!HU000003802T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 003 802
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 31/415
(21) Magyar ügyszám: E 04 798326 (22) A bejelentés napja: 2004. 11. 26. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040798326 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1691805 A1 2005. 06. 23. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1691805 B1 2008. 05. 28.
(51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 20030001793 2003. 12. 09.
(73) Jogosult: Biocis Pharma Oy, 20520 Turku (FI)
FI
(72) Feltalálók: Leino, Iasse, Merimasku (FI); Laihia, Jarmo, Leito (FI) (54)
(2006.01) A61K 31/4745 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05056007 PCT/FI 04/000717
(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Sejtcitoplazmát savanyítani képes urokánsav alkalmazása emberben sejtszaporodás meggátlására vagy megállítására
(57) Kivonat
HU 003 802 T2
A találmány tárgya urokánsav alkalmazása sejtcitoplazma-savanyításra, ezáltal sejtszaporodás meggátlására vagy megállítására, különösen tumoros vagy egyéb transzformált vagy nem transzformált hiperproli-
feráló sejtekre emberben vagy állatban, és sejtnövekedés és szaporodás megállításával gyógyítható rák és hiperproliferatív betegségek kezelésére vagy megelõzésére.
A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 003 802 T2
A találmány területe A találmány tárgya urokánsav alkalmazása sejtcitoplazma-savanyításra, és ezáltal sejtproliferáció (sejtszaporodás) meggátlására vagy megállítására, különösen tumoros vagy egyéb transzformált vagy nem transzformált hiperproliferáló sejtekre emberben vagy állatban, és sejtnövekedés és szaporodás megállításával gyógyítható rák és bizonyos hiperproliferatív betegségek kezelésére vagy megelõzésére. A találmány háttere Azon közlemények és egyéb anyagok, amelyeket itt alkalmazunk a találmány hátterének megvilágítására, és különösen azok az esetek, amelyek a megvalósítási módokról adnak további részleteket, hivatkozásként a leírás részét képezik. Számos celluláris funkció, mind a normális, mind a transzformált sejtekben az intracelluláris pH fenntartásához kötött. Számos vizsgálat bemutatta nemrégiben, hogy a rákos sejtek szaporodási (proliferációs) aktivitása befolyásolható a sejtcitoszol savanyítására képes vegyületekkel (Cosentini és munkatársai 2001, Wahl és munkatársai 2002, Thangaraju és munkatársai 1999). Analóg módon az intracelluláris savanyítás aktiválja az apoptózisos vagy programozott sejthalálos kaszkádokat (Gottlieb és munkatársai 1996, Matsuyama és munkatársai 2000). A savanyodásról kijelenthetõ, hogy kulcs apoptotikus enzimeket befolyásol, mint amilyenek a savas endonukleázok, amelyek DNS-fragmentálódást okoznak, és a savas szfingomielinázok, amelyek ceramidot termelnek (Gottlieb és munkatársai 1996). A sejtszaporodási aktivitás vagy az apoptózis szabályozása ennek megfelelõen egy ígéretes megközelítés a rákba történõ farmakológiai beavatkozásra (összefoglaló, Los és munkatársai 2003). A tumorágyban az élõ tumorsejtek citoszolikus pH¹ja jellemzõen semleges közeli értéken van tartva a szaporodás elõsegítésére, miközben az extracelluláris környezet savanyodik a celluláris metabolizmus hatására (Yamagata & Tannock 1996). A találmány összefoglalása Jelen találmány feltalálói az urokánsav („urocanic acid”, UCA) egy eleddig ismeretlen tulajdonságát mutatták be. Meglepetésre azt találták, hogy az UCA a malignus és nem malignus sejtek citoszoljába migrál olyan formában, amely képes egy protont leadni a citoszolban. Ennek következtében a citoszol savanyodik (a pH csökken), és további következményeként meggátlódik a normális és abnormális sejtszaporodási aktivitás. Így a találmány egyik szempontja szerint a találmány tárgya cisz-urokánsav alkalmazása emberben vagy állatban a) rák, vagy b) nem rákos hiperproliferációs betegség, amely a következõkbõl álló csoportból választott: bõr vagy prosztata benignus hiperpláziája, mint amilyen a benignus prosztatahipertrófia; rheumatoid arthritis esetén ízületi hiperplázia; gyulladásos bélbetegség; restenosis; atherosclerosis; thrombosis; scleroderma és fibrosis megelõzésére vagy kezelésére
2
alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására, amelyben cisz-urokánsav hatásos mennyisége kerül beadásra lényegében nem disszociált formában az embernek vagy állatnak. Egy további szempont szerint a találmány tárgya 5 cisz-urokánsav és egy másik terápiás hatóanyag alkalmazása rák vagy proliferációs betegség megelõzésére vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására, amelyben – a terápiás hatóanyag rákellenes gyógyszer vagy 10 proliferációellenes gyógyszer, és – az urokánsav a terápiás hatóanyag enhanszere.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a camptothecin sejtszaporodás-ellenes hatását mutatja sejtvonalakon. A sejteket 44 órát tenyésztettük 2 mM camptothecin (CPT) jelenlétében és hiányában 6,5 vagy 7,4 pH¹értéken. 2 órás, a proliferációs vizsgálati reagenssel végzett inkubáció után rögzítettük a 490 nm¹es abszorbanciát, a sejteket 15 000 sejt (K562, HT¹1080, HK293) vagy 75 000 sejt (a többi sejt) sûrûségben 150 ml térfogatban tenyésztettük. A 2. ábra a cisz-UCA–camptothecin kombináció sejtszaporodás elleni hatását mutatja és az alacsony pH¹adaptációt két emberbõl származó bõr-melanomasejtvonalban. A sejteket három példányban tenyésztettük 2 mM camptothecin (CPT) vagy 10 mM cisz-UCA jelenlétében vagy hiányában 15 000 sejt/150 ml sûrûségben 92 órát. A, a normális 7,4 pH¹értékrõl vett sejtek a vizsgálati 6,5 pH¹értéken. B, 3 óráig az alacsony 6,7¹es pH 6,7 értékû adaptációs tápközegben tenyésztett sejteket vizsgáltuk 6,5 pH¹értéken. C, 7,4 pH¹értéken tenyésztett és tesztelt sejtek. A 3. ábra a cisz-UCA-koncentrációválaszt mutatja az A2058 melanomasejt-szaporodás esetén. A proliferációt 44 órás vizsgálat során mértük 6,5 pH¹értéken 30 mM–30 mM cisz-UCA-val és 2 mM camptothecinnel. Mind a proliferációs (A), mind a számolt százalékos gátlás (B) adatait bemutatjuk. A 4. ábra mutatja a cisz-UCA additív antiproliferációs hatását. Három sejtvonalat tenyésztettünk cisz-UCA-val és/vagy 1 mM camptothecinnel lyukanként (100 ml) 3000 sejt sûrûségben 44 órát 6,5 pH¹értékû tápközegben. Üres lyukakat, amelyek tartalmazták az összes cisz-UCAkoncentrációt, de sejteket nem is készítettünk, és az abszorbanciájukat levontuk a megfelelõ vizsgálati lyukakéból. Az 5. ábra UCA-kezelt tumorsejtek intracelluláris in situ pH¹mérését mutatja. A sejteket BCECF-fel jelöltük, és beállított pH¹érté-
1
HU 003 802 T2
kû pufferoldatokba helyeztük különbözõ koncentrációjú cisz-UCA jelenlétében vagy hiányában. Bal oldal, BCECF fluoreszcencia intenzitás kalibráció nigericinkezelt sejtekben nagy káliumtartalmú pufferben a puffer pH¹értéke függvényében. Jobb oldal, intracelluláris pH¹értékek különbözõ koncentrációjú cisz-UCA jelenlétében vagy hiányában. Az összes vizsgálati puffert 7,4 pH¹értékre (%) vagy 6,5 (+) pH¹értékre állítottuk a cisz-UCA hozzáadását követõen. Az eredményeket a megfelelõ bal oldali kalibrációs görbe alkalmazásával számoltuk. A találmány részletes ismertetése Egy elõnyös megvalósítási mód szerint a gyógyászatilag elfogadható vegyület az urokánsav (UCA). A gyógyászatilag elfogadható vegyületet összekeverjük hordozóval, ami lehet egyetlenegy komponens, vagy elõnyösebben két vagy több komponens keveréke. A komponensek egyike megfelelõen egy pufferezõvegyület, amely a készítmény pH¹értékét a kívánt értékre állítja. Különösen ha az UCA transz-izomere, a transz-UCA a hatóanyag, akkor elõnyös a készítmény pH¹értékét 4,0–6,1¹re állítani, elõnyösebben 5,0–6,1¹re. Ebben a pH¹tartományban a transz-UCA még nem disszociál. Amennyiben az UCA cisz-izomere, a cisz-UCA a hatóanyag, akkor elõnyös a készítmény pH¹értékét 5,0–7,0 értékre állítani, elõnyösebben 6,0–7,0 értékre. Ebben a pH¹tartományban a cisz-UCA még nem disszociál. Egy megvalósítási mód szerint a gyógyászati készítmény tartalmazhat további terápiás hatóanyagot, amelynek a hatását javítja az UCA. Elõnyösen, nem korlátozó módon, az ilyen terápiás hatóanyag antiproliferatív vagy rákellenes gyógyszer. A pH 4,0–7,0 értékre állítására megfelelõ vegyület példájaként említhetjük, nem korlátozó módon az 50 mM nátrium-foszfátot kiegészítve 55 mM nátriumkloriddal, sejttenyésztõ tápközeg 25 mM HEPES-sel és 10 mM Pipes kiegészítve 133 mM nátrium-kloriddal. A találmány szerinti eljárás és készítmény alkalmas rák vagy bizonyos hiperproliferatív betegségek kezelésére vagy megelõzésére, amelyek gyógyíthatóak intracelluláris savanyítással, és az alábbi felsorolásban találhatóak. A leírás szerinti értelemben az intracelluláris savanyítás a megemelkedett hidrogénion-koncentrációra utal egy eukarióta sejt citoszoljában vagy a szubcelluláris kompartmentjeiben. A találmánnyal kezelhetõ és megelõzhetõ rákok a rák bármilyen formái, mint amilyen nem korlátozó módon az agy¹, bõr- (mint amilyen a melanoma), hólyag¹, gasztrikus, hasnyálmirigy¹, mell¹, fej¹, nyak¹, nyelõcsövi, prosztata¹, kolorektális, tüdõ¹, szem¹, nõgyógyászati (mint amilyen a petefészek¹) vagy pajzsmirigyrák; egyéb epitheliomák; ciszták különbözõ szervekben; vírusfertõzés indukálta szemölcsök és szemölcsszerû tumorok; fibroszarkóma és metasztázisai. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya nem rákos hiperproliferatív rendellenesség kezelése, neveze-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
2
tesen a bõr vagy a prosztata benignus hiperpláziája (például benignus prosztatahipertrófia), rheumatoid arthritis esetén ízületi hiperplázia; gyulladásos bélbetegség; restenosis; atherosclerosis; thrombosis; scleroderma vagy fibrosis kezelése. Legelõnyösebben a találmány szerinti készítmények és eljárások célsejtjei között vannak a bõrben lévõ tömör tumorok. Jelen találmány céljára a gyógyászatilag elfogadható vegyület különbözõ módokon adható be akár szisztémásan, akár lokálisan. A megfelelõ beadási módok közé tartoznak például a kután kiszerelések; az intratumor injekciók, ideértve az intravénás, intramuszkuláris és szubkután injekciókat; az intraszinoviális injekciókat; és a mukozális, transzdermális, nazális, inhalációs vagy rektális kiszereléseket. Különösen megfelelõ kiszerelések a lokális bejuttatásra való készítmények, mint amilyenek a topikális kiszerelések, kenõcs, zselé, krémek, paszták, oldatok, szuszpenziók, borogatószerek és emulziók. Továbbá a célzott gyógyszerbejuttató rendszerek, mint amilyenek a liposzómák és nanorészecskék, kombinációban a fenti beadási formákkal alkalmazhatók a gyógyászatilag elfogadható vegyület beadására. A gyógyászatilag elfogadható vegyület szükséges dózisa függ az adott gyógyítani kívánt állapottól, az állapot súlyosságától, a kezelés hosszától és az alkalmazott specifikus vegyület beadási módjától. Egy topikális kiszerelésben a gyógyászatilag elfogadható vegyület mennyisége jellemzõen 0,01%–50%, elõnyösebben 0,1%–10%. A találmányt a következõ, nem korlátozó, kísérletes részben fogjuk részletesen ismertetni. Kísérletes szakasz Jelen találmány célja annak a hipotézisnek a vizsgálata, hogy az UCA bemegy transzformált sejttípusokba megfelelõ extracelluláris környezet esetén, savanyítja a citoplazmát, és ennek következtében gátolja a sejtek szaporodását. Egy korábbi közleményünkben (WO 2004/080456 számú nemzetközi közzétételi irat) bemutattuk, hogy mind a cisz-UCA, mind a transz-UCA gyorsan és irreverzíbilisen akkumulál humán polimorf nukleáris neutrofilek citoszoljában. Nem jelezte semmi továbbá, hogy az UCA intracelluláris orgenellumokhoz kötõdne, sem azt, hogy metabolizálódna a citoszolban. A ciszUCA, szemben a transz-UCA-val, befolyásolta a neutrofilek intracelluláris pH¹értékét, amennyiben az extracelluláris pH 6,1–7,0 tartományba esett. Ezen körülmények között a cisz-UCA még nem disszociált, miközben a 6,1 pKa-értékû transz-UCA leginkább vagy teljesen disszociált, és emiatt nem tudott protont szállítani a citoszolban. Azonban, amennyiben az extracelluláris pH 6,1 alatt volt, például 5,0–6,0, akkor a transz-UCA is protonkarrierként tudott mûködni, és intracelluláris savanyodást váltott ki. Az egyértelmûség kedvéért a kísérletes eredmények itt csak a cisz-UCA hatását mutatják, habár hasonló eredményeket lehet elérni a transz-UCA-val egy megfelelõ pH¹tartományban.
1
HU 003 802 T2
Az intracelluláris savanyodásról ismert, hogy elõfeltétel számos sejtfunkció, mint amilyen a növekedés megállása, változásához. Az is ismert, hogy a transzformált sejttípusok, mint amilyenek a ráksejtvonalak, növekedése (szaporodása) gátolható olyan vegyületekkel, amelyek képesek intracelluláris savanyodást kiváltani. Az ilyen vegyületek (általában szerves savak) alkalmazása a rák klinikai kezelésében hátrányt szenvedhet a súlyos mellékhatásaik vagy a toxikusságuk következtében. Eljárások Urokánsav Transz-urokánsavat [transz-UCA,3-(1H¹imidazol4¹il)-2-propénsav, MT 138,14] vásároltunk a Sigmától (St. Louis, MO, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK). Cisz-UCA¹t készítettünk a transz-UCA-ból UV fotoizomerizációval a következõ módon. Transz-UCA¹t (138 mg, 1 mmol) oldottunk vízben (500 ml). Az oldatot pH 9¹re állítottuk kálium-hidroxiddal, ezután besugároztuk nitrogénatmoszféra alatt 10 °C¹on 4 óráig. A fotoizomerizációt Normag esõfilm-fotoreaktorban végeztük Hanau kvarc-higany nagynyomású lámpával (500 W, 270–350 nm). Az eredményül kapott keveréket (transz/cisz kb. 30/70 HPLC-vel) száradásig bepároltuk, és a visszamaradót feloldottuk 12,5 M ecetsavban. Az oldatot pH 9¹re állítottuk és ioncserélõ oszlopon kromatografáltuk (25×2,3 cm, 200–400 háló, acetát forma, Bio-Rad 1¹x8) 12,5 mM (500 ml), 25 mM (500 ml) és 100 mM (1000 ml) ecetsavat alkalmazva egymást követõ eluensként. Cisz-UCA jelent meg kb. 1100 ml után, és a transz-UCA leginkább 1300 ml eluens térfogat után. Az oldószer eltávolítása a frakciókból, majd az ezt követõ dietil-éteres mosás és 65 °C¹os vákuumszárítás foszfor-pentoxid felett tiszta transz- és cisz-izomereket eredményezett. A ciszUCA-hozam 85 mg (58%), olvadáspont 176–178 °C volt, és HPLC elemzéssel több mint 99,5%¹os kémiai tisztaságú volt. Amino-propil állófázis oszlopot Lichrosorb NH2, Hibar RT, 250×4 mm, 5 mm (Merck, Darmstadt, Németország) alkalmaztunk a HPLC vizsgálatra. Az eluens 50%¹os (térf/térf) acetonitril és 2%¹os (térf/térf) ecetsav és 0,5% (tömeg/térf) vizes oldata volt (pH kb. 5). Az izomereket 268 nm¹en detektáltuk, és a visszatartási idõ Tr (cisz) 3,7 perc és Tr (transz) 5,4 perc volt. Cisz-UCA¹t oldottunk fel közvetlenül inkubációs pufferben vagy tápközegben 30 mM koncentrációban, sterilre szûrtük (0,2 mm) és a kívánt koncentrációra hígítottuk közvetlenül az egyes kísérletek elkezdése elõtt. Camptothecin Camptothecin- (Sigma, MT 348,4) törzsoldatot készítettünk a reagens ionmentesített vízben történõ feloldásával (1,4–2,1 mg/ml). Az oldatot alkalizáltuk 1 N NaOH-dal, és tovább segítettük a feloldódást forrásban lévõ vízfürdõn történõ melegítéssel. A törzsoldatból hígításokat készítettünk fiziológiai sóoldatba. A végsõ koncentrációk a kísérletekben 20–2000 nmol/l voltak.
2
Sejtvonalak WM 266–4 és A2058 (kután melanoma), HT¹1080 (epithelialis fibroszarkóma), HeLa (méhnyak epithelialis adenokarcinóma), HK293 (vese epithelialis sejtek) 5 transzformált tumorsejtvonalakat és humán eredetû HSF (egészséges hím önkéntes donorból származó bõrfibroblast) nem transzformált sejtvonalat már korábban ismertettek (Li és munkatársai 2003). A K562 (krónikus mielogén leukémia) sejteket az 10 American Type Culture Collection törzsgyûjteménytõl vásároltuk. A sejteket logaritmikus növekedési fázisban tartottuk IMDM tápközegben (Invitrogen, Paisley, Nagy-Britannia), amely 10% borjúszérummal és antibiotikumok15 kal volt kiegészítve, nedvesített inkubátorban +37 °C¹on, 5% CO2. A tapadó sejtvonalakat PBS-ben lévõ 0,25% tripszin-EDTA-val gyûjtöttük össze 5 percig, ezután tápközegben újraszuszpendáltuk és mostuk õket. Az élõ sejtek megszámlálása után, 20 15 000–75 000 sejtet helyeztünk sima fenekû 96 lyukú sejttenyésztési lemezekre 100 vagy 150 ml térfogatba. Proliferációs vizsgálat A tenyésztett sejtvonalak szaporodási aktivitását sima fenekû 96 lyukú lemezeken határoztuk meg módosított kolorimetrikus vizsgálati eljárással, amely tetrazoliumszármazékon (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) alapult. A sejte30 ket camptothecin és/vagy cisz-UCA jelenlétében tenyésztettük 20–92 órát, ezután hozzáadtuk a proliferációs reagenst 2 órára, és mértük a 490 nm¹es abszorbanciát egy lemezolvasón. A sejtmentes tápközeget tartalmazó lyukak abszorpciós értékeit levontuk az 35 összehasonlító vizsgálat elõtt. 25
40
45
50
55
60 4
Az intracelluláris pH megfigyelése Cisz-UCA jelenlétében mértük az intracelluláris pH¹értéket a sejtvonalakban pH¹érzékeny fluoreszcens festék, 2’,7’-bisz(2¹karboxi-etil)¹5- (és ¹6)-karboxi-fluoreszcein (BCECF, acetoxi-metil-észter; Molecular Probes, Leiden, Hollandia) alkalmazásával áramlási citométerrel. Kétmillió sejtet inkubáltunk 5 ml DMEM tápközegben (Invitrogen), pH 7,4, amely 0,35 mM BCECF¹et tartalmazott 37 °C¹on, 30 percig, egyszer mostuk nátrium-foszfát-pufferben (50 mM NaH 2PO4/Na2HPO4, 43 mM NaCl), pH 7,4, és újraszuszpendáltuk sóoldatban. Húsz ml¹t pipettáztunk a sejtszuszpenzióból áramlási citométer csövekbe. A nátriumfoszfát-puffer-oldatokat, cisz-UCA-val vagy nélküle pH 6,5 vagy 7,4 értékre állítottuk (0,1 N HCl/NaOH-dal) a cisz-UCA hozzáadása után, és a csövekbe tettük, hogy 500 ml végtérfogatot kapjunk. Az áramlási citometriát egy órán belül elvégeztük. Az intracelluláris pH kalibrációját a K+/H+ ionofór nigericinnel végeztük in situ (Molecular Probes) nagy káliumtartalmú pufferekben. BCECF-jelölt sejteket (20 ml sóoldatban) újraszuszpendáltunk beállított pH¹értékû kalibrációs pufferekben (480 ml 50 mM KH2PO4/K2HPO4, 43 mM KCl, pH 6,2, 6,5, 6,8, 7,2 és 7,5) áramlási citomé-
1
HU 003 802 T2
ter csövekben. Nigericin-törzsoldatot (10 mM metanolban) hígítottunk 1:10 arányba sóoldatban, és 5 ml¹t adtunk a kalibrációs sejtszuszpenzióhoz, röviddel (10–15 perc) a vizsgálat elõtt. A sejteket szobahõmérsékleten tartottuk a kísérlet során. A pontos intracelluláris pH¹értékeket az átlagos BCECF fluoreszcencia intenzitásokból számoltuk, figyelembe véve a nigericinkiütött kalibrációs sejteket. A kalibrációt külön és egyidejûleg végeztük minden egyes sejtvonalra.
2
I. táblázat Cisz-UCA (10 mM) és camptothecin (CPT, 2 mM) által kiváltott proliferáció- (sejtszaporodás¹) gátlás 6,5 pH¹értéken lévõ sejtvonalakban 5 Sejtvonal
CPT
cisz-UCA
CPT+ciszUCA
HSF
37±0,42 p=0,00056
31±1,1% p=0,0053
69±2,3% p=0,00020
WM266–4
82±1,1% p=0,0016
20±0,6% p=0,044
80±3,4% p=0,0012
A2058
84±3,3% p=0,0069
45±4,4% p=0,038
89±1,0% p=0,0054
HK293
56±1,0% p=0,0035
22±0,1% p=0,013
55±3,3% p=0,00080
HeLa
78±1,6% p=0,00046
50±1,7% p=0,0032
85±1,7% p=0,00042
K562
77±3,3% P=0,0018
26±2,9% p=0,016
79±18% p=0,0069
HT-1080
71±1,7% p=0,00035
47±0,5% p=0,0024
79±4,1% p=0,0018
10 Eredmények A camptothecin antiproliferációs hatást mutatott, amely javult alacsonyabb pH¹értéken. Az alapvonali proliferáció (szaporodás) a legtöbb sejtvonalnál nagyobb volt a 7,4¹es pH¹értékû tenyészeteknél, mint a 6,5¹es pH¹értékûeknél. A camptothecin (2 mM) minden sejtvonal tenyészeténél gátolta a proliferációt, és hatásosabb gátlást mutatott 6,5¹es pH¹értéken (1. ábra). A cisz-UCA gátolja a rákos sejtproliferációt, és fokozza a camptothecin proliferációellenes hatását 6,5 pH¹értéken. A korábbi perifériás vérneutrofileken végzett megfigyeléseink alapján a cisz-UCA gátlóhatást fejt ki a nem disszociált molekuláris formájában, például 6,1–7,0 extracelluláris pH¹tartományban, ezért vizsgáltuk a cisz-UCA hatását A2058 és WM266–4 melanomasejtvonalakon két pH¹értéken, pH 6,5¹en és pH 7,4¹en. A 10 mM cisz-UCA jelentõsen gátolta a sejtproliferációt önmagában, valamint javította a camptothecin által kifejtett gátlást, ha normálisan (7,4 pH¹értéken) tenyésztett sejteket vizsgáltunk 6,5 pH¹értékû tenyésztési tápközegben (2A. ábra). 10 mM cisz-UCA egymaga általi százalékos gátlás 83% (p=0,0028) volt az A2058 sejtekben és 36% (p=0,0020) a WM266–4 sejtekben. A sejtek proliferációja elõször adaptálódott a 6,7¹es pH tenyésztési körülményekhez 3 napig, mielõtt elkezdtük a vizsgálati tenyésztési szakaszt 6,5¹es pH¹értéken ugyanebben a sorrendben (rendre cisz-UCA¹ra, 87%, p=0,0056 és 28%, p=0,090) (2B. ábra). A 7,4¹es pH¹értéken a gátlás csak 2–3% volt (2C. ábra). Hasonlóan a camptothecin hatása ismét jobb volt alacsonyabb pH¹értéken (2. ábra). Ezek a kísérletek bemutatták, hogy a cisz-UCA antiproliferatív anyagként hat a tumorsejtekre, ha az extracelluláris pH
15
20
100 ml-enként 15 000 sejtet tenyésztettünk 44 órát lyukakban, háromszoros sorozatban. 2 Átlagos százalékos gátlás ±SD a nem kezelt kontrollhoz képest. 1
25
Egy további kísérletben alacsonyabb camptothecin30 koncentrációt (1 mM) alkalmaztunk a cisz-UCA additív szaporodásgátló hatásának jellemzésére. Mindhárom vizsgált transzformált sejtvonal esetén a cisz-UCA gátolta a sejtszaporodást 3 mM vagy ennél magasabb koncentrációban (4. ábra). A cisz-UCA és a camptothe35 cin additív hatása nyilvánvaló volt az 1–10 mM tartományban a sejtvonaltól függõen. A legnagyobb vizsgált cisz-UCA-koncentráció esetén (30 mM) a sejtszaporodás cisz-UCA-val egyedül mindig azonos szinten volt, mint a camptothecinnel kombinált esetben, és alacso40 nyabb volt, mint egyedül 1 mM camptothecin esetében (4. ábra).
45
50
55
60 5
A cisz-UCA csökkenti az intracelluláris pH¹értéket transzformált sejtekben Mivel a cisz-UCA sejtszaporodás-gátló hatást mutatott a sejtvonalakban, ezért ezt követõen megvizsgáltuk, hogy vajon a cisz-UCA is intracelluláris savanyodást idéz¹e elõ ezekben a sejtekben. Korábban bemutattuk, hogy a cisz-UCA nagy koncentrációkra akkumulálódik a citoszolba periferiális vér neutrofilekben, és csökkenti a citoszol pH¹értékét, amennyiben az extracelluláris pH¹értéket 7,0 alá állítjuk. Szelektált transzformált sejteket jelöltünk BCECF pH¹érzékeny fluoreszcens festékkel, és beállított pH¹jú pufferoldatokba helyeztük õket különbözõ koncentrációjú cisz-UCA jelenlétében vagy hiányában. Az áramlási citometriás vizsgálat azt mutatta, hogy az intracelluláris pH az A2058 és a HeLa-sejtekben majdnem állandó maradt az egészen 30 mM¹ig növekvõ cisz-UCA-koncentrációk esetén, ha az extracelluláris értéket 7,4¹es pH¹ér-
1
HU 003 802 T2
téken tartottuk. Ha az extracelluláris puffert 6,5¹es pH¹értékre állítottuk, akkor viszont csökkent az intracelluláris pH a cisz-UCA-koncentrációtól függõen a 0,3–30 mM tartományban. A csökkenés körülbelül 0,25 pH¹egység volt a legnagyobb cisz-UCA-koncentrációnál (5. ábra). Ezek az adatok az A2058 és a HeLa-sejtekkel azt mutatják, hogy a cisz-UCA képes transzformált sejtek citoszoljának savanyítására. A megfigyelt savanyítás valószínûleg egy iniciációs esemény a cisz-UCA szaporodásellenes hatásában. Következtetések A tumorsejtek transzformáció révén szerzik meg azon képességüket, hogy elkerüljék a sejtosztódás szabályozásának szoros kontrollját. Ebben a többlépéses folyamatban a szaporodást visszatartó intracelluláris útvonalak inaktiválása és azok aktiválása, amelyek ezt elõsegítik, a kulcsesemények. Az eredményül kapott rendellenes növekedési viselkedése a transzformált sejteknek a gyógyítás fontos kihívása marad. Mivel a rákos sejtek általában nem engedelmeskednek a sejtciklus-elõrehaladás és az apoptózis normális celluláris mechanizmusainak, és a tömör daganatok rendellenesen savas és hipoxikus mikrokörnyezetet teremtenek, ezért a gyógyszerterápiák hatásossága gyakran kompromittálódik, de adhat egy új perspektívát a tumorszelektív gyógyszerek tervezésére (Kozin et al. 2001). A tömör tumorszövet sejtjei pH¹gradienst próbálnak fenntartani a sejtmembrán két oldalán; a citoszol pH¹értéke közel van a semlegeshez, miközben az extracelluláris mikrokörnyezet savas, általában 6,7 pH¹érték körüli (Kozin és munkatársai 2001, Yamagata & Tannock 1996). Az alacsony extracelluláris pH esetén bizonyos gyógyszerek sejtekbe felvétele, mint amilyen a camptothecin, javul (Gabr és munkatársai 1997), és savas intracelluláris környezet szükséges a hatásos szaporodásgátló aktivitáshoz, mivel reverzíbilis átalakulások történnek a molekuláris szerkezetében (Bürke & Mi 1993). Bemutatták, hogy a tumorsejtek kémiai szenzitivitása a camptothecinre szintén javítható savakkal történõ egyidejû kezeléssel, amely savak képesek az intracelluláris környezet savanyítására (Cosentini és munkatársai 2001, Gabr és munkatársai 1997). A camptothecin önmagában savanyítja leukémiasejtek citoszolját egy többórás idõkeretben, amely apoptózisindukcióhoz vezet (Goossens és munkatársai 2000). Egy kiegészítõ protonkarrier általi intracelluláris savanyítás javíthatja a camptothecin és a hasonló gyógyszerek hatását. Hasonlóan, az alkilezõ és platinatartalmú gyógyszerek kölcsönhatása a DNS-sel az alacsony pH¹jú intracelluláris környezetet kedvelik (Jahde és munkatársai 1989, Atema és munkatársai 1993). A találmány szerinti kísérletekben alkalmazott ciszUCA hatásos koncentrációja a millimoláris tartományban van, leginkább 1 és 30 mM között. A cisz-UCA természetes lokalizációja az epidermisz felszíni rétege, ahol a közölt teljes UCA-koncentrációk a 0,5–8,9 mM tartományban vannak, figyelembe véve az epidermis átlagos vastagságát (Laihia és munkatársai 1998).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
Ezért lehetséges, hogy ezek a koncentrációk fontosak a veleszületett antibakteriális, szaporodásgátló és gyulladáscsökkentõ savas felszíni környezet fenntartásában (savas köpeny „acid mantle”, Ohman & Vahlquist 1994) a patogén mikroorganizmusokkal, tumorokkal és a neutrofil akkumulációval szemben. Egy nemrégiben végzett elemzés bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az Uca a fõ hatást kiváltó molekula az epidermis savalapú homeosztázisában (Krien & Kermici 2000). Másrészrõl a további szerves savak koncentrációi, amelyek kísérletesen fokozzák a camptothecin szaporodásgátló hatását, ugyanebbe a tartományba esnek. Példaként a fenil-butirát és fenil-acetát hiszton-deacetiláz inhibitorok csökkentették a vastagbélkarcinóma-sejtek szaporodását in vitro rendre 20%–86%-kal az 5–40 mM koncentrációtartományban (Cosentini et al. 2001). Habár még nem vizsgálták részletesen, de az UCAnak, mint potenciális farmakológiai anyagnak a tulajdonságai a rákba történõ beavatkozás során ígéretesek. Elõször is az UCA egy természetes molekula, amely nagy mennyiségben szintetizálódik a bõrben, ahogy ezt fent bemutattuk. Az UCA már több mint 120 éve ismert, és több száz biomedikai közlemény témája. Ezek a tények kizárják a meglepetésszerû farmakológiai toxikusság és az allergén érzékenységek gyanúját. Másodszor, a cisz-UCA vízoldható, és könnyen bejut szövetekbe és a sejtcitoplazmába. Harmadsorban emlõsökben nem ismert a cisz-UCA katabolizmusa, ezért nem várhatóak hátrányos hatások a lehetséges metabolitoktól. A bõrön in vivo, a transz-UCA hisztidinbõl szintetizálódik (Baden & Pathak 1967). Az UV indukálta fotoizomerizáció termeli a cisz-izomert, amely ezt követõen kiválasztásra kerül izzadság és vizelet formájában. Ha nem szándékolt fotoizomerizáció történik vissza a transz-UCA¹vá a cisz-UCA-kezelést követõen, akkor a szisztémás transz-UCA számos ártalmatlan intermedieren keresztül természetes módon metabolizálódik glutamáttá a májban. Nincs endogén metabolizmus a bõrben. Negyedszer, a cisz-UCA protondisszociáló tulajdonsága potenciális rákgyógyszerré teszi. Az UCA gyenge poliprotikus sav két protondonorrésszel, a karboxilcsoporttal és az imidazolilcsoporttal. A ciszUCA karboxilcsoportjára vonatkozó elsõ pKa 3,3 (Roberts és munkatársai 1982). Praktikusan az összes cisz-UCA-molekula ennek következtében deprotonált a karboxilcsoportnál pH>4 esetén. A fiziológiailag releváns pH¹szinteken egyedül az imidazolilcsoport protonáltsága határozza meg, hogy vajon a molekula képes¹e protont adni, és ezáltal elõsegíteni a savanyodást. A cisz-UCA második pKa-értéke, az imidazolilcsoporté 7,0 (Roberts és munkatársai 1982, Krien & Kermici 2000). Ennek következményeként a cisz-UCA imidazolilcsoportja csak pH<7,0 esetén protonált és protondonorként tud viselkedni, ha bejut a citoplazmába, amelynek a pH¹értéke >7,0. Megfigyelték, hogy a savanyodás által kiváltott apoptózis a ráksejtekben akkor a leghatásosabb, ha az intracelluláris pH értéke közel van 6,5-hez (Thangaraju és munkatársai 1999). A mitokondriális citokróm¹C általi kaszpázaktiváció pH¹érzékeny, és a pH¹optimum a 6,3–6,8 tartományban van in
1
HU 003 802 T2
vitro (Matsuyama és munkatársai 2000). Az itt bemutatott adatok azt mutatják, hogy a cisz-UCA potens szaporodásellenes aktivitással bír élõ ráksejtekben 6,5¹es extracelluláris pH esetén, de korlátozott az aktivitása pH 7,4¹en. A rákgyógyszerek protondisszociációs tulajdonságait már tárgyalták, de csak a celluláris felvétel szempontjából (Kozin és munkatársai 2001). Továbbá jó felvételi jellemzõkhöz egy optimális gyógyszer a tumorokban lévõ sejtek savanyítására nagyobb pKa-értékkel kell hogy bírjon, mint az aktuális extracelluláris pH, és alacsonyabbal, mint az állandósult állapotbeli intracelluláris pH. Az enyhén savas extracelluláris körülmények esetén a tumorsejtek szaporodását meg kell fognia a cisz-UCA indukálta intracelluláris savanyodásnak. Ez az ötlet igaz lehet a hiperproliferáció további állapotai esetében is, mint amilyen az ízületi fibroblastok szaporodása a rheumatoid arthritis esetén. A farmakológiai kezelés kontextusában a tömör tumorok vagy egyéb lehetséges hiperproliferatív sejtek kezelése esetén az enyhén savas extracelluláris körülmények lehetnek az ideálisak a cisz-UCA alkalmazására. Összefoglalva, a jelen vizsgálat olyan adatokat mutat, amelyek elõször demonstrálják meglepetésre az UCA szaporodásgátló hatását a ráksejtekre. A befolyás az UCA azon tulajdonságával függ össze, hogy savanyítja a citoszolt. A savanyítótulajdonság az UCA elõnyös pKa-értékén alapul, és olyan körülményekre korlátozódik, ahol a citoszol pH¹értéke közel van vagy nagyobb a semlegeshez, és az extracelluláris környezet enyhén savas. Ezek a pH¹körülmények általánosan fordulnak elõ a tömör tumorszövetek esetében. A találmányt tovább jellemezzük a következõ nem korlátozó példákkal. A találmány szerinti kiszerelések példái
5
(% m/m) 0,1–10 1,5 12,5 0,01–1
2¹es gélkészítmény Cisz-urokánsav Natrosol (hidroxi-etil-cellulóz) Pufferezõvegyület Tisztított vízzel 100¹ra kiegészítve.
(% m/m) 0,1–10 1,0 0,01–1
1¹es krémkészítmény Cisz-urokánsav Propilénglikol Cetosztearil-alkohol Nátrium-lauril-szulfát Pufferezõvegyület Tisztított vízzel 100¹ra kiegészítve.
(% m/m) 0,1–10 50 15 1 0,01–1
2¹es krémkészítmény Cisz-urokánsav Propilénglikol
(% m/m) 0,1–10 40
Cetosztearil-alkohol Nátrium-lauril-szulfát Poloxamer 407 Ásványi olaj Rostos vazelin Pufferezõvegyület Tisztított vízzel 100¹ra kiegészítve.
6,75 0,75 1 5 12,5 0,01–1
Kenõcskészítmény (% m/m) 0,1–10 10 Cisz-urokánsav Ásványi olaj 5 Pufferezõvegyület 0,01–1 Vazelinnel 100¹ra kiegészítve. Értelemszerûen jelen találmány szerinti eljárásokat 15 számos megvalósítási módba lehet belefoglalni, amelyek közül csak néhányat ismertettünk itt. Ezért az ismertetett megvalósítási módok csak példaként szolgálnak, és nem tekinthetõek korlátozónak. 20
25
30
35
1¹es gélkészítmény Cisz-urokánsav Carbopol 974 Propilénglikol Pufferelõvegyület Tisztított vízzel 100¹ra kiegészítve.
2
40
45
50
55
60 7
Hivatkozások Angiin JH Jr, Batten WH. Studies on cis urocanic acid. J Invest Dermatol 1968; 50: 463–6. Atema A, Buurman KJ, Noteboom E, Smets LA. Potentiation of DNA-adduct formation and cytotoxicity of platinum-containing drugs by low pH. Int J Cancer 1993; 54: 166–72. Baden HP, PathakMA. The metabolism and function of urocanic acid in skin. J Invest Dermatol 1967; 481: 11–7. Beissert S, Mohammad T, Torri H, Lonati A, Yan Z, Morrison H, Granstein RD. Regulation of tumor antigen presentation by urocanic acid. J Immunol 1997; 159: 92–6. Burke TG, Mi Z. Preferential binding of the carboxylate form of camptothecin by human serum albumin. Anal Biochem 1993; 212: 285–7. Cosentini E, Haberl I, Pertschy P, Teleky B, Mallinger R, Baumgartner G, Wenzl E, Hamilton G. The differentiation inducersphenylacetate and phenylbutyrate modulate camptothecin sensitivity in colon carcinoma cells in vitro by intracellular acidification. Int. J. Oncol. 2001; 19: 1069–74. El-Ghorr AA, Norval M. The effect of chronic treatment of mice with urocanic acid isomers. Photochem Photobiol 1997; 65: 866–72. Everett MA, Angiin JH Jr, Bever AT. Ultraviolet induced biochemical alterations in skin. I. Urocanic acid. Arch Dermatol 1961; 84: 717–9. Gabr A, Kuin A, Aalders M, El¹Gawly H, Smets LA. Cellular pharmacokinetics and cytotoxicity of camptothecin and topotecan at normal and acidic pH. Cancer Res 1997; 57: 4811–6. Garssen J, Norval M, Crosby J, Dortant P, Van Loveren H. The role of urocanic acid in UVB-induced suppression of immunity to Trichinella spiralis infection in the rat. Immunology 1999; 96: 298–306. Gilmour JW, Vestey JP, George S, Norval M. Effect of phototherapy and urocanic acid isomers on natural killer cell function. J Invest Dermatol 1993; 101: 169–74. Goossens JF, Henichart JP, Dassonneville L, Facompre M, Bailly C. Relation between intracellular acidifica-
1
HU 003 802 T2
tion and camptothecin-induced apoptosis in leukemia cells. Eur J Pharm Sci 2000; 10: 125–31. Gottlieb RA, Nordberg J, Skowronski E, Babior BM. Apoptosis induced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellular acidification. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 654–8. Gruner S, Diezel W, Stoppe H, Oesterwitz H, Henke W. Inhibition of skin allograft rejection and acute graft-versus-host disease by cis-urocanic acid. J Invest Dermatol 1992; 98: 459–62. Holan V, Kuffova L, Zajicova A, Krulova M, Filipec M, Holler P, Jancarek A. Urocanic acid enhances IL–10 production in activated CD4+ T cells. J Immunol 1998; 161: 3237–41. Jahde E, Glusenkamp KH, Klunderl, Hulser DF, Tietze LF, Rajewsky MF. Hydrogen ionmediated enhancement of cytotoxicity of bis-chloroethylating drugs in rat mammary carcinoma cells in vitro. Cancer Res 1989; 49: 2965–72. Kivisto K, Punnonen K, Toppari J, Leino L. Urocanic acid suppresses the activation of human neutrophils in vitro. Inflammation 1996; 20: 451–9. Kozin SV, Shkarin P, Gerweck LE. The cell transmembrane pH gradient in tumors enhances cytotoxicity of specific weak acid chemotherapeutics. Cancer Res 2001; 61: 4740–3. Krien PM, Kermici M. Evidence for the existence of a self-regulated enzymatic process within the human stratum corneum¹an unexpected role for urocanic acid. J Invest Dermatol 2000; 115: 414–20. Laihia JK, Attila M, Neuvonen K, Pasanen P, Tuomisto L, Jansen CT. Urocanic acid binds to GABA but not to histamine (H1, H2, or H3) receptors. J Invest Dermatol 1998; 111: 705–6. Li SP, Junttila MR, Han J, Kahari VM, Westermarck J. p38 Mitogen-activated protein kinase pathway suppresses cell survival by inducing dephosphorylation of mitogenactivated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase, 2. Cancer Res 2003; 63: 3473–7. Los M, Burek CJ, Stroh C, Benedyk K, Hug H, Mackiewicz A. Anticancer drugs of tomorrow: apoptotic pathways as targets for drug design, [review] Drug Discov Today 2003; 8: 67–77. Matsuyama S, Llopis J, Deveraux QL, Tsien RY, Reed JC. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol 2000; 2: 318–25. Moodycliffe AM, Bucana CD, Kripke ML, Norval M, Ullrich SE. Differential effects of a monoclonal antibody to cis-urocanic acid on the suppression of delayed and contact hypersensitivity following ultraviolet irradiation. J Immunol 1996; 157: 2891–9. Ohman H, Vahlquist A. In vivo studies concerning a pH gradient in human stratum corneum and upper epidermis. Acta Derm Venereol. 1994 Sep; 74 (5): 375–9. Roberts JD, Yu C, Flanagan C, Birdseye TR. A nitrogen¹15 nuclear magnetic resonance study of the acid-
2
base and tautomeric equilibria of 4¹substituted imidazoles and its relevance to the catalytic mechanism of a¹Iytic protease. J Am Chem Soc 1982; 104: 3945–9. Thangaraju M, Sharma K, Liu D, Shen SH, Srikant CB. 5 Interdependent regulation of intracellular acidification and SHP¹1 in apoptosis. Cancer Res 1999; 59: 1649–54. Wahl ML, Owen JA, Burd R, Herlands RA, Nogami SS, Rodeck U, Berd D, Leeper DB, Owen CS. Regu10 lation of intracellular pH in human melanoma: potential therapeutic implications. Mol Cancer Ther 2002; 1: 617–28. Wille JJ, Kydonieus AF, MurphyGF. Cis-urocanic acid induces mast cell degranulation and release of prefor15 med TNF-alpha: A possible mechanism linking UVB and cis-urocanic acid to immunosuppression of contact hypersensitivity. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 1999; 12: 18–27. Yamagata M, Tannock IF. The chronic administration 20 of drugs that inhibit the regulation of intracellular pH: in vitro and anti-tumour effects. Br J Cancer 1996; 73: 1328–34.
25
30
35
40
45
50
55
8
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Cisz-urokánsav alkalmazása emberben vagy állatban a) rák, vagy b) nem rákos hiperproliferációs betegség, amely a következõkbõl álló csoportból választott: bõr vagy prosztata benignus hiperpláziája, mint amilyen a benignus prosztatahipertrófia; rheumatoid arthritis esetén ízületi hiperplázia; gyulladásos bélbetegség; restenosis; atherosclerosis; thrombosis; scleroderma és fibrosis megelõzésére vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására, amelyben cisz-urokánsav hatásos mennyisége kerül beadásra lényegében nem disszociált formában az embernek vagy állatnak. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a rák lokális vagy szisztémás rák, amely a következõk közül választott: agy¹, tüdõ¹, bõr¹, hólyag¹, gasztrikus, hasnyálmirigy¹, mell¹, fej¹, nyak¹, vese¹, petefészek¹, prosztata¹, kolorektális, nyelõcsõ¹, nõgyógyászati és pajzsmirigyrák. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a cisz-urokánsav szisztémásan vagy lokálisan, elõnyösen lokálisan, legelõnyösebben topikálisan kerül beadásra. 4. Cisz-urokánsav és egy másik terápiás hatóanyag alkalmazása rák vagy proliferációs betegség megelõzésére vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására, amelyben – a terápiás hatóanyag rákellenes gyógyszer vagy proliferációellenes gyógyszer, és – az urokánsav a terápiás hatóanyag enhanszere.
HU 003 802 T2 Int. Cl.: A61K 31/415
9
HU 003 802 T2 Int. Cl.: A61K 31/415
10
HU 003 802 T2 Int. Cl.: A61K 31/415
11
HU 003 802 T2 Int. Cl.: A61K 31/415
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
