(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000004186T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 004 186

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 31/135

(21) Magyar ügyszám: E 04 711387 (22) A bejelentés napja: 2004. 02. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040711387 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1601349 A1 2004. 09. 10. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1601349 B1 2008. 07. 23.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 20030001849 2003. 02. 14. 20030453574 2003. 06. 03.

(73) Jogosult: PIERRE FABRE MEDICAMENT, 92100 Boulogne-Billancourt (FR)

FR US

(72) Feltalálók: DEREGNAUCOURT, Jean, F-75014 Paris (FR); GROSSE, Richard, F-45520 Gidy (FR) (54)

(2006.01) A61K 31/165 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04075886 PCT/FR 04/000347

(74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Milnaciprán(1S,2R)-enantiomerének alkalmazása gyógyszer elõállítására

(57) Kivonat

HU 004 186 T2

A találmány a milnaciprán (1S,2R)-enantiomerének (Z(±)-2-(amino-metil)¹N,N-dietil-1-fenil-ciklopropánkarboxamid) vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sójának depresszió, vizeletinkontinencia, általános szorongás, pánikrohamok, fóbia, obszesszív-kompulzív zavarok, viselkedési zavarok, fáradtság és az ezt kísérõ fájdalom szindrómák, fájdalom és drogfüggés megelõzésére vagy kezelésére szánt gyógyszer elõállítására történõ alkalmazására vonatkozik májés/vagy veseelégtelenségben szenvedõ betegeknél,

szervi és/vagy máj vagy vese szöveti toxicitást elõidézõ kezelésben részesülõ betegeknél, szívkezelésben részesülõ betegeknél, szív- és érrendszeri mellékhatásokat elõidézõ kezelésben részesülõ betegeknél, szív- és érrendszeri elõzményekkel rendelkezõ és/vagy szív- és érrendszeri zavarokban szenvedõ betegeknél, csökkentve a racém keverék formájában levõ milnaciprán beadásával kapcsolatos szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy szervi és/vagy szöveti toxicitást.

A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 4 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 004 186 T2

A találmány a milnaciprán (1S,2R)-enantiomerének (Z(±)-2-(amino-metil)¹N,N-dietil-1-fenil-ciklopropánkarboxamid) vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sójának depresszió, vizeletinkontinencia, általános szorongás, pánikrohamok, fóbia, obszesszív-kompulzív zavarok, viselkedési zavarok, fáradtság és az ezt kísérõ fájdalom szindrómák, fájdalom és drogfüggés megelõzésére vagy kezelésére szánt gyógyszer elõállítására történõ alkalmazására vonatkozik máj- és/vagy veseelégtelenségben szenvedõ betegeknél, szervi és/vagy máj vagy vese szöveti toxicitást elõidézõ kezelésben részesülõ betegeknél, szívkezelésben részesülõ betegeknél, szív- és érrendszeri mellékhatásokat elõidézõ kezelésben részesülõ betegeknél, szív- és érrendszeri elõzményekkel rendelkezõ és/vagy szív- és érrendszeri zavarokban szenvedõ betegeknél, csökkentve a racém keverék formájában levõ milnaciprán beadásával kapcsolatos szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy szervi és/vagy szöveti toxicitást. A találmány szerinti enantiomert közelebbrõl depresszió, krónikus fáradtság szindrómák és vizeletinkontinencia kezelésére szánjuk. A PIERRE FABRE MEDICAMENT (Castres, Franciaország) Kutatóközpontban elõállított, TN912, Dalciprán, Milnaciprán, Midalciprán vagy Midaliprán néven is ismert milnaciprán ((Z(±)-2(amino-metil)¹N,N-dietil-1fenil-ciklopropánkarboxamid) kombinált szerotonin (5¹HT) és noradrenalin (NA) újrafelvétel gátlóként ismert. A milnacipránt és elõállítási eljárását az US 4,478,836 számú szabadalomban írják le. A milnacipránnal kapcsolatos más információkat találhatunk a Merck index 12. kiadásában a 6 281¹es számú szócikkben. A kombinált szerotonin és noradrenalin újrafelvétel gátlók az antidepresszáns hatóanyagok jól ismert osztályát jelentik, amelyek szelektív módon egyszerre gátolják a szerotonin és a noradrenalin újrafelvételét. A venlafaxin és a duloxetin például szintén kombinált szerotonin és noradrenalin újrafelvétel gátlók. Vizsgálatokban bemutatták, hogy a noradrenalin újrafelvételének gátlása és a szerotonin gátlása közötti arány a milnaciprán esetén mintegy 2:1 [Moret és munkatársai, Neuropharmacology 24(12), 1211–1219 (1985); Palmier és munkatársai, Eur. J. Clin. Pharmacol. 37, 235–238 (1989)]. Az US 4,478,836 számú szabadalomban milnaciprán alkalmazását ismertetik központi idegrendszeri rendellenességek, különösen depresszió kezelésére. A WO 01/26623 számú szabadalmi bejelentésben milnaciprán alkalmazását ismertetik fenil-alaninnal és tirozinnal együtt olyan indikációkban, mint a fáradtság, a fájdalommal kapcsolatos szindrómák, a krónikus fáradtság szindróma, a fibromialgia és az irritábilis bél szindróma. A WO 01/62236 számú szabadalmi bejelentésben olyan készítményt ismertetnek, amely milnacipránt tartalmaz egy vagy több antimuszkarin hatóanyaggal együtt, számos indikációban, köztük depresszióban. A WO 97/35574 számú bejelentésben milnacipránt és idazoxánt tartalmazó gyógyászati készítményt ismertetnek kombinációs termékként, egy-

2

idejû, külön-külön vagy idõben eltolt alkalmazásra, depresszió és különbözõ formái, valamint olyan betegségek kezelésére alkalmazásra, amelyekben antidepresszánsokat használnak. A milnacipránt vizeletinkon5 tinencia kezelési indikáció esetén is használják (FR 2 759 290). A milnacipránmolekula két aszimmetrikus szénatomot tartalmaz, amely két különbözõ térbeli konfigurációhoz vezet: (1S,2R) és (1R,2S). Ezek a térbeli konfi10 gurációk egymással nem hozhatók fedésbe, a milnacipránmolekula tehát optikai izomériát mutat. A milnaciprán-hidroklorid tehát két optikailag aktív enantiomer formájában létezik: a jobbra forgató enantiomer vagy Z¹(1S,2R)-2-(amino-metil)¹N,N-dietil-1-fe15 nil-ciklopropánkarboxamid-hidroklorid és a balra forgató enantiomer Z¹(1R,2S)-2-(amino-metil)¹N,N-dietil-1fenil-ciklopropánkarboxamid-hidroklorid. A milnacipránt jelenleg hidroklorid formájában (amelyet F2207-nek is neveznek) forgalmazzák (IXEL, PIERRE FABRE ME20 DICAMENT, Franciaország) racém keverék formájában szerotoninerg-noradrenerg antidepresszáns gyógyszerként. Az F2695 és az F2696 rendre a milnaciprán-hidroklorid (F2207) (1S,2R) (jobbra forgató), illetve (1R,2S) (balra forgató) enantiomereit jelölik: 25

30

35 F2695

F2696

Ezt a két enantiomert a szakirodalomban ismerte40 tett eljárások szerint elválaszthatjuk és izolálhatjuk [Bonnaud és munkatársai, Journal of Chromatography, 318. kötet, 398–403 (1985); Shuto és munkatársai, Tetrahedron Letters, 37. kötet, 641–644 (1996); Grard és munkatársai, Electrophoresis 2000 21, 3028–3034 45 (2000); Doyle és Hu, Advanced Synthesis and Catalysis, 343. kötet, 299–302 (2001)]. A feltalálók most egy farmakokinetikai vizsgálatot végeztek emberen a milnaciprán racemátjával és a két enantiomerével, amely enantioszelektív adagolási 50 módszereket alkalmaz. Ezzel bemutatták, hogy in vivo nincs racemizáció az enantiomerek között. Egyébként, bár a racemátot rezolválták, nem végeztek semmiféle elemzést a két enantiomer farmakológiai és toxikológiai tulajdonságaira vonatkozóan, 55 amely a jelenleg rendelkezésre álló modern eljárásokat alkalmazza, mint amilyenek a telemetriás kardiovaszkuláris vizsgálatok vagy az in vitro farmakotoxikogenomikai elõrejelzõ vizsgálatok. Az antidepresszánsok, mint minden hatóanyag, 60 elõidézhetnek nemkívánatos hatásokat vagy bizonyos 2

1

HU 004 186 T2

toxicitást, amely alapvetõen ezeknek a gyógyszereknek a farmakológiai tulajdonságaiból, de az adagolásból, a betegek egyéni különbségeibõl (genetikai polimorfizmus, szervi elégtelenség, nem, életkor) vagy gyógyszerkölcsönhatásokból is ered. Az antidepresszánsok tehát az intoxikációért felelõs termékek harmadik osztályát jelentik a hipnotikumok és a nyugtatók után [Nores és munkatársai, Thérapie 42, 555–558 (1987)]. Az antidepresszánsok túladagolása súlyos kockázatot jelent, mivel halálhoz vezethet. Az antidepresszánsok által okozott akut intoxikációk okai között meg kell említeni a gyermekeknél elõforduló véletlen bevételt (annál is inkább, mivel bizonyos antidepresszánsokat ágybavizelés kezelésére használnak), az öngyilkossági kísérletet, az orvos általi nem szándékos túladagolást, idõs embereknél az egyidejûleg adott más gyógyszereket, az életkorral kapcsolatos fiziológiai és farmakokinetikai módosulásokat (szívelégtelenség, máj- és/vagy veseelégtelenség…), genetikai vagy gyógyszeres eredetû lassult metabolizmust (enzimatikus gátlás). A gyermekek után tehát az idõs emberek jelentik a második kockázati csoportot a kezelt betegek között. Ezeknél a betegeknél a plazmabeli koncentrációk magasabbak, ami csökkent mértékû veseés/vagy hepatikus klírensszel kapcsolatos, és az intoxikáció kockázatai súlyosabbak [Meadoer-Woodruff és munkatársai, J. Clim. Psychopharmacol. 8, 28–32 (1988)]. A milnacipránnal történõ kezelés során megfigyelt nemkívánatos mellékhatásokat, amelyek általában jóindulatúak, különösen a kezelés elsõ, esetleg elsõ két hete során lehet megfigyelni, és ezután a depressziós epizód javulásával párhuzamosan mérséklõdnek. A legáltalánosabban fellépõ nem kívánt hatások monoterápiában vagy más pszichotrópokkal együtt történõ adás során a szédülés, a túlzott izzadás, a szorongás, hõhullámok és vizelési zavar. Bizonyos kevésbé általánosan jelentkezõ nem kívánt hatások a hányinger, hányás, szájszárazság, székrekedés, remegés, erõs szívdobogás, nyugtalanság, bõrkiütések. Egyébként ismert, hogy szív- és érrendszeri elõzményekkel rendelkezõ vagy egyidejûleg szívre irányuló kezelésben részesülõ betegeknél a szív- és érrendszeri természetû nemkívánatos hatások elõfordulását (magas vérnyomás, alacsony vérnyomás, felálláskor jelentkezõ alacsony vérnyomás, erõs szívdobogás) fokozhatja a milnaciprán. Ezért magas vérnyomással vagy szívbetegséggel rendelkezõ betegeknél ajánlott a klinikai felügyelet fokozása, mivel a milnaciprán racém keverék formájában hajlamos a szívfrekvencia fokozására. Tehát a monoterápiában alkalmazott milnacipránnal megfigyelt túladagolás (800 mg¹tól 1 mg¹ig terjedõ dózisokban) ritka eseteiben az észlelt elsõdleges tünetek a hányás, a légzési zavarok és a szapora szívverés [Dictionnaire Vidal, 78. kiadás (2002)]. Egy másik nemkívánatos hatás, amelyet esetenként elõidéz a milnaciprán, a megnövekedett transzaminázszint, amely bizonyos májtoxicitást jelenthet. Ezért a milnacipránnal történõ kezelés során vagy azt követõen bizonyos számú nemkívánatos klinikai tü-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

net mutatására hajlamos rizikócsoportok a májés/vagy veseelégtelenségben szenvedõk, szervi és/vagy szöveti toxicitást, különösen máj- és/vagy vesetoxicitást elõidézõ kezelésben részesülõ betegek, szívbetegségre irányuló vagy szív- és érrendszeri mellékhatásokat kiváltó kezelésben részesülõ betegek, szív- és érrendszeri elõzményekkel rendelkezõ és/vagy szív- és érrendszeri zavarokban szenvedõ betegek, különösen szívritmuszavarban vagy artériás vérnyomászavarban szenvedõ betegek (alacsony vagy magas vérnyomásos betegek) vagy szívbetegségekben szenvedõ betegek. Azon igyekezve, hogy még inkább megelõzzék a milnacipránnal kezelt betegek egészségére veszélyt (bármilyen csekély legyen is az) jelentõ esetleges mellékhatások kialakulását, a feltalálók meglepõ és váratlan módon azt találták, hogy a milnaciprán (1S,2R)-enantiomere, amely a szerotonin és a noradrenalin újrafelvétel szelektív gátló aktivitásáért alapjában véve felelõs, kevesebb szív- és érrendszeri természetû mellékhatást és szervi és/vagy szöveti, különösen májtoxicitást vált ki, mint a racém elegy. A feltalálók közelebbrõl azt találták, hogy a milnaciprán (1S,2R)-enantiomerének beadása kutyáknál kevésbé növeli a szívfrekvenciát és az artériás vérnyomást, különösen diasztolés artériás vérnyomást, mint amit a racém keverék beadása hajlamos kiváltani. A feltalálók ezenkívül azt találták, hogy a milnaciprán-hidroklorid (1S,2R)-enantiomere (F2695) jobb toxikogenomikai profilt mutatott, mint a milnaciprán-hidroklorid (1R,2S)-enantiomere (F2696) patkány primer hepatociták kísérleti modelljében. A feltalálók ezenkívül bemutatták, hogy az (1R,2S)-enantiomer (F2696) hasonló toxikogenomikai profillal rendelkezik, mint a klomipramin, amelyet referenciapszichotrópként használnak, és amely relatív májtoxicitásáról ismert. A találmány tárgya tehát milnaciprán (1S,2R)-enantiomerének, elõnyösen a lényegében tiszta F2695 enantiomernek, valamint gyógyászatilag elfogadható sóiknak az alkalmazása depresszió, vizeletinkontinencia, általános szorongás, pánikrohamok, fóbia, obszesszív-kompulzív rendellenességek, viselkedészavarok, fáradtság és az azt kísérõ fájdalom szindrómák, fájdalom és drogfüggõség kezelésére szánt gyógyszer elõállítására, csökkentve a szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy csökkentve a szervi és/vagy szöveti toxicitás kockázatát. A „szív- és érrendszeri zavarok” kifejezés alatt monoterápiában vagy más hatóanyagokkal kombinálva beadott gyógyszerek nemkívánatos szív- és érrendszeri mellékhatásait értjük. A találmánnyal összefüggésben a „mellékhatás” alatt egy gyógyszer elõre látható aktivitását értjük egy olyan területen, amely különbözik attól, amiért beadták, és amely zavaró vagy nem kívánatos lehet, ha korlátozza a gyógyszer alkalmazását. A „toxicitás” alatt egy gyógyszernek azt a tulajdonságát értjük, hogy káros hatásokat vált ki szervi és/vagy szöveti szinten, különösen a milnaciprán metabolizmusában részt vevõ szervek vagy szövetek szintjén, különösen a milnaciprán máj- és/vagy vesemeta-

1

HU 004 186 T2

bolizmusa során, és még közelebbrõl a milnaciprán májon történõ elsõ áthaladása során. A szervi toxicitás elõnyösen szívtoxicitás és a szöveti toxicitás májés/vagy vesetoxicitás. A találmánnyal összefüggésben a „csökkentve a szív- és érrendszeri zavarok kockázatát” vagy a „csökkentve a toxicitás kockázatát” alatt azt értjük, hogy megakadályozzuk, hogy ezek a kockázatok jelentõsen megnövekedjenek egy betegnél a gyógyszer beadása következtében. A találmánnyal összefüggésben a „milnaciprán (1S,2R)-enantiomere” kifejezés alatt a milnaciprán (1S,2R)-enantiomerét, valamint ennek gyógyászatilag elfogadható sóit értjük. Elõnyösen a milnaciprán-hidroklorid (1S,2R)-enantiomerérõl (F2695) van szó. A „milnaciprán (1R,2S)-enantiomere” a milnaciprán (1R,2S)enantiomerét, valamint ennek gyógyászatilag elfogadható sóit jelenti, mint amilyen például a hidroklorid (F2696). A „racém elegy” a milnaciprán (1S,2R)-enantiomerének és a milnaciprán (1R,2S)-enantiomerének 50:50 tömegarányú keverékét jelenti, valamint ennek gyógyászatilag elfogadható sóit. Vannak a milnacipránnak metabolitjai is, elõnyösen az in vivo aktív metabolitok és ezek gyógyászatilag elfogadható sói, mint amilyenek: – Z(±)-1-fenil-2-amino-metil-ciklopropánkarbonsavhidroklorid (F1567):

2

Rétegkromatográfia:

5

hordozó: szilika oldószer: benzol/dioxán/etanol (90/25/4) elõhívás: ultraibolya és jód Rf: 0,46 – Z(±)-1-(para-hidroxi-fenil)-1-dietil-amino-karbonil2-amino-metil-ciklopropán-hidroklorid (F2782):

10

15

F2782 20 Molekulatömeg: Jellemzõk: Olvadáspont: Rétegkromatográfia: 25

30

298,82 fehér kristályok 250 °C hordozó: szilika oldószer: butanol/etanol/víz (6/2/2) elõhívás: ultraibolya és jód – ninhidrin Rf: 0,42 – Z(±)-1-fenil-1-etil-amino-karbonil-2-amino-metilciklopropán oxálsavas sója (F2800):

35 F1567 Molekulatömeg: Jellemzõk: Olvadáspont: Rétegkromatográfia:

277,7 fehér kristályok 230 °C hordozó: szilika oldószer: butanol/etanol/víz (6/2/2) elõhívás: ultraibolya és ninhidrin Rf: 0,6 – (±)-3-fenil-3,4-metilén-3-pirrolidon¹3 (F1612):

F2800 40 Molekulatömeg: Jellemzõk: Olvadáspont: Rétegkromatográfia: 45

50

308,33 fehér kristályok 150 °C hordozó: szilika oldószer: CHCl3/ metanol/NH4OH (90/9/1) elõhívás: ultraibolya és ninhidrin Rf: 0,40 – Z(±)-1-fenil-1-amino-karbonil-2-amino-metilciklopropán-hidroklorid (F2941):

55 F1612 Molekulatömeg: Jellemzõk: Olvadáspont:

173,2 fehér kristályok 70 °C

60 4

F2941

1

HU 004 186 T2

Molekulatömeg: Jellemzõk: Olvadáspont: Rétegkromatográfia:

226,74 fehér kristályok 245 °C hordozó: szilika oldószer: CHCl3/ metanol/NH4OH (80/18/2) elõhívás: ultraibolya és ninhidrin Rf: 0,30 Ahogyan a milnaciprán, ezek a metabolitok is két aszimmetrikus szénatommal rendelkeznek, ami két különbözõ térbeli konfigurációhoz vezet: (1S,2R) és (1R,2S). Ezek a térbeli konfigurációk egymással nem hozhatók fedésbe, így ezek a metabolitok szintén optikai izomériát mutatnak. A milnaciprán metabolitja két enantiomerének aránya az enantiomerelegyben olyan, ahogyan azt korábban a milnaciprán enantiomereire ismertettük. Aktív metaboliton a milnaciprán in vitro vagy in vivo metabolizmusából származó származékot értünk, amely képes a szerotonin és a noradrenalin újrafelvétel gátlására; elõnyösen az F2782, F2941, F2800, F1612 és F1567-rõl van szó. A „gyógyászatilag elfogadható só” jelent minden olyan sót, amely megtartja a hatóanyag hatékonyságát és tulajdonságait, és amely nem mutat mellékhatásokat. Elõnyösen gyógyászatilag elfogadható ásványi vagy szerves savas sókról van szó. Elõnyös, de nem korlátozó értelmû példákként megemlíthetjük a hidrohalogenideket, mint például hidroklorid, hidrobromid, vagy a fumarátot, a maleátot, az oxalátot, a citrátot, a metánszulfonátot, a glutamátot, a tartarátot, a mezilátot és adott esetben ezek hidrátjait. A találmány szerinti enantiomert, amely elõnyösen lényegében tiszta F2695 enantiomert, az alábbiakban definiált mindenféle típusú betegnek beadjuk, akiknek ilyen kezelésre van szüksége, legyen az akár terápiás és/vagy megelõzõ célú. Terápiás célból a kezelendõ betegség és/vagy egy vagy több ezzel járó tünet megszüntetését vagy javítását célozzuk. Megelõzõ célból a kezelendõ betegség és/vagy egy vagy több azzal járó tünet megjelenésének megelõzését célozzuk. Ugyanakkor a találmány szerinti enantiomer megfelelõ a kockázati csoportokba tartozó betegek számára, akiknél hajlamos egy vagy több nemkívánatos klinikai tünet kialakulni racém formájú milnacipránnal történõ kezelés során vagy azt követõen. Itt szó van máj- és/vagy veseelégtelenségben szenvedõkrõl, szervi és/vagy szöveti, máj- vagy vesetoxicitást indukáló kezelésben részesülõ betegekrõl, szívre irányuló kezelésben részesülõ betegekrõl, szív- és érrendszerei mellékhatásokat kiváltó kezelésben részesülõ betegekrõl, szív- és érrendszeri elõzményekkel (például szívinfarktus) rendelkezõ és/vagy szív- és érrendszeri zavarokban szenvedõ betegekrõl, mint például a szívritmuszavarokban szenvedõ betegek (szapora szívverés, lassú szívverés, erõs szívdobogás), artériás vérnyomás zavaraiban szenvedõ betegek (magas vagy alacsony vérnyomásos betegek) vagy szívbántalomban szenvedõ betegek. A számos betegség vagy kóros állapot közül, amelyek tünetként szívritmuszavarokat mutatnak, és ame-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

lyekre a találmány különösen megfelelõ a kockázati csoportba tartozó és ilyen betegségekben szenvedõ betegek kezelésére, meg kell említeni különösen a szapora szívverést, amely a szívdobogás ritmusa gyorsulásának felel meg (a szapora szívverés mérsékelt, ha a pulzus 80–100/perc, és súlyos, ha meghaladja a 100¹at), az erõs szívdobogást, az extraszisztolékat (elszórtan elõforduló, gyakori vagy szívinfarktus során), a pitvari fibrillációt, a pitvari szabálytalan szívdobogást és tachiszisztolét, a lassú szívverést, a szívelégtelenséget és a szívinfarktust. A számos betegség közül, amelyek tünetként az artériás vérnyomás zavarait mutatják, és amelyekre a találmány különösen alkalmas a kockázati csoportba tartozó és az ilyen betegségben szenvedõ betegek kezelése esetén, meg kell említeni közelebbrõl az alábbiakat: artériás magas vérnyomás; rosszindulatú artériás magas vérnyomás, a tüdõartériák magas vérnyomása, a portális magas vérnyomás, a paroxizmális esszenciális magas vérnyomás, az alacsony vérnyomás, a felálláskor jelentkezõ alacsony vérnyomás, az agyi magas vérnyomás. Azok a szív- és érrendszeri zavarok, amelyek kockázatát korlátozni lehet a találmány szerinti enantiomerkeverék beadásával, és elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer beadásával, elõnyösen az alábbiak: – az artériás diasztolés és/vagy szisztolés vérnyomás növekedése, amelyet higanymilliméterben (Hgmm) mérünk; közelebbrõl a diasztolés vérnyomás növekedése, és/vagy – szívritmuszavarok, különösen a beteg szívfrekvenciájának növekedése. A szisztolés artériás vérnyomás az artériás vérnyomás maximális értéke, és megfelel annak a pillanatnak, amikor a szív elsõ ütéseit halljuk a kari ütõérnél az artériás vérnyomás mérésekor. A szisztolé a szívciklusnak az a periódusa, amelyben a szív üregei összehúzódnak, és a vér kiáramlását okozzák. A diasztolés artériás vérnyomás az artériás vérnyomás minimális értéke, amely a szívhangok eltûnésének felel meg a kari verõérben, amikor az artériás vérnyomás mérésekor leengedjük a vérnyomásmérõ mandzsettáját. A diasztolé a szívciklusnak az a periódusa, amelynek során a szív üregei megtelnek vérrel. A szisztolés és/vagy diasztolés vérnyomás növekedése magában foglalja az artériás vérnyomás növekedését, ami a szisztémás artériás magas vérnyomás (és változatai) jellemzõje, amelynek tünetei az alábbiak lehetnek: fejfájás, fáradtság, enyhe érzékelési zavarok, mint például szédülés, fülzúgás, erõs szívdobogás, orrvérzés, zavartság vagy aluszékonyság, izomgörcsök, zsibbadás vagy bizsergés a lábakban és a kezekben. A szisztémás artériás magas vérnyomás (és változatai) súlyos, néha akár halálos komplikációkhoz vezethet: vaszkuláris eredetû neurológiai zavarok, balkamrai szívelégtelenség, veseelégtelenség, ischaemiás szívbetegségek (szívinfarktus, szívkoszorúérgörcs és ezek változatai). A jelenlegi ajánlások szerint egy betegrõl akkor mondjuk, hogy artériás magas vérnyomás betegségben szenved, ha az

1

HU 004 186 T2

artériás vérnyomása a diasztolés nyomás esetén 90 Hgmm-nél nagyobb, a szisztolés nyomás esetén 140 Hgmm-nél nagyobb. A toxicitás, melynek kockázatait csökkenthetjük a találmány szerinti enantiomer beadásával, elõnyösen a szervi toxicitás, különösen a szívtoxicitás és/vagy a szöveti toxicitás, különösen a máj- és/vagy vesetoxicitás. A szöveti toxicitás kimutatható azzal, ha sárgaság jelentkezik, vagy pedig biológiai markerekkel. A találmány tárgykörébe tartozik a találmány szerinti enantiomer alkalmazása állatgyógyászatban is, ilyen kezelésre szoruló állatok, különösen házi- vagy tenyészállatok kezelésére. Farmakológiai tulajdonságaik miatt, nevezetesen, mivel kombinált szerotonin (5¹HT) és noradrenalin (NA) újrafelvétel gátlók, a találmány szerinti enantiomer különösen hasznos olyan gyógyszerek elõállítására, amelyeket az alábbiakban ismertetett számos betegség vagy állapot (szindróma) megelõzõ és/vagy gyógyító kezelésére szánunk, korlátozva a szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy korlátozva a szervi és/vagy szöveti toxicitást, különösen a szív¹, májés/vagy vesetoxicitást. Ezek között a betegségek vagy állapotok között meg kell említeni a központi idegrendszer betegségeit, ahogyan azt a „The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders ¹IV (DSM¹IV), 1995 American Psychiatric Association” szakirodalmi helyen definiálják. Szemléltetõ jellegû és nem korlátozó értelmû példaként meg kell említeni az alábbiakat: depresszió, különösen a mélydepresszió, a rezisztens depresszió, az idõs emberek depressziója, pszichotikus depresszió, interferonkezelés által kiváltott depresszió, depresszív állapot, mániás depressziós szindróma, szezonális depresszív epizódok, egy általános egészségi állapottal kapcsolatos depresszív epizódok, kedélyállapotot befolyásoló szerekkel kapcsolatos depressziós epizódok, bipoláris szindróma, skizofrénia, általános szorongás, morózus és legyengült állapotok, stresszel kapcsolatos betegségek, pánikrohamok, fóbia, különösen a tériszony, obszesszív-kompulzív zavarok, viselkedési zavarok, oppozíciós zavarok, poszttraumás stressz szindrómák, az immunrendszer elnyomása, a fáradtság és az ezt kísérõ fájdalom szindrómák, a krónikus fáradtság szindróma, a fibromialgia és más funkcionális szomatikus természetû betegségek, autizmus, általános egészségi állapot miatti, figyelemhiánnyal jellemezhetõ betegségek, hiperaktivitás miatti figyelemhiány, táplálkozási szokások rendellenességei, bulimia nervosa, anorexia nervosa, elhízás, pszichotikus rendellenességek, apátia, migrén, fájdalom, különösen a krónikus fájdalom, irritábilis bél szindróma, szív- és érrendszeri betegségek, különösen a szorongásos-depressziós szindróma szívinfarktus vagy magas vérnyomás esetén, neurodegeneratív betegségek és az ezzel járó szorongásos-depressziós szindrómák (Alzheimerkór, Huntington-betegség, Parkinson-kór), vizeletinkontinenciák, különösen a stresszel kapcsolatos vizeletinkontinencia és az ágybavizelés, a drogfüggõség, különösen dohánytól, különösen a nikotintól, alkoholtól,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

narkotikumoktól, drogoktól, valamint az ilyen a függõségi állapotok esetén az elvonókúra során használt fájdalomcsillapítóktól való szorongásos függõség. A találmány tárgya közelebbrõl a találmány szerinti enantiomer, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer alkalmazása depresszió vagy depressziós állapot megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, korlátozva a szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy korlátozva a szervi és/vagy szöveti toxicitást, különösen a májés/vagy vesetoxicitást. A találmánnyal összefüggésben „depresszió” alatt egy tünetegyüttest értünk, amelynek van egyrészt egy lelki oldala, amely pesszimizmussal járó hangulatzavarból, lelki fájdalomból, halállal és öngyilkossággal kapcsolatos gondolatokból, lelki gátlásból áll, és másrészt egy testi oldal, amely motoros gátlásból, különösen a mozgási képesség lassulásából, étvágyzavarokból, székrekedésbõl, alvási zavarokból és a testtömeg megtartásának zavarából áll. A depresszió tehát egy kóros lelki állapot, amelyben a kedélyállapot súlyos változása és a szellemi és mozgási aktivitás lelassulása társul egymással. A „depresszív állapot” kifejezés alatt olyan mentális állapotot értünk, amelyre a neuropszichikai tónus csökkenése jellemzõ, mely kimerültségben, fáradékonyságban, elbátortalanodásban és a pesszimizmusra való hajlamban nyilvánul meg, és néha szorongás kíséri. A találmány tárgya közelebbrõl a találmány szerinti enantiomer, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer alkalmazása fibromialgia és/vagy krónikus fáradtság szindróma megelõzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, korlátozva a szív- és érrendszeri kockázatokat és/vagy korlátozva a szervi és/vagy szöveti toxicitást, különösen a májés/vagy a vesetoxicitást. A fibromialgia egy olyan krónikus szindróma, amelyre fájdalom vagy égõ érzés jellemzõ, elsõdlegesen az ízületi és ízület körüli rostos kötõszövetet érintõ reggeli merevséggel és nagymértékû fáradtságérzettel. A fibromialgia tünetek csoportjából áll. A leggyakoribbak a nem pihentetõ alvás, a fejfájások, emésztési zavarok, depresszív állapot, izomgörcsök, az arcon jelentkezõ fájdalom, zsibbadások stb. A krónikus fáradtság szindrómát kimerültség vagy fáradtság állapota jellemzi. A leggyakoribb tünetek a gyengeségérzés, az izomgörcsök és/vagy fájdalmak, a túlzott mértékû alvásigény, a láz, torokfájás, emlékezetkiesések és/vagy összpontosítási problémák, álmatlanság, depresszió. A találmány tárgya közelebbrõl egy találmány szerinti enantiomer, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer alkalmazása fájdalom és különösen krónikus fájdalom megelõzésére vagy kezelésére szánt gyógyszer elõállítására, korlátozva a szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy korlátozva a szervi és/vagy szöveti toxicitást, különösen a májés/vagy a vesetoxicitást. A fájdalom együtt járhat különféle betegségekkel és/vagy sérülésekkel. Epidemiológiai vizsgálatokban kimutatták, hogy kapcsolat van a krónikus fájdalom állapotai és a szorongásos depressziók között. Tehát a krónikus fájdalomtól szenve-

1

HU 004 186 T2

dõ betegeknél kialakulhatnak érzelmi problémák, amelyek depresszióhoz és legrosszabb esetben öngyilkossági kísérlethez vezethetnek. Egy betegrõl akkor mondjuk, hogy krónikus fájdalomban szenved, ha hat hónapot meghaladó idõtartam óta szenvedésrõl panaszkodik. Krónikus fájdalmak közül szemléltetõ jellegû és nem korlátozó értelmû példaként meg kell említeni a fibromialgiával kapcsolatos és/vagy a rostos kötõszövetekbõl, izmokból, idegekbõl, inakból és más helyekbõl eredõ fájdalmakat, a hasi fájdalmakat és az irritábilis bél szindróma esetén a hasmenést, valamint a hát alsó részének fájdalmait. A találmány tárgya továbbá közelebbrõl a találmány szerinti enantiomer, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer alkalmazása vizeletinkontinencia, különösen a stressz-vizeletinkontinencia és az éjszakai ágybavizelés megelõzésére vagy kezelésére szánt gyógyszer elõállítására, korlátozva a szív- és érrendszeri zavarok kockázatát és/vagy korlátozva a szervi és/vagy szöveti toxicitást, különösen a máj- és/vagy vesetoxicitást. A fenti betegségek megelõzõ és terápiás kezelését úgy végezzük, hogy egy állatnak, vagy elõnyösen embernek beadjuk a találmány szerinti enantiomer, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer terápiásan hatásos mennyiségét önmagában vagy egy vagy több más hatóanyaggal együtt. Az esetek többségében emberrõl van szó, de a kezelés alkalmazható állatoknál is, különösen tenyészállatoknál (haszonállatok, rágcsálók, szárnyasok, halak…) és társállatoknál is (kutyák, macskák, nyulak, lovak…). A milnaciprán (1S,2R)-enantiomerét, valamint gyógyászatilag elfogadható sóit – ahogyan azt a fentiekben ismertettük – elõnyösen olyan betegeknek adjuk be, akik egyidejûleg, külön vagy idõben eltolva legalább egy második hatóanyagot kapnak a fentiekben említett betegségek kezelésére. Elõnyösen a találmány tárgykörébe tartozik továbbá az alábbiak gyógyszerként történõ alkalmazása: a) a milnaciprán (1S,2R)-enantiomerében dúsított enantiomer, valamint ezek gyógyászatilag elfogadható sói, és b) legalább egy alábbiak közül választott hatóanyag: pszichotrópok, különösen az antidepresszánsok és az antimuszkarin szerek, kombinációs termékekként egyidejû, külön-külön vagy idõben eltolt módon történõ alkalmazásra depresszió, különösen mélydepresszió, rezisztens depresszió, idõs ember depressziója, pszichotikus depresszió, interferonkezelés által kiváltott depresszió, depresszív állapot, mániás depressziós szindróma, szezonális depresszív epizódok, általános egészségi állapottal kapcsolatos depresszív epizódok, kedélyállapotra ható szerekkel kapcsolatos depressziós epizódok megelõzésére vagy kezelésére. Pszichotrópon olyan természetes vagy mesterséges eredetû anyagot értünk, amely képes a mentális aktivitást módosítani, és amely alapvetõen a központi idegrendszerre és a lelkiállapotra gyakorol hatást. A pszichotrópokat három csoportba osztjuk: 1. a pszi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

choleptikumok (hipnotikumok, narkoleptikumok és anxiolitikumok), 2. a pszichoanaleptikumok (antidepresszánsok és pszichotonikumok) és 3. a pszichodiszleptikumok (hallucinogének). Az említett pszichotróp elõnyösen antidepresszáns. Nem korlátozó példaként az antidepresszánst az alábbiak közül választjuk: (i) monoamin-oxidáz-gátlók (IMAO), mint az iproniazid, a pargilin, a szelegin, (ii) az 5HTID agonisták, mint a szumatriptán, az adrenalin és a noradrenalin (alfa és béta szimpatomimetikumok), (iii) triciklusos antidepresszánsok, mint az imipramin, a klomipramin, (iv) a szelektív szerotonin újrafelvétel gátlók (SSRI), mint a fluoxetin, (v) a szelektív norepinefrin újrafelvétel gátlók, mint például a tandamin, a fluparoxán, a mirtazapin, (vi) a szerotonin és noradrenalin újrafelvétel gátlók, mint a venlafaxin és a duloxeton. Nem korlátozó értelmû példaként az antimuszkarin szert az alábbiak közül választjuk: tolterodin, propiverin, oxibutinin, troszpium, darifenacin, temiverin, ipratropium. A találmány tárgya továbbá elõnyösen az alábbiak alkalmazása gyógyszerként: a) a milnaciprán (1S,2R)-enantiomere, valamint gyógyászatilag elfogadható sói, és b) legalább egy másik hatóanyag az alábbiak közül: szervi toxicitást kiváltó hatóanyagok és szöveti, különösen máj- és/vagy vesetoxicitást kiváltó hatóanyagok, vagy egy vagy több májés/vagy veseelégtelenség kezelésére szánt hatóanyaggal együtt, kombinációs termékekként egyidejû, külön-külön történõ vagy idõben eltolt alkalmazásra, olyan betegségek vagy állapotok kezelésére vagy megelõzésére, amelyek kezelhetõk a szerotonin (5¹HT) és a noradrenalin (NA) újrafelvétel kombinált gátlóival. A találmány tárgya továbbá elõnyösen az alábbiak gyógyszerként történõ alkalmazása: a) a milnaciprán (1S,2R)-enantiomere, valamint gyógyászatilag elfogadható sói, és b) legalább egy másik hatóanyag szív- és érrendszeri mellékhatásokat kiváltó hatóanyagok és szív kezelésére irányuló vegyületek közül, kombinációs termékekként egyidejû, külön-külön történõ vagy idõben eltolt alkalmazásra olyan betegségek vagy állapotok kezelésére vagy megelõzésére, amelyeket a szerotonin (5¹HT) és noradrenalin (NA) újrafelvétel kombinált inhibitoraival kezelni lehet. A kiváltott szív- és érrendszeri mellékhatások elõnyösen a fentiekben említettek, közelebbrõl artériás magas vérnyomás, alacsony vérnyomás, szívritmuszavarok (szapora szívverés, lassú szívverés, erõs szívdobogások). A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben ismertetett kombinációs termékeket tartalmazó gyógyászati készítmények. A találmánnyal összefüggésben a találmány szerinti enantiomert, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomert, elõnyösen, de nem korlátozó értelmûen, orális úton, nazális, transzdermális, rektális, intesztinális, parenterális úton, intramuszkuláris, szubkután, intravénás injekcióval adjuk be önmagában vagy

1

HU 004 186 T2

más hatóanyagokkal együtt, ahogyan azt a fentiekben ismertettük. Ha önmagukban adjuk be, akkor a találmány szerinti enantiomert, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomert beadhatjuk per se vagy gyógyászati készítmény formájában, amelyben az említett enantiomerkeverék vagy gyógyászatilag elfogadható sóik elegyítve vagy elkeverve vannak egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozóval, segédanyaggal és/vagy hígítószerrel, amelyek megkönnyítik különösen a biológiai hozzáférhetõséget. Ha a találmány szerinti enantiomert és elõnyösen a milnaciprán lényegében véve tiszta (1S,2R) F2695 enantiomerét más hatóanyagokkal társítva adjuk be, akkor az enantiomert és a többi hatóanyagot formulázhatjuk keverékként vagy külön-külön, azonos vagy különbözõ formában. Ezeket beadhatjuk ugyanazon az úton vagy eltérõ úton. A találmány szerinti gyógyászati készítményeket formulázhatjuk a szakember számára jól ismert szokásos módszerekkel, egy vagy több fiziológiailag elfogadható hordozóanyag, többek között vivõanyagok, adjuvánsok és segédanyagok, mint például tartósítószerek, stabilizálószerek, nedvesítõszerek vagy emulgeálószerek alkalmazásával. A választott formulázási módszer függ a kívánt beadási úttól. Injekciós beadás esetén elõnyösen vizes oldatot használunk, különösen fiziológiailag elfogadható pufferoldatot, mint amilyen a Hank-oldat, a Ringer-oldat vagy egy pufferolt fiziológiás sóoldat. Transzdermális vagy a nyálkahártyán keresztül történõ beadás esetén elõnyösen penetrációt elõsegítõ szereket használunk, amelyek alkalmazhatók ahhoz a nyálkahártyához, amelyen át kell jutniuk. Az ilyen penetrációt elõsegítõ szerek jól ismertek a szakember számára. Orális beadás esetén a találmány szerinti gyógyászati készítményeket elõnyösen egységdózisok vagy multidózisok formájában adjuk be a szakember számára ismert megfelelõ gyógyászati hordozóanyagokkal elkeverve. A megfelelõ beadási egységdózisformák közé tartoznak különösen a tabletták, amelyek adott esetben lehetnek bemetszettek, a kapszulák, a porok, a granulátumok és az orális oldatok vagy szuszpenziók, és az aeroszolok. A megfelelõ beadási multidózisformák közé tartoznak különösen az iható cseppek, az emulziók és a szirupok. Tabletták elõállítása során a találmány szerinti enantiomert, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomert egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal, így például különösen poli(vinil-pirrolidon)-nal, karbopol géllel, polietilénglikollal, zselatinnal, talkummal, keményítõvel, laktózzal, magnézium-sztearáttal, gumiarábikummal vagy ezek analógjaival formulázzuk. A tabletta például az alábbi segédanyagokat tartalmazza: vízmentes kalcium-hidrogén-foszfát, karmellóz-kalcium, povidon K30, vízmentes kolloid szilícium-dioxid, magnézium-sztearát, talkum. A tablettákat adott esetben bevonhatjuk, vagyis különféle anyagok, mint például szacharóz több rétegével boríthatjuk azért, hogy megkönnyítsük a bevételt vagy a tartósítást. A be-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

vonat tartalmazhat pigmenteket vagy színezõanyagokat is, azért hogy a tablettát megkülönböztessük vagy jellemezzük, például a dózisuktól függõen. A tabletták lehetnek többé-kevésbé bonyolult formulában is abból a célból, hogy módosítsuk a hatóanyag felszabadulásának sebességét. A tabletta hatóanyagának felszabadulását gyorsíthatjuk, lassíthatjuk vagy késleltethetjük a kívánt abszorpciótól függõen. A találmány szerinti enantiomert, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomert tehát elõállíthatjuk nyújtott felszabadulású gyógyszerformaként az EP 939 626 számú szabadalomban leírt eljárás szerint. Ez a gyógyszerforma apró részecskék sokaságát egyesítõ multipartikuláris forma, és egy adott in vitro felszabadulású profillal rendelkezik. A találmány szerinti enantiomer felszabadulását késleltethetjük és/vagy szabályozhatjuk implantátum alkalmazásával vagy transzkután felszabadulás révén, különösen szubkután vagy intramuszkuláris úton, intramuszkuláris injekció útján vagy transzdermális tapasz útján. Az enantiomert ekkor közelebbrõl megfelelõ hidrofób vagy polimer anyagokkal és ioncserélõ gyantákkal formulázzuk. A találmány szerinti enantiomer, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomer betegnek beadandó mennyisége függ a kezelendõ állapottól, a kívánt hatástól, különösen, hogy terápiás vagy megelõzõ hatásról van¹e szó, a beteg egészségi állapotától és életkorától, különösen a szív- és érrendszeri elõzményeitõl, a kezelés körülményeitõl és a gyógyszer beadásának módjától. Egy humán betegnek beadandó hatásos terápiás vagy megelõzõ mennyiség meghatározható állatmodellekbõl kiindulva, vagy a szakember számára ismert adatokból, amelyet embereknél depresszió kezelése során nyertek, például a milnaciprán racém keverékének alkalmazásakor. A fentiekben hivatkozott betegségek és különösen a depresszió, a depresszív állapotok, a fibromialgia, a krónikus fáradtság szindróma és a fájdalom megelõzõ és/vagy terápiás kezelésével kapcsolatosan a találmány szerinti gyógyszert elõnyösen 0,01 mg és 10 mg/testtömeg¹kg közötti dózisokban adjuk be naponként egy vagy több adagban, még elõnyösebben 0,05 mg és 5 mg/testtömeg-kg/nap dózisban egy vagy több adagban, még elõnyösebben 0,1 és 1 mg/testtömeg-kg/nap dózisban egy vagy több részletben. Egy különösen elõnyös módon a gyógyszer fentiekben meghatározott dózisokban történõ beadását napi két alkalomra osztjuk, és elõnyösen kapszula formájában adjuk be. Példaként a találmány szerinti enantiomert, elõnyösen a lényegében véve tiszta F2695 enantiomert, zselatinkapszula formájában adjuk be, melynek hatóanyag-tartalma elõnyösen mintegy 6,75 mg/zselatinkapszula, 12,5 mg/zselatinkapszula, 25 mg/zselatinkapszula, 50 mg/zselatinkapszula. A találmány más jellemzõi, céljai és elõnyei világossá válnak az alábbi példákból. A találmány nem korlátozódik a csupán szemléltetõ céllal említett konkrét példákra, amelyeket az alább ábrákra tekintettel kell értelmezni.

1

HU 004 186 T2

Az ábrák feliratai 1. ábra: A szívfrekvencia változása egyszeri beadás után (delta értékek). *** p£0,001 versus ionmentes víz ** p£0,01 versus ionmentes víz * p£0,05 versus ionmentes víz p£0,05 versus F2207 2. ábra: A szívfrekvencia változása egyszeri beadás után (abszolút értékek). *** p£0,001 versus ionmentes víz ** p£0,01 versus ionmentes víz * p£0,05 versus ionmentes víz p£0,05 versus F2207 3. ábra: Különbözõ kezelések hatása a diasztolés artériás vérnyomás középértékeire (az utolsó kezelést követõ 6 órára vonatkozó átlagértékek 5 egymást követõ napi kezelés után). 4. ábra: Különbözõ kezelések hatása a szisztolés artériás vérnyomás középértékeire (az utolsó kezelést követõ 6 órára vonatkozó átlagértékek 5 egymást követõ napi kezelés után). 5. ábra: A toxicitási index számítási módjának sematikus ábrája. A toxicitási index az összes up¹ és downregulált gén összege

2

(a használó által definiált indukciós faktor függvényében). 6a., 6b., 6c. ábra: MTT-vizsgálat patkány primer hepatocitákon. A koncentrációkat mM-ban fejezzük ki.

5

Példák 1. példa: A milnaciprán és enantiomerei farmakokinetikai vizsgálatai A milnaciprán-hidroklorid (F2207) és enantiomereinek (F2695 és F2696) farmakokinetikai vizsgálatait különbözõ állatfajokon és embernél végeztük el. Állatoknál az egyes enantiomerek farmakokine15 tikáját a racemát, vagy pedig egy önálló enantiomer beadását követõen vizsgáltuk. Az F2695 és F2696 enantiomerek plazmakoncentrációi megközelítõleg ekvivalensek a két vizsgált fajnál (majom és patkány). 20 Embernél 12 egészséges alany részvételével végeztünk farmakokinetikai vizsgálatot racemát vagy a két enantiomer egyike beadásával. Ebbõl kitûnik, hogy az egyes enantiomerek farmakokinetikai profilja független attól, hogy ezeket külön vagy racemát formában 25 adtuk be, ami azt jelzi, hogy nincs kölcsönhatás a két enantiomer között (1. táblázat). 10

1. táblázat A milnaciprán-hidroklorid (F2207) és két enantiomere, az F2695 és F2696 fõ farmakokinetikai paramétereinek táblázata. Cmax: maximális plazmakoncentráció, amelyet közvetlenül a kísérleti adatokból kiindulva becsültünk, Tmax: a maximális plazmakoncentráció eléréséhez szükséges idõ, AUC0®¥: plazmakoncentráció-idõ görbe alatti területe a végtelenre extrapolálva, T1/2: a plazmakoncentráció csökkenésének terminális felezési ideje Beadott dózis (mg)

Cmax (nmol.l–1) Tmax (óra) AUC0®¥ T1/2 (óra)

(nmol.h.l–1)

F2207 (50 mg) F2695 (D)

F2696 (L)

214

179

3,42

2,87

2896

1563

9,28

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált fajokban az F2695 és F2696 enantiomereknek semmiféle biológiai átalakulását nem detektáltuk. 2. példa: A milnaciprán és enantiomerei biokémiai vizsgálatai A milnaciprán-hidroklorid (F2207) két enantiomerét (F2695 és F2696) in vitro vizsgáltuk patkányagyban noradrenalin és szerotonin felvétele és a paroxetin kötõdése vonatkozásában. 2.1. Anyagok és módszerek 2.1.1. Noradrenalin felvétele patkány hipotalamusz homogenátummal (P2) A P2 elõállítása 200–300 g¹os hím Sprague–Dawley-patkányokat agyonütünk és lefejezünk, majd gyorsan kivesszük a

5,75

F2695 (D) (25 mg)

F2696 (L) (25 mg)

216

212

3,08 2869 9,38

2,21 1543 5,58

hipotalamuszukat. Két hipotalamuszt homogenizálunk 45 4 ml 0,32 M szacharózban Potter S készülékben 800 fordulat/percen 16 teljes oda-vissza rázással, majd 10 percig 1000 g¹n centrifugáljuk a sejthulladék eltávolítása céljából. A felülúszót 20 percig 10 000 g¹n centrifugáljuk, és az így kapott P2¹t 4 ml 0,32 M szacharóz50 ban felvesszük és Dounce homogenizálóban homogenizáljuk. Felvétel („Uptake”) 13 Ci/mmol 3H¹(1)-NA¹t használunk (Amersham). A felvételt a használat elõtt 30 perccel O2/CO2 55 (95%:5%) keverékkel elõzetesen oxigenizált foszfátpufferben (amely literenként 8 g NaCl¹ot, 1,21 g K2HPO4¹ot és 0,34 g KH2PO4¹ot tartalmaz) végezzük. 37 °C¹os vízfürdõre helyezett 5 ml¹es mûanyag csövekbe bemérünk: 60 – 100 ml inhibitor puffert, 9

1

HU 004 186 T2

– 700 ml puffert (amely 25 mM pargilint tartalmaz) és – 100 ml P2¹t. A hõmérsékleti egyensúly elérése után a reakciót 100 ml 3H¹NA (végsõ koncentráció 50 nM) hozzáadásával indítjuk. Pontosan 10 perc elteltével a reakciót 2,5 ml jeges puffer hozzáadásával megállítjuk és GF/F szûrõkön keresztül szûrjük. Ezután a csövet is egyszer és a szûrõt

5

2

is egyszer öblítjük 2,5 ml jeges pufferrel. A szûrõt ezután egy Beckman minifiolába tesszük, és 3 ml Instagel (Packard) szcintillálófolyadék hozzáadása után a radioaktivitást egy Tricarb Packard folyadékszcintillációs számlálóban mérjük. A nem specifikus (NS) felvételt 10–5 M DMI jelenlétében mérjük. A gátlás százalékos értékét az alábbi képlet szerint számoljuk:

(teljes felvétel–NS)–(felvétel inhibitor jelenlétében–NS) ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– (teljes felvétel–NS) Az IC50-értéket grafikusan határozzuk meg az inhibitor koncentrációja logaritmusának függvényében ábrázolt százalékos gátlási értékek átlaggörbéjén (4 vizsgálat). 2.1.2. Szerotoninfelvétel Az eljárást Gray és Whittaker [J. Anat., 96.: 79–97 (1962)] alapján hajtottuk végre. Az agyszövet szacharózoldatban történõ homogenizálása után a preszinaptikus végzõdések elszakadnak az axontól és összezáródnak szinaptoszómákat alkotva, amelyek szubcelluláris frakcionálással kinyerhetõk. 180–200 g testtömegû hím Sprague–Dawley- (Janvier) patkányokat használtunk. Az állatok leölése után a hipotalamuszt eltávolítottuk, tömegüket megmértük és Dounce homogenizálóban 0,32 M szacharózban 0 °C¹on homogenizáltuk. Ezt a homogenizátumot 10 percig 1000 g¹n centrifugáltuk (2400 fordulat/perc – Hettlich, Rotenta). A felülúszót kinyertük és 20 percig 10 000 g¹n centrifugáltuk (8000 fordulat/perc – Beckam, J2–21 M modell: J14 rotor). A maradékot (amelyet P2 frakciónak neveznek) 50 mg/ml koncentrációjú szacharózban felvettük. 5 percig 37 °C¹on a következõket inkubáltuk: – 30 perccel korábban elõzetesen oxigenizált 350 ml jeges puffer (136 mM NaCl, 2,4 mM KH2PO4, 6,9 mM K2HPO4, pH=7,2), – 50 ml membrán (5 mg/ml végkoncentráció), – 50 ml citalopram (10–5 M végkoncentráció) a nem specifikus felvételhez, – 50 ml 3H-5¹HT (50 nM végkoncentráció) (NEN, Franciaország, 28,4 Ci/mmol). Pontosan 5 perccel az inkubáció megkezdése után a reakciót Whatman GF/F szûrõkön történõ vákuumszûréssel megállítottuk (elõzetes hígítás 2,5 ml jeges pufferrel, majd öblítés 3¹szor 2,5 ml¹rel). A szûrõn felgyülemlett radioaktivitást folyadékszcintillációval mértük (Packard Tricarb 4640) Emulsifier-Safe (Packard) alkalmazásával. Az IC50-értékeket úgy határoztuk meg, hogy grafikusan ábrázoltuk a gátlás százalékos értékeit a termék koncentrációja logaritmusa függvényében (6 koncentráció két párhuzamos méréssel). 2.1.3. A paroxetin kötõdése („Binding”) 180–200 g testtömegû hím Sprague–Dawley- (Janvier) patkányokat használtunk. Több patkány hipotala-

15 muszát összegyûjtöttük és homogenizáltuk 5 ml jeges pufferoldatban (50 mM Trisz-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, pH=7,5) Dounce homogenizálóban, és a homogenátumot 30 000 g¹n centrifugáltuk (27 000 fordulat/perc – Beckman, L5–50E, T40 rotor) 10 percig. A kapott ma20 radékot 5 ml pufferben felvettük, és ugyanilyen körülmények között újracentrifugáltuk. Az új maradékot ugyanilyen pufferben felvettük, és végül ismét homogenizáltuk Dounce homogenizálóban 10 mg/ml szöveti koncentrációban. A membránszuszpenziót (100 ml) 3H25 paroxetinnel (NEN, Franciaország, 28,6 Ci/mmol) inkubáltuk 0,1 nM végkoncentrációban, 20 °C¹on, 1 ml végsõ térfogatban 2 órán keresztül. A 2 órás inkubáció végén a reakciót Whatman GF/F szûrökön történõ vákuumszûréssel megállítottuk, ahol a szûrõket 30 perc30 cel korábban 0,05% polietiliminoldattal kezeltük (elõzetes hígítás 4 ml jeges pufferoldattal, majd a csõ öblítése 2¹szer 4 ml¹rel). A radioaktivitást folyadékszcintillációs spektrometriával mértük (Packard, Trikarb 4640) szcintillálóanyagként Emulsifier-Safe (Packard) alkal35 mazásával. A 3H-paroxetin specifikus kötõdését a teljes kötõdés és a 10 mM fluoxetin jelenlétében megmaradó kötõdés különbségeként definiáltuk. Az IC50-értékeket úgy határoztuk meg, hogy a gát40 lás százalékos értékeit grafikusan ábrázoltuk a termékkoncentráció logaritmusa függvényében (6 koncentráció két párhuzamosban).

45

2.1.4. Használt anyagok F2207: tételszám 10¹CTN3 kulcs P118, F2695: tételszám PL¹I-205, F2696: tételszám PL¹I-204C.

2.2. Eredmények Az F2207 és két enantiomere noradrenalin- és szerotoninfelvételre és a paroxetinkötõdésre gyakorolt hatását egy ábrán mutatjuk be, ahol az ordinátán a gátlás százalékos értékét (%) és az abszcisszán az F2207, az F2695 vagy az F2696 koncentrációját (M) ábrázol55 juk (az adatokat nem mutatjuk be). A két párhuzamosban vizsgált termék minden egyes koncentrációnál a megfelelõ százalékos gátlási értékek négy egymástól független kísérlet eredményeinek az átlagértékei. A három termék IC50-értékét ezekbõl a görbékbõl ki60 indulva határoztuk meg, és a 2. táblázatban mutatjuk be. 50

10

1

HU 004 186 T2

2. táblázat 3H-noradrenalin, 3H-szerotonin

felvételének és 3Hparoxetin-kötõdésnek (binding) gátlása IC50 (M)

Vegyületek

Felvétel

3H-paroxetin-kötõdés (binding)

3H-noradre-

3H-szeroto-

nalin

nin

F2695

1,5×10–8

4,6×10–8

6,0×10–8

F2207

3,0×10–8

15×10–8

13×10–8

F2696

75×10–8

60×10–8

70×10–8

Mindhárom vegyület aktív ezekben a farmakológiai vizsgálatokban, de vannak köztük különbségek: – a noradrenalinfelvétellel kapcsolatban: Az F2695 2¹szer olyan aktív, mint az F2207. Az F2695 25¹ször olyan aktív, mint az F2696. – a szerotoninfelvétellel kapcsolatban: Az F2695 3¹szor olyan aktív, mint az F2207. Az F2695 12¹szer olyan aktív, mint az F2696. – a paroxetinkötõdéssel (binding) kapcsolatban: Az F2695 2¹szer olyan aktív, mint az F2207. Az F2695 10¹szer olyan aktív, mint az F2696. Mindhárom vegyület aktív ezekben a farmakológiai kísérletekben, de az (1R,2S)-forma (F2696) és a racemát (F2207) kevésbé aktív. A milnaciprán-hidroklorid (1S,2R)-formája (F2695) 2–3-szor olyan aktív, mint az F2207. 3. példa: Orális úton beadott racém milnacipránhidroklorid (F2207) és (1S,2R) aktív enantiomere (F2695) szívfrekvenciára és artériás vérnyomásra gyakorolt összehasonlító aktivitása éber kutyákban 3.1. Bevezetés Ez a vizsgálat azt a célt szolgálja, hogy tanulmányozzuk az F2207 és az F2695 hatásait a) egyetlen

2

orális úton történõ beadás után a szívfrekvenciára (n=28 kutya) és b) 5 napos ismételt kezelés után orális úton a szisztolés és diasztolés artériás vérnyomásra kutyákban (n=6 kutya). Ezt a vizsgálatot az F2207 és az F2695 egyforma 5 gyógyászati dózisaival végeztük a szívfrekvencia és a vérnyomási paraméterek távolsági mérését (telemetria) lehetõvé tevõ implantátumokkal (Data Sciences International) rendelkezõ nõstény állatokon. Az állato10 kat minden vizsgálathoz három kezelési csoportra osztottuk: – 1¹es csoport (kontroll) ionmentes vízzel kezelt, – 2¹es csoport 20 mg/kg/nap dózisban F2207-tel kezelt, – 3¹as csoport 10 mg/kg/nap dózisban F2695-tel 15 kezelt.

20

25

30

35

40

3.2. Módszer Tekintettel az implantátummal egyidejûleg felszerelt állatok kis számára (maximum 8), a használt berendezés regisztrálócsatornáinak számára (8 csatorna) és azért, hogy homogén kezelési csoportokat képezzünk, az átfogó felmérést négy vizsgálatban hajtottuk végre, minden vizsgálatot három szakaszra osztottunk (minden állatot mindhárom termékkel kezeltünk), amelyeket egy mosási periódus és a szondák újrainicializálása („wash out”) választott el. Maguk a szakaszok két fázisban zajlanak le: – egy elsõ fázis, melynek során minden állatot ionmentes vízzel kezelünk, hogy hozzászokjanak a lefogáshoz és a gyomorszondán keresztül végzett orális kezeléshez, – egy második fázis, melynek során az állatok megkapják az adott kezelésüket (egyetlen beadás a szívfrekvencia esetén, 894/926/935/936 sorszámú vizsgálatok; ismételt beadás öt napon keresztül az artériás vérnyomás vizsgálatához, 894¹es számú vizsgálat). Az átfogó kísérleti sémát az alábbi táblázatban ismertetjük.

3. táblázat Tudatuknál levõ kutyáknak orálisan beadott racém milnaciprán-hidroklorid (F2207) és (1S,2R) aktív enantiomere (F2695) hatásai telemetriás vizsgálatának átfogó kísérleti sémája Csoport száma

1

2

3

27

28

28

1–2–7–8–13–14 (894¹es vizsgálat)

3–4–9–10–15–16 (894¹es vizsgálat)

5–6–11–12–17–18 (894¹es vizsgálat)

1–2–7–8–13–14 (926¹os vizsgálat)

3–4–9–10–15–16 (926¹os vizsgálat)

5–6–11–12–17–18 (926¹os vizsgálat)

1–2–9–10–11–17–18–19 (935¹ös vizsgálat)

3–4–5–12–13–20–21–22 (935¹ös vizsgálat)

6–7–8–14–15–16–23–24 (935¹ös vizsgálat)

1–2–9–10–11–17–18–19 (936¹os vizsgálat)

3–4–5–12–13–20–21–22 (936¹os vizsgálat)

6–7–8–14–15–16–23–24 (936¹os vizsgálat)

Állatok Szám Azonosító

11

1

HU 004 186 T2

2

3. táblázat (folytatás) Kezelés Azonosító Dózis

Ionmentes víz

F2207

F2695

–

20 mg/kg

10 mg/kg

Út

..………………………………………………orális……………………………………………….

Térfogat

………………………………………………5 ml/kg………………………………………………

(n=27 a kontrollcsoportban, mivel a 18¹as számú állat szondájának jelét nem regisztráltuk)

A különbözõ kezelések szívfrekvenciára gyakorolt hatásait egyetlen beadás után elemeztük a négy vizsgálatban. Az elemzés az alábbi 13 adatgyûjtési idõre vonatkozik: – az egyszeri kezelés elõtt, – az egyszeri kezelést követõ 6 órában 30 percenként. A különbözõ kezelések artériás vérnyomásra gyakorolt hatásait a 894¹es számú vizsgálatban elemeztük az egyensúlyi állapotban az 5., a 29. és a 33. napon (a hatásos kezelés utolsó napja mindegyik szakaszban). Az elemzés az alábbi adatgyûjtési idõkre vonatkozik: – kezelés elõtt, – a kezelést követõ 6 órán át 30 percenként. 3.3. Eredmények 3.3.1. Ami a szívfrekvenciát illeti (négy összesített vizsgálat), egy Tukey-próbát végeztünk az egyedi frekvenciaváltozásokon mind a 12 kezelés utáni idõpontra, a kezelés elõtti értékre vonatkoztatva, valamint a szívfrekvencia abszolút értékeire az összes regisztrációs idõpontra. Az alábbi megfigyeléseket tettük az ionmentes vizet kapó kontrollállatokhoz képest: # amikor a statisztikai elemzést a delta értékeken végeztük el (1. ábra): – a szívfrekvencia szignifikáns mértékben növekedett az F2207 (20 mg/kg) egyszeri beadását követõ elsõ fél órától kezdve, és ez a növekedés fennállt a kezelés utáni 5,5 óráig (p£0,001 az összes adatgyûjtési idõpontra, kivéve a 0,5 és 5,5 órás idõpontnál – p£0,01 – és az 5,0 órás idõpontnál – p£0,05 – a kezelés után), – az F2695 beadását követõen a szívfrekvencia növekedése, amely még mindig kisebb, mint az F2207 beadása után kapott érték. Ezenkívül ez a különbség az F2207 és az F2695 hatása között szignifikáns (p<0,05) a beadás után 1 és 4 órával az F2695 javára, – a szívfrekvencia növekedése, amely rövidebb ideig tart az F2695 esetén (1,0–4,5 óráig), mint az F2207 esetében (fennáll a kezelést követõ 5,5 óráig). # amikor a statisztikai elemzést a szívfrekvencia abszolút értékeire végeztük el, ugyanez a vizsgálat az alábbiakat igazolja (2. ábra): – a szívfrekvencia szignifikáns mértékben növekedett az F2207 (20 mg/kg) egyszeri beadását kö-

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

vetõ elsõ órától kezdve, és ez a növekedés fennállt a kezelés utáni 5,5 óráig (p£0,001 az összes adatgyûjtési idõpontra 1,0-tõl 4,5 óráig, kivéve a 3,5 órás idõpontnál – p£0,01 – és p£0,01 az 5,5 órás idõpontnál a kezelés után), – az F2695 beadását követõen a szívfrekvencia növekedése, amely még mindig kisebb, mint az F2207 beadása után kapott érték. Ezenkívül ez a különbség az F2207 és az F2695 hatása között szignifikáns (p<0,05) a beadás után 1 és 4 órával az F2695 javára, – a szívfrekvencia növekedése, amely rövidebb ideig tart az F2695 esetén (1,0–4,5 óráig), mint az F2207 esetében (fennáll a kezelést követõ 5,5 óráig). 3.3.2. Ami az artériás vérnyomást illeti (egy vizsgálat ismételt beadásokkal), egy átlagos diasztolés artériás vérnyomásértéket (3. ábra és 4. táblázat), valamint egy átlagos szisztolés artériás vérnyomásértéket (4. ábra és 5. táblázat) számoltunk ki minden kutyára, és az utolsó kezelést követõ 6 órára az öt egymást követõ napon át történõ beadás után. Ezeket a vérnyomás-átlagértékeket ANOVA-val elemeztük, és ha ez lehetséges volt, ezután egy Tukey-próbát végeztünk (az adatokat nem mutatjuk be). Az alábbiakat figyeltük meg: – a diasztolés artériás vérnyomás szignifikáns növekedése (p£0,001) F2207 (20 mg/kg/nap) vagy F2695 (10 mg/kg/nap) öt egymást követõ napon át történõ ismételt beadását követõen az ionmentes vízzel végzett kezeléshez képest, – a diasztolés artériás vérnyomásérték szignifikánsan különbözik (p£0,05) F2207 (20 mg/kg/nap) ötnapos ismételt kezelését követõen az F2695 (10 mg/kg/nap) ismételt beadását követõen kapott diasztolés artériás vérnyomás átlagértékétõl, – semmiféle szignifikáns hatás nincs a szisztolés artériás vérnyomás esetén; ugyanakkor megjegyezhetjük, hogy a szisztolés artériás vérnyomásértékek F2695 ötnapos ismételt beadása után közel állnak az ionmentes vízzel végzett kezelést követõ szisztolés artériás vérnyomásértékekhez. A diasztolés és szisztolés artériás vérnyomás egyedi adatait az alábbi 4., illetve 5. táblázatban mutatjuk be.

79

Idõ kezelés elõtt

13

82

102

83

85

91

83

81

82

97

94

83

87

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

Átlagos PAD kezelés után

ND: nem határoztuk meg.

84

0,50

Idõ kezelés után (óra)

1.

79

74

80

79

76

79

72

95

75

75

81

84

76

77

2.

78

82

70

67

91

75

78

99

75

71

79

77

70

73

7.

81

82

ND

95

84

77

73

85

84

98

75

72

63

77

8.

83

78

85

81

113

82

77

79

85

77

82

72

80

101

13.

Hordozó

Kezelés

Állat sorszáma

1

Csoport

76

77

82

82

85

68

65

84

79

75

68

76

70

76

14.

81

79

82

84

89

77

75

89

81

80

81

77

74

81

2

1

4

5

5

2

3

3

2

4

5

2

3

4

Kö- S.E.M. zépérték

122

115

103

116

135

133

120

121

137

123

131

130

103

112

3.

115

133

107

120

110

114

106

118

111

113

127

117

106

89

4.

114

120

115

98

126

105

133

112

116

99

137

113

96

93

9.

104

104

106

97

109

111

116

116

101

88

96

113

92

88

10.

104

103

92

97

104

110

103

106

115

107

100

90

88

86

15.

101

104

93

105

108

103

103

92

107

109

91

106

87

91

16.

F2207 (20 mg/kg/J)

2

110

113

103

106

115

113

114

111

115

107

114

112

95

93

4

5

4

4

5

4

5

4

5

5

8

5

3

4

Kö- S.E.M. zépérték

Egyedi értékek 5 egymást követõ napon végzett ismételt beadást követõen

Diasztolés artériás vérnyomás (PAD Hgmm-ben kifejezve)

4. táblázat A diasztolés artériás vérnyomás egyedi értékei

107

101

88

126

103

125

96

104

111

115

109

112

91

73

5.

95

113

86

100

104

91

106

91

88

88

83

96

91

89

6.

94

98

105

92

92

99

94

96

97

93

88

75

99

80

11.

98

105

98

95

100

108

107

96

89

95

97

97

90

71

12.

92

109

89

110

85

80

77

100

92

84

87

87

108

76

17.

104

108

99

102

108

109

103

106

107

109

112

96

85

78

18.

F2695 (10 mg/kg/J)

3

98

106

94

104

99

102

97

99

97

97

96

94

94

78

2

2

3

5

3

6

5

2

4

5

5

5

3

3

Kö- S.E.M. zépérték

HU 004 186 T2

139

Idõ kezelés elõtt

135

134

158

138

142

149

135

142

137

150

153

146

143

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

6,00

Átlagos PAS kezelés után

Idõ kezelés után (óra)

1.

14

145

144

149

146

140

143

129

167

143

136

151

158

132

141

2.

143

151

132

127

159

149

149

162

145

145

145

129

119

120

7.

160

176

ND

177

170

166

154

163

159

173

150

144

131

157

8.

155

146

148

160

190

164

153

150

160

151

153

141

149

172

13.

Hordozó

Kezelés

Állat sorszáma

1

Csoport

144

143

144

145

152

144

137

154

148

144

137

143

138

138

14.

148

151

145

151

158

151

143

158

150

148

149

142

134

145

3

5

4

7

8

4

4

3

3

5

3

4

4

7

Kö- S.E.M. zépérték

172

158

151

161

184

180

165

173

195

171

186

180

153

188

3.

166

192

154

171

161

157

153

177

168

160

181

167

154

164

4.

165

171

173

146

180

151

184

164

168

146

189

157

152

176

9.

146

154

152

141

155

154

167

157

144

122

129

150

128

149

10.

140

148

132

139

145

150

139

141

153

140

136

126

126

130

15.

153

172

155

166

168

153

155

146

161

163

138

130

129

169

16.

F2207 (20 mg/kg/J)

2

157

166

153

154

166

158

161

160

165

150

160

152

141

163

5

7

5

6

6

5

6

6

7

7

12

9

6

8

Kö- S.E.M. zépérték

Egyedi értékek 5 egymást követõ napon végzett ismételt beadást követõen

Szisztolés artériás vérnyomás (PAS Hgmm-ben kifejezve)

5. táblázat A szisztolés artériás vérnyomás egyedi értékei

159

156

142

182

158

180

146

156

165

168

164

159

135

136

5.

136

170

127

144

151

132

147

131

124

125

119

135

129

141

6.

140

148

152

137

138

145

141

145

142

135

138

124

140

138

11.

152

159

153

150

163

160

169

144

141

141

158

148

135

130

12.

139

160

141

162

131

124

123

151

134

127

127

131

160

134

17.

155

166

153

158

163

164

156

157

154

156

156

143

139

149

18.

F2695 (10 mg/kg/J)

3

147

160

145

156

151

151

147

147

143

142

144

140

140

138

4

3

4

6

5

9

6

4

6

7

8

5

4

3

Kö- S.E.M. zépérték

HU 004 186 T2

1

HU 004 186 T2

3.4. Következtetés A jelenlegi felmérés kísérleti körülményei között, amelyet négy egymást követõ vizsgálatban végeztünk el telemetriás eszközzel ellátott ébren lévõ kutyáknál orális beadással: – egyszeri beadással a kontrollcsoporthoz képest (n=28) a szívfrekvencia növekedése határozottan szignifikáns és tartós az F2207 esetén 20 mg/kg/nap dózisban; ez statisztikailag és klinikailag kisebb és múlékonyabb az F2695 esetén a farmakológiailag ekvivalens 10 mg/kg/nap dózisban, – az F2695 10 mg/kg/nap dózisban nem vált ki semmiféle statisztikailag szignifikáns módosulást az átlagos szisztolés artériás vérnyomásban az utolsó kezelést követõ 6 órában egyensúlyi állapotban az 5 napos ismételt kezelést követõen, – statisztikailag szignifikáns különbséget igazoltunk az átlagos diasztolés artériás vérnyomásértékeknél az utolsó kezelést követõ 6 órában az egyensúlyi állapotban az 5 napos ismételt beadás után az aktív F2695 enantiomer (98±2 Hgmm) és a farmakológiailag ekvivalens dózisú F2207 racém között (110±4 Hgmm). Ezek a különbségek világosan igazolják, hogy az F2695 aktív enantiomer szív- és érrendszeri szempontból jobban tolerálható. 4. példa: In vitro farmakotoxikogenomikai elõrejelzõ vizsgálat 4.1. Anyagok és módszerek A racém F2207 molekula enantiomereit, vagyis az F2695 és F2696 vegyületeket, valamint egy referenciaterméket, a klomipramint (a vizsgálatban C218 kódszámmal) az alábbi vizsgálat során értékeltük. A két enantiomert, az F2695¹öt és az F2696¹ot elõször is egy elõzetes citotoxicitási vizsgálatban (MTT-teszt) értékeltük primer patkány hepatocitákon, hogy kiválasszuk azt a három koncentrációt, amelyet a végsõ vizsgálatban használunk. Miután a primer patkány hepatocitákat kultúrában kezeltük, az RNS¹t kivontuk olyan módon, hogy jelzett komplementer DNS-szondákat generáljunk, amelyeket ezután egy 682 sejtstresszre specifikus alternatív splice fragmenst tartalmazó membránon hibridizálunk. A toxicitási indexet mindegyik vizsgált vegyületnél úgy kaptuk meg, hogy összehasonlítottuk a kezelt sejtek hibridizációs profilját a nem kezelt sejtekével. 4.1.1. A vizsgálat alapja és célja A Safe-Hit egy érzékeny, robusztus, megbízható, gyors és biztos farmakotoxikogenomikai elõrejelzõ vizsgálat, amely lehetõvé teszi, hogy vegyületeket hasonlítsunk össze és osztályozzunk a toxikus potenciáljuk optimalizált felmérése alapján. A Safe-Hit egy olyan, az EXONHIT tulajdonában lévõ technológiát (DATAS™: Differential Analysis of

5

10

15

20

25

30

2

Transcripts with Alternative Splicing) használ, amely lehetõvé teszi egy adott biológiai állapotból eredõ splicing események izolálását, és következésképpen klónozását egy kontrollállapottal összehasonlítva. Ez lehetõvé teszi a biológiai állapot függvényében különbözõen expresszált mRNS-izoformák izolálását. A Safe-Hit lehetõvé teszi egy kémiai sorozat molekuláinak osztályozását a toxicitási indexük alapján, amelyet az alábbi alaplépések szerint határozunk meg (szisztematikusan minden termékre két párhuzamos mérésként végezzük el): – sejtvonalakat kezelünk a különféle termékekkel három koncentrációban, amelyeket egy elõzetes sejttoxikológiai vizsgálatban (MTT-teszt) határozunk meg: egy referenciakoncentrációban, amely megfelel a 80%¹os sejt életképességi mutatónak, egy ennél 10¹szer nagyobb koncentrációban – ha ez lehetséges – és egy 10¹szer kisebb koncentrációban, – a totál RNS és a megfelelõ radiojelzett cDNSszondák elkészítése, – a cDNS-szondák hibridizálása: Safe-Hit macroarray, amely 682 egymástól független klónt tartalmaz, amelyek megfelelnek a WTp53 túlzott expressziójával indukált splicing módosulatainak (p53 a legáltalánosabb „mediátora” a sejtstressznek, és ezt választották ennek a módszernek a kidolgozásához), – adatgyûjtés és a toxicitási index meghatározása.

4.1.2. Sejtek A vizsgálathoz (elõzetes citotoxicitási MTT35 teszt és fõ teszt) használt sejtek fagyasztással konzervált, Sprague–Dawley-patkány-hepatociták elsõdleges tenyészete (tételszám Hep 184005 és Hep 184 006 – Biopredic), standard körülmények között tenyésztve. 40 4.1.2.1. Tenyésztõközeg – kiolvasztási közeg: Leibovitz 15 közeg glutamax 1¹gyel, amelyhez 100 NE/ml penicillint, 100 mg/ml sztreptomicint és 0,6 M glükózt adtunk (tételszám MIL 210009 – Biopredic), 45 – oltóközeg: Williams E közeg glutamax 1¹gyel, 100 NE/ml penicillinnel, 100 mg/ml sztreptomicinnel, 4 mg/ml szarvasmarha-inzulinnal és 10 térfogat% magzati borjúszérummal kiegészítve (tételszám MIL 260005 – Biopredic), 50 – inkubálási közeg: Williams E közeg glutamax 1¹gyel, 100 NE/ml penicillinnel, 100 mg/ml sztreptomicinnel, 4 mg/ml szarvasmarha-inzulinnal és 50 mM hidrokortizon-hemiszukcináttal kiegészítve (tételszám MIL 260009-260007 – 55 Biopredic). 4.1.2.2. Tenyésztési körülmények 37 °C, CO2-atmoszféra (5%), relatív páratartalom 60 (95%). 15

1

HU 004 186 T2

4.1.2.3. Tenyésztési eljárás Sejttoxicitási teszt

Fõ vizsgálat

5 A kezelés napján beoltott sejtek

Beoltás sûrûsége A közeg térfogata

35 000 sejt/lyuk 1,5 millió (96 lyukú lemez) sejt/30 mm lemez 0,1 ml

3 ml

4.1.3. Citotoxicitási teszt Ez a citotoxicitási teszt (MTT-teszt) az élõ sejteket detektálja egy kolorimetriás reakció segítségével, amely kimutatja a mitokondriumok aktivitását magában foglaló sejtlégzés sértetlenségét. A vízben oldódó MTT (3¹[4,5-dimetil-tiazol-2¹il]-2,5-difenil-tetrazóliumbromid) az élõ sejtek egy mitokondriális enzimjének hatására hasadással átalakul oldhatatlan lila színû formazánná. A formazánt egy szerves oldószerben oldjuk, és a kapott oldat spektrofotometriásan mérhetõ. A mért abszorbancia arányos a túlélõ sejtek számával. A sejteket 16 órán át hozzuk érintkezésbe a vizsgálandó vegyülettel 5 különbözõ koncentrációban (0–1–10–25–50 és 100 mM). Ezután az expozíciós fázis után egy MTT-oldatot (0,5 mg/ml a primer hepatociták inkubálási közegében) adunk hozzá 3 órán át. A formazánkristályok oldása után a soklyukú lemezeket egy spektrofotométerrel leolvassuk 500 nm¹en, a sejtek százalékos életképességi mutatójának meghatározása céljából. 4.1.4. Fõ farmakotoxikogenomikai vizsgálat A fõ vizsgálatot két párhuzamosban végezzük el, beoltott tenyészetekbõl kiindulva, amelyeket minden terméknek kitettünk azért, hogy növeljük a vizsgálatok közötti következetességet és validáljuk a kapott eredményeket. 4.1.4.1. Sejtek beoltása és kezelés A sejteket beoltjuk és 16 órán át tenyésztjük minden termékkel három koncentrációban, amelyeket az elõzetes MTT-tesztbõl kiindulva választottunk meg; két kontrollt (nem kezelt sejtek, csak oldószer) adunk hozzá a sorozathoz. 4.1.4.2. A totál RNS kivonása és mennyiségi meghatározás Kezelés után az RNS¹t az alábbiak szerint vonjuk ki és elemezzük: – a sejteket centrifugálással összegyûjtjük, – a kivonást felhasználásra kész fenol reagenssel (Trizol – tételszám 1106266 és 1121067 – Invitrogen) a gyártó utasításai szerint végezzük, – az RNS oldása vízben; – az RNS mennyiségi meghatározása spektrofotometriával (optikai sûrûség mérése 260, 280 és 300 nm¹en), – az RNS minõségének ellenõrzése Agilenttel.

2

4.1.4.3. cDNS-szondák elõállítása A cDNS-szondákat radioaktív inverz transzkripcióval állítjuk elõ (alfa dATP33P – Amersham). A radioaktív cDNS mennyiségi meghatározását (Instant Imager – Packard) a szondák aktivitásának igazolása céljából elvégezzük.

4.1.4.4. Hibridizálás Safe-Hit membránon A 682 DATAS klónt (alternatív splice motívumok) 10 két párhuzamosban az elõre kivágott nejlonból készült Safe-Hit membránokra (Q¹BIOgene) visszük fel egy Q¹Pix berendezés segítségével (GENETIX). A DNSszondákat egy éjszakán át hibridizáljuk a membráno15 kon, majd ez utóbbiakat mossuk.

20

25

30

35

4.1.1.5. A cDNS-szondák készítése – mátrix: 5 mg totál RNS (minden kezelési sorozathoz és minden koncentrációhoz), – primer: 100 ng oligo-dTV oligonukleotid, az 1. és a 2. hibridizáláshoz patkányokban (tételszám 12.00, Invitrogen), – fõ keverék: 10 ml First Strand 5x Premier puffer (tételszám 1131226 – Invitrogen) 1 ml dCTP+dGTP+dTTP 20 mM (tételszám 1105201 – Invitrogen) 1 mM ATP 120 mM (tételszám 1105201 – Invitrogen) 5 ml ditiotreitol (DTT) 0,1 M (tételszám 133609 – Invitrogen) 1 ml RNase Out 40 U (tételszám 1113345 – Invitrogen) 5 ml a33P ATP 3 000 Ci/mmol 10 mCi/ml (tételszám B0239 – Amersham) 4 ml Superscript II (tételszám 1137806 – Invitrogen) 1 ml glikogén (tételszám 1129328 – Invitrogen)

– eljárás: az RNS¹t és az oligo-dTV¹t 70 °C¹on 10 percig inku40 báljuk, majd jégre helyezzük. Hozzáadunk 27 ml MasterMixet, majd 43 °C¹on 1 órán át, majd 50 °C¹on 15 percig inkubáljuk. Hozzáadunk 20 ml vizet, majd 20 ml 50 mM EDTA¹t, majd 4 ml 10 N NaOH¹ot. 20 percig 65 °C¹on inkubáljuk, majd jégre helyezzük. Mennyiségi meghatározás: Instant Imager, Pac45 kard: 1 ml reakcióelegy, hozzáadunk 8 ml ecetsavat, 100 ml izopropanolt és 1 ml glikogént (20 mg/ml). –20 °C¹on 20 percig inkubáljuk, 4 °C¹on 20 percig 13 000 fordulat/percen centrifugáljuk. Újraszuszpen50 dáljuk 200 ml vízben. Mennyiségi meghatározás: Instant Imager, Packard: 1 ml reakcióelegy. – Közegek és pufferek Alapoldatok: 1. mosópuffer: 20X SSC (Invitrogen) 2X SSC 50X Denhardt-féle oldat 50% (w/v) Dextrán-szulfát (ICN) 20% SDS (v/v) (Quantum biotech.) 60 10 mg/ml lazacsperma-DNS (Q¹Biogene) 55

16

1

Elõhibridizációs puffer: 6X SSC 10X Denhardt-féle oldat 10% Dextrán-szulfát 0,5% SDS H2O Hibridizációs puffer: 5X SSC 5X Denhardt-féle oldat 0,1% SDS H2 O

HU 004 186 T2

2. mosópuffer: 2X SSC 0,1% SDS 5 3. mosópuffer: 0,5X SSC 0,1% SDS 10 4. mosópuffer: 1X SSC 0,1% SDS 15

– Elõhibridizáció A hibridizációs csövekbe bemérünk 5 ml elõhibridizációs puffert, hozzáadunk 100 mg/ml végsõ koncentrációnak megfelelõ térfogatú lazacsperma-DNS¹t, a membránokat 5X SSC-vel átitatjuk, a membránt a hibridizációs csõbe tesszük és 2 órán át 65 °C¹on elõhibridizáljuk. – Hibridizáció Az elõhibridizációs puffert eltávolítjuk, és 10–20 ml 5X SCC-vel öblítjük, az 5X SSC¹t eltávolítjuk, 5 ml puffer+lazacsperma-DNS-sel helyettesítjük, az RT¹szondákat 5 percig 95 °C¹on denaturáljuk, majd jégre helyezzük 1 percig, rekonstitúció céljából centrifugáljuk, majd a csõben a denaturált RT¹szondák megfelelõ térfogatát visszanyerjük (100 000–200 000 cpm/ml), egy éjszakán át 55 °C¹on inkubáljuk. – Mosás A membránokat 10–20 ml 1¹es mosópufferrel öblítjük, a puffert eltávolítjuk és 50 ml 2¹es mosópufferrel helyettesítjük, 30 percig 55 °C¹on inkubáljuk, majd eltávolítjuk, és a 4¹es pufferrel mosva helyettesítjük, 30 percig 55 °C¹on inkubáljuk, majd az utolsó mosófolyadékot leöntjük, a membránokat kivesszük a csövekbõl, kazettákra helyezzük, és 3 órán át végezzük az adatgyûjtést.

20

25

30

35

40

45 4.1.4.5. Adatgyûjtés és képelemzés A membránokat 3 órára egy ernyõre (FX Imaging ScreenK – Bio-rad) helyezzük. Ezután a filmet egy Personal Molacular Imager FX (Bio-rad) alkalmazásával leolvassuk. A képelemzést Safe-Hit Reader szoftver (COSE) alkalmazásával végezzük el.

50

4.1.4.6. Toxicitási index számítása Az összes adatot egy automatikus számítási programba visszük át, amely normalizálja a különbözõ 55 membránokat, és kiszámol egy toxicitási indexet, amely egyenlõ az egy adott koncentrációban adott vegyület által upregulált és downregulált gének számának összegével, egy nem kezelt kontrollal kapott eredményekhez képest. Ezután összehasonlítjuk a két Safe-Hit elemzés 60 17

2

eredményét, és ezeket kombináljuk, hogy a különbözõ vizsgált vegyületek toxicitási potenciálját meghatározzuk. A toxicitási index számításában szerepel két olyan paraméter, amely a felhasználó által módosítható: – a háttérérték (Backsround Threshold, BT) elsimítja a gyenge jeleket, amelyek közel vannak a háttérzajhoz és nem rendelhetõk hozzá szignifikáns génexpresszióhoz. Ez határozza meg tehát a detektálás küszöbét; – az indukciós tényezõ (IF), amelyet a kontrollmintákhoz képest a klónok up¹ vagy downreguláltnak nyilvánításához szükséges szorzótényezõként határozunk meg. Ennek a paraméternek az értéke általában 2 vagy 2 alatti ahhoz, hogy releváns eredményeket kapjunk. Az IF érték fokozatos növekedése kiválasztja azokat a klónokat, amelyek egyre erõsebben up¹ vagy downreguláltak. A toxicitási index számításának eljárását úgy fejlesztettük ki, hogy összehasonlítottuk a referenciaprofilokat (R: nem kezelt sejtek) egy kísérleti (E) profillal, és az alábbi lépéseket követi (lásd 5. ábra az eljárás sematikus szemléltetéséhez): – minden kapott értéket átalakítunk logaritmusértékekké, – minden párhuzamos vizsgálatnál kiszámítjuk a log értékek középértékét (MiR és MiE), – az MiR–MiE értékekkel létrehozunk egy mátrixot minden jelre (=Di), – az egyes MiE értékeket normalizáljuk úgy, hogy az MiE-bõl kivonjuk a 14 proximális Di érték mediánját (=NMiE), – a normalizált értékeket összehasonlítjuk a referenciaértékekkel (Ci=NMiE–MiR), – Ci (=Fi)¹t exponenciálisan transzformáljuk, – az Fi értéket összehasonlítjuk a felhasználó által választott indukciós faktorral: – ha az F1>IF, akkor a gént upreguláltnak tekintjük, – ha 1/IF
1

HU 004 186 T2

Azért, hogy az elvégzett vizsgálatban összehasonlítsuk az F2695 és F2696 jelet szolgáltató képességét, ugyanazokat a koncentrációkat használtuk mindegyiknél: 1 mM, 10 mM és 100 mM. Klomipramin esetén 1 mM, 10 mM és 50 mM koncentrációkat használtunk. Lásd a 6a., 6b. és 6c. ábrát. 4.3 Primer patkány hepatocitákra kapott eredmények A toxicitási indexet (IT) a fentiekben ismertetett módon meghatároztuk. Ezekben az indexekben csak azokat a klónokat vettük számításba, amelyeket a két független kísérletben a kontrollokhoz képest moduláltnak

2

találtunk, és csak azokat a klónokat vettük számításba, amelyeknek a jele 2¹szer akkora, mint a háttérérték (BT). Két különbözõ elemzést hajtottunk végre két szintkülönbséget (indukciós faktor – IF) véve a nem ke5 zelt kontrollhoz képest: – a nem kezelt kontrollhoz képest legalább 1,7-szeres. Ez az 1,7-szeres faktor jelenti azt a legkisebb értéket, amely lehetõvé teszi, hogy ne kapjunk indexet a két nem kezelt kontroll összehasonlítása során, 10 – a nem kezelt kontrollhoz képest legalább 2¹szeres. Ez a 2¹szeres faktor lehetõvé teszi a legrobusztusabb jelek figyelembevételét.

4.3.1. A nem kezelt kontrollhoz képest 1,7¹es indukciós tényezõ (6. táblázat) 6. táblázat „Up- és downregulált” klónok primer patkány hepatocitákkal (indukciós faktor=1,7-szeres)

18

1

HU 004 186 T2

Az alábbi toxicitási indexeket kaptuk: F2695

Toxicitási index

1 mM

0

10 mM

0

100 mM

17

F2696

Toxicitási index

1 mM

5

10

2

10 mM

5

100 mM

22

15 C218

Toxicitási index

1 mM

9

10 mM

15

50 mM

28

Az alábbi sort állíthatjuk tehát fel a legmérgezõbbtõl a kevésbé toxikus felé: C218 (klomipramin)>F2696>>>F2695. A jelen vizsgálatban a C218 kódszámú referenciamolekula, a klomipramin, az azonosítók („signature”) számának növekedését mutatja a vizsgált koncentrációkkal kapcsolatban: rendre 9, 15 és 28 azonosító az 1, 10, illetve 50 mM koncentrációknál (az elõzetes cito-

20

25

2

toxicitási teszt által meghatározott maximális koncentráció). Teljesen logikusan az összes azonosító, amely elõfordult a kis és közepes koncentrációknál, megtalálható a nagyobb koncentrációknál is. 1 és 10 mM koncentrációkban az F2695 a jelen vizsgálatban tesztelt 682 lehetséges stresszazonosító („stress signature”) egyikét sem váltja ki. A legnagyobb, 100 mM koncentrációban csak kettõ azonosító detektálható, melyek közül az egyik közös a C218éval, de a jelentése ismeretlen. Az F2696 az azonosítók számának növekedését mutatja a vizsgált koncentrációkkal összefüggésben: rendre 2, 5, illetve 22 azonosító az 1, 10, illetve 100 mM koncentrációknál. A kis és közepes koncentrációknál elõforduló azonosítók mindegyike megtalálható a nagyobb koncentrációknál. A 22 azonosító egyike sem közös az F2695-tel. Viszont a kis és közepes koncentrációknál megjelenõ azonosítók (5, szerepel, amelybõl már 2 megjelenik a kis koncentrációnál) közül mind az 5 szerepel a között a 9 azonosító között, amelyet a klomipraminnal detektáltunk már az alacsony, 1 mM dózistól kezdve. A 100 mM¹os nagy koncentrációban az F2696 26 azonosítójából tíz található meg a klomipramin 50 mM-nál detektált 28 azonosító között. Kvalitatív szempontból ki kell emelni az F2696 és a klomipramin mitokondriális transzkriptumokra gyakorolt hatását, nevezetesen a Cox1 és a citokróm b szintjén. Ezek az azonosítók nem jelentkeznek az F2695-tel (G05/G09/I01 pozíciók).

4.3.2. A nem kezelt állapothoz képest 2¹es indukciós faktor (7. táblázat) 7. táblázat „Up- és downregulált” klónok primer patkány hepatocitákkal (indukciós faktor=2-szeres)

19

1

HU 004 186 T2

2

7. táblázat (folytatás)

Az alábbi indexeket kaptuk: F2695

Toxicitási index

1 mM

0

10 mM

0

100 mM

0

Mindez az F2695 aktív enantiomer jobb toxikogenomikai profilját igazolja ebben a kísérleti modellben, és a 20 biztonsági koefficiens sokkal jobb, mint az F2696¹ra.

25 C218

Toxicitási index

1 mM

8

10 mM

13

50 mM

16

F2696

Toxicitási index

1 mM

0

10 mM

5

100 mM

16

Ezek alapján a paraméterek alapján az alábbi rangsort állíthatjuk fel a legtoxikusabbtól a kevésbé toxikus felé: C218 (klomipramin)>F2696>>>>>F2695. A kétszeres tényezõvel fokozottan vagy kevésbé expresszált klónokat figyelembe véve az F2695 nem indukál semmilyen azonosítót még 100 mM koncentrációnál sem. A koncentráció hatása az azonosítók megjelenésére azzal igazolható, hogy az 1 mM koncentrációban az F2696¹ra kapott gyenge azonosítók, amelyek az elõzõ, 1,7¹es indukciós faktorral végzett analízisben jelen voltak, eltûnnek. Kvalitatív szempontból az F2696 és a klomipramin hatása a Cox1¹re és a citokróm b¹re egyaránt igazolt (G05/G09/I01 pozíciók). Az F2207 farmakológiai aktív enantiomere, az F2695, szignifikáns hatástól mentes ebben a tesztben, amikor a klomipramint használjuk pozitív kontroll referenciatermékként. Viszont az F2207 inaktív enantiomere, az F2696 mennyiségi és minõségi szempontból a klomipraminéhoz hasonló azonosító profilt mutat, és nem mutat egyetlen közös azonosítót sem az F2695-tel.

30

35

40

45

50

55

60 20

4.4. Következtetés Az F2207 enantiomerein, az F2695 és az F2696 molekulákon (10, 50 és 100 mM koncentrációban) és a C218¹on (klomipramin, 1, 10 és 50 mM koncentrációban) végrehajtott farmakotoxikogenomikai vizsgálatok patkány hepatociták primer tenyészetébõl kiindulva lehetõvé tették koncentrációfüggõ stresszazonosítók és toxicitási indexek meghatározását. Ezek a vizsgálatok igazolják a farmakotoxikogenomikai vizsgálatnak azt a képességét, hogy fölfedik a stresszazonosítókat a kezelési körülmények között (koncentrációk, kezelési idõ), amelyek nem váltanak ki semmiféle toxicitást egy klasszikus életképességi tesztben, mint amilyen az MTT-teszt. Ebbõl a vizsgálatból több jelentõs tény derül ki: – ebben a primer patkány hepatocita modellben csak az F2695, vagyis az F2207 farmakológiailag aktív enantiomere az, amely nem vált ki szignifikáns toxicitási indexet; – az F2696, az F2207 inaktív enantiomere, és a klomipramin, amely a referenciapszichotróp, jelentõs toxicitási indexet mutatnak, amelyeket közös vagy egymáshoz nagyon közeli stresszazonosítók alkotnak. Ebben a rendszerben a klomipramin, vagyis a pozitív referenciamolekula az a termék, amely a legtöbb stresszazonosítót váltja ki, és jelentõs indexeket kapunk már a legkisebb koncentrációtól kezdve. Ezzel kapcsolatban érdekes megemlíteni, hogy a klomipramin képes bizonyos számú nemkívánatos hatást kiváltani az embernél, mint amilyen a szapora szívverés, a felálláskor jelentkezõ alacsony vérnyomás, vezetési vagy ritmuszavarok és kivételes esetekben a hepatitis. A klomipramin véletlen túladagolása esetén megfigyelhetünk többek között ájulást, hematológiai zavarokat és súlyos szív- és érrendszeri tüneteket. Anélkül, hogy egy fiziopatológiai mechanizmus meglétét elõre vetítenénk, érdekes megjegyezni, hogy

1

HU 004 186 T2

az F2696 a klomipraminéval azonos vagy nagyon közeli stresszazonosítókat mutat, és szintén olyan nem kívánt hatásokat vált ki, mint amilyenek az elõzõekben ismertetett szív- és érrendszeri zavarok. Így tehát jogos arra gondolni, hogy a megfigyelt azonosítók függetlenek bármiféle antidepresszáns vagy még általánosabban pszichotróp profiltól. Ezeket inkább „stresszazonosítók”-ként kell tekinteni (az F2696 közelebbrõl egy, a fehérjeszintézisben részt vevõ gén, és egy transzláció iniciáló faktor expressziójának csökkenését váltja ki). Mindez az aktív F2695 enantiomer jobb toxikogenomikai profilját igazolja, amelynek a biztonsági koefficiense ennek a modellnek az alapján sokkal jobb, mint az F2696¹é.

5

10

15 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. A milnaciprán (1S,2R)-enantiomere (Z(±)-2(amino-metil)¹N,N-dietil-1-fenil-ciklopropánkarboxamid) vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sója alkalmazása depresszió, vizeletinkontinencia, általános szorongás, pánikrohamok, fóbia, obszesszív-kompulzív zavarok, viselkedési zavarok, fáradtság és az ezt kísérõ fájdalom szindrómák, fájdalom és drogfüggés megelõzésére vagy kezelésére szánt gyógyszer elõállítására májés/vagy veseelégtelenségben szenvedõ betegeknél, szervi és/vagy máj vagy vese szöveti toxicitást elõidézõ kezelésben részesülõ betegeknél, szívkezelésben részesülõ betegeknél, szív- és érrendszeri mellékhatásokat elõidézõ kezelésben részesülõ betegeknél, szív- és érrendszeri elõzményekkel rendelkezõ és/vagy szív- és érrendszeri zavarokban szenvedõ betegeknél, csökkentve a racém keverék formájában levõ milnaciprán beadásával kapcsolatos szív- és érrendszeri zavarok kockázatát. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a szív- és érrendszeri zavarok megfelelnek az artériás vérnyomás növekedésének és/vagy a szívfrekvencia növekedésének. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az artériás vérnyomás növekedése megfelel a diasztolés artériás vérnyomás növekedésének. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, csökkentve a szervi és/vagy szöveti toxicitás kockázatát is. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a szervi toxicitás szívtoxicitás, és a szöveti toxicitás máj- és/vagy vesetoxicitás. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a milnaciprán (1S,2R)enantiomere a Z¹(1S,2R)-2-(amino-metil)¹N,N-dietil-1fenil-ciklopropánkarboxamid-hidroklorid (F2695). 7. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás mélydepresszió, rezisztens depresszió, idõs emberek depressziója, pszichotikus depresszió, interferonkezelés által kiváltott depresszió, depresszív állapot, mániás depressziós szindróma, szezonális depresszív epizódok, egy általános egészségi állapottal kapcsolatos depresszív epizódok, kedélyállapotot befolyásoló szerekkel kapcsolatos depressziós epizódok kezelésére.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

8. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás tériszony, krónikus fájdalom, krónikus fáradtság szindróma vagy fibromialgia kezelésére. 9. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás stressz-vizeletinkontinencia vagy ágybavizelés kezelésére vagy megelõzésére. 10. Az 1–6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás dohánytól, alkoholtól, narkotikumoktól, drogoktól, valamint az ilyen a függõségi állapotok esetén az elvonókúra során használt fájdalomcsillapítóktól való szorongásos függõség kezelésére. 11. Az 1–10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a szív- és érrendszeri elõzmények és/vagy a szív- és érrendszeri zavarok szívinfarktus, szívritmuszavarok (szapora szívverés, lassú szívverés, erõs szívdobogás), artériás vérnyomászavarok (alacsony vagy magas vérnyomásos betegek) és a szívbántalmak. 12. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszer tartalmaz: a) a milnaciprán említett (1S,2R)-enantiomerét vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sóját, és b) legalább egy hatóanyagot a pszichotrópok, különösen az antidepresszánsok és az antimuszkarin szerek közül, kombinációs termékekként egyidejû, külön-külön vagy idõben eltolt módon történõ alkalmazásra depresszió, különösen mélydepresszió, rezisztens depresszió, idõs ember depressziója, pszichotikus depresszió, interferonkezelés által kiváltott depresszió, depresszív állapot, mániás depressziós szindróma, szezonális depresszív epizódok, általános egészségi állapottal kapcsolatos depresszív epizódok, kedélyállapotra ható szerekkel kapcsolatos depressziós epizódok megelõzésére vagy kezelésére. 13. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszer tartalmaz a) a milnaciprán említett (1S,2R)-enantiomerét vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sóját, és b) legalább egy hatóanyagot szervi toxicitást kiváltó hatóanyagok és sejttoxicitást, közelebbrõl máj- és/vagy vesetoxicitást kiváltó hatóanyagok közül, kombinációs termékként egyidejû, külön-külön vagy idõben eltolt alkalmazásra depresszió, vizeletinkontinencia, általános szorongás, fáradtság és az ezt kísérõ fájdalom szindrómák, fájdalom és drogfüggõség kezelésére vagy megelõzésére. 14. Az 1–11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszer tartalmaz: a) a milnaciprán említett (1S,2R)-enantiomerét vagy valamely gyógyászatilag elfogadható sóját, és b) legalább egy hatóanyagot szív- és érrendszeri mellékhatást kiváltó aktív vegyületek közül, kombinációs termékként egyidejû, külön-külön vagy idõben eltolt alkalmazásra depresszió, vizeletinkontinencia, általános szorongás, fáradtság és az ezt kísérõ fájdalom szindrómák, fájdalom és drogfüggõség kezelésére vagy megelõzésére.

HU 004 186 T2 Int. Cl.: A61K 31/135

22

HU 004 186 T2 Int. Cl.: A61K 31/135

23

HU 004 186 T2 Int. Cl.: A61K 31/135

24

HU 004 186 T2 Int. Cl.: A61K 31/135

25

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest