. A pepszines kezelés egy F(ab’)2 fragmenst eredményez, amelynek két antigénkötõ helye van, és még képes antigén keresztkötésére. Az „Fv” az a minimális ellenanyagfragmens, amely teljes antigénfelismerõ és ¹kötõ helyet tartalmaz. Kétláncú Fv fajtákban ez a régió egy nehéz lánc és egy könnyû lánc variábilis domén dimerjét tartalmazza szo-

1

HU 007 240 T2

ros, nem kovalens kapcsolatban. Egyláncú Fv fajtákban egy nehéz lánc és egy könnyû lánc variábilis domén lehet kovalensen összekötve flexibilis peptid kapcsolómolekulával oly módon, hogy a könnyû és nehéz láncok a kétláncú Fv fajtával analóg „dimer” szerkezetté asszociálódhatnak. Ebben a konfigurációban az egyes variábilis domének három CDR¹je kölcsönhat az antigénkötõ hely kialakítására a VH–VL dimer felszínén. Összességében a hat CDR antigénkötõ specifitást biztosít az ellenanyag számára. Azonban még egyetlen variábilis domén is (vagy egy Fv egyik fele is, amely csak három CDR¹t tartalmaz, amelyek egy antigénre specifikusak) képes antigén felismerésére és kötésére, habár alacsonyabb affinitással, mint a teljes kötõhely. Az Fab fragmens továbbá tartalmazza a könnyûlánc állandó doménjét és a nehéz lánc elsõ állandó doménjét (CH1) is. Az Fab fragmensek néhány oldallánc hozzáadásával különböznek az Fab’ fragmensektõl a nehéz lánc CH1 domén karboxiterminális végénél, beleértve egy vagy több ciszteint az ellenanyag csuklórégiójából. A leírás szerinti értelemben Fab’–SH a neve annak az Fab’-nek, amelyben a konstans domének cisztein oldallánca(i) szabad tiolcsoportot tartalmaz(nak). Az F(ab’)2 ellenanyagfragmenseket eredetileg Fab’ fragmensek párjaiként állították elõ, amelyek között csuklóeredetû ciszteinek voltak. Ellenanyagfragmensek más kémiai kapcsolásai is ismertek. Bármilyen gerinces fajból származó ellenanyagok (immunglobulinok) „könnyû láncait” két egyértelmûen megkülönböztethetõ típus egyikébe osztályozhatjuk, amelyeket kappa (k) és lambda (l) néven nevezünk, azok konstans doménjeinek aminosavszekvenciája alapján. A nehéz láncuk konstans doménjének az aminosavszekvenciájától függõen az immunglobulinokat különbözõ osztályokban sorolhatjuk be. Öt fõ humán immunglobulin osztály van: IgA, IgD, IgE, IgG és IgM, és ezek közül többet tovább csoportosíthatunk alosztályokba (izotípusok), például IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 és IgA2. Az immunglobulinok különbözõ osztályainak megfelelõ nehéz lánc konstans doméneket sorrendben alfa, delta, epszilon, gamma és mû néven nevezzük. Az immunglobulinok különbözõ osztályainak az alegységszerkezete és háromdimenziós konfigurációja jól ismert. A különbözõ izotípusoknak különbözõ effektor funkciói vannak. Például a humán IgG1 és IgG3 izotípusok közvetítik az ellenanyagfüggõ sejtközvetített citotoxicitás (ADCC) aktivitást. A leírás szerint a „jel” szó detektálható vegyületre vagy készítményre utal, amely közvetlenül vagy közvetetten konjugálva van az ellenanyaghoz oly módon, hogy „jelzett” ellenanyag jöjjön létre. A jel önmagában detektálható lehet (például radioizotóp jelek vagy fluoreszcens jelek) vagy az enzimatikus jelek esetében szubsztrát vegyület vagy készítmény kémiai megváltozását katalizálhatják, ami detektálható. Detektálható jelként szolgáló radionuklidok közé tartozik például az I–131, I–123, I–125, Y–90, Re–188, Re–186, At–211, Cu–67, Bi–212 és Pd–109. A jel lehet nem detektálható entitás is, mint például toxin.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

Az „antagonista” kifejezést a legtágabb értelemben alkalmazzuk, és beletartozik minden olyan molekula, amely részlegesen vagy teljesen blokkolja, gátolja vagy semlegesíti a találmány szerinti natív célpont biológiai aktivitását vagy annak transzkripcióját vagy transzlációját. A leírás szerinti értelemben „hordozók” alatt gyógyászatilag elfogadható hordozókat, excipienseket vagy stabilizálószereket értünk, amelyek nem toxikusak azon sejt vagy emlõs számára, amelyet kiteszünk annak az alkalmazott dózisokban és koncentrációkban. Gyakran a gyógyászatilag elfogadható hordozó vizes, pH¹pufferelt sóoldat. Fiziológiásan elfogadott hordozók példái közé tartoznak pufferek, mint például foszfát, citrát, szukcinát és más szerves savak; antioxidánsok, köztük aszkorbinsav; kis molekulatömegû (kevesebb mint körülbelül 10 oldallánc) polipeptidek; fehérjék, mint például szérumalbumin, zselatin vagy immunglobulinok; hidrofil polimerek, mint például poli(vinil-pirrolidon); aminosavak, mint például glicin, glutamin, aszparagin, arginin vagy lizin; monoszacharidok, diszacharidok és szénhidrátok, köztük glükóz, mannóz vagy dextrinek; komplexképzõ szerek, mint például EDTA; cukoralkoholok, mint például mannitol vagy szorbitol; sóképzõ ellenionok, mint például nátrium; és/vagy nemionos felületaktív anyagok, mint például TWEEN, polietilénglikol (PEG) és Pluronics. Az egy vagy több terápiás ágenssel „kombinációban” beadva kifejezés magában foglalja a szimultán (egyidejû) és egymás utáni beadást bármilyen sorrendben. A leírás szerint a „gazdasejt” kifejezés alatt egysejtes entitásként tenyésztett olyan mikroorganizmust vagy eukarióta sejtet vagy sejtvonalat értünk, amely recipiensként alkalmazható vagy alkalmazva volt rekombináns vektor vagy más transzfer polinukleotid számára, és ezek közé tartozik a transzfektált eredeti sejt utódja is. Nyilvánvaló, hogy egy egyedi sejt utódja nem szükségszerûen teljesen azonos morfológiájában vagy genomiális vagy teljesen DNS-ében az eredeti szülõvel, természetes, véletlenszerû vagy szándékos mutáció miatt. A „humán effektorsejtek” olyan leukociták, amelyek egy vagy több FcR¹t expresszálnak és effektorfunkciót végeznek. Elõnyösen a sejtek legalább egy FcgRIII¹t expresszálnak és antigénfüggõ sejtközvetített citotoxicitási (ADCC) effektor funkciójúak. Az ADCC¹t közvetítõ humán leukociták példái közé tartoznak perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC), természetes ölõsejtek (NK), monociták, makrofágok, eozinofil és neutrofil sejtek, ahol a PBMC¹k és az NK sejtek az elõnyösek. Az ADCC-aktivitású ellenanyagok tipikusan IgG1 vagy IgG3 izotípusúak. Megjegyzendõ, hogy az IgG1 és IgG3 ellenanyagok izolálása mellett ilyen ADCC¹t közvetítõ sejteket elõállíthatunk nem-ADCC ellenanyagból származó variábilis régió vagy variábilis fragmens IgG1 vagy IgG3 izotípus konstans régióhoz történõ génsebészeti hozzáadásával. Az „Fc receptor” vagy „FcR” kifejezéseket olyan receptor leírására alkalmazzuk, amely köti ellenanyag Fc régióját. Az elõnyös FcR natív szekvenciájú humán

1

HU 007 240 T2

FcR. Emellett az elõnyös FcR az, amelyik IgG ellenanyagot köt (gamma receptor) és ezek közé tartoznak az FcgRI, FcgRII, és FcgRIII alosztályok, beleértve ezen receptorok allélikus variánsait és alternatívan hasított („spliced”) formái. Az FcgRII receptorok közé tartozik az FcgRIIA („aktiválóreceptor”) és FcgRIIB („gátlóreceptor”), amelyek hasonló aminosavszekvenciájúak, és elsõsorban a citoplazmatikus doménjükben különböznek. Az FcgRIIA aktiváló receptor immunreceptor tirozinalapú aktiváló motívumot (ITAM) tartalmaz a citoplazmatikus doménjében. Az FcgRIIB gátló receptor immunreceptor tirozinalapú gátló motívumot (ITIM) tartalmaz a citoplazmatikus doménjében [lásd Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203–234. oldal]. Az FcR-eket összefoglalják Ravetch és Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457–492. oldal (1991); Capel és munkatársai. (1994) Immunomethods 4:25–34. oldal; és de Haas és munkatársai (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330–341. oldal. Más FcR¹ek – köztük a jövõben azonosítottak – is beletartoznak az „FcR” leírás szerinti fogalmába. A kifejezés magában foglalja az újszülött receptort (FcRn) is, amely az anyai IgG¹k magzatba történõ transzferéért felelõs [Guyer és munkatársai (1976) J. Immunol. 117:587. oldal és and Kim és munkatársai (1994) J. Immunol. 24:249. oldal (1994)]. Számos mód van humán ellenanyagok elõállítására. Például szekretálósejteket immortalizálhatunk Epstein–Barr-vírussal (EBV) történõ megfertõzéssel. Azonban az EBV-fertõzött sejteket nehéz klónozni és általában alacsony az immunglobulin kitermelésük [James és Bell (1987) J. Immunol. Methods 100:5–40. oldal]. A jövõben lehet, hogy lehetséges lesz humán B¹sejtek immortalizálása transzformáló gének meghatározott kombinációnak bejuttatásával. Az ilyen lehetõséget megerõsíti annak a friss demonstrációja, hogy a telomeráz katalitikus alegységének az SV40 nagy onkoproteinnek és a H¹ras egy onkogén alléljével történõ együttes expressziója normális humán epitéliális és fibroblaszt sejtek tumorigenikus átalakulásához vezetett [Hahn és munkatársai (1999) Nature 400:464–468. oldal]. Ma már lehetséges transzgenikus állatok (például egerek) elõállítása, amelyek immunizálás hatására képesek humán ellenanyagok készletének az elõállításra endogén immunglobulin-termelés nélkül [Jakobovits és munkatársai (1993) Nature 362:255–258. oldal; Lonberg és Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65–93. oldal; Fishwild és munkatársai (1996) Nat. Biotechnol. 14:845–851. oldal; Mendez és munkatársai (1997) Nat. Genet. 15:146–156. oldal; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11–23. oldal; Tomizuka és munkatársai (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722–727. oldal; összefoglalva: Little és munkatársai (2000) Immunol. Today 21:364–370. oldal]. Például leírták, hogy az ellenanyag nehéz lánc kapcsolórégió (JH) gén homozigóta deléciója kiméra és csíravonal mutáns egerekben az endogén ellenanyagtermelés teljes gátlását eredményezi [Jakobovits és munkatársai (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551–2555. oldal]. A humán csíravonal immunglobulin génkészlet átvitele az ilyen csíravonalmutáns egerekbe humán ellenanyagok termelését eredményezi

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

antigénnel való találkozás hatására [Jakobovits és munkatársai (1993) Nature 362:255–258. oldal]. Mendez és munkatársai (1997) (Nature Genetics 15:146–156. oldal) olyan transzgenikus egérvonalat hoztak létre, amely – amikor antigénnel reagál – nagy affinitású teljes humán ellenanyagokat hoz létre. Ezt egy megabázis méretû humán nehéz lánc és könnyû lánc lókusz olyan egerek csíravonalába történõ beépítésével érték el, amelyekben az endogén JH szegmens deletálva volt, amint fent ismertettük. Ezek az egerek [XenoMouse® II technology (Abgenix; Fremont, California)] hordozzák a humán nehéz lánc lókusz 1020 kb¹át, amely megközelítõleg 66 VH gént, a teljes DH és JH régiókat és három különbözõ állandó régiót, és továbbá hordoznak 800 kb¹t a humán k lókuszból, amely 32 VK gént, Jk szegmenseket és Ck géneket is tartalmaz. Az ezekben az egerekben termelt ellenanyagok nagyon hasonlítanak az emberekben megtalálhatókra, beleértve génátrendezést, összeállítást és repertoárt. A humán ellenanyagok preferenciálisan expresszálódnak az endogén ellenanyagok helyett az endogén szegmensben lévõ deléció miatt, ami megakadályozza a génátrendezõdést az egér lókuszon. Az ilyen egereket immunizálhatjuk a jelentõséggel bíró antigénnel. Az ilyen immunizált állatokból származó szérumokat szkrínelhetjük az ellenanyagnak a kiindulási antigén elleni reaktivitására. Limfocitákat izolálhatunk a nyirokcsomókból vagy lépbõl, és tovább szelektálhatjuk B¹sejtekre CD138-negatív és CD19-pozitív sejtekre történõ szelekcióval. Egy aspektus szerint az ilyen B¹sejt tenyészeteket (BCC¹k) fuzionáltathatjuk mielomasejtekkel, hogy hibridómákat hozzunk létre, amint fent ismertettük. Egy másik aspektus szerint az ilyen B¹sejt tenyészeteket tovább szkrínelhetjük elõnyösen a kiindulási antigén elleni reaktivitásra. Az ilyen szkrínelés ELISA¹t foglal magában a célantigén fehérjével, kompetíciós vizsgálati eljárást ismert ellenanyagokkal, amelyek kötõdnek a jelentõséggel bíró antigénhez, és in vitro kötést tranziensen transzfektált CHO- vagy más sejtekhez, amelyek expresszálják az antigént. A leírás tárgyát képezi készítmények és eljárások CD40¹et expresszáló sejtek felszínén található CD40jeltovábbítás stimulálása által közvetített betegségben szenvedõ humán páciensek kezelésére. Az eljárások kezelést foglalnak magukban a találmány szerinti antiCD40 ellenanyaggal vagy annak antigénkötõ fragmensével, ahol az ellenanyag vagy antigénkötõ fragmens beadása pozitív terápiás választ segít elõ az ilyen terápiával kezelt páciensben. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható anti-CD40 ellenanyagok specifikusan kötõdnek humán sejt felszínén expresszált humán CD40-antigénhez és mentesek szignifikáns agonista aktivitástól, de antagonista aktivitást mutatnak, amikor kötõdnek a CD40¹et expresszáló sejten található CD40-antigénhez. Ezeket az anti-CD40 ellenanyagokat és antigénkötõ fragmenseiket a leírás szerint antagonista anti-CD40 ellenanyagoknak nevezzük. Ilyen ellenanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak az alább ismertetett CHIR–5.9 és CHIR–12.12 teljesen

1

HU 007 240 T2

humán monoklonális ellenanyagok, és olyan monoklonális ellenanyagok, amelyek rendelkeznek a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságaival. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti antagonista ellenanyagok és ezen ellenanyagok antigénkötõ fragmensei közé tartoznak olyan ellenanyagok és fragmenseik, amelyek rekombináns módon vannak elõállítva a szakterületen jól ismert és alább ismertetett eljárások alkalmazásával, és ezek közé tartoznak például a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok, amelyek rekombináns módon lettek elõállítva. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságaival rendelkezõ ellenanyagok közé tartoznak olyan ellenanyagok, amelyek kompetitíven zavarják a CD40 kötõdését és/vagy ugyanahhoz az epitóphoz kötõdnek, mint a CHIR–5.9 és CHIR–12.12. A szakember szokásos eljárások alkalmazásával képes meghatározni, hogy egy ellenanyag kompetitíven zavarja¹e a CHIR–5.9¹t vagy CHIR–12.12¹t. Amikor ezek az ellenanyag kötõdnek a humán sejtek, mint például humán B¹sejtek felszínén prezentált CD40-hez, az ellenanyagok mentesek szignifikáns agonista aktivitástól; bizonyos megvalósítási módok szerint a humán sejtek felszínén prezentált CD40-hez való kötõdésük ezen humán sejtek proliferációjának és differenciálódásának a gátlását eredményezi. Ily módon a találmány szerinti eljárásokban való alkalmazásra alkalmas antagonista anti-CD40 ellenanyagok közé tartoznak olyan monoklonális ellenanyagok, amelyek antagonista aktivitást mutatnak a sejtfelszíni CD40-antigént expresszáló normál és rosszindulatú humán sejtek iránt. Bizonyos megvalósítási módok szerint a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok megnövekedett daganatellenes aktivitást mutatnak az IDEC–C2B8 antiCD20 kiméra monoklonális ellenanyaghoz viszonyítva, ahol a daganatellenes aktivitást ezen ellenanyagok ekvivalens mennyiségével mérjük csupasz egér xenograft daganatmodellben humán limfómasejtvonalak alkalmazásával. Az IDEC–C2B8 (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California; kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ a Rituxan® kereskedelmi név alatt, rituximabnak is nevezik) egy kiméra anti-CD20 monoklonális ellenanyag, amely humán IgG1 és kappa konstans régiókat és az IDEC-2B8 egér anti-CD20 monoklonális ellenanyagból izolált egér variábilis régiókat tartalmaz [Reff és munkatársai (1994) Blood 83:435–445. oldal]. A Rituximab® visszatérõ B¹sejtes alacsony fokozatú vagy follikuláris nem Hodgkin-limfóma (NHL) kezelésére van engedélyezve. A Rituximab®-bal összehasonlítva jobb daganatellenes aktivitású ellenanyagok felfedezése drasztikusan javíthatja a B¹sejtes limfómák, különösen a B¹sejtes nem-Hodgkin-limfómák rákterápiájának eljárásait. Az alkalmas csupasz egér xenograft daganatmodellek közé tartoznak azok, amelyek a Namalwa és Daudi néven ismert humán Burkitt-limfóma sejtvonalakat alkalmaznak. Elõnyös megvalósítási módokat is-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

mertetünk daganatellenes aktivitás mérésére kétlépcsõs csupasz egér xenograft daganatmodellekben a Daudi humán limfómasejtvonal alkalmazásával a 17. példában. Egy kétlépcsõs csupasz egér xenograft daganatmodell a Daudi-limfóma sejtvonal alkalmazásával hatékonyabb egy adott ellenanyag terápiás hatékonyságának megkülönböztetésére, mint egy egylépcsõs modell, mivel a kétlépcsõs modellben az ellenanyagadagolását csak azután kezdjük meg, amikor a daganat mérhetõ méretet ért el. Az egylépcsõs modellben az ellenanyag adagolását általában a daganat beoltását követõ 1 napon belül és még a kitapintható daganat megjelenése elõtt megkezdjük. Egy ellenanyag képessége a Rituxan® felülmúlására (azaz megnövekedett daganatellenes aktivitás mutatása) egy kétlépcsõs modellben erõs utalása arra, hogy az ellenanyag terápiásan hatékonyabb lesz, mint a Rituxan®. Ezenfelül a Daudi-modellben az anti-CD20, a Rituxan® célpontja magasabb szinten expresszálódik a sejt felszínén, mint a CD40. A találmány szerinti anti-CD40 ellenanyag és Rituxan® „ekvivalens mennyisége” kifejezés alatt azt értjük, hogy ugyanazt a mg dózist adjuk be a tömegre vetítve. Ily módon amikor a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagot 0,01 mg/egértesttömeg¹kg dózisban adjuk be a daganatmodellben, a Rituxan®¹t is 0,01 mg/egér-testtömeg¹kg dózisban adjuk be. Hasonlóképpen, ahol a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagot 0,1, 1 vagy 10 mg/egértesttömeg¹kg dózisban adjuk be a daganatmodellben, a Rituxan®¹t is 0,1, 1 vagy 10 mg/egértesttömeg¹kg dózisban adjuk be. Amikor a csupasz egér xenograft daganatmodellben adjuk be, némely találmány szerinti ellenanyag szignifikánsan kisebb daganattérfogatot eredményez, mint a Rituxan® ekvivalens mennyisége. Ily módon például a teljesen humán CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag legalább 20% növekedést mutat a daganatellenes aktivitásban összehasonlítva a Rituxan-ekvivalens dózásával megfigyelttel, amikor a kétlépcsõs csupasz egér xenograft daganatmodellben van vizsgálva a Daudi humán limfómasejtvonal alkalmazásával az alábbi példákban ismertetett módon, és akár 50–60% növekedést is mutathat a daganatellenes aktivitásban ebben a vizsgálati eljárásban. Ez a megnövekedett daganatellenes aktivitás a daganat térfogatának nagyobb mértékû csökkenésében nyilvánul meg a találmány szerinti antiCD40 ellenanyaggal megfigyelve, amikor összehasonlítjuk Rituxan® ekvivalens dózisával. Ily módon például a daganat inokulálása után idõ függvényében a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag olyan daganattérfogatot mutathat, amely körülbelül egyharmada-fele a Rituxan® ekvivalens dózisával megfigyeltnek. Egy másik különbség az ellenanyag hatékonyságában az ellenanyag azon in vitro koncentrációjának a mértéke, ami a daganatsejtek maximális in vitro lízisének eléréséhez szükséges NK sejtek jelenlétében. Például a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok a Daudi-sejtek maximális lízisét a Rituxan® koncentrációjának kevesebb mint 1/2, és elõnyösen 1/4, és legelõnyösebben 1/10 EC50-értékénél érik el.

1

HU 007 240 T2

A CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag mellett más anti-CD40 ellenanyagok – amelyekre rendelkeznek a Rituxan® ekvivalens mennyiségénél szignifikánsan nagyobb hatékonyság jellemzõjével a fent ismertetett vizsgálati eljárásokban – nem korlátozó példái közé tartoznak a következõk: (1) a 12.12 hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyag; (2) olyan monoklonális ellenanyag, amely a 2. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 4. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, az 5. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 2. és 4. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia és a 2. és 5. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmaz; (3) olyan monoklonális ellenanyag, amely az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 3. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia és az 1. és 3. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekula által kódolt aminosavszekvenciát tartalmaz; (4) olyan monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely képes a 12.12 hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyag kötésére; (5) olyan monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a 10. vagy 12. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvencia 82–87. oldalláncait; (6) olyan monoklonális ellenanyag, amely verseng a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal kompetitív kötési vizsgálati eljárásban; és (7) olyan monoklonális ellenanyag, amely a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag vagy az elõbbi (1)–(6) pontok szerinti monoklonális ellenanyagok antigénkötõ fragmense, ahol a fragmens megtartja a humán CD40-antigénhez való specifikus kötõdés képességét. Antagonista anti-CD40 ellenanyagok A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok a találmány szerinti eljárásokban történõ alkalmazásra alkalmas antagonista anti-CD40 ellenanyagokat képviselnek. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagok IgG1 izotípusú teljesen humán antiCD40 monoklonális ellenanyagok, amelyeket a 131.2F8.5.9 (a leírás szerint 5.9 sejtvonal) és 153.8E2.D10.D6.12.12 (a leírás szerint a 12.12 sejtvonal) hibridóma sejtvonalak termelnek. Ezeket a sejtvonalakat a humán IgG1 nehéz lánc lókuszt és a humán k lánc lókuszt tartalmazó xenotipikus egerekbõl származó lépsejtek alkalmazásával hoztuk létre (XenoMouse® technológia; Abgenix; Fremont, California). A lépsejteket az SP2–0 egér mielomasejtekkel (Sierra BioSource) fuzionáltattuk. A kapott hibridómákat több alkalommal szubklónoztuk, hogy létrehozzuk a stabil 5.9 és 12.12 monoklonális sejtvonalakat. A találmány szerinti többi ellenanyagot hasonló módon állíthatjuk elõ humán immunglobulin lókuszokra transzgenikus egerek alkalmazásával vagy a szakterületen ismert és/vagy a leírásban ismertetett más eljárásokkal. A CHIR–12.12 ellenanyag variábilis régióinak nukleotid- és aminosavszekvenciáit és a CHIR–5.9 ellen-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

anyag variábilis régióinak az aminosavszekvenciáit ismertetjük. Közelebbrõl a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag könnyû lánc és nehéz lánc vezetõ, variábilis és konstans régió aminosavszekvenciáit sorrendben a 9A. és 9B. ábrán mutatjuk be. Lásd még a 2. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag könnyû láncának teljes szekvenciája), 4. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag nehéz láncának teljes szekvenciája) és az 5. azonosító számú szekvenciát (a 4. azonosító számú szekvencia szerinti CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag nehéz lánc variánsának teljes szekvenciája, ahol a variáns szerin szubsztitúciót tartalmaz alanin oldallánc helyett a 4. azonosító számú szekvencia 153. pozíciójában). A CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag könnyû láncát és nehéz láncát kódoló nukleotidszekvenciákat sorrendben a 11A. és 11B. ábrán mutatjuk be. Lásd még az 1. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag könnyû láncának a kódolószekvenciája) és a 3. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag nehéz láncának a kódolószekvenciája). A CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag könnyû lánc és nehéz lánc vezetõ, variábilis és konstans régió aminosavszekvenciáit sorrendben a 10A. és 10B. ábrán mutatjuk be. Lásd még a 6. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag könnyû láncának teljes szekvenciája), 7. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag nehéz láncának teljes szekvenciája) és a 8. azonosító számú szekvenciát (a 7. azonosító számú szekvencia szerinti CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag nehéz lánc variánsának teljes szekvenciája, ahol a variáns szerin szubsztitúciót tartalmaz alanin oldallánc helyett a 7. azonosító számú szekvencia 158. pozíciójában). Ezenfelül a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagokat expresszáló hibridómákat letétbe helyeztük az ATCC-nél sorrendben a PTA–5542 és PTA–5543 szabadalmi letéti számok alatt. Az antagonista aktivitás mellett elõnyös, ha a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok más daganatsejt-mûködés elleni mechanizmussal is rendelkeznek. Például a natív CHIR- és CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagoknak ADCC aktivitása van. Más megoldásképpen a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagok variábilis régióit expresszáltathatjuk más izotípusban, amelynek ADCC aktivitása van. Az is lehetséges, hogy a CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 natív formáit, rekombináns formáit vagy antigénkötõ fragmenseit konjugáljuk citotoxinhoz, terápiás ágenshez vagy radioaktív fémionhoz vagy radioizotóphoz, amint alább említjük. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötik az oldható CD40¹et ELISA-típusú vizsgálati eljárásokban, megakadályozzák a CD40-ligandum kötõdését sejtfelszíni CD40-hez és leszorítják ez elõzõleg felkötõdött CD40-ligandumot, áramlási citometriás vizsgálati eljárásokkal meghatározva. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagok versengenek egymással a CD40-hez való kötésben, de a 15B8¹al nem, amely a WO 02/28904 számú nemzetkö-

1

HU 007 240 T2

zi közzétételi iratban ismertetett anti-CD40 monoklonális ellenanyag. Amikor in vitro vannak tesztelve B¹sejtek proliferációjára gyakorolt hatásukra, a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 antagonista antiCD40 ellenanyagokként hatnak. Ezenfelül a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 nem indukálja normális alanyok humán limfocitáinak erõs proliferációját. Ezek az ellenanyagok képesek a CD40¹et expresszáló célsejtek elpusztítására ellenanyagfüggõ celluláris citotoxicitással (ADCC). A CHIR–5.9 humán CD40 iránti kötõ affinitása 1,2×10 –8 M és a CHIR–12.12 kötõ affinitása 5×10–10 M, a Biacore™ vizsgálati eljárással meghatározva. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható alkalmas antagonista anti-CD40 ellenanyagok erõs egypontos kötõaffinitást mutatnak a CD40 sejtfelszíni antigén iránt. A találmány szerinti monoklonális ellenanyagok mutatott disszociációs egyensúlyi állandója (KD) CD40 iránt legalább 10–5 M, legalább 3×10–5 M, elõnyösen legalább 10–6 M és 10–7 M közötti, elõnyösebben legalább 10–8 M és körülbelül 10–12 M közötti, szokásos vizsgálati eljárások, mint például Biacore™ alkalmazásával mérve. A Biacore elemzés ismert a szakterületen és a részleteit a „BIAapplications handbook” irodalmi hely adják meg. A WO 01/27160 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett eljárásokat alkalmazhatjuk a kötési affinitás modulálására. A „CD40-antigén”, „CD40 sejtfelszíni antigén”, „CD40-receptor” vagy „CD40” alatt olyan transzmembrán glikoproteint értünk, amely a tumornekrózis-faktor (TNF) receptorcsaládba tartozik [lásd például US 5 674 492 és 4 708 871 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok; Stamenkovic és munkatársai (1989) EMBO 8:1403. oldal; Clark (1990) Tissue Antigéns 36:33. oldal; Barclay és munkatársai (1997) „The Leucocyte Antigen Facts Book” (2. kiadás; kiad.: Academic Press, San Diego)]. A humán CD40-nek két izoformáját azonosították, amelyeket a gén két alternatívan hasított („spliced”) transzkripciós variánsa kódol. Az elsõ izoforma (amelyet „hosszú izoformának” vagy „1¹es izoformának” is neveznek) egy 277 aminosav hosszúságú prekurzor polipeptidként expresszálódik [12. azonosító számú szekvencia (elõször a GenBank CAA43045 hozzáférési szám alatt számoltak be róla, és 1¹es izoformaként azonosították a GenBank NP_001241 hozzáférési szám alatt), amelyet a 11. azonosító számú szekvencia kódol (lásd GenBank hozzáférési számok X60592 és NM_001250)], amelyekben az elsõ 19 aminosav a szignálszekvenciát képviseli. A második izoforma (amelyet „rövid izoformának” vagy „2¹es izoformának” is neveznek) egy 203 aminosav hosszúságú prekurzor polipeptidként expresszálódik [10. azonosító számú szekvencia (GenBank hozzáférési száma NP_690593), amelyet a 9. azonosító számú szekvencia kódol (GenBank hozzáférési száma NM_152854)], amelynek szintén van egy, az elsõ 19 oldallánc által képviselt szignálszekvenciája. A humán CD40 ezen két izoformájának prekurzor polipeptidjeinek közös az elsõ 165 oldallánca (azaz az 10. és 12. azonosító számú szekvencia 1–165. oldalláncai). A rövid izoforma prekurzor poli-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

peptidjét (10. azonosító számú szekvencia) egy transzkripciós variáns (9. azonosító számú szekvencia) kódolja, amely nem tartalmaz kódoló szegmenst, ami transzlációs fázisváltáshoz vezet; a kapott CD40 izoforma rövidebb és eltérõ C¹terminálist (a 10. azonosító számú szekvencia 166–203. oldalláncai) tartalmaz a CD40 hosszú izoformájában találhatóhoz képest (a C¹terminálist a 12. azonosító számú szekvencia 166–277. oldalláncain mutatjuk be). A találmány szerinti értelemben a „CD40-antigén”, „CD40 sejtfelszíni antigén”, „CD40-receptor” vagy „CD40” magában foglalja a CD40 rövid és hosszú izoformáit egyaránt. A találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok a humán CD40 olyan epitópjához kötõdnek, amely ugyanabban a pozícióban található a sejtfelszíni antigén rövid izoformájában és hosszú izoformájában egyaránt, amint alább ismertetjük. A CD40-antigén különféle sejtek felszínén prezentálódik, amint a leírásban más helyen ismertetjük. A „felszínen prezentálódik” és a „felszínen expresszálódik” kifejezés alatt azt értjük, hogy a CD40-antigén egésze vagy egy részlete hozzáférhetõ a sejt felszínén. A prezentált vagy expresszált CD40-antigén teljesen vagy részlegesen glikozilált lehet. Az „agonista aktivitás” kifejezés alatt azt értjük, hogy az anyag agonistaként hat. Egy agonista kapcsolódik a sejten található receptorhoz, és olyan reakciót vagy aktivitást vált ki, amely hasonló vagy ugyanaz, mint a receptor természetes liganduma által kiváltott. A CD40 agonistája nem korlátozó példaként a következõ válaszok mindegyikét vagy bármelyikét váltja ki: B¹sejt-proliferáció és ¹differenciáció, ellenanyag-termelés, intercelluláris adhézió, B¹sejt-memória létrehozása, izotípusváltás, az MHC II¹es osztály és CD80/86 sejtfelszíni expressziójának felülszabályozása, és proinflammatorikus citokinek, mint például IL–8, IL–12 és TNF szekréciója. Az „antagonista aktivitás” alatt azt értjük, hogy az anyag antagonistaként hat. A CD40 antagonistája megakadályozza vagy csökkenti a CD40-receptornak agonista ligandumhoz, elõnyösen CD40L-hez történõ kötõdése által kiváltott válaszok bármelyikét. Az antagonista az agonista kötõdésére adott válaszok mindegyikének vagy bármelyikének indukálását csökkentheti 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%-kal, elõnyösen 40%, 45%, 50%, 55%, 60%kal, elõnyösebben 70%, 80%, 85%-kal és legelõnyösebben 90%, 95%, 99% vagy 100%-kal. Az antiCD40 ellenanyag és CD40-ligandum kötési specifitásának mérésére szolgáló eljárások ismertek a szakember számára, és nem korlátozó példái közé tartoznak szokásos kompetitív kötési vizsgálati eljárások, immunglobulinok B¹sejtek általi szekréciójának monitorozására szolgáló vizsgálati eljárások, B¹sejt proliferációs vizsgálati eljárások, Banchereau–Like-B-sejt proliferációs vizsgálati eljárások, ellenanyag termelésre szolgáló T¹sejt segítõ vizsgálati eljárások, B¹sejt kostimulációs proliferációs vizsgálati eljárások és B¹sejt aktivációs markerek felülszabályozásának vizsgálati eljárásai. Lásd például a WO 00/75348 számú nemzetközi közzétételi iratban és az US 6 087 329 számú amerikai

1

HU 007 240 T2

egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetett vizsgálati eljárásokat. A „szignifikáns” agonista aktivitás alatt a B¹sejt-válasz mérésére szolgáló vizsgálati eljárással mért, semleges anyag vagy negatív kontroll által indukált agonista aktivitásnál legalább 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% vagy 100%-kal nagyobb agonista aktivitást értünk. Elõnyösen a „szignifikáns” agonista aktivitás olyan agonista aktivitás, amely legalább 2¹szer nagyobb vagy legalább 3¹szor nagyobb, mint a semleges anyag vagy negatív kontroll által indukált agonista aktivitás, B¹sejt-válasz mérésére szolgáló vizsgálati eljárással mérve. Ily módon például amikor a jelentõséggel bíró B¹sejtes válasz B¹sejt-proliferáció, a „szignifikáns” agonista aktivitás olyan B¹sejtproliferációs szint indukálása lenne, amely legalább 2¹szer nagyobb vagy legalább 3¹szor nagyobb, mint a semleges anyag vagy negatív kontroll által indukált B¹sejt proliferáció szintje. Egy megvalósítási mód szerint nemspecifikus immunglobulin, például olyan IgG1 szolgál negatív kontrollként, amely nem kötõdik a CD40-hez. Egy olyan anyag, amely „mentes szignifikáns agonista aktivitástól”, olyan agonista aktivitást mutatna, amely nem több mint körülbelül 25%-kal nagyobb mint egy semleges anyag vagy negatív kontroll által indukált agonista aktivitás, elõnyös nem több mint körülbelül 20%-kal nagyobb, 15%-kal nagyobb, 10%kal nagyobb, 5%¹kal nagyobb, 1%¹kal nagyobb, 0,5%kal nagyobb vagy akár nem több mint körülbelül 0,1%kal nagyobb, mint a semleges anyag vagy negatív kontroll által indukált agonista aktivitás, B¹sejtes válasz mérésre szolgáló vizsgálati eljárással mérve. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható antagonista anti-CD40 ellenanyagok mentesek szignifikáns agonista aktivitástól, amint fent említettük, amikor kötõdnek a humán sejt felszínén található CD40-antigénhez. A találmány egy megvalósítási módja szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyag mentes szignifikáns agonista aktivitástól egy B¹sejtes válaszban. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint az antagonista antiCD40 ellenanyagmentes szignifikáns agonista aktivitástól egynél több B¹sejtes válasz (például proliferáció és differenciáció, vagy proliferáció, differenciáció és ellenanyag-termelés) vizsgálati eljárásában. A leírás szerint az „anti-CD40 ellenanyag” kifejezés magában foglal bármilyen olyan ellenanyagot, amely specifikusan felismeri a CD40 B¹sejt felszíni antigént, beleértve poliklonális ellenanyagokat, monoklonális ellenanyagokat, egyláncú ellenanyagokat, és azok fragmenseit, mint például Fab, F(ab’)2, Fv, és más olyan fragmenseket, amelyek megtartják a szülõi antiCD40 ellenanyag antigénkötõ funkcióját. Különösen érdekesek a találmány szerint azok a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagok, amelyek osztják a fent ismertetett CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságait. Ilyen ellenanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak a következõk: (1) a 131.2F8.5.9 (a leírás szerint 5.9 jelû sejtvonal) és a 153.8E2.D10.D6.12.12 (a leírás szerint 12.12 jelû sejtvonal) hibridóma sejtvonal által termelt

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

2

monoklonális ellenanyagok, amelyek letétbe lettek helyezve az ATCC-nél sorrendben a PTA–5542 számú szabadalmi letétként és PTA–5543 számú szabadalmi letétként; (2) olyan monoklonális ellenanyag, amely a 2. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 4. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, az 5. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 2. és 4. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia és a 2. és 5. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmaz; (3) olyan monoklonális ellenanyag, amely a 6. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 7. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 8. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 6. és 7. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia és a 6. és 8. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmaz; (4) olyan monoklonális ellenanyag, amely az 1. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia, a 3. azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia és az 1. és 3. azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia által alkotott csoportból kiválasztott nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekula által kódolt aminosavszekvenciát tartalmaz; (5) olyan monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely képes az 5.9 hibridóma sejtvonal vagy a 12.12 hibridóma sejtvonal által termelt monoklonális ellenanyag kötésére; (6) olyan monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a 10. vagy 12. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvencia 82–87. oldalláncait; (7) olyan monoklonális ellenanyag, amely verseng a CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal kompetitív kötési vizsgálati eljárásban; és (8) olyan monoklonális ellenanyag, amely a CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag vagy az elõbbi (1)–(7) pontok szerinti monoklonális ellenanyagok antigénkötõ fragmense, ahol a fragmens megtartja a humán CD40-antigénhez való specifikus kötõdés képességét. Antagonista anti-CD40 ellenanyagok elõállítása A találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagokat és a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható ellenanyagokat a szakember számára ismert bármilyen ellenanyag-termelõ eljárás alkalmazásával elõállíthatjuk. Ily módon poliklonális szérumokat állíthatunk elõ hagyományos eljárások alkalmazásával. Általánosságban elõször a GD40 antigént tartalmazó oldatot alkalmazunk megfelelõ állat, elõnyösen egér, patkány, nyúl vagy kecske immunizálására. A nyulak vagy kecskék elõnyösek a poliklonális szérumok elõállítására, a kapott szérum térfogata, és a jelzett antinyúl és antikecske ellenanyagok hozzáférhetõsége miatt. Poliklonális szérumokat transzgenikus állatban, elõnyösen humán immunglobulin lókuszokat hordozó egérben állíthatunk elõ. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint CD40¹et expresszáló Sf9 sejteket alkalmazunk immunogénként. Az immunizálási végrehajthatjuk

1

HU 007 240 T2

az antigént tartalmazó oldat összekeverésével vagy emulgeálásával sóoldattal, elõnyösen Freund-féle komplett adjuvánssal, és a keverék vagy emulzió parenterális (általában szubkután vagy intramuszkuláris) beinjektálásával. Tipikusan 50–200 mg/injekció dózis elegendõ. Az immunizálási általában megerõsítjük 2–6 héttel késõbb a fehérje egyszeri vagy többszöri injektálásával sóoldatban, elõnyösen Freund-féle inkomplett adjuváns alkalmazásával. Más megoldásképpen ellenanyagokat létrehozhatunk in vitro immunizálással szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, amelyeket a találmány szerint ekvivalensnek tekintünk az in vivo immunizálással. A poliklonális antiszérumokat az immunizált állatok üveg vagy mûanyag tartályba történõ véreztetésével, a vér 25 °C¹on egy órán keresztül történõ inkubálásával, majd 4 °C¹on 2–18 órán keresztül történõ inkubálásával állítjuk elõ. A szérumot centrifugálással nyerjük vissza (például 1000×g 10 percen keresztül). Nyulaktól véreztetésenként körülbelül 20–50 ml¹t nyerhetünk. Az Sf 9 (Spodoptera frugiperda) sejtek elõállítását az US 6 004 552 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetik. Röviden, humán CD40¹et kódoló szekvenciákat juttatunk be rekombináns úton bakulovírusba transzfervektorok alkalmazásával. A plazmidokat együtt betranszfektáljuk vad típusú bakulovírus DNS-sel Sf 9 sejtekbe. A rekombináns bakulovírussal megfertõzött Sf 9 sejteket azonosítjuk és klonálisan megtisztítjuk. Elõnyösen az ellenanyag monoklonális természetû. A „monoklonális ellenanyag” kifejezés alatt leírás szerinti értelemben lényegében homogén ellenanyagok populációjából elõállított ellenanyagot értünk, azaz a populációt alkotó egyedi ellenanyagok azonosak, kivéve lehetséges természetben elõforduló mutációkat, amely kismértékben jelen lehetnek. A kifejezés nem korlátozott az ellenanyag fajára vagy forrására. A kifejezés magában foglalja a teljes immunglobulinokat, valamint a fragmenseket, mint például Fab, F(ab’)2, Fv és másokat, amelyek megtartják az ellenanyag antigénkötõ funkcióját. A monoklonális ellenanyagok erõsen specifikusak, egyetlen antigenikus hely ellen irányulnak, azaz a találmány szerinti CD40 sejtfelszíni antigén ellen. Ezenfelül ellentétben a hagyományos (poliklonális) ellenanyag-készítményekkel, amelyek tipikusan különbözõ determinánsok (epitópok) elleni különbözõ ellenanyagokat tartalmaznak, mindegyik monoklonális ellenanyag az antigén egyetlen determinánsa ellen irányul. A „monoklonális” módosító jelzi az ellenanyag azon jellegzetességét, hogy ellenanyag egy lényegében homogén populációból származik, és nem tekinthetõ úgy, hogy az ellenanyagot bármilyen adott eljárással kell elõállítani. Például a találmány szerint alkalmazható monoklonális ellenanyagokat elõállíthatjuk a hibridóma eljárással, amelyet elõször Kohler és munkatársai írtak le [Nature 256: 495. oldal (1975)], vagy rekombináns DNS-eljárásokkal állíthatjuk elõ azokat (lásd például US 4 816 567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). A „monoklonális ellenanyagok” lehetnek fág-ellenanyag könyvtárakból izolál-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

tak is, például a Clackson és munkatársai (1991) Nature 352:624–628. oldal; Marks és munkatársai (1991) J. Mol. Biol. 222:581–597. oldal; és US 5 514 548 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat irodalmi helyeken ismertetett eljárások alkalmazásával. Az „epitóp” kifejezés alatt antigenikus molekula azon részét értjük, amely ellen ellenanyag termelõdik és amelyhez az ellenanyag kötõdhet. Az epitópok tartalmazhatnak lineáris aminosav-oldalláncokat (azaz az oldalláncok az epitópon belül egymás után helyezkednek el lineáris módon), nem lineáris oldalláncokat (amit a leírás szerint „nem lineáris epitópoknak” nevezünk; ezek az epitópok nem szekvenciálisan vannak elrendezve) vagy egyaránt lineáris és nem lineáris aminosav-oldalláncokat. A monoklonális ellenanyagokat Kohler és munkatársai (1975) Nature 256:495–496. oldal eljárásának alkalmazásával állíthatjuk elõ, vagy annak módosításával. Tipikusan egeret immunizálunk antigént tartalmazó oldattal. Az immunizálási végrehajthatjuk az antigént tartalmazó oldat összekeverésével vagy emulgeálásával sóoldattal, elõnyösen Freund-féle komplett adjuvánssal, és a keverék vagy emulzió parenterális beinjektálásával. A szakterületen ismert bármilyen immunizálási eljárást alkalmazhatunk a találmány szerinti monoklonális ellenanyagok elõállítására. Az állat immunizálása után a lépet (és adott esetben számos nagy nyirokcsomót) eltávolítjuk, és egyedi sejtekké disszociáltatjuk. A lépsejteket szkrínelhetjük a sejtszuszpenziónak a jelentõséggel bíró antigénnel bevont lemezre vagy mérõhelyekre történõ felvitelével. Az antigénre specifikus membránkötött immunglobulint expresszáló B¹sejtek kötõdnek a lemezhez, és nem mosódnak el. A kapott B¹sejteket, vagy az összes disszociáltatott lépsejtet azután indukáljuk, hogy fuzionáljanak mielomasejtekkel, hibridómákat alkotva, és szelektív tápközegen tenyésztjük azokat. A kapott sejteket kiszélesztjük sorozathígítással és elemezzük olyan ellenanyagok termelésére, amelyek specifikusan kötõdnek a jelentõséggel bíró antigénhez (és amelyek nem kötõdnek nem rokon antigénekhez). A kiszelektált monoklonális ellenanyagot (mAb) szekretáló hibridómákat azután tenyésztjük akár in vitro (például szövettenyésztõ edényekben vagy hollow-fiber reaktorokban), akár in vivo (egerekben aszciteszként). Amikor a találmány szerinti antagonista antiCD40 ellenanyagokat rekombináns DNS-eljárások alkalmazásával állítjuk elõ, a monoklonális ellenanyagokat kódoló DNS¹t könnyedén izolálhatjuk és szekvenálhatjuk hagyományos módszerekkel (például olyan oligonukleotid próbákkal, amelyek képesek specifikusan kötõdni az egér ellenanyagok nehéz és könnyû láncát kódoló génekhez). A találmány szerinti hibridóma sejtek szolgálnak ilyen DNS¹ek elõnyös forrásaként. Ha egyszer izoláltuk, a DNS¹t expressziós vektorokba tehetjük, amelyeket azután gazdasejtekbe transzferálhatjuk, mint például E. coli-sejtekbe, majom COS-sejtekbe, kínai aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtekbe, vagy mielomasejtekbe, amelyek egyébként nem termelnek immunglobulin fehérjét, hogy elérjük a monoklonális ellenanyagok szintézisét a rekombináns gazdasejtekben.

1

HU 007 240 T2

Ellenanyagot kódoló DNS baktériumokban történõ rekombináns expresszióját összefoglaló cikkek közé tartoznak a Skerra és munkatársai (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256. oldal és Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151. oldal irodalmi helyek. Más megoldásképpen az ellenanyagot elõállíthatjuk sejtvonalban, mint például CHO-sejtvonalban, amint azt ismertetik az US 5 545 403; 5 545 405; és 5 998 144 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban. Röviden, a sejtvonalat transzfektáljuk a nehéz lánc és könnyû lánc expresszálására képes vektorokkal. A két fehérje különálló vektorokon történõ transzfektálásával kiméra ellenanyagokat állíthatunk elõ. Egy másik elõny az ellenanyag helyes glikozilációja. Bizonyos megvalósítási módokban az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét CHO-sejtekben állítjuk elõ a GS génexpressziós rendszer alkalmazásával (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), amely a glutamin-szintetázt alkalmazza markerként. Lásd az US 5 122 464; 5 591 639; 5 658 759; 5 770 3.59; 5 827 739; 5 879 936; 5 891 693; és 5 981 216 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. CD40 elleni monoklonális ellenanyagok ismertek a szakterületen. Lásd például A B¹sejt antigénrõl szóló szekciókat a következõ irodalmi helyeken: McMichael, szerk. (1987; 1989) „Leukocyte Typing III and IV” (kiad.: Oxford University Press, New York); US 5 674 492; 5 874 082; 5 677 165; 6 056 959 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok; WO 00/63395; WO 02/28905 és WO 02/28904 számú nemzetközi közzétételi iratok; Gordon és munkatársai (1988) J. Immunol. 140:1425. oldal; Valle és munkatársai (1989) Eur. J. Immunol. 19:1463. oldal; Clark és munkatársai (1986) PNAS 83:4494. oldal; Paulie és munkatársai (1989) J. Immunol. 142:590. oldal; Gordon és munkatársai (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535. oldal; Jabara és munkatársai (1990) J. Exp. Med. 172:1861. oldal; Zhang és munkatársai (1991) J. Immunol. 146:1836. oldal; Gascan és munkatársai (1991) J. Immunol. 147:8. oldal; Banchereau és munkatársai (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3:8. oldal; és Banchereau és munkatársai (1991) Science 251:70. oldal. Különösen érdekesek a találmány szerint azok a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagok, amelyek osztják a fent ismertetett CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságait. A „CD40-antigén epitóp” kifejezés alatt a leírás szerint olyan molekulát értünk, amely immunreakcióra képes a találmány szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyagokkal, a CD40-antigént magát kizárva. A CD40antigén epitópok tartalmazhatnak fehérjéket, fehérjefragmenseket, szénhidrátokat, lipideket és más molekulákat, de a jelen találmány céljára leggyakrabban fehérjék, rövid oligopeptidek, oligopeptidmimetikumok (azaz olyan szerves vegyületek, amelyek utánozzák a CD40antigén antigénkötõ tulajdonságait), vagy ezek kombinációi. Alkalmas oligopeptid mimetikumokat többek között az US 91/04282 PCT-bejelentés ismertet.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

Emellett az „anti-CD40 ellenanyag” kifejezés a leírás szerint magában foglalja a kiméra anti-CD40 ellenanyagokat; a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható ilyen kiméra anti-CD40 ellenanyagok rendelkeznek a találmány szerinti CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságaival. A „kiméra” ellenanyag kifejezés alatt olyan ellenanyagokat értünk, amelyek legelõnyösebben rekombináns dezoxiribonukleinsav-módszerekkel állítottunk elõ, és amelyek humán (beleértve immunológiailag „rokon” faj, például csimpánz) és nem humán komponenseket egyaránt tartalmaznak. Ily módon a kiméra ellenanyag konstans régiója legelõnyösebben lényegében azonos a természetes humán ellenanyag konstans régiójával; a kiméra ellenanyag variábilis régiója legelõnyösebben nem humán forrásból származik, és a CD40 sejtfelszíni antigén elleni kívánt antigénspecifitással rendelkezik. A nem humán forrás bármilyen gerinces forrás lehet, amely alkalmazható humán CD40 sejtfelszíni antigén vagy humán CD40 sejtfelszíni antigént tartalmazó anyag elleni ellenanyagok létrehozására. Ilyen nem humán források nem korlátozó példái közé tartoznak rágcsálók (például nyúl, patkány, egér stb.; lásd például US 4 816 567 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és nem humán fõemlõsök (például óvilági majmok, emberszabású majmok stb.; lásd például US 5,750,105 és 5,756,096 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok). A leírás szerint az „immunológiailag aktív” kifejezés alatt – amikor kiméra anti-CD40 ellenanyagokkal kapcsolatosan alkalmazzuk – olyan kiméra ellenanyagot értünk, amely humán CD40¹et köt. Kiméra és humanizált anti-CD40 ellenanyagok is beletartoznak a találmány szerinti értelemben az antiCD40 ellenanyag fogalmába. A kiméra ellenanyagok különbözõ fajokból származó ellenanyag-szegmenseket tartalmaznak. A Rituxan® a kiméra ellenanyag egy példája, egér variábilis régióval és humán konstans régióval. A „humanizált” kifejezés alatt anti-CD40 ellenanyagok olyan formáit értjük, amelyek minimális nem humán immunglobulin szekvenciákból származó szekvenciát tartalmaznak. A legtöbb esetben a humanizált ellenanyagok humán immunglobulinok (recipiens ellenanyagok), amelyekben a recipiens hipervariábilis régiós (más néven komplementaritást meghatározó régió vagy CDR) oldalláncai helyettesítve vannak hipervariábilis régiós oldalláncokkal egy nem humán fajból (donor ellenanyag), mint például egér, patkány, nyúl vagy nem humán fõemlõs, amely a kívánt specifitással, affinitással és kapacitással rendelkezik. A „komplementaritást meghatározó régió” kifejezés alatt olyan aminosavszekvenciákat értünk, amelyek együttesen meghatározzák a natív immunglobulin kötõhely természetes Fv¹régiójának a kötési affinitását és specifitását. [Lásd például Chothia és munkatársai (1987) J. Mol. Biol. 196:901–917. old.; Kabat és munkatársai (1991) U. S. Dept of Health and Human Services, NIH Publication No. 91–3242.)] A „konstans régió” kifejezés alatt az ellenanyag-molekula azon részletét értjük, amely az ef-

1

HU 007 240 T2

fektorfunkciókat biztosítja. Humán betegség terápiájára alkalmazható nem immunogenikus ellenanyagok biztosítására vonatkozó korábbi munkákban egér konstans régiót helyettesítettek humán konstans régiókkal. A humanizált ellenanyagok konstans régióit humán immunglobulinokból nyerték ki. Azonban ezek a humanizált ellenanyagok még mindig nemkívánatos és potenciálisan veszélyes immunválaszt váltottak ki emberekben és csökkent volt az affinitásuk. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható humanizált anti-CD40 ellenanyagok a találmány szerinti CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságaihoz hasonlóval rendelkeznek. A humanizálást lényegében Winter és munkatársai eljárását követve hajthatjuk végre [Jones és munkatársai (1986) Nature 321:522–525. oldal; Riechmann és munkatársai (1988) Nature 332:323–327. oldal; Verhoeyen és munkatársai (1988) Science 239:1534–1536. oldal], rágcsáló vagy mutáns rágcsáló CDR- vagy CDRszekvenciák behelyettesítésével a humán ellenanyag megfelelõ szekvenciái helyére. Lásd az US 5 225 539; 5 585 089; 5 693 761; 5 693 762; 5 859 205 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Bizonyos esetekben a humán immunglobulin egy vagy több variábilis régiójának vázrégióiban található oldalláncokat helyettesítjük a megfelelõ nem-humán oldalláncokkal (lásd például az US 5 585 089; 5 693 761; 5 693 762 és 6 180 370 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat). Ezenfelül a humanizált ellenanyagok tartalmazhatnak olyan oldalláncokat, amelyek nem találhatók meg a recipiens ellenanyagban vagy a donor ellenanyagban. Ezeket a módosításokat a kívánt biológiai aktivitás ellenanyag-teljesítményének további finomítására (például a kívánt affinitás elérésére) végezzük. Általában a humanizált ellenanyag tartalmazhatja legalább egy, és tipikusan kettõ variábilis domén lényegében egészét, amelyekben a hipervariábilis régiók egésze vagy lényegében egésze megfelel a nem humán immunglobulinénak, és a vázrégiók egésze vagy lényegében egésze megfelel a humán immunglobulin szekvenciának. A humanizált ellenanyag adott esetben tartalmazhatja immunglobulin konstans régió (Fc) legalább egy részét, tipikusan a humán immunglobulinét. További részletekért lásd Jones és munkatársai, Nature 321, 522–525. oldal; Riechmann és munkatársai (1988) Nature 332:323–327. oldal és Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593–596. oldal (1992). Ennek megfelelõen az ilyen „humanizált” ellenanyag közé tartozhatnak olyan ellenanyagok, amelyekben lényegesen kevesebb mint egy intakt humán variábilis domén lett szubsztituálva egy nem humán faj megfelelõ szekvenciájával. A gyakorlatban a humanizált ellenanyagok tipikusan olyan humán ellenanyagok, amelyekben bizonyos CDR oldalláncok és esetleg bizonyos vázrégió oldalláncok szubsztituálva vannak rágcsáló ellenanyagok analóg helyeirõl származó oldalláncokkal. Lásd például az US 5 225 539; 5 585 089; 5 693 761; 5 693 762; 5 859 205 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Lásd még az US 6 180 370 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot és a WO 01/27160 számú

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

nemzetközi közzétételi iratot, ahol humanizált ellenanyagokat és módszereket ismertetnek egy meghatározott antigén elleni javított affinitású humanizált ellenanyagok elõállítására. Az anti-CD40 ellenanyagok kifejezés szintén magában foglal xenogeneikus vagy módosított CD40 ellenanyagokat, amelyek nem-humán emlõs gazdában lettek termeltetve, közelebbrõl transzgenikus egérben, amelyben az endogén immunglobulin (Ig) lókuszok inaktiválva vannak. Az ilyen transzgenikus állatokban a gazda immunglobulinok könnyû- és nehéz láncát expresszáló kompetens endogén gének mûködésképtelenné vannak téve és helyettesítve vannak az analóg humán immunglobulin lókuszokkal. Ezek a transzgenikus állatok emberi ellenanyagokat termelnek a gazda immunglobulin könnyû vagy nehéz lánc alegységek lényegi hiánya mellett. Lásd például az US 5 877 397 és 5 939 598 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Elõnyösen a teljesen humán CD40 elleni ellenanyagokat transzgenikus egerek immunizálásával állítjuk elõ. Egy ilyen egeret a XenoMouse® technológiával állítunk elõ (Abgenix; Fremont, California), amely az US 6 075 181, 6 091 001 és 6 114 598 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban van feltárva. A találmány szerinti ellenanyagok elõállítására a humán IgG1 nehéz lánc lókuszra és a humán k könnyû lánc lókuszra transzgenikus egereket immunizáltunk humán CD40¹et expresszáló Sf 9 sejtekkel. Az egerek más izotípusokra is transzgenikusak lehetnek. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható teljesen humán ellenanyagok a találmány szerinti CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok kötési tulajdonságaihoz hasonlóval rendelkeznek. Az anti-CD40 ellenanyagok fragmensei alkalmasak a találmány szerinti eljárásokban történõ alkalmazásra, mindaddig, amíg megtartják a teljes hosszúságú ellenanyag kívánt affinitását. Ily módon az anti-CD40 ellenanyag fragmense megtartja a CD40 B¹sejt-felszíni antigénhez való kötõképességét. Az ilyen fragmensek tulajdonságai hasonlóak a megfelelõ teljes hosszúságú antagonista anti-CD40 ellenanyagéhoz, azaz a fragmensek specifikusan kötõdnek a humán sejtek felszínén expresszált humán CD40-antigénhez és mentesek szignifikáns agonista aktivitástól, de antagonista aktivitást mutatnak, amikor kötõdnek a CD40¹et expresszáló sejteken található CD40-antigénhez. Az ilyen fragmenseket a leírás szerint „antigénkötõ” fragmenseknek nevezzük. Egy ellenanyag alkalmas antigénkötõ fragmensei a teljes hosszúságú ellenanyag egy részletét tartalmazzák, elõnyösen annak az antigénkötõ vagy variábilis régióját. Az ellenanyagfragmensek nem korlátozó példái közé tartoznak Fab, F(ab’)2 és Fv fragmensek és egyláncú ellenanyag-molekulák. A „Fab” kifejezés alatt immunglobulin olyan monovalens antigénkötõ fragmensét értjük, amely a könnyû láncból és a nehéz lánc egy részébõl áll. Az F(ab’)2 kifejezés alatt immunglobulin olyan bivalens antigénkötõ fragmensét értjük, amely mindkét könnyû láncot és mindkét nehéz lánc egy ré-

1

HU 007 240 T2

szét tartalmazza. Az „egyláncú Fv” vagy „sFv” ellenanyagfragmensek olyan fragmensek, amelyek egy ellenanyag VH és VL doménjeit tartalmazzák, ahol ezek a domének egyetlen polipeptidláncon helyezkednek el. Lásd például az US 4 946 778, 5 260 203, 5 455 030 és 5 856 456 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Általában az Fv polipeptid továbbá tartalmaz egy polipeptid kapcsolómolekulát is a VH és VL domének között, amely lehetõvé teszi az sFV számára, hogy felvegye az antigénkötéshez szükséges szerkezetet. Az sFv¹t tárgyaló összefoglalásért lásd Pluckthun (1994), „The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”, 113. kötet, szerk.: Rosenburg és Moore (kiad.: Springer-Verlag, New York), 269–315. oldal. A találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagok antigénkötõ fragmenseit konjugálhatjuk citotoxinhoz is, hogy kiváltsuk célzott ráksejtek elpusztítását, amint azt alább ismertetjük. Ellenanyagokat és ellenanyagfragmenseket izolálhatunk például a következõ irodalmi helyeken ismertetett módszerekkel létrehozott ellenanyag-fág könyvtárakból: McCafferty és munkatársai (1990) Nature 348:552–554. oldal (1990) és US 5 514 548 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. Clackson és munkatársai (1991) Nature 352:624–628. oldal és Marks és munkatársai (1991) J. Mol. Biol. 222:581–597. old. sorrendben egér és humán ellenanyagok izolálását ismertetik fágkönyvtárak alkalmazásával. Késõbbi publikációk ismertetik nagy affinitású (nM¹os tartomány) humán ellenanyagok elõállítását lánckeveréssel [Marks és munkatársai (1992) Bio/Technology 10:779–783. oldal], valamint kombinatorikus fertõzést és in vivo rekombinációt nagyon nagy fágkönyvtárak létrehozására szolgáló stratégiák érdekében [Waterhouse és munkatársai (1993) Nucleic, Acids Res. 21:2265–2266. oldal]. Ily módon ezek a módszerek életképes alternatívát jelentenek a hagyományos monoklonális ellenanyag hibridóma módszerekhez képest monoklonális ellenanyagok izolálására. Különféle módszereket fejlesztettek ki ellenanyagfragmensek elõállítására. Hagyományosan ezeket a fragmenseket intakt ellenanyagok proteolitikus emésztésével állították elõ [lásd például Morimoto és munkatársai (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107–117. oldal (1992) és Brennan és munkatársai (1985) Science 229:81. oldal]. Azonban ezeket a fragmenseket már közvetlenül elõállíthatjuk rekombináns gazdasejtek alkalmazásával is. Például az ellenanyagfragmenseket izolálhatjuk a fent tárgyalt ellenanyag fágkönyvtárakból. Más megoldásképpen Fab’–SH fragmenseket közvetlenül visszanyerhetünk E. coli-sejtekbõl, és kémiai úton kapcsolhatjuk F(ab)2 fragmenseket állítva elõ [Carter és munkatársai (1992) Bio/Technology 10:163–167. oldal]. Egy másik megközelítési mód szerint F(ab’)2 fragmenseket izolálhatunk közvetlenül a rekombináns gazdasejt-tenyészetbõl. Az ellenanyagfragmensek elõállítására szolgáló egyéb módszerek nyilvánvalóak szakember számára. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható antagonista anti-CD40 ellenanyagok közé tartoznak a ta-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

2

lálmány szerinti CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok, valamint az ettõl az ellenanyagtól különbözõ ellenanyagok, amelyek azonban megtartják a CDR-eket; és olyan ellenanyagok, amelyekben egy vagy több aminosavaddíció, ¹deléció vagy ¹szubsztitúció van, és ahol az antagonistaaktivitást B¹sejt-proliferáció és/vagy ¹differenciáció gátlásával mérjük. A találmány tárgyát képezik deimmunizált antagonista antiCD40 ellenanyagok is, amelyek például a WO 98/52976 és WO 0034317 számú nemzetközi közzétételi iratokban ismertetett módon állíthatók elõ. Ezen a módon a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagokban található oldalláncokat úgy módosítjuk, hogy azok az ellenanyagokat nem vagy kevésbé immunogenikussá tegyék emberekben, miközben megtartják az antagonista aktivitásukat a humán CD40-expresszáló sejtek iránt, ahol az ilyen aktivitást a leírásban máshol említett vizsgálati eljárásokkal mérjük. Az igénypontok oltalmi körébe tartoznak fúziós fehérjék is, amelyek találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy fragmensét tartalmazzák, amely fúziós fehérjéket megszintetizálhatjuk vagy megfelelõ polinukleotid vektorokról expresszáltathatjuk, amint az ismert a szakterületen. Az ilyen fúziós fehérjéket ellenanyagok alább ismertetett konjugálására vonatkoztatva ismertetjük. A találmány szerinti ellenanyagok szekvenciavariációkat tartalmazhatnak, amelyeket például a EP 0 983 303 A1 számú európai szabadalmi irat, WO 00/34317 és WO 98/52976 számú nemzetközi közzétételi iratok által ismertetett eljárások alkalmazásával lehet elõállítani. Például kimutatták, hogy a CDR¹en belüli szekvenciák az ellenanyag kötõdését okozhatják II¹es osztályú MAC-hoz, és nem kívánt segítõ T¹sejtes választ válthatnak ki. Egy konzervatív szubsztitúció lehetõvé teheti az ellenanyag számára, hogy megtartsa a kötési aktivitását és elveszítse a képességét nem kívánt T¹sejtes válasz kiváltására. Bármilyen ilyen konzervatív vagy nem konzervatív szubsztitúciót szakterületen ismert eljárások alkalmazásával hajthatunk végre, mint például a leírásban máshol említettekkel, és a kapott ellenanyagok a találmány oltalmi körébe esnek. A variáns ellenanyagokat rutinszerûen tesztelhetjük antagonista aktivitásra, affinitásra és specifitásra a leírásban ismertetett eljárások alkalmazásával. A fent ismertetett eljárások bármelyikével vagy bármely más itt nem ismertetett eljárással elõállított ellenanyag a leírás oltalmi körébe esik, ha rendelkezik a következõ biológiai aktivitások legalább egyikével: T¹sejtekkel stimulált normál humán perifériás B¹sejtek általi immunglobulin-szekréció gátlása; Jurkat T¹sejtekkel stimulált normál humán perifériás B¹sejtek túlélésének és/vagy proliferációjának gátlása; CD40L-expresszáló sejtekkel vagy oldható CD40-ligandummal (sCD40L) stimulált normál humán perifériás B¹sejtek túlélésének és/vagy proliferációjának gátlása; sCD40L vagy szilárd fázisú CD40L által stimulált bármilyen sejt „túlélési” antiapoptopikus intracelluláris szignáljának gátlása; sCD40L vagy szilárd fázisú CD40L ligálása hatására bekövetkezõ transzdukció gátlása bármilyen sejtben;

1

HU 007 240 T2

és humán rosszindulatú B¹sejtek proliferációjának gátlása, amint alább említjük. Ezeket a vizsgálati eljárásokat a leírás szerinti példákban ismertetett módon hajthatjuk végre. Lásd még a következõ irodalmi helyeken ismertetett vizsgálati eljárásokat: Schultze és munkatársai (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:8200–8204. oldal; Denton és munkatársai (1998) Pediatr. transplant. 2:6–15. old.; Evans és munkatársai (2000) J. Immunol. 164:688–697. oldal; Noelle (1998) Agents Actions Suppl, 49:17–22. oldal; Lederman és munkatársai (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77–86. oldal; Coligan és munkatársai (1991) Current Protocols in Immunology 13:12. oldal; Kwekkeboom és munkatársai (1993) Immunology 79:439–444. oldal; és az US 5 674 492 és 5 847 082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Egy reprezentatív vizsgálati eljárás a találmány szerint azonosított CD40-antigén epitópokra specifikus antagonista anti-CD40 ellenanyagok detektálására a „kompetitív kötési vizsgálati eljárás”. A kompetitív kötési vizsgálati eljárások szerológia vizsgálati eljárások, amelyekben az ismeretlent azon képessége alapján detektáljuk, valamint határozzuk meg a mennyiségét, hogy gátolja egy jelzett ligandum kötõdését a specifikus ellenanyagához. Ezt kompetitív gátlási vizsgálati eljárásnak is nevezzük. Egy reprezentatív kompetitív kötési vizsgálati eljárásban jelzett CD40 polipeptidet csapunk ki ellenanyagjelöltekkel egy mintában, például a találmány szerinti monoklonális ellenanyagok egy vagy több epitópja elleni monoklonális ellenanyagokkal kombinálva. A jelentõséggel bíró epitóppal specifikusan reagálni képes anti-CD40 ellenanyagokat azonosíthatjuk a CD40 fehérje vagy a jelentõséggel bíró CD40 fehérje adott epitópját tartalmazó fehérje fragmense ellen termeltetett ellenanyagok sorozatának szkrínelésével. Például a humán CD40 esetében a jelentõséggel bíró epitópok közé tartoznak a 12B. ábrán bemutatott humán CD40 rövid izoformájának (lásd GenBank NP_690593 hozzáférési szám, 10. azonosító számú szekvencia) – amelyet a 12A. ábrán bemutatott szekvencia kódol (9. azonosító számú szekvencia; lásd még GenBank M_152854 hozzáférési szám) – vagy a humán CD40 hosszú izoformájának (lásd GenBank hozzáférési szám CAA43045 és NP_001241), amelyet a 12.D ábrán mutatunk be (12. azonosító számú szekvencia) – amelyet a 12.C ábrán bemutatott szekvencia kódol (11. azonosító számú szekvencia; lásd GenBank hozzáférési szám X60592 és NM_001250) – lineáris és/vagy nem lineáris aminosavoldalláncait tartalmazó epitópok. Más megoldásképpen korábban azonosított alkalmas antagonista antiCD40 ellenanyagokat alkalmazó kompetitív kötési vizsgálati eljárásokat alkalmazhatunk a korábban azonosított ellenanyagokkal összehasonlítható monoklonális ellenanyagok kiszelektálására. Az ilyen immunológiai vizsgálati eljárásokban alkalmazott ellenanyagok lehetnek jelzettek vagy jelöletlenek. A jelöletlen ellenanyagokat agglutinációban alkalmazhatjuk; a jelzett ellenanyagokat vizsgálati eljárások széles körében alkalmazhatjuk, amelyek jelölések szé-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 17

2

les körét alkalmazhatják. Egy anti-CD40 ellenanyag és jelentõséggel bíró epitóp közötti ellenanyag-antigén komplex kialakulásának detektálását elõsegíthetjük detektálható anyagnak az ellenanyaghoz való kötésével. Alkalmas detektálási módok közé tartozik jelölések alkalmazása, mint például radionuklidok, enzimek, koenzimek, fluoreszcens jelek, kemilumineszcens jelek, kromogének, enzimszubsztrátok vagy kofaktorok, enziminhibitorok, prosztetikus csoport komplexek, szabad gyökök, részecskék, festékek és hasonlók. Alkalmas enzimek példái közé tartozik a tormaperoxidáz, alkalikus foszfatáz, b¹galaktozidáz vagy acetil-kolin-észteráz; alkalmas prosztetikus csoportok példái közé tartozik sztreptavidin/biotin és avidin/biotin; alkalmas fluoreszcens anyagok példái közé tartozik az umbelliferon, fluoreszcein, fluoreszcein-izotiocianát, rodamin, dikloro-triazinilamin-fluoreszcein, danzil-klorid vagy fikoeritrin; lumineszcens anyag példája a luminol; biolumineszcens anyagok példái közé tartozik a luciferáz, luciferin és aequorin; és az alkalmas radioaktív anyagok példái közé tartozik a 125I, 131I, 35S vagy 3H. Ilyen jelzett reagenseket különféle jól ismert vizsgálati eljárásokban alkalmazhatunk, mint például radioaktív immunológiai vizsgálati eljárásokban, enzimes immunológiai vizsgálati eljárásokban, például ELISA-ban, fluoreszcens immunológiai vizsgálati eljárásokban, és hasonlókban. Lásd például az US 3 766 162; 3 791 932; 3 817 837 és 4 233 402 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. A korábban ismertetett antagonista anti-CD40 ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek bármelyike konjugálható a találmány szerinti eljárásokban történõ alkalmazását megelõzõen. Konjugált ellenanyagok elõállítására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen. Ily módon az anti-CD40 ellenanyagot megjelölhetjük közvetett vagy közvetlen jelölés módok alkalmazásával. A leírás szerinti értelemben a „közvetett jelölés” és „közvetett jelölési mód” kifejezések alatt azt értjük, hogy kelátképzõ ágenst kapcsolunk kovalensen ellenanyaghoz, és legalább egy radionuklid kapcsolódik a kelátképzõ ágenshez. Lásd például a Srivagtava and Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589–603. oldal irodalmi helyeken ismertetett kelátképzõ ágenseket és radionuklidokat. Alkalmas jelölések közé tartoznak fluorofórok, kromoforok, radioaktív atomok (különösen 32P és 125I), elektron-denz reagensek, enzimek, és specifikus kötési partnerekkel rendelkezõ ligandumok. Az enzimeket tipikusan az aktivitásuk alapján detektáljuk. Például a tormaperoxidázt általában azon képessége alapján detektáljuk, hogy átalakítja a 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidint (TMB) kék pigmentté, amely mennyiségileg meghatározható spectrofotométerrel. A „specifikus kötési partner” kifejezés alatt olyan fehérjét értünk, amely képes ligandummolekula megkötésére nagy specifitással, mint például egy antigén és az arra specifikus monoklonális ellenanyag esetében. Más specifikus kötési partnerek közé tartozik a biotin és avidin vagy sztreptavidin, IgG és protein¹A, és a szakterületen ismert számos receptor-ligandum pár. Nyilvánvaló, hogy a fenti

1

HU 007 240 T2

ismertetés nem tekintendõ a különbözõ jelöléseket osztályozónak, hiszen ugyanaz a jelölés számos különbözõ módon alkalmazható. Például a 125I alkalmazható radioaktív jelölésként vagy elektron-denz reagensként. A HRP alkalmazható enzimként vagy mAb antigénjeként. Ezenkívül a különbözõ jelölések kombinálhatók a kívánt hatás elérésére. Például mAb¹ok és avidin szintén igényelnek jeleket a találmány gyakorlatba vételénél: ily módon egy mAb¹ot megjelölhetünk biotinnal, és a jelenlétét detektálhatjuk 125I-vel jelzett avidinnel, vagy HRP-vel jelzett antibiotin mAb-bal. Más permutációk és lehetõségek nyilvánvalóak a szakember számára és ekvivalensnek tekintendõk a találmány szerint. Más megoldásképpen az anti-CD40 ellenanyagot megjelölhetjük „közvetlen jelölés” vagy „közvetlen jelölési mód” alkalmazásával, ahol radionuklid közvetlenül kovalensen kötve van ellenanyaghoz (tipikusan egy aminosav-oldalláncon keresztül). Elõnyös radionuklidokat ismertetnek Srivagtava és Mease (1991), mint fent. A közvetett jelölési mód különösen elõnyös. Lásd még például a WO 00/52031 és WO 00/52473 számú nemzetközi közzétételi iratokat, ahol kapcsolómolekulát alkalmaznak radioaktív jelölõ ellenanyagokhoz történõ kapcsolására; és az anti-CD40 ellenanyagok jelzett formáit az US 6 015 542 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetik. Ezenfelül egy ellenanyag (vagy fragmense) konjugálva lehet terápiás molekularészhez, mint például citotoxinhoz, terápiás ágenshez, vagy radioaktív fémionhoz vagy radioizotóphoz. Citotoxinok vagy citotoxikus ágensek közé tartozik bármilyen olyan ágens, amely károsítja a sejteket. Ezek példái közé tartozik a taxol, citochalazin¹B, gramicidin¹D, etidium-bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkrisztin, vinblasztin, kolhicin, doxorubicin, daunorubicin, dihidroxi-antracindion, mitoxantron, mithramicin, aktinomicin¹D, 1¹dehidrotesztoszteron, glukokortikoidok, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, and és puromicin, és ezek analógjai és homológjai. Terápiás ágensek nem korlátozó példái közé tartoznak antimetabolitok (például metotrexát, 6¹merkapto-purin, 6¹tioguanin, citarabine, 5¹fluoro-uracil-dekarbazin), alkiláló ágensek [például mechloretamine, thioepa klorambucil, melfalán, carmustine (BSNU) és lomustine (CCNU), ciklofoszfamid, busulfan, dibromomannitol, sztreptozotocin, mitomicin¹C, és cisz-diklór-diamin-platinum (II) (DDP) ciszplatin], antraciklinek [például daunorubicin (régebben daunomicin) és doxorubicin], antibiotikumok [például daktinomicin (régebben aktinomicin), bleomicin, mithramicin és antramicin (AMC)] és antimitotikus ágensek (például vinkrisztin és vinblasztin). Radioizotópok nem korlátozó példái közé tartozik az I–131, I–123, I–125, Y–90, Re–188, Re–186, At–211, Cu–67, Bi–212, Bi–213, Pd–109, Tc–99, In–111 és hasonlók. A találmány szerinti konjugátumokat egy adott biológiai válasz módosítására alkalmazhatjuk; a drog molekularészt nem tekinthetjük klasszikus kémiai terápiás ágensre korlátozottnak. Például a drog molekularész lehet olyan fehérje vagy polipeptid, amely kívánt biológiai aktivitással

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

rendelkezik. Ilyen fehérje példái közé tartoznak toxinok, mint például abrin, ricin¹A, pseudomonas exotoxin vagy diftéria toxin; fehérje, mint például tumornekrózisfaktor, interferon-alfa, interferon-béta, idegi növekedési faktor, vérlemezke-eredetû növekedési faktor, szöveti plazminogén aktivátor, vagy biológiai választ módosító anyagok, mint például limfokinok, interleukin–1 („IL–1”), interleukin–2 („IL–2”), interleukin–6 („IL–6”), granulocita-makrofág kolóniastimuláló faktor („GMCSF”), granulocita kolóniastimuláló faktor („G-CSF”), vagy más növekedési faktorok. Az ilyen terápiás molekularész ellenanyagokhoz történõ konjugálására szolgáló módszerek jól ismertek. Lásd például Amon és munkatársai (1985) „Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”, „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, szerk.: Reisfeld és munkatársai (kiad.: Alan R. Liss, Inc.), 243–256. oldal; szerk: Hellstrom és munkatársai (1987) „Antibodies for Drug Delivery”, „Controlled Drug Delivery”, szerk.: Robinson és munkatársai (2. kiadás, kiad.: Marcel Dekker, Inc.), 623–653. oldal; Thorpe (1985) „Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review”, „Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications”, szerk.: Pinchera és munkatársai 475–506. oldal (kiad.: Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); „Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy”, „Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy”, szerk.: Baldwin és munkatársai (kiad.: Academic Press, New York, 1985), 303–316. oldal; és Thorpe és munkatársai (1982) Immunol. Rev. 62:119–158. oldal. Más megoldásképpen ellenanyagot egy második ellenanyaghoz konjugálhatunk ellenanyag-heterokonjugátum kialakítására, amint az US 4 676 980 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban ismertetik. Ezenfelül kapcsolómolekulákat alkalmazhatunk a jelölõk és a találmány szerinti ellenanyagok között (lásd US 4 831 175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Az ellenanyagokat vagy azok antigénkötõ fragmenseit közvetlenül megjelölhetjük radioaktív jóddal, indiummal, ittriummal vagy más, a szakterületen ismert radioaktív részecskével (US 5 595 721 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). A kezelés kombinációs kezelés lehet konjugált és nem konjugált ellenanyagokkal egyidejûleg vagy egymás után beadva (WO 00/52031 és WO 00/52473 számú nemzetközi közzétételi iratok).

Antagonista anti-CD40 ellenanyagok variánsai Az antagonista anti-CD40 ellenanyag alkalmas biológiailag aktív variánsait alkalmazhatjuk a találmány szerinti eljárásokban. Az ilyen variánsok megtartják a szülõi antagonista anti-CD40 ellenanyag kívánt kötési 55 tulajdonságait. Ellenanyag-variánsok elõállítására szolgáló eljárások általánosan ismertek a szakterületen. Például egy antagonista anti-CD40 ellenanyag – például a találmány szerinti CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagok – aminosavszekvencia-va60 riánsait elõállíthatjuk a jelentõséggel bíró ellenanyagot 50

18

1

HU 007 240 T2

kódoló klónozott DNS-szekvencia mutációival. Mutagenezisre és nukleotidszekvencia-változtatásokra szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen [lásd például Walker és Gaastra (szerk.) (1983) „Techniques in Molecular Biology” (kiad.: MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. ¹USA 82:488–492. oldal; Kunkel és munkatársai (1987) Methods Enzymol. 154:367–382. oldal; Sambrook és munkatársai (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (kiad.: Cold Spring Harbor, New York); US 4 873 192 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és az azokban idézett hivatkozások]. A megfelelõ, a jelentõséggel bíró fehérje biológiailag aktivitását nem befolyásoló aminosavszubsztitúciókra vonatkozó iránymutatást találhatunk Dayhoff és munkatársai modelljében [1978, „Atlas of Protein Sequence and Structure” (kiad.: Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.]. A konzervatív szubsztitúciók elõnyösek lehetnek, mint például egy aminosavnak hasonló tulajdonságú másik aminosavval történõ kicserélése. Konzervatív szubsztitúciók nem korlátozó példái közé tartozik a Gly«Ala, Val«Ile«Leu, Asp«Glu, Lys«Arg, Asn«Gln és Phe«Trp«Tyr. A jelentõséggel bíró antagonista anti-CD40 ellenanyag variánsainak elõállításakor a módosításokat úgy hajtjuk végre, hogy a variánsok rendelkezzenek a kívánt aktivitással, azaz hasonló kötési affinitással és képesek legyenek specifikusan kötõdni humán sejtek felszínén expresszált humán CD40-antigénhez, és mentesek legyenek szignifikáns agonista aktivitástól, de antagonista aktivitást mutassanak, amikor kötõdnek a CD40¹et expresszáló sejteken található CD40-antigénhez. Nyilvánvaló, hogy a variáns polipeptidet kódoló DNS-ben végrehajtott bármilyen mutáció nem változtathatja meg a szekvencia olvasási fázisát és elõnyösen nem hoz létre olyan régiókat, amelyek másodlagos mRNS-szerkezeteket eredményezhetnek. Lásd az EP 75 444 számú európai szabadalmi iratot. Emellett egy antagonista anti-CD40 ellenanyag konstans régióját mutáltathatjuk úgy, hogy különféle módokon megváltoztassa az effektorfunkciót. Például lásd az US 6 737 056 B1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot és az US 2004/0132101 A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést, amelyek olyan Fc mutációkat ismertetnek, amelyek optimalizálják az ellenanyag kötõdését Fc¹receptorokhoz. Elõnyösen egy referenciaantagonista anti-CD40 ellenanyag variánsainak olyan az aminosavszekvenciája, amely legalább 70% vagy 75% szekvenciaazonosságú, elõnyösen legalább 80% vagy 85% szekvenciaazonosságú, elõnyösebben legalább 90%, 91%, 92%, 93%, 94% vagy 95% szekvenciaazonosságú a referenciaantagonista anti-CD40 ellenanyag-molekula, például a találmány szerinti CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag, vagy a referencia ellenanyag-molekula egy kisebb részletének aminosavszekvenciájával. Elõnyösebben a molekulák legalább 96%, 97%, 98% vagy 99% szekvenciaazonosságúak. A találmány szerint a szekvenciaazonosságot a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

2

Smith–Waterman homológia-keresési algoritmussal határozzuk meg, ’affine gap’ keresés alkalmazásával, 12¹es ’gap open penalty’ értékkel és 2¹es ’gap extension penalty’ értékkel és 62¹es ’BLOSUM matrix’ értékkel. A Smith–Waterman homológia-keresési algoritmust a Smith és Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482–489. oldal irodalmi hely ismerteti. Egy variáns például akár csak 1–15 aminosav-oldalláncban, akár csak 1–10 aminosav-oldalláncban, mint például 6–10, akár csak 5, csak 4, 3, 2, vagy akár csak 1 aminosavoldalláncban különbözhet a referenciaantagonista antiCD40 ellenanyagtól. Két aminosavszekvencia optimális egymás alá rendezése vonatkozásában a variáns aminosavszekvencia összefüggõ szegmense további aminosav-oldalláncokat vagy deletált aminosav-oldalláncokat tartalmazhat a referencia aminosavszekvenciához viszonyítva. A referencia aminosavszekvencia összehasonlítására alkalmazott összefüggõ szegmens legalább 20 összefüggõ aminosav-oldalláncot tartalmazhat, és 30, 40, 50 vagy több aminosav-oldallánc hosszúságú lehet. A szekvenciaazonosságot korrigálhatjuk a konzervatív oldalláncszubsztitúciókkal vagy résekkel kapcsolatosan (lásd a Smith–Waterman homológia-keresési algoritmust). A CD40 specifikus kötésére képes és az antagonista aktivitást megtartó polipeptid pontos kémiai szerkezete, különösen amikor rosszindulatú B¹sejteken található CD40-antigénhez kötõdik, számos tényezõtõl függ. Mivel ionizálható amino- és karboxilcsoportok vannak jelen a molekulán, egy adott polipeptid savas vagy bázisos sóként, vagy semleges formában lehet. Az összes olyan készítmény beletartozik az antagonista anti-CD40 ellenanyagok találmány szerinti definíciójába, amely megtartja a biológiai aktivitását amikor alkalmas környezeti körülmények közé kerül. Ezenfelül a polipeptid elsõdleges aminosavszekvenciáját javíthatjuk cukor-molekularészek alkalmazásával történõ származékoltatással (glikozilálással), vagy más kiegészítõ molekulákkal, mint például lipidekkel, foszfáttal, acetilcsoportokkal és hasonlókkal. Javíthatjuk szacharidokkal történõ konjugálással is. Az ilyen javítás bizonyos aspektusait a termelõ gazda poszttranszlációs rendszereivel hajtjuk végre; más módosításokat in vitro építhetünk be. Mindenesetre az ilyen módosítások az anti-CD40 ellenanyag találmány szerinti definíciójába tartoznak mindaddig, amíg az anti-CD40 ellenanyag antagonista tulajdonságai nem tûnnek el. Várható, hogy az ilyen módosítások minõségileg vagy mennyiségileg befolyásolják a polipeptid aktivitását a különbözõ vizsgálati eljárásokban, akár fokozva, akár csökkentve azt. Ezenfelül a lánc egyedi aminosav-oldalláncait módosíthatjuk oxidálással, redukálással vagy más származtatással, és a polipeptidet elhasíthatjuk az aktivitást megtartó fragmenseket nyerve. Az olyan változtatások, amelyek nem rontják le az antagonista aktivitást, nem távolítják el a polipeptidszekvenciát a találmány szerinti jelentõséggel bíró anti-CD40 ellenanyagok definíciójából. A szakirodalom jelentõs kitanítást ad polipeptidvariánsok elõállítására és alkalmazására. Az anti-

1

HU 007 240 T2

CD40 ellenanyag-variánsok elõállításakor a szakember könnyedén meghatározhatja, hogy a natív fehérje nukleotid- vagy aminosavszekvenciájának milyen módosításai eredményeznek olyan variánst, amely alkalmas a leírás szerinti eljárásokban alkalmazható gyógyászati készítmények terápiásan hatásos hatóanyagaként történõ alkalmazásra. Az antagonista anti-CD40 ellenanyagokat alkalmazó terápiás eljárások A leírásban feltárt eljárások antagonista antiCD40 ellenanyagok alkalmazására irányulnak olyan páciensek kezelésére, amelyek a CD40¹et expresszáló sejtek felszínén található CD40 jeltovábbítás stimulálásával közvetített betegségben szenvednek. A „CD40¹et expresszáló sejt” kifejezés alatt normál és rosszindulatú sejteket értünk, amelyek expresszálják a CD40-antigént. A CD40 sejtekben történõ expressziójának detektálására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és ezek nem korlátozó példái közé tartoznak PCR-módszerek, immunhisztokémia, áramlási citometria, Western-blot, ELISA, és hasonlók. A „rosszindulatú” B¹sejt kifejezés alatt bármilyen neoplasztikus B¹sejt értendõ, nem korlátozó példaként limfómákból származó B¹sejtek, beleértve alacsonyt, közepes és magas fokú B¹sejtlimfómákat, immunoblasztikus limfómákat, nem Hodgkin-limfómákat, Hodgkin-kórt, Epstein–Barr-vírus (EBV) által indukált limfómákat és AIDS-szel kapcsolatos limfómákat, valamint B¹sejtes akut limfoblasztikus leukémiákat, mielómákat, krónikus limfocitikus leukémiákat, akut mieloblasztikus leukémiákat és hasonlókat. A „kezelés” kifejezést a leírás szerint antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense páciensben történõ alkalmazásaként vagy annak történõ beadásaként, vagy antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense páciensbõl izolált szövetben vagy sejtvonalban történõ alkalmazásaként vagy annak történõ beadásaként definiáljuk, ahol a páciens betegségben szenved, vagy betegség tüneteit mutatja, vagy hajlamos a betegségre, ahol a cél a betegségnek, a betegség tüneteinek vagy a betegségre való hajlamnak a gyógyítása, orvoslása, enyhítése, könnyítése, megváltoztatása, orvoslása, jobbítása, javítása, vagy befolyásolása. A „kezelés” kifejezést alatt a leírás szerint értjük antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmazó gyógyászati készítmény páciensben történõ alkalmazását vagy annak történõ beadását, vagy antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy annak fragmensét tartalmazó gyógyászati készítmény páciensbõl izolált szövetben vagy sejtvonalban történõ alkalmazását vagy annak történõ beadását, ahol a páciens betegségben szenved, vagy betegség tüneteit mutatja, vagy hajlamos a betegségre, ahol a cél a betegségnek, a betegség tüneteinek vagy a betegségre való hajlamnak a gyógyítása, orvoslása, enyhítése, könnyítése, megváltoztatása, orvoslása, jobbítása, javítása, vagy befolyásolása. A „daganatellenes aktivitás” kifejezés alatt a rosszindulatú, CD40¹et expresszáló sejtek proliferációja vagy felhalmozódása sebességének a csökkentését

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 20

2

értjük, és ily módon egy meglévõ vagy a terápia alatt kialakuló daganat növekedési sebességének a csökkenését, és/vagy meglévõ (neoplasztikus) daganat vagy újonnan kialakult neoplasztikus sejtek elpusztítását, és ily módon a daganat általános méretének a csökkentését a terápia folyamán. A terápia legalább egy antiCD40 ellenanyaggal (vagy annak antigénkötõ fragmensével) olyan fiziológiás választ okoz, amely jótékony hatású a CD40¹et expresszáló sejteken található CD40 jeltovábbítás stimulálásával kapcsolatos beteg állapot kezelésével kapcsolatosan emberben. A leírásban feltárt eljárások alkalmazhatók nem Hodgkin-limfómák kezelésében, amelyek abnormális, kontrollálhatatlan B¹sejt-proliferációval vagy felhalmozódással kapcsolatosak. A leírás céljaira az ilyen limfómákra a ’Working Formulation’ osztályozás szerint hivatkozunk, azaz ezeket a B¹sejtes limfómákat alacsony fokozatúnak, közepes fokozatúnak és magas fokozatúnak kategorizáljuk [lásd „The Non-Hodgkin’s Limfóma Pathologic Classiflcation Project,” Cancer 49(1982):2112–2135. oldal]. Ily módon az alacsony fokozatú B¹sejtes limfómák közé tartoznak kis limfocitikus, follikuláris kis-hasított sejtes és follikuláris kevert kis-hasított és nagysejtes limfómák; a közepes fokozatú limfómák közé tartoznak follikuláris nagysejtes, diffúz kis-hasított sejtes, diffúz kevert kis- és nagysejtes és diffúz nagysejtes limfómák; és a magas fokozatú limfómák közé tartoznak a Burkitt-típusú és nem-Burkitt típusú nagysejtes immunoblasztikus, limfoblasztikus és kis nem hasított sejtes limfómák. Nyilvánvaló, hogy a leírásban feltárt eljárások hasznosak olyan B¹sejtes limfómák terápiás kezelésére, amelyek a ’Revised European and American Limfóma Classification’ (REAL) rendszer szerint vannak osztályozva. Az ilyen B¹sejtes limfómák nem korlátozó példái közé tartoznak prekurzor B¹sejtes neoplazmákként osztályozott limfómák, mint például B limfoblasztikus leukémia/limfóma; perifériás B¹sejtes neoplazmák, beleértve B¹sejtes krónikus limfocitikus leukémia, kis limfocitikus limfóma, limfoplazmacitoid limfóma/immunocitóma, köpenysejtes („mantle cell”) limfóma (MCL), follikulus center limfóma (follikuláris) (beleértve diffúz kissejtes, diffúz kevert kis- és nagysejtes és diffúz nagysejtes limfómákat), marginális zóna B¹sejtes limfóma (beleértve extranodális, nodális és szplenikus típusokat), hajas sejtes („hairy cell”) leukémia, plazmacitóma/mieloma, primer mediasztinális (csecsemõmirigy) altípusba tartozó diffúz nagysejtes B¹sejtes limfóma, Burkitt-limfóma, és Burkitt-szerû magas fokozatú B¹sejtes limfóma; akut leukémiák; akut limfocitikus leukémia; mieloblasztikus leukémiák; akut mielocitikus leukémiák; promielocitikus leukémia; mielomonocitikus leukémia; monocitikus leukémia; eritroleukémia; granulocitikus leukémia (krónikus mielocitikus leukémia); krónikus limfocitikus leukémia; polycythemia vera; többszörös mieloma; Waldenstrom-féle makroglobulinémia; nehéz lánc betegség; és osztályozhatatlan alacsony fokozatú vagy magas fokozatú B¹sejtes limfómák. Nyilvánvaló, hogy a leírásban feltárt eljárások hasznosak lehetnek a terápia alatt keletkezõ további daga-

1

HU 007 240 T2

natos kinövések megelõzésére. A leírásban feltárt eljárások különösen alkalmasak alacsony fokozatú B¹sejtes limfómákban szenvedõ alanyok, különösen olyan alanyok kezelésére, amelyek a szokásos kemoterápia után visszaesésben szenvednek. Az alacsony fokozatú B¹sejtes limfómák indolensebbek mint a közepes vagy magas fokozatú B¹sejtes limfómák, és azokat visszatérõ/kiújuló lefolyás jellemzi. Ily módon ezen limfómák kezelése javul a leírásban feltárt eljárások alkalmazásával, mivel az epizódok kiújulása csökken a számában és súlyosságában. A találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagok alkalmazhatók gyulladásos betegségek és az immunrendszer deficienciái és rendellenességei esetében is, amelyek nem korlátozó példái közé tartozik szisztémás lupus erythematosus, psoriasis, scleroderma, CREST szindróma, gyulladásos myositis, Sjogrenszindróma, kevert kötõszöveti típusú betegség, reumatoid arthritis, sclerosis multiplex, gyulladásos bélbetegség, akut respiratorikus distressz szindróma, tüdõgyulladás, idiopátiás pulmonáris fibrózis, oszteoporózis, késleltetett típusú hiperszenzitivitás, asztma, primer epecirrózis és idiopátiás thrombocytopenic purpura. A leírásban feltárt eljárások értelmében legalább egy, találmány szerint definiált antagonista antiCD40 ellenanyagot (vagy annak antigénkötõ fragmensét) alkalmazzuk pozitív terápiás válasz elõsegítésére rosszindulatú humán B¹sejttel kapcsolatosan. A „pozitív terápiás válasz” kifejezés alatt rákkezeléssel kapcsolatban azt értjük, hogy a betegség javul a találmány szerinti ellenanyagok vagy azok fragmensei daganatellenes aktivitásával kapcsolatosan és/vagy a betegséghez kapcsolódó tünetek javulnak. Azaz az antiproliferatív hatás, további daganatos kinövések megelõzése, a daganat méretének csökkenése, a rákos sejtek számának csökkenése, és/vagy a CD40¹et expresszáló sejtek stimulálása által közvetített egy vagy több tünet csökkenése figyelhetõ meg. Ily módon például a betegség javulását a teljes válasz jellemezheti. A „teljes válasz” kifejezés alatt azt értjük, hogy nincs jele klinikailag detektálható betegségnek és a korábbi abnormális radiográfiás vizsgálatok, csontvelõ- és gerincvelõi folyadék (CSF) normalizálódnak. Az ilyen válasznak tartósnak kell lennie legalább egy hónapig a találmány szerinti eljárásokban feltárt kezelést követõen. Más megoldásképpen a betegség javulását részleges válasznak kategorizálhatjuk. A „részleges válasz” kifejezés alatt azt értjük, hogy az összes mérhetõ daganatterhelés (azaz az alanyban jelen lévõ daganatsejtek száma) legalább körülbelül 50%-kal csökken új sérülések megjelenése nélkül és legalább egy hónapig megmarad. Az ilyen válasz csak mérhetõ daganatok esetében alkalmazható. A daganat-választ vizsgálhatjuk a daganat morfológiájának változásával (azaz az általános daganatterhelés, daganatméret, és hasonlók) olyan szkrínelõmódszerek alkalmazásával, mint például mágneses rezonanciás képalkotás (MRI), röntgenradiográfiás képalkotás, számítógépes tomográfia (CT), biolumineszcens képalkotás, például luciferáz képalkotás, csontletapo-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

gató képalkotás, és daganatbiopsziás mintavétel, beleértve a csontvelõ-aspirációt (BMA). Ezen pozitív terápiás válaszok mellett a az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy annak antigénkötõ fragmensét alkalmazó terápiát kapó alany tapasztalhatja a betegséggel kapcsolatos tünetek javulásának jótékony hatásait. Ily módon a B¹sejtes daganatok esetében az alany tapasztalhatja az úgynevezett B¹tünetek, azaz éjjeli izzadás, láz, tömegvesztés és/vagy csalánkiütés csökkenését. A „terápiásan hatásos dózis vagy mennyiség” vagy „hatásos mennyiség” kifejezés alatt az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense olyan mennyiségét értjük, amely amikor beadják, pozitív terápiás választ eredményez a CD40¹et expresszáló sejtek stimulálását magában foglaló betegségben szenvedõ páciensben. Bizonyos megvalósítási módok szerint az anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisa a körülbelül 0,01 mg/kg és körülbelül 40 mg/kg, körülbelül 0,01 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 0,1 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 1 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 25 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg, körülbelül 5 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg vagy körülbelül 7 mg/kg és körülbelül 12 mg/kg közötti tartományba esik. Nyilvánvaló, hogy a kezelési eljárás magában foglalhatja a terápiásan hatásos dózis egyszeri beadását vagy az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos dózisának többszöri beadását. A leírás egy további megvalósítási módja antagonista anti-CD40 ellenanyagok alkalmazása fehérjeszintek szövetbeli diagnosztikai monitorozására klinikai tesztelési eljárás részeként, például egy adott kezelési rend hatásosságának meghatározására. A detektálást elõsegíthetjük az ellenanyagnak detektálható anyaghoz való kapcsolásával. Detektálható anyagok példái közé tartoznak különféle enzimek, prosztetikus csoportok, fluoreszcens anyagok, lumineszcens anyagok, biolumineszcens anyagok és radioaktív anyagok. Alkalmas enzimek példái közé tartozik a tormaperoxidáz, alkalikus foszfatáz, b¹galaktozidáz vagy acetil-kolin-észteráz; alkalmas prosztetikus csoportok példái közé tartozik sztreptavidin/biotin és avidin/biotin; alkalmas fluoreszcens anyagok példái közé tartozik az umbelliferon, fluoreszcein, fluoreszcein-izotiocianát, rodamin, dikloro-triazinilamin-fluoreszcein, danzil-klorid vagy fikoeritrin; lumineszcens anyag egy példája a luminol; biolumineszcens anyagok példái közé tartozik a luciferáz, luciferin és aequorin; és alkalmas radioaktív anyagok példái közé tartozik a 125I, 131I, 35S vagy 3H. A találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagokat továbbá alkalmazhatjuk olyan reagensek, például jelzett ellenanyagok biztosítására, amelyek például CD40¹et expresszáló sejtek azonosítására alkalmazhatók. Ez nagyon hasznos lehet egy ismeretlen minta sejttípusának meghatározására. Monoklonális ellenanyagok paneljeit alkalmazhatjuk szövetek azonosítására fajés/vagy szervtípus szerint. Hasonló módon ezen antiCD40 ellenanyagok alkalmazhatók szövettenyészet

1

HU 007 240 T2

sejtjeinek szkrínelésére kontaminációra (azaz CD40¹et expresszáló sejtek és CD40¹et nem expresszáló sejtek keverékének jelenlétére való szkrínelésre egy tenyészetben). Az antagonista anti-CD40 ellenanyagok alkalmazhatók kombinációban ismert kemoterápiás szerekkel és citokinekkel olyan beteg állapotok kezelésére, amelyek stimulált CD40¹et expresszáló sejteket tartalmaznak. Például a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok alkalmazhatók citokinekkel, mint például interleukin–2-vel kombinációban. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti anti-CD40 ellenanyagok alkalmazhatók kombinációban rituximabbal (IDEC–C2B8; Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California). Ily módon a találmány szerinti antagonista antiCD40 ellenanyagokat vagy azok antigénkötõ fragmenseit kombinációban adjuk be legalább egy másik rákterápiával, melyek nem korlátozó példái közé tartozik mûtét vagy mûtéti eljárások (például lépeltávolítás, májeltávolítás, nyirokcsomó-eltávolítás, leukoforézis, csontvelõ-transzplantáció, és hasonlók); sugárterápia; kemoterápia, adott esetben kombinálva autológ csontvelõ-transzplantációval, ahol az alkalmas kemoterápiás ágensek nem korlátozó példái közé tartozik fludarabin vagy fludarabin-foszfát, klorambucil, vinkrisztin, pentosztatin, 2¹klór-dezoxiadenozin (cladribin), ciklofoszfamid, doxorubicin, prednizon, és ezek kombinációi, például antraciklint tartalmazó beadási rendek, mint például CAP (ciklofoszfamid, doxorubicin plusz prednizon), CHOP (ciklofoszfamid, vinkrisztin, prednizon plusz doxorubicin), VAD (vinkritszin, doxorubicin, plusz dexametazon), MP (melfalan plusz prednizon), és egyéb kemoterápiában alkalmazott citotoxikus és/vagy terápiás ágensek, mint például mitoxantron, daunorubicin, idarubicin, aszparagináz és antimetabolitok, melyek nem korlátozó példái közé tartozik citarabin, metotrexát, 5¹fluoro-uracil-dekarbazin, 6¹tioguanin, 6¹merkapto-purin és nelarabin; egyéb rákellenes monoklonális ellenanyag terápia [például alemtuzumab (Campath®)] vagy egyéb anti-CD52 ellenanyag, amely a CD52 sejtfelszíni glikoproteint célozza rosszindulatú B¹sejteken; rituximab (Rituxan®), a teljesen humán ellenanyag HuMax-CD20, R–1594, IMMU–106, TRU–015, AME–133, tositumomab/I–131 tositumomab (Bexxar ® ), ibritumomab tiuxetan (Zevalin ® ), vagy egyéb terápiás anti-CD20 ellenanyag, amely a CD20 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken; antiCD19 ellenanyag (például MT103, amely egy bispecifikus ellenanyag); anti-CD22 ellenanyag (például a humanizált monoklonális ellenanyag epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) vagy egyéb rákellenes ellenanyag, amely a humán vaszkuláris növekedési faktort célozza; anti-CD22 ellenanyag, amely a CD22 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken (például a monoklonális ellenanyag BL–22, ami egy alfa-CD22 toxin); a¹M-CSF ellenanyag, ami a makrofág kolóniastimuláló faktort célozza; a nukleáris faktor-kappaB (RANK) és annak ligandumjai (RANKL) – amelyek többszörös mielómában expresszálódnak – receptor aktivátorát

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 22

2

célzó ellenanyagok; anti-CD23 ellenanyag, amely a CD23 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken (például IDEC–152); anti-CD80 ellenanyag, amely a CD80 antigént célozza (például IDEC–114); antiCD38 ellenanyag, amely a CD38 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken; a fõ hisztokompatibilitási komplex II¹es osztályába tartozó, rosszindulatú B¹sejteken expresszálódó receptorokat célzó ellenanyagok (anti-MHC ellenanyagok); egyéb anti-CD40 ellenanyagok (például SGN–40), amelyek a CD40¹et célozzák rosszindulatú B¹sejteken; és tumornekrózis-faktorral rokon apoptózisindukáló ligandum receptor-1¹et (TRAIL–R1) célzó (például az agonista humán monoklonális ellenanyag HGS-ETR1) és TRAIL–R2¹t – amely számos szilárd daganaton és hematopoietikus eredetû daganatokon expresszálódik – célzó ellenanyagok; kismolekula-alapú rákterápia, amelynek nem korlátozó példái közé tartoznak mikrotubulus és/vagy topoizomerázinhibitorok (például a mitotikus inhibitor dolastatin és dolastatinanalógok; a tubulinkötõ ágens T900607; XL119; és a topoizomerázinhibitor aminocamptothecin), SDX–105 (bendamustine hidroklorid), ixabepilone (ami egy epothilone analóg, más néven BMS–247550), protein-kináz¹C inhibitorok, például midostaurin [(PKC–412, CGP 41251, N¹benzoylstaurosporine), pixantrone, eloxatin (ami egy antineoplasztikus ágens), ganite (gallium-nitrát), Thalomid® (thalidomide), thalidomide immunmoduláns származékai [például revlimid (korábban revimid)], Affinitak™ (protein-kinázC-alfa antiszensz inhibitor), SDX–101 (R¹etodolac, ami rosszindulatú limfociták apoptózisát indukálja), második generációs purinnukleozidanalógok, mint például clofarabine, a protein Bcl–2 ráksejtek általi termelésének inhibitora (például az oblimersen és Genasense® antiszensz ágensek), proteaszómainhibitorok [például Velcade™ (bortezomib)], kismolekulás kináz-inhibitorok (például CHIR–258), kismolekulás VEGF-inhibitorok (például ZD–6474), a 90¹es hõsokkfehérje (HSP) kismolekulás inhibitorai (például 17¹AAG), hiszton-deacetilázok kismolekulás inhibitorai (például hibrid/poláris citodifferenciációs HPC), olyan ágensek, mint például szuberanilohidroxámsav (SAHA), és FR¹901228} és apoptotikus ágensek, mint például Trisenox® (arzén-trioxid) és Xcytrin® (motexafin-gadolinium); vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápiák, melyek nem korlátozó példái közé tartoznak vakcinás megközelítések (például Id¹KLH, onkofág, vitalethine), személyre szabott immunterápia vagy aktív idiotípus immunterápia (például MyVax® Personalized Immunotherapy, korábbi nevén GTOP–99), Promune® [CpG 7909, a tollszerû receptor¹9 (TLR9) szintetikus agonistája], interferon-alfa-terápia, interleukin–2- (IL–2) terápia, IL–12-terápia, IL–15-terápia és IL–21-terápia; szteroid terápia; vagy egyéb rákterápia; ahol a további rákterápiát az antagonista anti-CD40 ellenanyag terápiát megelõzõen, az alatt vagy azt követõen alkalmazzuk. Ily módon ahol a kombinált terápiák antagonista antiCD40 ellenanyag vagy annak antigénkötõ fragmense és egy másik terápiás ágens, mint például kemoterápia, sugárterápia vagy egyéb rákellenes terápia, kis-

1

HU 007 240 T2

molekulás terápia vagy vakcina¹/immunterápia alapú rákterápia kombinált beadását tartalmazza, a leírásban feltárt eljárások magukban foglalnak együttes beadást, különálló kiszerelések vagy egyetlen gyógyászati kiszerelés alkalmazásával, vagy egymás utáni beadást bármilyen sorrendben. Ahol a leírásban feltárt eljárások kombinált terápiás beadási rendeket tartalmaznak, ezeket a terápiákat egyidejûleg alkalmazhatjuk, azaz az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy annak antigénkötõ fragmensét egyszerre vagy ugyanazon idõben adjuk be az egyéb rákterápiával (azaz a terápiák egyszerre történnek, de az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy annak antigénkötõ fragmensét nem pontosan ugyanabban az idõben adjuk be a másik rákterápiával). Más megoldásképpen a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy annak antigénkötõ fragmensét a másik rákterápia elõtt vagy azt követõen alkalmazzuk. A különbözõ rákterápiák egymást követõ beadását attól függetlenül hajthatjuk végre, hogy a kezelt alany reagál¹e az elsõ terápiára, hogy csökkentse a visszatérés vagy kiújulás lehetõségét. Ahol a kombinált terápiák antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy annak antigénkötõ fragmense és citotoxikus ágens kombinált beadását tartalmazza, elõnyösen az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy annak antigénkötõ fragmensét a citotoxikus ágens beadását megelõzõen adjuk be. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagokat vagy antigénkötõ fragmenseiket kemoterápiával kombinálva adjuk be, és adott esetben autológ csontvelõ-transzplantációval kombinálva, ahol az ellenanyagot és a kemoterápiás ágens(eke)t egymás után alkalmazhatjuk, bármilyen sorrendben, vagy egyidejûleg (azaz egyszerre vagy ugyanabban az idõben). Ilyen kemoterápiás ágensek nem korlátozó példái közé tartozik fludarabin vagy fludarabin-foszfát, klorambucil, vinkrisztin, pentosztatin, 2¹klór-dezoxiadenozin (cladribin), ciklofoszfamid, doxorubicin, prednizon, és ezek kombinációi, például antraciklint tartalmazó beadási rendek, mint például CAP (ciklofoszfamid, doxorubicin plusz prednizon), CHOP (ciklofoszfamid, vinkrisztin, prednizon plusz doxorubicin), VAD (vinkritszin, doxorubicin, plusz dexametazon), MP (melfalan plusz prednizon), és egyéb kemoterápiában alkalmazott citotoxikus és/vagy terápiás ágensek, mint például mitoxantron, daunorubicin, idarubicin, aszparagináz és antimetabolitok, melyek nem korlátozó példái közé tartozik citarabin, metotrexát, 5¹fluoro-uracil-dekarbazin, 6¹tioguanin, 6¹merkapto-purin és nelarabine. Bizonyos megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a kemoterápiás ágenssel történõ kezelést megelõzõen adjuk be. Alternatív megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot a kemoterápiás ágenssel történõ kezelés után adjuk be. Még más megvalósítási módok szerint a kemoterápiás ágenst egyidejûleg adjuk be az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 23

2

Ily módon például bizonyos megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét fludarabinnal vagy fludarabin-foszfáttal kombinálva adjuk be. Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista antiCD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a fludarabin vagy fludarabin-foszfát beadását megelõzõen adjuk be. Alternatív megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a fludarabinnal vagy fludarabin-foszfáttal történõ kezelés után adjuk be. Még másik megvalósítási módok szerint a fludarabint vagy fludarabin-foszfátot egyidejûleg adjuk be az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. A találmány más megvalósítási módjai szerint klorambucilt, ami egy alkilálószer, adunk be kombinációban találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyaggal, például CHIR 12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével együtt. Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a klorambucil beadását megelõzõen adjuk be. Alternatív megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a klorambucillal történõ kezelés után adjuk be. Még más megvalósítási módok szerint a klorambucilt egyidejûleg adjuk be az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. A találmány más megvalósítási módjai szerint antraciklint tartalmazó beadási rendet, mint például CAP (ciklofoszfamid, doxorubicin plusz prednizon) és CHOP (ciklofoszfamid, vinkrisztin, prednizon plusz doxorubicin) kombinálhatunk találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyag, például CHIR 12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense beadásával. Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét az antraciklint tartalmazó beadási rend beadását megelõzõen adjuk be. Más megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét az antraciklint tartalmazó beadási renddel történõ kezelés után adjuk be. Még más megvalósítási módok szerint az antraciklint tartalmazó beadási rendet egyidejûleg alkalmazzuk az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. Alternatív megvalósítási módok szerint a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét alemtuzumabbal (Campath®; terjeszti a Berlex Laboratories, Richmond, California) kombinálva adjuk be. Az alemtuzumab egy rekombináns humanizált monoklonális ellenanyag (Campath¹1H), amely a rosszindulatú B¹sejteken expresszált CD52 antigént célozza. Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét az alemtuzumab beadását megelõzõen adjuk be. Más megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy

1

HU 007 240 T2

antigénkötõ fragmensét az alemtuzumabbal történõ kezelés után adjuk be. Még más megvalósítási módok szerint az alemtuzumabot egyidejûleg adjuk be az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. Alternatív megvalósítási módok szerint a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét olyan terápiás antiCD20 ellenanyaggal kombinálva adjuk be, amely a CD20 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken, például a rituximab (Rituxan®), a teljesen humán ellenanyag HuMax-CD20, R–1594, IMMU–106, TRU–015, AME–133, tositumomab/I–131 tositumomab (Bexxar®) vagy ibritumomab tiuxetan (Zevalin®). Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét az anti-CD20 ellenanyag beadását megelõzõen adjuk be. Más megvalósítási módok szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét az anti-CD20 ellenanyaggal történõ kezelés után adjuk be. Még más megvalósítási módok szerint az anti-CD20 ellenanyagot egyidejûleg adjuk be az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. Alternatív megvalósítási módok szerint a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét kismolekulán alapuló rákterápiával kombinálva adjuk be, melynek nem korlátozó példái közé tartoznak a mikrotubulus és/vagy topoizomerázinhibitorok (például a dolastatin és dolastatinanalóg mitotikus inhibitorok; a tubulinkötõ ágens T900607; XL119; és a topoizomerázinhibitor aminocamptothecin), SDX–105 (bendamustine hidroklorid), ixabepilone (ami egy epothilone analóg, más néven BMS–247550), protein-kinase¹C inhibitorok, például midostaurin {(PKC–412, CGP 41251, N¹benzoylstaurosporine), pixantrone, eloxatin (ami egy antineoplasztikus ágens), ganite (gallium-nitrát), Thalomid® (thalidomide), thalidomide immunmoduláns származékai [például revlimid (korábban revimid)], Affinitak™ (protein-kináz-C-alfa antiszensz inhibitor), SDX–101 (R¹etodolac, ami rosszindulatú limfociták apoptózisát indukálja), második generációs purinnukleozidanalógok, mint például clofarabine, a protein Bcl–2 ráksejtek általi termelésének inhibitora (például az oblimersen és Genasense® antiszensz ágensek), proteaszómainhibitorok [például Velcade™ (bortezomib)], kismolekulás kinázinhibitorok (például CHIR–258), kismolekulás VEGF-inhibitorok (például ZD–6474), a 90¹es hõsokkfehérje (HSP) kismolekulás inhibitorai (például 17¹AAG), hiszton-deacetilázok kismolekulás inhibitorai (például hibrid/poláris citodifferenciációs HPC), olyan ágensek, mint például szuberanilohidroxámsav (SAHA), és FR–901228} és apoptotikus ágensek, mint például Trisenox® (arzén-trioxid) és Xcytrin® (motexafin-gadolinium); Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a kismolekulán alapuló rákterápia alkalmazását megelõzõen adjuk be. Más megvalósítási módok

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 24

2

szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a kismolekulán alapuló rákterápiával történõ kezelés után adjuk be. Még másik megvalósítási módok szerint a kismolekulán alapuló rákterápiát adjuk be az antagonista anti-CD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. Még másik megvalósítási módok szerint a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápiákkal kombinálva adhatjuk be, melyek nem korlátozó példái közé tartoznak vakcinás megközelítések (például Id¹KLH, onkofág, vitalethine), személyre szabott immunterápia vagy aktív idiotípus immunterápia (például MyVax® Personalized Immunotherapy, korábbi nevén GTOP–99), Promune® [CpG 7909, a toll-szerû receptor¹9 (TLR9) szintetikus agonistája], interferon-alfa-terápia, interleukin–2- (IL–2) terápia, IL–12-terápia, IL–15-terápia és IL–21-terápia; vagy szteroid terápia. Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápia alkalmazását megelõzõen adjuk be. Más megvalósítási módok szerint az antagonista antiCD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápiával történõ kezelés után adjuk be. Még másik megvalósítási módok szerint a vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápiát egyidejûleg alkalmazzuk az antagonista antiCD40 ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével. Egy ilyen megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét IL–2-vel kombinálva adhatjuk be. Az IL–2¹t – amely ismert módon felszaporítja a természetes ölõsejt (NK) effektorsejteket a kezelt páciensekben – egyidejûleg, vagy a találmány szerinti antagonista antiCD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét megelõzõen adhatjuk be. Az NK effektorsejtek ezen felszaporított száma a beadott antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense fokozott ADCC aktivitásához vezethet. Más megvalósítási módok szerint az IL–21 immunterápiás ágensként szolgálhat az NK¹sejt-aktivitás stimulálására, amikor kombinálva van beadva találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyaggal, például CHIR 12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyaggal vagy antigénkötõ fragmensével együtt. Ezenfelül kombinációs terápia két vagy több terápiás ágenssel és találmány szerinti antagonista antiCD40 ellenanyaggal szintén alkalmazható stimulált CD40¹et expresszáló sejteket tartalmazó beteg állapotok, például B¹sejtekkel kapcsolatos rákok és autoimmun és/vagy gyulladásos rendellenességek kezelésére. Korlátozás nélkül a példák közé tartozik tripla kombinációs terápia, ahol két kemoterápiás ágenst adunk be kombinálva találmány szerinti antagonista antiCD40 ellenanyaggal, és ahol a kemoterápiás ágenst és egy másik rákellenes monoklonális ellenanyagot (például alemtuzumabot, rituximabot vagy anti-CD23 ellen-

1

HU 007 240 T2

anyagot) adunk be kombinációban találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyaggal. Ilyen kombinációk nem korlátozó példái közé tartozik fludarabin, ciklofoszfamid és az antagonista anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 vagy antigénkötõ fragmense kombinációi; és fludarabin, egy antiCD20 ellenanyag, például rituximab (Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California), és a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense kombinációi. Gyógyászati kiszerelések és beadási módozatok A találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagokat olyan koncentrációban adjuk be, amely terápiásan hatásos CD40¹et expresszáló sejtek által közvetített betegségek, mint például SLE, PBC, ITP, sclerosis multiplex, psoriasis, Crohn-betegség, graft kilökõdés és B¹sejtes limfóma kezelésére vagy megelõzésére. Ezen cél elérésére az ellenanyagokat a szakterületen ismert különféle elfogadható excipiensekkel szerelhetjük ki. Tipikusan az ellenanyagokat injekcióval adjuk be, intravénásan vagy intraperitoneálisan. Az ilyen beadás végrehajtására szolgáló eljárások ismertek az átlagos szakember számára. Az is lehetséges, hogy olyan készítményeket állítsunk elõ, amelyek topikálisan vagy orálisan adhatók be, vagy amelyek képesek átjutni nyálkahártyamembránokon. Az intravénás beadás elõnyösen infúzióval történik körülbelül 1 óra és körülbelül 10 óra közötti, elõnyösebben körülbelül 1 óra és körülbelül 8 óra, még elõnyösebben körülbelül 2 óra és körülbelül 7 óra között, még elõnyösebben körülbelül 4 óra és körülbelül 6 óra közötti idõszakon keresztül, a beadott anti-CD40 ellenanyagtól függõen. A gyógyászati készítmény kezdeti infúzióját körülbelül 4 és körülbelül 6 óra közötti idõszakon át adhatjuk be, és a késõbbi infúziókat gyorsabban juttathatjuk be. A késõbbi infúziókat körülbelül 1 óra és körülbelül 6 óra közötti idõszakon keresztül adhatjuk be, beleértve például körülbelül 1 óra és körülbelül 4 óra, körülbelül 1 óra és körülbelül 3 óra és körülbelül 1 óra és 2 óra között. A találmány szerinti gyógyászati készítményt úgy szereljük ki, hogy kompatibilis legyen a szándékolt beadás útjával. Lehetséges beadási utak példái közé tartozik a parenterális [például intravénás (IV), intramuszkuláris (IM), intradermális, szubkután (SC), vagy infúzió], orális és pulmonáris (például inhaláció), nazális, transzdermális (topikális), transzmukózális és rektális beadás. Parenterális, intradermális vagy szubkután alkalmazásra használt oldatok és szuszpenziók az alábbi komponenseket tartalmazhatják: steril oldószer, mint például injektálásra alkalmas víz, sóoldat, rögzített olajok, polietilénglikolok, glicerin, propilénglikol vagy más szintetikus oldószerek; baktériumellenes szerek, mint például benzil-alkohol vagy metil-parabének; antioxidánsok, mint például aszkorbinsav vagy nátrium-biszulfit; komplexképzõ szerek, mint például etilén-diamin-tetraecetsav; pufferek, mint például acetátok, citrátok vagy foszfátok, és tonitást módosító szerek, mint

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 25

2

például nátrium-klorid vagy dextróz. A pH¹t savakkal vagy bázisokkal, mint például sósavval vagy nátriumhidroxiddal állíthatjuk be. A parenterális készítményt ampullákba, eldobható fecskendõkbe vagy üvegbõl vagy mûanyagból készült többdózisos fiolákba zárhatjuk be. Az anti-CD40 ellenanyagokat tipikusan szokásos módszerekkel biztosítjuk gyógyászatilag elfogadható pufferben, például steril sóoldatban, steril pufferelt vízben, propilénglikolban, az elõzõek keverékeiben stb. Parenterálisan beadható ágensek elõállítására szolgáló eljárásokat ismertetnek a „Remington’s Pharmaceutical Sciences (18. kiadás, kiad.: Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) irodalmi helyen. Lásd még például a WO 98/56418 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely stabilizált ellenanyag gyógyászati kiszereléseket ismertet, amelyek alkalmasak a leírásban feltárt eljárásokban történõ alkalmazásra. A beadandó legalább egy anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense mennyisége könnyedén meghatározható a szakember számára szükségtelen kísérletezés nélkül. A beadás módját és a legalább egy antagonista anti-CD40 ellenanyag (vagy fragmense) mennyiségét befolyásoló tényezõk nem korlátozó példái közé tartozik a betegség súlyossága, a betegség története, és a terápián átesõ személy kora, magassága, tömege, egészségi és fizikai állapota. Hasonlóképpen a beadandó antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense mennyisége függ a beadás módjától, és attól, hogy az alany a daganatellenes ágens egyszeri vagy több dózisát kapja¹e. Általában az anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense magasabb dózisa elõnyös a terápián átesõ személy tömegének növekedésével. A beadandó anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense dózisa a körülbelül 0,003 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg közötti tartományba, elõnyösen a 0,01 mg/kg és körülbelül 40 mg/kg közötti tartományba esik. Ily módon például a dózis lehet 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg vagy 50 mg/kg. A leírás egy másik megvalósítási módja szerint az eljárás antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense több dózisának beadását foglalja magában. Az eljárás antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy fragmensét tartalmazó gyógyászati készítmény 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 vagy több terápiásan hatásos dózisának beadását foglalhatja magában. Az anti-CD40 ellenanyagot vagy fragmensét tartalmazó gyógyászati készítmények több dózisa beadásának gyakoriság és idõtartama könnyedén meghatározható a szakember számára szükségtelen kísérletezés nélkül. Ezenkívül alany kezelése ellenanyag terápiásan hatásos mennyiségével egyetlen kezelést foglalhat magában, vagy elõnyösen kezelések sorozatát foglalhatja magában. Egy elõnyös példa szerint alanyt körülbelül 0,1 és 20 mg/testtömeg¹kg között változó ellenanyaggal kezelünk, hetente egyszer körülbelül 1–10 héten keresztül, elõnyösen 2–8 héten keresztül,

1

HU 007 240 T2

elõnyösebben körülbelül 3–7 héten keresztül és még elõnyösebben körülbelül 4, 5 vagy 6 héten keresztül. A kezelés évente történhet a visszaesés megakadályozására vagy a visszaesés jelére. Az is nyilvánvaló, hogy az ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense kezelésre alkalmazott hatásos dózisa növekedhet vagy csökkenhet egy adott kezelés folyamán. A dózis változása nyilvánvaló lehet a találmány szerinti diagnosztikai vizsgálati eljárások eredményeinek eredményébõl. Ily módon egy megvalósítási mód szerint az adagolási rend magában foglalja legalább egy anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisának egy elsõ beadását a kezelési idõszak 1., 7., 14. és 21. napján. Egy másik megvalósítási mód szerint az adagolási rend magában foglalja legalább egy anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisának egy elsõ beadását a kezelési idõszak egy hetének az 1., 2., 3., 4., 5., 6. és 7. napján. További megvalósítási módok szerint az adagolási rend magában foglalja legalább egy anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisának egy elsõ beadását a kezelési idõszak egy hetének az 1., 3., 5. és 7. napján; egy adagolási rend magában foglalja legalább egy anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisának egy elsõ beadását a kezelési idõszak egy hetének az 1. és 3. napján; egy elõnyös adagolási rend magában foglalja legalább egy anti-CD40 ellenanyag vagy fragmense terápiásan hatásos dózisának egy elsõ beadását a kezelési idõszak egy hetének az 1. napján. A kezelési idõszak 1 hét, 2 hét, 3 hét, 1 hónap, 3 hónap, 6 hónap vagy egy év lehet. A kezelési idõszakokat egy nap, egy hét, egy hónap, 3 hónap, 6 hónap vagy egy év választhatja el egymástól. Bizonyos megvalósítási módok szerint az agonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos dózisa a körülbelül 0,003 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg, körülbelül 0,01 mg/kg és körülbelül 40 mg/kg, körülbelül 0,01 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 0,1 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 0,5 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 1 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 30 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 25 mg/kg, körülbelül 3 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg, körülbelül 5 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg vagy körülbelül 7 mg/kg és körülbelül 12 mg/kg közötti tartományba esik. Ily módon például bármely agonista antiCD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense dózisa lehet 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg vagy más ilyen dózis, amely a körülbelül 0,003 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg közötti tartományba esik. Az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense ugyanilyen terápiásan hatásos dózisát beadhatjuk az ellenanyag adagolásának mindegyik hetén. Más megoldásképpen az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 26

2

fragmense különbözõ terápiásan hatásos dózisait adhatjuk be egy kezelési idõszak folyamán. Más megvalósítási módok szerint a leírásban máshol ismertetett antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense kezdeti terápiásan hatásos dózisa az alacsonyabb adagolási tartományban lehet (azaz körülbelül 0,003 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg között), és a késõbbi dózisok a magasabb adagolási tartományban lehetnek (azaz körülbelül 20 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg között). Alternatív megvalósítási módok szerint a leírásban máshol ismertetett antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense kezdeti terápiásan hatásos dózisa a magasabb adagolási tartományban lehet (azaz körülbelül 20 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg között), és a késõbbi dózisok az alacsonyabb adagolási tartományban lehetnek (azaz körülbelül 0,003 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg között). Ily módon egy megvalósítási mód szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense kezdeti terápiásan hatásos dózisa körülbelül 20 mg/kg és körülbelül 35 mg/kg közötti, beleértve körülbelül 20 mg/kg, körülbelül 25 mg/kg, körülbelül 30 mg/kg és körülbelül 35 mg/kg, és az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense késõbbi terápiásan hatásos dózisai körülbelül 5 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg közöttiek, beleértve körülbelül 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg és körülbelül 15 mg/kg. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyag terápiát egy az ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense „feltöltõ dózisával” indítjuk az antagonista anti-CD40 ellenanyag terápiára szoruló páciensben. A „feltöltési dózis” kifejezés alatt az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense egy kezdeti dózisát értjük, amelyet az alanynak beadunk, ahol a beadott ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense a magasabb adagolási tartományba esik (azaz körülbelül 20 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg között). A „feltöltési dózist” egyetlen beadásként adhatjuk be, például egyetlen infúzióval, ahol az ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét IV adjuk be, vagy több beadással, például több infúzióval, ahol az ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét IV adjuk be, mindaddig, amíg a teljes „feltöltési dózist” körülbelül 24 órás idõszakon belül beadjuk. A „feltöltési dózis” beadását követõen az alanynak azután az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense egy vagy több további terápiásan hatásos dózisát adjuk be. A késõbbi terápiásan hatásos dózisokat például heti adagolási rend szerint adhatjuk be, vagy kéthetente, háromhetente vagy négyhetente. Az ilyen megvalósítási módok szerint a késõbbi terápiásan hatásos dózisok általában az alacsonyabb adagolási tartományba esnek (azaz körülbelül 0,003 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg közöttiek). Más megoldásképpen bizonyos megvalósítási módok szerint a „feltöltési dózist” követõen az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmensei késõbbi dózisait egy „fenntartási rend” szerint adjuk be, ahol az ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terá-

1

HU 007 240 T2

piásan hatásos dózisát havonta egyszer, hathetente egyszer, kéthavonta egyszer, 10 hetente egyszer, háromhavonta egyszer, 14 hetente egyszer, négyhavonta egyszer, 18 hetente egyszer, öthavonta egyszer, 22 hetente egyszer, hathavonta egyszer, 7 havonta egyszer, 8 havonta egyszer, 9 havonta egyszer, 10 havonta egyszer, 11 havonta egyszer vagy 12 havonta egyszer adjuk be. Ilyen megvalósítási módokban az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos dózisa az alacsonyabb adagolási tartományba esik (azaz 0,003 mg/kg és körülbelül 20 mg/kg közötti), különösen amikor a késõbbi dózisokat gyakrabban adjuk be, például kéthetente egyszer vagy havonta egyszer, vagy a magasabb adagolási tartományba esik (azaz körülbelül 20 mg/kg és körülbelül 50 mg/kg közötti), különösen amikor a késõbbi dózisokat kevésbé gyakori idõközönként adjuk be, például ahol a késõbbi dózisokat körülbelül egy hónap és körülbelül 12 hónap közötti eltéréssel adjuk be. A leírásban feltárt eljárásokban alkalmazható találmány szerinti gyógyászati készítményben jelen lévõ antagonista anti-CD40 ellenanyagok lehetnek natívak vagy rekombináns módszerekkel elõállítottak, és bármilyen forrásból származhatnak, beleértve emlõsforrásokat, mint például egér, patkány, nyúl, fõemlõs, sertés és ember. Elõnyösen az ilyen polipeptidek humán forrásból származnak, elõnyösebben rekombináns humán fehérjék hibridóma sejtvonalakból. A leírásban feltárt eljárásokban hasznos gyógyászati készítmények a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagok biológiailag aktív variánsait tartalmazhatják. Az ilyen variánsok megtartják a natív polipeptid kívánt biológiai aktivitását oly módon, hogy a variáns polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítménynek ugyanolyan a terápiás hatása, mint a natív polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítménynek, amikor alanynak beadjuk. Azaz a variáns anti-CD40 ellenanyag ahhoz hasonló módon szolgál terápiásan aktív komponensként, mint amit megfigyeltünk a natív ellenanyag, például a CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 esetében, amint azokat az 5.9 vagy 12.12 hibridóma sejtvonalak expresszálják. Vannak a szakterületen eljárások annak meghatározására, hogy egy variáns antiCD40 ellenanyag megtartja¹e a kívánt biológiai aktivitását, és ily módon gyógyászati készítményben terápiásan hatásos komponensként szolgál¹e. Egy ellenanyag-variáns biológiai aktivitását a natív antagonista ellenanyag aktivitásának mérésére tervezett vizsgálati eljárások alkalmazásával mérhetjük, mint amelyeket ismertetünk a leírásban. Terápiásan aktív komponensként a találmány szerinti kívánt kötési tulajdonságú antagonista antiCD40 ellenanyagot tartalmazó bármilyen gyógyászati készítményt alkalmazhatunk a leírásban feltárt eljárásokban. Ily módon terápiásan aktív komponensként egy vagy több találmány szerinti antagonista antiCD40 ellenanyagot tartalmazó folyékony, liofilizált vagy permetezve szárított készítményeket állíthatunk elõ vizes vagy nemvizes oldatként vagy szuszpenzióként az alanynak történõ késõbbi beadás céljára, a leírásban

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 27

2

feltárt eljárásoknak megfelelõen. Ezen készítmények mindegyike legalább egy találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot tartalmaz terápiásan vagy profilaktikusan aktív komponensként. A „terápiásan vagy profilaktikusan aktív komponens” kifejezés alatt azt értjük, hogy az anti-CD40 ellenanyagot specifikusan azért alkalmazzuk a készítményben, hogy a kívánt terápiás vagy profilaktikus választ hozza létre egy betegség vagy állapot páciensben történõ kezelése, megelõzése vagy diagnosztizálása érdekében, amikor a gyógyászati készítményt beadjuk az alanynak. Elõnyösen a gyógyászati készítmények megfelelõ stabilizálószereket, térfogatnövelõ szereket, vagy mindegyiket tartalmaznak a fehérje stabilitásának és biológiai aktivitásának elvesztésével kapcsolatos problémák minimalizálására az elõállítás és tárolás folyamán. Kiszerelõszereket adhatunk a találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagot tartalmazó gyógyászati készítményekhez. Ezen kiszerelõanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak olajok, polimerek, vitaminok, szénhidrátok, aminosavak, sók, pufferek, albumin, felületaktív anyagok vagy térfogatnövelõ szerek. Elõnyösen a szénhidrátok közé cukor és cukor-alkoholok tartoznak, mint például mono¹, di¹ vagy poliszacharidok, vagy vízoldható glukánok. A szacharidok vagy glukánok közé tartozhat fruktóz, glükóz, mannóz, szorbóz, xilóz, maltóz, szukróz, dextrán, pullulán, dextrin, a¹ és b¹ciklodextrin, oldható keményítõ, hidroxi-etil-keményítõ, és karboxi-metil-cellulóz, vagy ezek keverékei. A „cukoralkohol” kifejezés alatt C4–C8 szénhidrogént értünk, amely hidroxilcsoportot tartalmaz, és ezek közé tartozik galaktitol, inozitol, mannitol, xilitol, szorbitol, glicerin és arabitol. Ezek a cukrok és cukoralkoholok egyedül vagy kombinációban alkalmazhatók. A cukor vagy cukoralkohol koncentrációja 1,0% és 7% w/v közötti, elõnyösebben 2,0% és 6,0% w/v közötti. Elõnyösen az aminosavak közé a karnitin, arginin és betain balra forgató (L) formái tartoznak; azonban más aminosavakat is alkalmazhatunk. Elõnyös polimerek közé tartozik a poli(vinil-pirrolidon) (PVP) 2000 és 3000 közötti átlagos molekulatömeggel vagy polietilénglikol (PEG) 3000 és 5000 közötti átlagos molekulatömeggel. A kiszereléshez adható felületaktív anyagok az EP 270 799 és 268 110 számú európai szabadalmi iratokban bemutatottak. Ezenfelül az ellenanyagokat kémiai úton módosíthatjuk polimerhez történõ kovalens konjugálással, hogy fokozzuk például azok keringési féléletidejét. Elõnyös polimereket, és azok peptidekhez történõ kapcsolására szolgáló eljárásokat mutatnak be az US 4 766 106; 4 179 337; 4 495 285 és 4 609 546 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok. Elõnyös polimerek a polioxi-etilált poliolok és polietilénglikol (PEG). A PEG oldható vízben szobahõmérsékleten és az általános képlete: R(O–CH2–CH2)nO–R, ahol R lehet hidrogénatom, vagy védõcsoport, mint például alkil- vagy alkanolcsoport. Elõnyösen a védõcsoport 1–8 szénatomos, elõnyösebben metil. Az n jelentése pozitív egész szám, elõnyösen 1 és 1000 között, elõnyösebben 2 és 500 között. A PEG elõnyös átlagos

1

HU 007 240 T2

molekulatömege 1000 és 40 000 között van, elõnyösebben 2000 és 20 000 közötti és legelõnyösebben 3000 és 12 000 közötti. Elõnyösen a PEG legalább egy hidroxicsoportot tartalmaz, elõnyösebben terminális hidroxicsoportot. Ez az a hidroxicsoport, amely elõnyösen aktiválva van, hogy reagáljon az inhibitoron lévõ szabad aminocsoporttal. Azonban nyilvánvaló, hogy a reaktív csoportok típusa és mennyisége változhat, hogy elérjük a találmány szerinti kovalensen konjugált PEG/ellenanyagot. Vízoldható polioxi-etilált poliolok is hasznosak a találmány szerint. Ezek közé tartozik a polioxi-etilált szorbitol, polioxi-etilált glükóz, polioxi-etilált glicerin (POG), és hasonlók. A POG az elõnyös. Ennek egyik oka az, hogy a polioxi-etilált glicerin glicerin-gerince ugyanaz, mint ami a természetben elõfordul, például állatokban és emberekben a mono¹, di¹, trigliceridekben. Tehát ez az elágazás nem szükségszerûen tûnik idegen ágensnek a szervezetben. A POG elõnyös molekulatömege ugyanabba a tartományba esik, mint a PEG¹é. A POG szerkezetét a Knauf és munkatársai (1988) J. Bio. Chem. 263:15 064–15 070. oldal irodalmi helyen ismertetik, és POG/IL–2 konjugátumok tárgyalása megtalálható az US 4 766 106 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban. Egy másik drogbejuttató rendszer a keringési féléletidõ megnövelésére a liposzóma. Liposzómás bejuttatórendszerek elõállítására szolgáló eljárásokat ismertetnek Gabizon és munkatársai (1982) Cancer Research 42:4734. oldal; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129. oldal; és Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplsys. Eng. 9:467. oldal. Más drogbejuttató rendszerek is ismertek a szakterületen, és azokat például a Poznansky és munkatársai (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed., Oxford, N. Y.) pp. 253–315. oldal; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277. oldal irodalmi helyeken ismertetik. A gyógyászati készítményekbe beépítendõ kiszerelõ anyagoknak biztosítania kell az antagonista antiCD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense stabilitását. Azaz az antagonista anti-CD40 ellenanyagnak vagy antigénkötõ fragmensének meg kell tartania a fizikai és/vagy kémiai stabilitását, és kívánt biológiai aktivitásúnak kell lennie, azaz rendelkezni kell a találmány szerint ismertetett egy vagy több biológiai aktivitással, nem korlátozó példaként beleértve a T¹sejtek által stimulált normál humán perifériás B¹sejtek immunglobulin-szekréciójának gátlását; Jurkat T¹sejtekkel stimulált normál humán perifériás B¹sejtek túlélésének és/vagy proliferációjának gátlását; CD40L-expresszáló sejtekkel vagy oldható CD40-ligandum (sCD40L) által stimulált normál humán perifériás B¹sejtek túlélésének és/vagy proliferációjának gátlását; sCD40L vagy szilárd fázisú CD40L által stimulált bármilyen sejt „túlélési” antiapoptopikus intracelluláris szignáljának gátlását; sCD40L vagy szilárd fázisú CD40L ligálása hatására bekövetkezõ transzdukció gátlását bármilyen sejtben; és humán rosszindulatú B¹sejtek proliferációjának gátlását, amint a leírásban máshol említjük.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 28

2

A fehérjestabilitás monitorozására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen. Lásd például Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10:29–90. oldal; Lee (szerk.) (1991) „Peptide and Protein Drug Delivery” (kiad.: Marcel Dekker, Inc., New York, New York); és a leírásban alább ismertetett stabilitási vizsgálati eljárások. Általában a fehérjestabilitást kiválasztott hõmérsékleten mérjük meghatározott idõtartamon keresztül. Elõnyös megvalósítási módok szerint egy stabil ellenanyag gyógyászati kiszerelés biztosítja az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense stabilitását, amikor szobahõmérsékleten (körülbelül 25 °C) tároljuk legalább 1 hónapon, legalább 3 hónapon vagy legalább 6 hónapon keresztül, és/vagy stabil körülbelül 2–8 °C¹on legalább 6 hónapon, legalább 9 hónapon, legalább 12 hónapon, legalább 18 hónapon, legalább 24 hónapon keresztül. Egy fehérjét, mint például ellenanyagot – amikor gyógyászati készítménybe van kiszerelve – úgy tekintünk, hogy megtartotta a fizikai stabilitását egy adott idõpontban, ha nem mutatja kicsapódás, aggregáció és/vagy denaturáció látható (azaz elszínezõdés vagy átlátszóság elvesztése) vagy mérhetõ [például méretkizárásos kromatográfia (SEC) vagy UV fényszórás alkalmazásával] jeleit az adott gyógyászati készítményben. A kémiai stabilitás tekintetében egy fehérjét, mint például ellenanyagot – amikor gyógyászati készítménybe van kiszerelve – úgy tekintünk, hogy megtartotta a kémiai stabilitását egy adott idõpontban, ha a kémiai stabilitás mérései arra utalnak, hogy a fehérje (azaz ellenanyag) megtartja a jelentõséggel bíró biológiai aktivitást az adott gyógyászati készítményben. A kémiai stabilitás változásának monitorozására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, és nem korlátozó példáik közé tartoznak a fehérje kémiailag megváltozott formáinak – mint amelyek az elhasadásból származnak – detektálására szolgáló eljárások, például SDS-PAGE, SEC és/vagy mátrix-asszisztált lézer deszorpciós ionizációs/repülési idõ tömegspektrometria; a molekuláris töltés megváltozásával kapcsolatos degradáció (például a dezamidációval kapcsolatosak), például ioncserélõ kromatográfia alkalmazásával. Lásd például a leírásban alább feltárt eljárásokat. Egy antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét – amikor gyógyászati készítménybe van kiszerelve – úgy tekintünk, hogy megtartotta a kívánt biológiai aktivitását egy adott idõpontban, ha a kívánt biológiai aktivitás abban az idõpontban a kívánt biológiai aktivitás a gyógyászati készítmény által az elõállításkor mutatott kívánt biológiai aktivitásnak körülbelül 30%¹án, elõnyösen körülbelül 20%¹án belül van, amint a kívánt biológiai aktivitás meghatározására alkalmas vizsgálati eljárással meghatározzuk. A találmány szerinti antagonista anti-CD40 ellenanyagok és antigénkötõ fragmenseik kívánt biológiai aktivitásának meghatározására szolgáló vizsgálati eljárások a leírás szerinti példákban ismertetett módon hajthatók végre. Lásd még a következõ irodalmi helyeken ismertetett vizsgálati eljárásokat: Schultze és munkatársai (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200–8204. oldal; Den-

1

HU 007 240 T2

ton és munkatársai (1998) Pediatr. Transplant. 2:6–15. oldal; Evans és munkatársai (2000) J. Immunol. 164:688–697. oldal; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17–22. oldal; Lederman és munkatársai (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77–86. oldal; Coligan és munkatársai (1991) Current Protocols in Immunology 13:12. oldal; Kwekkeboom és munkatársai (1993) Immunology 79:439–444. oldal és az US 5 674 492 és 5 847 082 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint az antagonista anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense folyékony gyógyászati kiszerelésbe van kiszerelve. Az antagonista antiCD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét a szakterületen ismert bármilyen eljárással elõállíthatjuk, beleértve a leírásban fent ismertetett eljárásokat. Egy megvalósítási mód szerint az antagonista antiCD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét rekombináns úton állítjuk elõ CHO-sejtvonalban. Az elõállítását és tisztítását követõen az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét folyékony gyógyászati készítménybe szerelhetjük ki a leírásban megadott módon. Ahol az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense tárolandó a kiszerelést megelõzõen, azt lefagyaszthatjuk, például £20 °C¹on, és azután felolvaszthatjuk szobahõmérsékleten a további kiszereléshez. A folyékony gyógyászati kiszerelés az antagonista anti-CD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét tartalmazza. Az ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense kiszerelésben jelen lévõ mennyisége figyelembe veszi a beadás útvonalát és a kívánt dózistérfogatot. Ily módon a folyékony gyógyászati kiszerelés az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 ellenanyagot, vagy azok antigénkötõ fragmensét körülbelül 0,1 mg/ml és körülbelül 50,0 mg/ml, körülbelül 0,5 mg/ml és körülbelül 40,0 mg/ml, körülbelül 1,0 mg/ml és körülbelül 30,0 mg/ml, körülbelül 5,0 mg/ml és körülbelül 25,0 mg/ml, körülbelül 5,0 mg/ml és körülbelül 20,0 mg/ml vagy körülbelül 15,0 mg/ml és körülbelül 25,0 mg/ml közötti koncentrációban tartalmazza. Bizonyos megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét körülbelül 0,1 mg/ml és körülbelül 5,0 mg/ml, körülbelül 5,0 mg/ml és körülbelül 10,0 mg/ml, körülbelül 10,0 mg/ml és körülbelül 15,0 mg/ml, körülbelül 15,0 mg/ml és körülbelül 20,0 mg/ml, körülbelül 20,0 mg/ml és körülbelül 25,0 mg/ml, körülbelül 25,0 mg/ml és körülbelül 30,0 mg/ml, körülbelül 30,0 mg/ml és körülbelül 35,0 mg/ml, körülbelül 35,0 mg/ml és körülbelül 40,0 mg/ml, körülbelül 40,0 mg/ml és körülbelül 45,0 mg/ml vagy körülbelül 45,0 mg/ml és körülbelül 50,0 mg/ml közötti koncentrációban tartalmazza. Más

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 29

2

megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét körülbelül 15,0 mg/ml, körülbelül 16,0 mg/ml, körülbelül 17,0 mg/ml, körülbelül 18,0 mg/ml, körülbelül 19,0 mg/ml, körülbelül 20,0 mg/ml, körülbelül 21,0 mg/ml, körülbelül 22,0 mg/ml, körülbelül 23,0 mg/ml, körülbelül 24,0 mg/ml vagy körülbelül 25,0 mg/ml koncentrációban tartalmazza. A folyékony gyógyászati kiszerelés az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét és olyan puffert tartalmaz, amely a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti értéken tartja, beleértve a körülbelül pH=5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, és más egyéb ilyen értékeket a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 értékek között. Bizonyos megvalósítási módokban a puffer a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=6,5, körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=6,0, körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=5,5, körülbelül pH=5,5 és körülbelül 7,0, körülbelül pH=5,5 és körülbelül pH=6,5 vagy körülbelül pH=5,5 és körülbelül pH=6,0 közötti tartományban tartja. Bármilyen olyan alkalmas puffer alkalmazható a kiszerelésben, amely a folyékony anti-CD40 ellenanyag kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti tartományban tartja, mindaddig, amíg az ellenanyag fizikai-kémiai stabilitása és kívánt biológiai aktivitása megmarad, amint fent említettük. Alkalmas pufferek nem korlátozó példái közé tartoznak hagyományos savak és azok sói, ahol az ellenion lehet például nátrium, kálium, ammónium, kalcium vagy magnézium. A folyékony gyógyászati kiszerelés pufferelésére alkalmazható hagyományos savak és sóik nem korlátozó példái közé tartoznak a borostyánkõsavvagy szukcinát¹, citromsav- vagy citrát¹, ecetsav- vagy acetát¹, borkõsav- vagy tartarát¹, foszforsav- vagy foszfát¹, glukonsav- vagy glukonát¹, glutaminsav- vagy glutamát¹, aszparaginsav- vagy aszpartát¹, maleinsavvagy maleát- és almasav- vagy malátpufferek. A kiszerelésben található puffer koncentrációja körülbelül 1 mM és körülbelül 50 mM közötti lehet, beleértve körülbelül 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, vagy más ilyen érték a körülbelül 1 mM és körülbelül 50 mM közötti tartományban. Bizonyos megvalósítási módokban a puffer koncentrációja a kiszerelésben körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti, beleértve körülbelül 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, vagy más ilyen érték a körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti tartományban. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a folyékony gyógyászati kiszerelés antagonista antiCD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét tartalmazza és szukcinátpuffert vagy citrátpuffert olyan koncentrációban, amely a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körül-

1

HU 007 240 T2

belül pH=7,0, elõnyösen körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=6,5 közötti értéken tartja. A „szukcinátpuffer” vagy „citrátpuffer” kifejezés alatt borostyánkõsav sóját vagy citromsav sóját tartalmazó puffert értünk. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a szukcinát vagy citrát ellenionja a nátriumkation, és ily módon a puffer nátrium-szukcinát vagy nátrium-citrát. Azonban bármilyen kation várhatóan hatékony. Más lehetséges szukcinátvagy citrátkationok nem korlátozó példái közé tartozik a kálium, ammónium, kalcium és magnézium. Amint fent említettük, a szukcinát- vagy citrátpuffer koncentrációja a kiszerelésben körülbelül 1 mM és körülbelül 50 mM közötti lehet, beleértve körülbelül 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, vagy más ilyen érték a körülbelül 1 mM és körülbelül 50 mM közötti tartományban. Bizonyos megvalósítási módokban a puffer koncentrációja a kiszerelésben körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti, beleértve körülbelül 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM vagy körülbelül 15 mM. Más megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés tartalmazza az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét körülbelül 0,1 mg/ml és körülbelül 50.0 mg/ml, vagy körülbelül 5,0 mg/ml és körülbelül 25,0 mg/ml közötti koncentrációban, és szukcinát- vagy citrátpuffert, például nátrium-szukcinátvagy nátrium-citrátpuffert, körülbelül 1 mM és körülbelül 20 mM, körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti, elõnyösen körülbelül 10 mM koncentrációban. Ahol kívánatos, hogy a folyékony gyógyászati kiszerelés közel izotóniás legyen, az antagonista antiCD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét és a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti értéken tartó puffert tartalmazó folyékony gyógyászati kiszerelés továbbá a kiszerelést megfelelõen izotóniássá tevõ izotonizáló ágens tartalmazhat. A „közel izotóniás” kifejezés alatt azt értjük, hogy a vizes kiszerelésnek az ozmolaritása körülbelül 240 mmol/kg és körülbelül 360 mmol/kg, elõnyösen körülbelül 240 és körülbelül 340 mmol/kg, elõnyösebben körülbelül 250 és körülbelül 330 mmol/kg, még elõnyösebben körülbelül 260 és körülbelül 320 mmol/kg/ még elõnyösebben körülbelül 270 és körülbelül 310 mmol/kg közötti. Egy oldat izotonicitásának meghatározására szolgáló eljárások ismertek a szakember számára. Lásd például Setnikar és munkatársai (1959) J. Ara. Pharm. Assoc. 48:628. oldal. A szakembernek számára ismerõsek különféle gyógyászatilag elfogadható oldószerek, amelyek hasznosak az izotonicitás biztosítására gyógyászati készítményekben. Az izotonizáló ágens bármilyen olyan ágens lehet, amely képes beállítani a találmány szerinti folyékony gyógyászati kiszerelés ozmotikus nyomását egy testfolyadékéval majdnem egyenlõ értékre. Kívánatos gyógyászatilag elfogadható izotonizáló ágens alkalmazása. Ily módon az antagonista anti-CD40 ellen-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 30

2

anyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét és a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti értéken tartó puffert tartalmazó folyékony gyógyászati kiszerelés továbbá olyan komponenseket is tartalmazhat, amelyek izotonicitás biztosítására alkalmazhatók, például nátrium-klorid; aminosavak, mint például alanin, valin és glicin; cukrok és cukoralkoholok (poliolok), melyek nem korlátozó példái közé tartozik glükóz, dextróz, fruktóz, szukróz, maltóz, mannitol, trehalóz, glicerin, szorbitol és xilitol; ecetsav, más szerves savak vagy sóik, és citrátok vagy foszfátok viszonylag kis mennyiségei. Az átlagos szakember ismeri azokat a további ágenseket, amelyek alkalmasak a folyékony kiszerelés optimális tonicitásának biztosítására. Bizonyos elõnyös megvalósítási módokban az antagonista anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét és a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti értéken tartó puffert tartalmazó folyékony gyógyászati kiszerelés továbbá nátrium-kloridot tartalmaz izotonizáló ágensként. A kiszerelésben lévõ nátrium-klorid mennyisége a többi tonicitáshoz hozzájáruló komponenstõl függ. Bizonyos megvalósítási módokban a nátrium-klorid koncentrációja körülbelül 50 mM és körülbelül 300 mM, körülbelül 50 mM és körülbelül 250 mM, körülbelül 50 mM és körülbelül 200 mM, körülbelül 50 mM és körülbelül 175 mM, körülbelül 50 mM és körülbelül 150 mM, körülbelül 75 mM és körülbelül 175 mM, körülbelül 75 mM és körülbelül 150 mM, körülbelül 100 mM és körülbelül 175 mM, körülbelül 100 mM és körülbelül 200 mM, körülbelül 100 mM és körülbelül 150 mM, körülbelül 125 mM és körülbelül 175 mM, körülbelül 125 mM és körülbelül 150 mM, körülbelül 130 mM és körülbelül 170 mM, körülbelül 130 mM és körülbelül 160 mM, körülbelül 135 mM és körülbelül 155 mM, körülbelül 140 mM és körülbelül 155 mM vagy körülbelül 145 mM és körülbelül 155 mM közötti. Egy ilyen megvalósítási mód szerint a nátrium-klorid koncentrációja körülbelül 150 mM. Más ilyen megvalósítási módokban a nátriumklorid koncentrációja körülbelül 150 mM, a puffer nátrium-szukcinát- vagy nátrium-citrát-puffer körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti koncentrációban, a folyékony gyógyászati kiszerelés az antagonista antiCD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag, vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét tartalmazza, és a kiszerelés pH¹ja körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0, körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=6,0 vagy pH=5,5 és körülbelül pH=6,5 közötti. Más megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés tartalmazza az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét körülbelül 0,1 mg/ml és körülbelül 50,0 mg/ml vagy körülbelül 0,5 mg/ml és körülbelül 25,0 mg/ml közötti koncentrációban, és körülbelül 150 mM nátrium-kloridot és

1

HU 007 240 T2

körülbelül 10 mM nátrium-szukcinátot vagy nátrium-citrátot, körülbelül pH=5,5¹ös pH¹n. A fagyasztás-felolvasztás vagy mechanikai nyírás miatti fehérjedegradáció a találmány szerinti folyékony gyógyászati kiszerelés processzálása folyamán meggátolható felületaktív anyagoknak a kiszerelésbe történõ beépítésével, annak érdekében, hogy csökkentsük az oldat-levegõ határfelület felületi feszültségét. Ily módon bizonyos elõnyös megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés antagonista antiCD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét és a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti értéken tartó puffert tartalmaz, és továbbá tartalmaz felületaktív anyagot. Más megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés antagonista anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag, vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét és a kiszerelés pH¹ját a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti értéken tartó puffert, izotonizáló ágenst mint például körülbelül 50 mM és körülbelül 300 mM közötti koncentrációjú nátrium-kloridot tartalmaz, és továbbá tartalmaz felületaktív anyagot. Az alkalmazott tipikus felületaktív anyagok nemionos felületaktív anyagok, beleértve polioxi-etilén-szorbitol-észtereket, mint például poliszorbát-80¹at (Tween 80) és poliszorbát-20¹at (Tween 20); polioxi-propilénpolioxi-etilén-észtereket, mint például Pluronic F68¹at; polioxi-etilén-alkoholokat, mint például Brij 35¹öt; simethicone¹t; polietilénglikolt, mint például PEG400¹at; lizofoszfatidil-kolint; és polioxi-etilén-p-t-oktil-fenolt, mint például Triton X–100¹at. A gyógyászati készítmények klasszikus stabilizálása felületaktív anyagokkal vagy emulgeálószerekkel ismertetve van például a Levine és munkatársai (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3):160–165. oldal irodalmi helyen. A találmány gyakorlatba vételénél az elõnyös felületaktív anyag a poliszorbát¹80. Ahol felületaktív anyagot alkalmazunk, az tipikusan körülbelül 0,001% és körülbelül 1,0% (w/v), körülbelül 0,001% és körülbelül 0,5%, körülbelül 0,001% és körülbelül 0,4%, körülbelül 0,001% és körülbelül 0,3%, körülbelül 0,001% és körülbelül 0,2%, körül belül 0,005% és körülbelül 0,5%, körülbelül 0,005% és körülbelül 0,2%, körülbelül 0,01% és körülbelül 0,5%, körülbelül 0,01% és körülbelül 0,2%, körülbelül 0,03% és körülbelül 0,5%, körülbelül 0,03% és körülbelül 0,3%, körülbelül 0,05% és körülbelül 0,5% vagy körülbelül 0,05% és körülbelül 0,2% közötti mennyiségben van alkalmazva. Ily módon a találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a folyékony gyógyászati kiszerelés antagonista anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CH1R¹5.9 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense terápiásan hatásos mennyiségét tartalmazza, a puffer szukcinátpuffer vagy citrátpuffer körülbelül 1 mM és körülbelül 50 mM, körülbelül 5 mM és körülbelül 25 mM vagy körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti koncentrációban; a kiszerelés pH¹ja körülbelül pH=5,0 és

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 31

2

körülbelül pH=7,0, körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=6,0 vagy körülbelül pH=5,5 és körülbelül pH=6,5 közötti; és a kiszerelés továbbá felületaktív anyagot tartalmaz, például poliszorbát-80¹at, körülbelül 0,001% és körülbelül 1,0% vagy körülbelül 0,001% és körülbelül 0,5% közötti mennyiségben. Az ilyen kiszerelések adott esetben izotonizáló ágenst, mint például nátrium-kloridot tartalmazhatnak körülbelül 50 mM és körülbelül 300 mM, körülbelül 50 mM és körülbelül 200 mM vagy körülbelül 50 mM és körülbelül 150 mM közötti koncentrációban. Más megvalósítási módokban a folyékony gyógyászati kiszerelés tartalmaz antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmaz körülbelül 0,1 mg/ml és körülbelül 50,0 mg/ml vagy körülbelül 5,0 mg/ml és körülbelül 25,0 mg/ml koncentrációban, beleértve körülbelül 20,0 mg/ml¹t; körülbelül 50 mM és körülbelül 200 mM nátrium-kloridot, beleértve körülbelül 150 mM nátrium-kloridot; nátrium-szukcinátot vagy nátrium-citrátot körülbelül 5 mM és körülbelül 20 mM közötti koncentrációban; beleértve körülbelül 10 mM nátriumszukcinátot vagy nátrium-citrátot; nátrium-kloridot körülbelül 50 mM és körülbelül 200 mM közötti koncentrációban, beleértve körülbelül 150 mM¹ban; és adott esetben felületaktív anyagot, például poliszorbát-80¹at, körülbelül 0,001% és körülbelül 1,0%, beleértve körülbelül 0,001% és körülbelül 0,5% közötti mennyiségben; ahol a folyékony gyógyászati kiszerelés pH¹ja körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0, körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=6,0, körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=5,5, körülbelül pH=5,5 és körülbelül 6,5 vagy körülbelül pH=5,5 és körülbelül pH=6,0 közötti tartományban van. A folyékony gyógyászati kiszerelés lényegében mentes lehet mindenféle tartósítószertõl és más hordozóktól, excipiensektõl vagy stabilizálószerektõl, amint fent említettük. Más megoldásképpen a kiszerelés egy vagy több tartósítószert, mint például antibakteriális ágenseket tartalmazhat, és gyógyászatilag elfogadható hordozókat, excipienseket és stabilizálószereket, amint ismertettük, amennyiben azok nem befolyásolják károsan az antagonista anti-CD40 ellenanyag és antigénkötõ fragmense fizikai-kémiai stabilitását. Az elfogadható hordozók, excipiensek és stabilizálószerek nem korlátozó példái közé tartoznak további pufferelõágensek, társoldószerek, felületaktív anyagok, antioxidánsok, mint például aszkorbinsav és metionin, kelálóágensek, mint például EDTA, fémkomplexek (például Zn¹protein komplexek), és biodegradábilis polimerek, mint például poliészterek. A gyógyászatilag elfogadható hordozók, excipiensek, stabilizálószerek és izomolitok átfogó tárgyalása megtalálható a „Remington’s Pharmaceutical Sciences” (18. kiadás.; kiad.: Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) irodalmi helyen. Miután a találmány szerinti folyékony gyógyászati kiszerelést vagy gyógyászati készítményt elõállítottuk, azt liofilizlhatjuk a degradáció megelõzésére. Folyékony készítmények liofilizálására szolgáló eljárások is-

1

HU 007 240 T2

mertek az átlagos szakember számára. A felhasználást megelõzõen a készítményt visszaoldhatjuk steril oldószerrel (például Ringer-oldat, desztillált víz vagy steril sóoldat), amely további alkotóelemeket tartalmazhat. A feloldás után a készítményt elõnyösen beadjuk az alanyoknak a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. Antagonista anti-CD40 ellenanyagok alkalmazása gyógyszerek gyártására A találmány tárgyát képezi antagonista antiCD40 ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása is gyógyszer gyártására alany olyan rák esetén történõ kezelésére, amelyet neoplasztikus B¹sejtnövekedés jellemez, ahol a gyógyszert legalább egy másik rákterápiával történõ kezeléssel koordináljuk. A neoplasztikus B¹sejt-növekedéssel jellemzett rákok nem korlátozó példái közé tartoznak a fent tárgyalt B¹sejttel kapcsolatos rákok, például nem Hodgkin-limfóma, krónikus limfocitikus leukémia, többszörös mieloma, B¹cell limfóma, magas fokozatú B¹sejtes limfóma, közepes fokozatú B¹sejtes limfóma, alacsony fokozatú B¹sejtes limfóma, B¹sejtes akut limfoblasztikus leukémia, mieloblasztikus leukémia, Hodgkin-betegség, plazmacitoma, follikuláris limfóma, follikuláris kis hasított limfóma, follikuláris nagysejtes limfóma, follikuláris kevert kis hasított limfóma, diffúz kis hasított sejtes limfóma, diffúz kis limfocitikus limfóma, prolimfocitikus leukémia, limfoplazmacitikus limfóma, szélsõzónás limfóma, nyálkahártyával kapcsolatos nyirokszövet-limfóma, monocitoid B¹sejtes limfóma, léplimfóma, csillósejtes leukémia, diffúz nagysejtes limfóma, mediasztinális nagy B¹sejtes limfóma, limfomatoid granulomatózis, intravaszkuláris limfomatózis, diffúz kevert sejtes limfóma, diffúz nagysejtes limfóma, immunoblasztikus limfóma, Burkitt-limfóma, AIDS-szel kapcsolatos limfóma és köpeny sejtes limfóma. A „koordinált” kifejezés alatt azt értjük, hogy az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmazó gyógyszer az alany legalább egy másik rákterápiával történõ kezelését megelõzõen, azalatt vagy után alkalmazandó. A másik rákterápiák nem korlátozó példái közé tartozik a mûtét; sugárterápia; kemoterápia, adott esetben kombinálva autológ csontvelõ-transzplantációval, ahol az alkalmas kemoterápiás ágensek nem korlátozó példái közé tartozik fludarabin vagy fludarabin-foszfát, klorambucil, vinkrisztin, pentosztatin, 2¹klór-dezoxiadenozin (cladribine), ciklofoszfamid, doxorubicin, prednizon, és ezek kombinációi, például antraciklint tartalmazó beadási rendek, mint például CAP (ciklofoszfamid, doxorubicin plusz prednizon), CHOP (ciklofoszfamid, vinkrisztin, prednizon plusz doxorubicin), VAD (vinkritszin, doxorubicin, plusz dexametazon), MP (melfalan plusz prednizon), és egyéb kemoterápiában alkalmazott citotoxikus és/vagy terápiás ágensek, mint például mitoxantron, daunorubicin, idarubicin, aszparagináz és antimetabolitok, melyek nem korlátozó példái közé tartozik citarabin, metotrexát, 5¹fluoro-uracil-dekarbazin, 6¹tioguanin, 6¹merkapto-purin és nelarabin; egyéb rákellenes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 32

2

monoklonális ellenanyag terápia [például alemtuzumab (Campath®)] vagy egyéb anti-CD52 ellenanyag, amely a CD52 sejtfelszíni glikoproteint célozza rosszindulatú B¹sejteken; rituximab (Rituxan®), a teljesen humán ellenanyag HuMax-CD20, R–1594, IMMU–106, TRU–015, AME–133, tositumomab/I–131 tositumomab (Bexxar ® ), ibritumomab tiuxetan (Zevalin ® ), vagy egyéb terápiás anti-CD20 ellenanyag, amely a CD20 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken; antiCD19 ellenanyag (például MT103, amely egy bispecifikus ellenanyag); anti-CD22 ellenanyag (például a humanizált monoklonális ellenanyag epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) vagy egyéb rákellenes ellenanyag, amely a humán vaszkuláris növekedési faktort célozza; anti-CD22 ellenanyag, amely a CD22 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken (például a monoklonális ellenanyag BL–22, ami egy alfa-CD22 toxin); a¹M-CSF ellenanyag, amely a makrofág kolóniastimuláló faktort célozza; a nukleáris faktor-kappaB (RANK) és annak ligandumjai (RANKL) – amelyek többszörös mielómában expresszálódnak – receptor aktivátorát célzó ellenanyagok; anti-CD23 ellenanyag, amely a CD23 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken (például IDEC–152); anti-CD38 ellenanyag, amely a CD38 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken; a fõ hisztokompatibilitási komplex II¹es osztályába tartozó, rosszindulatú B¹sejteken expresszálódó receptorokat célzó ellenanyagok (anti-MHC ellenanyagok); egyéb anti-CD40 ellenanyagok (például SGN–40), amelyek a CD40¹et célozzák rosszindulatú B¹sejteken; és tumornekrózis-faktorral rokon apoptózisindukáló ligandum receptor-1¹et (TRAIL–R1) (például az agonista humán monoklonális ellenanyag HGS-ETR1) – amely számos szilárd daganaton és hematopoietikus eredetû daganatokon expresszálódik – célzó ellenanyagok; kismolekulán alapuló rákterápia, amelynek nem korlátozó példái közé tartoznak mikrotubulus és/vagy topoizomerázinhibitorok (például a mitotikus inhibitor dolastatin és dolastatin analógok; a tubulinkötõ ágens T900607; XL119; és a topoizomerázinhibitor aminocamptothecin), SDX–105 (bendamustine hidroklorid), ixabepilone (ami egy epothilone analóg, más néven BMS–247550), protein-kináz¹C inhibitorok, például midostaurin (PKC–412, CGP 41251, N¹benzoylstauros-porine), pixantrone, eloxatin (ami egy antineoplasztikus ágens), ganite (gallium-nitrát), Thalomid® (thalidomide), thalidomide immunmoduláns származékai [például revlimid (korábban revimid)], Affinitak™ (a proteinkináz-C-alfa antiszensz inhibitor), SDX–101 (R¹etodolac, ami rosszindulatú limfociták apoptózisát indukálja), második generációs purinnukleozidanalógok, mint például clofarabine, a protein Bcl–2 ráksejtek általi termelésének inhibitora (például az oblimersen és Genasense® antiszensz ágensek), proteaszómainhibitorok [például Velcade™ (bortezomib)], kismolekulás kinázinhibitorok (például CHIR–258), kismolekulás VEGF-inhibitorok (például ZD–6474), a 90¹es hõsokkfehérje (HSP) kismolekulás inhibitorai (például 17¹AAG), hiszton-deacetilázok kismolekulás inhibitorai (például hibrid/poláris citodifferenciációs HPC), olyan ágensek, mint például

1

HU 007 240 T2

szuberanilohidroxám sav (SAHA, és FR–901228) és apoptotikus ágensek, mint például Trisenox® (arzén-trioxid) és Xcytrin® (motexafin-gadolinium); vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápiák, melyek nem korlátozó példái közé tartoznak vakcinás megközelítések (például Id¹KLH, onkofág, vitalethine), személyre szabott immunterápia vagy aktív idiotípus immunterápia (például MyVax® Personalized Immunotherapy, korábbi nevén GTOP–99), Promune® [CpG 7909, a toll-szerû receptor¹9 (TLR9) szintetikus agonistája], interferon-alfa-terápia, interleukin–2- (IL–2) terápia, IL–12-terápia; IL–15-terápia és IL–21-terápia; szteroidterápia; vagy egyéb rákterápia; ahol a további rákterápiával vagy további rákterápiákkal történõ kezelés az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmazó gyógyszerrel történõ kezelést megelõzõen, az alatt vagy azt követõen történik, amint a leírásban említettük. Bizonyos megvalósítási módok szerint a leírás tárgya az anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása B¹sejtes limfóma, például nem Hodgkin-limfóma alanyban történõ kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a gyógyszer koordinálva van legalább egy másik rákterápiával történõ kezeléssel, amely a kemoterápia, rákellenes ellenanyag-terápia, kismolekulán alapuló rákterápia és a vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápia által alkotott csoportból van kiválasztva, ahol a gyógyszer a másik rákterápiával történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, Ily módon például bizonyos megvalósítási módokban a leírás tárgya a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása B¹sejtes limfóma, például nem Hodgkinlimfóma alanyban történõ kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a gyógyszer koordinálva van kemoterápiával, ahol a kemoterápiás ágens a cytoxan, doxorubicin, vinkrisztin, prednizon és azok kombinációi, például a CHOP által alkotott csoportból van kiválasztva. Más megvalósítási módokban a leírás tárgya a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása B¹sejtes limfóma, például nem Hodgkin-limfóma alanyban történõ kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a gyógyszer koordinálva van legalább egy másik rákterápiával történõ kezeléssel, amely a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: alemtuzumab (Campath ® ) vagy a rosszindulatú B¹sejteken lévõ CD–52 sejtfelszíni glikoproteint célzó más antiCD52 ellenanyag; rituximab (Rituxan®), a teljesen humán ellenanyag HuMax-CD20, R–1594, IMMU–106, TRU–015, AME–133, tositumomab/I–131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), vagy bármely egyéb terápiás anti-CD20 ellenanyag, amely a CD20 antigént célozza rosszindulatú B¹sejteken; antiCD19 ellenanyag (például MT103, amely egy bispecifikus ellenanyag); anti-CD22 ellenanyag (például a hu-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 33

2

manizált monoklonális ellenanyag epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) vagy egyéb rákellenes ellenanyag, amely a humán vaszkuláris növekedési faktort célozza; és azok bármilyen kombinációja; ahol a gyógyszer a másik rákterápiával történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó. Még további megvalósítási módokban a leírás tárgya a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása B¹sejtes limfóma, például nem Hodgkin-limfóma alanyban történõ kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a gyógyszer koordinálva van legalább egy másik kismolekulán alapuló rákterápiával történõ kezeléssel, amely a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: mikrotubulus és/vagy topoizomerázinhibitorok (például a dolastatin és dolastatinanalóg mitotikus inhibitorok; a tubulinkötõ ágens T900607; XL119; és a topoizomerázinhibitor aminocamptothecin, SDX–105 (bendamustine hidroklorid), ixabepilone (ami egy epothilone analóg, más néven BMS–247550), protein-kináz¹C inhibitorok, például midostaurin (PKC–412, CGP 41251, N¹benzoylstaurosporine), pixantrone, eloxatin (ami egy antineoplasztikus ágens), ganite (gallium-nitrát), Thalomid® (thalidomide), apoptotikus ágensek, mint például Xcytrin ® (motexafin-gadolinium), a Bcl–2 fehérje ráksejtek általi termelésének inhibitora (például az oblimersen és Genasense® antiszensz ágensek), nelarabin és azok bármilyen kombinációja; ahol a gyógyszer a másik rákterápiával történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó. Még további megvalósítási módokban a leírás tárgya a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása B¹sejtes limfóma, például nem Hodgkin-limfóma alanyban történõ kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a gyógyszer koordinálva van legalább egy másik vakcina¹/immunterápián alapuló rákterápiával történõ kezeléssel, amely a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: vakcinás megközelítések (például Id¹KLH, onkofág, vitalethine), személyre szabott immunterápia vagy aktív idiotípus immunterápia (például MyVax® ’Personalized Immunotherapy’, korábbi nevén GTOP–99), Promune® [CpG 7909, a toll-szerû receptor¹9 (TLR9) szintetikus agonistája], interferon-alfa-terápia, interleukin–2- (IL–2) terápia, IL–12-terápia; IL–15-terápia és IL–21-terápia, és azok bármilyen kombinációja; ahol a gyógyszer a másik rákterápiával történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó. Bizonyos megvalósítási módok szerint a leírás tárgya az anti-CD40 ellenanyag, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigén-

1

HU 007 240 T2

kötõ fragmense alkalmazása B¹sejttel kapcsolatos leukémia, például B¹sejtes akut limficitikus leukémia (B¹ALL) alanyban történõ kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a gyógyszer koordinálva van legalább egy másik rákterápiával történõ kezeléssel, amely a kemoterápia és antimetabolitterápia által alkotott csoportból van kiválasztva, ahol a gyógyszer a másik rákterápiával történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó. Ilyen megvalósítási módok nem korlátozó példái közé tartoznak azok az esetek, ahol az antagonista antiCD40 ellenanyagot, például a CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmazó gyógyszer koordinálva van a következõk által alkotott csoportból kiválasztott kemoterápiás ágenssel vagy antimetabolittal: cytoxan, doxorubicin, vinkrisztin, prednizon, cytarabin, mitoxantron, idarubicin, aszparagináz, metotrexát, 6¹tioguanin, 6¹merkapto-purin és azok kombinációi; ahol a gyógyszer a másik rákterápiával történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelést megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó. Egy ilyen példában a gyógyszer cytarabin plusz daunorubicin, cytarabin plusz mitoxantron és/vagy cytarabin plusz idarubicin kezeléssel van koordinálva; ahol a gyógyszer az B¹ALL-ban szenvedõ alany másik rákterápiával történõ kezelését megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó, vagy többszörös kombinált terápiák esetében a másik rákterápiákkal történõ kezelését megelõzõen, azalatt vagy azután alkalmazandó. A leírásban fel van tárva antagonista anti-CD40 ellenanyag, például találmány szerinti CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy antigénkötõ fragmense alkalmazása is gyógyszer gyártására alany olyan rák esetén történõ kezelésére, amelyet neoplasztikus B¹sejt-növekedés, beleértve B¹sejtekkel kapcsolatos rák jellemez, ahol a gyógyszert olyan alanyban alkalmazzuk, aki legalább egy másik rákterápiával elõzõleg kezelve volt. A „elõzõleg kezelt” vagy „elõkezelés” kifejezés alatt azt értjük, hogy az alany egy vagy több másik rákterápiát kapott (azaz legalább egy másik rákterápiával kezelve volt) mielõtt megkapta az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmazó gyógyszert. Az „elõzõleg kezelt” vagy „elõkezelés” kifejezések magukban foglalnak olyan pácienseket, akik legalább egy másik rákterápiával voltak kezelve 2 éven belül, 18 hónapon belül, 1 éven belül, 6 hónapon belül, 2 hónapon belül, 6 héten belül, 1 hónapon belül, 4 héten belül, 3 héten belül, 2 héten belül, 1 héten belül, 6 napon belül, 5 napon belül, 4 napon belül, 3 napon belül, 2 napon belül vagy akár csak 1 napon belül az antagonista anti-CD40 ellenanyagot, például a találmány szerinti CHIR–12.12 vagy CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagot vagy fragmensét tartalmazó gyógyszert alkalmazó kezelés megkezdését megelõzõen. Nem szükséges, hogy az alany

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 34

2

reagáló volt¹e a korábbi rákterápiával vagy korábbi rákterápiákkal történõ elõkezelésre, ily módon az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmazó gyógyszert kapó alany reagálhatott vagy nem reagálhatott (azaz a rák nehezen kezelhetõ volt) a korábbi rákterápiával történõ elõkezelésre, vagy a korábbi rákterápiák közül eggyel vagy többel történõ elõkezelésre, ahol az elõkezelés több rákterápiát tartalmazott. A másik rákterápiák – amelyekkel az alany elõkezelést kaphatott az antagonista anti-CD40 ellenanyagot vagy antigénkötõ fragmensét tartalmaz gyógyszer beadása elõtt – nem korlátozó példái közé tartozik a mûtét; sugárterápia; kemoterápia, adott esetben kombinálva autológ csontvelõ-transzplantációval, ahol az alkalmas kemoterápiás ágensek nem korlátozó példái közé tartoznak a leírásban fentebb felsoroltak; más rákellenes monoklonális ellenanyag terápiák, melyek nem korlátozó példái közé tartoznak a leírásban fentebb felsorolt rákellenes ellenanyagok; kismolekulán alapuló más rákellenes terápiák, melyek nem korlátozó példái közé tartoznak a leírásban fentebb felsorolt kismolekulák; vakcina¹/immunterápián alapuló más rákellenes terápiák, melyek nem korlátozó példái közé tartoznak a leírásban fentebb felsoroltak; szteroid terápia; egyéb rákterápia; vagy azok bármilyen kombinációja. A „kezelés” kifejezés alatt a gyógyszer egy vagy több más rákterápiával koordinálva történõ alkalmazása vonatkozásában a gyógyszer vagy a másik rákterápia alkalmazását vagy beadását értjük az alanynak, vagy a gyógyszer vagy másik rákterápia alkalmazását vagy beadását értjük az alanyból izolált szövetbe vagy sejtvonalba, ahol az alanynak olyan rákja van, amelyet neoplasztikus B¹sejt-növekedés jellemez, vagy ilyen rákra hajlamos, ahol a cél a rák, a rákkal kapcsolatos tünetek vagy a rák kialakulására való hajlam gyógyítása, orvoslása, enyhítése, könnyítése, megváltoztatása, orvoslása, jobbítása, javítása vagy befolyásolása. Az alábbiakban a találmányt részletesebben is bemutatjuk, azonban az oltalmi kört nem kívánjuk a bemutatott megvalósítási módokra korlátozni. Kísérletes rész A példákban alkalmazott antagonista anti-CD40 ellenanyagok a CHIR–5.9 és CHIR–12.12. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 anti-CD40 ellenanyagok humán IgG1 altípusú anti-humán CD40 monoklonális ellenanyagok (mAb), amelyeket a humán IgG1 nehéz lánc lókuszt és a humán k lánc lókuszt tartalmazó transzgenikus egerek immunizálásával hoztunk létre (XenoMouse® technológia; Abgenix; Fremont, California). Amint FACS elemzéssel kimutattuk, a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 specifikusan kötõdik a humán CD40-hez és képes megakadályozni a CD40-ligandum kötõdését. Mindkét ellenanyag verseng a sejtfelszíni CD40-hez elõre odakötött CD40-ligandummal. Mindkét ellenanyag erõs antagonista és gátolja a normális B¹sejtek, valamint NHL és CLL páciensekbõl származó ráksejtek in vitro CD40-ligandum-közvetített proliferációját. In vitro mindkét ellenanyag elpusztítja ADCC-vel a rákos sejtvonalakat, valamint NHL páciensekbõl származó elsõdleges

1

HU 007 240 T2

ráksejteket. A CHIR–5.9 kötési affinitása humán CD40hez 1,2×10–8 M és a CHIR–12.12 kötési affinitása humán CD40-hez 5×10–10 M. A 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) egér hibridómavonal és a 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) hibridóma vonal letétbe lett helyezve az American Type Culture Collection intézetnél [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110–2209 (USA)] a PTA–5542 és PTA–5543 szabadalmi letéti számok alatt. A következõ protokollokat alkalmaztuk az alábbi ismertetett példákban. ELISA vizsgálati eljárás immunglobulin mennyiségi meghatározására A humán IgM és IgG koncentrációját ELISA-val becsültük meg. 96 mérõhelyes ELISA lemezeket vontunk be 2 mg/ml kecske anti-humán IgG MAb-bal (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) vagy 2 mg/ml kecske antihumán IgM MAb 4102-vel (Bio Source International, California) 0,05 M karbonátpufferben (pH=9,6), 16 órán keresztül történõ inkubációval 4 °C¹on. A lemezeket megmostuk 3¹szor PBS-0,05% Tween–20 pufferrel (PBS-Tween) és telítettük BSA-val 1 órán keresztül. 2 mosás után a lemezeket 2 órán keresztül inkubáltuk 37 °C¹on a tesztminták különbözõ hígításaival. 3 mosás után a megkötõdött Ig¹t detektáltuk 2 órás inkubálással 37 °C¹on 1 mg/ml peroxidázzal jelzett kecske antihumán IgG MAb-bal vagy kecske antihumán IgM Mab-bal. A lemezeket 4¹szer megmostuk, és a megkötõdött peroxidázaktivitást elõhívtuk O¹feniléndiamin szubsztrátként történõ hozzáadásával. Humán IgG vagy IgM standardokat (Caltaq, Burlingame, California) alkalmaztunk mindegyik vizsgálati eljárás standard görbéjének felvételéhez. Perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) izolálása humán perifériás vérbõl 20 ml Ficoll–Paque-oldatot (alacsony endotoxin szint; Pharmacia) adtunk 50 ml¹es polisztirolcsövekbe, 3 csõben, 30 perccel a vér hozzáadása elõtt. A Ficoll–Paque-oldatot felmelegítettük szobahõmérsékletre. 3 l 1:10 hígítású hipóoldatot készítettünk el, és azt alkalmaztuk a vérrel érintkezõ összes csõ és pipetta elmosására. A vért rárétegeztük a Ficoll–Paque-oldat tetejére a Ficoll-réteg megzavarása nélkül, 1,5 ml vér/1 ml Ficoll–Paque arányban. A csöveket lecentrifugáltuk 1700 rpm-mel 30 percig szobahõmérsékleten, úgy hogy a centrifuga fékje ki volt kapcsolva. A felsõ rétegbõl (plazma) annyit eltávolítottunk, amennyit csak lehetett, minimalizálva a vákuumot, hogy elkerüljük az oldat második rétegének az eltávolítását. A második réteget, amely a B¹ és T¹limfocitákat tartalmazza, összegyûjtöttük steril Pasteur-pipetta alkalmazásával, és két 50 ml¹es polisztirolcsõbe helyeztük. Az összegyûjtött anyagot meghígítottuk 3×¹térfogatnyi hideg RPMI-vel adalék anyagok nélkül, és a csöveket lecentrifugáltuk 1000 RPM-mel 10 percig. A tápközeget eltávolítottuk leszívással, és a sejteket az 50 ml¹es csövekbõl újra felszuszpendáltuk összesen 10 ml hideg RPMI-ben

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

(adalék anyagokkal), és átvittük egy 15 ml¹es csõbe. A sejteket leszámláltuk hemacitométer alkalmazásával, és azután lecentrifugáltuk 1000 RPM¹en 10 percig. A tápközeget eltávolítottuk, és azután a sejteket újra felszuszpendáltuk 4 ml RPMI-ben. Ez a frakció tartalmazta a PBMC¹t. A B¹sejtek izolálása PBMC-bõl 100 ml Dynabeadet (anti¹h CD19) helyeztünk egy 5 ml¹es mûanyag csõbe. 3 ml steril PBS¹t adtunk a gyöngyökhöz és összekevertük, és mágneses tartóra helyeztük, azután hagytuk ülepedni 2 percen keresztül. Az oldatot eltávolítottuk Pasteur-pipetta alkalmazásával. 3 ml steril PBS¹t adtunk hozzá, összekevertük, és mágneses tartóra helyeztük, azután hagytuk ülepedni 2 percen keresztül. Ezt a procedúrát a steril PBS-sel még egyszer megismételtük, összesen 3 mosást eredményezve. A PBMC¹t hozzáadtuk a gyöngyökhöz és keverés mellett 30 percig inkubáltuk 40 °C¹on. A PBMC¹t és a gyöngyöket tartalmazó csövet a mágneses tartóra helyeztük 2 percre, és az oldatot átvittük egy új 5 ml¹es csõbe a mágneses tartón. 2 perc elteltével az oldatot átvittük egy új 15 ml¹es csõbe. Ezt a lépés megismételtük még négyszer, és az elsõ négy alkalom oldatait összegyûjtöttük a 15 ml¹es csõbe, azután lecentrifugáltuk 1000 RPM-mel 5 percig. Ez a lépés eredményezte a T¹sejt-elválasztás csapadékát. 100 ml RPMI¹t (adalék anyagokkal) adtunk a gyöngyök z összegyûjtéséhez, és az oldatot átvittük egy 0,7 ml¹es csõbe. 10 ml Dynal Detacha Beadet adtunk a szuszpenzióhoz szobahõmérsékleten, és hagytuk keverõdni 45 percen keresztül. A szuszpenziót átvittük egy új 5 ml¹es csõbe és 3 ml RPMI¹t (adalék anyagokkal) adtunk hozzá. A csövet a mágneses tartóra raktuk 2 percre. Az oldatot átvittük egy új 5 ml¹es csõbe a tartóban 2 percre, majd utána egy 15 ml¹es csõbe. Az elõzõ lépést megismételtük még három alkalommal, összegyûjtve az oldatot a 15 ml¹es csõbe. A 15 ml¹es csövet lecentrifugáltuk 1000 RPM-mel 10 percig, és a sejteket újra felszuszpendáltuk 10 ml RMPI-ben. A mosási lépést megismételtük még 2 alkalommal, összesen 3 mosást eredményezve. A sejteket leszámláltuk az utolsó centrifugálás elõtt. Ez a lépés befejezte a B¹sejt-tisztítást. A sejteket 90% FCS-ben és 10% DMSO-ban tároltuk –80 °C¹on lefagyasztva.

A T¹sejtek izolálása A humán T¹cell Enrichment Column (R&D systems, anti¹h CD 3 column kit) oszlopot 20 ml 1×oszlopmosó 50 pufferrel készítettük elõ, amelyet 2 ml 10×oszlopmosó puffer és 18 ml steril desztillált víz összekeverésével állítottunk elõ. Az oszlopot letisztítottuk 70% etanollal és egy 15 ml¹es csõ tetejére helyeztük. Elõször az oszlop felsõ kupakját távolítottuk el, hogy elkerüljük a levegõ 55 beszívását az oszlop alján. Azután az alsó kupakot is eltávolítottuk, és a csúcsát megtisztítottuk 70% etanollal. Az oszlopban lévõ folyadékot hagytuk kifolyni a 15 ml¹es csõbe. Egy új steril 15 ml¹es csövet helyeztünk az oszlop alá miután az oszloppuffer kifolyt a fehér 60 szûrõ szintjéig. A B¹sejtekre kimerített PBMC-frakciót 35

1

HU 007 240 T2

felszuszpendáltuk 1 ml pufferben és felvittük az oszlop tetejére. A sejteket hagytuk inkubálódni az oszloppal szobahõmérséklet 10 percen keresztül. A T¹sejteket eluáltuk az oszlopról 1×oszlopmosópuffer 4×2 ml¹es aliquotjával. Az összegyûjtött T¹sejteket lecentrifugáltuk 1000 RPM-mel 5 percig. A felülúszót eltávolítottuk és a sejteket újra felszuszpendáltuk 10 ml RPMI-ben. A sejteket leszámláltuk és még egyszer lecentrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, befejezve ezzel a T¹sejttisztítást. A sejteket 90% FCS-ben és 10% DMSO-ban tároltuk –80 °C¹on lefagyasztva. A fenti eljárásokban az RPMI-készítmény 10% FCS¹t (56 °C¹on inaktiválva 45 percen keresztül), 1% Pen/Strep¹et (100 m/ml penicillin, 0,1 mg/ml sztreptomicin), 1% glutamátot, 1% nátrium-piravátot, 50 mM 2¹ME¹et tartalmazott. Áramlási citometriás vizsgálati eljárás Ramos-sejteket (106 sejt/minta) inkubáltunk 100 ml elsõdleges ellenanyaggal (10 mg/ml PBS-BSA-ban) 20 percen keresztül 4 °C¹on. 3 mosás után PBS-BSAval vagy HBSS-BSA-val, a sejteket 100 ml kecske anti(humán IgG) ellenanyag FITC-jelzett F(ab’)2 fragmensével (Caltaq) inkubáltuk 20 percen keresztül 4 °C¹on. 3 PBS-BSA mosás és 1 PBS mosás után a sejteket újra felszuszpendáltuk 0,5–ml PBS-ben. Az elemzéseket FACSCAN V (Becton Dickinson, San Jose, California) készülékkel végeztük. Hibridóma klónok létrehozása Immunizált egerekbõl származó lépsejteket fuzionáltattunk SP 2/0 vagy P 3×63Ag8.653 egér mielomasejtekkel 10:1 arányban 50% polietilénglikol alkalmazásával amint korábban de Boer és munkatársai (1988) J. Immunol. Meth. 113:143. oldal ismertették. A fuzionáltatott sejteket újra felszuszpendáltuk komplett IMDM tápközegben, ami ki volt egészítve hipoxantinnal (0,1 mM), aminopterinnel (0,01 mM), timidinnel (0,016 mM) és 0,5 ng/ml hIL–6-tal (Genzyme,

2

Cambridge, Massachusetts). A fuzionáltatott sejteket azután szétosztottuk 96 mérõhelyes szövettenyésztõ lemezek mérõhelyei között oly módon, hogy mindegyik mérõhelyen átlagosan 1 hibridóma növekedjen. 10–14 nap leteltével a hibridóma populációk felül5 úszóit szkríneltük specifikus ellenanyag termelésére. A hibridóma klónok általi specifikus ellenanyag-termelés szkrínelésére az egyes mérõhelyek felülúszóit összeöntöttük, és teszteltük anti-CD40-aktivitásra elõ10 ször specifikus ELISA-val. A pozitív klónokat azután fluoreszcens sejtfestésre alkalmaztuk EBV-transzformált B¹sejteken, amint fentebb a FACS vizsgálati eljárásnál ismertettük. A pozitív hibridóma sejteket kétszer megklónoztuk korlátozó hígítással IMDM/FBS-ben, ami 15 0,5 ng/ml hIL–6¹ot tartalmazott.

20

25

30

35

1. példa: Anti-CD40 ellenanyagok elõállítása Számos teljesen humán, IgG1 izotípusú antagonista anti-CD40 monoklonális ellenanyagot hoztunk létre. A humán IgG1 nehéz lánc lókuszt és a humán k lánc lókuszt tartalmazó transzgenikus egereket [Abgenix g–1 XenoMouse® technológia (Abgenix; Fremont, California)] alkalmaztunk ezen ellenanyagok létrehozására. A CD40 extracelluláris doménjét expresszáló SF9 rovarsejteket alkalmaztunk immunogénként. Összesen 31 egérlépet fuzionáltattunk az SP2/0 egér mielomasejtekkel, hogy 895 olyan ellenanyagot hozzunk létre, amelyek felismerik a rekombináns CD40¹et ELISA-ban (1A. és 1B. táblázat). Átlagosan az Abgenix XenoMouse® technológia alkalmazásával elõállított hibridómák megközelítõleg 10%¹a tartalmazhat egér lambda könnyû láncot a humán kappa lánc helyett. Az egér könnyû láncot tartalmazó ellenanyagokat kiszelektáltuk. 260 olyan ellenanyag alkészletét alkalmaztuk a további elemzésekben, amelyek kötõdést mutattak a sejtfelszíni CD40-hez. Egy sorozat szubklónozási procedúrával kiszelektált stabil hibridómákat alkalmaztunk a további jellemzéshez kötési és funkcionális vizsgálati eljárásokban.

1A. táblázat Egy tipikus fúzió Anti-CD40 titer Fúzió száma

(1:100K)

Fúzió hatékonysága

Szkrínelt mérõhelyek száma

ELISA+száma

Sejtfelszíni+száma

100%

960

123

33

15%

140

0

0

3

3

153

3

154

4,67

155

6

~40%

960

156

3,17

~25%

220

1

0

157

4,67

90%

960

32

6

158

4,4

90%

960

23

8

159

1,17

100%

960

108

18

160

1,78

90%

960

30

5

6120

320

73

Összesen

36

HU 007 240 T2

1B. táblázat Négy sorozat fúzió összefoglalása Egerek száma

ELISA-pozitív hibridómák

Sejtfelszíni pozitív hibridómák

31

895

260

2. táblázat Az anti-CD40 IgG1 ellenanyagokkal végzett kezdeti adatok összefoglalása Anyahibridóma

131.2F5

153.3C5

153.1D2

158.6F3

153.8E2

155.2C2

Hibridóma klónok

Sejtfelszíni kötés

Antagonista

ADCC

CDC

CMCC#

131.2F5.8.5.1

+++

++

ND

ND

ND

131.2F5.8.5.9

+++

+++

++

–

12047

igen

131.2F5.8.5.11

+++

+++

++

–

12055

igen

153.3C5D8D7.8.4.7.1

++

ND

ND

ND

ND

153–3C5D8D7.8.4.7.8

++

ND

ND

ND

ND

153.3C5D8D7.8.4.7.11

+++

+++

+

ND

ND

153.1D2.9.1

+++

ND

ND

ND

12067

153.1D2.9.8

+++

+++

++

–

12057

153.1D2.9.12

+++

ND

ND

ND

12068

158.6F3.5.1

+++

+++

++

–

12054

158.6F3.5.7

+++

ND

ND

ND

12061

158.6F3.5.10

+++

ND

ND

ND

12062

153.8E2D10D6.12.7

+++

ND

ND

ND

12075

153.8E2D10D6.12.9

+++

ND

ND

ND

12063

153.8E2D10D6.12.12

+++

+++

++++

–

12056

155.2C2E9F12.2.10.4

+++

+/–

ND

ND

12064

155.2C2E9F12.2.10.5

+++

ND

ND

ND

12065

155.2C2E9F12.2.10.6

+/–

ND

ND

ND

12066

166.5E6G12.1

+++

ND

ND

ND

12069

166.SE6

166.5E6G12.3

+++

ND

ND

ND

12070

166.5E6G12.4

+++

+

ND

ND

12071

177.8C10

177.8C10B3H9

+++

++

ND

ND

ND

183.4B3E11.6.1.5

++

ND

ND

ND

ND

183.4B3

183.2G5

184.6C11

185.3E4

185.1A9

V-régió DNS-szekvencia

183.4B3E11.6.1.9

++

ND

ND

ND

ND

183.4B3E11.6.1.10

+++

++

ND

ND

ND

183.2G5D2.8.7

+++

+/–

ND

ND

ND

183.2GSD2.8.8

+++

ND

ND

ND

ND

183.2G5D2.8.9

+++

ND

ND

ND

ND

184.6C11D3.2

++

ND

ND

ND

12078

184.6C11D3.3

++

ND

ND

ND

12080

184.6C11D3.6

+/–

+/–

ND

ND

12079

185.3E4F12.5.6

+++

ND

ND

ND

12072

185.3E4F12.5.11

+++

ND

ND

ND

12073

185.3E4F12.5.12

+++

+

ND

ND

12074

185.1A9E9.6.1

+

ND

ND

ND

ND

185.1A9E9.6.6

+++

+++

+

ND

ND

185.9F1E10.3B5.1

+++

ND

ND

ND

ND

37

igen

igen

1

HU 007 240 T2

2

2. táblázat (folytatás) Anyahibridóma

Hibridóma klónok

Sejtfelszíni kötés

Antagonista

ADCC

CDC

CMCC#

185.9F11

185.9F11E10.3B5.8

+++

ND

ND

ND

ND

185.9F11E10.3B5.12

+++

+++

ND

ND

ND

V-régió DNS-szekvencia

7 anyahibridómából származó klónokat azonosítottunk antagonista aktivitásúnak. Azok relatív antagonista hatásossága és ADCCaktivitása alapján két hibridóma klónt választottunk ki. Ezek neve: 131.2F8.5.9 (5.9) és 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12).

7 másik hibridómából származó klónokat azonosítottunk antagonista aktivitásúnak (fenti 2. táblázat). Azok relatív antagonista hatásossága és ADCC-aktivitása alapján két hibridóma klónt választottunk ki továb- 15 bi értékelésre. Azokat 131.2F8.5.9 (5.9) és 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12) néven neveztük el. A két ellenanyag CD40+ limfóma vonalhoz való kötési profilját az 1. ábrán bemutatott áramlási citometriás 20 hisztogrammon mutatjuk be. 2. példa: A humán anti-CD40 ellenanyagok polinukleotid- és aminosavszekvenciája Az ellenanyagjelöltek variábilis régióit kódoló cDNSeket PCR-rel amplifikáltuk, megklónoztuk és megszekvenáltuk. A CHIR–12.12 ellenanyag könnyû láncának és nehéz láncának az aminosavszekvenciáját a 9A. és 9B. ábrán mutatjuk be. Lásd még a SEQ ID NO:2 (a CHIR–12.12 mAb könnyû lánca) és SEQ ID NO:4 (a CHIR–12.12 mAb nehéz lánca) azonosító számú szekvenciákat. A CHIR–12.12 mAb nehéz láncának egy variánsát a 9B. ábrán mutatjuk be (lásd még a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvenciát), amely annyiban tér el a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvenciától, hogy a szerin-oldallánc szubsztitúcióját tartalmazza az alaninoldallánc helyett a 4. azonosító számú szekvencia 153. pozíciójában. A CHIR–12.12 ellenanyag könnyû láncának és nehéz láncának a nukleotidszekvenciáját a 10A. és 10B. ábrán mutatjuk be. Lásd még az 1. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–12.12 mAb könnyû láncának a kódolószekvenciája) és a 3. azonosító számú szekvenciát (a CHIR–12.12 mAb nehéz láncának a kódolószekvenciája). A CHIR–5.9 ellenanyag könnyû láncának és nehéz láncának az aminosavszekvenciáját a 11A. és 11B. ábrán mutatjuk be. Lásd még a SEQ ID NO:6 (a CHIR–5.9 mAb könnyû lánca) és SEQ ID NO:7 (a CHIR–5.9 mAb nehéz lánca) azonosító számú szekvenciákat. A CHIR–5.9 mAb nehéz láncának egy variánsát a 11B. ábrán mutatjuk be (lásd még a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvenciát), amely annyiban tér el a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvenciától, hogy a szerinoldallánc szubsztitúcióját tartalmazza az alaninoldallánc helyett a 7. azonosító számú szekvencia 158. pozíciójában. Amint várható a független hibridómákból származó ellenanyagok esetében, lényeges nukleotidszekvencia-variáció van a komplementaritást meghatározó régiókban. A VH CDR3 régiójának diverzitásáról gondolják azt, hogy legszignifikánsabb az ellenanyag specifitásának meghatározásában.

25

3. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 hatása CD40/CD40L kölcsönhatásra in vitro A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagjelöltek megakadályozzák a CD40-ligandum kötõdését a sejtfelszíni CD40-hez és leszorítják az elõre odakötõdött CD40-ligandumot. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagokat teszteltük azon képességükre, hogy megakadályozzák¹e a CD40-ligandum kötõdését CD40-hez limfómasejtvonal (Ramos) felszínén. Mindkét ellenanyag (jelöletlen) megakadályozta a PE¹CD40 ligandum azt követõ kötõdését, amint azt áramlási citometriás vizsgálati eljárásokkal meghatároztuk (2A. ábra). A vizsgálati eljárás egy második sorozatában a két ellenanyagot teszteltük a képességükre a sejtfelszíni CD40-hez elõre kötõdött CD40-ligandum helyettesítésére. Mindkét ellenanyag hatásos volt az elõre kötõdött CD40 ligandummal való versengésben, és a CH1R¹5.9 kissé hatékonyabb volt, mint a CHIR–12.12 (2B. ábra).

30

35

40

45

50

55

60 38

4. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 a 15B8-tól eltérõ epitópokhoz kötõdik a CD40-en A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 monoklonális ellenanyagjelöltek versengenek egymással a CD40-hez való kötõdésben, de nem versengenek a 15B8-cal, ami egy IgG2 anti-CD40 mAb (lásd a WO 02/28904 számú nemzetközi közzétételi iratot). Ellenanyag-kompetíciós vizsgálatokat terveztünk Biacore alkalmazásával aminkapcsolással immobilizált protein-A¹t tartalmazó CM5 bioszenzor chip alkalmazásával, amelyet anti-CD40, CHIR–12.12 vagy 15B8 befogására alkalmaztunk. Normál asszociációs/disszociációs kötési görbéket figyeltünk meg CD40-his különbözõ koncentrációival (adatokat nem közlünk). A kompetíciós vizsgálatokhoz CHIR–12.12 vagy 15B8 ellenanyagot fogtunk be a protein¹A felszínre. Azt követõen CD40-his /CHIR–5.9 Fab komplexet (100 nM CD40:1 mM CHIR–5.9.Fab) áramoltattunk át különbözõ koncentrációkban a módosított felszín felett. A CHIR–12.12 esetében nem figyeltük meg a komplex asszociációját, ami arra utal, hogy a CHIR–5.9 blokkolja a CHIR–12.12 CD40-his-hez való kötõdését. Az 15B8 esetében megfigyeltük a Fab CHIR–5.9 komplex kötõdését, ami arra utal, hogy a CHIR–5.9 nem blokkolja a 15B8 kötõdését a CD40 kötõhelyéhez. Azonban a komplex off-sebessége drámaian megnövekedett (adatokat nem közlünk). Azt is meghatároztuk, hogy a 15B8 és CHIR–12.12 nem verseng a CD40-his kötéséért. Ezt a kísérletet a CHIR–12.12 protein¹A bioszenzorcsipre történõ befogásával végeztük, a megmaradó protein¹A helyek blok-

1

HU 007 240 T2

kolásával hlgG1-gyel, a CD40-his kötésével és azután 15B8 átáramoltatásával a módosított felszín felett. A 15B8 kötõdött ilyen körülmények között, ami arra utal, hogy a CHIR–12.12 nem blokkolja a 15B8 kötõdését a CD40-hez. 5. példa: Kiválasztott hibridómák kötési tulajdonságai Protein-A¹t immobilizáltunk CM5 bioszenzorcsipre aminkapcsolással. Humán anti-CD40 monoklonális ellenanyagokat fogtunk be 1,5 mg/ml koncentrációban a módosított bioszenzor felszínre 1,5 percen keresztül

Ellenanyag

5

10

2

10 ml/perc sebességgel. Oldható rekombináns CD40his¹t áramoltattunk át a bioszenzor felszíne felett különbözõ koncentrációkban. Az ellenanyagot és antigént meghígítottuk 0,01 M HEPES pH=7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfactant P20 pufferben (HBS¹EP). A kinetikai és affinitási állandókat a Biaevaluation szoftver alkalmazásával határoztuk meg az 1:1 kölcsönhatási modell/globális illesztéssel. Amint az alábbi 3. táblázatban bemutatjuk, 121szeres különbség van a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 offsebességében, ami 24¹szeres nagyobb affinitást eredményez a CHIR–12.12 esetében.

ka (M–1 sec–1)

kd (sec–1)

KD (nM)

Anti-CD40,CHIR–5.9

(12,35±0,64)×105

(15,0±1,3)×10–3

12,15±0,35

Anti-CD40, CHIR–12.12

(2,41±0,13)×105

(1,24±0,06)×10–4

0,51±0,02

6. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 a humán limfociták CD40-közvetített proliferációjának hatásos antagonistái normál alanyokban A CD40 és CD40-ligandum kötõdése indukálja humán B¹sejtek proliferációját. Egy antagonista antiCD40 ellenanyagtól azt várjuk, hogy gátolja ezt a proliferációt. Két ellenanyagjelöltet (CHIR–5.9 és CHIR–12.12) teszteltünk azon képességükre, hogy gátolják¹e normál humán alanyokból származó PBMC CD40-ligandum-indukált proliferációját. A CD40-ligandumot (CD40L) transzfektáltan expresszáló, formaldehiddel rögzített CHO-sejteket alkalmaztunk a CD40-ligandum forrásaként. Humán PBMC¹t tenyésztettünk 4 napon keresztül a CD40-ligandumot expresszáló formaldehiddel rögzített CHO-sejtekkel a CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 anti-CD40 mAb¹ok különbözõ koncentrációinak jelenlétében. A proliferációt tríciált timidin beépülésével mértük. A sejteket pulzáltuk tríciummal jelzett timidinnel 37 °C¹on 14–18 órán keresztül. Mindkét ellenanyagot nagyon hatékonynak találtuk a humán PBMC CD40-ligandum-indukált proliferációjának gátlására (4A. táblázat, CHIR–5.9 mAb, 4B. táblázat,

20

25

30

35

40

CHIR–12.12 mAb). A kísérletet több PBMC donorral végeztük el (n=12 a CHIR–5.9 és n=2 a CHIR–12.12 esetében) annak biztosítására, hogy a megfigyelt gátlás nem egyetlen donortól származó sejtek sajátossága volt. 4 további PBMC donorral végzett követõ kísérleteket hajtottunk végre a CHIR–12.12 mAb¹ra, és hasonló trendeket figyeltünk meg. Az ellenanyag-koncentrációk széles tartományát (0,01 mg/ml–100 mg/ml) alkalmaztuk ezekben a vizsgálati eljárásokban. A CD40-ligandum-indukált proliferáció majdnem teljes gátlását lehet elérni az ellenanyagok 0,1 mg/ml koncentrációjával a legtöbb esetben. A CD40-ligandum-indukált limfocitaproliferáció 50%¹os gátlásához szükséges ellenanyag-koncentráció (pM) (IC50) 6 donortól származó limfocitákban átlagosan 47 értékû lC50¹et (pM) eredményezett (SD=21; 1¹es donor, 24; 2¹es donor, 66; 3¹as donor, 45; 4¹es donor, 84; 5¹ös donor, 30; 6¹os donor, 35), ami kedvezõ összehasonlítva a 4B. táblázatban bemutatott 49,65 értékû (pM) átlagos IC50-értékkel. A jelen adatsor alapján mindkét ellenanyagjelölt hasonlónak tûnik normál PBMC CD40-ligandum-indukált proliferációjának gátlásában.

4A. táblázat A CHIR–5.9 mAb hatása CD40L-indukált PBMC-proliferációra Kísérlet száma

PBMC–010

PBMC–011 Donor#1

PBMC önmagában

CHO¹ CD40L önmagában

Ab konc. (mg/ml)

PBMC+ CHO¹ CD40L

huIgG1 CPM

CHIR–5.9

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

1851

121

4 436

1

5 080

–26

2622

74

1851

121

4 436

0,25

5 498

–43

2907

62

1851

121

4 436

0,0625

6 029

–65

2619

74

1851

121

4 436

0,0156

5 814

–56

1199

131

2162

178

8 222

10

13 137

–84

2252

101

2162

178

8 222

1

11 785

–61

1438

115

2162

178

8 222

0,1

10 758

–43

1249

119

2162

178

8 222

0,01

11 322

–53

4705

60

39

HU 007 240 T2

4A. táblázat (folytatás) Kísérlet száma

Donor#2

Donor#3

Donor#4

PBMC–012

PBMC–014

PBMC–015 Donor#1

Donor#2

Donor#3

PBMC-016

PBMC-017

PBMC önmagában

CHO¹ CD40L önmagában

PBMC+ CHO¹ CD40L

Ab konc. (mg/ml)

huIgG1

CHIR–5.9

CPM

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

2216

294

7 873

10

16 679

–164

2362

103

2216

294

7 873

1

14 148

–117

1202

124

2216

294

7 873

0,1

12 422

–85

756

133

2216

294

7 873

0,01

13 870

–112

6606

24

2396

241

11 021

10

11 641

–7

2631

100

2396

241

11 021

1

13 528

–30

1450

114

2396

241

11 021

0,1

12 176

–14

990

120

2396

241

11 021

0,01

11 895

–10

5357

68

4552

133

15 301

10

22 098

–64

3768

109

4552

133

15 301

1

19 448

–39

2040

125

4552

133

15 301

0,1

18 398

–29

1728

128

4552

133

15 301

0,01

22 767

–70

9481

55

777

117

6 041

10

7 327

–25

2150

76

777

117

6 041

1

6 212

–3

1550

87

777

117

6 041

0,1

7 006

–19

828

101

0,01

777

117

6 041

7 524

–29

1213

94

1857

73

7 889

100

9 399

–25

3379

76

1857

73

7 889

20

8 120

–4

3870

67

1857

73

7 889

4

8 368

–8

2552

90

1857

73

7 889

0,8

9 564

–28

1725

103

3203

127

10 485

100

15 425

–69

1497

126

3203

127

10 485

20

11 497

–14

1611

124

3203

127

10 485

4

11 641

–16

1359

128

3203

127

10 485

0,8

12 807

–32

1490

126

3680

175

15 145

100

21 432

–56

1792

118

3680

175

15 145

20

16 998

–16

1779

118

3680

175

15 145

4

17 729

–23

1965

117

3680

175

15 145

0,8

17 245

–19

2217

115

2734

152

19 775

100

22 967

–19

1664

107

2734

152

19 775

20

21 224

–9

1848

106

2734

152

19 775

4

20 658

–5

1534

108

2734

152

19 775

0,8

18 923

5

1262

110

1118

36

13 531

0,1

10 928

21

745

103

1118

36

13 531

0,05

11 467

17

962

102

1118

36

13 531

0,01

11 942

13

3013

85

962

75

12 510

1

13 597

–9

258

107

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 100 mg/ml koncentrációnál

–42

107

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 10 mg/ml koncentrációnál

–69

98

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 1 mg/ml koncentrációnál

–41

107

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 0,1 mg/ml koncentrációnál

–28

117

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 0,01 mg/ml koncentrációnál

–44

64

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása

–35

101

%¹os gátlás: 100–(CPM Abs–PBMC önmagában–CHO¹CD40L önmagában)/(CPM PBMC+CHO¹CD40L–PBMC önmagában–CHO¹CD40L önmagában)*100%

40

HU 007 240 T2

4B. táblázat A CHIR–12.12 mAb hatása CD40L-indukált PBMC-proliferációra Kísérlet száma

PBMC–025 Donor#1

Donor#2

PBMC–026 Donor#1

Donor#2

PBMC–028 Donor#1

Donor#2

PBMC–029 Donor#1

Donor#2

PBMC–030 Donor#1

Donor#2

PBMC önmagában

CHO¹ CD40L önmagában

PBMC+ CHO¹ CD40L

Ab konc. (mg/ml)

4051

32

42 292

4051

32

42 292

HuIgG1

CHIR–12.12

CPM

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

0,1

33 354

23

440

110

0,01

37 129

14

8 696

88

4051

32

42 292

0,001

40 271

5

32 875

25

4051

32

42 292

0,0001

40 034

6

37 261

13

2260

31

14 987

0,1

15 767

–6

365

115

2260

31

14 987

0,01

17 134

–17

6 734

65

2260

31

14 987

0,001

20 142

–41

16 183

–9

2260

31

14 987

0,0001

17 847

–23

16 187

–9

2039

35

19 071

0,1

17 136

11

624

109

2039

35

19 071

0,01

16 445

15

6 455

74

2039

35

19 071

0,001

16 195

17

17 833

7

2039

35

19 071

0,0001

18 192

5

17 924

7

2016

64

17 834

0,1

17 181

4

2 078

100

2016

64

17 834

0,01

16 757

7

10 946

44

2016

64

17 834

0,001

18 613

–5

17 924

–1

2016

64

17 834

0,0001

17 169

4

18 569

–5

4288

45

22 547

1

18 204

24

2 098

112

4288

45

22 547

0,1

20 679

10

1 827

114

4288

45

22 547

0,01

22 799

–1

6 520

88

4288

45

22 547

0,001

23 547

–5

22 327

1

4288

45

22 547

0,0001

24 778

–12

24 124

–9

2148

58

54 894

1

48 545

12

5 199

94

2148

58

54 894

0,1

45 708

17

5 091

95

2148

58

54 894

0,01

51 741

6

18 890

68

2148

58

54 894

0,001

52 421

5

50 978

7

2148

58

54 894

0,0001

54 778

0

52 581

4

609

69

10 054

0,1

11 027

–10

2 098

85

609

69

10 054

0,01

10 037

0

1 827

88

609

69

10 054

0,001

10 222

–2

6 520

38

609

69

10 054

0,0001

11 267

–13

22 327

–131

7737

57

23 132

0,1

21 254

12

2 536

134

7737

57

23 132

0,01

21 726

9

10 249

84

7737

57

23 132

0,001

22 579

4

23 380

–2

7737

57

23 132

0,0001

22 491

4

23 183

0

2739

47

53 426

0,1

60 116

–13

2 132

101

2739

47

53 426

0,01

56 411

–6

14 297

77

2739

47

53 426

0,001

59 167

–11

55 868

–5

2739

47

53 426

0,0001

59 290

–12

60 865

–15

4310

50

53 781

0,1

52 881

2

3 208

102

4310

50

53 781

0,01

51 741

4

30 716

47

4310

50

53 781

0,001

53 072

1

53 628

0

4310

50

53 781

0,0001

58 045

–9

54 343

–1

41

IC50 (nM)

24,22

65,96

45

84

30,07

34,68

28,06

55,35

35,52

102,88

1

HU 007 240 T2

2

4B. táblázat (folytatás) Kísérlet száma

PBMC–032 Donor#1

PBMC önmagában

CHO¹ CD40L önmagában

PBMC+ CHO¹ CD40L

Ab konc. (mg/ml)

2458

42

14 058

2458

42

14 058

2458

42

2458

42

HuIgG1

CHIR–12.12

CPM

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

0,1

16 579

–22

636

116

0,01

19 250

–45

3 358

93

14 058

0,001

19 852

–50

20 639

–57

14 058

0,0001

19 161

–44

18 907

–42

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 0,1 mg/ml koncentrációnál

3

107

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 0,01 mg/ml koncentrációnál

–1

74

Humán PBMC átlagos %¹os gátlása 0,001 mg/ml koncentrációnál

–7

0

Humán PBMC átlágos %¹os gátlása 0,0001 mg/ml koncentrációnál

–8

–17

IC50 (nM)

40,36

49,65

%¹os gátlás: 100–(CPM Abs–PBMC önmagában–CHO¹CD40L önmagában)/(CPM PBMC+CHO¹CD40L–PBMC önmagában–CHO¹CD40L önmagában)*100%

A B¹sejtek mellett a humán PBMC tartalmaz természetes ölõsejteket is, amelyek képesek az ellenanyagfüggõ citotoxicitást (ADCC) közvetíteni. A proliferáció ellenanyag-közvetített gátlása mechanizmusának tisztázásra vizsgálatokat végeztünk humán PBMC-bõl tisz- 25 tított B¹sejtekkel. A PBMC-vel kapott eredményekhez

hasonlóan mindkét ellenanyag hatásosan gátolta a tisztított B¹sejtek CD40-ligandum-indukált proliferációját (5. táblázat, n=3). Ezek az adatok azt demonstrálják, hogy az ellenanyagjelöltek antagonista aktivitása, és nem az ADCC-mechanizmus a proliferáció gátlásának az oka ezekben a vizsgálati eljárásokban.

5. táblázat Anti-CD40 ellenanyagok hatása tisztított humán B¹sejtek CD40-ligandum-indukált proliferációjára Kísérlet száma

B-sejt 004

Donor #

1

2

B-sejt 005

3

CPM

Ab konc. (mg/ml)

B-sejtek

CHO¹C D40L

B-sejtek+ CHO¹CD40L

418

89

3 132

100

418

89

3 132

418

89

3 132

418

89

3 132

81

73

27 240

81

73

27 240

81

73

81

73

267

HuIgG1

CHIR–12.12

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

429

103

271

109

152

114

20

3 193

–2

316

107

222

111

4

3 175

–2

144

114

235

110

0,8

6 334

–122

245

110

63

117

100

28 311

–4

85

100

77

100

20

24 707

9

65

100

94

100

27 240

4

23 081

15

108

100

68

100

27 240

0,8

26 252

4

87

100

77

100

75

24 552

1

25 910

–6

291

100

102

101

267

75

24 552

0,1

28 447

–16

259

100

108

101

267

75

24 552

0,01

26 706

–9

2957

89

4922

81

Átlagos %¹os gátlás

CPM

CHIR–5.9

–3

103

103

%¹os gátlás: 100–(CPM Abs–B-sejt önmagában–CHO¹CD40L önmagában)/(CPM B¹sejt+CHO¹CD40L–B-sejt önmagában–CHO¹CD40L önmagában)*100%

7. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 nem 55 indukálja humán B¹sejtek erõs proliferációiát normál alanyokban A CD40-ligandum proliferációra aktiválja a normál B¹sejteket és a B¹sejtes limfómasejteket. Bizonyos antiCD40 ellenanyagok (agonisták) kötõdése hasonló stimuláló szignált biztosíthat normál és rákos B¹sejtek prolife- 60 42

rációjára. Az erõs B¹sejt stimuláló aktivitású ellenanyagok nem alkalmas jelöltek B¹sejtes limfómák terápiás kezelésére. A két ellenanyagjelöltet teszteltük képességükre normál önkéntes donorokból származó B¹sejtek proliferációjának indukálására. A normális donorokból származó Ficoll–Hypaque Plus gradiens centrifugálással megtisztított B¹sejteket 96 mérõhelyes lemezeken te-

1

HU 007 240 T2

nyésztettük az ellenanyagjelöltek különbözõ koncentrációval (a 0,001–100 mg/ml tartományban) összesen 4 napon keresztül. A pozitív kontrollcsoportban PBMC¹t tenyésztettünk CD40-ligandumot expresszáló formaldehiddel rögzített CHO-sejtekkel. A B¹sejt-proliferációt tríciummal jelzett timidin beépülésével mértük 37 °C¹on

5

2

14–18 órán keresztül. Míg a CHO-sejteken prezentált CD40-ligandum a B¹sejtek erõteljes proliferációját indukálta 145 értékû átlagos stimulációs indexet (SI) eredményezte, az ellenanyagjelöltek csak gyenge proliferációt indukáltak 2,89 és 5,08 értékkel a CHIR–12.12 és CHIR–5.9 esetében (n=3) (6. táblázat).

6. táblázat Normál humán alanyokból tisztított B¹sejtek proliferációja anti-CD40 mAb¹ok hatására Kísérlet száma

B-sejt 004

Donor száma

1

Fagyasztott

Fagyasztott

B-sejt 005

2

3

B-sejtek

B-sejtek+ CHO¹CD40L

CPM

CPM

418

3 132

418

Ab konc. (mg/ml)

S. index (1)

B-sejtek+huIgG1

B-sejtek+ CHIR–5.9

B-sejtek+ CHIR–12.12

CPM

S. index (2)

CPM

S. index (2)

CPM

S. index (2)

100

498

1,19

401

0,96

458

1,10

3 132

20

245

0,59

232

0,56

370

0,89

418

3 132

4

241

0,58

232

0,56

211

0,50

418

3 132

0,8

376

0,90

298

0,71

230

0,55

81

27 240

34

0,42

454

5,60

122

1,51

7,49

336,30

100

81

27 240

20

48

0,59

706

8,72

255

3,15

81

27 240

4

41

0,51

567

7,00

367

4,53

81

27 240

267

24 552

267

34

0,42

736

9,09

408

5,04

1

691

2,59

2101

7,87

1223

4,58

24 552

0,1

686

2,57

2267

8,49

1557

5,83

267

24 552

0,01

808

3,03

2203

8,25

1027

3,85

267

24 552

0,001

567

2,12

846

3,17

826

3,09

Átlagos Stimulációs Index (SI)

0,8 91,96

145,25

1,29

5,08

2,88

S. index (1):=CPM (B¹sejtek+CHO¹CD40L)/CPM (B¹sejtek önmagukban) S. index (2):=CPM (B¹sejtek+Ab¹k)/CPM (PBMC önmagában)

A B¹sejtek mellett a humán PBMC tartalmaz olyan sejttípusokat is, amelyek IgG1-molekulákat felismerõ Fc receptorokat (FcR) hordoznak, amelyek a B¹sejteken található CD40-hez kötõdött anti-CD40 ellenanyagokat keresztköthetik. Ez a keresztkötés potenciálisan 40 fokozhatja az anti-CD40 ellenanyagok stimuláns aktivitását. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 ellenanyagok keresztkötõ sejtek hiányában való B¹sejt-stimuláló aktivitása hiányának igazolására proliferációs kísérleteket végeztünk B¹sejteket és FcR+ sejteket egyaránt tartal- 45 mazó teljes PBMC-vel. Az ezen kísérletekbõl szárma-

zó adatok (7A. táblázat, CHIR–5.9 mAb; 7B. táblázat, CHIR–12.12 mAb) megerõsítik, hogy ezek az ellenanyagjelöltek még FcR¹t hordozó sejtek jelenlétében sem stimulálják általában a B¹sejtek proliferációját a kontroll humán IgG1 (n=10) által indukált proliferáción felül. A CD40-ligandum 7,41 értékû átlagos stimulációs indexet (SI) indukált. Az ellenanyagjelöltekkel az átlagos SI 0,55 és 1,05 volt a CHIR–12.12 és CHIR–5.9 esetében. Csak a 10 tesztelt donor PBMC egyike mutatott valamekkora stimuláns választ a CHIR–5.9 ellenanyagra (donor #2 a 7. táblázatban).

7A. táblázat Normál humán alanyokból származó PBMC proliferációja CHIR–5.9 mAb hatására Kísérlet száma

PBMC

PBMC+CHO¹CD40L CPM

Ab konc. (mg/ml)

index (1)

PBMC+huIgG1 CPM

index (2)

1218

0,86

PBMC–010

PBMC+CHIR–5.9 CPM

index (2)

597 1417

5279

3,73

1

3

4,22

481 1417

5279

0,25 0,062

43

1712

1,21

5 364

3,40

HU 007 240 T2

7A. táblázat (folytatás) Kísérlet száma

PBMC

PBMC+CHO¹CD40L CPM

Ab konc. (mg/ml)

index (1)

1417

5279

5

1417

5279

56

PBMC+huIgG1 CPM

index (2)

1449

1,02

1194

0,84

0,015

PBMC+CHIR–5.9 CPM

2

index (2)

2,57

324

PBMC–011

2

2,29

317 donor#1

2138

8247

3,86

10

3047

1,43

7

1,49

361 2138

8247

1

2726

1,28

2138

8247

0,1

2026

0,95

2138

8247

0,01

2424

1,13

7

1,69

201 1

0,94

186 1156 donor#2

2374

1

4,87

10

4966

2,09

1

1

2544

1,07

1,91

0,1

2177

0,92

5

1,03

146

1 1156

2374

3 244

1156 2374

0,87

452

1156 2374

0

2

0,62

189

1

0,01

4672

1,97

6

0,80

211 donor#3

3229

7956

2,46

10

5035

1,56

9

0,66

109 3229

7956

1

2826

0,88

3229

7956

0,1

2277

0,71

9

0,34

105 2

0,33

189 3229 donor#4

4198

7956

9

1431

517

4

3,41

10

5012

1,19

1

3592

0,86

0,1

5298

1,26

1431 4198

2

1,12

431

4 1431

4198

1,23

470

4 1431

4198

6

0,59

9

1,03

540

4

0,01

5758

1,37

PBMC–014

0

1,29

247 2350

8787

2350

8787

3,74

100

2722

1,16

20

2315

0,99

1

1,05

244 7

1,04

165 2350

8787

4

2160

0,92

9

0,71

167 2350

8787

0,8

44

2328

0,99

1

0,71

HU 007 240 T2

7A. táblázat (folytatás) Kísérlet száma

PBMC

PBMC+CHO¹CD40L CPM

PBMC 015

Ab konc. (mg/ml)

index (1)

PBMC+huIgG1 CPM

index (2)

1293 donor#1

3284

6

3,94

100

3598

1,10

6

20

2751

0,84

4

3135

0,95

6099

6 1

0,8

4027

1,23

3,14

100

2999

0,49

1

20

4025

0,66

4

4496

0,74

2479

1 6

0,34

9

0,43

4

0,84

7

0,64

1

0,55

413 0,8

3834

0,63

1982 donor#3

5

334

1 1912

6099

0,48

391

1912 6099

2

510

1912 6099

0,51

141

1912 donor#2

2

110

6 1293

3284

index (2)

156

1293 3284

CPM

168

1293 3284

PBMC+CHIR–5.9

9

0,68

120 8,00

100

3564

1,44

4

0,49

20

1874

0,76

782

0,32

4

1779

0,72

634

0,26

0,8

2274

0,92

937

0,38

1982 2479

6 1982

2479

6 1982

2479 PBMC–016

6 1578

1148

9

103 13,75

0,1

1255

1,09

6

0,90

0,05

1284

1,12

871

0,76

0,01

1446

1,26

952

0,83

1578 1148

9 1578

1148

9

A PBMC átlagos SI¹értéke

5,09

1,06

1,03

index (1):=(PBMC+CHO¹CD40L)/PBMC index (2):=(PBMC+Ab)/PBMC

7B. táblázat Normál humán alanyokból származó PBMC proliferációja CHIR–12.12 mAb hatására Kísérlet száma

PBMC–025 donor#1

PBMC

PBMC+CHO¹CD40L CPM

index (1)

10,44

Ab konc. (mg/ml)

PBMC+huIgG1 CPM

index (2)

PBMC+CHIR–12.12 CPM

index (2)

4051

42 292

0,1

2909

0,72

2451

0,61

4051

42 292

0,01

4725

1,17

8924

2,20

4051

42 292

0,001

8080

1,99

8782

2,17

4051

42 292

0,0001

4351

1,07

4342

1,07

45

HU 007 240 T2

7B. táblázat (folytatás) Kísérlet száma

PBMC

PBMC+CHO¹CD40L CPM

donor#2

PBMC–026 donor#1

donor#2

PBMC–027 donor#1

donor#2

PBMC–028 donor#1

donor#2

PBMC–029 donor#1

donor#2

PBMC–030 donor#1

donor#2

2260

14 987

Ab konc. (mg/ml)

index (1)

6,63

0,1

PBMC+huIgG1

PBMC+CHIR–12.12

CPM

index (2)

CPM

index (2)

2538

1,12

6741

2,98

2260

14 987

0,01

3524

1,56

8921

3,95

2260

14 987

0,001

3159

1,40

4484

1,98

2260

14 987

0,0001

2801

1,24

2533

1,12

2085

18 313

0,1

1386

0,66

2761

1,32

2085

18 313

0,01

2871

1,38

3162

1,52

2085

18 313

0,001

2602

1,25

3233

1,55

0,0001

2085

18 313

676

18 054

8,78

26,71

1709

0,82

1766

0,85

0,1

660

0,98

2229

3,30

676

18 054

0,01

2864

4,24

1238

1,83

676

18 054

0,001

693

1,03

1507

2,23

676

18 054

0,0001

984

1,46

811

1,20

2742

13 028

0,1

4725

1,72

2795

1,02

2742

13 028

0,01

4575

1,67

5353

1,95

2742

13 028

0,001

3218

1,17

3501

1,28

2742

13 028

1338

11 901

4,75

8,89

0,0001

5107

1,86

4272

1,56

0,1

1633

1,22

1943

1,45

1338

11 901

0,01

1520

1,14

5132

3,84

1338

11 901

0,001

1517

1,13

2067

1,54

1338

11 901

0,0001

1047

0,78

2076

1,55

4288

22 547

0,1

3686

0,86

2525

0,59

4288

22 547

5,26

0,01

3113

0,73

2047

0,48

4288

22 547

0,001

4414

1,03

3515

0,82

4288

22 547

2148

54 894

2148

54 894

25,56

0,0001

2452

0,57

4189

0,98

0,1

9127

4,25

5574

2,59

0,01

4566

2,13

6515

3,03

2148

54 894

0,001

5285

2,46

5919

2,76

2148

54 894

0,0001

4667

2,17

4298

2,00

609

10 054

0,1

359

0,59

363

0,60

609

10 054

0,01

473

0,78

956

1,57

609

10 054

0,001

461

0,76

1159

1,90

609

10 054

7737

23 132

7737

23 132

16,51

0,0001 2,99

625

1,03

558

0,92

0,1

4940

0,64

3493

0,45

0,01

6041

0,78

3644

0,47

7737

23 132

0,001

5098

0,66

5232

0,68

7737

23 132

0,0001

5135

0,66

5241

0,68

4164

57 205

10

2713

0,65

1046

0,25

4164

57 205

1

3627

0,87

1576

0,38

4164

57 205

0,1

4590

1,10

1512

0,36

4164

57 205

3324

53 865

3324

53 865

13,74

0,01 16,20

46

4384

1,05

2711

0,65

10

6376

1,92

4731

1,42

1

4720

1,42

5219

1,57

1

HU 007 240 T2

2

7B. táblázat (folytatás) Kísérlet száma

PBMC

PBMC+CHO¹CD40L CPM

PBMC–032 donor#1

3324

53 865

3324

53 865

1808

15 271

1808

15 271

Ab konc. (mg/ml)

index (1)

PBMC+huIgG1 CPM

index (2)

CPM

index (2)

3880

1,17

5869

1,77

0,1 0,01 8,45

PBMC+CHIR–12.12

3863

1,16

5657

1,70

10

2349

1,30

4790

2,65

1

3820

2,11

5203

2,88

1808

15 271

0,1

2098

1,16

6332

3,50

1808

15 271

0,01

1789

0,99

5005

2,77

A PBMC átlagos SI¹értéke

11,92

1,30

1,62

index (1):=CPM (PBMC+CHO¹CD40L)/CPM PBMC index (2):=CPM (PBMC+Ab)/CPM PBMC

A mAb-jelöletek általi stimulálóaktivitás hiányát továbbá megerõsítettük a PBMC-proliferáció mérésével a 20 mérõhelyek (n=2) mûanyag felszínére immobilizált antiCD40 ellenanyagjelöltekkel. Az átlagos SI CD40-ligan-

dummal, CHIR–12.12 és CHIR–5.9 stimulációval 22, 0,67 és 1,2 volt (8. táblázat). Együttesen ezek az adatok azt mutatják, hogy az anti-CD40 ellenanyagjelöltek nem rendelkeznek erõs B¹sejt-stimuláló tulajdonságokkal.

8. táblázat Normál humán alanyokból származó PBMC proliferációja immobilizált anti-CD40 ellenanyagok hatására Kísérlet száma

PBMC–012

Immobilizált-004

PPBM CPM

PBMC+ CHO¹CD40L CPM

S. index (1)

225

6 808

30,26

225 225

PBMC+huIgG1

Ab konc., (mg/ml)

PBMC+CHIR–5.9

CPM

S. index (2)

10

279

1,24

734

3,26

200

0,89

6 808

1

175

0,78

178

0,79

161

0,72

6 808

0,1

156

0,69

226

1,00

249

1,11

225

6 808

0,01

293

1,30

232

1,03

254

1,13

857

11 701

1000

479

0,56

1428

1,67

384

0,45

857

11 701

100

543

0,63

839

0,98

265

0,31

857

11 701

10

487

0,57

411

0,48

262

0,31

857

11 701

1

632

0,74

372

0,43

376

0,44

13,65

Átlagos stimulációs index

CPM

21,96

S. index (2)

PBMC+CHIR–12.12

0,81

CPM

1,21

S. index (2)

0,67

S. index (1):=CPM (PBMC+CHO¹CD40L)/CPM (PBMC) S. index (2):=CPM (PBMC+mAb)/CPM (PBMC)

8. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 képes elpusztítani a CD40¹et hordozó célsejteket ADCC-vel Az ellenanyagjelöltek képesek elpusztítani a 50 CD40¹et hordozó célsejteket (limfómavonalakat) az ADCC-mechanizmussal. A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 egyaránt teljesen humán IgG1 izotípusú ellenanyagok, és várható, hogy képesek indukálni a célsejtek elpusztítását az ADCC-mechanizmussal. Teszteltük azokat rá- 55 kos sejtvonalak elpusztításának képességére in vitro vizsgálati eljárásokban. Két humán limfómasejtvonalat (Ramos és Daudi) választottunk ki célsejtként ezekhez a vizsgálati eljárásokhoz. 8 normál humán önkéntes donorból származó PBMC¹t vagy dúsított NK¹sejteket al- 60 47

kalmaztunk effektorsejtekként ezekben a vizsgálati eljárásokban. Hatásosabb ADCC-választ figyeltünk meg a CHIR–12.12-vel, összehasonlítva a CHIR–5.9-cel mindkét limfómás rákos sejtvonal célsejtjei ellen. A limfómás sejtvonalak CD20¹at is expresszálnak, ami a rituximab (Rituxan®) célantigénje, ami lehetõvé tette a két mAbjelölt ADCC-aktivitásának az összehasonlítását a rituximab ADCC-aktivitásával. A limfómás sejtvonal esetében rendre 35%, 59% és 47% átlagos specifikus lízist figyeltünk meg a CHIR–5.9, CHIR–12.12 és rituximab esetében, amikor azokat 1 mg/ml koncentrációban alkalmaztuk (9. táblázat). A két ellenanyag nem mutatott sok aktivitást komplementfüggõ citotoxicitási (CDC) vizsgálati eljárásokban.

1

HU 007 240 T2

2

9. táblázat Limfómasejtvonalak anti-CD40 mAB-függõ elpusztítása ADCC-vel Limfómasejtvonalak anti-CD40 mAB-függõ elpusztítása ADCC-vel Kísérlet száma

Effektorsejt

E:T arány

Célsejtek: humán limfómasejtvonal (Ramos vagy Daudi) %¹os lízis IgG1

Ab konc. (mg/ml)

CHIR–5.9

CHIR–12.12

Rituxan

%¹os lízis %¹os lízis %¹os lízis %¹os lízis %¹os lízis %¹os lízis – %¹os lí– %¹os lí– %¹os lízis IgG1 zis IgG1 zis 2IgG1

ADCC–005

huNK

3

17,05

5

30,75

13,70

65,22

48,17

ND

ND

Alarmor Blue

huNK

3

40,81

5

58,62

17,81

87,87

47,06

ND

ND

ADCC–006

huNK

2

–3,09

10

3,50

6,59

43,71

46,8

34,82

37,91

–8,62

1

–10,10

–1,48

45,13

53,75

37,07

45,69

0,1

–14,80

–3,80

39,82

50,82

33,61

44,61

2,53

7,07

50,07

54,61

28,49

33,03

Alarmor Blue

–11 –4,54 51Cr

ADCC–009

huNK

huNK

5

10

Kalcein AM

ADCC–011

huNK

8

Kalcein AM

1,5

10

32,09

30,59

47,24

45,742

ND

ND

2,4

1

18,01

15,61

37,42

35,022

ND

ND

2,5

0,1

14,67

12,17

37,63

35,131

ND

ND

2,32

5

66,20

63,88

97,70

95,38

86,2

83,88

0,48

1

67,20

66,72

123,00

122,52

88,2

87,72

–1,43

0,2

78,40

79,83

118,00

119,43

88,8

90,23

3,39

0,04

69,10

65,71

109,00

105,61

84,9

81,51

3,18

1

15,36

12,19

51,59

48,42

22,44

19,27

4,58

0,01

7,39

2,81

46,80

42,22

14,68

10,10

5,41

0,002

6,35

0,94

5,10

–0,31

9,58

4,16

7,03 ADCC–012

huNK

10

Kalcein AM

ADCC–013

PBMC

100

51Cr

13,34

51Cr

PBMC

100

0,0004 10

7,76

0,73

5,99

–1,04

5,99

-1,04

73,31

59,97

117,80

104,46

50,75

37,41

13,50

1

74,76

61,26

88,64

75,14

65,97

52,47

12,27

0,01

58,52

46,25

72,88

60,61

50,16

37,89

13,61

0,005

57,50

43,89

69,45

55,84

39,28

25,67

11,95

0,001

56,81

44,86

65,17

53,22

33,07

21,12

1

21,03

18,49

37,94

35,40

32,28

29,74

2,54 2,45

0,1

15,50

13,05

30,82

28,37

27,18

24,73

2,92

0,01

14,53

11,61

22,59

19,67

12,79

9,87

2,78 ADCC–014

0,01

4,64

0,001 10

3,90

1,12

8,99

6,21

53,54

48,90

56,12

51,48

3,13

0,35

ND

ND

4,64

1

46,84

42,20

43,00

38,36

ND

ND

4,64

0,1

45,63

40,99

39,94

35,30

ND

ND

4,64

0,01

7,73

3,09

9,79

5,15

ND

ND

4,64

0,001

8,83

4,19

10,81

6,17

ND

ND

Átlagos %¹os lízis a mAb¹ok 1 mg/ml koncentrációjánál

35,31

59,03

47,23

* A 100%-nál nagyobb elpusztítás a 100% elpusztítási kontrollok esetében a detergens általi nem teljes elpusztítás miatt van.

9. példa: A CD40 jelen van nyirokcsomó-biopszia páciensekbõl származó NHL-sejtek felszínén NHL-sejteket izoláltunk páciensek biopsziázott nyirokcsomóiból, és azokat felhasználásig folyékony nitrogénen tartósítottuk. A sejtek életképessége az elem- 60 48

zéskor meghaladta a 90%¹ot. Két rituximabérzékeny és három rituximabrezisztens páciens (összesen öt páciens) sejtjeit megfestettük vagy közvetlenül jelzett 15B8-FITC-vel vagy 15B8 plusz anti-huIgG2-FITC-vel, és elemeztük áramlási citometriával. Azt találtuk, hogy

1

HU 007 240 T2

az összes páciens NHL-sejtjei expresszálják a CD40¹et. A 10. táblázat azt mutatja, hogy átlagosan az NHL-sejtek 76%¹a expresszál CD40¹et (tartománya 60–91%). 5

10. táblázat Páciens IDa

% pozitívc

Pácienstípusb

MS81d

15B8e

d.f

91,02

B

CR

n.

J

CR

n. d.

60,36

H

NR

n. d.

85,08

H

NR

72,24

81,19

K

NR

n. d.

70,69

L

NR

n. d.

66,82

Pozitívok átlagos %¹a

10

15

76

a

anti-CD20 mAb-val kezelt NHL-páciensek, páciens válasz anti-CD20 mAb¹ra; CR=teljesen reagáló; NR=nem reagáló, c a limfocita kapuban pozitívan festõdõ sejtek %¹a, d MS81, agonista anti-CD40 mAb, e 15B8, antagonista anti-CD40 Mab, f n. d., nem végeztük el.

20

b

25

2

10. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 nem stimulálja az NHL-páciensek nyirokcsomóiból származó ráksejtek proliferációját A CD40-ligandum ismert módon stimulálószignált ad NHL-páciensekbõl származó limfómás sejtek túléléséhez és proliferációjához. Bizonyos anti-CD40 ellenanyagok (agonisták) kötõdése hasonló stimulálószignált biztosíthat páciens ráksejtek proliferációjára. Az erõs B¹sejt-stimuláló-aktivitású ellenanyagok nem alkalmas jelöltek B¹sejtes limfómák terápiás kezelésére. A két ellenanyagjelöltet teszteltük képességükre 3 páciensbõl származó NHL-sejtek proliferációjának indukálására. A nyirokcsomó (LN) biopsziákból izolált sejteket ellenanyagjelöltek különbözõ koncentrációival (0,01–300 mg/ml tartományban) tenyésztettük 3 napon keresztül. A sejtproliferációt tríciummal jelzett timidin beépülésével mértük. A két mAb-jelölt egyike sem indukálta ráksejtek proliferációját egyik tesztelt koncentrációban sem (11. táblázat). Az ellenanyagok még hozzáadott IL–4 – ami egy B¹sejt növekedési faktor – jelenlétében sem indukálták az NHL-sejtek proliferációját (a három páciens egyikének sejtjein tesztelve). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 nem agonista anti-CD40 ellenanyagok, és nem stimulálják páciensekbõl származó NHL-sejtek in vitro proliferációját.

11. táblázat NHL-páciensek nyirokcsomóiból származó ráksejtek proliferációja anti-CD40 mAb¹ok hatására Donor száma

Ab konc. (mg/ml)

CPM sejtek+ IgG1

PP

MM

sejt+ CHIR–5.9

CHIR–5.9

CPM-sejtek+ CHIR–12.12

S. index

CPM-sejtek+MS81

CHIR–12.12

S. index MS81

0,01

180

203

1,23

133,67

0,74

ND

ND

0,1

107,5

151,67

1,41

136

1,27

ND

ND

1

130,67

206,67

1,58

197,33

1,51

179

1,37

10

152,5

245

1,61

137,33

0,90

871,67

5,71

100

137,67

332,33

2,41

157,33

1,14

ND

ND

300

137,67

254,33

1,85

100,67

0,73

ND

ND

0,01

165

180,33

1,09

124

0,75

ND

ND

0,1

180,5

149,67

0,83

111,33

0,62

ND

ND

62

109,67

1,77

104,67

1,69

ND

ND

93,33

1,02

100

1,09

763

8,34

1 10

BD (IL–4)

S. index

91,5

100

123

173

1,41

105,33

0,86

ND

ND

300

109

183,67

1,69

157

1,44

ND

ND

0,01

1591,5

1623,67

1,02

1422

0,89

ND

ND

0,1

1405

1281

0,91

1316,33

0,94

ND

ND

1

1526

1352,33

0,89

1160

0,76

1508,33

0,99

10

1450

1424

0,98

1244

0,86

4146,67

2,86

100

1406,67

1497,67

1,06

1255,33

0,89

ND

ND

300

1410,33

1466,67

1,04

1233

0,87

ND

ND

49

1

HU 007 240 T2

11. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 képes blokkolni nem Hodgkin-limfómás páciensekbõl származó ráksejtek CD40-ligandum-közvetített proliferációját A CD40 és CD40-ligandum kötõdése indukálja NHL- 5 páciensekbõl származó ráksejtek proliferációját. Egy antagonista anti-CD40 ellenanyagtól azt várjuk, hogy gátolja ezt a proliferációt. A két anti-CD40 ellenanyagjelöltet változó koncentrációban (0,01 mg /ml–100 mg/ml tartományban) teszteltük a képességükre páciensekbõl 10

2

származó NHL-sejtek CD40-ligandum-indukált proliferációjának gátlására. Páciensekbõl származó NHL-sejteket tenyésztettünk szuszpenzióban CD40L¹et expresszáló táplálósejtek felett IL–4 jelenlétében. A NHLsejtek proliferációját 3H-timidin beépüléssel mértük. Mindkét ellenanyagot nagyon hatékonynak találtuk a NHL-sejtek CD40-ligandum-indukált proliferációjának gátlására (12. táblázat, n=2). A CD40-ligandum-indukált proliferáció majdnem teljes gátlását lehet elérni az ellenanyagok 1,0–10 mg/ml koncentrációjával.

12. táblázat NHL-páciensek nyirokcsomójából származó ráksejtek CD40-ligandum-indukált proliferációjának gátlása Páciens

Ab konc. (mg/ml)

CPM

CHIR–5.9

IgG1

BD

0,01

29 525,5

25 369

0,1

29 554

1

29 486,67

10 100 PP

CPM

0,01

29 710 29 372,33

CHIR–12.12

%¹os gátlás

CPM

Rituximab

%¹os gátlás

CPM

%¹os gátlás

14

24 793

16

29 490,3

0

20 265,33

31

13 671

54

29 832,7

–1

6 785,33

77

453

98

26 355,3

11

506,33

98

371

99

29 427,3

1

386,67

99

ND

ND

0

25 317,3

–7

512,33

98

23 572

23 229,33

1

23 666

19 092,33

15

17 197

24

26 349,7

–17

1 442,33

94

802,67

97

26 515,7

–13 –10

0,1

22 520

1

23 535,67

10

23 101,5

608,67

97

221,33

99

25 478,3

100

23 847,33

ND

ND

252

99

ND

ND

%¹os gátlás: 100–(CPM-teszt Ab¹bal/CPM with kontroll mAb-bal)*100%

12. példa: A CHIR–5.9 hatása az életképes NHLsejtek számára amikor CD40-ligandumot hordozó 35 sejtekkel együtt tenyésztjük A CHIR–5.9 hatását vizsgáltuk az életképes NHLsejtek számára amikor CD40-ligandumot hordozó sejtekkel együtt tenyésztettük hosszabb idõn keresztül (7, 10 és 14 nap). A CD40-ligandum-közvetített jeltovábbítás CD40¹en keresztül fontos a B¹sejtek túlélésében. 40 Ezzel a kísérletsorozattal értékeltük az anti-CD40 ellenanyagok hatását az NHL-sejtek számára 7, 10 és 14 nap elteltével. Öt páciensbõl származó NHL-sejteket tenyésztettünk szuszpenzióban CD40L¹et expresszáló táplálósejtek felett IL–4 jelenlétében. A kont- 45

roll humán IgG és CHIR–5.9 ellenanyagokat 10 mg/ml koncentrációban alkalmaztuk a 0. napon és a 7. napon. Az egyes körülmények között életképes sejteket leszámláltuk a meghatározott napokon. A sejtszám a kontrollcsoportban (IgG) a várt módon idõvel növekedett. Csökkentett számú sejtet nyertünk vissza a CHIR–5.9-cel kezelt tenyészetekben, összehasonlítva a kontrollcsoporttal. A sejtszám csökkenésének legnagyobb mértékét a CHIR–5.9 ellenanyag esetében a 14. napon figyeltük meg, és az átlagosan 80,5% volt (49–94% tartomány), összehasonlítva az izotípuskontrollal (n=5). Ezeket az adatokat a 13. táblázatban foglaljuk össze.

13. táblázat Anti-CD40 ellenanyag (CHIR–5.9/5.11) hatása az NHL-páciens-sejtek számára hosszabb tenyésztési idõ alatt (7, 10 és 14 nap) Páciens

Napok a tenyészetben

Életképes sejtszám IgG

%¹os csökkenés IgGkontrollhoz hasonlítva

mAb CHIR–5.9/5.11

100 000 PS

0

0

1 000 000

0,00

7

935 000

447 500

52,14

127 090

50

1

HU 007 240 T2

2

13. táblázat (folytatás) Páciens

Napok a tenyészetben

Életképes sejtszám IgG

10

%¹os csökkenés IgGkontrollhoz hasonlítva

mAb CHIR–5.9/5.11

0

504 100

6034

102 910 14

0

525 000

48,98

100 000 MT

0

0

1 000 000

0,00

7

267 600

182 500

31,80

10

683 400

191 600

71,96

145 000

BRF

DP

PP

14

0

225 000

84,48

0

250 000

250 000

0,00

7

145 000

86 667

40,23

10

207 500

65 000

68,67

14

570 500

33 330

94,16

0

250 000

250 000

0,00

7

188 330

136 670

27,43

10

235 000

128 330

45,39

14

428 330

58 330

86,38

0

250 000

250 000

0,00

7

270 000

176 670

34,57

10

311 670

128 330

58,83

14

458 330

53 330

88,36

* %¹os csökkenés kontroll Ab¹hez hasonlítva=100–(teszt Ab/kontroll Ab)*100

13. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 képes elpusztítani NHL-páciensek nyirokcsomóiból származó ráksejteket ADCC-vel A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 egyaránt teljesen humán IgG1 izotípusú ellenanyagok, amelyekrõl kimutattuk, hogy indukálják limfómasejtvonalak in vitro elpusztítását az ADCC-mechanizmussal (9. táblázat). Teszteltük azokat egyetlen NHL-páciensbõl származó ráksejtek elpusztításának képességére in vitro vizsgálati eljárásokban. Normál önkéntes donorból származó dúsított NK¹sejteket – akár frissen izolálás után, akár éjszakán keresztül 37 °C¹on történõ tenyésztés után – alkalmaztunk effektorsejtekként ebben a vizsgálati eljárásban. Hasonló eredményeket kaptunk frissen izolált NK¹sejtekkel és éjszakán keresztül történõ tenyésztés után alkalmazott NK¹sejtekkel. ADCC nagyobb szintjét figyeltük meg CHIR–12.12-vel, összehasonlítva CHIR–5.9-cel a páciensbõl származó NHL-sejtekkel szemben. Az NHL-sejtek CD20¹at is expresszálnak, ami a rituximab (Rituxan®) célantigénje, ami lehetõvé tette a két mAb-jelölt ADCC-aktivitásának az összehasonlítását a rituximabéval. A CHIR–12.12 ellenanyag és a rituximab hasonló szintû ADCC-aktivitást mutat, ahol a CHIR–5.9 ad alacsonyabb értéket ebben a vizs-

gálati eljárásban. Ezeket az adatokat a 3A. és 3B. ábrán mutatjuk be. 40

45

50

55

60 51

14. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 képes blokkolni CLL-páciensekbõl származó ráksejtek CD40-közvetített túlélését és proliferációját Az ellenanyagjelöltek képesek blokkolni CLL-páciensekbõl származó ráksejtek CD40-közvetített túlélését és proliferációját páciensekbõl származó CLL-sejteket tenyésztettünk szuszpenzióban CD40L¹et expresszáló, formaldehiddel rögzített CHO-sejtek felett kétféle körülmények között: humán izotípus ellenanyag IgG (kontroll) hozzáadásával; és vagy CHIR–5.9 vagy CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag hozzáadásával. Az összes ellenanyagot 1,10 és 100 mg/ml koncentrációban alkalmaztuk IL–4 nélkül. A sejtszámlálást 24 és 48 óra elteltével végeztük el MTS vizsgálati eljárással. Csökkentett számú sejtet nyertünk vissza a CHIR–5.9cel (n=6) és CHIR–12.12-vel (n=2) kezelt tenyészetekbõl, összehasonlítva a kontrollcsoporttal. Az antiCD40 mAb-bal kezelt és kontrollcsoport közötti nagyobb sejtszám-különbséget a 48 órás idõpontban láttuk. Ezeket az adatokat a 14. táblázatban foglaljuk össze.

1

HU 007 240 T2

2

14. táblázat Az ellenanyagjelöltek hatása CLL-páciensekbõl származó ráksejtek CD40-közvetített túlélésére és proliferációjára 48 órával a tenyészet indítása után mérve Páciens

Ab konc. (mg/ml)

Relatív sejtszám IgG1

CHIR–5.9/5.11

Sejtszám %¹os csökkenése* CHIR–12.12

CHIR 5.9/5.11

CHIR–12.12

25,27

ND

90,62

ND

33,07

ND

67,44

ND

40,16

ND

69,28

ND

75,8

ND

71,46

ND

128,5

ND

43,53

ND

9

6,4

ND

97,59

ND

1

85,9

35,39

ND

58,80

ND

10

70,44

39,51

ND

43,91

ND

269,3 1

1

1 101,5

10

8 130,7

100

1 265,5

2

1

5 227,5

10

7 265,9

100 3

4

5

100

77,65

20,95

ND

73,02

ND

1

80,48

15,03

ND

81,32

ND

10

63,01

19,51

ND

69,04

ND

100

55,69

3,65

ND

93,45

ND

1

90,63

91,66

89,59

–1,14

1,15

10

78,13

82,28

60,41

–5,31

22,68

63,53

86,47

39,59

–36,11

37,68

77,6

71,88

40,40

44,80

78,13

73,96

40,71

43,87

76,56

82,29

39,75

35,25

100

130,2 6

1

1 131,7

10

7 127,0

100

8

* %¹os csökkenés kontroll Ab¹hez hasonlítva=100–(teszt Ab/kontroll Ab)* 100

15. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 daganatellenes aktivitást mutat állatmodellekben Farmakológia/in vivo hatásosság A mAb-jelöltek várhatóan kívánt farmakológiai hatást eredményeznek a daganatterhelés csökkentésére két daganatellenes mechanizmus egyikével vagy mindegyikével, azaz a proliferációs/túlélési szignál blokkolása és az ADCC indukálása. A jelenleg elérhetõ humán limfóma xenograft modellek hosszú távú limfómasejtvonalakat alkalmaznak, amelyek – ellentétben primer ráksejtekkel – nem függenek a CD40-stimulálástól a növekedésükhöz és túlélésükhöz. Tehát nem várható, hogy ezen mAb¹ok daganatellenes aktivitásának a daganat proliferációjának/túlélésének blokkolásán alapuló komponense hozzájárulna a daganatellenes hatá-

45

50

sossághoz ezekben a modellekben. A hatásosság ezekben a modellekben az ADCC-tõl függ, ami a CHIR–5.9 és CHIR–12.12 mAb-okkal kapcsolatos második daganatellenes mechanizmus. Két, a Namalwa és Daudi sejtvonalakon alapuló humán xenograft limfóma modellt vizsgáltunk a mAb-jelöltek daganatellenes aktivitására. A terápiás hatásuk további demonstrálására a mAb-jelölteket a Daudi-sejtvonalon alapuló egylépcsõs és kétlépcsõs xenograft humán limfóma modellben értékeltük.

55

60 52

Az in vivo hatásossági adatok összefoglalása Amikor intraperitoneálisan (ip.) volt beadva hetente egyszer összesen 3 dózisban, a CHIR–12.12, a két mAb-jelölt egyike, szignifikánsan gátolta az agresszív egylépcsõs B¹sejtes limfóma (Namalwa) növekedését

1

HU 007 240 T2

dózisfüggõ módon (4. ábra). A második mAb-jelöltet, a CHIR–5.9, csak egy dózisban teszteltük ebben a vizsgálatban és kevésbé volt hatásos, mint az ugyanolyan dózisú CHIR–12.12. Érdekes, hogy a CHIR–12.12¹t hatásosabbnak találtuk ebben a modellben, mint a rituximabot. Lehetséges, hogy a rituximab alacsonyabb hatásossága az alacsony CD20-expresszió miatt van a Namalwa-limfóma-sejtvonalban. A mAb-jelöltekkel megfigyelt hatásosság fontosabb, mert a ráksejteket elpusztító két mechanizmus közül csak az egyik (ADCC) mûködik a jelenlegi xenograft limfóma modellben. A humán limfómapáciensekben várhatóan két pusztító mechanizmus – az ADCC és a túlélési szignál blokkolása – járul hozzá a daganatellenes aktivitáshoz. Ez valószínûleg növeli a hatékonyság elérésének esélyét humán limfómapáciensekben. Az anti-CD40 mAbjelöltek hajlamosnak mutatkoztak a daganatnövekedés gátlására is egy második B¹sejtes limfóma modellben (nem validált Daudi-modell, adatokat nem közlünk). Követõ vizsgálatokban a két ellenanyagjelöltrõl kimutattuk, hogy dózisfüggõ daganatellenes aktivitásuk van az egylépcsõs és kétlépcsõs Daudi-limfóma-modellekben egyaránt (5. és 6. ábra). A kétlépcsõs Daudi-modellben a CHIR–12.12. mAb hatásosabb volt a daganat térfogatának csökkentésére, mint Rituxan® hasonló dózisa. Xenograft humán B¹sejtes limfómamodellek A konzisztens daganatnövekedés biztosítására T¹sejt-deficiens csupasz egereket teljes testen besugároztunk 3 Gy¹vel, hogy még jobban elnyomjuk az immunrendszert, egy nappal a daganat beoltása elõtt. A daganatsejteket szubkután oltottuk be a jobb lágyékba egerenként 5×106 sejt mennyiségben. A kezelést vagy egy nappal a daganat beültetése után (egylépcsõs szubkután xenograft humán B¹sejtes limfóma modellek, Namalwa és Daudi), vagy amikor a daganat térfogata elérte a 200–400 mm3¹t (kétlépcsõs Daudi-modell, általában 15 nappal a daganat beoltása után) kezdtük meg. A daganatot hordozó egereket antiCD40 mAb-okkal oltottuk be intraperitoneálisan (ip.), hetente egyszer a jelzett dózisokkal. A daganatok térfogatát hetente kétszer feljegyeztük. Amikor a daganat térfogata bármelyik csoportban elérte a 2500 mm3¹t, a vizsgálatot leállítottuk. Megjegyzendõ, hogy a kétlépcsõs Daudi-modellben a daganattérfogat-adatokat a 36. napig elemeztük, az egerek némelyikének ezen nap utáni elpusztulása miatt. A teljes regressziót (CR) a vizsgálat végéig számoltuk. Az adatokat ANOVA vagy Kruskal–Wallis-teszt, és a megfelelõ teszt utáni többcsoportos összehasonlítás alkalmazásával elemeztük. Az egylépcsõs Namalwa-modellben az antiCD40 CHIR–12.12 mAb – azonban a Rituxan® (rituximab) nem – szignifikánsan (p=<0,01) gátolta a Namalwa-daganatok növekedését (60%¹os daganattérfogatcsökkenés, szemben 25%-kal a rituximab esetében, n=10 egér/csoport) (4. ábra). Ily módon ebben a modellben az anti-CD40 CHIR–12.12 mAb hatásosabb volt, mint a rituximab. Említésre méltó, hogy a második

5

10

15

20

25

2

mAb-jelölt, a CHIR–5.9, legalább olyan hatásos volt, mint a rituximab, a rituximab 1/10 dózisánál. Az antiCD40 CHIR–12.12 mAb és a rituxan egyaránt szignifikánsan megakadályozta a daganat kifejlõdését az egylépcsõs Daudi-daganatmodellben (14/15 rezisztencia a daganatkezelés ellen) (5. ábra). Amikor ezeket az anti-CD40 monoklonális ellenanyagokat tovább összehasonlítottuk kétlépcsõs xenograft Daudi-modellben, amelyben a kezelés akkor kezdõdött, amikor a szubkután daganat kitapintható volt, az anti-CD40 CHIR–12.12 mAb 1 mg/kg dózisban szignifikáns daganatcsökkenést eredményezett (p=0,003) 60% teljes regresszió mellett (6/10), míg a rituximab ugyanebben a dózisban nem gátolta szignifikánsan a daganatnövekedést és nem is okozott teljes regressziót (0/10). Lásd a 6. ábrát. Összefoglalva, az anti-CD40 CHIR–12.12 mAb szignifikánsan gátolta a daganatnövekedést kísérletes limfómamodellekben. Ugyanabban az adagolási rendben a CHIR–12.12 mAb jobb rákellenes aktivitást mutatott, mint a Rituxan® (rituximab). Ezenfelül nem figyeltük meg toxicitás klinikai jeleit ebben a dózisban és beadási rendben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az anti-CD40 CHIR–12.12 mAb hatásos antihumán limfóma aktivitású in vitro és xenograft modellekben, és klinikailag hatásos lehet limfóma kezelésére.

16. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 farmakokinetikája Az anti-CD40 mAb egérbeli farmakokinetikáját egy30 szeri IV és IP dózis beadása után vizsgáltuk. Az antiCD40 mAb magas szisztémás bioelérhetõséget mutatott IP beadás után, és elnyújtott végsõ féléletidõt (>5 nap) (adatokat nem közlünk). Ezt az alapkísérletet 35 a farmakológiai vizsgálatok megtervezésének segítésére végeztük; azonban ennek kicsi vagy semmilyen jelentõsége sincs a mAb aktivitásának kifejtésére, mivel ez a teljesen humán mAb nem keresztreagál az egér CD40-nel. 40 17. példa: A CHIR–12.12 és CHIR–5.9 monoklonális ellenanyagok epitópjának a jellemzése A CHIR–12.12 és CHIR–5.9 monoklonális ellen45 anyagok által felismert epitóp CD40¹en való elhelyezkedésének a meghatározására SDS-PAGE és Western-blot-elemzést hajtottunk végre. Tisztított CD40¹et (0,5 mg) választottunk el 4–12% NUPAGE gélen redukáló- és nem redukáló körülmények között, átvittük 50 PVDF-membránokra, és próbáztuk a monoklonális ellenanyagokkal 10 mg/ml koncentrációban. A blotokat alkalikus foszfatázzal konjugált antihumán IgG-vel próbáztuk, és a Western Blue® stabilizált alkalikus foszfatáz szubsztráttal (Promega) hívtuk elõ. Az eredmények arra utalnak, hogy az anti55 CD40 CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag a CD40 nem redukált és redukált formáján egyaránt megtalálható epitópokat ismer fel, és a CD40 nem redukált formája nagyobb intenzitást mutat, mint a 60 CD40 redukált formája (15. táblázat; a blottokat nem 53

1

HU 007 240 T2

mutatjuk be). Az a tény, hogy a felismerés pozitív volt a CD40 mindkét formáján, arra utal, hogy az ellenanyag lineáris szekvenciájú konformációs epitóppal lép kölcsönhatásba. A CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag elsõsorban a CD40 nem redukáló formáját ismeri fel, ami arra utal, hogy az ellenanyag elsõsorban egy konformációs epitópot ismer fel (15. táblázat; a blottokat nem mutatjuk be). 15. táblázat Doménazonosítás

17. táblázat A SPOTs elemzés eredménye anti-CD40 CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal történõ próbázással 5 Folt száma

10

1. domén

2. domén

3. domén

4. domén

CHIR–12.12 mAb

–

+

–

–

CHIR–5.9 mAb

–

+

–

–

15B8 mAb

+

–

–

–

A CD40 antigenikus régiójának feltérképezésére a CD40 négy extracelluláris doménjét megklónoztuk és expresszáltattuk rovarsejtekben GST fúziós fehérjeként. A négy domén szekrécióját GP67 szekréciós szignállal biztosítottuk. Rovarsejt felülúszókat elemeztünk SDS-PAGE-val és Western-blottal, hogy azonosítsuk az epitópot tartalmazó domént. A CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag egy 2. doménen található epitópot ismer fel redukálódás nem redukáló körülmények között egyaránt (16. táblázat; a blottokat nem mutatjuk be). Ezzel ellentétben a CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag nagyon gyengén ismeri fel a 2. domént (16. táblázat; a blottokat nem mutatjuk be). Az ellenanyagok egyike sem ismeri fel az 1., 3. vagy 4. domént ezekben az elemzésekben. 16. táblázat A 2. domén elemzése Redukáló

Nem redukáló

CHIR–12.12 mAb

++

+++

CHIR–5.9 mAb

+

+

A CHIR–12.12 mAb által felismert epitóp pontosabb meghatározásához a CD40 2. doménjébõl olyan peptideket szintetizáltunk, amelyek a PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICT szekvenciának felelnek meg (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú szekvenciákon bemutatott szekvencia 61–104. oldalláncai). SPOTs membránokat (Sigma) hoztunk létre, amelyek 35 10 tagú peptidet tartalmaztak 1 aminosavnyi eltolással. Western-blotelemzést hajtottunk végre a CHIR–12.12 mAb-bal, és antihumán IgG béta-galaktozidázzal másodlagos ellenanyagként. A blotot lepucoltuk és újrapróbáztuk CHIR–5.9 mAb-bal, hogy meghatározzuk az ezen ellenanyag által felismert régiót. Az anti-CD40 CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal 10 mg/ml koncentrációban próbázott SPOTs elemzés pozitív reakciót adott a 18–22. foltokban. Az ezen peptidek által lefedett szekvenciarégiót a 17. táblázatban mutatjuk be.

2

18.

HQHKYCDPNL (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 78–87. oldalláncai)

19.

QHKYCDPNLG (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 79–88. oldalláncai)

20.

HKYCDPNLGL (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 80–89. oldalláncai)

21.

KYCDPNLGLR (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 81–90. oldalláncai)

22.

YCDPNLGLRV (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 82–91. oldalláncai)

15

20

Szekvenciarégió

Ezek az eredmények az YCDPNL lineáris epitópnak felelnek meg (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azo25 nosító számú szekvencián bemutatott szekvencia 82–87. oldalláncai). Ez az epitóp tartalmazza az Y82, D84 és N86 oldalláncokat, amelyekrõl megjósolták, hogy részt vesznek a CD40–CD40 ligandum kölcsönhatásban. A SPOTs elemzés a CHIR–5.9 mAb-bal gyenge 30 felismerést mutatott a 18. táblázatban bemutatott 20–22. foltok által képviselt peptidekkel, ami az YCDPNLGL régió szerepére utal (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú szekvencián bemutatott szekvencia 82–89. oldalláncai) a 35 CD40-hez való kötõdésben. Megjegyzendõ, hogy a CHIR–12.12 és CHIR–5.9 mAb¹ok versengenek egymással a CD40 kötésében BIACORE elemzésben.

40

45

18. táblázat A SPOTs elemzés eredménye antiCD40 CHIR–5.9 monoklonális ellenanyaggal történõ próbázással Folt száma

Szekvenciarégió

20.

HKYCDPNLGL (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 80–89. oldalláncai)

21.

KYCDPNLGLR (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 81–90. oldalláncai)

22.

YCDPNLGLRV (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú sz. 82–91. oldalláncai)

50

A SPOTs elemzésekkel azonosított lineáris epitópok a CD40 B1 modulban találhatók. A CD40 B1 moduljának a szekvenciája: HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú szekven60 cia 80–103. oldalláncai) 55

54

1

HU 007 240 T2

A CHIR–12.12 azonosított lineáris epitópjában található a C83 oldallánc. Ismert, hogy ez a cisztein diszulfidhidat alkot a C103-mal. Valószínû, hogy a CHIR–12.12 mAb konformációs epitópja tartalmazza ezt a diszulfidhidat (C83–C103) és/vagy a C103-hoz konformációsan közeli aminosavakat. 18. példa: A CP20- és CD40-molekulák száma Namalwa- és Daudi-sejteken A Namalwa- és Daudi-sejteken található CD20- és CD40-molekulák számát a 7. ábrán körvonalazott módon határoztuk meg 0,01, 0,1, 1, 10 és 100 mg/ml ellenanyag-koncentrációk alkalmazásával. Amint a 7. ábrán látható, a CD20-molekulák (a rituximab célpontja) átlagos száma nagyobb a Namalwa- és Daudi-sejtvonalakon egyaránt, mint a CD40-molekulák száma (a CHIR–12.12 mAb célpontja). 19. példa: A CHIR–12.12 mAb és Rituximab ADCC¹je Daudi-limfóma-sejtek ellen A rituximabot és CHIR–12.12 mAb-jelöltet in vitro teszteltük ADCC-aktivitásra különbözõ koncentrációkban a Daudi-limfóma-sejtvonallal célsejtekként (T) és egészséges humán önkéntesekbõl származó tisztított

5

10

15

20

2

NK¹sejtekkel effektor (E) sejtekként. Frissen izolált humán NK¹sejteket kevertünk össze kalceinjelzett Daudilimfóma-sejtekkel 10 értékû E:T arányban. A sejtkeveréket 4 órán keresztül inkubáltuk 37 °C¹on a CHIR–12.12 mAb vagy rituximab jelzett koncentrációinak jelenlétében. Mértük a lizált sejtekbõl a felülúszóba felszabadult kalcein szintjét „Arbitrary Fluorescent Unit”-ként (AFU). A specifikus százalékos lízist a következõképpen számítottuk ki: 100×(AFU teszt–AFU spontán felszabadulás)/(AFU maximális felszabadulás–AFU spontán felszabadulás), ahol az AFU spontán felszabadulás a célsejtek által felszabadított kalcein ellenanyag vagy NK¹sejtek hiányában, és az AFU maximális felszabadulás a célsejtek által detergens hatására felszabadított kalcein. A Daudi-sejtek ellenanyag-koncentráció függõ lízisét figyeltük meg (8. ábra és az alábbi 19. táblázat) A célpont limfómasejtek anti-CD40 mAb által indukált maximális specifikus lízise nagyobb volt, összehasonlítva a rituximab által indukált lízissel (63,6% vs. 45,9%, n=6; párosított t¹teszt CHIR–12.12 mAb vs. rituximab, p=0,0002). Emellett a rituximab ED50-értéke átlagosan (n=6) 51,6 pM volt, 13¹szor több, mint az antiCD40 CHIR 12.12 mAb ED50-értéke erre az aktivitásra.

19. táblázat A CHIR–12.12 mAb és Rituximab komparatív ADCC¹je Daudi-limfóma-sejtek ellen NK sejtdonor

Maximális elpusztítás (%)

ED50 (pM)

CHIR–12.12 mAb

Rituximab

CHIR–12.12 mAb

Rituximab

1.

50,2

34,9

3,2

14,2

2.

83,1

68,6

2,2

27,2

3.

64,2

36,9

4,1

66,9

4.

53,3

39,5

2,4

47,6

5.

74,8

56,6

2,8

24,1

6.

56,2

38,9

7,9

129,5

Átlag

63,6

45,9

3,8

51,6

20. példa: A CHIR–12.12 blokkolja a CD40Lközvetített CD40 túlélést és jeltovábbítási útvonalat normál humán B¹sejtekben Az oldható CD40-ligandum (CD40L) aktiválja a B¹sejteket és funkcionális válaszok különféle aspektusait indukálja, beleértve a túlélés és proliferáció fokozását, és az NFkB, ERK/MAPK, PI3K/Akt és p38 jeltovábbítási útvonalak aktiválását. Emellett a CD40L-közvetített CD40 stimuláció túlélési szignált biztosít a hasított PARP csökkentésével és az antiapoptotikus XIAP és Mcl–1 fehérjék indukálásával normál B¹sejtekben. A CD40L-közvetített CD40-stimuláció toborozza a TRAF2¹t és TRAF3¹at is a CD40 citoplazmatikus domén megkötésére. A következõ vizsgálatok azt demonstrálják, hogy a CHIR–12.12 közvetlenül gátolta ezen stimulációs hatások mindegyikét normál humán B¹sejteken. Például a CHIR–12.12 kezelés a kaszpáz-9, kaszpáz¹3 és PARP

45

50

55

60 55

megnövekedett hasítását, valamint az XIAP és Mcl–1 csökkenését eredményezte idõ- és dózisfüggõ módon, visszaállítva a B¹sejtek apoptózisát. A CHIR–12.12-vel történõ kezelés gátolta az IkB kináz (IKK) a és b (NFkB útvonal), ERK, Akt és p38 foszforilációját a CD40L-közvetített CD40-stimulációra adott válaszként. Ezenfelül azt találtuk, hogy a CHIR–12.12 nem váltotta ki ezeket az apoptotikus hatásokat a kezdeti CD40L-közvetített CD40 stimuláció nélkül. A CHIR–12.12 gátolta a CD40-ligandum által közvetített túlélést a PARP hasításának indukálásával Ezekben a kísérletekben 0,6×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-lel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Azután CHIR–12.12¹t (10 mg/ml) és kontroll IgG¹t

1

HU 007 240 T2

adtunk hozzá. A sejteket összegyûjtöttük 0, 20 perc, 2 óra, 6 óra, 18 óra és 26 óra múlva. Detektáltuk a hasított kaszpáz-9¹et, hasított kaszpáz-3¹at, hasított PARP¹t, és b¹aktin-kontrollokat a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, azt figyeltük meg, hogy a CD40L-közvetített CD40-stimuláció túlélési szignált biztosított, mivel nem eredményezte a hasított kaszpáz-9, hasított kaszpáz-3, vagy hasított PARP idõbeli megnövekedését, utalva arra, hogy a sejtek nem mentek át apoptózison. Azonban a kezelés CHIR–12.12-vel ezen hasított termékek megnövekedését eredményezte, utalva arra, hogy a CHIR–12.12 kezelés megszüntette a CD40Lkötõdés hatásait a túlélési szignálokra sCD40L-stimulált normál B¹sejtekben, visszaállítva a B¹sejt-apoptózist (adatokat nem közlünk). A CHIR–12.12 gátolta a „túlélési” antiapoptotikus fehérjék expresszióját Ezekben a kísérletekben 0,6×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-nel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Azután CHIR–12.12¹t (10 mg/ml) és kontroll IgG¹t adtunk hozzá. A sejteket összegyûjtöttük 0, 20 perc, 2 óra, 6 óra, 18 óra és 26 óra múlva. Detektáltuk az Mcl–1, XIAP, CD40 és b¹aktin kontrollokat a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, az sCD40L stimuláció az Mcl–1 és XIAP idõben fenntartott expresszióját eredményezte. Azonban az sCD40L-stimulált sejtek kezelése CHIR 12.12vel ezen fehérjék csökkentett expresszióját eredményezte idõvel (adatokat nem közlünk). Mivel az Mcl–1 és XIAP az apoptotikus útvonalak blokkolására képes „túlélési” szignálok, ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a CHIR–12.12 kezelés eltávolítja az apoptózis elleni blokkolást sCD40L-stimulált normál B¹sejtekben. A CHIR–12.12 kezelés gátolta az IKK a (Ser180) és IKK b (Ser 181) foszforilációját normál B¹sejtekben Ezekben a kísérletekben 1,0×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-nel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Azután CHIR–12.12¹t (10 mg/ml) és kontroll IgG¹t adtunk hozzá. A sejteket összegyûjtöttük 0 és 20 perc múlva. Detektáltuk a foszforilált IKK a (Ser180) és IKK b (Ser 181) és totál IKK b¹kontrollokat a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, az sCD40L stimuláció az IKK a (Ser180) és IKK b (Ser 181) foszforilációját eredményezte idõvel; azonban a kezelés CHIR–12.12-vel megszüntette ezt a választ az sCD40L-stimulációra normál B¹sejtekben (adatokat nem közlünk). A CHIR–12.12 kezelés gátolta a CD40-ligandum által közvetített túlélést dózisfüggõ módon Ezekben a kísérletekben 0,6×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (szá-

2

zalékos tisztaság 85–95% között) stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-lel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). Azután CHIR–12.12¹t (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 mg/ml) és kontroll IgG¹t adtunk hozzá. A sejteket 5 összegyûjtöttük 24 óra múlva. Detektáltuk a hasított PARP¹t és b¹aktin-kontrollokat a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, a CHIR–12.12 kezelés a PARP-hasítás megnövekedését eredményezte dózisfüggõ módon 10 sCD40L-stimulált sejtekben, és ezáltal megszüntette a túlélési jeltovábbítási útvonalat sCD40L-stimulált normál B¹sejtekben (adatokat nem közlünk). A CHIR–12.12 dózisfüggõ módon gátolta a „túlélési” antiapoptotikus fehérjék expresszióját Ezekben a kísérletekben 0,6×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-lel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, 20 UK). Azután CHIR–12.12¹t (0,5, 2 és 10 mg/ml) és kontroll IgG¹t adtunk hozzá. A sejteket összegyûjtöttük 22 óra múlva. Detektáltuk az Mcl–1, XIAP, hasított PARP és b¹aktin-kontrollokat a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, a CHIR–12.12 kezelés csökkentett 25 Mcl–1 és XIAP expressziót és megnövekedett hasított PARP-expressziót eredményezett dózisfüggõ módon sCD40L-stimulált sejtekben, és ily módon megszüntette az apoptotikus jeltovábbítási útvonal ilyen blokkolá30 sait sCD40L-stimulált normál B¹sejtekben (adatokat nem közlünk). 15

35

40

45

50

A CHIR–12.12 nem befolyásolta a hasított PARP és XI4P antiapoptotikus fehérjék expresszióját oldható CD40L jeltovábbítás hiányában Ezekben a kísérletekben 1,0×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) kezeltünk CHIR–12.12-vel (10 mg/ml) és kontroll IgG-vel (azaz a sejteket nem stimuláltuk elõre sCD40L-lel az ellenanyag hozzáadása elõtt). A sejteket összegyûjtöttük 0, 4, 14 és 16 óra múlva. Detektáltuk a XIAP, hasított PARP és b¹aktin-kontrollokat a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, az eredmények azt mutatják, hogy az sCD40L-stimulálás nélkül a sejtek hasított PARP megnövekedett koncentrációit expresszálták, míg a XIAP expressziója állandó maradt, az IgG-vel kezelt kontrollsejtekben és CHIR–12.12 sejtekben (adatokat nem közlünk). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a CHIR–12.12 nem vált ki apoptózist normál humán B¹sejtekben CD40L-stimuláció nélkül.

A CHIR–12.12 gátolja az IKK a (Ser180) és IKK b (Ser 181), Akt, ERK és p38 foszforilációját normál B¹sejtekben Ezekben a kísérletekben 1,0×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) szérum-éheztettünk 60 1% FBS¹t tartalmazó tápközegben és stimuláltunk 55

56

1

HU 007 240 T2

1 mg/ml sCD40L-lel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). A tenyészeteket CHIR–12.12-vel (1 és 10 mg/ml) és kontroll IgG-vel kezeltük. A sejteket összegyûjtöttük 0 és 20 perc múlva. Detektáltuk a foszfo-IKKa, foszfo-IKKb totál IKKb, foszfoERK, totál ERK, foszfo-Akt, totál Akt, foszfo-p38 és totál p38 szintjét a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, az sCD40L-stimuláció az IKKa/b foszforiláció, ERK-foszforiláció, Akt-foszforiláció és p38-foszforiláció megnövekedését eredményezte, ily módon a sejtek túléléséhez vagy proliferációjához vezetve. A sejtek kezelése CHIR–12.12-vel megszüntette az sCD40L-stimuláció hatásait ezekre a jeltovábbítási útvonalakra normál B¹sejtekben (adatokat nem közlünk). A CHIR 12.12 több jeltovábbítási útvonalat is, mint például PI3K és MEKIERK gátol a CD40jeltovábbítási kaszkádban Ezekben a kísérletekben 1,0×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) szérum-éheztettünk 1% FBS¹t tartalmazó tápközegben és stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-lel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). A tenyészeteket kezeltük CHIR–12.12vel (1 és 10 mg/ml), Wortmaninnal (ami egy PI3K/Akt inhibitor, 1 és 10 mM), LY 294002-vel (ami egy PI3K/Akt inhibitor; 10 és 30 mM) és PD 98095-tel (ami egy MEK-inhibitor, 10 és 30 mg/ml) is. A sejteket összegyûjtöttük 0 és 20 perc múlva. Detektáltuk a foszfoERK, foszfo-Akt, totál Akt, foszfo-IKKa/b és totál szintjét a sejtlizátumokban Western-blottal. Röviden, az eredmények azt mutatják, hogy a CHIR–12.12 megszüntette mindegyik jeltovábbítási molekula foszforilációját, míg a jeltovábbítási inhibitorok csak a jeltovábbítás specifikus megszüntetését mutatták, arra utalva, hogy a CHIR–12.12 valószínûleg a CD40L-stimulációval közvetített ezen jeltovábbítási molekuláktól „upstream” gátol (adatokat nem közlünk). A CHIR–12.12 gátolja a TRAF2 és TRAF3 jeltovábbító molekulák kötõdését a CD40 citoplazmatikus doménjéhez normál B¹sejtekben Ezekben a kísérletekben 4,0×106 egészséges humán donoroktól származó normál humán B¹sejtet (százalékos tisztaság 85–95% között) szérum-éheztettünk 1% FBS¹t tartalmazó tápközegben és stimuláltunk 1 mg/ml sCD40L-lel (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, UK). A sejteket összegyûjtöttük 0 és 20 perc múlva. A CD40¹et immunprecipitáltattuk poliklonális anti-CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA) alkalmazásával, és próbáztuk Western-blotban anti-TRAF2 mAbbal (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-TRAF3 mAbbal (Santa Cruz Biotechnology, CA), és antiCD40 mAb-bal (Santa Cruz Biotechnology, CA). Röviden, az eredmények azt mutatják, hogy a TRAF2 és TRAF3 együtt precipitálódik a CD40-nel az sCD40L-stimuláció után. Ezzel szemben a CHIR–12.12 kezelés megszüntette CD40-TRAF2/3 jeltovábbítási komplex sCD40L-stimulált normál B¹sejtekben.

2

A CD40 expressziója nem változott (adatokat nem közlünk). Anélkül hogy elméletileg korlátoznánk magunkat, ezen kísérletek eredményei, és a fenti példákban körvo5 nalazott eredmények arra utalnak, hogy a CHIR–12.12 ellenanyag kettõs hatású antagonista anti-CD40 monoklonális ellenanyag, amelynek sajátosságai egyedi kombinációt képviselnek. Ez a teljesen humán monoklonális ellenanyag blokkolja a CD40L-közvetített 10 CD40 jeltovábbítási útvonalakat a B¹sejtek túlélésére és proliferációjára; ez az antagonizmus végsõ soron sejthalálhoz vezet. A CHIR–12.12 közvetíti az effektorsejtek felismerését és kötõdését, megindítva az ellenanyag-függõ celluláris citotoxicitást (ADCC). Ha egy15 szer a CHIR–12.12 kötõdött az effektorsejtekhez, citolitikus enzimek szabadulnak fel, ami B¹sejt-apoptózishoz és lízishez vezet. A CHIR–12.12 hatásosabb daganatellenes ellenanyag, mint a rituximab, amikor preklinikai daganatmodellekben összehasonlítjuk. 20 21. példa: Agonista és antagonista aktivitás NHL, CLL és NM páciensekbõl származó primer ráksejtekkel szemben Klinikai kutatókkal együttmûködve a mAb-jelölteket 25 teszteljük különféle aktivitásokra (amint alább felsoroljuk) NHL és CLL és többszörös mieloma páciensekbõl származó primer ráksejtek ellen. – Agonista hatás proliferációs vizsgálati eljárásokban (8 NHL páciens, 8 CLL páciens és 8 MM páciens). 30 – Antagonista hatás proliferációs vizsgálati eljárásokban (8 NHL páciens, 8 CLL páciens és 8 MM páciens). – Apoptotikus hatás Annexin¹V vizsgálati eljárásokban (3–4 NHL páciens, 4 CLL páciens és 4 MM 35 páciens). – Túlélési szignál visszafordítása Annexin¹V vizsgálati eljárással (3 NHL páciens, 3 CLL páciens és 3 MM páciens). – Komplementfüggõ citotoxicitás (4 NHL páciens, 40 4 CLL páciens és 4 MM páciens). – Ellenanyagfüggõ citotoxicitás (6 NHL páciens, 6 CLL páciens és 6 MM páciens). 22. példa: Releváns állatfajok azonosítása toxicitási vizsgálatokhoz Mivel ez a két ellenanyagjelölt nem keresztreagál rágcsáló CD40-nel, más fajokat kell azonosítani a toxikológiai hatások tesztelésére. A két anti-CD40 ellenanyagjelölt állati CD40-nel 50 való keresztreagáló képességét áramlási citometriás vizsgálati eljárásokkal teszteljük. Patkányt, nyúlat, kutyát, cynomolgus makákókat és közönséges selyemmajmokat tesztelünk ebben a vizsgálatban. Az ellenanyagjelöltek antagonista aktivitást mutat55 nak CD40-hez való kötés hatására humán B¹sejteken. Olyan állatfaj azonosításához, amely hasonlóképpen reagál az ellenanyagjelöltekre, az ellenanyagjelöltek kötését mutató fajból származó limfocitákat tesztelünk 60 proliferációs vizsgálati eljárásokban antagonista aktivi45

57

1

HU 007 240 T2

tásra. Az ellenanyagjelöltek antagonista kötésére kiválasztott fajokból származó limfocitákat tovább teszteljük azon képességükre, hogy effektorsejtekként szolgálnak¹e CD40¹et expresszáló limfómasejtvonalak elpusztításában ADCC-mechanizmus útján. Végül a kiválasztott állatfajokat teszteljük IHC-vizsgálatban az ellenanyagjelölt szövetkötési mintázatára. Az ellenanyagjelölekre a humán sejtek esetében megfigyelthez hasonló módon reagáló állatfajokat választjuk ki toxikológiai vizsgálatokhoz. A kezdeti vizsgálatok azt mutatják, hogy az antiCD40 mAb-jelöltek keresztreagálnak cynomolgus makákók CD40-éveI. 23. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 daganatcélzó profilja A CHIR–12.12 és CHIR–5.9 mAb¹ok relatív daganatcélzó profiljának meghatározására fluoreszcens jelzett mAb-jelölteket és izotípus kontroll ellenanyagokat adunk be daganatot hordozó egereknek. Daganatmintákat és normál szerveket gyûjtünk be különbözõ idõpontokban az adagolás után. Elemezzük a jelzett ellenanyag daganatokban és normál szervekben történõ felhalmozódását.

150 mM nátrium-kloridban és körülbelül pH=5,5 értékû pH¹n van kiszerelve.

5

10

15

20

25 24. példa: A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 hatásmechanizmusa A CHIR–5.9 és CHIR–12.12 mAb¹ok daganatnövekedést közvetítõ mechanizmusá(ai)nak megvilágítására a következõ vizsgálatokat hajtjuk végre: Fc-receptor „knock-out” vagy blokkolási modell: Az ADCC¹t effektorsejtek, mint például NK, makrofág és monociták közvetítik az ellenanyag Fc¹részletéhez az Fc receptoron keresztül. Aktiváló Fc receptorokra deficiens egerek, valamint ezen receptorok Fc¹kötésének megzavarására szolgáló ellenanyagok blokkolják az ADCC által közvetített daganatnövekedést-gátlást. Ebben a modellben az elveszett vagy szignifikánsan csökkent daganatgátlás arra utal, hogy a két mAb-jelölt daganatnövekedés-gátlását fõleg az ADCC mechanizmus közvetíti. 25. példa: Antagonista anti-CD40 ellenanyagok folyékony gyógyászati kiszerelése Ezen vizsgálat célja az oldat pH¹ja hatásának vizsgálata volt az antagonista anti-CD40 CHIR–12.12 ellenanyag stabilitására biofizikai és biokémiai eljárásokkal, hogy kiválasszuk az ellenanyag számára optimális oldat körülményeket. Differenciális szkennelõ kalorimetriás (DSC) eredmények azt mutatták, hogy a CHIR¹12.12 konformációs stabilitása 5,5–6,5 pH¹jú kiszerelésekben optimális. SDS-PAGE, méretkizárásos HPLC (SEC–HPLC) és kationcserélõ HPLC (CEX¹HPLC) elemzések kombinációja alapján a CHIR–12.12 Fizikai-kémiai stabilitása körülbelül 5,0–5,5 pH¹n optimális. Ezen eredmények tükrében az ezt az ellenanyagot tartalmazó egy javasolt folyékony gyógyászati kiszerelés a CHIR–12.12¹t körülbelül 20 mg/ml koncentrációban tartalmazó kiszerelés, amely körülbelül 10 mM nátrium-szukcinátban,

2

Anyagok és eljárások A kiszerelési vizsgálatokban alkalmazott CHIR–12.12 ellenanyag CHO-sejt-tenyésztési folyamatban elõállított humán monoklonális ellenanyag. Ennek a mAb-nak a molekulatömege 150 kDa, és két könnyû láncból és két nehéz láncból áll, amelyeket diszulfidhidak kötnek össze. A CD40 felszíni receptort célozza CD40¹et expresszáló sejteken, beleértve normál és rosszindulatú B¹sejteket, különféle rákok és autoimmun/gyulladásos betegsége kezelésére. Az erre vizsgálatra alkalmazott anti-CD40 hatóanyag CHO-eredetû tisztított anti-CD40 (CHIR–12.12) nagy mennyiségben gyártott mintája volt. A hatóanyagkészítmény 9,7 mg/ml CHIR–12.12 ellenanyag volt 10 mM nárium-citrátban, 150 mM nátrium-kloridban, pH=6,5¹en. A vizsgálatban a kontrollminta a kapott hatóanyag volt, lefagyasztva £ –60 °C¹on, felolvasztva szobahõmérsékleten, és együtt tesztelve a stabilitási mintákkal elõre meghatározott idõpontokban. A stabilitási mintákat a hatóanyag dialízisével állítottuk elõ különbözõ pH¹jú oldatokkal szemben, és a CHIR–12.12 koncentrációját mindegyik mintában UV 280 értékként határoztuk meg, amint a 20. táblázatban bemutatjuk. 20. táblázat CHIR–12.12-kiszerelések

30

35

40

45

50

Puffer összetétele

pH

CHIR–12.12koncentráció (mg/ml)

10 mM nátrium-citrát, 150 mM nátrium-klorid

4,5

9,0

10 mM nátrium-szukcinát, 150 mM nátrium-klorid

5,0

9,3

10 mM nátrium-szukcinát, 150 mM nátrium-klorid

5,5

9,2

10 mM nátrium-citrát, 150 mM nátrium-klorid

6,0

9,7

10 mM nátrium-citrát, 150 mM nátrium-klorid

6,5

9,4

10 mM nátrium-foszfát, 150 mM nátrium-klorid

7,0

9,4

10 mM nátrium-foszfát, 150 mM nátrium-klorid

7,5

9,5

10 mM glicin, 150 mM nátrium-klorid

9,0

9,5

A CHIR–12.12 ellenanyag fizikai-kémiai stabilitását a különbözõ kiszerelésekben a következõ protokollokkal vizsgáltuk. 55 Differenciális szkennelõ kalorimetria (DSC) A különbözõ kiszerelési minták konformációs stabilitását MicroCal VP¹DSC alkalmazásával monitoroztuk 15 °C¹ról 90 °C¹ra történõ felmelegítés közben 60 1 °C/perc sebesség mellett. 58

1

HU 007 240 T2

SDS-PAGE A fragmentációt és aggregációt 4–20%¹os Tris-Glicin géllel becsültük meg nem redukáló és redukálókörülmények között. A fehérjét Coomassie-blue festéssel detektáltuk. Méretkizárásos kromatográfia (SEC–HPLC) A fehérjefragmentációt és ¹aggregációt mértük Water Alliance HPLC készülékkel is Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL oszloppal, 100 mM nátrium-foszfát, pH=7,0 pufferrel mozgó fázisként 0,7 ml/min folyási sebességgel. Kationcserélõ kromatográfia (CEX¹HPLC) A töltésváltozással kapcsolatos degradációt Waters 600s HPLC rendszerrel mértük Dionex Propac WCX–10 oszloppal, 50 mM HEPES, pH=7,3 pufferrel A mozgó fázisként, és 50 mM HEPES 500 mM NaCl, pH=7,3 pufferrel B mozgó fázisként 0,5 °C/perc folyási sebességgel. Eredmények és diszkusszió Konformáció stabilitási vizsgálatok A CHIR–12.12 termális kitekeredése legalább két termális átmenetet tárt fel valószínûleg az Fab- és az Fc¹domének olvadási kitekeredése miatt. Magasabb hõmérsékleteken a fehérje feltehetõleg aggregálódott, ami a DSC jel elvesztését eredményezte. A kiszerelési szkrínelés céljára a legalacsonyabb termális átmeneti hõmérsékletet definiáltuk az olvadási hõmérsékletként (Tm) ebben a vizsgálatban. A 13. ábra mutatja az olvadási hõmérsékletet a kiszerelés pH¹ja függvényében. A pH=5,5–6,5 közötti kiszerelések esetében az antiCD40-nek magasabb volt a konformációs stabilitása, amint azt a magasabb termális olvadási hõmérsékletek jelezték. SDS¹PA GE elemzés A pH=4,5–9,0 értékû CHIR–12.12 kiszerelési mintákat 40 °C¹on inkubáltuk 2 hónapon keresztül és SDSPAGE elemzéssel vizsgáltuk (adatokat nem közlünk).

2

Nem redukáló körülmények között 23 kDa és 27 kDa molekulatömegû (MW) csíkokat figyeltünk meg a pH=5,5 feletti mintákban, és a 51 kDa MW méretût mindegyik kiszerelésben, de az kevésbé tûnt fel a 5 pH=5,0–5,5 között. Egy 100 kDa méretû csíkot láttunk pH=7,5 és pH=9,0 értéken. Redukálókörülmények között a CHIR–12.12 szabad nehéz láncra és könnyû láncra redukálódott 50 kDa és 24 kDa MW mérettel. A 100 kDa méretû csík 10 látszólag nem volt teljesen redukálható, és növekedett az oldat pH¹jának emelkedésével, ami arra utal, hogy nem diszulfidos kovalens asszociáció történhet a molekulákban. Mivel más azonosítatlan csíkok is voltak az SDS-PAGE¹n, az egyes kiszerelések stabilitásának az 15 összehasonlítását a CHIR–12.12 megmaradó tisztaságára alapoztuk. A pH=5,0–6,0 érték biztosított a stabilabb körülményeket a CHIR–12.12 számára. Kevés aggregátumot detektáltunk SDS-PAGE-val (adatokat nem közlünk). 20 SEC–HPLC elemzés A SEC–HPLC elemzés az intakt CHIR–12.12¹t detektálta fõ csúcsként, egy aggregált formát elõcsúcsként elválva a fõcsúcstól, egy nagy fragmensformát 25 vállcsúcsként a fõcsúcs hátsó felénél, és egy kis fragmenscsúcsot a fõcsúcsot követõen. 5 °C¹on és 25 °C¹on történõ 3 hónapos inkubáció után elhanyagolható mennyiségû fehérjefragmenst és ¹aggregátumot (<1,0%) detektáltunk a fenti kiszerelésekben és 30 CHIR–12.12 fõ csúcsa több mint 99% tisztaságú maradt (adatokat nem közlünk). Azonban fokozatosan fehérjefragmensek alakultak ki 40 °C¹on történõ tárolás hatására, és több fragmens alakult ki pH=4,5 és pH=6,5–9,0 értéken, amint a 21. táblázatban bemutat35 juk. A CHIR–12.12 kiszerelések 40 °C¹on történõ 3 hónapos inkubálása után körülbelül 2–3% aggregátumot detektáltunk pH=7,5 és pH=9,0 értéken, míg kevesebb mint 1% aggregátumot detektáltunk más pH¹jú kiszerelésekben (adatokat nem közlünk). A SEC–HPLC ered40 mények arra utalnak, hogy a CHIR–12.12 stabilabb körülbelül pH=5,0–6,0 értéken.

21. táblázat A CHIR–12.12 stabilitási minták SEC–HPLC eredményei valós idejû és gyorsított tárolási körülmények között Minta

Fõ csúcs %

Fragmensek %

t=0

40 °C 1 m

40 °C 2 m

40 °C 3 m

t=0

40 °C 1 m

40 °C 2 m

40 °C 3 m

kontroll

99,4

99,2

99,9

99,5

<1,0

<1,0

<1,0

<1,0

pH=4,5

99,4

93,2

86,0

81,3

<1,0

6,4

13,2

18,1

pH=5,0

99,8

98,7

91,3

89,2

<1,0

<1,0

7,8

10,2

pH=5,5

99,8

98,9

91,4

90,6

<1,0

<1,0

7,6

8,8

pH=6,0

99,6

97,7

90,4

87,3

<1,0

1,9

8,2

11,7

pH=6,5

99,3

93,4

89,0

86,9

<1,0

5,6

9,9

12,4

pH=7,0

99,2

93,9

87,4

85,1

<1,0

5,5

11,1

13,5

pH=7,5

99,1

92,8

84,4

81,9

<1,0

6,4

12,9

16,2

pH=9,0

99,3

82,4

61,6

50,6

<1,0

15,4

36,2

47,6

59

1

HU 007 240 T2

CEX-FIPLC elemzés A CEX¹HPLC elemzés az intakt CHIR–12.12¹t detektálta fõ csúcsként, a savas variánsok a fõ csúcs elõtt és a C¹terminális lizinaddíciós variánsok a fõ csúcs után eluálódtak. A 22. táblázat a megmaradó CHIR–12.12 fõ csúcs és savas variánsok százalékos arányának függését mutatja az oldat pH¹ja függvényében. A kontrollminta már nagy mennyiségû savas formát tartalmazott (–33%), valószínûleg a korábbi fermentációs és tisztítási folya-

5

2

matok miatt. A CHIR–12.12 magasabb pH¹jú oldatokban való érzékenységét két tény mutatta. Elõször, a kezdeti minta pH=9,0 értéken (t=0) már 12%-kal több savas formát eredményezett, mint a kontroll. Másodszor, a savas formák százalékos aránya erõsen növekedett a pH=növekedésével. A töltésváltozás-függõ degradáció valószínûleg a dezamidáció miatt van. A fenti adatok arra utalnak, hogy a CHIR–12.12 ilyen típusú degradációja minimális volt körülbelül pH=5,0–5,5 értéken.

22. táblázat A CHIR–12.12 százalékos csúcsterülete CEX¹HPLC-vel különbözõ pH¹jú kiszerelésekben valós idejû és gyorsított tárolási körülmények között Minta

Fõ csúcs %

Savas forma %

t=0

5 °C 3 m

25 °C 3 m 40 °C 1 m 40 °C 2 m

t=0

5 °C 3 m

kontroll

49,2

49,8

49,8

49,2

pH=4,5

48,5

49,7

43,7

pH=5,0

49,6

49,8

pH=5,5

50,7

pH=6,0

50,3

32,0

33,7

33,7

32,0

33,6

39,7

30,0

32,5

32,6

38,0

44,2

56,4

48,3

40,6

31,4

32,7

31,8

35,0

44,3

57,1

50,3

48,1

40,0

30,2

32,6

31,8

37,8

48,9

63,3

50,2

49,9

47,9

37,4

23,9

33,1

33,6

38,5

54,9

72,7

pH=6,5

49,4

49,9

42,3

29,7

14,6

33,3

33,6

47,7

65,2

84,6

pH=7,0

49,7

49,9

21,9

–

–

34,4

36,4

64,4

–

–

pH=7,5

49,3

48,3

12,7

–

–

35,5

40,1

79,2

–

–

pH=9,0

41,3

31,8

–

–

–

44,7

59,9

–

–

–

Konklúzió A pH¹nak szignifikáns hatása van a CHIR–12.12 konformációs és fizikai-kémiai stabilitására. A töltésvál- 35 tozás-függõ degradációt határoztuk meg a fõ degradációs útvonalként a CHIR–12.12 esetében, ami minimalizálható pH=5,0–5,5 értéken. Az általános stabilitási adatok tükrében az ezt az ellenanyagot tartalmazó egy javasolt folyékony gyógyászati kiszerelés a 40 CHIR–12.12¹t körülbelül 20 mg/ml koncentrációban tartalmazó kiszerelés, amely körülbelül 10 mM nátriumszukcinátban, körülbelül 150 mM nátrium-kloridban és körülbelül pH=5,5 értékû pH¹n van kiszerelve. 45 26. példa: CHIR–5.9 és CHIR–12.12 klinikai vizsgálatok Klinikai célok Az általános cél hatékony terápia biztosítása B¹sejtes daganatokra azok anti-CD40 IgG1 ellenanyaggal 50 való célzásával. Ezen tumorok közé tartozik a B¹sejtlimfóma, Krónikus limfocitikus limfóma (CLL), Akut limfoblasztikus leukémia (ALL), multiplex mielóma (MM), Waldenstrom-féle makroglobulinémia és szisztémás Castleman-betegség. Ezen betegségek szignálját a II. 55 fázisban határozzuk meg, habár az aktivitás bizonyos szintjét elérhetjük az I. fázisban is. Kezdetben az ágenst egyedi ágensként vizsgáljuk, de más ágensekkel, kemoterápiákkal és ellenanyagokkal is kombinál60 juk, amint a fejlesztés elõrehalad. 60

25 °C 3 m 40 °C 1 m 40 °C 2 m

I. fázis – A biztonságosság és farmakokinetika értékelése – dózisemelés B¹sejtes rosszindulatú betegségekben szenvedõ alanyokban. – Dózis kiválasztása a biztonságosság, tolerálhatóság és a CD40 szérummarkereinek változása alapján. Általában MTD¹re törekszünk, de a hatásosság más indikációi (CD40+ B¹sejtek depléciója stb.) is megfelelõek lehetnek a dózis megtalálására. – Egynél több dózis megfontolása, különösen különbözõ indikációkra, például a CLL dózis eltérhet az NHL-étõl. Ily módon szükség lehet dóziskeresésre a II. fázisban is. – A pácienseket hetente kezeljük valósidejû farmakokinetikai (Pk) mintavételezéssel. Kezdetben 4 hetes ciklus a megengedett maximális dózis. A Pk erõsen változhat a tanulmányozott betegségtõl, a CD40 sûrûségétõl stb. függõen. – Ez(ek) a vizsgálat(ok) nyitott(ak) B¹sejtes limfómában, CLL-ben és potenciálisan más B¹sejtes rosszindulatú betegségben szenvedõ páciensek számára. – Döntés a vizsgálat megszakításáról vagy folytatásáról, a biztonságosság, dózis, és a daganatellenes aktivitás elõzetes bizonyítékai alapján. – A hatóanyag aktivitását a II. fázisban határozzuk meg, a válaszadás aránya alapján. – A dózis(ok) azonosítása a II. fázis számára.

1

HU 007 240 T2

II. fázis Számos vizsgálatot kezdeményezünk a fent említett daganattípusokban, koncentrálva a B¹sejtes limfómára, CLL¹re és multiplex mielómára (MM). Különálló vizsgálatokra van szükség alacsony fokozatú és közepes/magas fokozatú NHL esetében, mivel a CD40-nek különbözhet a funkciója a limfóma fokozatától függõen. Az alacsony fokozatú betegségben a CD40 inkább túlélési faktorként hat, megakadályozva az apoptózist. A magasabb fokozatú betegségben a CD40-jeltovábbítás megszakítása sejthalálhoz vezethet. Egynél több dózist és egynél több adagolási rendet tesztelhetünk randomizált II. fázisos elrendezésekben. Mindegyik betegségben olyan populációt célzunk meg, amelyben a jelenlegi standard ellátás sikertelen volt: – CLL: olyan páciensek, akik rezisztensek voltak Campath®¹ra és kemoterápiára. – Alacsony fokozatú NHL: Rituxan® vagy CHOP¹R kudarca.

5

2

– Közepes fokozatú NHL: CHOP¹R kudarca. – Multiplex mielóma: Kemoterápia kurdarca. – Döntés a vizsgálat megszakításáról vagy folytatásáról, a terápiás koncepció II. fázisbeli igazolása alapján. – Annak meghatározása, hogy alkalmazhatunk¹e helyettesítõ markert a klinikai hatásosság korai markereként. – A dózisok azonosítása a III. fázis számára.

10 III. fázis A III. fázis attól függ, hogy detektáltunk¹e szignált a II. fázisban, és milyen versengõ terápiákat tekinthetünk standardnak. Ha a szignál a betegség azon stá15 diumában van, ahol nincs standard terápia, akkor egykarú, kontrollált vizsgálat szolgálhat döntõ vizsgálatként. Ha vannak versengõ, standardnak tekinthetõ ágensek, akkor fej-fej melleti vizsgálatokat végzünk. 20

A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása <210> 1 <223> A 12.12 humán anti-CD40 ellenanyag könnyû láncának kódolószekvenciája <210> 2 <223> A 12.12 humán anti-CD40 ellenanyag könnyû lánca <210> 3 <223> A 12.12 humán anti-CD40 ellenanyag nehéz láncának kódolószekvenciája (intronokkal) <210> 4 <223> A 12.12 humán anti-CD40 ellenanyag nehéz lánca <210> 5 <223> A variáns 12.12 humán anti-CD40 ellenanyag nehéz lánca <210> 6 <223> Az 5.9 humán anti-CD40 ellenanyag könnyû lánca <210> 7 <223> A 5.9 humán anti-CD40 ellenanyag nehéz lánca <210> 8 <223> A variáns 5.9 humán anti-CD40 ellenanyag nehéz lánca <210> 9 <223> A humán CD40 rövid izoformájának kódolószekvenciája <210> 11 <223> A humán CD40 hosszú izoformájának kódolószekvenciája

61

HU 007 240 T2

62

HU 007 240 T2

63

HU 007 240 T2

64

HU 007 240 T2

Szekvencialista <110> Chen, Bao¹Lu Hurst, Deborah Lee, Sang Hoon Long, Li Lu, Xiaofeng Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel <120> Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use <130> PP20107.004 (282916) <150> 60/565,710 <151> 2004–04–27 <150> 60/525,579 <151> 2003–11–26 <150> 60/517,337 <151> 2003–11–04 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for light chain of 12.12 human anti-CD40 antibody <221> CDS <222> (1)…(720) <400> 1

atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtc tct Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15

48

gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30

96

gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tcc agt cag agc Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45

144

ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60

192

cca ggg cag tct cca cag gtc ctg atc tct ttg ggt tct aat cgg gcc Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80

240

65

HU 007 240 T2

tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

288

aca ctg aaa atc agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110

336

tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125

384

gtg gat atc aga cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140

432

cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160

480

ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175

528

aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190

576

agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205

624

gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220

672

ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys * 225 230 235

720

<210> 2 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 12.12 human anti-CD40 antibody <400> 2

Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45

66

HU 007 240 T2

Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 2016 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding sequence for heavy chain of 12.12 human anti-CD40 antibody (with introns) <400> 3

atg gtc cct agt gag gac acg tat tgg cca aca acg ccg acc

gag cag ggg agc tgg tcc ctg tac ggc tcc gcg gtg gct gtg

ttt tgt agg tat gtg gtg tat tgt cag gtc gcc tcg gtc ccc

ggg cag tcc ggc gca aag ctg gcg gga ttc ctg tgg cta tcc

ctg gtg ctg atg gtt ggc caa aga acc ccc ggc aac cag agc

agc cag aga cac ata cga atg gat ctg ctg tgc tca tcc agc

tgg ttg ctc tgg tca ttc aac ggg gtc gcg ctg ggc tca ttg

gtt gtg tcc gtc tat acc agc ggt acc ccc gtc gcc gga ggc

ttc gag tgt cgc gag atc ctc ata gtc gct aag ctg ctc acc

ctt tct gca cag gaa tcc aga gca tcc agc gac acc tac cag 67

gtt ggg gcc gct agt aga act gca tca aag tac agc tcc acc

gct gga tct cca aat gac gag cct gca agc ttc ggc ctc tac

att ggc gga ggc aga aat gac ggg agt acc ccc gtg agc atc

tta gtg ttc aag tac tcc acg cct acc tct gaa cac agc tgc

aga gtc acc ggg cat aag gct gac aag ggg ccg acc gtg aac

ggt cag ttc ctg gca atc gtg tac ggc ggc gtg ttc gtg gtg

48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672

HU 007 240 T2

aat cca tgc agg gct cag tgg cct cct gcc gcc agt cct tcc ctg tca caa tcc gca cca ggc tct cca gtc ggg gac tgg cac

cac gca ctg ccc cag gct gct aag tct caa agc agc cca tct agg agt agc tca agg aag cgg gtc tcc aaa cag ggc cag aac

aag cag gac cgt gga agg cag ccc ctc atc cca ctg tct tcc tca tca cgc ccg tct cca ctc cct cgg ggc ccg tcc cag cac

ccc gga gca ctg gag tgc acc acc ctc ttg ggc cat ctt ccc cat act ggg tcc cca aag ggc aca gag ttc gag ttc ggg tac

agc ggg tcc cct ggt ccc tgc cca cca tga ctc cca cct caa gcg ggt agg tgc aca gtg cca ggg gag tat aac ttc aac acg

aac agg cgg ctt ctt taa caa aag gat caa gcc ggg cag aac tgg acg agc acc aag gga ccc cag atg ccc aac ctc gtc cag

acc gtg cta cac ctg ccc gag gcc tcc aac ctc aca cac cca tgg tgg agt agg ccc ccc tct ccc acc agc tac tat ttc aag

aag tct tgc ccg gct agg cca aaa agt tca cag ggc ctg agg tgg acg aca act tcc gtg gcc cga aag gac aag agc tca agc

gtg gct agt gag ttt ccc tat ctc aac cac ctc ccc aac aca acg gcg aca ggc cag ggg ctg gaa aac atc acc aag tgc ctc

gac gga ccc gcc tcc tgc ccg tcc tcc atg aag agc tcc ccc tga tgg gca tga ccc tgc aga cca cag gcc acg ctc tcc tcc

aag agc agt tct cca aca gga act caa ccc gcg cgg tgg tca gcc agg cgt atg cca gag gtg cag gtc gtg cct acc gtg ctg

aga cag cca gcc ggc caa gga ccc tct acc gga gtg ggg tga acg tgc acc gca tcg ggc acc gtg agc gag ccc gtg atg tct

gtt gct ggg cgc tct agg ccc tca tct gtg cag ctg gac tct aag ata gtg agg aga cac gct tac ctg tgg gtg gac cat ccg

ggt cag cag ccc ggg ggc tgc gct ctc ccc gtg aca cgt ccc acc atg tgg agt aaa atg gta acc acc gag ctg aag gag ggt

gag cgc caa act cag agg ccc cgg tgc agg ccc cgt cag gga ctg cca tca aca cca gac cca ctg tgc agc gac agc gct aaa

agg tcc ggc cat gca tgc tga aca aga taa tag cca tct ccc agg aga gcg agt tct aga acc ccc ctg aat tcc agg ctg tga

<210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 12.12 human anti-CD40 antibody <400> 4

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

68

720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392 1440 1488 1536 1584 1632 1680 1728 1776 1824 1872 1920 1968 2016

HU 007 240 T2

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Phe Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430

69

HU 007 240 T2

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of variant of 12.12 human anti-CD40 antibody <400> 5

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 70

HU 007 240 T2

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 360 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Aan Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of 5.9 human anti-CD40 antibody <400> 6

Met Ala Leu Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 71

HU 007 240 T2

Gly Ser Ser Gly Ala Ile Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Ser Pro 20 25 30 Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Val Thr Gln Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Aap Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Aep Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of 5.9 human anti-CD40 antibody <400> 7

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 72

HU 007 240 T2

Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365

73

HU 007 240 T2

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Pho Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 8 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of variant of 5.9 human anti-CD40 antibody <400> 8

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 35 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Aap Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr tle Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Aap Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 74

HU 007 240 T2

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

75

HU 007 240 T2

<210> 9 <211> 612 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)…(612) <221> misc_feature <222> (0)…(0) <223> Coding sequence for short isoform of human CD40 <400> 9

atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15

48

gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30

96

ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45

144

agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60

192

agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80

240

aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95

288

tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110

336

agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125

384

ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140

432

ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160

480

tgt cac cct tgg aca agg tcc cca gga tcg gct gag agc cct ggt ggt Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 165 170 175

528

76

HU 007 240 T2

gat ccc cat cat ctt cgg gat cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct ggt Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190

576

ctt tat caa aaa ggt ggc caa gaa gcc aac caa taa Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln * 195 200

612

<210> 10 <211> 203 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly 165 170 175 Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln 195 200 <210> 11 <211> 834 <212> DNA <213> Homo sapiens

77

HU 007 240 T2

<220> <221> CDS <222> (1)… (834) <221> misc_feature <222> (0)…(0) <223> Coding sequence for long isoform of human CD40 <400> 11

atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctg acc Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15

48

gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag tac cta Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30

96

ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45

144

agt gac tgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60

192

agc gaa ttc cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80

240

aaa tac tgc gac ccc aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95

288

tca gaa aca gac acc atc tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110

336

agt gag gcc tgt gag agc tgt gtc ctg cac cgc tca tgc tcg ccc ggc Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125

384

ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tct gat acc atc tgc gag Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140

432

ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tca tct gct ttc gaa aaa Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160

480

tgt cac cct tgg aca agc cgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175

528

gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggt ccc cag gat cgg ctg Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190

576

78

HU 007 240 T2

aga gcc ctg gtg gtg atc ccc atc atc ttc ggg atc ctg ttt gcc atc Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205

624

ctc ttg gtg ctg gtc ttt atc aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220

672

aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag atc aat ttt ccc gac Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240

720

gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act tta cat Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ua Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255

768

gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atc tca Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270

816

gtg cag gag aga cag tga Val Gln Glu Arg Gln * 275

834

<210> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 79

1

HU 007 240 T2

2

Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Humán monoklonális ellenanyag, amely képes specifikusan kötõdni humán CD40¹et expresszáló sejt felszínén expresszált humán CD40-antigénhez, amely monoklonális ellenanyag mentes szignifikáns agonista aktivitástól, miáltal amikor a monoklonális ellenanyag kötõdik a sejt felszínén expresszált CD40-antigénhez, a sejt növekedése vagy differenciálódása gátolt, ahol az ellenanyag a következõk által alkotott csoportból van kiválasztva: a) monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely képes az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5542 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag vagy az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5543 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag kötésére; b) monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú szekvencián bemutatott CD40 szekvencia 82–87. oldalláncait; c) monoklonális ellenanyag, amely olyan epitóphoz kötõdik, amely tartalmazza a SEQ ID NO:10 vagy SEQ ID NO:12 azonosító számú szekvencián bemutatott CD40 szekvencia 82–89. oldalláncait; és d) monoklonális ellenanyag, amely verseng az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5542 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ CHIR–5.9 monoklonális ellenanyaggal vagy az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5543 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ CHIR–12.12 monoklonális ellenanyaggal.

30

35

40

45

50

55

60 80

2. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol az ellenanyag az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5542 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ CHIR–5.9 monoklonális ellenanyag és az ATCC-nél letétbe helyezett, PTA–5543 szabadalmi letéti számú hibridóma sejtvonalból nyerhetõ CHIR–12.12 monoklonális ellenanyag által alkotott csoportból van kiválasztva. 3. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol az ellenanyag a következõk által alkotott csoportból kiválasztott monoklonális ellenanyag: (i) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ 1D NO:2 azonosító számú szekvencia 44–54., 70–76. és 109–117. oldalláncait tartalmazó könnyû lánc variábilis domént tartalmaz; (ii) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia 50–54., 69–84. és 114–121. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; (iii) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvencia 50–54., 69–84. és 114–121. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; (iv) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 44–54., 70–76. és 109–117. oldalláncait tartalmazó könnyû lánc variábilis domént tartalmaz; (v) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia 50–54., 69–84. és 114–121. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; és (vi) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvencia 50–54., 69–84. és

1

HU 007 240 T2

114–121. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; vagy a következõk által alkotott csoportból kiválasztott monoklonális ellenanyag: (i) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia 46–52., 70–72. és 111–116. oldalláncait tartalmazó könnyû lánc variábilis domént tartalmaz; (ii) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia 45–51., 72–74. és 115–120. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; (iii) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvencia 45–51., 72–74. és 115–120. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; (iv) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 46–52., 70–72. és 111–116. oldalláncait tartalmazó könnyû lánc variábilis domént tartalmaz; (v) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia 45–51., 72–74. és 115–120. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; és (vi) monoklonális ellenanyag, amely a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvencia 45–51., 72–74. és 115–120. oldalláncait tartalmazó nehéz lánc variábilis domént tartalmaz; 4. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol az ellenanyag a következõk által alkotott csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmazó monoklonális ellenanyag: (i) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia 21–132. oldalláncai; (ii) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia 21–239. oldalláncai; (iii) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia; (iv) a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia 20–139. oldalláncai; (v) a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia 20–469. oldalláncai; (vi) a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia; (vii) a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvencia 20–469. oldalláncai; (viii) a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvencia; (ix) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia 21–132. oldalláncai és a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia 20–139. oldalláncai; (x) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia 21–239. oldalláncai és a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia 20–469. oldalláncai; (xi) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia 21–239. oldalláncai és a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvencia 20–469. oldalláncai; (xii) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia és a SEQ ID NO:4 azonosító számú szekvencia; és (xiii) a SEQ ID NO:2 azonosító számú szekvencia és a SEQ ID NO:5 azonosító számú szekvencia. 5. Az 1. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol az ellenanyag a következõk által alkotott

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 81

2

csoportból kiválasztott aminosavszekvenciát tartalmazó monoklonális ellenanyag: (i) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 21–132. oldalláncai; (ii) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 21–239. oldalláncai; (iii) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia; (iv) a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia 20–144. oldalláncai; (v) a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia 20–144. oldalláncai; (vi) a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia; (vii) a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvencia 20–474. oldalláncai; (viii) a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvencia; (ix) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 21–132. oldalláncai és a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia 20–144. oldalláncai; (x) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 21–239. oldalláncai és a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia 20–474. oldalláncai; (xi) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia 21–239. oldalláncai és a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvencia 20–474. oldalláncai; (xii) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia és a SEQ ID NO:7 azonosító számú szekvencia; és (xiii) a SEQ ID NO:6 azonosító számú szekvencia és a SEQ ID NO:8 azonosító számú szekvencia. 6. Bármelyik elõzõ igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol a monoklonális ellenanyag a humán CD40-antigénhez legalább 10–6 M affinitással (KD) kötõdik. 7. A 6. igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol a monoklonális ellenanyag a humán CD40-antigénhez legalább 10–8 M affinitással (KD) kötõdik. 8. Bármelyik elõzõ igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol a monoklonális ellenanyag egy monoklonális ellenanyag antigénkötõ fragmense, ahol a fragmens megtartja a humán CD40-antigénhez való specifikus kötõdés képességét. 9. A 8. igénypont szerinti antigénkötõ fragmens, ahol a fragmens az Fab fragmens, F(ab’)2 fragmens, Fv fragmens és egyláncú Fv fragmens által alkotott csoportból van kiválasztva. 10. Bármelyik elõzõ igénypont szerinti monoklonális ellenanyag, ahol a monoklonális ellenanyag CHO-sejtvonalban van termeltetve. 11. Izolált nukleinsavmolekula, amely bármelyik elõzõ igénypont szerinti monoklonális ellenanyagot kódoló polinukleotidot tartalmaz. 12. Hibridóma sejtvonal, amely képes az 1–7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális ellenanyag termelésére. 13. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása normál humán B¹sejt növekedésének vagy differenciációjának gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. 14. In vitro eljárás normál humán B¹sejt növekedésének vagy differenciációjának gátlására, amely eljárás

1

HU 007 240 T2

magában foglalja a B¹sejt érintkeztetését 1–10. igénypontok bármelyike szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. 15. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása normál humán B¹sejt proliferációjának gátlására szolgáló gyógyszer gyártására, ahol a proliferációt fokozza a CD40-ligandum kölcsönhatása a B¹sejt felszínén expresszált CD40-antigénnel. 16. In vitro eljárás normál humán B¹sejt proliferációjának gátlására, ahol a proliferációt fokozza a CD40-ligandum kölcsönhatása a B¹sejt felszínén expresszált CD40-antigénnel, amely eljárás magában foglalja a B¹sejt érintkeztetését 1–10. igénypontok bármelyike szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. 17. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag vagy fragmense hatásos mennyiségének alkalmazása B¹sejtek humán páciensben való ellenanyag-termelésének gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. 18. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása B¹sejt leszármazási vonalba tartozó ráksejtek növekedésének gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. 19. In vitro eljárás B¹sejt leszármazási vonalba tartozó ráksejtek növekedésének gátlására, amely eljárás magában foglalja a ráksejt érintkeztetését 1–10. igénypontok bármelyike szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. 20. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása CD40 expressziójával jellemzett rák kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. 21. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti antiCD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségének alkalmazása CD40-ligandum által közvetített jeltovábbítási útvonal CD40¹et expresszáló humán sejtben történõ gátlására szolgáló gyógyszer gyártására. 22. In vitro eljárás CD40-ligandum által közvetített jeltovábbítási útvonal CD40¹et expresszáló humán sejtben történõ gátlására, amely eljárás magában foglalja a B¹sejt érintkeztetését 1–10. igénypontok bármelyike szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyag hatásos mennyiségével. 23. A 21. igénypont szerinti alkalmazás vagy a 22. igénypont szerinti eljárás, ahol a humán CD40-exp-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

82

2

resszáló sejt normál humán B¹sejt vagy rosszindulatú humán B¹sejt és a CD40 jeltovábbítási útvonal a B¹sejt túlélése. 24. In vitro eljárás olyan ellenanyag azonosítására, amely antagonista aktivitású CD40¹et expresszáló sejtekkel szemben, amely eljárás magában foglalja kompetitív kötési vizsgálati eljárás végrehajtását 1–10. igénypontok bármelyike szerinti anti-CD40 monoklonális ellenanyaggal. 25. Gyógyászati készítmény, amely 1–10. igénypontok szerinti anti-CD40 ellenanyagot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. 26. A 25. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a készítmény folyékony gyógyászati kiszerelés, amely a kiszerelés pH¹ját a a körülbelül pH=5,0 és körülbelül pH=7,0 közötti tartományban tartó mennyiségû puffert tartalmaz. 27. A 26. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a kiszerelés továbbá a készítményt közel izotóniássá tévõ mennyiségû izotonizálószert is tartalmaz. 28. A 27. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol az izotonizálószer nátrium-klorid, amely nátrium-klorid körülbelül 50 mM és körülbelül 300 mM közötti koncentrációban van jelen a kiszerelésben. 29. A 28. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a nátrium-klorid körülbelül 150 mM koncentrációban van jelen a kiszerelésben. 30. A 26–29. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, ahol a puffer a szukcinát¹, citrátés foszfátpufferek által alkotott csoportból van kiválasztva. 31. A 30. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a puffer körülbelül 1 mM és körülbelül 50 mM közötti koncentrációban van jelen a kiszerelésben. 32. A 31. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a puffer nátrium-szukcinát vagy nátrium-citrát, körülbelül 5 mM és körülbelül 15 mM közötti koncentrációban. 33. A 26–32. igénypontok bármelyike szerinti gyógyászati készítmény, ahol a kiszerelés továbbá felületaktív anyagot is tartalmaz körülbelül 0,001% és körülbelül 1,0% közötti mennyiségben. 34. A 33. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, ahol a felületaktív anyag poliszorbát¹80, amely körülbelül 0,001% és körülbelül 0,5% közötti koncentrációban van jelen a kiszerelésben.

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

83

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

84

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

85

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

86

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

87

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

88

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

89

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

90

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

91

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

92

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

93

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

94

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

95

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

96

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

97

HU 007 240 T2 Int. Cl.: A61K 39/395

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest