(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000005805T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 005 805

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/575

(21) Magyar ügyszám: E 06 710361 (22) A bejelentés napja: 2006. 01. 30. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060710361 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1846445 A1 2006. 08. 10. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1846445 B1 2009. 03. 25.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 650366 P 2005. 02. 04. 733656 P 2005. 11. 04.

(73) Jogosult: Pfizer Products Incorporated, Groton, CT 06340 (US)

US US

(72) Feltalálók: FINN, Rory Francis, Pfizer Global R. & D., Chesterfield, MO 63017-1732 (US); SIEGEL, Ned Roger, Pfizer Global R. & D., Chesterfield, MO 63017-1732 (US); SUMMERS, Neena Lynne, St. Charles, MO 63304-2423 (US); NARDONE, Nancy Ann, Pfizer Global R. & D., Groton, CT 06340 (US) (54)

(2006.01) A61K 38/22 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06082517 PCT/IB 06/000270

(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

PYY agonisták és alkalmazásaik

(57) Kivonat

HU 005 805 T2

A találmány tárgya PYY változatok és pegezett származékaik és készítmények és eljárások, amelyek NPY

Y2 receptor agonista által modulált állapotok kezelésére szolgálnak.

A leírás terjedelme 48 oldal (ezen belül 16 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 005 805 T2

A találmány területe A találmány tárgyát képezik PYY agonisták, különösen PYY3–36 variánsok és PYY3–36 és PYY3–36 variánsok pegezett származékai, az ilyen agonistákat tartalmazó készítmények, ilyen PYY agonistákat kódoló izolált nukleinsavak, a találmány tárgya továbbá az ilyen agonisták vagy készítmények alkalmazása elhízás és a hozzá kapcsolódó betegségek kezelésére, vagy emlõsszervezet étvágyának, élelmiszer-bevitelének vagy kalóriabevitelének csökkentésére. A találmány háttere Az elhízás egy fontos közegészségügyi probléma a növekvõ gyakorisága és a hozzá kapcsolódó egészségügyi kockázatok következtében. Továbbá az elhízás befolyásolhatja személy életminõségét a korlátozott mozgékonyságon és a lecsökkent fizikai teljesítõképességen keresztül, valamint a szociális, tanulmányi és munkahelyi diszkrimináció révén. Az elhízottságot és a túlsúlyosságot általánosan a testtömegindex (Body Mass Index, BMI) alkalmazásával definiálják, ami korrelál a teljes testzsírmennyiséggel és egyes betegségek kockázatának mértékeként szolgál. A BMI értékét a kg¹ban megadott testtömeg m¹ben megadott testmagasság négyzetével történõ elosztásával számoljuk ki (kg/m2). A túlsúlyosságot jellemzõen 25–29,9 kg/m2 BMI-értékkel definiáljuk és az elhízottságot jellemzõen 30 kg/m2 vagy ennél nagyobb BMI-értékkel definiáljuk. Lásd például National Heart, Lung, and Blood Institute, Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adults, The Evidence Report, Washington, DC: U. S. Department of Health and Human Services, NIH közzétételi szám: 98–4083 (1998). Nemrégiben végzett vizsgálatok azt találták, hogy az elhízottság és a hozzá kapcsolódó egészségügyi kockázatok nem korlátozódnak felnõttekre, hanem meglepõ mértékben érint gyermekeket és serdülõkorúakat is. A Center for Disease Control nevû szervezet szerint a túlsúlyosnak definiált gyermekek és serdülõk százalékos aránya több, mint megkétszerezõdött a korai 1970¹es évek óta, és jelenleg a gyermekek és serdülõkorúak körülbelül 15 százaléka túlsúlyos. A szívbetegségek kockázati tényezõi, mint amilyen a magas koleszterinszint és magas vérnyomás, nagyobb gyakorisággal fordul elõ túlsúlyos gyermekekben és serdülõkorúakban a hasonló korú normális testsúlyú alanyokhoz képest. Továbbá a 2¹es típusú cukorbetegség, amelyet korábban felnõttkori betegségnek tartottak, elõfordulása drámaian megnövekedett gyermekek és serdülõkorúak esetében. A túlsúlyos állapotok és az elhízottság szorosan kapcsolódik a 2¹es típusú cukorbetegséghez. Nemrégiben azt becsülték, hogy a túlsúlyos serdülõkorúaknak 70%¹os az esélyük arra, hogy túlsúlyos vagy elhízott felnõtté váljanak. A valószínûség 80%¹ra növekszik, amennyiben legalább az egyik szülõ túlsúlyos vagy elhízott. A társadalmi diszkrimináció a túlsúlyosság legközvetlenebb következménye, amit a gyermekek maguk is érzékelnek. A túlsúlyos vagy elhízott egyének esetében megnövekszik az olyan betegségek kockázata, mint a magas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

vérnyomás, diszlipidémia, 2¹es típusú (nem inzulinfüggõ) cukorbetegség, inzulinrezisztencia, glükózintolerancia, hiperinzulinémia, szívkoszorúér-betegség, torokgyulladás, szívszélhûdés, szélütés, epekövek, epehólyag-gyulladás, epekõbántalom, köszvény, csontízületi gyulladás, obstruktív alvási légzésszünet és légzési problémák, epehólyag-betegség, bizonyos rákformák (például: endometriális, mell¹, prosztata- és vastagbél¹) és pszichológiai rendellenességek (mint például depresszió, evési rendellenességek, torzult testkép és kis önbecsülés). Az elhízottság negatív egészségügyi következményei a második megelõzhetõ halálokká teszik az elhízottságot az Egyesült Államokban és jelentõs gazdasági és pszichológiai hatással van a társadalomra. Lásd: McGinnis M, Foege WH., „Actual Causes of Death in the United States”, JAMA 270:2207–12, 1993. Az elhízottságot jelenleg krónikus betegségként azonosítják, amely kezelésre szorul a hozzá kapcsolódó egészségügyi kockázatok csökkentésére. Habár a testtömegcsökkenés egy fontos kezelési eredmény, azonban az elhízottság kezelésének az egyik legfontosabb célja a kardiovaszkuláris és metabolikus értékek javítása az elhízottsághoz kapcsolódó morbiditási és mortalitási értékek csökkentésére. Azt találták, hogy 5–10%¹os testtömegcsökkenés lényegesen javíthatja az olyan metabolikus értékeket, mint amilyen a vércukorszint, vérnyomás és lipidkoncentrációk. Tehát úgy gondolják, hogy 5–10%¹os testtömegcsökkenés csökkentheti a morbiditást és mortalitást. Az elhízottság kezelésére szolgáló jelenleg elérhetõ vényre kapható gyógyszerek általánosan csökkentik a testtömeget a táplálék-zsírfelvétel általános csökkentése révén, mint az orlistat, vagy energiahiány létrehozásával az élelmiszerbevitel csökkentésén keresztül és/vagy az energiafelhasználás növelése révén, amint ez a sibutramine esetén látható. A jelenleg elérhetõ elhízás elleni ágensek alternatíváinak megtalálására végzett kutatás számos úton indult el, amelyek egyike egyes bélpeptidekre fókuszált, amelyekrõl azt mutatták ki, hogy modulálják a jóllakottságot, mint például az YY peptid (PYY). A PYY a hormonok hasnyálmirigyi („pancreatic polypeptide”, PP) családjának tagja [a PP¹vel és az Y neuropeptiddel együtt (NPY)]. Amint a többi családtagok esetén a PYY egy C¹terminálisan amidált, 36 aminosavból álló peptid. Ez egy bél endokrin peptid, amelyet eredetileg sertésbélbõl izoláltak (Tatemoto és Mutt, Nature 285:417–418, 1980) és ezt követõen arról számoltak be, hogy csökkenti patkányok esetében a magas zsírtartalmú élelmiszer-bevitelt periferiális beadást követõen (Okada és munkatársai, Endocrinology Supplement 180, 1993) és egerekben súlycsökkenést vált ki periferiális beadást követõen (Morley és Flood, Life Sciences 41:2157–2165, 1987). Számos tárolt és cirkuláló PYY forma létezésérõl tudunk (Chen és munkatársai, Gastroenterology 87:1332–1338, 1984; és Roddy és munkatársai, Regul Pept 18:201–212, 1987). Az egyik ilyen forma, a PYY3–36, humán vastagbélnyálkahártya-kivonatokból lett izolálva (Eberlein és munkatársai, Peptides 10:797–803, 1989), és ezt találták a

1

HU 005 805 T2

PYY domináns formájának a human posztprandiális plazmában (Grandt és munkatársai, Regul. Pept. 51:151–159, 1994). Beszámolók szerint a PYY3–36 nagy affinitású NPY Y2 receptor (Y2R) szelektív agonista (Keire és munkatársai, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279:G126-G131, 2000). A PYY3–36 periferiális beadása jelentõsen csökkenti patkányok esetében a táplálékbevitelt és a súlygyarapodást, emberek esetében csökkenti az étvágyat és a táplálékbevitelt, és csökkenti egerek esetében a táplálékbevitelt, de nem csökkenti Y2R-null egerekben, amelyrõl azt gondolták, hogy a táplálékbevitelhez szükséges az Y2R. Humán vizsgálatokban a PYY3–36 infúziójáról azt találták, hogy szignifikánsan csökkenti az étvágyat és 24 óra alatt 33%-kal csökkenti a táplálékbevitelt. A normális posztprandiális cirkulációs peptidkoncentrációk elérésére végzett PYY 3–36 infúzió csúcs szérum PYY3–36 szintekhez vezettek 15 percen belül, amit gyors, az alapértékekre történõ csökkenés követett 30 percen belül. Arról számoltak be, hogy a PYY3–36 infúziót követõ 12 órás idõszakban jelentõs táplálékbevitel-gátlás volt, de lényegében nem volt hatása a táplálékbevitelre a 12 órától 24 óráig terjedõ idõszakban. Egy patkányvizsgálatban az ismételt PYY3–38 IP (napi kétszeri injekció, 7 napon át) beadás csökkentette az összesített táplálékbevitelt (Batterham és munkatársai, Nature 418:650–654, 2002). Polipeptidalapú gyógyszerek, amelyek kovalensen vannak polimerekhez, mint például polietilénglikolhoz kapcsolva növelik az in vivo féléletidejüket. Azonban ez gyakran a biológiai vagy farmakológiai aktivitás drasztikus elvesztéséhez vezet (Shechter és munkatársai, FEBS Letters 579:2439–2444, 2005; Fuerteges és Abuchowski, J. Control Release 11:139–148, 1990; Katre, Adv. Drug Del. Sys. 10:91–114, 1993; Bailon és Berthold, Pharm. Sci. Technol. Today 1:352–356, 1996; Nucci és munkatársai, Adv. Drug Delivery Rev. 6, 1991; Delgado és munkatársai, Critical Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9:249–304, 1992; Fung és munkatársai, Polym. Preprints 38:565–566, 1997; Reddy, Ann. Pharmacother. 34:915–923, 2000; Veronese, Biomaterials 22:405–417, 2001). Például Shechter és munkatársai, fent, arról számoltak be, hogy a PYY3–36 standard kémiával végzett 40 kD pegezése, stabil kötés kialakításán keresztül (40 kD PEG-PYY3–36), a teljes inaktiválásához vezetett egereken végzett táplálékbevitel-vizsgálatokban (sc. injekció). Arról is beszámoltak, hogy a PYY3–36 reverzíbilis pegezése (40 kD PEGFMS-PYY3–36) a funkcionális féléletidõ nyolcszoros növekedését eredményezte (24 óra a 3 órával szemben). Lásd még a WO 2004/089279 és WO 03/026591 számú nemzetközi szabadalmi bejelentéseket. A találmány összefoglalása A találmány tárgyát képezik PYY agonisták, amelyek hPYY3–36 variánsai. A találmány egy szempontja szerint a PYY agonista a humán PYY3–36 variánsa, amelyben a 10. aminosav (glutaminsav) vagy a 11. aminosav (aszparginsav) ki van cserélve ciszteinre, és amely azzal a funkcióval

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

2

bír, hogy konjugálható hidrofil polimerrel, mint például polietilénglikollal (PEG). A megfelelõ variánsok tehát a következõk: (E10C)PYY3–36 és (D11C)PVV3–36. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a PYY agonista az (E10C)hPYY3–36 polipeptid, amelynek aminosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:3], vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint a PYY agonista a (D11C)hPYY3–36 polipeptid, amelynek aminosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:4], vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. Legelõnyösebben az agonista az (E10C)hPYY3–36. A találmány szerinti PYY agonista elõnyösen konjugálva van hidrofil polimerrel, elõnyösen PEG-gel. Az agonista elõnyösen monopegezett, azaz az agonista:PEG arány körülbelül 1:1, ami konjugálható funkciós csoporthoz van kötve. A PEG lehet lineáris, elágazó vagy lelógó; elõnyösebben lineáris vagy elágazó; legelõnyösebben lineáris. A lineáris PEG-eknek, a PEG egyik vége olyan csoporttal van lefedve, amely közömbös a PEG¹et az agonistához kapcsoló körülmények esetén, például étercsoport, elõnyösebben metoxicsoport. Az ilyen módon terminált PEG-eket (azaz metoxicsoporttal) gyakran nevezik mPEG-eknek. A másik vég aktiválva van a PYY agonistához történõ kapcsolódásra. Hasonló módon, a találmányban alkalmazható elágazó PEG¹ek esetén egy kivételével az összes vég le van éterrel fedve, és az éterrel nem lefedett vég van a kapcsolódásra aktiválva. Egy megvalósítási mód szerint a nem éterrel lefedett PEG-vég egy kapcsolórésszel („L”) van lefedve, amely a PEG¹et egy olyan funkcióscsoporthoz köti, amely reagál a cisztein-aminosav konjugálható funkcióscsoportjával, hogy olyan konjugátum jöjjön létre, amelyben a PEG kovalens módon van a konjugálható funkcióscsoportjához kötve. Egy további megvalósítási mód szerint a PEG közvetlenül van a reaktív csoporthoz kötve kapcsolórész közbeiktatása nélkül. Az ilyen PEG-eket gyakran nevezik „kapcsoló nélküli” PEG-eknek. Az (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36 polipeptidek esetén a PEG nem lefedett vége elõnyösen egy kapcsolóhoz van kötve, amely a PEG¹et maleimidvagy egyéb csoporthoz köti, amely reagál a ciszteinaminosav tioljával, hogy ezáltal olyan konjugátum jöjjön létre, ahol a PEG kovalensen van kötve a cisztein tiolcsoportjához. Az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)PYY3–36 peptiddel alkalmazható megfelelõ reaktív PEG-ekhez tartoznak a következõ képletû PEG¹ek:

55

60 3

,

1

HU 005 805 T2

mPEG–SO2CH=CH2, mPEG–HN–COCH2I és

5 . Elõnyösen a PEG a fent ismertetett mPEG-maleimid, amely tartalmaz kapcsolórészt, –L–. A kapcsolórész nélküli PEG-maleimidek szintén alkalmasak a találmányban történõ alkalmazásra, különösen az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)PYY3–36 peptidekkel. Az ilyen kapcsolórész nélküli PEG-maleimidek elõállíthatóak, amint azt Goodson és Katre ismertették, Bio/Technology 8:343–346, 1990. Az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)PYY3–36 polipeptidek és a fent ismertetett mPEG¹ek párosításával elõállított konjugátumokat a következõ képletekkel ismertetjük, ahol –SR jelentése (E10C)hPYY 3–36 vagy (D11C)PYY3–36 polipeptid, amelyben S a cisztein tiolcsoportjának kénatomját jelöli:

10

15

20

25

, mPEG–SO2CH2CH2SR, mPEG–HN–COCH2SR és mPEG–S–SR. A kapcsoló –L– csupán arra szolgál, hogy összekapcsolja a PEG¹et a reaktív funkcióscsoporttal és ezért nem különösen korlátozó, de elõnyösen tartalmaz észterkötést, uretánkötést, amidkötést, éterkötést, karbonátkötést, vagy másodlagos aminocsoportot tartalmazó alkiléncsoportot. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint, különösen lineáris PEG¹ek esetén a kapcsoló a következõ képletû csoport: –O(CH2)pNHC(O)(CH2)r–, amelyben p jelentése 1 és 6 közötti egész szám, elõnyösen, 1 és 3 közötti, még elõnyösebben, 2 vagy 3, legelõnyösebben 3, és r jelentése 1 és 6 közötti egész szám, elõnyösen, 1 és 3 közötti, még elõnyösebben, 2 vagy 3, legelõnyösebben 2. Egy elõnyös kapcsoló a következõ csoport: –CH2CH2CH2NHCOCH2CH2–, Egy további elõnyös megvalósítási mód szerint, különösen elágazó PEG¹ek esetében a kapcsoló a következõ képletû csoport: –NHC(O)(CH2)s–, amelyben s jelentése 1 és 6 közötti egész szám, elõnyösen, 1 és 3 közötti, még elõnyösebben, 2 vagy 3, legelõnyösebben 2. Egy elõnyös kapcsoló a következõ csoport: –NHC(O)CH2CH2–. A PEG lehet lineáris vagy nem lineáris, például elágazó vagy lelógó. Elõnyösen a PEG lineáris vagy el-

2

ágazó, elõnyösen lineáris vagy elágazó mPEG-maleimid. Glicerinelágazó mPEG-maleimid egy elõnyös elágazó PEG. Elõnyösen a PEG lineáris mPEG-maleimid. A PEG-nek elõnyösen az átlagos molekulatömege a körülbelül 1 kD–körülbelül 50 kD tartományba esik. Elõnyösen az átlagos molekulatömege a körülbelül 5 kD–körülbelül 45 kD tartományba esik; elõnyösebben az átlagos molekulatömege körülbelül 10–12 kD–körülbelül 40–45 kD, vagy körülbelül 20 kD–körülbelül 40–45 kD. Különösen jelentõs a lineáris mPEG, mint például amilyet az (1) képleten mutattunk be, amelynek az átlagos molekulatömege körülbelül 20 vagy körülbelül 30 kD. A (2) képlet szerinti glicerinelágazó mPEG szintén jelentõs és elõnyösen az átlagos molekulatömege körülbelül 20 kD vagy körülbelül 43 kD. Az elõnyös PEG¹ek, amelyek aktiválva vannak az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)PYY3–36 peptidek cisztein-tiolcsoportjával történõ konjugációra az (1) és (2) képlet szerinti vegyületek. Az (1) képlet szerinti lineáris mPEG-ben n jelentése egy körülbelül 175–800 tartományba esõ egész szám; elõnyösen, körülbelül 375–525 vagy körülbelül 600–750, vagy körülbelül 425–475 vagy körülbelül 650–700, vagy körülbelül 437–463 vagy 675–700. A (2) képlet szerinti glicerinelágazó mPEG-ben minden egyes m jelentése körülbelül azonos és körülbelül 150–500 tartományba esõ egész szám; elõnyösen körülbelül 160–285 vagy körülbelül 400–525, vagy körülbelül 200–250 vagy 450–500.

30

35

1

40

45

2 50 Sokféle PEG, amelyek peptid-aminosavak oldalláncaiban lévõ célfunkcióscsoportokhoz, például keto, tiol, hidroxi, karboxi, vagy szabad amino funkcióscsoportok, történõ konjugálásra aktiválva vannak elérhetõk a ke55 reskedelemben számos szállítótól, például a következõktõl: NOF Corporation, Tokió, Japán, vagy Nektar Therapeutics Corporation, Huntsville, AL. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya a PYY3–36-variánsok és polietilénglikol 60 konjugátumai. 4

1

HU 005 805 T2

2

Egy megvalósítási mód szerint a konjugátum a (3) képlet szerinti:

5

10 3 ahol az mPEG-rész lineáris vagy elágazó és az átlagos molekulatömege a körülbelül 1 kD–50 kD tartományba esik, elõnyösen, 5 kD–körülbelül 45 kD, elõnyösebben körülbelül 10 kD vagy 12 kD–körülbelül 40 kD vagy 45 kD, vagy körülbelül 20 kD–körülbelül 40 kD vagy 45 kD, L jelentése a következõ képlet szerinti csoport: –O(CH2)pNHC(O)(CH2)r– amelyben p jelentése 1 és 6 közötti egész szám, elõnyösen, 1 és 3 közötti, még elõnyösebben, 2 vagy 3, legelõnyösebben 3, és r jelentése 1 és 6 közötti egész szám, elõnyösen, 1 és 3 közötti, még elõnyösebben, 2 vagy 3, legelõnyösebben 2; vagy L jelentése a következõ képlet szerinti csoport: –NHC(O)(CH2)s– amelyben s jelentése 1 és 6 közötti egész szám, elõnyösen, 1 és 3 közötti, még elõnyösebben, 2 vagy 3, legelõnyösebben 2; és –SR jelentése az (E10C)hPVV3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 polipeptid, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelöli. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a (4) képlet szerinti lineáris mPEG-PYY3–36 variáns konjugátum

5 15

20

25

30

35

40

4 45 ahol n jelentése körülbelül 175–800 tartományba esõ egész szám; elõnyösen körülbelül 375–525 vagy körülbelül 600–750, vagy körülbelül 437–463 vagy körülbelül 675–700; és –SR jelentése (E10C)hPVV3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 polipeptid, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelöli; vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. Elõnyösen a (CH2CH2O)n rész átlagos molekulatömege körülbelül 20 kD vagy 30 kD. Különösen jelentõs az a konjugátum, amelyben az –SR az (E10C)hPYY3–36 polipeptid. Egy további szempont szerint a találmány tárgya olyan konjugátum, amelyben a PEG-rész elágazó. Ezen kategória elõnyös konjugátumai tartalmaznak glicerinelágazó PEG-részt. Különösen jelentõs az (5) képlet szerinti konjugátum:

50

55

60 5

ahol minden egyes m jelentése körülbelül azonos és körülbelül 150–550 tartományba esõ egész szám; elõnyösen körülbelül 160–285 vagy körülbelül 400–525, vagy körülbelül 200–250 vagy körülbelül 450–500, és –SR jelentése (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 polipeptid, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelöli; vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. Elõnyösen minden egyes (CH2CH2O)m rész molekulatömege a körülbelül 9–11 kD vagy körülbelül 20–22 kD tartományba esik. Elõnyösen a kombinált átlagos molekulatömege a (CH2CH2O)m részeknek körülbelül 20 kD vagy körülbelül 43 kD. Különösen jelentõs az a konjugátum, amelyben az –SR az (E10C)hPYY3–36 polipeptid. A találmány tárgya továbbá monoklonális antitest, amely specifikusan kötõdik olyan polipeptidhez, amely tartalmazza a 3. vagy 4. azonosító számú szekvencián bemutatott aminosavszekvenciát. A találmány ezen szempontjának egy megvalósítási módja szerint a polipeptid pegezett a cisztein-aminosavnál. Továbbá a találmány tárgya polinukleotidszekvencia, amely a találmány szerinti polipeptidszekvenciát kódolja, elõnyösen a 3. vagy 4. azonosító számú szekvenciát kódolja. A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti PYY agonistát és gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz. Egy további megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz továbbá legalább egy további gyógyászati ágenst, amely lehet olyan ágens, amely alkalmas a készítmény elsõdleges indikációjának kezelésére vagy az elsõdleges indikációval együtt járó betegség kezelésére. A további gyógyászati ágens elõnyösen elhízás elleni ágens. A készítmény elõnyösen tartalmazza a találmány szerinti PYY agonista terápiásan hatásos mennyiségét vagy a találmány szerinti PYY agonista és a további gyógyászati ágens terápiásan hatásos mennyiségét. A találmány tárgya továbbá a jelen vegyületek alkalmazása gyógyszer elõállítására, amely gyógyszer a következõkben történõ alkalmazásra szolgál: emlõsökben Y2R agonista által modulált betegség, állapot vagy rendellenesség kezelésére szolgáló eljárás, amely tartalmazza ilyen kezelésre szükséget mutató emlõsnek a találmány szerinti PYY agonista hatásos mennyiségének periferiális beadását. A találmány szerinti PYY

1

HU 005 805 T2

agonista alkalmazható önmagában vagy legalább egy gyógyszerészeti ágenssel kombinációban, amely ágens alkalmas betegség, állapot vagy rendellenesség, vagy együttesen elõforduló betegség, állapot vagy rendellenesség kezelésére. Emlõsökben Y2R agonista által modulált betegségek, állapotok vagy rendellenességek közé tartozik az elhízottság és a túlsúlyosság. Az ilyen betegségek, állapotok vagy rendellenességekkel együttesen elõforduló betegségek valószínûleg egyidejûleg javulnának az ilyen betegségek, állapotok vagy rendellenességek kezelésével. A találmány tárgya továbbá a jelen vegyületek alkalmazása gyógyszer elõállítására, amely gyógyszer a következõkben történõ alkalmazásra szolgál: ilyen kezelésre szükséget mutató emlõs elhízottságának kezelése, amely tartalmazza a találmány szerinti PYY agonista hatásos mennyiségének periferiális beadását az emlõsnek. A találmány tárgya továbbá eljárás tömegcsökkentésre vagy tömegcsökkentés elõsegítésére (ideértve a súlygyarapodás megelõzését és meggátlását) emlõsben, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti PYY agonista súlykontrolláló vagy súlycsökkentõ mennyiségének periferiális beadását az emlõsnek. A találmány tárgya továbbá eljárás táplálékbevitel csökkentésére emlõsben, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti PYY agonista táplálékbevitel-csökkentõ mennyiségének periferiális beadását az emlõsnek. A találmány tárgya továbbá eljárás jóllakottság érzetének elõidézésére emlõsben, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti PYY agonista jóllakottságot elõidézõ mennyiségének periferiális beadását az emlõsnek. A találmány tárgya továbbá eljárás kalóriabevitelcsökkentésre emlõsben, amely eljárás tartalmazza a találmány szerinti PYY agonista kalóriabevitelt csökkentõ mennyiségének periferiális beadását az emlõsnek. A PYY agonista beadható önmagában vagy legalább egy gyógyászati hatóanyaggal kombinációban, elõnyösen elhízás elleni ágenssel kombinációban. Az itt ismertetett eljárások mindegyikében és a kapcsolódó igénypontokban a PYY agonista beadható önmagában vagy legalább egy gyógyászati hatóanyaggal kombinációban, elõnyösen elhízás elleni ágenssel kombinációban. A PYY agonisták és az õket tartalmazó készítmények szintén alkalmasak az itt említett terápiás alkalmazásokra szolgáló gyógyszerek elõállítására. Definíciók és rövidítések A „gyógyászatilag elfogadható” kifejezés azt jelenti, hogy az anyag vagy készítmény kémiailag és/vagy toxikológiailag kompetens kell, hogy legyen a kiszerelés további összetevõivel, és/vagy a vele kezelt emlõssel. A „PYY agonista” kifejezés, bármely olyan vegyületet jelöl, amely hPYY3–36 által kiváltott egy vagy több hatással megegyezõ hatást vált ki in vivo vagy in vitro. A „terápiásan hatásos mennyiség” kifejezés a találmány szerinti PYY agonista olyan mennyiségét jelenti, amely csökkenti a kalóriabevitelt, csökkenti a testtö-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

meget és/vagy csökkenti a testzsírt a megfelelõ kontrollértékekhez képest, amelyek a kezelést megelõzõen lettek meghatározva vagy hordozóval kezelt csoportban. Az „emlõs” kifejezés jelent embert, valamint az állatkirályság további meleg vérû tagjait, amelyeknek az emlõsosztályra jellemzõ homeosztatikus mechanizmusaik vannak, például társemlõsök, állatkerti emlõsök és táplálékforrás-emlõsök. A társként szolgáló emlõsök néhány példája a kutyafélék (például kutyák), macskafélék (például macskák) és a lovak; a táplálékforrásemlõsök néhány példája közé tartoznak a disznók, szarvasmarhák, juhok és a hasonlók. Elõnyösen az emlõs ember vagy társemlõs. Legelõnyösebben az emlõs ember, férfi vagy nõ. A „kezelni”, „kezel” vagy „kezelés” kifejezések magukban foglalnak mind megelõzõ, azaz profilaktikus, mind palliatív kezelést. A „periferiális beadás” kifejezés azt jelenti, hogy a beadás a központi idegrendszeren kívül történik. A periferiális beadás nem tartalmazza az agyba történõ közvetlen beadást. A periferiális beadás tartalmazza, nem korlátozó módon, a következõ beadási módokat: intravaszkuláris, intramuszkuláris, szubkután, inhalációs, orális, nyelv alatti, enterális, rektális, transzdermális vagy intranazális. A „human PYY” vagy „hPYY” kifejezés 36¹aminosavas C¹terminálisan amidált polipeptidet jelöl, amelynek az aminosavszekvenciája a következõ: YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEC ID NO:1] A „hPYY3–36” kifejezés a hPYY C¹terminális 34¹merét jelöli, amelynek az aminosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:2] A „(E10C)hPYY3–36” kifejezés a hPYY C¹terminális 34¹merét jelöli, amelyben a 10¹es glutaminsav ciszteinre van cserélve, és amelynek az aminosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:3]. A „(D11C)hPYY3–36” kifejezés a hPYY C¹terminális 34¹merét jelöli, amelyben a 11¹es aszparaginsav ciszteinre van cserélve, és amelynek az aminosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGECASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 [SEQ ID NO:4]. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra fordított fázisú HPLC, amely a tisztított (E10C)hPYY3–36 peptidet követi Zorbax Eclipse XDB¹C8 oszlopon. A 2. ábra méretkizárásos HPLC, amely a lineáris 30K mPEG-maleimid és az (E10C)hPYY3–36 reakcióelegyet követi Shodex 804 SEC oszlopon. A 3. ábra SP Hitrap tisztításból származó lineáris 30K mPEG-maleimid és az (E10C)hPYY3–36 frakciók SDS PAGE fo-

1

A 4. ábra

Az 5. ábra

A 6. ábra

A 7. ábra

A 8. ábra

A 9. ábra

A 10. ábra

A 11. ábra

A 12. ábra

A 13. ábra

HU 005 805 T2

tója. MT=molekulatömeg standardok; L=oszloptöltet; FT=átáramlás; 4–23=elúciós frakciók. fordított fázisú HPLC, amely a tisztított (D11C)hPYY3–36 peptidet követi Zorbax Eclipse XDB¹C8 oszlopon. méretkizárásos HPLC, amely a lineáris 30K mPEG-maleimid és a (D11C)hPYY3–36 reakcióelegyet követi Shodex 804 SEC oszlopon. méretkizárásos HPLC, amely a tisztított lineáris 30K mPEG-maleimid és a (D11C)hPYY 3–36 terméket követi és mutatja az elúciós profilját Shodex 804 SEC oszlopon. méretkizárásos HPLC, amely a tisztított lineáris 30K mPEG-maleimid és a (D11C)hPYY 3–36 terméket követi és mutatja az elúciós profilját Shodex 804 SEC oszlopon. méretkizárásos HPLC, amely a glicerinelágazó 43K mPEG-maleimid és az (E10C)hPYY3–36 reakcióelegyet követi Shodex 804 SEC oszlopon. méretkizárásos HPLC, amely a glicerinelágazó 43K mPEG-maleimid és az (E10C)hPYY3–36 terméket követi és mutatja az elúciós profilját Shodex 804 SEC oszlopon. a kumulatív táplálékbevitel gátlásának grafikonja éheztetett egereknél intraperitoneális (IP) injekciót követõen. A 10A. ábra a natív PYY3–36 dózishatását mutatja a hordozós csoporthoz képest. A 10B. ábra a lineáris 30K mPEGmaleimid (E10C)hPYY3–36 dózishatását mutatja. IP injekció esetében mutatja a glicerinelágazó 43K mPEG-maleimid (E10C)PYY3–36 és a hordozó és a lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)PYY3–36 összehasonlító táplálékbevitel hatását éheztetett egereken. A 11A. ábra egy vonalgrafikon, amely az injekciót követõen 6 órával mutatja a választ. A 11B. ábra egy oszlopdiagram, amely összehasonlítja a hatásokat az injekciót követõen 24 órával. a hordozó, PYY3–36, és lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)PYY3–36 hatását mutatja IP injekció esetén, spontán módon táplált egerek esetében. A 12A. ábra a táplálékbevitel hatását mutatja, és a 12B. ábra a testtömegre kifejtett hatást mutatja. a hordozó, PYY3–36, és lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)PYY3–36 hatását mutatja szubkután (SC) injekció esetén, spontán módon táplált egerek esetében. A 13A. ábra a táplálékbevitel ha-

5

10

15

20

25

2

tását mutatja, és a 13B. ábra a testtömegre kifejtett hatást mutatja. A 14. ábra a plazmakitettséget mutatja PYY¹ra egerekben 0,1 mg/kg IP injekciót követõen. A 14A. ábra demonstrálja a plazma PYY szinteket hPYY3–36 injekcióját követõen és a 14B. ábra demonstrálja a plazma PYY szinteket lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 injekcióját követõen. A 15. ábra egy koncentrációválasz-görbe a PYY3–36 peptidre vagy a lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)PYY3–36 peptidre szcintillációs közelségvizsgálatból („Scintillation Proximity Assay”, SPA), amelyben a ligandok versengenek a 125I-PYY 1–36 peptiddel a KAN¹TS sejteken expresszált Y2R-hez történõ kötõdésért. A 16. ábra egy koncentrációválasz-görbe a PYY3–36 peptidre vagy a lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)PYY3–36 peptidre GTPgamma[35S] kötõdésvizsgálatból, ahol a KAN¹TS membránokon expresszált Y2R-hez kötõdik.

A találmány részletes ismertetése A találmány tárgyát képezik PYY agonisták, amelyek a hPYY3–36 variánsai és pegezett konjugátumai, 30 amelyeknek lehet legalább egy, a következõk közül nem korlátozó módon választott, javított kémiai vagy fiziológiai tulajdonságuk: lecsökkent kiürülési sebesség, megnövelt plazmatartózkodási idõ, kinyújtott in vivo aktivitás, megnövelt hatásosság, megnövelt stabilitás, 35 megnövelt szolubilizálhatóság és lecsökkentett antigenikusság. A találmány egy elõnyös a PYY3–36-variánsa az (E10C)hPYY 3–36 . További elõnyös variáns a (D11C)hPYY3–36. A találmány ezen variánsai elõállít40 hatóak szintetikusan és rekombináns vagy egyéb módokon, amint azt az alábbiakban ismertettük a példákban vagy ezekkel analóg eljárásokkal. Szintetikus elõállítás A találmány szerinti PYY3–36-variánsok, például (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36, elõállíthatóak a szakterületen ismert standard peptidszintézis-eljárásokkal, például szilárd fázisú peptidszintézissel, amelyet automata peptidszintetizátorral végzünk (például: 50 433A modell; Applied Biosystems, Foster City, CA) a tBoc vagy Fmoc kémia alkalmazásával. A számos elérhetõ peptidszintézis-eljárás egy összefoglalója megtalálható a következõben: Solid Phase Peptide Synthesis 2. kiad. (Stewart, J. M. és Young, J. D., Pierce Chemi55 cal Company, Rockford, IL, 1984). Lásd még a Solidphase Organic Synthesis címû könyvet (Burgess, K., John Wiley & Sons, New York, NY, 2000) és Engels és munkatársai szakcikkét, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716–34, 1989. A fenti hivatkozások hivatkozásként 60 a leírás részét képezik. 45

7

1

HU 005 805 T2

A találmány szerinti PYY3–36-variánsokat elõnyösen PEG-gel konjugáljuk. A konjugáló reakciókat, amelyekre pegezõ reakcióként hivatkoznak, történeti okokból oldatban végezték a polimer moláris feleslegében és tekintet nélkül arra, hogy a polimer pontosan hova is kapcsolódott a fehérjéhez. Az ilyen általános eljárásokról azonban jellemzõen bebizonyították, hogy nem megfelelõek bioaktív fehérjék konjugálására nem antigén polimerekhez, hogy közben elégséges biológiai aktivitásuk maradjon. A PYY3–36 agonistavariáns pegezést követõ bioaktivitásának fenntartására egy módja, hogy lényegében elkerüljük a kapcsolási folyamat során a variáns bármely reaktív csoportjának konjugációját, amely kapcsolódik az agonistának a célreceptorhoz való kötõdéséhez. A találmány egy szempontja szerint a találmány tárgya eljárás polietilénglikolnak a találmány szerinti PYY3–36-variáns agonistához való konjugálására, ami specifikus reakciós helyeken történik, amelyek lényegében nem interferálnak a receptor kötõhely(ek)kel, annak érdekében, hogy magas szintû aktivitás maradjon. A találmány egy további szempontja reaktív aminosavak inszerciója a PYY3–36 peptidbe, hogy ezáltal az agonista variánsainak a polietilénglikollal történõ konjugáció során korlátozott aktivitásváltozásuk legyen. A kovalens kötésen keresztüli kémiai módosítás elvégezhetõ bármilyen megfelelõ feltételek mellett, amelyeket általánosan biológiailag aktív anyag és aktivált PEG konjugálási reakciójára adaptáltak. A konjugációs reakciót viszonylag enyhe körülmények között végezzük, hogy elkerüljük a PYY3–36-variáns agonista inaktiválását. Az enyhe körülmények magukban foglalják a reakcióoldat pH¹értékének a körülbelül 3–10 tartományban tartását, és a reakció-hõmérsékletnek a körülbelül 0–40 °C tartományban tartását. A PYY3–36-variánsok nem cél funkcióscsoportjai, amelyek reaktívak a pegezési körülmények között az aktivált PEG-gel, elõnyösen védve vannak megfelelõ védõcsoporttal, amely eltávolítható a célfunkcióscsoportról a pegezést követõen. A szabad aminosavak pegezése során, ahol olyan reagenseket alkalmazunk, mint például PEG aldehidek vagy PEG szukcinimidek, jellemzõen a pH¹értéket a körülbelül 3–10 tartományban tartjuk, elõnyösen körülbelül 4–7,5 értéken. A kapcsolóreakció elõnyösen megfelelõ pufferben van elvégezve (pH=3–10), például, foszfát, MES, citrát, acetát, szukcinát vagy HEPES, körülbelül 1–48 óráig, körülbelül 4–40 °C tartományba esõ hõmérsékleten. A pegezés során a tiolcsoportokat alkalmazó reagensek esetén, mint például a PEG-maleimidek, PEG-vinil-szulfonok vagy PEG-ortopiridil-diszulfidok, elõnyösen körülbelül 4–8 tartománybeli pH¹értéket tartunk fenn. A PEG-aminok alkalmasak ketocsoportok pegezésére, például p¹acetil-fenil-alanin és elõállíthatók, amint azt Pillai és munkatársai ismertették, J. Org. Chem. 45:5364–5370, 1980. A találmány szerinti konjugálási reakciók jellemzõen olyan reakciókeveréket adnak, amely tartalmazza a kívánt monopegezett PYY3–36-variánst, valamint az el nem reagált PYY3–36-variánspeptidet, el nem reagált PEG¹et, és általában kevesebb mint körülbelül 20%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

nagy molekulatömegû anyagok, amely tartalmazhat olyan konjugátumokat, amelyek több, mint egy PEGszálat tartalmaznak és/vagy aggregálódtak. A nem reagált anyagok és a nagy molekulatömegû anyagok eltávolítását követõen, kinyerjük az elsõdlegesen egyszeresen pegezett PYY3–36-variánsokat tartalmazó készítményeket. Mivel a konjugátumok gyakran egyetlen polimerszálat tartalmaznak, ezért a konjugátum lényegében homogén. A kívánt PEG-PYY3–36-variáns konjugátum tisztítható a reakcióelegybõl fehérjék tisztítására jellemzõen alkalmazott, hagyományos eljárásokkal, mint például dialízissel, kisózással, ultraszûréssel, ioncsere-kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatásos kromatográfiával (HIC), gélkromatográfiával és elektroforézissel. Az ioncsere-kromatográfia különösen hatásos az el nem reagált PEG vagy az el nem reagált PYY3–36-variáns eltávolítására. A kívánt PEG-variáns konjugátum elválasztása végrehajtható a kevert anyagot tartalmazó reakcióelegy körülbelül 4–körülbelül 10 pH¹értékû, elõnyösen alacsonyabb, mint 8 értékû pufferoldatba helyezésével a deamidálás elkerülésére. A pufferoldat elõnyösen, nem korlátozó módon, a következõk közül választott egy vagy több puffersót tartalmazza: KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 és CH3CO2Na. Amennyiben a pegezési reakcióban alkalmazott pufferrendszer különbözik az elválasztási eljárás során alkalmazottól, akkor a pegezési elegyet puffercserének/diaszûrésnek vetjük alá, vagy hígítjuk a kezdeti elválasztási puffer elégséges mennyiségével. A konjugátumok frakcionálását egy olyan keverékbe, amely tartalmazza a kívánt típusokat, ioncsere-kromatográfiás közeg alkalmazásával végezzük. Az ilyen közeg képes a PEG-PYY3–36-variáns konjugátumok szelektív megkötésére a töltésben lévõ különbségek révén, amelyek bizonyos mértékig elõre jelezhetõ mértékben változnak. Például a PYY3–36-variáns felszíni töltése meghatározható a peptid felszínén lévõ, az oszloptöltettel kölcsönhatásra elérhetõ töltött csoportok számából, amelyeket nem kompromittál a PEG jelenléte. Ezek a töltött csoportok jellemzõen kapcsolódási pontként szolgálnak a PEG polimereknek. Tehát a PEG-PYY3–36-variáns konjugátumoknak a többi jelen lévõ típustól eltérõ töltésük lesz, ami lehetõvé teszi a szelektív izolálást. A jelen PEG-PYY3–36-variáns konjugátumok tisztítására különösen elõnyösek az ioncserélõ gyanták. A kationcserélõ gyanták, mint például a szulfopropil gyanták vannak alkalmazva a találmány szerinti tisztítási eljárásban. A jelen találmánynak megfelelõ kationcserélõ gyanták nem korlátozó listája tartalmazza a következõket: SP¹hitrap®, SP Sepharose HP® és SP Sepharose® fast flow. További megfelelõ kationcserélõ gyanták, például S és CM gyanták is alkalmazhatóak. A kationcserélõ gyanta elõnyösen oszlopba van töltve és hagyományos módon van ekvilibrálva. Olyan puffert alkalmazunk, amelynek megegyezik a pH¹értéke és az ozmolaritása a PEG-konjugált PYY3–36-variáns oldatáéval. Az elúciós puffer elõnyösen, nem kor-

1

HU 005 805 T2

látozó módon, egy vagy több a következõk közül választott sót tartalmaz: CH3CO2Na, HEPES, KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 és (NH4)2CO3. A konjugátumot tartalmazó oldat ezt követõen az oszlopra van adszorbeálva az el nem reagált PEG-gel és valamennyi nagy molekulatömegû anyaggal, ami nincs visszatartva. A töltés befejezésekor elúciós puffer gradiensáramát növekvõ sókoncentrációval alkalmazunk az oszlopon, hogy eluáljuk a kívánt PEG-konjugált PYY3–36 variáns frakcióját. Az eluált összegyûjtött frakciók elõnyösen egységes polimerkonjugátumokra vannak osztva a kationcserélõ elválasztási lépést követõen. Bármilyen nem konjugált PYY3–36-variáns ezt követõen lemosható az oszlopról hagyományos technikákkal. Kívánt esetben mono- és többszörösen pegezett PYY3–36-variánsok és nagyobb molekulatömegû anyagok tovább választhatóak el egymástól további ioncserélõ kromatográfiával vagy méretkizárásos kromatográfiával. Növekvõ koncentrációk többszörös izokratikus lépéseit alkalmazó technikák alkalmazhatóak a lineáris gradiens helyett. Növekvõ koncentrációk többszörös izokratikus lépései a többszörösen pegezett/aggregált és ezt követõen a monopegezett PYY3–36-variáns konjugátumok szekvenciális elúcióját fogják eredményezni. pH¹gradiensen alapuló elúciós technikák is alkalmazhatóak. Az elúció hõmérséklet-tartománya általánosan körülbelül 4 °C és körülbelül 25 °C közötti. A PEG-PYY3–36-variáns elúcióját UV abszorbanciával követjük 280 nm¹en. A frakciók begyûjtése elvégezhetõ egyszerû idõbeli elúciós profilokkal. Rekombináns expresszió Nukleinsavmolekulák Az (E10C)hPYY3–36-polipeptidet kódoló nukleinsavmolekulák tartalmazhatják a következõ nukleinsavszekvenciákat (az E10C szubsztitúció kodonmutációit aláhúztuk): atcaaacccgaggctcccggctgtgacgcctcgccggaggagctg aaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggca gcg gtat (SEQ ID NO: 5); vagy atcaaacccgaggctcccggctgcgacgcctcgccggaggagctg aaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggca gc ggtat (SEQ ID NO: 6). A (D11C)hPYY3–36 polipeptidet kódoló nukleinsavmolekulák tartalmazhatják a következõ nukleinsavszekvenciákat (a D11C szubsztitúció kodonmutációit aláhúztuk): atcaaacccgaggctcccggcgaatgtgcctcgccggaggagctg aaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggca gcg gtat (SEQ ID NO: 7); vagy atcaaacccgaggctcccggcgaatgcgcctcgccggaggagctg aaccgctactacgcctccctgcgccactacctcaacctggtcacccggca gc ggtat (SEQ ID NO: 8). Ezek a szekvenciák tartalmazhatnak stopkodont (például: tga, taa, tag) a C¹terminális végen és számos módon elõállíthatóak, amelyek közé korlátozások nélkül tartoznak a következõk: kémiai szintézis, cDNS vagy

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

genomikus könyvtár szkrínelés, expressziós könyvtár szkrínelés alkalmazásával elõállított vad típusú hPYY polinukleotid genetikai mutációja, és/vagy cDNS-polimeráz-láncreakcióval (PCR) végzett amplifikálása. Az (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36 variánsokat kódoló nukleinsavmolekulák elõállíthatóak helyirányított mutagenezissel, PCR amplifikációval és egyéb megfelelõ eljárásokkal, ahol a primer(ek)nek a kívánt pontmutációjuk van. Az itt ismertetett rekombináns DNS-eljárások és mutagenezis eljárások általánosan olyanok, mint amilyeneket ismertetnek a következõk: Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) és Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel és munkatársai, kiad., Green Publishers Inc. és Wiley and Sons 1994). Amennyiben szükségessé válik, hogy egyéb természetben nem elõforduló aminosavra legyen az E10 vagy D11 cserélve, akkor az ilyen peptid expresszálható rekombinánsan például a 2005/0208536 számú USA szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint, amelyet hivatkozásként a leírás részévé teszünk. A hPYY-okat kódoló nukleinsav-polinukleotidok azonosíthatóak expressziós klónozással, ami a pozitív klónok detektálását alkalmazza, az expresszált fehérje tulajdonsága alapján. Jellemzõen nukleinsavkönyvtárak vannak szkrínelve antitest vagy egyéb kötõpartner kötésével (például receptor vagy ligand) a klónozott fehérjékhez, amelyek expresszálva vannak és be vannak mutatva egy gazdasejt felszínén. Az antitest vagy kötõpartner detektálható jelöléssel van módosítva, azon sejtek azonosítására, amelyek expresszálják a kívánt klónt. Az alább ismertetetteknek megfelelõen végrehajtott rekombináns expressziós technikák követhetõek az (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36 kódoló polinukleotidok elõállítására és a kódolt polipeptidek expresszálására. Például olyan nukleinsavszekvencia egy megfelelõ vektorba történõ inszerciójával, amely egy (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-variáns aminosavszekvenciáját kódolja, szakember egyszerûen tud nagy mennyiségeket elõállítani a kívánt nukleotidszekvenciából. A szekvenciák ezt követõen alkalmazhatóak detektálási próbák vagy amplifikációs primerek elõállítására. Alternatív esetben egy (E10C)hPYY3–36¹ vagy egy (D11C)hPYY3–36-polipeptid aminosavszekvenciáját kódoló polinukleotid inszertálható egy expressziós vektorba. Az expressziós vektor megfelelõ gazdába történõ bejuttatásával a kódolt (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-variáns nagy mennyiségben elõállítható. A megfelelõ nukleinsavszekvencia elõállításának további módszere a polimeráz-láncreakció (PCR). Ebben az eljárásban, cDNS¹t állítunk elõ poli(A)+RNS-bõl vagy összes RNS-bõl a reverz-transzkriptáz enzim alkalmazásával. Két primert, amelyek jellemzõen komplementerek az (E10C)hPYY3–36¹ vagy a (D11C)hPYY3–36-variáns aminosavszekvenciáját kódoló cDNS különálló szakaszaival, ezt követõen hozzáadunk a cDNS-hez polimerázzal együtt, mint például Taq polimerázzal, és a polimeráz megsokszorozza a két primer közötti cDNS szakaszt.

1

HU 005 805 T2

Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-variáns aminosavszekvenciáját kódoló nukleinsavmolekula elõállításának további eszköze a kémiai szintézis, amely szakember számára jól ismert eljárásokat alkalmaz, mint például azok, amelyeket Engels és munkatársai ismertettek, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716–34, 1989. Ezen eljárások közé tartoznak a következõk: foszfotriészter, foszforoamidit, és H¹foszfonát nukleinsav szintetizáló eljárások. Az ilyen kémiai szintézis egy elõnyös eljárása a polimer vázon történõ szintézis, amelynek során standard foszforamiditkémiát alkalmaznak. Jellemzõen az (E10C)hPYY3–36 aminosavszekvenciáját kódoló DNS körülbelül 100 nukleotid hosszúságú. A 100 nukleotidnál hosszabb nukleinsavak számos fragmensbõl szintetizálhatóak ezen módszerek alkalmazásával. A fragmensek ezt követõen összekapcsolhatóak egy (E10C)hPYY3–36-gén teljes hosszúságú nukleotidszekvenciájának kialakítása végett. A polipeptid amino végét kódoló DNS fragmensnek lehet ATG¹je, ami metionint kódol. Ez a metionin vagy jelen van vagy nincs jelen az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C) hPYY3–36 érett formáján, attól függõen, hogy a gazdasejtben elõállított polipeptid arra lett¹e tervezve, hogy kiválasztódjon a sejtbõl. Az izoleucint kódoló kodon szintén alkalmazható starthelyként. További, szakember által ismert eljárások szintén alkalmazhatóak. Egyes megvalósítási módokban a nukleinsavvariánsok tartalmaznak olyan kodonokat, amelyek meg lettek változtatva az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 egy adott sejtben történõ optimális expressziójának érdekében. Az egyedi kodonváltozatok függnek az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-variánstól és az expresszióhoz választott gazdasejttõl. Ilyen „kodonoptimalizálás” számos módszerrel elvégezhetõ, például olyan kodonok kiválasztásával, amelyek elõnyösek erõsen expresszált génekben történõ alkalmazásra az adott gazdasejtben. Számítógépes algoritmusok, amelyek tartalmazzák a kodongyakoriság-táblázatokat alkalmazhatóak, mint például az „Eco_high.Cod” az erõsen expresszált bakteriális gének kodonpreferenciájára és megadja a University of Wisconsin Package Version 9.0 szoftvercsomag (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). A további kodongyakoriságtáblázatok közé tartoznak a következõk: „Celegans_high.cod”, „Celegans_low.cod”, „Drosophilahigh.cod”, „Human-high.cod”, „Maize_high.cod” és „Yeast_high.cod”. Vektorok és gazdasejtek Az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 aminosavszekvenciáját kódoló nukleinsavmolekula megfelelõ expressziós vektorba van inszertálva standard ligálási technikák alkalmazásával. A vektort jellemzõen úgy választjuk ki, hogy mûködõképes legyen az adott alkalmazott gazdasejtben (azaz, a vektor kompatibilis a gazdasejt gépezetével, hogy a gén amplifikációja és/vagy a gén expressziója megtörténhessen). Az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 aminosavszekvenciáját kódoló nukleinsavmolekula amplifikálha-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

tó/expresszálható prokarióta, élesztõ, rovar (baculovirusrendszerek) és/vagy eukarióta gazdasejtekben. Az expressziós vektorok összefoglalását lásd Meth. Enz, 185. kötet (D. V. Goeddel, szerk., Academic Press, 1990). Jellemzõen a gazdasejtek bármelyikében alkalmazott expressziós vektorok tartalmaznak szekvenciákat a plazmid fenntartására és exogén nukleotidszekvenciák klónozására és expressziójára. Az ilyen szekvenciák, amelyeket együttesen „határolószekvenciáknak” nevezünk, egyes megvalósítási módok esetén jellemzõen egyet vagy többet tartalmaznak a következõ szekvenciák közül: promoter, egy vagy több enhanszer szekvencia, replikációs origó, transzkripciós terminációs szekvencia, teljes intronszekvencia, amely tartalmaz donor és akceptor vágási helyet, polipeptidkiválasztás vezetõszekvenciáját kódoló szekvencia, riboszómakötõ hely, poliadenilezési szekvencia, többszörös kapcsolószakasz az expresszálandó polipeptidet kódoló nukleinsav inszerciójára, és szelektálható jelölõelem. Ezen szekvenciák mindegyikét tárgyaljuk az alábbiakban. Adott esetben a vektor tartalmazhat „tag”¹et kódoló szekvenciát, azaz olyan oligonukleotidmolekulát, amely az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 kódolószekvencia 5’ vagy 3’ végén elhelyezkedõ oligonukleotidmolekula; az oligonukleotidszekvencia poliHis¹t kódol (mint például hexaHis), vagy egyéb „tag”¹et, mint például a FLAG, HA (hemaglutinin influenzavírus), vagy myc, amelyekre kereskedelemben elérhetõ antitestek léteznek. Ez a tag jellemzõen a polipeptidhez van fuzionálva a polipeptid expressziójakor és eszközként szolgálhat az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 affinitástisztításához a gazdasejtbõl. Az affinitástisztítás végrehajtható például affinitás mátrixként a tag elleni antitesteket alkalmazó oszlopkromatográfia. Adott esetben a tag ezt követõen eltávolítható a tisztított (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-peptidtõl különbözõ eszközökkel, mint például egyes peptidázok alkalmazása hasításra, például enterokinázos emésztése FLAG tag szekvencia 3’ végének, amely a SEQ ID NOs: 3–4. azonosító számokon bemutatott aminosavszekvenciák elõtt van. A határolószekvenciák lehetnek homológok (azaz, ugyanabból a fajból és/vagy törzsbõl, mint gazdasejt), heterológok (azaz, a gazdasejt fajtól vagy törzstõl különbözõ fajból), hibrid (azaz, több mint egy forrásból származó határolószekvenciák kombinációja), vagy szintetikus, vagy a határolószekvenciák lehetnek natív szekvenciák, amelyek normálisan a hPYY3–36 expresszióját szabályozzák. A határolószekvencia forrása lehet bármilyen prokarióta vagy eukarióta élõlény, bármilyen gerinces vagy gerinctelen élõlény, vagy bármilyen növény, feltéve, hogy a határolószekvencia mûködõképes a gazdasejtben és aktiválható a gazdasejt gépezete által. Alkalmas határolószekvenciák elérhetõek a szakterületen jól ismert számos eljárás bármelyikével. Jellemzõen az itt alkalmazható szekvenciák, amelyek nem a PYY-gént határoló szekvenciák, már elõzõleg azono-

1

HU 005 805 T2

sítva lettek térképezéssel és/vagy restrikciós endonukleáz általi emésztéssel, és ezáltal izolálhatóak megfelelõ szövetforrásból a megfelelõ restrikciós endonukleázok alkalmazásával. Egyes esetekben a határolószekvencia teljes nukleotidszekvenciája is ismert lehet. Ez esetben a határolószekvencia az itt ismertetett nukleinsavszintézis vagy klónozó eljárásokkal is megszintetizálható. Abban az esetben, ha a határolószekvenciának csak egy részlete ismert, akkor elõállítható a következõk alkalmazásával: PCR eljárás és/vagy szkrínelési eljárás megfelelõ oligonukleotiddal és/vagy azonos, vagy különbözõ fajból származó határolószekvenciafragmenssel genomikus könyvtárban. Ahol a határolószekvencia nem ismert, ott egy nagyobb darab DNSbõl izolálható határolószekvenciát tartalmazó DNS fragmens, ahol a nagy DNS tartalmazhat például kódolószekvenciát vagy egyéb gént vagy géneket. Az izolálás elvégezhetõ restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel, ami megfelelõ DNS fragmenst hoz létre, ezt követi agarózgélen végzett tisztítás alkalmazásával végzett izoláció, Qiagen® oszlopkromatográfia (Chatsworth, CA), vagy egyéb szakember által ismert eljárás. Szakember számára egyértelmû az ezen célnak megfelelõ enzimek kiválasztásának módja. Egy replikációs origó jellemzõen része azoknak az expressziós vektoroknak, amelyeket kereskedelemben megvásárolhatunk, és az origó segít a vektor gazdasejtbeli amplifikációjában. Egy vektor egy bizonyos kópiaszámig történõ amplifikációja, egyes esetekben fontos lehet az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 expressziójához. Ha a kiválasztott vektor nem tartalmaz replikációs origót, akkor kémiailag lehet egyet szintetizálni egy ismert szekvencia alapján, és ezt követõen ligálható a vektorba. Például a pBR322 (New Englang Biolabs, Beverly, MA) plazmidból származó replikációs origó megfelelõ a legtöbb Gram negatív baktériumhoz és különbözõ origók [például SV40, polióma, adenovírus, vezikuláris sztomatitisz vírus (VSV), vagy papillómavírusok, mint például HPV vagy BPV] alkalmasak vektorok emlõssejtekbe történõ klónozására. Általánosan a replikációs origó nem szükséges emlõsvektorok esetében (például, az SV40 origót gyakran csak azért alkalmazzák, mert tartalmaz egy korai promotert). Egy transzkripciós terminációs szekvencia jellemzõen a polipeptidet kódoló szakasz 3’ végén helyezkedik el, és a transzkripció befejezése a feladata. Általában, prokarióta sejtekben egy transzkripciós terminációs szekvencia G¹C gazdag fragmens, amelyet poli¹T szekvencia követ. Miközben a szekvencia könnyen klónozható egy könyvtárból vagy kereskedelemben is megvásárolható egy vektor részeként, addig könnyen meg is szintetizáltatható az itt ismertetett nukleinsavszintézis-eljárásokkal hasonló eljárásokkal. Egy szelektálható markergén elem olyan fehérjét kódol, amely szükséges a szelektív tenyésztési közegben növesztett gazdasejt növekedéséhez és túléléséhez. A jellemzõ szelekciós markergének olyan fehérjéket kódolnak, amelyek (a) rezisztenciát adnak antibioti-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

kumokra vagy egyéb toxinokra, például ampicillin, tetraciklin, vagy kanamicin prokarióta gazdasejtek esetében; (b) a sejt auxotrófiás hiányosságait komplementálják; vagy (c) a komplex tápközegbõl nem elérhetõ kritikus tápanyagokat szolgáltatnak. Az elõnyös szelektálható marker a kanamicin rezisztencia gén, az ampicillin rezisztencia gén és a tetraciklin rezisztencia gén. Neomicin rezisztencia gén is alkalmazható szelekcióra prokarióta- és eukarióta-gazdasejtekben. Egyéb szelekciós gének is alkalmazhatóak az expresszált gén amplifikálására. Az amplifikáció egy olyan folyamat, ahol azok a gének, amelyekre nagy szükség van a növekedéshez kritikus fehérje termeléséhez, a rekombináns sejtek egymást követõ generációinak kromoszómáiban együttesen maradnak meg. Az emlõssejtek megfelelõ szelekciós markereinek példái közé tartozik a dihidrofolát reduktáz (DHFR) és a timidin kináz. Az emlõssejt transzformánsokat szelekciós nyomás alá helyezzük, ahol csak azok a transzformánsok maradnak életben, amelyek egyedileg adaptálódtak a vektorban lévõ szelekciós gén révén. A szelekciós nyomást a transzformált sejtek olyan tenyésztési közegben történõ tenyésztésével hozzuk létre, ahol a szelekciós ágens koncentrációja a tápközegben sikeresen megváltozik, ezáltal mind a szelekciós gén, mind az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-peptidet kódoló DNS amplifikációjához vezet. Ennek eredményeként nagyobb mennyiségben szintetizálódik (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 az amplifikált DNS-rõl. Egy riboszómakötõ hely általában szükséges az mRNS transzlációs iniciációjához, és jellemzõ rája a Shine-Dalgarno szekvencia (prokarióták) vagy a Kozak szekvencia (eukarióták). Az elem jellemzõen a promoterhez képest 3’ irányban helyezkedik el és 5’ irányban az expresszálandó (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódolószekvenciához képest. A Shine-Dalgarno szekvencia változó, de jellemzõen polipurin (azaz nagy az A, G tartalma). Számos Shine-Dalgarno szekvenciát azonosítottak már, amelyek mindegyike egyszerûen szintetizálható olyan módszerekkel, mint amilyeneket itt ismertettünk, és alkalmazható prokarióta vektorban. Vezetõ- vagy szignálszekvencia alkalmazható az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 gazdasejtbõl történõ kijuttatására. Jellemzõen a szignálszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 nukleinsavmolekula kódoló régiójába van helyezve, vagy közvetlenül az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 kódoló régiójának 5’ végére. Számos szignálszekvenciát azonosítottak már, és a választott gazdasejtben mûködõképesek közül bármelyik alkalmazható az (E10C)hPYY 3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 nukleinsav-molekulához kapcsoltan. Tehát egy szignálszekvencia lehet homológ (természetben elõforduló) vagy heterológ az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36 nukleinsav-molekulához képest. Továbbá szignálszekvenciát lehet kémiai úton szintetizálni az itt ismertetett eljárások alkalmazásával. A legtöbb esetben az (E10C)hPYY 3–36 vagy a

1

HU 005 805 T2

(D11C)hPYY3–36 gazdasejtbõl történõ szekréciója a szignálpeptid jelenléte révén a kiválasztott (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 peptidtõl elválik a szignálpeptid. A szignálszekvencia lehet a vektor része, vagy lehet része egy (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 nukleinsavmolekulának, amely a vektorba van inszertálva. A natív hPYY3–36 szignálszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia összekapcsolható egy (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódoló szakasszal vagy heterológ szignálszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia összekapcsolható egy (E10C)hPYY 3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódoló szakasszal. A kiválasztott heterológ szignálszekvencia olyan kell, hogy legyen, amilyent felismer és feldolgoz, azaz lehasít a gazdasejt szignálpeptidáza. Azon prokarióta-gazdasejtek esetében, amelyek nem ismerik fel, vagy nem dolgozzák fel a natív hPYY szignálszekvenciát, ott a szignálszekvencia lecserélhetõ prokarióta szignálszekvenciával, amely például a következõk által alkotott csoportból választott: alkáli foszfatáz, penicillináz, vagy hõstabilis enterotoxin II vezetõszekvenciák. Az élesztõbõl történõ szekrécióhoz a natív hPYY szignálszekvencia helyettesíthetõ élesztõ invertáz, alfa faktor, vagy savas foszfatáz vezetõszekvenciájával. Emlõssejtben történõ expresszió esetén elégséges a natív szignálszekvencia, habár egyéb emlõs szignálszekvenciák is megfelelõek lehetnek. Számos esetben egy nukleinsavmolekula transzkripciója megnövekedik a vektorban lévõ egy vagy több intron révén; ez különösen igaz, ha a polipeptidet eukariótasejtben termeljük, különösen emlõs gazdasejtek esetén. Az alkalmazott intronok lehetnek a PYY génben természetesen elõforduló intronok, különösen, ha az alkalmazott gén a teljes hosszúságú genomikus szekvencia vagy annak egy fragmense. Ha az intron nem természetesen elõforduló a génben (mint a legtöbb cDNS esetében), ott az intron beszerezhetõ egyéb forrásból. Az intron pozíciója a határolószekvenciák és a PYY génhez képest általában fontos, mivel az intronnak át kell lennie írva, hogy hatásos legyen. Tehát ha egy (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódoló cDNS-molekula van átírva, akkor az intron elõnyös pozíciója a transzkripciós start helytõl 3’ irányban van és a poli¹A transzkripciós terminációs szekvenciától 5’ irányban van. Elõnyösen az intron vagy intronok a cDNS az egyik oldalán vagy a másikon fognak elhelyezkedni (azaz, 5’ vagy 3’), hogy nem zavarja meg a kódolószekvenciát. Bármilyen forrásból, ideértve virális, prokarióta és eukarióta (növény vagy állat) származó bármilyen intron alkalmazható, feltéve, hogy kompatibilis a gazdasejttel, amelybe inszertálva van. Szintén ide tartoznak a szintetikus intronok. Adott esetben egy vagy több intron is alkalmazható a vektorban. Az expressziós és klónozó vektorok jellemzõen tartalmaznak egy olyan promotert, amelyet felismer a gazdaszervezet és mûködõképes módon van kapcsolva egy (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódolómolekulához. A promoterek át nem írt szekvenciák, amelyek 5’ irányban vannak a struktúrgén startkodon-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

2

jához képest (általában 100–1000 bp távolságon belül), és amelyek a struktúrgén transzkripcióját szabályozzák. A promotereket hagyományosan két osztályba soroljuk: indukálható promoterek és konstitutív promoterek. Az indukálható promoterek a szabályozásuk alatt lévõ DNS-rõl megnövekedett transzkripciót iniciálnak a tenyésztési feltételek bizonyos változása esetén, mint amilyen például egy tápanyag jelenléte vagy hiánya, vagy a hõmérsékletben történõ változás. A konstitutív promoterek másrészrõl folytonos génterméktermelést iniciálnak; azaz nincs vagy csak kis kontroll van a génexpresszión. Számos, sokféle potenciális gazdasejt által felismert promoter jól ismert. Egy megfelelõ promoter mûködõképes módon van kapcsolva egy (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódoló DNShez a forrás DNS-bõl restrikciós enzimes emésztéssel történõ eltávolítás és a kívánt promoterszekvencia vektorba történõ inszertálást követõen. Azonban elõnyös egy heterológ promoter, ha nagyobb transzkripciót tesz lehetõvé és az expresszált fehérje nagyobb hozamát éri el a natív promoterhez képest, és ha kompatibilis az alkalmazásra kiválasztott gazdasejt rendszerével. A prokarióta gazdákkal alkalmazható promoterek közé tartozik a béta-laktamáz és laktóz promoter rendszerek; az E. coli T7 indukálható RNS polimeráz; alkáli foszfatáz; triptofán (trp) promoter rendszer; és a hibrid promoterek, mint például tac promoter. Egyéb ismert bakteriális promoterek is megfelelõek. A szekvenciáik közölve vannak, ezáltal szakember képes a kívánt DNS-szekvenciához kapcsolni õket, szükség szerint linkerek vagy adapterek alkalmazásával, hogy bármilyen szükséges restrikciós helyet adjanak. Az élesztõgazdákkal alkalmazható megfelelõ promoterek szintén jól ismertek a technika állása szerint. Az élesztõenhanszerek elõnyösen alkalmazhatóak az élesztõpromoterekkel. Az emlõssejtekben alkalmazható megfelelõ promoterek jól ismertek és nem korlátozó módon ide tartoznak azok, amelyek vírusok genomjából erednek, mint amilyen vírus a poliómavírus, bárányhimlõvírus, adenovírus (mint például a 2¹es adenovírus), szarvasmarha-papillómavírus, szárnyas szarkómavírus, citomegalovírus, retrovírusok, hepatitisz¹B vírus és legelõnyösebben Simian vírus 40 (SV40). A további megfelelõ emlõspromoterek közé tartoznak a heterológ emlõs promoterek, például a hõsokkpromoterek és az aktinpromoter. Az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 expresszióját szabályozó további promoterek nem korlátozó példái közé tartoznak a következõk: az SV40 korai promoter régió (Bemoist és Chambon, Nature 290:304–10, 1981); a CMV promoter; a Rous szarkóma vírus 3’ hosszú terminális ismétlõdésében lévõ promoter (Yamamoto és munkatársai, Cell 22:787–97, 1980); a herpesz timidin kináz promoter (Wagner és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78:1444–45, 1981); a metalotioningén szabályozószekvenciái (Brinster és munkatársai, Nature 296:39–42, 1982); prokarióta expressziós vektorok, mint például a bétalaktamáz promoter (Villa-Kamaroff és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75:3727–31, 1978); vagy

1

HU 005 805 T2

a tac promoter (DeBoer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80:21–25, 1983). Egy enhanszer szekvencia inszertálható a vektorba, a magasabb rendû eukarióták transzkripciójának növelésére, ahol a DNS egy (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-peptidet kódol. Az enhanszerek cisz hatású DNS elemek, általában 10–300 bp hosszúságúak, amelyek a promoteren hatnak a transzkripció megnövelése érdekében. Az enhanszerek viszonylag irányultság- és pozíciófüggetlenek. Találtak már a transzkripciós egységhez képest 5’ és 3’ irányban is. Számos emlõsgénbõl elérhetõ enhanszer szekvencia ismert (például: globin, elasztáz, albumin, alfa- fetoprotein és inzulin). Jellemzõen, azonban víruseredetû enhanszer van alkalmazva. Az SV40 enhanszer, a citomegalovírus korai promoter enhanszer, a polióma enhanszer, és az adenovírus enhanszerek példa enhanszer elemek eukarióta promoterek aktiválására. Miközben egy enhanszer betehetõ a vektorba az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 kódoló nukleinsavmolekulához képest 5’ vagy 3’ irányba is, addig jellemzõen a promoterhez képest 5’ irányban lévõ helyen van. Expressziós vektorok konstruálhatóak egy kiindulási vektorból, mint például egy kereskedelemben elérhetõ vektorból. Az ilyen vektorok vagy tartalmazzák, vagy nem tartalmazzák az összes szükséges határolószekvenciát. Ha az itt ismertetett határolószekvenciák közül egy vagy több még nincs benne a vektorban, akkor egyedileg beszerezhetõek és behelyezhetõek a vektorba. Szakember számára jól ismertek az egyes határolószekvenciák elõállítására szolgáló eljárások. Az elõnyös vektorok azok, amelyek kompatibilisek baktérium¹, rovar- és emlõsgazdasejtekkel. Ilyen vektorok, többek között, a következõk: pCRII, pCR3 és pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP¹N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (WO 90/14363 számú nemzetközi közzétételi irat) és pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY). További megfelelõ vektorok nem korlátozó példái közé tartoznak kozmidok, plazmidok és módosított vírusok, de értékelhetõ módon a vektorrendszernek kompatibilisnek kell lennie a kiválasztott gazdasejttel. Az ilyen vektorok, nem korlátozó példái közé tartoznak a következõk: plazmidok, mint például Bluescript® plazmid származékok (nagy kópiaszámú ColE1-alapú fágmid, Stratagene), PCR klónozó plazmidok, amelyek Taq-amplifikált PCR-termékek klónozására lettek megtervezve (például: TOPO® TA Cloning® Kit, PCR2.1® plazmid származékok, Invitrogen), és emlõs¹, élesztõvagy vírusvektorok, mint például a baculovírus expressziós rendszer (pBacPAK plazmid származékok, Clontech). Azt követõen, hogy a vektor elõ lett állítva és az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula a vektor megfelelõ helyére lett inszertálva, a teljes vektor inszertálható egy megfe-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

lelõ gazdasejtbe amplifikálásra és/vagy polipeptidexpresszióra. Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36polipeptid expressziós vektorjának egy kiválasztott gazdasejtbe történõ transzformációja elvégezhetõ jól ismert eljárásokkal, ideértve az olyan eljárásokat, mint például a transzformáció, infekció, elektroporáció, mikroinjektálás, lipofekció, DEAE-dextrán eljárás, vagy egyéb ismert technikák. A kiválasztott eljárás ismert szakember számára és például Sambrook és munkatársai fenti könyvében ismertetve vannak. A gazdasejtek lehetnek prokarióta-gazdasejtek (mint például az E. coli) vagy eukarióta-gazdasejtek (mint például élesztõ¹, rovar- vagy gerincessejt). A gazdasejt, ha megfelelõ körülmények között tenyésztik, akkor szintetizálja az (E10C)hPYY 3–36 ¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidet, amely ezt követõen begyûjthetõ a tenyésztési tápközegbõl (ha a gazdasejt a tápközegbe választja ki) vagy közvetlenül az õt termelõ gazdasejtbõl (ha nem kerül kiválasztásra). A megfelelõ gazdasejt általi kiválasztás különbözõ tényezõktõl függ, mint például: kívánt expressziós szint, az aktivitáshoz szükséges vagy elõnyös polipeptidmódosítások (mint például glikozilezés vagy foszforilezés) és a biológiailag aktív formába történõ feltekeredés könnyûsége. Számos megfelelõ gazdasejt ismert a szakterületen és számos elérhetõ az American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA nevû törzsgyûjteménybõl. A nem korlátozó példák közé tartoznak a következõk: kínai hörcsög petefészeksejtjei (CHO), CHO DHFR(–) sejtek (Urlaub és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:4216–20, 1980), humán embrionális vese (HEK) 293 és 293T-sejtek, és 3T3 sejtek. A megfelelõ emlõsgazdasejtek szelekciója, valamint eljárások transzformálásra, tenyésztésre, amplifikációra, szkrínelésre, termék-elõállításra és tisztításra jól ismertek a szakterületen. További megfelelõ emlõssejtvonalak a majom COS¹1 és COS¹7 sejtvonalak és a CV¹1 sejtvonal. A további példa emlõsgazdasejtek közé tartoznak fõemlõssejtvonalak és rágcsálósejtvonalak, ideértve a transzformált sejtvonalakat is. Normális diploid sejtek, elsõdleges szövet in vitro tenyészetébõl származó sejtek, valamint elsõdleges explantátumok, szintén megfelelõek. A jelölt sejtek genotípusosan hiányosak lehetnek a szelekciós génre, vagy tartalmazhatnak dominánsan ható szelekciós gént. Az emlõssejtvonalak további megfelelõ, nem korlátozó példái a következõek: egér neuroblasztoma N2A sejtek, HeLa, egér L¹929 sejtek, Swiss, Balb¹c vagy NIH egerekbõl származó 3T3 vonalak, BHK vagy HaK hörcsög sejtvonalak. Ezen sejtvonalak mindegyike ismert és elérhetõ fehérjeexpresszió területén jártas szakember számára. Hasonlóan alkalmasak megfelelõ gazdasejtnek a bakteriális sejtek. Például az E. coli különbözõ törzsei (például: HB101, DH5a, DH10 és MC1061) jól ismertek, mint gazdasejtek a biotechnológia területén. A B. subtilis, Pseudomonas fajok, egyéb Bacillus fajok és Streptomyces fajok különbözõ törzsei is alkalmazhatóak ebben az eljárásban. Szakember számára ismert, számos élesztõsejt érhetõ el, mint az (E10C)hPYY3–36¹ és (D11C)hPYY3–36-

1

HU 005 805 T2

polipeptidek expressziójának gazdasejtjei. Az elõnyös élesztõsejtek közé tartozik például a Saccharomyces cerivisae és a Pichia pastoris. Továbbá, kívánt esetben, rovarsejtrendszerek is alkalmazhatóak az (E10C)hPYY3–36 és a (D11C)hPYY3–36 expressziójára. Ilyen rendszereket ismertetnek például a következõk: Kitts és munkatársai, 1993, Biotechniques 14:810–17; Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564–72, 1993; és Lucklow és munkatársai, J. Virol., 67:4566–79, 1993. Az elõnyös rovarsejtek az Sf¹9 és Hi5 sejtek (Invitrogen). (E10C)hPYY3–36¹ és (D11C)hPYY3–36-polipeptid termelés Egy (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36 expressziós vektort tartalmazó gazdasejtvonal tenyészthetõ standard tápközegben, ami jól ismert szakember számára. A tápközeg általában tartalmazza a sejtek növekedéséhez és túléléséhez szükséges összes tápanyagot. Az E. coli-sejtek tenyésztéséhez megfelelõ tápközeg például a Luria Broth (LB) és/vagy Terrific Broth (TB) tápközegek. Az eukariótasejtek tenyésztéséhez megfelelõ tápközegek közé tartozik például a Roswell Park Memorial Institute tápközeg 1640 (RPMI 1640), Minimális Esszenciális tápközeg (MEM) és/vagy Dulbecco’s Modified Eagle tápközeg (DMEM), amelyek mindegyike kiegészíthetõ szérummal és/vagy az éppen tenyésztett egyedi sejtvonalhoz szükséges növekedési faktorokkal. A rovartenyészetekre alkalmas egyik tápközeg a Grace tápközeg, szükség szerint kiegészítve élesztõkivonattal, laktalbumin hidrolizátummal és/vagy borjúszérummal. Jellemzõen a tápközeghez kiegészítõként van adva antibiotikum vagy egyéb a transzformált vagy transzfektált sejtek szelektív tenyésztését lehetõvé tevõ vegyület. Az alkalmazott vegyületet a gazdasejtet transzformált plazmidban jelen lévõ szelektálható marker elem határozza meg. Például, ahol a szelektálható marker elem a kanamicinrezisztencia, ott a tenyésztési tápközeghez adandó vegyület a kanamicin. Az egyéb szelektív tenyésztést lehetõvé tevõ vegyületek közé tartozik az ampicillin, tetraciklin és neomicin. Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptid gazdasejt által termelt mennyisége meghatározható standard a szakterületen ismert eljárásokkal. Korlátozások nélkül, ilyen eljárások közé tartozik a Western blot vizsgálat, SDS poliakrilamid gélelektroforézis, nem denaturáló gélelektroforézis, Nagy teljesítményû folyadékkromatográfiás (HPLC) elválasztás, immunoprecipitáció, és/vagy az olyan aktivitásvizsgálatok, mint például a DNS kötõdés géleltolódás vizsgálatok. Ha az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 úgy lett megtervezve, hogy kiválasztódjon a gazdasejtvonalból, akkor a polipeptidek legnagyobb része a sejttenyésztési tápközegben található meg. Azonban, ha a polipeptid nem választódik ki a gazdasejtekbõl, akkor a citoplazmában és/vagy sejtmagban (eukariótasejtek esetén) vagy a citoszólban (Gram negatív bakteriális gazdasejtek esetén) lesz jelen.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

Ha egy (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36polipeptid a gazdasejt citoplazmájában és/vagy sejtmagjában (eukariótasejtek esetén) vagy a citoszóljában (Gram negatív bakteriális gazdasejtek esetén) van jelen, akkor a sejten belüli anyag (ideértve a zárványtesteket a Gram negatív baktériumok esetén) kivonható a gazdasejtbõl bármilyen szakember által ismert standard eljárással. Például a gazdasejt lizáltatható a periplazma/citoplazma tartalmának kibocsátása érdekében French press eljárással, homogénezéssel és/vagy szonikálással, amelyet centrifugálás követ. Ha az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptid zárványtesteket alakított ki a citoszólban, akkor a zárványtestek gyakran megkötõdnek a belsõ és/vagy külsõ sejtmembránokon és így a centrifugálást követõen elsõsorban a pelletanyagban lesz megtalálható. A pelletanyag ezt követõen extrém pH¹val kezelhetõ, vagy kaotrópikus ágenssel, mint például detergenssel, guanidinnel, guanidinszármazékokkal, karbamiddal, vagy karbamidszármazékokkal redukáló ágens jelenlétében, mint például ditiotreitol lúgos pH¹érték esetén vagy trisz-karboxi-etil-foszfin savas pH esetén a zárványtestek kibocsátása, feltörése és szolubilizálása érdekében. A szolubilizált (E10C)hPYY 3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 ezt követõen elemezhetõ gélelektroforézissel, immunoprecipitációval és hasonló eljárásokkal. Ha cél a polipeptid izolálása, akkor az izolálást elvégezhetjük standard eljárásokkal, mint amilyeneket itt ismertettünk és amilyeneket Marston és munkatársai ismertettek, Meth. Enz. 182:264–75, 1990. Ha nem alakul ki szignifikáns mennyiségû zárványtest az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 expressziójakor, akkor a polipeptid elsõsorban a felülúszóban lesz a sejthomogenizátum centrifugálását követõen. A polipeptidet lehet tovább izolálni a felülúszóból például az itt ismertetett eljárások alkalmazásával. Az (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36 tisztítása oldatból különféle technikákkal érhetõ el. Ha a polipeptid oly módon lett szintetizálva, hogy tartalmaz tag¹et, mint például Hexahisztidin 9 vagy egyéb kis peptidet, mint például FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) vagy myc (Invitrogen) akár a karboxi, akár az amino végén, akkor tisztítható egylépéses eljárással az oldatnak affinitásoszlopon történõ átáramoltatásával, ahol az oszlop mátrixának nagy affinitása van a tag-hez. Például a polihisztidin nagy affinitással és specifikussággal kötõdik nikkelhez. Tehát, egy nikkel-affinitásoszlop (mint például Qiuagen® nikkeloszlop) alkalmazható a tisztításra. Lásd például Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel és munkatársai, kiadók: Green Publishers Inc. és Wiley and Sons, 1993). Továbbá egy (E10C)hPYY 3–36 ¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptid tisztítható monoklonális antitest alkalmazásán keresztül, amely képes specifikusan felismerni és megkötni az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidet. Azokban az esetekben, ahol elõnyös részlegesen vagy teljesen tisztítani az (E10C)hPYY 3–36 ¹ vagy

1

HU 005 805 T2

(D11C)hPYY3–36-polipeptidet, hogy ezáltal részlegesen vagy lényegében mentes legyen szennyezõ anyagoktól, ott szakember számára ismert standard eljárások alkalmazhatóak. Ilyen eljárások nem korlátozó példái közé tartoznak a következõk: elválasztás elektroforézissel, amelyet elektroelúció követ, különbözõ típusú kromatográfiák (affinitás, immunoaffinitás, molekuláris szûrõ és ioncsere), HPLC és preparatív izoelektromos fókuszálás („Isoprime” gép/technika, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). Egyes esetekben két vagy több tisztítási technika kombinálható a megnövelt tisztaság elérése érdekében. Számos további eljárás ismert a szakterületen polipeptidek elõállítására és ezek az eljárások alkalmazhatóak az (E10C)hPYY3–36¹ és (D11C)hPYY3–36-polipeptidek elõállítására. Lásd például: Roberts és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:12 297–303, 1997, amely mRNS és az általa kódolt peptid fúziósfehérjéjének elõállítását ismerteti. Lásd még: Roberts, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268–73, 1999. Az 5,763,192; 5,814,476; 5,723,323; és 5,817,483 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak ismertetnek továbbá eljárásokat peptidek és polipeptidek elõállítására. Az eljárás tartalmazza sztochasztikus gének vagy fragmenseik termelését és ezt követõen ezen gének bejuttatását olyan gazdasejtekbe, amelyek a sztochasztikus gének által kódolt egy vagy több fehérjét termelnek. A gazdasejtek ezt követõen szkrínelve vannak azon klónok azonosítása érdekében, amelyek a kívánt aktivitású peptideket vagy polipeptideket termelik. További rekombináns peptid expressziójára szolgáló eljárásokat ismertetnek a 6,103,495, 6,210,925, 6,627,438 és 6,737,250 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak. A folyamat E. colit és az E. coli általános kiválasztási útvonalát alkalmazza. A peptid szignálszekvenciához van fuzionálva, tehát a peptid kiválasztásra van célozva. További eljárást ismertet a WO 99/15650 számú nemzetközi közzétételi irat peptidek vagy polipeptidek elõállítására. A közölt eljárás, amelyet gének felfedezése céljából végzett véletlen génexpresszió-aktiválásnak neveznek, tartalmazza endogén génexpresszió aktiválását vagy egy gén túltermelését in situ rekombinációs eljárásokkal. Például egy endogén gén expressziója aktiválódik vagy megnövekedik a célsejtbe történõ szabályozószekvencia integrálásával, amely célsejt képes a gén expressziójának aktiválására nem homológ vagy rendellenes rekombinációval. A cél DNS¹t elõször sugárzásnak vetik alá, és ezt követõen inszertálódik a genetikai promoter. A promoter végül a gén elõtt lévõ törésbe lokalizálódik, kiváltva ezzel a gén transzkripcióját. Ez a kívánt peptid vagy polipeptid expresszióját eredményezi. Amidálás Szintetikusan vagy rekombinánsan elõállított peptid amidálása elvégezhetõ egy peptidil-glicin-alfa amidáló monooxigenáz (PAM) nevû enzimmel. Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-peptidek rekombináns elõállítása során, bakteriális expressziós

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

rendszer alkalmazásakor, a peptidek lehetnek C¹terminálisan amidáltak in vitro reakcióval rekombináns PAM enzim alkalmazásával. A PAM enzim forrás, eljárások az elõállítására és tisztítására, és az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-peptidek amidálására alkalmazható eljárásokat ismertetnek a 4,708,934; 5,789,234 és 6,319,685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak. Szelektív (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36 antitestek Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidekhez, amelyek pegezve vannak vagy nincsenek pegezve a cisztein szubsztitúció helyén (amint azt itt ismertetjük), specifikusan kötõdõ antitestek és antitest fragmensek, amelyek nem kötõdnek szelektíven a natív hPYY3–36-hoz, a találmány oltalmi körén belül vannak. Az antitestek lehetnek poliklonálisak, ideértve a monospecifikus poliklonálist; monoklonálisak; rekombinánsak; kiméra; humanizált, mint például CDR-graftolt; humán; egyláncú; és/vagy bispecifikusak; valamint fragmensek; variánsok; vagy ezek származékai. Az antitest fragmensek közé tartoznak azok az antitestrészek, amelyek egy epitóphoz kötõdnek az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptideken. Ilyen fragmensek példái közé tartoznak a teljes antitestek enzimatikus hasításával létrehozott Fab és F(ab’) fragmensek. A további kötõfragmensek közé tartoznak azok, amelyek rekombináns DNS-technikákkal lettek elõállítva, mint például antitest variábilis szakaszokat kódoló nukleinsavszekvenciákat tartalmazó rekombináns plazmidok expressziója. Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidre irányított poliklonális antitesteket általánosan állatokban állítják elõ (például nyulakban vagy egerekben) többszörös az (E10C)hPYY 3–36 ¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptid és egy adjuváns többszörös SC vagy IP injekciójával. Elõnyös lehet az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidet hordozófehérjéhez konjugálni, amely immunogén az immunizált fajban, mint például a kulcslyuk limpet hemocianin, szérum albumin, szarvasmarha tiroglobulin, vagy szójabab tripszin inhibitor. Továbbá aggregáló ágensek, mint például az alum alkalmazható az immunválasz serkentésére. Az immunizálási követõen az állatokat kivéreztetik és a szérumot vizsgáljuk (E10C)hPYY3–36 elleni vagy (D11C)hPYY3–36 elleni antitest titerre. Az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidek elleni monoklonális antitestek elõállíthatóak bármilyen eljárással, amely tenyészetben folytonos sejtvonalak által termelt antitestmolekulákat biztosít. A megfelelõ monoklonális antitestek elõállítására szolgáló eljárások példái közé tartoznak Kohler és munkatársai, Nature 256:495–97, 1975 hibridomaeljárásai, és a humán B¹cell hibridomaeljárás (Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur és munkatársai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). A találmány ad továbbá hibridoma-sejtvonalakat, amelyek (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-

1

HU 005 805 T2

polipeptidekkel reaktív monoklonális antitesteket termelnek. A kompetitív inhibíció révén meghatározott monoklonális antitestspecifikusság és affinitás elõnyös eljárásai megtalálható: Harlow és Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunology (Colligan és munkatársai, kiadó: Greene Publishing Assoc. és Wiley Interscience, 1993); és Muller, Meth. Enzymol. 92:589–601, 1988. A találmány szerinti kiméra antitestek tartalmazhatnak egyedi H és/vagy L immunoglobulin láncokat. Egy elõnyös kiméra H lánc tartalmaz antigénkötõhelyet, ami nem humán antitest H láncából ered, amely antitest specifikus egy (E10C)hPYY 3–36 ¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidre, amely kapcsolva van legalább a humán H lánc C régiójának (CH) legalább egy részéhez, mint például CH1 vagy CH2. Egy elõnyös kiméra L lánc tartalmaz L lánc eredetû antigénkötõ régiót, amely L lánc (E10C)hPYY 3–36 ¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidre specifikus nem humán antitest, amely polipeptid a humán L lánc C régiójának (CL) legalább egy részletéhez van kötve. A szakterületen ismertek a kiméra antitestek és az elõállításukra szolgáló eljárások. Lásd Cabilly és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:3273–77, 1984; Morrison és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6851–55, 1984; Boulianne és munkatársai, Nature 312:643–46, 1984; Neuberger és munkatársai, Nature 314:268–70, 1985; Liu és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84:3439–43, 1987; és Harlow és Lane, fent. Ugyanazon vagy különbözõ kötésspecifitású kiméra H láncokat és L láncokat kötõ szelektív kötõágensek szintén elõállíthatóak az egyedi polipeptidláncok megfelelõ társításával, a szakterületen ismert eljárásokkal. Lásd például: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel és munkatársai, kiadó: Green Publishers Inc. és Wiley and Sons, 1994) és Harlow és Lane, fent. Ezen megközelítés szerint kiméra H láncokat (vagy származékaikat) expresszáló gazdasejtek, és az immunglobulinláncok különállóan vannak kinyerve, majd ezt követõen társítva. Alternatív esetben a gazdasejtek együttesen tenyészthetõk és a láncokat spontán módon hagyjuk asszociálni a tenyésztési tápközegben, és ezt követõen kinyerjük az elkészült immunglobulint. Egy további megvalósítási mód szerint a találmány szerinti monoklonális antitest „humanizált” antitest. A szakterületen jól ismertek a nem humán antitestek humanizálására szolgáló eljárások. Lásd 5,585,089 és 5,693,762 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak. Általában egy humanizált antitestbe egy vagy több aminosav van bevive egy nem humán forrásból. A humanizálás elvégezhetõ például a szakterületen ismert eljárásokkal (Jones és munkatársai, 1986, Nature 321:522–25; Riechmann és munkatársai, 1998, Nature 332:323–27; Verhoeyen és munkatársai, 1988, Science 239:1534–36), a rágcsáló komplementaritást meghatározó régió (CDR) legalább egy részének humán antitest megfelelõ részére történõ helyettesítésével.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

2

Antitest-molekulák (azaz, Fab vagy variábilis régió fragmensek) antigénkötõ régióinak rekombináns DNS változatait létrehozó technikák, amelyek kikerülik a monoklonális antitestek létrehozását, szintén a találmány oltalmi körén belül vannak. Ebben a technikában, antitestspecifikus hírvivõ RNS-molekulák vannak kivonva az immunrendszer sejtjeibõl, amelyek immunizált állatból származnak és cDNS¹be vannak átírva. A cDNS ezt követõen bakteriális expressziós rendszerbe van klónozva. Az ilyen technikák egy példája, amely megfelelõ jelen találmány gyakorlatba vételére, egy bakteriofág lambda vektor rendszert alkalmaz, amelyben olyan vezetõszekvencia van, amely az expresszált Fab fehérjét a periplazmás térbe irányítja (a bakteriális sejtmembrán és a sejtfal közé) vagy kiválasztásra. Könnyen elõállítható és szkrínelhetõ nagyszámú funkcionális Fab fragmens azokra, amelyek kötik az antigént. Ilyen (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidet kötõ molekulák [Fab fragmensek, amelyek specifikusak az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidre] specifikusan részét képezik az „antitest” kifejezésnek a leírás szerinti értelemben. Szintén a találmány oltalmi körén belül vannak technikák, amelyeket kiméra antitestek elõállítására fejlesztettek ki megfelelõ antigénspecifitású egérantitest-molekula génjeinek hasítása egyidejûleg megfelelõ biológiai aktivitású [mint például humán komplement aktiválási képesség és antitestfüggõ celluláris citotoxikusság (ADCC) közvetítõ képesség] humán antitestmolekula génjeivel. Morrison és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81:6851–55, 1984; Neuberger és munkatársai, Nature, 312:604–08, 1984. Az ezzel a technikával elõállított szelektív kötõágensek, mint például antitestek szintén a találmány oltalmi körén belül vannak. Értelemszerûen a találmány nem korlátozódik egér vagy patkány monoklonális antitestekre; valójában humán antitestek is alkalmazhatóak. Ilyen antitestek elõállíthatóak humán hibridomák alkalmazásával. A teljesen humán antitestek, amelyek megkötik a (E10C)hPVV3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptideket, tehát a találmány részét képezik. Ilyen antitesteket állíthatunk elõ transzgenikus állatok (például egerek) (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–38-antigénnel történõ immunizálással (adott esetben hordozóhoz konjugálva), amely egerek képesek endogén immunglobulintermelés hiányában humán antitestrepertoár elõállítására. Lásd például: Jakobovits és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:2551–55, 1993; Jakobovits és munkatársai, Nature 362:255–58, 1993; Bruggemann és munkatársai, Year in Immuno. 7:33–40, 1993. A találmány magában foglal olyan humán antitesteket is, amelyek kötõdnek az (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidekhez. Transzgenikus állatok (például egerek) alkalmazásával, amelyek endogén immunglobulintermelés hiányában képesek humán antitestek repertoárjának termelésére, ilyen antitesteket (E10C)hPYY3–36¹ vagy (D11C)hPVV3–36-polipeptid antigénnel történõ immunizálással állítunk elõ (azaz leg-

1

HU 005 805 T2

alább 6 folytonos aminosavval bír), adott esetben hordozóhoz konjugáltan. Lásd például: Jakobovits és munkatársai, 1993 fent; Jakobovits és munkatársai, Nature 362:255–58, 1993; Bruggermann és munkatársai, 1993, fent. Egy eljárás szerint ilyen transzgenikus állatokat állítunk elõ a benne a nehéz és könnyû immunglobulinláncokat kódoló lókuszok inaktiválásával, és a genomjukba humán nehéz- és könnyûlánc fehérjéket kódoló lókuszok inszertálásával. Részlegesen módosított állatok, azaz, amelyek kevesebb mint a teljes módosítással komplement bírnak, ezt követõen keresztezve vannak, hogy olyan állatot kapjunk, amelynek a kívánt, módosított immunrendszere van. Ha ezen transzgenikus állatoknak immunogént adunk, akkor ezek az állatok humán aminosavszekvenciájú (nem pedig például rágcsáló¹) antitesteket termelnek, ideértve az ezen antigénekre immunspecifikus variábilis régiókat is. Lásd: WO 96/33735 és WO 94/02602 számú nemzetközi közzétételi irat. További eljárásokat ismertetnek: 5,545,807 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, WO 91/10741 és WO 90/04036 számú nemzetközi közzétételi iratok, és 0 546 073 B1 számú európai szabadalom és WO 92/03918 számú nemzetközi közzétételi irat. Humán antitestek szintén elõállíthatóak gazdasejtekben történõ rekombináns DNS expresszióval vagy hibridomasejtekben történõ expresszióval, amint azt itt ismertettük. Egy alternatív megvalósítási mód szerint humán antitestek elõállíthatóak fág-bemutatott könyvtárakból is Hoogenboom és munkatársai, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks és munkatársai, J. Mol. Biol. 222:581, 1991). Ezek az eljárások utánozzák az immunszelekciót antitestrepertoárok bemutatása révén filamentumos bakteriofág felszínén, és a fág ezt követõ szelekcióját a kiválasztott antigénhez történõ kötõdés révén. Egy ilyen technikát ismertettek a WO 99/10494 számú nemzetközi közzétételi iratban, amely nagy affinitású és funkcionálisan agonisztikus antitestek izolálását ismerteti MPL- és msk-receptorokra ilyen megközelítés alkalmazásával. A kiméra, CDR ojtott, és humanizált antitesteket jellemzõen rekombináns eljárásokkal állítják elõ. Az antitesteket kódoló nukleinsavak vannak bejuttatva gazdasejtekbe és expresszálva vannak az itt ismertetett és a technika állasa szerinti anyagok és eljárások alkalmazásával. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az antitestek emlõsgazdasejtben, mint például CHO sejtekben vannak elõállítva. Monoklonális (például humán) antitestek elõállíthatóak gazdasejtben rekombináns DNS expresszálásával vagy hibridomasejtekben történõ expresszióval, ahogy ezt ismertettük. A találmány szerinti anti-(E10C)hPYY3–36 és anti(D11C)hPYY3–36 antitestek alkalmazhatóak bármilyen ismert vizsgálati módszerben, mint például kompetitív kötõdési vizsgálatok, közvetlen és közvetett szendvics vizsgálatok és immunprecipitációs vizsgálatok [Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158 (CRC Press, Inc., 1987)] az (E10C)hPYY3–36¹ és (D11C)hPYY 3–36 -polipeptidek detektálására és mennyiségi meghatározására, valamint polipeptidtisztí-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 17

2

tásra. Az antitestek olyan affinitással kötõdnek az (E10C)hPVV3–36¹ vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidek, amely megfelelõ az alkalmazott vizsgálati eljáráshoz. A találmány szerinti PYY agonisták adhatóak gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós só formájában a találmány szerinti eljárásban történõ alkalmazáshoz. Jellemzõ gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói a találmány szerinti vegyületeknek például a következõk: hidroklorid¹, hidrobromid¹, hidrojodid¹, nitrát¹, szulfát¹, biszulfát¹, foszfát¹, savanyú foszfát¹, izonikotinát¹, acetát¹, laktát¹, szalicilát¹, citrát¹, savanyú citrát¹, tartarát¹, pantotenát¹, bitartarát¹, aszkorbát¹, szukcinát¹, maleát¹, gantizinát¹, fumarát¹, glükonát¹, glükuronát¹, szaccharát¹, formiát¹, benzoát¹, glutamát¹, metánszulfonát¹, etánszulfonát¹, benzolszulfonát¹, pozícióig tartó toluolszulfonát¹, pamoát¹, palmitát¹, malonát¹, sztearát¹, laurát¹, malát¹, borát¹, hexafluor-foszfát¹, naftilát¹, glükoheptanoát¹, laktobionát és lauril-szulfonát-sók és a hasonlók. A nem pegezett változatok sói nem szükséges, hogy gyógyászatilag elfogadhatóak legyenek, ha az alkalmazott változat egy köztitermék a PEG-PYY3–36 változat konjugátum elõállítása során. A találmány szerinti PYY agonisták általában gyógyászati készítmény formában vannak beadva. A gyógyászati készítmény lehet például orális beadásra (például tabletta, kapszula, pirula, por, oldat, szuszpenzió), parenterális injekcióra (például steril oldat, szuszpenzió vagy emulzió), intranazális beadásra (például aeroszol cseppek stb.), rektális beadásra (például kúp) vagy transzdermális beadásra (például tapasz) alkalmas formában. A gyógyászati készítmény tartalmazni fog hagyományos gyógyászati hordozót és hatóanyagként a találmány szerinti PYY agonistát. Továbbá tartalmazhat további hatóanyagokat, adjuvánsokat stb. is. Bioaktív peptidek különbözõ gyógyászati készítményeinek elõállítására szolgáló eljárások jól ismertek a gyógyszerészetben. Lásd például a 2005/0009748 számú (az orális beadásra); és 2004/0157777, 2005/0002927 és 2005/0215475 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéseket (nyálkahártyán keresztüli beadásra, például intranazális vagy bukkális beadás). Lásd még Remington: The Practice of Pharmacy, Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 20. kiadás 2000. A találmány szerinti PYY agonista alkalmazható egyéb gyógyászati hatóanyagokkal az itt ismertetett betegségállapotok és ¹körülmények kezelésére. Tehát a kezelési eljárások tartalmazzák a találmány szerinti vegyületek beadását kombinációban egyéb hatóanyagokkal és szintén a találmány tárgyát képezik. A találmány szerinti PYY agonistákkal kombinációban alkalmazható gyógyászati hatóanyagok közé tartoznak elhízás elleni hatóanyagok, mint például kannabinoid¹1 (CB¹1) antagonisák (mint például rimonabant), 11b-hidroxi-szteroid-dehidrogenáz¹1 (1¹es típusú 11bHSD) inhibitorok, MCR¹4 agonisták, kolecisztokinin¹A (CCK¹A) agonisták, monoamin újrafelvétel gátlók (mint például szibutramin), szimpatomimetikus ágensek, b3adrenerg receptor agonisták, dopamin receptor agonisták (mint például bromocriptin), melanocitastimuláló

1

HU 005 805 T2

hormon receptor analógok, 5HT2c receptor agonisták, melaninkoncentráló hormon antagonisták, leptin, leptin analógok, leptin receptor agonisták, galanin antagonisták, lipáz inhibitorok (mint például tetrahidrolipsztatin, például orlisztát), anorektikus ágensek (mint például a bombezin agonista), neuropeptid¹Y receptor antagonisták (például NPY Y5 receptor antagonisták), tiromimetikus ágensek, dehidroepiandroszteron vagy analógja, glükokortikoid receptor agonisták vagy antagonisták, orexin receptor antagonisták, glükagonszerû peptid¹1 receptor agonisták, ciliáris neurotrófikus faktorok (mint például Axokine™ beszerezhetõ: Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY és Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH), humán agutirokon protein (AGRP) inhibitorok, ghrelin receptor antagonisták, hisztamin 3 receptor antagonisták vagy inverz agonisták, neuromedin U receptor agonisták, MTP/ApoB inhibitorok (például nyelõcsõszelektív MTP inhibitorok, mint például dirlotapid) és a hasonlók. A találmány szerinti PYY agonistákkal kombinációban alkalmazható elõnyös elhízás elleni hatóanyagok közé tartoznak a következõk: CB¹1 receptor antagonisták, nyelõcsõszelektív MTP inhibitorok, CCKa agonisták, 5HT2c receptor agonisták, NPY Y5 receptor antagonisták, orlisztát és szibutramin. A találmány szerinti eljárásokban alkalmazható elõnyös CB¹1 receptor antagonisták közé tartoznak a következõk: rimonabant (SR141716A ismert az Acomplia™ márkanéven is) beszerezhetõ a Sanofi-Synthelabo-tól vagy elõállítható az 5,624,941 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetett módon; N¹(piperidin-1¹il)-1¹(2,4diklór-fenil)-5-(4¹jód-fenil)-4-metil-1H-pirazol-3karboxamid (AM251) beszerezhetõ a Tocris™-tól, Ellisville, MO; [5¹(4¹bróm-fenil)-1¹(2,4-diklór-fenil)-4-etil-N(1¹piperidinil)-1H-pirazol-3-karboxamid) (SR147778), amely elõállítható a 6,645,985 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetett módon; N¹(piperidin-1¹il)-4,5-difenil-1-metil-imidazol-2-karboxamid, N¹(piperidin-1¹il)-4¹(2,4-diklór-fenil)-5-(4¹klór-fenil)-1metil-imidazol-2-karboxamid, N¹(piperidin-1¹il)-4,5-di(4¹metil-fenil)-1-metil-imidazol-2-karboxamid, N¹ciklohexil-4,5-di-(4¹metil-fenil)-1-metil-imidazol-2karboxamid, N¹(ciklohexil)-4¹(2,4-diklór-fenil)-5-(4¹klórfenil)-1-metil-imidazol-2-karboxamid és N¹(fenil)-4¹(2,4diklór-fenil)-5-(4¹klór-fenil)-1-metil-imidazol-2karboxamid, amely elõállítható a WO 03/075660 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett módon; az 1¹[9¹(4¹klór-fenil)-8-(2¹klór-fenil)-9H-purin-6¹il]-4-etilamino-piperidin-4-karbonsavamid-hidroklorid, mezilát és bezilát sója, amely elõállítható a 2004/0092520 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint; 1¹[7¹(2¹klór-fenil)-8-(4¹klórfenil)-2-metil-pirazolo[1,5¹a][1,3,5]triazin-4¹il]-3-etil-amino-azetidin-3-karbonsavamid és 1¹[7¹(2¹klór-fenil)-8(4¹klór-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5¹a][1,3,5]triazin-4¹il]-3metil-amino-azetidin-3-karbonsavamid, amely elõállítható a 2004/0157839 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint; 3¹(4¹klór-fenil)-2-(2¹klór-fenil)-6¹(2,2-difluor-propil)2,4,5,6-tetrahidro-pirazolo[3,4¹c]piridin-7¹on, amely elõ-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 18

2

állítható a 2004/0214855 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint; 3¹(4¹klór-fenil)-2-(2¹klór-fenil)-7¹(2,2-difluor-propil)6,7-dihidro¹2H,5H-4-oxa-1,2,7-triazaazulén-8¹on, amely elõállítható a 2005/0101592 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint; 2¹(2¹klór-fenil)-6¹(2,2,2-trifluor-etil)-3(4¹trifluor-metil-fenil)-2,6-dihidropirazolo[4,3¹d]pirimidin7¹on, amely elõállítható a 2004/0214838 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint; (S)-4-klór-N-{[3¹(4¹klór-fenil)-4-fenil-4,5-dihidropirazol-1¹il]-metil-amino-metilén}-benzolszulfonamid (SLV-319) és (S)-N-{[3¹(4¹klór-fenil)-4-fenil-4,5-dihidropirazol-1¹il]-metil-amino-metilén}-4-trifluor-metil-benzolszulfonamid (SLV-326), amely elõállítható a WO 02/076949 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettek szerint; N¹piperidino-5-(4¹bróm-fenil)-1¹(2,4-diklór-fenil)-4-etil-pirazol-3-karboxamid, amely elõállítható a 6,432,984 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetettek szerint; 1¹[bisz-(4¹klór-fenil)-metil]-3-[(3,5-difluor-fenil)metánszulfonil-metilén]-azetidin, amely elõállítható a 6,518,264 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetettek szerint; 2¹(5¹(trifluor-metil)-piridin-2-il-oxi)-N-(4¹(4¹klór-fenil)-3-(3¹ciano-fenil)-butan2¹il)-2-metil-propanamid, amely elõállítható a WO 04/048317 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettek szerint; 4¹{[6¹metoxi-2-(4¹metoxi-fenil)-1benzofuran-3¹il]-karbonil}-benzonitril (LY-320135), amely elõállítható az 5,747,524 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetettek szerint; 1¹[2¹(2,4-diklór-fenil)-2-(4¹fluor-fenil)-benzo[1,3]dioxol-5-szulfonil]-piperidin, amely elõállítható a WO 04/013120 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettek szerint; és [3¹amino-5-(4¹klór-fenil)-6¹(2,4diklór-fenil)-furo[2,3¹b]piridin-2¹il]-fenil-metanon, amely elõállítható a WO 04/012671 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettek szerint. A találmány szerinti kombinációkban, gyógyászati készítményekben, eljárásokban alkalmazható elõnyös belekben ható MTP inhibitorok közé tartoznak a következõk: dirlotapid ((S)-N-{2¹[benzil-(metil)-amino]-2-oxo1-fenil-etil}-1-metil)-5-{4’-(trifluor-metil)¹[1,1’-bifenil)]-2karboxamido]-1H-indol-2-karboxamid) és 1¹metil)-5[(4’-trifluor-metil-bifenil-2-karbonil)-amino]-1H-indol-2karbonsav-(karbamoil-fenil-metil)-amid, amelyek mindegyike elõállítható a 6,720,351 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertettek szerint; (S)-2-[(4’-trifluor-metil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kinolin-6-karbonsav-(pentil-karbamoil-fenil-metil)-amid, (S)2-[(4’-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kinolin-6-karbonsav-([(4¹fluor-benzil)-metil-karbamoil)-fenil-metil}amid, és (S)-2-[(4’-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]kinolin-6-karbonsav-[(4¹fluor-benzil-karbamoil)-fenilmetil]-amid, amelyek mindegyike elõállítható a 2005/0234099A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertettek szerint, (–)-4[4¹(4¹[4¹[[(2S,4R)-2-(4¹klór-fenil)-2-[[(4¹metil-4H-1,2,4triazol-3¹il)-szulfanil]-metil-1,3-dioxolán-4¹il]-metoxi]-fenil]-piperazin-1¹il]-fenil]-2-(1R)-1-metil-propil]-2,4-dihid-

1

HU 005 805 T2

ro-3H-1,2,4-triazol-3¹on (ismert, mint Mitratapid vagy R103757), amely elõállítható az 5,521,186 és 5,929,075 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban ismertetett módon; és implitapid (BAY 13–9952), amely elõállítható a 6,265,431 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban ismertetett módon. A legelõnyösebb a dirlotapid, mitratapid, (S)-2[(4’-trifluor-metil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kinolin-6karbonsav-(pentil-karbamoil-fenil-metil)-amid, (S)-2[(4¹terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kinolin-6-karbonsav-{[(4¹fluor-benzil)-metil-karbamoil]-fenil-metil}amid, vagy (S)-2-[(4’-terc-butil-bifenil-2-karbonil)-amino]-kinolin-6-karbonsav-[(4¹fluor-benzil-karbamoil)fenil-metil]-amid. Az elõnyös NPY Y5 receptor antagonisák közé tartoznak a következõk: 2¹oxo-N-(5¹fenil-pirazinil)-spiro[izobenzofurán-1-(3H),4’-piperidin]-1’-karboxamid, amely elõállítható a 2002/0151456 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetettek szerint; és 3¹oxo-N-(5¹fenil-2-pirazinil)-spiro[izobenzofurán-1-(3H),4’-piperidin]-1’-karboxamid; 3¹oxo-N-(7¹trifluor-metil-pirido[3,2¹b]piridin-2¹il)spiro[izobenzofurán-1-(3H),4’-piperidin]-1’-karboxamid; N¹[5¹(3¹fluor-fenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro-[izobenzofurán-1-(3H)], [4’-piperidin]-1’-karboxamid; transz-3’oxo-N-(5¹fenil-2-pirimidinil)]-spiro[ciklohexán-1,1’(3’H)-izobenzofurán]-4-karboxamid; transz-3’-oxo-N[1¹(3¹kinolil)-4-imidazolil]-spiro[ciklohexán-1,1’-(3’H)izobenzofurán]-4-karboxamid; transz-3-oxo-N-(5¹fenil2-pirazinil)-spiro-[4¹azaizo-benzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]-4’-karboxamid; transz-N-[5¹(3¹fluor-fenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro-[5¹azaizobenzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]-4’-karboxamid; transz-N-[5¹(2¹fluor-fenil)-2-pirimidinil]-3-oxospiro-[5¹azaizobenzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]-4’-karboxamid; transz-N-[1¹(3,5-difluor-fenil)4-imidazolil]-3-oxospiro-[7¹azaizobenzourán-1-(3H),1’ciklohexán]-4’-karboxamid; transz-3-oxo-N-(1¹fenil-4pirazolil)-spiro-[4¹azaizobenzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]-4’-karboxamid; transz-N-[1¹(2¹fluor-fenil)-3-pirazolil]-3-oxospiro-[6¹azaizobenzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]-4’-karboxamid; transz-3-oxo-N-(1¹fenil-3-pirazolil)-spiro-[6¹azaizobenzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]-4’karboxamid; és transz-3-oxo-N-(2¹fenil-1,2,3-triazol4¹il)-spiro-[6¹azaizobenzofurán-1-(3H),1’-ciklohexán]4’-karboxamid, amelyek mindegyike elõállítható a WO 03/082190 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettek szerint; és gyógyászatilag elfogadható sóik és észtereik. A találmány szerinti eljárásokban a találmány szerinti PYY agonista önmagában vagy egy vagy több gyógyászati hatóanyaggal kombináltan periferiálisan van beadva alanynak külön vagy együtt bármilyen a szakterületen ismert periferiális beadási módon. Tehát, a PYY agonista vagy kombináció beadható alanynak parenterálisan (például intravénásan, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan vagy szubkután), intranazálisan, orálisan, nyelv alatti módon, bukkálisan inhalációval (például aeroszollal), rektálisan (például kúpokkal) vagy transzdermálisan. A parenterális beadás az elõnyös beadási eljárás, és a parenterális beadás elõnyös beadási módja a szubkután beadás.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

2

A parenterális injekciós beadásra alkalmas készítmények általában tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható steril vizes vagy nem vizes oldatokat, diszperziókat, szuszpenziókat vagy emulziókat, és steril injekciózható oldatokká vagy diszperziókká újraoldható steril porokat. A megfelelõ vizes és nem vizes hordozók és diluensek (ideértve oldószereket és hordozókat) közé tartoznak a következõk: víz, etanol, poliolok (propilénglikol, polietilénglikol, glicerin és a hasonlók), ezek megfelelõ keverékei, trigliceridek, ideértve a növényi olajokat, mint például olívaolaj, és injekciózható szerves észterek, mint például az etil-oleát. Ezek a parenterális injekciózásra szolgáló készítmények tartalmazhatnak excipienseket is, mint például tartósító¹, nedvesítõ¹, szolubilizáló¹, emulgeáló- és diszpergálószereket. A készítmények mikroorganizmusok általi fertõzésének megelõzése elérhetõ különbözõ antibakteriális és gomba elleni szerekkel, például parabének, klór-butanol, fenol, szorbinsav és a hasonlók. Elõnyös lehet az is, hogy tartalmaz izotóniás szereket, például cukrokat, nátrium-kloridot és a hasonlókat. Az injekciózható gyógyászati készítmények elnyújtott abszorpciója elérhetõ olyan szerek alkalmazásával, amelyek képesek az abszorpció késleltetésére, például alumínium-monosztearát és zselatin. A találmány szerinti PYY agonisták alanynak olyan dózisban lesznek beadva, ami számos tényezõtõl függ, ideértve a beadás módját, az alany korát és súlyát, a betegség súlyosságát, a kezelt állapotot vagy rendellenességet, és a beadott PYY agonista farmakológiai aktivitását. A dózistartományok és az optimális dózisok meghatározása egy adott páciens esetében bõven az átlagos képességû szakember tudásán belül van. Parenterális beadás esetén a találmány szerinti PYY agonista beadható humán alanynak körülbelül 0,01 mg/kg–körülbelül 10 mg/kg/dózistartományba esõ dózisokban nem pegezett változatot alapul vevõ dózisrezsimben. Például a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 esetén a parenterális dózisszint a körülbelül 0,01 mg/kg–körülbelül 10 mg/kg/dózis dózistartományba esne az (E10C)hPYY3–36 alapján, elõnyösen a körülbelül 0,05 mg/kg–körülbelül 1,0 mg/kg/dózis tartományba, vagy körülbelül 0,05 vagy 0,1 mg/kg–körülbelül 1,0 mg/kg/dózis, vagy körülbelül 0,05 vagy 0,1 mg/kg–körülbelül 0,3 vagy 0,5 mg/kg/dózis. Például 85 mg 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 dózis, amelynek a molekulatömege körülbelül 34 024 Da (30 k Da PEG plusz 4024, a nem pegezett peptid molekulatömege), ekvivalens 10 mg nem pegezett (E10C)hPYY3–36-alapúval. A dózisrezsim lehet napi egy vagy több dózis, elõnyösen étkezések elõtt, vagy különösen a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 vagy a 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 esetén elõnyös a heti kétszer vagy háromszor vagy heti egyszeri rezsim vagy a 10–14 naponta egyszeri rezsim. A következõ példák jellemzik a találmány megvalósítási módjait. Értelemszerûen, azonban, a találmány megvalósítási módjai nem korlátozódnak ezen példák specifikus részleteire, mivel egyéb változatai közönséges szakember számára ismertek, vagy egyértelmûek

1

HU 005 805 T2

reakciókat közvetlenül töltöttük a kationcserélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket SEC–HPLC-vel határoztuk meg (2. ábra).

a jelen kitanítás és kapcsolódó igénypontok fényében. Az összes hivatkozott dokumentum hivatkozásként a leírás részét képezi. Példák 1. példa Lineáris 30K és 20K mPEG és 20K maleimid (E10C)hPYY3–36 Ez a példa lényegében homogén monopegezett (E10C)hPYY3–36-változatot ad, ahol az mPEG (20K vagy 30K) a 10. aminosavnál kapcsolódik. (a) Az (E10C)hPYY3–36 elõállítása (E10C)PYY3–36-polipeptidet szintetizáltunk szilárd fázisú eljárással Fmoc stratégia alkalmazásával 2¹(1Hbenzotrizole-1¹il)-1,1,3,3-tetrametil-urónium-hexafluorfoszfát (HBTU) aktiválással (Fastmoc, 0,15 mmol ciklusok) automata peptidszintetizátor készülék alkalmazásával (433A model; Applied Biosystems, Foster City, CA). Az alkalmazott oldallánc-védõcsoportok a következõk voltak: Trt az Asn, Gln, Cys és His esetében; tBu a Ser, Thr és Tyr esetében; Boc a Lys esetében; OtBu az Asp és Glu esetében; és Pbf az Arg esetében. A peptid-gyanta hasítást 9 mL trifluor-ecetsav (TFA), 0,5 g fenol, 0,5 mL H2O, 0,5 mL tioanizol és 0,25 mL 1,2-etánditiol keverékével szobahõmérsékleten végeztük 4 órán át. A peptidet jéghideg etil-éterben csaptuk ki, és mostuk etil-éterrel, feloldottuk DMSO-ban és fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk Waters Deltapak C18, 15 mm, 100 Å, 50×300 mm ID oszlopon (Cat # WAT011801, Waters, Milford, MA) lineáris gradiens alkalmazásával 100% A oldószer: 0% B oldószertõl 70% A oldószer: 30% B oldószerig, 30 perc alatt 80 mL/min áramlási sebességgel. Az A oldószer vizes 0,1% TFA (trifluor-ecetsav)-oldat. A B oldószer 0,1% TFA-oldat acetonitrilben. A tisztított peptid molekulatömegét igazoltuk ESI¹MS alkalmazásával (MAvg=4024), a tisztaságot pedig fordított fázisú HPLC alkalmazásával határoztuk meg (1. ábra). (b) Lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 elõállítása Lineáris mPEG-maleimid-reagenst, amely körülbelül 30 000 MW volt (Sunbright ME¹300MA, NOF Corporation, Tokió, Japán) szelektíven kapcsoltunk (E10C)hPYY3–36-polipeptidhez a 10. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Lineáris 30K mPEG-maleimid, feloldva 20 mM HEPES-ben (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH=7,0, vagy alternatív esetben, 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH=4,5, azonnal reagáltatva volt (E10C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, amely körülbelül 1 mg/mL peptidkoncentrációt adott és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(E10C)hPYY3–36 moláris arányt. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 óráig. A HEPES-ben pH=7,0 végzett reakciók 20 mM nátrium-acetátba pH=4,5 történõ hígítással lettek leállítva, kationcserélõ kromatográfiás azonnali tisztításhoz. A 20 mM nátrium-acetátban, pH=4,5, lévõ

2

5

10

15

20

25

30

35

40

(c) Lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 tisztítása A pegezett (E10C)hPYY3–36-peptideket a reakciókeverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-kromatográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett (E10C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított (E10C)hPYY3–36-peptidbõl és nagy molekulatömegûekbõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket hétszeresére hígítottuk az A pufferrel és az oszlopra töltöttük 2,5 mL/min áramlási sebességgel. Az oszlopot 5–10 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk. Ezt követõen különbözõ fajta (E10C)hPYY3–36-polipeptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 20 térfogatnyi 0–100 mM lineáris gradiensével. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frakciókat gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit ®SDS-PAGE alkalmazásával határoztunk meg (3. ábra). A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra egy Centriprep 3 betöményítõkészülékben (Amicon Technology Corporation, Northborough, MA) vagy alternatív esetben Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációjának meghatározását az RP HPLC csúcsterületnek a PYY3–36 standard görbéhez (nem mutatjuk) történõ összehasonlításával végeztük, vagy alternatív esetben az összegyûjtött frakciók koncentrációját a 280 nm¹es abszorbanciával határoztuk meg kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiensek alkalmazásával. Pegezett (E10C)hPYY3–36 tisztított adagját SEC–HPLC-vel határoztuk meg, amint azt a 6. ábrán mutatjuk.

(d) Lineáris 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 elõállítása Lineáris mPEG-maleimid-reagenst, amely körülbelül 20 000 MW volt (Sunbright ME¹200MA, NOF Corporation) szelektíven kapcsoltunk (E10C)hPYY3–36-polipeptidhez a 10. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjá50 hoz. Lineáris 20K mPEG-maleimidet, feloldva 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical, St. Luis, MO) pH=4,5, azonnal reagáltattunk (E10C)h PYY3–36-peptiddel, a peptid közvetlen hozzáadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön létre és körülbelül 55 1,3:1 mPEG:(E10C)hPYY3–36 relatív moláris arány jöjjön létre. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 60 percig, ezt követõen 4 °C¹on 16 óráig. A 20 mM nátrium-acetátban, pH=4,5, lévõ reakciókat közvetlenül töltöttük a kationcserélõ kromatográfiára. 60 A reakciótermékeket SEC–HPLC-vel határoztuk meg. 45

20

1

HU 005 805 T2

(e) Lineáris 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 tisztítása A pegezett (E10C)hPVV3–36-peptideket a reakciókeverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-kromatográfiás lépés alkalmazásával. A monopegezett (E10C)hPYY3–36-peptidet elválasztottuk a szabad PEGtõl, a nem módosított (E10C)hPYY3–36-peptidtõl és nagy molekulatömegûektõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 20K mPEG-maleimid (E10C)hPVV3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM nátriumacetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket az oszlopra 1,0 mL/perc áramlási sebességgel töltöttük. Az oszlopot mostuk 4 oszloptérfogatnyi A pufferrel 2,5 mL/perc áramlási sebességgel. Ezt követõen a különbözõ (E10C)hPYY3–36-fajtákat eluáltuk az oszlopról 25 oszloptérfogatnyi lineáris 0–200 mM NaCl gradienssel 2,5 mL/perc áramlási sebességgel. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretfrakciókat gyûjtöttünk össze. A frakciókat a pegezés mértéke szerint gyûjtöttük össze, amit SEC–HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen 0,5–5 mg/mL koncentrációra töményítettük be Vivaspin 10K betöményítõkészülék alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group). A tisztított frakció fehérjekoncentrációját 280 nm¹es abszorbanciával határoztuk meg kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával. A tisztított mono 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 teljes hozama 38% volt. A mono 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 frakciót 96%¹os tisztaságúnak határoztuk meg SEC–HPLC alkalmazásával.

5

10

15

20

25

30

35 2. példa Lineáris 30K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 Ez a példa lényegében homogén monopegezett (E10C)hPYY3–36 változatot ad, ahol az mPEG (20K vagy 30K) a 10. aminosavnál kapcsolódik. (a) A (D11C)hPYY3–36 elõállítása (D11C)PYY3–36-polipeptidet szintetizáltunk szilárd fázisú eljárással Fmoc stratégia alkalmazásával 2¹(1Hbenzotrizole-1¹il)-1,1,3,3-tetrametil-urónium-hexafluorfoszfát (HBTU) aktiválással (Fastmoc, 0,15 mmol ciklusok) automata peptidszintetizátor készülék alkalmazásával (433A model; Applied Biosystems, Foster City, CA). Az alkalmazott oldallánc-védõcsoportok a következõk voltak: Trt az Asn, Gln, Cys és His esetében; tBu a Ser, Thr és Tyr esetében; Boc a Lys esetében; OtBu az Asp és Glu esetében; és Pbf az Arg esetében. A peptid-gyanta hasítást 9 mL trifluor-ecetsav (TFA), 0,5 g fenol, 0,5 mL H2O, 0,5 mL tioanizol és 0,25 mL 1,2-etánditiol keverékével szobahõmérsékleten végeztük 4 órán át. A peptidet jéghideg etil-éterben csaptuk ki, és mostuk etil-éterrel, feloldottuk DMSO-ban és fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk Waters Deltapak C18, 15 mm, 100 Å, 50×300 mm ID oszlopon (katalógusszám: WAT011801, Waters, Milford, MA) lineáris

40

45

50

55

60 21

2

gradiens alkalmazásával 100% A oldószer: 0% B oldószertõl 70% A oldószer: 30% B oldószerig, 30 perc alatt 80 mL/min áramlási sebességgel. Az A oldószer vizes 0,1% TFA (trifluor-ecetsav)-oldat. A B oldószer 0,1% TFA-oldat acetonitrilben. A tisztított peptid molekulatömegét igazoltuk ESI¹MS alkalmazásával (MAvg=4038), a tisztaságot pedig fordított fázisú HPLC alkalmazásával határoztuk meg (4. ábra). (b) Lineáris 30K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 elõállítása Lineáris mPEG-maleimid-reagenst, amely körülbelül 30 000 MW volt (Sunbright ME¹300MA, NOF Corporation, Tokió, Japán) szelektíven kapcsoltunk (D11C)hPYY3–36-polipeptidhez a 11. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Lineáris 30K mPEG-maleimid, feloldva 20 mM HEPES-ben (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH=7,0, azonnal reagáltatva volt (D11C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, amely körülbelül 1 mg/mL peptidkoncentrációt adott és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(E10C)hPYY3–36 moláris arányt. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 óráig. A HEPES-ben pH=7,0 végzett reakciók 20 mM nátrium-acetátba pH=4,5 történõ hígítással lettek leállítva, kationcserélõ kromatográfiás azonnali tisztításhoz. A reakciótermékeket SEC–HPLCvel határoztuk meg (5. ábra). Alternatív esetben a fent ismertetett HEPES-ben lévõ lineáris 30K mPEG-maleimid feloldása helyett, 20 mM nátrium-acetátban van feloldva (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH=4,5, azonnal reagáltatva volt (D11C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, amely körülbelül 1 mg/mL peptidkoncentrációt adott és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(E10C)hPYY3–36 moláris arányt. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 óráig. A reakciókat közvetlenül töltöttük a kationcserélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket SEC–HPLC-vel határoztuk meg. (c) Lineáris 30K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 tisztítása A pegezett (D11C)hPYY3–36-peptideket a reakciókeverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-kromatográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett (D11C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított (D11C)hPYY 3–36 -peptidbõl és nagy molekulatömegûekbõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 30K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM nátriumacetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket hétszeresére hígítottuk az A pufferrel és az oszlopra töltöttük 2,5 mL/min áramlási sebességgel. Az oszlopot 5–10 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk. Ezt követõen különbözõ fajta (D11C)hPYY3–36-polipeptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 20 térfogatnyi 0–100 mM lineáris gradiensével. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frak-

1

HU 005 805 T2

ciókat gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációját az RP HPLC csúcsterületnek a PYY3–36 standard görbéhez (nem mutatjuk) történõ összehasonlításával végeztük. Pegezett (D11C)hPYY3–36 tisztított adagját SEC–HPLC-vel határoztuk meg, amint azt a 7. ábrán mutatjuk. Alternatív esetben a fenti pH=4,5 értékû reakciók a fenti (b) lépésbõl közvetlenül vannak az oszlopra töltve 2,5 ml/perc áramlási sebességgel és az összegyûjtött frakciók koncentrációját a 280 nm¹es abszorbanciával határoztuk meg kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiensek alkalmazásával. 3. példa Elágazó 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 Ez a példa lényegében homogén monopegezett (E10C)hPYY3–36-változat elõállítását mutatja be, ahol az mPEG a 10. aminosavnál kapcsolódik. (a) Elágazó 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 elõállítása Elágazó mPEG-maleimid-reagenst, amely körülbelül 43 000 MW volt (Sunbright GL2–400MA, NOF Corporation, Tokió, Japán) szelektíven kapcsoltunk (E10C)hPYY3–36-peptidhez, amelyet az 1(a) példában ismertetettek szerint állítottunk elõ, a 10. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Elágazó 43K mPEG-maleimidet oldottunk fel 20 mM HEPES-ben (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH=7,0, azonnal reagáltattuk (E10C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön létre és körülbelül 1:1 mPEG:(E10C)hPYY 3–36 relatív moláris arány. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 órát. A HEPES-ben, pH=7,0, lévõ reakciókat 20 mM nátrium-acetátba, pH=4,5, történõ hígítással állítottuk le az azonnal kationcserélõ kromatográfiás tisztításhoz. A reakciótermékeket SEC–HPLC alkalmazásával határoztuk meg (8. ábra). Alternatív esetben elágazó 43K mPEG-maleimidet, oldottunk fel 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH=4,5, és azonnal reagáltattuk az (E10C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön létre és körülbelül 1:1 mPEG:(E10C)hPYY3–36 relatív moláris arány. A reakciókat közvetlenül töltöttük kationcserélõ kromatográfiára. (b) Monopegezett elágazó 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 tisztítása A monopegezett elágazó 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY 3–36 -polipeptidet a nem módosított (E10C)hPYY3–36 és a nagyobb molekulatömegû fajtáktól egyetlen kationcserélõ kromatográfiás lépéssel választottuk el. Egy jellemzõ elágazó 43K mPEG-malei-

5

10

15

20

25

2

mid (E10C)hPYY3–36 reakciókeveréket (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionáltunk SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare), amely 20 mM nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A pH=7,0 reakciókeverékeket 10×¹re hígítottuk az A pufferrel és 2,5 mL/perc áramlási sebességgel töltöttük az oszlopra. Az oszlopot 5–10 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk. Ezt követõen, a különbözõ fajta (E10C)hPYY3–36peptideket eluáltuk az oszlopról 20 oszloptérfogatnyi 0–100 mM lineáris NaCl gradienssel. Az eluátumot 280 nm¹es (A280) abszorbanciával ellenõriztük és összegyûjtöttük a megfelelõ méretû frakciókat. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC–HPLC-vel határoztunk meg. A tisztított adagot ezt követõen 0,5–5 mg/mL¹re töményítettük be Centriprep 3 betöményítõvel (Amicon Technology Corporation) vagy, alternatív esetben, Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group). Az összegyûjtött adag fehérjekoncentrációját aminosavanalízissel határoztuk meg. Monopegezett elágazó 43 K mPEG-maleimid (E10C)hPYY 3–36 -polipeptid összegyûjtött adagját jellemeztük SEC–HPLC alkalmazásával, amint azt a 9. ábrán mutatjuk. Alternatív esetben a fehérjekoncentrációt az RP HPLC csúcsterület és a PYY3–36 standard görbe (nem mutatjuk) összehasonlításával határoztuk meg vagy 280 nm¹es abszorbanciával kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával.

30 4. példa Ez a példa bemutatja a lényegében homogén monopegezett (E10C)hPYY3–36 elõállítását lineáris 12 kD mPEG-gel, vagy elágazó 20 kD mPEG-gel, amelyek a 35 10. aminosavhoz kapcsolódnak, és a lényegében homogén monopegezett (D11C)hPYY3–36 elõállítását lineáris 12 kD mPEG-gel, vagy elágazó 20 kD mPEGgel, amelyek a 11. aminosavhoz kapcsolódnak. (a) Lineáris 12K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 elõállítása Körülbelül 12 000 MW lineáris mPEG-maleimid-reagenst (Sunbright ME¹120MA, NOF Corporation) szelektíven kapcsoltunk (E10C)hPYY3–36-peptidhez a 10. cisz45 tein-aminosav szulfhidril csoportjához. Lineáris 12K mPEG-maleimidet oldottunk fel 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical) pH=4,5, majd azonnal reagáltattuk (E10C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön lét50 re és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(E10C)hPYY3–36 moláris arány. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 órát. A 20 mM nátrium-acetátban, pH=4,5, lévõ reakciókat közvetlenül töltöttük kationcserélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket SEC–HPLC 55 vagy SDS-PAGE alkalmazásával határoztuk meg. 40

(b) Lineáris 12K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 tisztítása A pegezett (E10C)hPYY3–36-peptideket a reakció60 keverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-kro22

1

HU 005 805 T2

matográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett (E10C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított (E10C)hPYY3–36-peptidtõl, szabad PEG-tõl és nagy molekulatömegûektõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 12K mPEG-maleimid (E10C)hPYY 3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket az oszlopra töltöttük 1,0 mL/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot 4 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Ezt követõen különbözõ fajta (E10C)hPYY3–36-polipeptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 25 térfogatnyi 0–200 mM lineáris gradiensével, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frakciókat gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációját 280 nm¹es abszorbanciával kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával határoztuk meg. 12K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 tisztított adagját SEC–HPLC-vel vagy SDS-PAGE-val határoztuk meg.

2

nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket az oszlopra töltöttük 1,0 mL/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot 4 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. 5 Ezt követõen különbözõ fajta (E10C)hPYY3–36-polipeptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 25 térfogatnyi 0–200 mM lineáris gradiensével, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frakciókat 10 gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius 15 Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációját 280 nm¹es abszorbanciával kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával határoztuk meg. 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 tisztított adagját 20 SEC–HPLC-vel vagy SDS-PAGE-val határoztuk meg.

(e) Lineáris 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 elõállítása Körülbelül 20 000 MW lineáris mPEG-maleimid-rea25 genst (Sunbright ME¹200MA, NOF Corporation) szelektíven kapcsoltunk (D11C)hPYY3–36-peptidhez a 11. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Lineáris 20K mPEG-maleimidet oldottunk fel 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical) pH=4,5, majd azonnal reagáltat30 tuk (D11C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön (c) Elágazó 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 létre és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(D11C)hPYY3–36 elõállítása Körülbelül 20 000 MW elágazó mPEG-maleimid-reamoláris arány. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékgenst (Sunbright GL2–200MA, NOF Corporation) szeleten végeztük 0,5–24 órát. A 20 mM nátrium-acetátlektíven kapcsoltunk (E10C)hPYY3–36-peptidhez a 10. 35 ban, pH=4,5, lévõ reakciókat közvetlenül töltöttük kationcserélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Elágazó 20K SEC–HPLC vagy SDS-PAGE alkalmazásával határozmPEG-maleimidet oldottunk fel 20 mM nátrium-acetáttuk meg. ban (Sigma Chemical) pH=4,5, majd azonnal reagáltattuk (E10C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hoz(f) Lineáris 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 záadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön lét- 40 tisztítása re és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(E10C)hPYY3–36 moA pegezett (D11C)hPYY3–36-peptideket a reakcióláris arány. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten keverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-krovégeztük 0,5–24 órát. A 20 mM nátrium-acetátban, matográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett pH=4,5, lévõ reakciókat közvetlenül töltöttük kationcserélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket SEC–HPLC 45 (D11C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított (D11C)hPYY3–36-peptidtõl, szabad PEG-tõl és nagy vagy SDS-PAGE alkalmazásával határoztuk meg. molekulatömegûektõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 20K mPEG-maleimid (d) Elágazó 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 (D11C)hPYY 3–36 reakciókeverék (10 mg protein), tisztítása A pegezett (E10C)hPYY3–36-peptideket a reakció- 50 amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biokeverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-krotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM matográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). (E10C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított A reakciókeveréket az oszlopra töltöttük 1,0 mL/perc (E10C)hPYY3–36-peptidtõl, szabad PEG-tõl és nagy molekulatömegûektõl kationcsere-kromatográfia alkal- 55 áramlási sebességgel. Az oszlopot 4 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. mazásával. Egy jellemzõ lineáris 20K mPEG-maleimid Ezt követõen különbözõ fajta (D11C)hPYY3–36-poli(E10C)hPYY 3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose peptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 25 térfogatnyi Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Bio0–200 mM lineáris gradiensével, 2,5 ml/perc áramlási tech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM 60 sebességgel. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorban23

1

HU 005 805 T2

ciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frakciókat gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációját 280 nm¹es abszorbanciával kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával határoztuk meg. 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 tisztított adagját SEC–HPLC-vel vagy SDS-PAGE-val határoztuk meg. (g) Lineáris 12K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 elõállítása Körülbelül 12 000 MW lineáris mPEG-maleimid-reagenst (Sunbright ME¹120MA, NOF Corporation) szelektíven kapcsoltunk (D11C)hPYY3–36-peptidhez a 10. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Lineáris 12K mPEG-maleimidet oldottunk fel 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical) pH=4,5, majd azonnal reagáltattuk (D11C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hozzáadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön létre és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(D11C)hPYY3–36 moláris arány. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 órát. A 20 mM nátrium-acetátban, pH=4,5, lévõ reakciókat közvetlenül töltöttük kationcserélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket SEC–HPLC vagy SDS-PAGE alkalmazásával határoztuk meg. (h) Lineáris 12K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 tisztítása A pegezett (D11C)hPYY3–36-peptideket a reakciókeverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-kromatográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett (D11C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított (D11C)hPYY3–36-peptidtõl, szabad PEG-tõl és nagy molekulatömegûektõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 12K mPEG-maleimid (D11C)hPYY 3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket az oszlopra töltöttük 1,0 mL/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot 4 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Ezt követõen különbözõ fajta (D11C)hPYY3–36-polipeptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 25 térfogatnyi 0–200 mM lineáris gradiensével, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frakciókat gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációját 280 nm¹es ab-

2

szorbanciával kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával határoztuk meg. 12K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 tisztított adagját SEC–HPLC-vel vagy SDS-PAGE-val határoztuk meg. 5 (i) Elágazó 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 elõállítása Körülbelül 20 000 MW elágazó mPEG-maleimid-reagenst (Sunbright GL2–200MA, NOF Corporation) sze10 lektíven kapcsoltunk (D11C)hPYY3–36-peptidhez a 10. cisztein-aminosav szulfhidril csoportjához. Elágazó 20K mPEG-maleimidet oldottunk fel 20 mM nátrium-acetátban (Sigma Chemical) pH=4,5, majd azonnal reagáltattuk (D11C)hPYY3–36-peptiddel a peptid közvetlen hoz15 záadásával, hogy 1 mg/mL peptidkoncentráció jöjjön létre és körülbelül 1:1 relatív mPEG:(D11C)hPYY3–36 moláris arány. A reakciókat sötétben, szobahõmérsékleten végeztük 0,5–24 órát. A 20 mM nátrium-acetátban, pH=4,5, lévõ reakciókat közvetlenül töltöttük kationcse20 rélõ kromatográfiára. A reakciótermékeket SEC–HPLC vagy SDS-PAGE alkalmazásával határoztuk meg.

25

30

35

40

45

50

55

(j) Elágazó 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 tisztítása A pegezett (D11C)hPYY3–36-peptideket a reakciókeverékbõl tisztítottuk >95%¹ra egyetlen ioncsere-kromatográfiás lépés alkalmazásával. Monopegezett (D11C)hPYY3–36-peptidet tisztítottunk nem módosított (D11C)hPYY3–36-peptidtõl, szabad PEG-tõl és nagy molekulatömegûektõl kationcsere-kromatográfia alkalmazásával. Egy jellemzõ lineáris 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY 3–36 reakciókeverék (10 mg protein), amint fent ismertettük, frakcionálva volt SP¹Sepharose Hitrap oszlopon (5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, GE Healthcare, Piscataway, NJ), amely 20 mM nátrium-acetáttal volt ekvilibrálva, pH=4,5 (A puffer). A reakciókeveréket az oszlopra töltöttük 1,0 mL/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot 4 oszloptérfogatnyi A pufferrel mostuk, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Ezt követõen különbözõ fajta (D11C)hPYY3–36-polipeptidek eluálódtak az oszlopról NaCl 25 térfogatnyi 0–200 mM lineáris gradiensével, 2,5 ml/perc áramlási sebességgel. Az eluenst 280 nm¹es (A280) abszorbanciával monitoroztuk és megfelelõ méretû frakciókat gyûjtöttünk be. A frakciókat a pegezés mértékében öntöttük össze, amit SEC HPLC alkalmazásával határoztunk meg. A tisztított frakciókat ezt követõen betöményítettük 0,5–5 mg/mL koncentrációra Vivaspin 10K betöményítõ alkalmazásával (Vivascience Sartorius Group, Hannover, Németország). A tisztított összegyûjtött frakciók fehérjekoncentrációját 280 nm¹es abszorbanciával kísérletesen meghatározott extinkciós koefficiens alkalmazásával határoztuk meg. 20K mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 tisztított adagját SEC–HPLC-vel vagy SDS-PAGE-val határoztuk meg.

5. példa Biokémiai jellemzés (E10C)hPYY 3–36 , (D11C)hPYY 3–36 és az 60 (E10C)hPYY3–36 és (D11C)hPYY3–36 pegezett formáit 24

1

HU 005 805 T2

különbözõ biokémiai eljárásokkal jellemeztük, mint például rendre elektromos porlasztás tömegspektrometria (ESI¹MS), SDS-PAGE, és SEC HPLC és RP HPLC. (A) Elektromos porlasztás ionizációs tömegspektrometria (ESI¹MS) mérést végeztünk 1100 sorozatú LC/MSD elektromos porlasztás tömegspektrométerrel (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) a pozitív módban. [1(a), 2(a) példa]. (B) Fordított fázisú kromatográfiát végeztünk az (E10C)hPYY3–36-peptid elemzésére (1. és 4. ábra) ZORBAX Eclipse XDB¹C8 készüléken, 4,6×150 mm, 5 mm oszlop (katalógusszám: 993967–906, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) 100% A oldószer, 0% B oldószer–95% A oldószer, 5% B oldószer lineáris gradiens alkalmazásával 3 perc alatt, majd 95% A oldószer, 5% B oldószer–50% A oldószer, 50% B oldószer 12 perc alatt 1,5 ml/perc sebességgel [1(a) példa]. Az A oldószer vizes 0,1% TFA-oldat. A B oldószer 0,1% TFA-oldat acetonitrilben. Fordított fázisú kromatográfiát végeztünk a pegezett (E10C)hPYY3–36 és (D11C)PYY3–36 (nem mutatjuk) mennyiségi meghatározására Vydac C18 (2,1×250 mm) oszlopon (katalógusszám: 218MS552, Vydac, Hesperia, CA) 80% A oldószer, 20% B oldószer–40% A oldószer, 60% B oldószer lineáris gradiens alkalmazásával 48 perc alatt, 0,2 mL/perc sebességgel. (1C, 2C példa) Az A oldószer vizes 0,1% TFA-oldat. A B oldószer 0,085% TFA-oldat acetonitrilben. (C) Méretkizárásos nagy teljesítményû folyadékkromatográfia (SEC–HPLC) Lineáris 30K vagy elágazó 43 K mPEG vagy (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36-peptiddel alkotott reakciókeverékeit, a kationcserés tisztítási terméküket, és a végsõ tisztított termékeket nem denaturáló SEC–HPLC alkalmazásával határoztuk meg [1(b) és (c), 2(b) és (c) példa]. Analitikai nem denaturáló SEC–HPLC¹t végeztünk Shodex KW804 vagy TSK G4000PWXL (Tosohaas) alkalmazásával 20 mM foszfátban pH=7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mL/perc áramlási sebesség (adott esetben Superdex 200 7,8 mm×30 cm, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). A pegezés nagymértékben megnöveli a protein hidrodinamikai térfogatát, amely a korábbi retenciós idõk felé történõ eltolódást eredményez. A 30K mPEG-maleimid plusz (E10C)hPYY3–36 reakciókeverékekben, egy kis csúcsot figyeltünk meg, amely megfelelt a maradék nem módosított (E10C)hPYY3–36peptidnek, valamint új csúcsokat figyeltünk meg, amelyek megfelelnek a pegezett peptideknek (2. ábra). Új fajtákat figyeltünk meg a 30K mPEG (D11C)hPYY3–36 és az elágazó 43K mPEG (E10C)hPYY3–36 reakciókeverékekben, ahol nagyon kevés nem módosított (D11C)hPYY3–36 vagy (E10C)hPYY3–36 maradt (5. és 8. ábra). Ezeket a pegezett és nem pegezett fajtákat SP¹Sepharose kromatográfiával frakcionáltuk, és az eredményül kapott tisztított mono-mPEG (E10C)hPYY3–36 és mPEG (D11C)hPYY3–36-fajtákat ezt követõen bemutattuk, hogy egyetlen csúcsként eluálódnak nem denaturáló SEC alkalmazásával,

2

>95% tisztasággal (6., 7. és 9. ábra). Az SP¹Sepharose kromatográfiás lépés hatásosan eltávolította a szabad mPEG¹et, (E10C)hPYY 3–36 vagy (D11C)hPYY3–36-peptidet és a nagyobb molekulatö5 megû fajtákat a monopegezett lineáris 30K és az elágazó 43K mPEG(E10C)hPYY 3–36 vagy mPEG (D11C)hPYY3–36-peptidtõl. (D) SDS PAGE SDS-PAGE¹t [1(c) példa] alkalmaztunk a reakció, 10 kationcserélõ tisztítási frakciók (3. ábra) és a végsõ tisztítási termékek meghatározására. Az SDS-PAGE¹t 1 mm vastag 10¹NuPAGE géleken végeztük (Invitrogen, Carlsbad, CA) redukáló- és nem redukálókörülmények mellett és Novex Colloidal Coomassie™ 15 G¹250 megfestõ készlet (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával festettük meg. Biológiai vizsgálatok A találmány szerinti PYY agonisták alkalmassága, 20 mint gyógyászati hatóanyagok a súlygyarapodás csökkentésében és az elhízás kezelésében emlõsökben (különösen emberekben), bemutatható az agonisták hagyományos vizsgálati eljárásokban és in vitro és in vivo vizsgálati eljárásokban mutatott aktivitással, amint 25 azt lent ismertettük. Az ilyen vizsgálati eljárások eszközt adnak, miáltal a találmány szerinti PYY agonisták aktivitása összehasonlítható ismert vegyületek aktivitásával. 30

35

40

45

50

55

60 25

Táplálékbeviteli vizsgálatok Éheztetésindukált újratáplálási vizsgálat: C57BL/6J hím egereket (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ketrecenként kettesével tartottunk. 12:12 fény:sötét cikluson voltak tartva (fények bekapcsolva reggel 5:00 órakor, fények kikapcsolva délután 5:00 órakor), táplálék pelletált RMH3000 Purina rágcsáló táp (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ), és korlátozás nélkül kaptak vizet. Az egerek 7¹8 hetes korúak lettek és minimum 10 napot akklimatizálódtak a vizsgálat elõtt. A vizsgálat napján az egerek 9–12 hetesek voltak. A vizsgálatot megelõzõ napon az egereket friss almot és táplálékot nem tartalmazó ketrecekbe helyeztük és szabadon engedtük õket vízhez hozzáférni. Éjszakán át éheztetve voltak (20–24 óra). A vizsgálat napján az egereknek IP injekcióval adtuk be a dózist (dózistérfogat=5 mL/kg), visszahelyeztük õket a ketrecbe, és elõre megmért élelmiszert helyeztünk azonnal a ketrecükbe. A dózishordozó 20 mM Na¹acetát volt, pH=4,5, 50 mM NaCl és a dózist a pegezés nélküli aktív PYY részre számoltuk. Hordozókontroll, natív PYY, 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY 3–36 és 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 három dózisban (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg és 1,0 mg/kg) volt vizsgálva. Az élelmiszert újramértük a dózisbeadást követõen 2, 4, 6 és 24 órával. Az almot ellenõriztük a kiszóródásra, amit megmértünk és hozzáadtuk a számításokhoz. Az összesített táplálékbevitelt az egyes idõpontokbeli táplálék tömegének a kiindulási tápláléktömegbõl történõ levonásával számoltuk ki. A százalékos (%) gátlást a következõ módon számoltuk: (Flkezelés – Flhordozó)/Flhordozó*100.

1

HU 005 805 T2

(E10C)hPYY3–36-peptidre mutattunk, ugyanannál a dózisnál (0,1 mg/kg) mind a 6 órás, mind a 24 órás esetben. A 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–38 hatását 5 az éhezésindukált újratáplálásra 0,1 mg/kg (SC) injekciót követõen szintén összehasonlítottuk a 30K maleimid (D11C)hPYY3–36 hatásaival. Míg a 30K mPEGmaleimid (D11C)hPYY 3–36 -polipeptid csökkentett összesített táplálékbevitelt (’food intake’, FI) okozott a 10 24 órás idõtartam alatt, amint azt az alábbi táblázatban mutatjuk, addig a hatás nem volt olyan nagy, mint amilyet a 30K maleimid (E10C)hPYY3–36 esetében figyeltünk meg.

A 10. ábra mutatja a 6 órás összesített bevitelt natív PYY 3–36 (10A. ábra) és a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 három dózisának IP injekciózását követõen (10B. ábra). Mind a natív PYY3–36, mind a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 dózisfüggõ csökkenést mutatott az összesített táplálékbevitelre a 6 óra alatt. A 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 szintén dózisfüggõ csökkenést mutatott 6 óra alatt (11A. ábra) és 24 óra alatt (11B. ábra) az összesített táplálékbevitelre. Azonban a 43K mPEG-maleimid (E10C)hPYY 3–36 összesített táplálékbevitelt csökkentõ hatása nem volt olyan nagy, mint amilyet a 30K mPEG-maleimid

Kezelés

Hordozó E10C D11C

2 óra FI

4 óra FI

% változás

2

6 óra FI

% változás

% változás

24 óra FI

átlag

2,03

0,00

2,93

0,00

4,06

0,00

10,79

0,00

SEM

0,16

8,06

0,22

7,46

0,46

11,30

0,67

6,23

átlag

1,89

–6,99

2,16

–26,21

2,45

–39,62

8,04

–25,48

SEM

0,27

13,45

0,27

9,09

0,26

6,33

0,88

8,14

átlag

2,14

5,22

2,56

–12,56

3,09

–24,02

9,08

–15,88

SEM

0,15

7,30

0,23

7,72

0,27

6,68

0,42

3,88

rint). Egy vizsgálatban, ahol 0,1 mg/kg (IP) dózist injekcióztunk hím egerekbe, az eredmények a következõk voltak, az alábbi táblázatban bemutatva.

A lineáris 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 hatását összehasonlítottuk a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36-peptiddel (mindkettõ az 1. példa sze-

% változás az összesített táplálékbevitelben a hordozóval kezelthez képest Kezelés

2 óra FI

4 óra FI

6 óra FI

24 óra FI

48 óra FI

30K E10C

–56

–65

–78

–47

–20

20K E10C

–65

–73

–79

–36

–17

Hasonlóan egy második vizsgálatban a lineáris 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 és 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 táplálási hatásainak összeha-

sonlításakor, 0,1 mg/kg dózist (SC) követõen, az eredmények a következõ táblázat szerintiek. 40

% változás az összesített táplálékbevitelben a hordozóval kezelthez képest. Kezelés

2 óra FI

4 óra FI

6 óra FI

24 óra FI

48 óra FI

72 óra FI

30K E10C

–13

–24

–29

–20

–12

–2

20K E10C

–45

–55

–58

–28

–14

–5

A plazma PYY koncentrációk SC injekciókat követõen a következõk voltak. Kezelés

2 óra

4 óra

6 óra

24 óra

30 óra

48 óra

30K E10C

151±58

204±48

308±29

139±27

79±14

40±6

20K E10C

110±21

186±37

204±14

62±16

45±12

13±3

Spontán táplálékbeviteli vizsgálat: C57BL/6J hím egereket (The Jackson Laboratory) egyedileg tartottunk és hagytuk õket 2 hetet akklimatizálódni a vizsgálat elõtt. 12:12 fény:sötét cikluson voltak tartva, por tápot ad lib kaptak, és szabadon hozzáfértek vízhez.

A dózisbeadása elõtti napon, az egereket táplálékbeviteli kamrákba helyeztük, és hagytuk õket 1 napot akklimatizálódni. A következõ napon az egereket IP vagy szubkután módon (SC) injekcióztuk közvetlenül a fé60 nyek kikapcsolását megelõzõen (délután 4 óra). A táp26

1

HU 005 805 T2

lálékbevitelt automatikusan rögzítettük 10 perces idõközönként a teljes idõtartam alatt és naponta mértük a testtömegeket. Az eredményeket natív PYY3–36 és a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 IP injekciója esetén mutatjuk be (12. ábra) és natív PYY3–36 és a 30K PEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 SC injekciója esetén (13. ábra). Míg mind a natív PYY3–36 mind a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 azonnali csökkenést váltott ki az összesített táplálékbevitelben a hordozóval kezelt egerekhez képest, addig a 30K mPEGmaleimid (E10C)hPYY3–36 által kiváltott csökkent táplálékbeviteli hatás sokkal hosszabb idõtartamú volt, mint a natív PYY3–36 által kiváltott hatás idõtartama. A hosszabb hatású táplálékbeviteli hatás mellett a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 megnyújtott plazmakitettséget is mutatott egyetlen injekciót követõen (0,1 mg/kg, IP) (14. ábra). Míg a natív PYY3–36 kiürülési sebessége 16 ml/perc/kg volt és a Cmax. 38 nM volt, addig a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 kiürülési sebessége 0,2 ml/perc/kg volt és a Cmax. 267 nM volt. A plazma PYY értékeket az egerekben hPYY radioimmunovizsgálati készlet alkalmazásával végeztük (Linco Research, Inc., St. Louis, MO). Minipumpa-vizsgálat ob/ob egerekkel: hím ob/ob egereket (The Jackson Laboratory), 8¹9 hetesek (n=26), tartottunk fenn normális táp mellett, és implantáltunk beléjük 14 napos ozmotikus minipumpákat (Alza Corp., Mountain View, CA), amelyek a következõk valamelyikét adták be: hordozót (sóoldat), PYY3–36 (0,1 mg/kg/nap), vagy 30K PEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 (0,03 mg/kg/nap). A tápláléktömeget és a testtömeget naponta mértük. A testzsírösszetételt a 0. és a 13. napokon határoztuk meg. Vérmintákat vettünk a vizsgálat végén. Nem volt szignifikáns különbség a táplálékbevitelben, testtömegben vagy a testzsírösszetételben ezen csoportok esetében. A plazma PYY értékét a vizsgálat végén határoztuk meg radioimmunovizsgálattal, amint azt fent ismertettük. A natív PYY3–36 kezelt csoportban, a plazma PYY szinteket 15±2 ng/ml értékûnek mértük; a 30K mPEGmaleimid (E10C)hPYY3–36 kezelt csoportban a plazma PYY szint 132±22 ng/ml volt. In vitro kötõdési vizsgálatok SPA ligand kötõdésre Az SPA a ligand kötõdésre a radiológiailag jelölt PYY kompetitív kiszorítását méri az Y2 receptorokról és szcintillációs anyagot (SPA gyöngyök) tartalmazó mikrogömböket alkalmaz, amelyek lektinnel vagy ivari agglutininnel (WGA) voltak bevonva, szállító: Amersham Biosciences (katalógusszám RPNQ 0085). KAN¹TS humán neuroblasztómasejtek szuszpenziói, amely sejtek a felszínükön expresszálnak Y2 recepto-

2

rokat (Fuhlendorf és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:182–186, 1990) állítottunk elõ sejtbetakarító puffer alkalmazásával, amely puffer a következõkbõl állt: 50 mM Hepes puffer (pH=7,4), 145 mM NaCl, 5 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glükóz, 0,1% BSA, 5% DMSO és Roche proteáz inhibitorok. Az SPA vizsgálatokat 96 lyukú alakban háromszorosan végeztük el lyukanként 50 000 sejt alkalmazásával, 125 I-PYY (40 000 cpm/lyuk) és SPA gyöngyök (0,5 mg/lyuk), 10 amelyek a következõ összetételû vizsgálati pufferben voltak: 50 mM Hepes puffer, pH=7,4, 1 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl,, 0,1% (tömeg/térfogat) BSA, 0,025% (tömeg/térfogat) bacitracin és 0,025% nátrium-azid. Különbözõ koncentrációkban (0,032–500 nM) adtunk hoz15 zá vizsgálati ligandokat a vizsgálatelegyhez, amelyet ezt követõen, rázatás mellett 16–24 órát inkubáltuk szobahõmérsékleten. A lemezeket egy órát állni hagytuk és ezt követõen számláltuk MicroBeta® Trilux detektor alkalmazásával (Perkin-Elmer, Boston, MA). Az 20 1. példa szerinti hPYY3–36 és a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 eredményeit a 15. ábrán mutatjuk be.

25

30

35

40

45

50

GTPg [35S] kötõdési vizsgálatok az NPY Y2R receptorokon A funkcionális vizsgálat egy GTPg [35S] kötõdési vizsgálat, amelyet NEN Flashplates (96 lyukú forma) lemezeken végeztünk. Membránokat állítottunk elõ KAN¹TS sejtekbõl, amint azt Bass és munkatársai ismertették, Mol. Pharm. 50: 709–715, 1990. GTPg [35S] kötõdési vizsgálatokat végeztünk 96 lyukú FlashPlate™ formán kétszeresen 100 pM GTPg [35S] és 10 mg membrán alkalmazásával lyukanként, amelyek vizsgálati pufferben voltak, amelynek az összetétele a következõ volt: 50 mM Tris HCl, pH=7,4, 3 mM MgCl2, pH=7,4, 10 mM MgCl2, 20 mM EGTA, 100 mM NaCl, 5 mM GDP, 0,1% borjú szérum albumin és a következõ proteáz inhibitorok: 100 mg/mL bacitracin, 100 mg/mL benzamidin, 5 mg/mL aprotinin, 5 mg/mL leupeptin. A vizsgálati elegyet ezt követõen inkubáltuk a vizsgálati vegyület növekvõ koncentrációival (6 pontos koncentrációgörbe; log hígítások a 10–12 M–10–5 M tartományban) 60 percig, 30 °C hõmérsékleten. A FlashPlates™ lemezeket ezt követõen 2000×g-vel centrifugáltuk 10 percig. A GTPg [35S] kötõdés stimulálását ezt követõen Microbeta™ detektor alkalmazásával határoztuk meg. Az EC50 és a belsõ aktivitás számításokat a Graphpad Prism alkalmazásával végeztük. Az 1. példa szerinti hPYY3–36 és a 30K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 eredményeit a 16. ábrán mutatjuk be. Az 1. példa szerinti 30K mPEGmaleimid (E10C)hPYY3–36 és a 20K mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 EC50-értékei összehasonlíthatóak voltak (például, 4,3 nM és 4,6 nM, ha ugyanazon vizsgálat során lettek mérve).

Szekvencialista <110> PFIZER PRODUCTS INC Summers, Neena L. Finn, Rory F. Siegel, Ned R.

27

HU 005 805 T2

<120> PYY AGONISTS AND USES THEREOF <130> PC32768B <150> US 60/650,366 <151> 2005–02–04 <150> US 60/733,656 <151> 2005–11–04 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr

28

1

HU 005 805 T2

2

<210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Cys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 5 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5

atcaaacccg aggctcccgg ctgtgacgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at

60 102

<210> 6 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6

atcaaacccg aggctcccgg ctgcgacgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at

60 102

<210> 7 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7

atcaaacccg aggctcccgg cgaatgtgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at

60 102

<210> 8 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8

atcaaacccg aggctcccgg cgaatgcgcc tcgccggagg agctgaaccg ctactacgcc tccctgcgcc actacctcaa cctggtcacc cggcagcggt at SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Az (E10C)hPYY3–36-polipeptid, amelynek az aminosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGCDAS-

60 102

PEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH 2 [SEQ ID No.:3] vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. 2. A (D11C)hPYY3–36-polipeptid, amelynek az ami60 nosavszekvenciája a következõ: IKPEAPGECAS29

1

HU 005 805 T2

PEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH 2 [SEQ ID No.:4] vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. 3. Konjugátum, amely polietilénglikolt (PEG) és (E10C)hPYY3–36 vagy (D11C)hPYY3–36-polipeptidet tartalmaz. 4. A 3. igénypont szerinti konjugátum, amelynek a képlete az alábbi (3) képlet:

5

2

8. A 7. igénypont szerinti konjugátum, ahol az (OCH2CH2)n rész tömegre vetített átlagos molekulatömege körülbelül 20 kD. 9. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelynek a képlete az alábbi (4) képlet:

10 4 3 ahol a PEG metoxi-PEG, és lineáris vagy elágazó, és a tömegre vetített átlagos molekulatömege körülbelül 1 kD–50kD, L jelentése a következõ képlet szerinti –O(CH2)pNHC(O)(CH2)r–, amely képletben p és r mindegyike egymástól függetlenül egész szám, amely legalább 1 és legfeljebb 6, vagy L jelentése a következõ képlet szerinti: –NHC(O)(CH2)s–, amely képletben s egész szám, amely legalább 1 és legfeljebb 6, és –SR az (E10C)hPYY3–36 vagy a (D11C)hPYY3–36polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti. 5. A 4. igénypont szerinti konjugátum, ahol az mPEG lineáris. 6. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelynek a képlete az alábbi (4) képlet:

ahol n jelentése körülbelül 600–750 tartománybeli 15 egész szám, és –SR a (D11C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti. 10. A 6. vagy 9. igénypont szerinti konjugátum, ahol az (OCH2CH2)n rész tömegre vetített átlagos molekula20 tömege körülbelül 30 kD. 11. A 4. igénypont szerinti konjugátum, ahol az mPEG elágazó. 12. A 11. igénypont szerinti konjugátum, ahol az mPEG glicerinnel van elágaztatva. 13. A 12. igénypont szerinti konjugátum, amelynek 25 a képlete az alábbi (5) képlet:

30

35 5

4 ahol n jelentése körülbelül 600–750 tartománybeli egész szám, és –SR az (E10C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti. 7. Az 5. igénypont szerinti konjugátum, amelynek a képlete az alábbi (4) képlet:

ahol mindegyik m jelentése körülbelül 450–500 tar40 tománybeli, körülbelül egyforma egész szám, és –SR az (E10C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti. 14. A 12. igénypont szerinti konjugátum, amelynek a képlete az alábbi (5) képlet: 45

50

4 ahol n jelentése körülbelül 375–525 tartománybeli egész szám, és –SR az (E10C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti.

55

5

ahol mindegyik m jelentése körülbelül 450–500 tartománybeli, körülbelül egyforma egész szám, és –SR a (D11C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisz60 tein-tiolcsoport kénatomját jelenti. 30

1

HU 005 805 T2

15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti konjugátum, ahol az (OCH2CH2)m részek mindegyikének tömegre vetített átlagos molekulatömege körülbelül 20 kD–22 kD. 16. Glicerinnel elágaztatott 43k mPEG-maleimid (E10C)hPYY3–36 konjugátum, amelynek képlete az alábbi (5) képlet

5

10

15 5 ahol mindegyik m körülbelül egyforma, és –SR az (E10C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti, vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. 17. Glicerin elágazó 43k mPEG-maleimid (D11C)hPYY3–36 konjugátum, amelynek képlete az alábbi (5) képlet

20

25

5

31

2

ahol mindegyik m körülbelül egyforma, és –SR a (D11C)hPYY3–36-polipeptidet jelöli, amelyben S a cisztein-tiolcsoport kénatomját jelenti, vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója. 18. Gyógyászati készítmény, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptidet vagy a 3–17. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot vagy gyógyszerészetileg elfogadható sójukat, és gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz. 19. A 18. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely tartalmaz egy második, elhízás elleni hatóanyagot. 20. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid vagy a 3–17. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum vagy gyógyszerészetileg elfogadható sójuk alkalmazása emlõsökben elhízás vagy túlsúlyosság állapotának kezelésére vagy emlõsökben súlygyarapodás gátlására, táplálékbevitel csökkentésére vagy kalóriabevitel csökkentésére szolgáló gyógyszer elõállítására. 21. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptidet kódoló polinukleotid. 22. Monoklonális antitest, amely specifikusan kötõdik a 3. vagy 4. azonosító számú szekvenciákon (SEQ ID NO:3 vagy SEQ ID NO:4) bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidhez. 23. A 22. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol a polipeptid a cisztein-aminosavnál pegezve van.

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

32

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

33

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

34

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

35

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

36

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

37

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

38

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

39

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

40

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

41

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

42

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

43

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

44

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

45

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

46

HU 005 805 T2 Int. Cl.: C07K 14/575

47

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest