(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000006779T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 006 779

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/00

(21) Magyar ügyszám: E 04 783275 (22) A bejelentés napja: 2004. 09. 03. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040783275 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1675579 A1 2005. 04. 14. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1675579 B1 2009. 08. 12.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 507349 P 2003. 09. 30.

(73) Jogosult: Centocor Ortho Biotech, Inc., Horsham, PA 19044 (US)

US

(72) Feltalálók: HEAVNER, George, Malvern, Pennsylvania 19355 (US); KNIGHT, David, M., Berwyn, Pennsylvania 19312 (US); SCALLON, Bernard, Collegeville, Pennsylvania 19426 (US); GHRAYEB, John, Downingtown, Pennsylvania 29335 (US); NESSPOR, Thomas, C., Collegeville, PA 19426 (US); HUANG, Chichi, Berwyn, Pennsylvania 19312 (US) (54)

(2006.01) A61K 38/00 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) C07K 16/00 (2006.01) C07K 16/46 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) C12N 5/00 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) A61P 7/06 (2006.01) C07K 14/505 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05032460 PCT/US 04/028976

(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Emberi eritropoietinutánzó kapocsmag utánzóanyagok („hinge core mimetibodyk), készítmények, eljárások és alkalmazások

HU 006 779 T2

(57) Kivonat A találmány tárgyát emlõs-EPO-utánzó kapocsmag („hinge core”) utánzóanyagok („mimetibodyk”), EPOutánzó kapocsmag utánzóanyagokat kódoló és komplementer nukleinsavak, gazdasejtek, valamint ezek elõ-

állítására és alkalmazására szolgáló eljárások képezik, ideértve a terápiás kiszereléseket és a gyógyászati alkalmazásokat is.

A leírás terjedelme 38 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 006 779 T2

A találmány leírása A találmány háttere A találmány tárgyköre A találmány tárgyát emlõs-EPO-utánzó kapocsmag („hinge core”) utánzóanyagok („mimetibodyk”), EPOutánzó kapocsmag utánzóanyagokat kódoló és komplementer nukleinsavak, gazdasejtek, valamint ezek elõállítására és alkalmazására szolgáló eljárások képezik, ideértve a terápiás kiszereléseket és a gyógyászati alkalmazásokat is. A vonatkozó technika állása A rekombináns proteinek a gyógyászati ágensek egyre fontosabb osztályát képezik. Az ilyen rekombináns terápiás ágensek elõrelépést hoztak a proteinek kiszerelése és kémiai módosítása terén. Ezek a módosítások potenciálisan fokozzák a terápiás proteinek terápiás alkalmazhatóságát, például a felezési idõ megnövelésével (például a proteolitikus enzimek hozzáférésének blokkolásával), biológiai aktivitásuk fokozásával, vagy nemkívánatos mellékhatásaik csökkentésével. Ilyen módosítás például a receptorproteinekkel fuzionált immunglobulinfragmensek, például az enteracept alkalmazása. Hosszabb felezési idõ elérése, vagy például Fc¹receptor-kötés, A¹protein-kötés vagy komplementkötés biztosítása érdekében is szerkesztettek az Fc domén alkalmazásával terápiás proteineket. Az emlõsök vérképzõ rendszerének egyik specifikus, létfontosságú szerepe az állat testét alkotó különféle szövetekhez oxigént szállító eritrociták, más néven vörösvérsejtek képzése. Az eritrociták képzésének folyamata (az eritropoézis) az eritrociták pusztulásának ellensúlyozása érdekében az állat egész életében folyamatosan zajlik. A vörösvértestek élettartama viszonylag rövid, jellemzõen 100–120 nap közötti. Az eritropoézis precízen szabályozott élettani mechanizmus, amelyben a szövetek megfelelõ oxigénellátásához elegendõ, de a vérkeringést nem akadályozó számú eritrocita képzésére kerül sor. Ma már ismert, hogy az eritropoézist elsõdlegesen egy polipeptid, az eritropoietin (EPO) nevû savas glikoprotein szabályozza. Az eritropoietin egy emlõs kromoszómán található egy kópiájú gén expressziójának eredményeként termelõdik. A rekombináns emberi EPO („rHuEPO”) aminosavszekvenciája alapvetõen megegyezik az emberi vizeletbõl nyert EPO aminosavszekvenciájával. A rHuEPO glikozilációja azonban eltér a vizelet eredetû EPO és az emberi szérumeredetû EPO esetében tapasztalttól. Egészséges emlõs vérplazmája nagyon alacsony koncentrációban tartalmaz EPO¹t, mivel a meglévõ számú keringõ eritrocita képes biztosítani a szövetek megfelelõ oxigénellátását. A plazmában jelen lévõ EPO az elöregedésük miatt elvesztett eritrociták pótlásához szükséges vörösvérsejtek képzõdését stimulálja. Az EPO-termelés fokozódik hipoxiás állapotokban, amelyeknél a test szöveteinek oxigénellátása a megfelelõ szöveti vérellátás ellenére az élettani szint alá csökken. Hipoxia alakulhat ki vérzés, sugárzás okozta

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

vörösvértest-pusztulás, különféle anémiák, nagy tengerszint feletti magasság, vagy hosszabb ideig tartó eszméletvesztés miatt. Ezzel szemben, ha a keringõ vörösvérsejtek száma meghaladja a normál szöveti oxigénellátáshoz szükséges mennyiséget, az EPO termelése csökken. Bizonyos megbetegedések rendellenes eritropoézissel járnak. A rekombináns emberi EPO¹t (rHuEPO¹t) számos országban terápiás céllal alkalmazzák. Az Amerikai Egyesült Államokban az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszer-engedélyezési Hivatala (U. S. Food and Drug Administration, FDA) jóváhagyta az rHuEPO végállapotú vesebetegséggel kapcsolatos anémia kezelésére történõ alkalmazását. Az ezen betegség kezelése érdekében hemodialízisen átesõ betegek jellemzõen súlyos fokú anémiában szenvednek, amit a vörösvérsejtek dialíziskezelés okozta károsodása és korai pusztulása idéz elõ. Az EPO más típusú anémiák kezelésére is eredményesen alkalmazható. Így például a kemoterápia okozta anémia, a mielodiszplázia okozta anémia, a különféle veleszületett megbetegedésekkel kapcsolatos anémiák, az AIDShez kapcsolódó anémia, a koraszülöttséghez kapcsolódó anémia mind kezelhetõk EPO-val. Mindemellett az EPO egyéb területeken is szerepet kaphat, így például csontvelõ-átültetésen átesett páciensekben elõsegítheti a normál hematokritérték gyorsabb elérését, igénybe vehetõ autológ vértranszfúzióra készülõ betegekben, valamint vastelítettségi rendellenességben szenvedõ páciensekben. Az eritropoietin (EPO) 165 aminosavból és négy szénhidrátláncból álló glikoprotein, amely az eritrocita prekurzorsejtek felületén lévõ specifikus receptorhoz kapcsolódva az eritropoézis elsõdleges szabályozójaként mûködik. A kötõdés hatására a prekurzorsejtek proliferálódnak és érett vörösvérsejtekké differenciálódnak. Az eritropoietinreceptor 484 aminosavból álló glikoprotein, amely nagy affinitással kötõdik az eritropoietinhez. Az eritropoietinreceptor esetében a ligandum indukálta homodimerizáció lehet az aktiválódást irányító egyik kulcsfontosságú esemény. Az eritropoietin viszonylag rövid felezési idõvel bír. Az intravénásan beadott eritropoietin elsõ fajú kinetikát követve eliminálódik, a keringõ eritropoietin felezési ideje idült vesebeteg páciensek esetében 3¹4 óra közötti. A terápiás dózisintervallum legalább 24 órán keresztül kimutatható plazma-eritropoietinszintet biztosít. Az eritropoietin szubkután beadását követõen szérumkoncentrációja 5–24 órán belül éri el a csúcsértéket majd lassan csökken. Random fág diszpléj peptidkönyvtárak eritropoietinreceptorral szembeni affinitás szempontjából történõ szkrínelésével több kutatócsoport is kisméretû eritropoietin peptidomimetikumokat azonosított. Ezek a szekvenciák nem mutatnak homológiát az eritropoietinnel. Funkcionális vizsgálati eljárásokban ezen peptidek közül több is aktivitást mutatott, amely azonban a rekombináns eritropoietinének csupán egy százezred része volt. Bár számos kísérlet történt ezen peptidek hatáserõsségének kovelens dimerek vagy multimerek ki-

1

HU 006 779 T2

alakításával történõ fokozására, ezek a vegyületek moláris egyenértéken számítva még mindig ezerszer–tízezerszer kevésbé aktívak, mint az eritropoietin, továbbá nagyon rövid felezési idõvel rendelkeznek, ami nem teszi lehetõvé terápiás felhasználásukat. Mindezek alapján igény mutatkozik terápiás EPOproteinek továbbfejlesztett és/vagy módosított változatai iránt, amelyekkel kikerülhetõk az említett és a szakember számára ismert egyéb problémák.

5

10 A találmány szerinti megoldás összefoglalása A találmány tárgyát 2. igénypont szerinti emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag, valamint az 1. igénypont szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag készítmény, valamint a 3–11. igénypontok szerinti kódoló- vagy komplementer nukleinsav, vektorok, gazdasejtek, készítmények, a utánzóanyag elõállítására szolgáló eljárások, valamint annak gyógyászati alkalmazásai képezik. A WO 00/24782 számú nemzetközi közzétételi irat Fc domén biológiailag aktív peptiddel történt fúzióját mutatja be. A biológiailag aktív peptid az EMP¹1 jelû EPO-utánzó peptid is lehet (lásd D2, SEQ ID NOS.: 17–20, 110. oldal, 1–5. sor). Az US 2003/0082749 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat emberi EPO-utánzó HuEPOL-vFc (g1, g2 vagy g4 izotípusú) fúziós proteineket mutat be (lásd [0002] bekezdés, valamint 2C. ábra). Mindezeknek megfelelõen egy ellenanyag vagy immunglobulinszerkezet vagy ¹funkció legalább egy részét utánzó, saját tulajdonságokkal és funkciókkal rendelkezõ találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag velejáró vagy szerzett in vitro, in vivo vagy in situ tulajdonságokkal vagy aktivitással rendelkezõ terápiás peptidet biztosít. Egy szempontból a találmány tárgyát a specifikus utánzóanyagot kódoló polinukleotidot tartalmazó vagy azzal komplementer izolált nukleinsavmolekulák képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a utánzóanyag nukleinsavmolekulákat tartalmazó rekombináns vektorok, az ilyen nukleinsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint az EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag nukleinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek elõállítására és/vagy alkalmazására szolgáló eljárások. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag a utánzóanyag P¹részének legalább egy ligandumhoz történõ kötõdését utánozza, vagy legalább egy protein, alegység, fragmens, rész vagy ezek tetszõleges kombinációjának legalább egy biológiai aktivitásával rendelkezik. A találmány tárgyát képezi továbbá az izolált EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag, ahol az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag legalább egy biológiai aktivitással bír, amilyen például, de nem kizárólag az I. képlet P¹részletének megfelelõ legalább egy bioaktív peptid vagy polipeptid ismert biológiai aktivitása. Egy EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag ez alapján ismert eljárásokkal megfelelõ aktivitás, így például legalább egy proteinre vagy annak fragmensére irányuló neutralizáló aktivitás megléte szempontjából szkrínelhetõ.

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

A találmány tárgyát képezi továbbá a következõ összetevõkbõl álló legalább egy készítmény (a) találmány szerinti izolált EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló nukleinsav és/vagy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag; (b) megfelelõ vivõanyag vagy hígító. A vivõanyag vagy hígító adott esetben ismert eljárások szerint gyógyászati szempontból elfogadható lehet. A készítmény adott esetben tartalmazhat továbbá legalább egy további vegyületet, proteint vagy készítményt. A találmány tárgyát képezi továbbá az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag gazdasejtben történõ expresszálására szolgáló legalább egy eljárás, amely során a gazdasejt kimutatható és/vagy kinyerhetõ mennyiségû EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag expresszálódását biztosító, találmány szerinti vagy szakember számára ismert körülmények közötti tenyésztésére kerül sor. A találmány tárgyát képezi továbbá a 8. igénypont szerinti, ember-EPO-ligandummal kapcsolatos állapotának kezelése érdekében beadandó, EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy azt tartalmazó készítmény. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag adott esetben a következõ tulajdonságok legalább egyikével rendelkezik: legalább 10–9 M, legalább 10–10 M, legalább 10–11 M, vagy legalább 10–12 M affinitással képes proteint megkötni; lényeges mértékben neutralizálja legalább egy protein vagy annak részlete legalább egy aktivitását. A találmány tárgyát képezi továbbá az izolált emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló izolált nukleinsav; az izolált nukleinsavat tartalmazó izolált nukleinsavvektor, és/vagy az izolált nukleinsavat magában foglaló prokarióta vagy eukarióta gazdasejt. A gazdasejt adott esetben a következõk bármelyike lehet: COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO¹, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa¹, mielóma- vagy limfómasejt, vagy ezek bármely származéka, halhatatlanná tett (immortalizált) vagy transzformált alakja. A találmány tárgyát képezi továbbá az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag elõállítására szolgáló eljárás, amely során az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló nukleinsav in vitro, in vivo vagy in situ transzlációjára kerül sor olyan körülmények között, amelyek kimutatható vagy kinyerhetõ mennyiségû EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag expresszálódását teszik lehetõvé. A találmány tárgyát képezi továbbá az izolált emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot és legalább egy, gyógyászati szempontból elfogadható vivõanyagot vagy hígítót tartalmazó készítmény. A készítmény adott esetben a következõ vegyületek vagy proteinek legalább egyikének hatékony mennyiségét tartalmazhatja: kimutatható jelzõanyag vagy riporter, antiinfektív drog, szív-érrendszeri (CV) drog, központi idegrendszeri (CNS) drog, autonóm idegrendszeri (ANS) drog, légzõszervi drog, gyomor-bélrendszeri drog, hormonális drog, folyadék- vagy elektrolit-egyensúlyra ható drog, hematológiai drog, daganatellenes drog, immunmoduláló drog, szem¹, fül- vagy orrkezelésre szolgáló drog, helyi kezelésre szolgáló drog, táplálkozásra ható drog, TNF-antagonista, reumaellenes szer, izomrela-

1

HU 006 779 T2

xáns, narkotikum, nem szteroid gyulladáscsökkentõ, fájdalomcsillapító, érzéstelenítõ, szedatívum, helyi érzéstelenítõ, neuromuszkuláris blokkoló, antimikrobiális szer, övsömörellenes szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, eritropoietin, immunizáció, immunglobulin, immunszuppresszáns, növekedési hormon, hormonhelyettesítõ drog, radiofarmakon, antidepresszáns, antipszichotikum, stimuláns, asztmaellenes készítmény, béta-antagonista, inhalációs szteroid, adrenalin vagy analógja, citokin, vagy citokinantagonista. A találmány tárgyát képezi továbbá sejt, szövet, szerv vagy állat megbetegedésének kezelésére szolgáló izolált emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag, amely kezelés során (a) a találmány szerinti izolált emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag hatékony mennyiségét tartalmazó készítménnyel inkubáljuk vagy kezeljük a sejtet, szövetet, szervet vagy állatot. Adott esetben a készítményben lévõ hatékony mennyiség 0,001–50 mg/kg sejt, szövet, szerv vagy állat. A utánzóanyag adott esetben a következõ beadási módok legalább egyikével inkubálható vagy adható be: parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás, intraartikuláris, intrabronchialis, intraabdominalis, intrakapszuláris, porcba történõ, intrakavitáris, intraceliális, intracerebelláris, intracerebroventrikuláris, vastagbélbe történõ, intracervikális, intragasztrikus, intrahepatikus, intramiokardiális, intraoszteális, medencébe történõ, intraperikardiális, intraperitoneális, intrapleurális, intraprosztatikus, intrapulmonáris, intrarektális, intrarenális, intraretinális, intraspinális, intraszinoviális, intratorakális, intrauterin, intravezikális módon, bóluszban, vaginálisan, rektálisan, szublingválisan, intranazálisan vagy transzdermálisan. A utánzóanyag adott esetben az (a) inkubálás vagy beadás elõtt, azzal egy idõben vagy azt követõen adott, a következõk közül legalább egy vegyületet vagy proteint tartalmazó készítmény beadásával együtt is alkalmazható: kimutatható jelzõanyag vagy riporter, antiinfektív drog, kardiovaszkuláris (CV) drog, központi idegrendszeri (CNS) drog, autonóm idegrendszeri (ANS) drog, légzõszervi drog, gasztrointesztinális (GI) drog, hormonális drog, folyadék- vagy elektrolitegyensúlyra ható drog, hematológiai drog, daganatellenes drog, immunmoduláló drog, szem¹, fül- vagy orrkezelésre szolgáló drog, helyi kezelésre szolgáló drog, táplálkozásra ható drog, TNF-antagonista, reumaellenes szer, izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid gyulladáscsökkentõ, fájdalomcsillapító, érzéstelenítõ, szedatívum, helyi érzéstelenítõ, neuromuszkuláris blokkoló, antimikrobiális szer, övsömörellenes szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, eritropoietin, immunizáció, immunglobulin, immunszuppresszáns, növekedési hormon, hormonhelyettesítõ drog, radiofarmakon, antidepresszáns, antipszichotikum, stimuláns, asztmaellenes készítmény, béta-antagonista, inhalációs szteroid, adrenalin vagy analógja, citokin, vagy citokinantagonista. A találmány szerinti megoldás leírása A találmány tárgyát a 2. igénypontban meghatározott izolált, rekombináns és/vagy szintetikus utánzó-

5

10

15

20

25

30

35

40

2

anyag, valamint az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló legalább egy polinukleotidot tartalmazó készítmények és kódoló nukleinsavmolekulák képezik. Jelen leírás szerinti értelemben az „EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag” legalább egy protein legalább egy ligandumkötését vagy legalább egy biológiai aktivitását, így például többek között, de nem kizárólag az 1–30. azonosító számú szekvenciák (SEQ ID NO. 1–30.) bármelyikén megadott protein in vitro, in situ és/vagy elõnyösen in vivo ligandumkötését vagy aktivitását utánozza, hordozza vagy stimulálja. Például az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag képes megkötni legalább egy proteinligandumot, és legalább egy proteinligandum, receptor, oldható receptor stb. lehet. A találmány szerinti megoldás szempontjából megfelelõ EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag képes modulálni, fokozni, módosítani, aktiválni legalább egy proteinreceptor jelátadást vagy egyéb mérhetõ vagy kimutatható aktivitást. A találmány szerinti utánzóanyag proteinligandumokhoz vagy receptorokhoz történõ megfelelõ affinitású kötõdéssel és adott esetben elõnyösen alacsony toxicitással jellemezhetõ. Közelebbrõl az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag elõnyösen alacsony szintû immunogenitással rendelkezik. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható utánzóanyag adott esetben jellemzõen alacsony toxicitás mellett, hosszú ideig tartó kezelésre alkalmazható, és megfelelõ vagy kiváló mértékben enyhíti a páciensek tüneteit. Az elért terápiás eredményekhez a kismértékû immunogenitás és/vagy nagyfokú affinitás, valamint egyéb, közelebbrõl nem meghatározott tulajdonságok is hozzájárulhatnak. „Kismértékû immunogenitás” alatt azt értjük, hogy a kezelt páciensek kevesebb mint körülbelül 75%-ában, vagy kevesebb mint körülbelül 50, 45, 40, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 és/vagy 1%¹ában idéz elõ lényeges mértékû HAMA, HACA vagy HAHA válaszreakciót, vagy a kezelt páciensekben a titeremelkedés mértéke alacsony (dupla antigénes enzim immunvizsgálati eljárásban kevesebb mint körülbelül 300, elõnyösen kevesebb mint körülbelül 100) [lásd például Elliott és munkatársai, Lancet 344:1125–1127 (1994)].

Alkalmazás A találmány szerinti izolált nukleinsavak az EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag elõállítására vehetõk igénybe, amely sejtben, szövetben, szervben vagy állatban (beleértve az emlõsöket és az embert) a következõk közül legalább egy proteinnel kapcsolatos álla50 pot, például többek között egy immunológiai rendellenesség CEN5039PCT vagy betegség, szív-érrendszeri rendellenesség vagy betegség, egy fertõzõ, malignus és/vagy neurológiai rendellenesség vagy betegség, anémia, immun/autoimmun; és/vagy rákos/fertõzõ, va55 lamint további ismert vagy meghatározott, proteinnel kapcsolatos állapot módosítására, kezelésére, enyhítésére, elõfordulásának megakadályozására vagy tüneteinek csökkentésére alkalmazható. A utánzóanyag-készítmény vagy az EPO-utánzó 60 kapocsmag utánzóanyagot tartalmazó gyógyászati ké45

4

1

HU 006 779 T2

szítmény hatékony mennyiségben adagolható az ilyen módosítást, kezelést, enyhítést, megelõzést vagy tünet¹, hatás- vagy mechanizmuscsökkentést igénylõ sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens részére. Hatékony lehet a körülbelül 0,0001 és 500 mg/kg közötti mennyiség egy vagy több alkalommal beadva, vagy a 0,0001–5000 mg/ml közötti szérumkoncentráció eléréséhez szükséges mennyiség egy vagy több alkalommal beadva, vagy az ezek közötti bármely hatékony érték vagy tartomány, amely meghatározására az itt leírt, vagy a releváns szakirodalomból ismert eljárások alkalmazhatók. Hivatkozások A jelen leírásban hivatkozott közlemények és szabadalmak a találmány szerinti leírás idõpontjában aktuális tudományos ismereteket tükrözik és/vagy bemutatják és elõsegítik a találmány szerinti megoldás megvalósítását. Publikáció alatt bármely tudományos vagy szabadalmi publikációt, vagy bármely, többek között rögzített, elektronikus vagy nyomtatott média formátumban elérhetõ egyéb információt értünk. Idetartoznak a következõ publikációk: Ausubel és munkatársai, szerk., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987–2003); Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow és Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan és munkatársai, szerk., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994–2003); Colligan és munkatársai, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997–2003). A találmány szerinti utánzóanyag ismert proteinekkel összehasonlítva legalább egy megfelelõ tulajdonságot biztosít, ilyen többek között, de nem kizárólag a következõk legalább egyike: megnövelt felezési idõ, fokozott aktivitás, specifikusabb aktivitás, fokozott aviditás, megnövekedett vagy csökkent „off rate”, szelektált vagy megfelelõbb aktivitás, kisebb mértékû immunogenitás, legalább egy kívánatos terápiás hatás fokozott minõsége vagy idõtartama, kevesebb mellékhatás stb. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot legalább egy sejtvonal, kevert sejtvonal, immortalizált sejt vagy immortalizált és/vagy tenyésztett sejtek klonális populációja termeli. A fehérjetermelõ, immortalizált sejtek elõállítására megfelelõ eljárások vehetõk igénybe. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag elõállítására elõnyösen legalább egy funkcionálisan átrendezett, vagy funkcionális átrendezõdésre alkalmas, továbbá a találmány szerinti utánzóanyag szerkezetét tartalmazó emberi immunglobulinlokuszból származó, vagy ahhoz alapvetõen hasonló DNS¹t tartalmazó vektor vagy nukleinsav alkalmazásával kerül sor. A „funkcionálisan átrendezett” kifejezés immunglobulin lokuszból származó, V(D)J rekombináción átesett, így immunglobulinláncot (például nehézláncot),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

vagy annak tetszõleges részletét kódoló nukleinsavszegmenst jelöl. Funkcionálisan átrendezett immunglobulingén megfelelõ eljárásokkal, így például nukleotidszekvenálással, hibridizációval (például Southern-blot¹, Northern-blot-módszerrel), a génszegmensek közötti kódoló kapcsolódási pontokhoz tapadó próbákkal, immunglobulingének enzimatikus amplifikációjával (például polimeráz-láncreakcióval) a génszegmensek közötti kódoló kapcsolódási pontokhoz tapadó láncindítókkal közvetlenül vagy közvetett módon azonosítható. Megfelelõ eljárásokkal az is megállapítható, hogy egy sejt termeli¹e az egy meghatározott variábilis régiót, vagy egy adott szekvenciát (például legalább egy P¹szekvenciát) magában foglaló variábilis régiót tartalmazó EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot. A találmány szerinti utánzóanyag elõállítható az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló nukleinsav alkalmazásával létrehozott, a utánzóanyagot a tejükben termelõ transzgenikus állatok vagy emlõsök, például kecskék, tehenek, lova, juhok stb. segítségével is. Ilyen állatok ellenanyag kódoló szekvenciákra alkalmazott ismert eljárások segítségével nyerhetõk. Lásd például, de nem kizárólag az 5827690; az 584999; a 4873316; az 5849992; az 5994616; az 5565362; az 5304489 számú és a hasonló amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. A találmány szerinti utánzóanyag elõállítható továbbá legalább egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló nukleinsav segítségével létrehozott transzgenikus növények és tenyésztett növényi sejtek (többek között, de nem kizárólag például dohány és kukorica) alkalmazásával, amelyek a növényi részekben vagy a belõlük tenyésztett sejtekben termelik az utánzóanyagokat. Nem korlátozó érvényû példaként megemlítendõ, hogy rekombináns proteineket expresszáló transzgenikus dohányleveleket sikeresen alkalmaztak nagy mennyiségû rekombináns protein elõállítására, például indukálható promoter segítségével. Lásd például Cramer és munkatársai, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:95–118 (1999) és a benne foglalt hivatkozásokat. Transzgenikus kukoricát vagy gabonát igénybe vettek továbbá emlõsproteinek ipari mennyiségû expresszálására, amelyek a más rekombinánsrendszerekben elõállított, vagy természetes forrásokból kitisztított proteinekkel egyenrangú biológiai aktivitással rendelkeztek. Lásd például Hood és munkatársai, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127–147 (1999) és a benne foglalt hivatkozásokat. Transzgenikus növényi magokból, például dohánymagból és burgonyagumóból nagy mennyiségben állítottak elõ ellenanyagokat, így ellenanyagfragmenseket, például szimpla láncú utánzóanyagokat (scFv’s) is. Lásd például Conrad és munkatársai, Plant Mol. Biol. 38:101–109 (1998) és a benne foglalt hivatkozásokat. Mindezeknek megfelelõen a találmány szerinti utánzóanyag ismert eljárásokkal, transzgenikus növények alkalmazásával is elõállítható. Lásd továbbá például Fischer és munkatársai, Biotechnol. Apl. Biochem. 30:99–108 (Oct., 1999), Ma és munkatársai, Trends Biotechnol. 13:522–7 (1995); Ma és munkatársai, Plant Physiol. 109:341–6 (1995); White-

1

HU 006 779 T2

lam és munkatársai, Biochem. Soc. Trans. 22:940–944 (1994) és a bennük foglalt referenciákat. A találmány szerinti utánzóanyag széles affinitástartományban (KD) képes emberi proteinligandumok megkötésére. A találmány egy elõnyös megvalósítási módjában a találmány szerinti emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag adott esetben legalább egy proteinligandumot nagy affinitással képes megkötni. Például a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag adott esetben legalább egy proteinligandumot 10–7 M vagy alacsonyabb KD értékkel, elõnyösebben 0,1–9,9 (ideértve bármely köztes tartományt vagy értéket)×10–7, 10–8, 10–9, 10–10, 10–11, 10–12, vagy 10–13 M vagy alacsonyabb KD értékkel (beleértve bármely köztes értéket vagy tartományt) képes megkötni. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag legalább egy proteinligandumra vonatkozó affinitása vagy aviditása bármely arra alkalmas, például ellenanyag-antigén kötõdés affinitásának vagy aviditásának megállapítására használt eljárással, kísérletesen állapítható meg. (Lásd például Berzofsky és munkatársai, „Antibody-Antigen interactions” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., szerk., Raven Press; New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company; New York, NY (1992); illetve a bennük közzétett eljárásokat). Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag-ligandum kölcsönhatás megállapított affinitása különbözõ körülmények (például sókoncentráció, pH) között mérve eltérõ lehet. Emiatt az affinitás és egyéb ligandumkötési paraméterek (például KD, Kn, Kd) meghatározását elõnyösen az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag és ligandum standardizált oldataival, valamint például a leírásban szereplõ standardizált puffer alkalmazásával kell elvégezni.

5

10

15

20

25

30

35 Nukleinsavmolekulák A jelen leírásban közölt információ, így például az 1–30. azonosító számú szekvenciák bármelyikén megadott egymást követõ aminosavak legalább 90–100%¹át, valamint egy ellenanyag legalább egy részét kódoló nukleotidszekvenciák ismeretében, ahol az említett szekvenciák (I) képletbe P szekvenciaként inszertálva találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot adnak, vagy az említett szekvenciák legalább egyikét tartalmazó deponált vektor ismeretében itt közzétett, vagy szakember számára ismert eljárásokkal elõállítható az EPOutánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló találmány szerinti nukleinsavmolekula. A találmány szerinti nukleinsav lehet RNS, így például mRNS, hnRNS, tRNS vagy bármely egyéb forma, vagy lehet DNS, így többek között, de nem kizárólag cDNS, klónozással vagy szintetikus úton elõállított genomi DNS, vagy mindezek tetszõleges kombinációja. A DNS tripla szálú, dupla szálú, szimpla szálú, vagy ezek tetszõleges kombinációja lehet. A DNS vagy RNS legalább egy szálának tetszõleges része kódoló, más néven szensz szál lehet, vagy lehet nemkódoló, másnéven antiszensz szál. A találmány szerinti izolált nukleinsavmolekulák közé tartozhatnak nyitott leolvasási keretet (ORF¹et) és

40

45

50

55

60 6

2

adott esetben egy vagy több intront tartalmazó nukleinsavmolekulák, az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag kódolószekvenciáját tartalmazó nukleinsavmolekulák, valamint a fentiektõl lényegesen eltérõ nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavmolekulák, amelyek azonban a genetikai kód degeneráltságának köszönhetõen mégis a találmány szerinti vagy szakember számára ismert EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódolják. A genetikai kód szakember számára természetesen jól ismert. Ennek megfelelõen gyakorlott szakember számára rutinfeladatnak számít a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló degenerált nukleinsavvariánsok elõállítása (lásd például Ausubel és munkatársai, fentebb). Ezek a nukleinsavvariánsok is a találmány tárgyát képezik. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló nukleinsavat tartalmazó találmány szerinti nukleinsavmolekulák közé tartoznak többek között, de nem kizárólag a magát az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag-fragmens aminosavszekvenciáját kódoló nukleinsavmolekulák, a teljes EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag kódolószekvenciáját tartalmazó nukleinsavmolekulák, az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag kódolószekvenciáját további szekvenciákkal együtt, például legalább egy szignálvezetõ vagy fúziós peptid kódolószekvenciájával, az elõbbiekben említett további kódolószekvenciákkal vagy azok nélkül, például legalább egy intronnal, további nemkódoló szekvenciákkal, így többek között, de nem kizárólag nemkódoló 5’ és 3’ szekvenciákkal, például a transzkripcióban, mRNS-feldolgozásban szerepet játszó transzkriptált, nem transzlált szekvenciákkal, ideértve a szplájszing és poliadenilációs szignálokat (például riboszómakötés és mRNS-stabilitás); valamint további, kiegészítõfunkciókat biztosító további aminosavakat kódoló szekvenciákkal együtt tartalmazó nukleinsavmolekulák. Ennek megfelelõen az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló szekvencia marker szekvenciához, például a fuzionált EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag kitisztítását elõsegítõ peptidet kódoló szekvenciához fuzionálható. Nukleinsavszerkesztés A találmány szerinti nukleinsavak szakember számára jól ismert módon elõállíthatók (a) rekombinánseljárásokkal, (b) szintetikustechnikákkal, (c) tisztítótechnikákkal vagy mindezek kombinációjával. A nukleinsavak egy találmány szerinti polinukleotid mellett kényelmi okokból tartalmazhatnak egyéb szekvenciákat is. Például a polinukleotid izolálásának elõsegítése érdekében a nukleinsavba egy vagy több endonukleáz restrikciós helyet tartalmazó többszörös klónozóhely inszertálható. Hasonlóképpen transzlálható szekvenciák inszertálásával elõsegíthetõ a transzlált, találmány szerinti polinukleotid izolálása. Például egy hexa-hisztidin markerszekvencia megkönnyíti a találmány szerinti proteinek tisztítását. A találmány szerinti nukleinsav – a kódolószekvencia kivételével – adott esetben a találmány szerinti polinukleotid klónozására és/vagy expresszió-

1

HU 006 779 T2

jára szolgáló vektor, adapter vagy kapcsolószekvencia (linker). Az említett klónozó- és/vagy expressziós szekvenciákhoz a klónozásban és/vagy expresszióban betöltött mûködésük optimalizálása, a polinukleotid izolálásának elõsegítése, vagy a polinukleotid sejtbe juttatásának javítása érdekében további szekvenciák adhatók. Szakember számára jól ismertek a klónozóvektorok, expressziós vektorok, adapterek, kapcsolószekvenciák alkalmazásának módjai. Lásd például Ausubel, fentebb; vagy Sambrook, fentebb. Nukleinsavszerkesztésre szolgáló rekombinánseljárások A találmány szerinti izolált nukleinsavkészítmények, például RNS, cDNS, genomi DNS vagy ezek kombinációi biológiai forrásokból, képzett szakember számára ismert tetszõleges klónozómetódussal nyerhetõk ki. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a találmány szerinti polinukleotidokhoz megfelelõ sztringensségû állapotok mellett szelektíven hibridizáló oligonukleotidpróbákat alkalmazunk a kívánt szekvencia cDNS- vagy genomi DNS-könyvtárban történõ azonosítására. Az RNS-izolálás és a cDNS és genomi könyvtár készítés átlagosan képzett szakember számára jól ismertek (lásd például Ausubel, fentebb; vagy Sambrook, fentebb). Nukleinsavszerkesztésre szolgáló szintetikus eljárások A találmány szerinti izolált nukleinsavak ismert eljárásokkal közvetlen kémiai szintézis útján is elõállíthatók (lásd például Ausubel és munkatársai, fentebb). A kémiai szintézis általában szimpla szálú oligonukleotidot eredményez, amely dupla szálú DNS¹sé alakítható például komplementer szekvenciával történõ hibridizációval, vagy a szimpla szálat templátként alkalmazva DNS-polimerázzal történõ polimerizálással. Szakember számára ismert, hogy bár kémiai szintézissel csak körülbelül 100 körüli bázisból álló DNS-szekvenciák állíthatók elõ, a rövid szekvenciák összekapcsolásával hosszabb szekvenciák is nyerhetõk. Rekombináns expressziós kazetták A találmány tárgyát képezik továbbá az egy találmány szerinti nukleinsavat magukban foglaló rekombináns expressziós kazetták. Egy találmány szerinti nukleinsavszekvencia, például a találmány szerinti EPOutánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló cDNS vagy genomi szekvencia igénybevételével rekombináns expressziós kazetta szerkeszthetõ, amely legalább egy kívánt gazdasejtbe illeszthetõ. A rekombináns expressziós kazetta jellemzõen a polinukleotid adott gazdasejtben történõ transzkripcióját irányító transzkripciókezdést szabályozó szekvenciákhoz mûködõképesen kapcsolt formában tartalmaz egy találmány szerinti polinukleotidot. A találmány szerinti nukleinsavak expressziójának irányításához heterológ és nem heterológ (vagyis endogén) promoterek egyaránt igénybe vehetõk.

2

A találmány egyes megvalósítási módjaiban a találmány szerinti polinukleotid expressziójának fokozása vagy csökkentése érdekében egy nem heterológ alakú, találmány szerinti polinukleotid megfelelõ (5’ oldali, 3’ 5 oldali vagy intronbeli) pozíciójába promoter, enhenszer vagy egyéb szerepet betöltõ elemek juttathatók. Endogén promoterek módosíthatók például szakember számára ismert módon in vivo vagy in vitro mutációval, delécióval és/vagy szubsztitúcióval. Egy találmány szerin10 ti polinukleotid kívánt esetben szensz vagy antiszensz irányultságban egyaránt expresszálható. A génexpresszió szensz vagy antiszensz irányultságban történõ szabályozása közvetlen hatással lehet a megfigyelhetõ jellemzõkre. A szuppresszió egy további formája a 15 szensz szuppresszió. Szensz irányultságú nukleinsav bejuttatásával igazoltan hatékonyan blokkolható a célpont gének transzkripciója.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

Vektorok és gazdasejtek A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti izolált nukleinsavmolekulákat tartalmazó vektorok, a rekombináns vektorokkal genetikailag módosított gazdasejtek, valamint az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag szakember számára ismert rekombinánstechnikákkal történõ elõállítása (lásd például Sambrook és munkatársai, fentebb; Ausubel és munkatársai, fentebb). Gazdaszervezetben történõ szaporítás céljából a polinukleotidok adott esetben kiválasztást elõsegítõ markert tartalmazó vektorhoz csatolhatók. Egy plazmidvektor sejtbe juttatása általában megfelelõ ismert eljárásokkal, például elektroporációval vagy hasonló módon történhet, erre a célra alkalmas további eljárások a vektor precipitátumként, például kalcium-foszfátprecipitátumként, vagy töltött lipiddel képzett komplexben történõ alkalmazása. Ha a vektor vírus, megfelelõ csomagoló sejtvonal segítségével in vitro csomagolható, majd gazdasejtekbe transzdukálható. A DNS-inszertnek megfelelõ promoterhez mûködõképesen kapcsoltnak kell lennie. Az expressziós szerkezetek adott esetben legalább egy további helyet tartalmaznak transzkripciókezdés, ¹befejezés, valamint a transzkriptált régióban a transzláció érdekében riboszómakötõdés céljából. A szerkezetek által expresszált érett transzkriptumok kódolórésze elõnyösen a transzlálandó mRNS elején transzlációs kezdõhelyet, végén elhelyezve pedig végkodont (például UAA, UGA vagy UAG) tartalmaz, emlõs- vagy eukarióta sejtben történõ expresszió esetén az UAA és az UAG alkalmazása az elõnyös. Az expressziósvektorok elõnyösen, de csak adott esetben legalább egy kiválasztást elõsegítõ markert tartalmaznak. Ilyen markerek többek között, de nem kizárólag a metotrexát (MTX), a dihidrofolátreduktáz (DHFR, 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636 és 5179017 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), az ampicillin, a neomicin (G418), a mikofenolsav vagy a glutaminszintetáz (GS, 5122464; 5770359 és 5827739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) eukarióta sejttenyé-

1

HU 006 779 T2

szet esetében, valamint a tetraciklin- vagy ampicillinrezisztencia-gének E. coli és más baktériumok vagy prokarióták esetében. Szakember számára ismertek a fentiekben említett gazdasejteknek megfelelõ tápközegek és tenyésztési körülmények. A megfelelõ vektorok gyakorlott szakember számára jól ismertek. Vektorszerkezet gazdasejtbe juttatására alkalmas a kalciumfoszfát-transzfekció, a DEAE-dextrán közvetített transzfekció, a kationos lipid közvetített transzfekció, az elektroporáció, a transzdukció, a fertõzés vagy egyéb ismert eljárás. Ezen eljárások leírása megtalálható a szakirodalomban, lásd például Sambrook, fentebb, 1–4. és 16–18. fejezet; Ausubel, fentebb, 1., 9., 13., 15. és 16. fejezet. A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag módosított alakban, így például fúziós proteinként is expresszálható, és nem csupán szekréciós szignálokat, hanem további heterológ funkcionális régiókat is tartalmazhat. Például gazdasejtbeli perzisztencia és a tisztítás, vagy a késõbbi kezelés és tárolás alatti stabilitás elérése érdekében további, elsõsorban töltéssel rendelkezõ aminosavakból álló régió adható egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag N¹terminálisához, annak meghatározott részéhez vagy variánsához. A tisztítás elõsegítése érdekében a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyaghoz peptidgyökök is adhatók. Ezek a régiók az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag végleges elkészítése elõtt eltávolíthatók. Az erre vonatkozó eljárások számos standard laboratóriumi kézikönyvben megtalálhatók, lásd például Sambrook, fentebb, 17.22–17.42 és 18.1–18.74 fejezetek; Ausubel, fentebb, 16., 17. és 18. fejezet. Átlagosan képzett szakember megfelelõ ismeretekkel rendelkezik a találmány szerinti proteint kódoló nukleinsav expressziójára rendelkezésre álló számos expressziós rendszerrel kapcsolatban. A utánzóanyag elõállítására alkalmas sejttenyészetek jellemzõ képviselõi az emlõssejtek. Az emlõseredetû sejtrendszerek a legtöbb esetben egyrétegû sejttenyészetek, bár emlõssejt-szuszpenziók vagy bioreaktorok szintén igénybe vehetõk. Intakt glikozilált proteinek expresszálására alkalmas számos gazdasejtvonalat kialakítottak már, ilyenek például a COS¹1 (például ATCC CRL 1650), a COS¹7 (például ATCC CRL-1651), a HEK293, a BHK21 (például ATCC CRL¹10), a CHO (például ATCC CRL 1610, DG¹44) és a BSC¹1 (például ATCC CRL¹26) sejtvonal, a hepG2 sejtek, a P3X63Ag8.653, SP2/0¹Ag14, 293 sejtek, a HeLa-sejtek stb., amelyek egyszerûen beszerezhetõk például az „American Type Culture Collection”-tõl (Manassas, VA). Elõnyösnek tekintett gazdasejtek a lymphoid eredetû sejtek, így például a mieloma- és lymphomasejtek. Különösen elõnyös gazdasejtek a P3X63Ag8.653 sejtek (ATCC elérési szám CRL-1580) és az SP2/0¹Ag14 sejtek (ATCC elérési szám CRL-1851). Az ezen sejtek esetében alkalmazható expressziósvektorok a következõ expressziót szabályozó szekvenciák közül egyet vagy többet tartalmazhatnak, így például tartalmazhatnak replikációs kezdõhelyet, promotert (például késõi vagy korai SV40 promotere-

5

10

15

20

25

2

ket, CMV promotert (például 5168062; 5385839 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), HSV tk promotert, pgk (foszfoglicerátkináz) promotert, EF¹1 alfa-promotert (például 5266491 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), legalább egy emberi immunglobulinpromotert; enhenszert és/vagy feldolgozáshoz szükséges információt biztosító helyeket, így például riboszómakötõ helyet, RNS-szplájszhelyeket, poliadenilációs helyeket (például SV40 nagy T Ag poli A addíciós helyet), valamint transzkripciós terminátorszekvenciát. Lásd például Ausubel és munkatársai, fentebb; Sambrook és munkatársai, fentebb. A találmány szerinti nukleinsavak vagy proteinek elõállítására alkalmazható további sejtek megismerhetõk és/vagy beszerezhetõk például az „American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”-ból (www.atcc.org) vagy egyéb ismert, vagy kereskedelmi forrásokból. Eukarióta gazdasejtek igénybevétele esetén a poliadenilációs vagy transzkripciós terminátorszekvenciákat jellemzõen a vektor tartalmazza. Terminátorszekvencia például a szarvasmarha növekedési hormon génjébõl származó poliadenilációs szekvencia. A transzkriptum pontos szplájszingját elõsegítõ szekvenciák is igénybe vehetõk. Szplájszingszekvencia például az SV40 VP1 intronja [Sprague és munkatársai, J. Virol. 45:773–781 (1983)]. A vektorba foglalhatók mindemellett a gazdasejtbeli replikációt szabályozó, szakember számára ismert génszekvenciák is.

30

35

40

45

50

55

60 8

Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag tisztítása Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag rekombináns sejttenyészetekbõl történõ kinyerésére és kitisztítására jól ismert eljárások alkalmazhatók, ilyenek többek között, de nem kizárólagosan az A¹protein-tisztítás, az ammónium-szulfát- vagy etanolprecipitáció, a savas extrakció, az anion- vagy kationcserélõ kromatográfia, a foszfocellulózkromatográfia, a hidrofób interakciós kromatográfia, az affinitáskromatográfia, a hidroxil-apatit-kromatográfia és a lektinkromatográfia. A tisztítás céljára nagy teljesítményû folyadékkromatográfia (HPLC) is igénybe vehetõ. Lásd például Colligan, Current Protocols in Immunology, vagy Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997–2003), például 1., 4., 6., 8., 9., 10. fejezetek. A találmány szerinti utánzóanyag a természetes úton kitisztított termékeket, a szintetikus kémiai eljárásokkal nyert termékeket, valamint az eukarióta gazdasejtekbõl, például élesztõgomba¹, magasabb rendû növényi, rovar- vagy emlõssejtekbõl rekombinánstechnikákkal elõállított termékeket egyaránt magában foglalja. A rekombináns termelési eljárásban alkalmazott gazdaszervezet függvényében a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag lehet glikozilált vagy nem glikozilált, elõnyösen az utóbbi. Ilyen eljárások leírása számos standard laboratóriumi kézikönyvben megtalálható, lásd például Sambrook, fentebb, 17.37–17.42 szakaszok; Ausubel, fentebb, 10., 12., 13., 16., 18. és 20. fejezet; Colligan, protein Science, fentebb, 12–14. fejezetek.

1

HU 006 779 T2

Utánzóanyag A találmány szerinti izolált utánzóanyag magában foglal a találmány szerinti bármely polinukleotid által a leírásban részletesen tárgyalt módon kódolt EPOutánzó kapocsmag utánzóanyagot, valamint bármely izolált vagy elõállított EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag elõnyösen legalább egy EPO-proteinligandumhoz vagy receptorhoz kötõdik, így a neki megfelelõ proteinnek vagy fragmensének legalább egy EPO biológiai hatást biztosít. Szakember számára jól ismertek különféle terápiás vagy diagnosztikai szempontból lényeges proteinek, valamint szakember számára szintén jól ismertek az ilyen proteinek biológiai hatásai és a nekik megfelelõ vizsgálati eljárások. Az alábbi 1. táblázatban a találmány szempontjából megfelelõ EPO-utánzó peptidekre ismertetünk példákat, nem korlátozó jelleggel. Ezek a peptidek a találmány szerinti és/vagy szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elõ. A legtöbb esetben az aminosavakat egybetûs kóddal jelöltük. Ezekben a szekvenciákban (és a jelen leírás egészében, hacsak egy adott esetben nem határoztuk meg másként) az X azt jelenti, hogy a 20, természetes körülmények között elõforduló vagy ismert aminosav vagy azok ismert származékai, vagy bármely módosított aminosav egyaránt szerepelhet az adott helyen. Az említett peptidek bármelyike kapcsolószekvenciával vagy a nélkül tandem módon (vagyis egymás után) kapcsolódhat, a táblázatban felsoroltunk néhány példát a tandem kapcsolt peptidekre. A kapcsolószekvenciákat „D” jelöli, a találmány szerinti leírásban szereplõ bármely kapcsolószekvencia jelen lehet. A tandem ismétlõdéseket és a kapcsolószekvenciákat a könnyebb érthetõség kedvéért egymástól szaggatott vonallal elválasztva ábrázoltuk. Bármely,

5

10

15

20

25

30

35

2

ciszteinilreziduumot tartalmazó peptid adott esetben keresztkötéssel összekapcsolható egy másik, Cys-tartalmú peptiddel, az egyik vagy mindkét peptid vivõanyaghoz kapcsolt is lehet. A táblázatban keresztkötéssel összekapcsolt peptidekre is bemutatunk néhány példát. Bármely, egynél több Cys reziduumot tartalmazó peptid a peptiden belüli diszulfidkötést is kialakíthat, lásd például az 1. táblázat EPO-utánzó peptidjeit. A táblázatban peptiden belüli diszulfidkötéseket tartalmazó peptidekre is hozunk néhány példát. Az említett peptidek bármelyike a leírásban ismertetett módon derivatizálható, a táblázatban bemutatunk néhány példát a derivatizált peptidekre. Azoknál a származékoknál, ahol a karboxiterminálist aminocsoport fedi, a fedõ aminocsoportot –NH2-vel jelöltük. Azoknál a származékoknál, amelyekben az aminosavakat nem aminosavgyökökkel szubsztituáltuk, a szubsztitúciót d¹val jelöltük, amely szakember számára ismert bármely gyök helyett állhat, lásd például Bhatnagar és munkatársai (1966), J. Med. Chem. 39:3814–9 és Cuthbertson és munkatársai (1997), J. Med. Chem. 40:2876–82. A J szubsztituens és a Z szubsztituensek (Z5, Z 6 …Z 40 ) definícióját az 5608035, 5786331 és 5880096 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok tartalmazzák. Az EPO-utánzó szekvenciák (1. táblázat) esetében a X2 és Xn szubsztituensek, valamint az „n” egész szám definíciója a WO 96/40772 számú nemzetközi közzétételi iratban található. A kivastagítva jelölt reziduumok D¹aminosavak, de adott esetben L¹aminosavak is lehetnek. Mindegyik peptid ellenkezõ értelmû jelzés hiányában peptidkötéseken keresztül kapcsolódik. A rövidítések jegyzéke a leírás végén található. A „SEQ ID NO.” oszlopban az „NR” jelzés jelentése, hogy az adott szekvencia esetében nincs szükség a szekvencialistában való feltüntetésre.

1. táblázat EPO-utánzó peptidszekvenciák

Szekvencia/szerkezet YXCXXGPXTWXCXP YXCXXGPXTWXCXP-YXCXXGPXTWCCXP YXCXXGPXTWXCXP-L-YXCXXGPXTWXCXP YXCXXGPXTWXCXP-L-(e-amine)

SEQ ID NO 1 1 1 1

K bA YXCXXGPXTWXCXP-L- (a-amine) GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG GGVYACRMGPITWVCSPLGG VGNYMCHFGPITWVCRPGGG GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-L- GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK 9

1 2 3 4 5 6 7 7 7 8 8

1

HU 006 779 T2

2

1. táblázat (folytatás)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-L-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSS (e-amine)

8

K bA GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSS (a-amine) GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (-L-biotin) CX4X5GPX6TWX7C GGTYSCHGPLTWVCKPQGG VGNYMAHMGPITWVCRPGG GGPHHVYACRMGPLTWIC GGTYSCHPGPLTWVCKPQ GGLYACHMGPMTWVCQPLRG TIAQYICYMGPETWECRPSPKA YSCHFGPLTWVCK YCHFGPLTWVC X3X4X5GPX6TWX7X8 YX2X3X4X5GPX6TWX7X8 X1YX2X3X4X5GPX6X7X8X9X10X11 X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11 GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG VGNYMCHFGPITWVCRPGGG GGVYACRMGPITWVCSPLGG TIAQYICYMGPETWECRPSPKA YSCHFGPLTWVCK YCHFGPLTWVC SCHFGPLTWVCK (AX2)nX3X4X5GPX6TWX7X8 Az EPO biológiai aktivitásai szakember számára jól ismertek. Lásd például Anagnostou A. és munkatársai Eritropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Science (USA) 87: 5978–82 (1990); Fandrey J és Jelkman WE Interleukin 1 and tumor necrosis factor-alpha inhibit eritropoietin production in vitro. Annals of the New York Academy of Science 628: 250–5 (1991); Geissler K és munkatársai. Recombinant human eritropoietin: A multipotential hemopoietic growth factor in vivo and in vitro. Contrib. Nephrol. 87: 1–10 (1990); Gregory CJ Eritropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system. Studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cellular Physiology 89: 289–301 (1976); Jelkman W és munkatársai Monokines inhibiting eritropoietin production in human hepatoma cultures and in isolated perfused rat kidneys. Life Sci. 50: 301–8 (1992); Kimata H és munkatársai Human recombinant eritropoietin directly stimulates B cell immunoglobulin production and proliferation in serum-free medium. Clinical and Experimental Immunology 85: 151–6 (1991); Kimata H és munkatársai Eritropoietin enhances immunoglobulin production and proliferation by human plasma cells in a serum-free medium. Clin. Immunology Immunopathol. 59: 495–501 (1991); Kimata H és munkatársai Effect of recombinant human eritropoietin on human IgE pro-

8 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 duction in vitro Clinical and Experimental Immunology 35 83: 483–7 (1991); Koury MJ és Bondurant MC Eritropoietin retards DNA breakdown and prevents programmed cell death in erythroid progenitor cells. Science 248: 378–81 (1990); Lim VS és munkatársai Effect of recombinant human eritropoietin on renal function in 40 humans. Kidney International 37: 131–6 (1990); Mitjavila MT és munkatársai Autocrine stimulation by eritropoietin and autonomous growth of human erythroid leukemic cells in vitro. Journal of Clinical Investigation 88: 789–97 (1991); Andre M és munkatársai Performance 45 of an immunoradiometric assay of eritropoietin and results for specimens from anemic and polycythemic patients. Clinical Chemistry 38: 758–63 (1992); Hankins WD és munkatársai Eritropoietin-dependent and eritropoietin-producing cell lines. Implications for research 50 and for leukemia therapy. Annals of the New York Academy of Science 554: 21–8 (1989); Kendall RGT és munkatársai Storage and preparation of samples for eritropoietin radioimmunoassay. Clin. Lab. Haematology 13: 189–96 (1991); Krumvieh D és munkatársai 55 Comparison of relevant biological assays for the determination of biological active eritropoietin. Dev. Biol. Stand. 69: 15–22 (1988); Ma DD és munkatársai Assessment of an EIA for measuring human serum eritropoietin as compared with RIA and an in¹vitro bioassay. 60 British Journal of Haematology 80: 431–6 (1992); Noe 10

1

HU 006 779 T2

G és munkatársai A sensitive sandwich ELISA for measuring eritropoietin in human serum British Journal of Haematology 80:285–92 (1992); Pauly JU és munkatársai Highly specific and highly sensitive enzyme immunoassays for antibodies to human interleukin 3 (IL3) and human eritropoietin (EPO) in serum. Behring Institut Mitteilungen 90: 112–25 (1991); Sakata S és Enoki Y Improved microbioassay for plasma eritropoietin based on CFU¹E colony formation. Ann. Hematology 64: 224–30 (1992); Sanengen T és munkatársai Immunoreactive eritropoietin and erythropoiesis stimulating factor(s) in plasma from hypertransfused neonatal and adult mice. Studies with a radioimmunoassay and a cell culture assay for eritropoietin. Acta Physiol. Scand. 135: 11–6 (1989); Widness JA és munkatársai A sensitive and specific eritropoietin immunoprecipitation assay: application to pharmacokinetic studies. Journal of Lab. Clin. Med. 119: 285–94 (1992); további információért lásd az egyes biológiai vizsgálati eljárásokban alkalmazott egyedi sejtvonalakat. Az EPO vizsgálatára például a faktorra válaszreakciót adó HCD57, NFS¹60, TF¹1 vagy UT¹7 sejtvonalak alkalmazhatók. A csontvelõsejtekbõl képzõdõ CFU-E¹k számának megállapítása alapján az EPO-aktivitás telepképzõ vizsgálati eljárással is meghatározható. Alternatív és teljes mértékben eltérõ detekciós eljárás a citokinek mennyiségi meghatározása RT¹PCR-rel. A legalább egy protein vagy fragmens legalább egy biológiai aktivitását részben, vagy elõnyösen alapvetõ mértékben biztosító EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag képes a proteinbõl vagy fragmensébõl álló ligandum megkötésére, legalább egy olyan aktivitást biztosítva ezzel, ami egyébként a protein legalább egy proteinligandumhoz vagy receptorhoz történõ kötõdésén, vagy egyéb, proteinfüggõ vagy ¹közvetített mechanizmusokon keresztül érvényesül. Az „EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag aktivitás” alatt olyan EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot értünk, amely körülbelül 20–10 000% közötti mértékben, elõnyösen legalább 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000%-ban, vagy a vizsgálati eljárástól függõen akár nagyobb mértékben képes legalább egy proteinfüggõ aktivitás módosítására vagy kifejtésére. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag legalább egy proteinfüggõ aktivitás kifejtésére vonatkozó kapacitásának elbírálására elõnyösen egy találmány szerin-

5

10

15

20

25

30

35

2

ti és/vagy szakember számára ismert megfelelõ protein biológiai vizsgálati eljárás vehetõ igénybe. A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag legalább egy proteinre, alegységre, fragmensre, részre vagy ezek bármely kombinációjára specifikus legalább egy meghatározott ligandumhoz kötõdik. A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag eredetû EPO-utánzó peptid adott esetben a ligandum legalább egy meghatározott ligandumepitópjához kötõdik. A kötõepitóp legalább 1–3 aminosavból álló aminosavszekvenciától egy proteinligandum, például EPO-receptor vagy egy része által alkotott szekvenciából származó, egymást követõ aminosavak meghatározott szakaszának egészéig terjedõ szekvenciák tetszõleges kombinációját tartalmazhatja. Ezek a utánzóanyagok elõállíthatók például az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag (I) képletben feltüntetett különbözõ részeinek ismert eljárásokkal történõ összekapcsolásával, az EPO-utánzó kapocsmag utánzó-anyagot kódoló legalább egy (vagyis egy vagy több) nukleinsavmolekula ismert rekombináns-DNStechnológiai eljárások vagy bármely egyéb megfelelõ eljárás, például kémiai szintézis alkalmazásával történõ elõállításával és expresszálásával. Az emberi EPO-ligandumokhoz vagy receptorokhoz kötõdõ és legalább részben meghatározott nehézvagy könnyûlánc variábilis régiót tartalmazó utánzóanyagok megfelelõ, szakember számára ismert és/vagy a találmány tárgyát képezõ eljárások, például fág diszpléj [Katsube, Y. és munkatársai, Int J Mol. Med, 1 (3):863–868 (1998)] vagy transzgenikus állatokat alkalmazó módszerek segítségével állíthatók elõ. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag a kódolónukleinsav vagy egy része alkalmazásával megfelelõ gazdasejtben expresszálható. Elõnyösen az ilyen utánzóanyagok vagy ligandumkötõ fragmenseik nagy affinitással képesek emberi EPO-ligandumokat vagy receptorokat megkötni (például KD kisebb, vagy egyenlõ, mint körülbelül 10–7 M).

40 Aminosavkódok A találmány szerinti utánzóanyagot alkotó aminosavakat gyakran rövidítve jelezzük. Amint az szakember számára jól ismert, az aminosavakat egybetûs kóddal, 45 hárombetûs kóddal, névvel vagy három nukleotidból álló kodonokkal azonosíthatjuk (lásd Alberts, B., és munkatársai, Molecular Biology of the Cell, Harmadik kiadás, Garland Publishing, Inc., New York, 1994), lásd 2. táblázat.

2. táblázat Egybetûs kód

Hárombetûs kód

Név

Három nukleotidból álló kodon(ok)

A

Ala

Alanin

GCA, GCC, GCG, GCU

C

Cys

cisztin

UGC, UGU

D

Asp

aszpartámsav

GAC, GAU

E

Glu

glutaminsav

GAA, GAG

F

Phe

fenil-alanin

UUC, UUU

11

1

HU 006 779 T2

2

2. táblázat (folytatás) Egybetûs kód

Hárombetûs kód

Név

G

Gly

glicin

H

His

hisztidin

Három nukleotidból álló kodon(ok)

GGA, GGC, GGG, GGU CAC, CAU

I

Ile

izoleucin

K

Lys

lizin

L

Leu

leucin

M

Met

metionin

N

Asn

aszparagin

P

Pro

prolin

Q

Gln

glutamin

R

Arg

arginin

AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU

S

Ser

szerin

AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU

T

Thr

treonin

ACA, ACC, ACG, ACU

V

Val

valin

GUA, GUC, GUG, GUU

W

Trp

triptofán

Y

Tyr

tirozin

A találmány szerinti EPO kapocsmag utánzóanyag összetevõinek alábbi leírása a következõ, I. képleten alapul ((V(m)P(n)-L(o)-H(p)-CH2(q)-CH3(r))(s), ahol a V egy immunglobulin variábilis régió N¹terminálisának legalább egy része, a P legalább egy bioaktív peptid, az L legalább egy linker polipeptid, a H legalább egy immunglobulin kapocsrégió legalább egy része, a CH2 legalább egy immunglobulin CH2 konstans régió legalább egy része, a CH3 legalább egy immunglobulin CH3 konstans régió legalább egy része, az m, n, o, p, q, r és az s pedig egymástól függetlenül 0, 1 vagy 2 és 10 közötti egész szám. (A utánzóanyag) különbözõ típusú immunglobulinmolekulákat utánozhat, ilyenek többek között, de nem kizárólag az IgG1, az IgG2, az IgG3, az IgG4, az IgA, az IgM, az IgD, az IgE stb., vagy ezek bármely alosztálya vagy kombinációja. A kapocsmag utánzóanyagokban az opcionális N¹terminális V részlet legalább egy nehézlánc variábilis váz 1 (FR1) régióból származó 1–20 aminosavat tartalmazhat, amint az az 1–9. ábrákon látható (31–39. azonosító számú szekvencia; SEQ ID NOS:31–39), vagy legalább egy LC variábilis régiót, például amint az a 10–31. ábrákon látható (40–61. azonosító számú szekvencia; SEQ ID NOS:40–61) a 60/507349 számú, 2003/09/30¹án benyújtott amerikai egyesült államokbeli ideiglenes szabadalmi bejelentésben, amelyek megfelelnek a 2004. június 7¹én benyújtott PCT US04/19783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 1–41. ábráinak, ideértve az ezeken az ábrákon bemutatott szubsztitúciókat, deléciókat vagy inszerciókat, amely ábrák közül az 5., a 6. és a 8. ábra tekintendõ elõnyösnek. Elõnyösnek tekintendõk továbbá a Q–X–Q szekvenciát tartalmazó variábilis szekvenciák. A P részlet a szakember számára ismert, vagy a találmány tárgyát képezõ bármely terápiás peptid közül

AUA, AUC, AUU AAA, AAG UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU AUG AAC, AAU CCA, CCC, CCG, CCU CAA, CAG

UGG UAC, UAU

25 legalább egyet tartalmaz, amilyen többek között, de nem kizárólag az 1. táblázatban megadott 1–30. azonosító számú szekvenciák (SEQ ID NOS: 1–30) legalább egyike vagy ezek bármely kombinációja, vagy konszenzusszekvenciája, vagy bármely fúziós proteinje. 30 Az adott esetben alkalmazott kapcsolószekvencia lehet bármely, a célra megfelelõ, szakember számára ismert peptidlinker. Az elõnyösnek tekintett szekvencia a G és S tetszõleges kombinációit tartalmazza, például ilyen az X1¹X2-X3-X4¹Xn, ahol X lehet G vagy S és az 35 n 5–30 közötti. Erre vonatkozó, nem korlátozó erejû példák a GS, a GGGS, a GSGGGS, valamint a GSGGGSGG stb. A CH1 rész használaton kívül van és a kapocsrégió N¹terminálisáról változó számú aminosav törölve lett, 40 amint az a 60/507349 számú, 2003/09/30¹án benyújtott amerikai egyesült államokbeli ideiglenes szabadalmi bejelentés 1–42. ábráin látható, amelyek megfelelnek a 2004. június 7¹én benyújtott PCT US04/19783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 45 1–41. ábráinak és a 3. táblázatnak. Egy utánzóanyag kapocsmagrészéhez felhasznált változó számú aminosav többek között, de nem kizárólag legalább egy kapocsrégió N¹terminális aminosavai közül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 50 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, vagy 1–3, 2–5, 2–7, 2–8, 3–9, 4–10, 5–9, 5–10, 5–15, 10–20, 2–30, 20–40, 10–50, vagy bármely köztes értéknek vagy tartománynak 55 megfelelõ számú aminosav deléciójának eredményeként alakult ki, például amint az a 60/507349 számú, 2003/09/30¹án benyújtott amerikai egyesült államokbeli ideiglenes szabadalmi bejelentés 32–40. ábráin látható, amelyek megfelelnek a 2004. június 7¹én benyújtott 60 PCT US04/19783 számú amerikai egyesült államokbeli 12

1

HU 006 779 T2

szabadalmi bejelentés 1–41. ábráinak, és a 3. táblázatnak, de nem korlátozódik a 99–101 és 105–157 aminosavak bármelyikének vagy mindegyikének deléciójára, így a 99–105, 99–108, 99–111, 99–112, 99–113, 99–114, 99–115, 99–119, 99–125, 99–128, 99–134, 99–140, 99–143, 99–149, 99–155 és 99–158 pozíciójú aminosavakra, amelyek megfelelnek 2003/09/30¹án benyújtott 60/507349 számú ideiglenes amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 32–40. ábráinak, amelyek megfelelnek a 2004. június 7¹én benyújtott PCT US04/19783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 1–41. ábráinak, és a 3. táblázatnak, amelyek megfelelnek a 62–70. azonosító számú szekvenciáknak (SEQ ID NOS:62–70), ideértve a 2003/09/30¹án benyújtott 60/507349 számú ideiglenes amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 32–40. ábráin, valamint a 2004. június 7¹én benyújtott PCT US04/19783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 1–41. ábráin és a 3. táblázatban látható szubsztitúciókat, inszerciókat vagy deléciókat. A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban a kapocsmagrégió egészen egy Cys-reziduumig terjedõ, de azt nem tartalmazó, vagy egészen egy CysPro-Xaa-Cys szekvenciáig terjedõ, de azt nem tartalmazó deléciót magában foglaló kapocsmagrégió biztosítása érdekében kapocsrégió N¹terminális deléciót tartalmaz. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módjában a kapocsmag utánzóanyagban található kapocsmag szekvenciák a 36. ábrán (66. azonosító számú szekvencia; SEQ ID NO:66) (IgGI) látható 109–113. vagy 112–113. aminosavakat; a 37. ábrán (67. azonosító számú szekvencia; SEQ ID NO:67) (IgG2) látható 105–110. vagy 109–110. aminosavakat, a 38. ábrán (68. azonosító számú szekvencia; SEQ ID. No:68) (IgG3) látható 111–160., 114–160., 120–160., 126–160., 129–160., 135–160., 141–160., 144–160., 150–160., 156–160. és 159–160. aminosavakat, vagy a 39. ábrán (69. azonosító számú szekvencia; SEQ ID NO:69) (IgG4) látható 106–110. vagy 109–110. aminosavakat tartalmazzák. A CH2, CH3 és adott esetben a CH4 szekvencia bármely megfelelõ emberi vagy azzal kompatibilis szekvencia lehet, ilyenek például a 2004. június 7¹én benyújtott PCT US04/19783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 1–41. ábráinak megfelelõ, a 2003/09/30¹án benyújtott 60/507349 számú ideiglenes amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 1–42. ábráin, valamint a 3. táblázatban látható, vagy szakember számára ismert szekvenciák, vagy ezek bármely kombinációja vagy konszenzusszekvenciája, vagy bármely fúziós proteinje. Egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag mûködéséhez nélkülözhetetlen aminosavak szakember számára ismert eljárásokkal azonosíthatók, ilyenek például a helyirányított mutagenezis vagy az alaninszkennelõ mutagenezis [például Ausubel, fentebb, 8., 15. fejezet; Cunningham és Wells, Science 244:1081–1085 (1989)]. Az utóbbi eljárással a molekula minden egyes reziduumánál egyszeri alaninmutációt hoznak létre. Az így nyert mutáns molekulákat ezek után biológiai aktivi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

tásuk, így például, de nem kizárólag legalább egy, találmány szerinti vagy szakember számára ismert, proteinhez kapcsolódó aktivitás szempontjából vizsgálják. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy meghatározott része vagy variánsa kötõdése szempontjából kritikus helyek szerkezeti elemzéssel, például kristályosítással, magmágneses rezonanciavizsgálattal vagy fotoaffinitásjelzéssel is azonosíthatók [Smith és munkatársai, J. Mol. Biol. 224:899–904 (1992) és de Vos és munkatársai, Science 255:306–312 (1992)]. A utánzóanyagok az (I) képlet P részleteként nem kizárólagosan legalább egy részt, szakaszt vagy ezekbõl álló kombinációt tartalmazhatnak az 1–30. azonosító számú szekvenciák közül háromból vagy többõl, de legalább egyet tartalmaznak (SEQ ID NOS: 1–30.). A fenti aktivitásokat fokozni vagy fenntartani képes nem kizárólagos variánsok például, de nem kizárólag a fentiekben említett polipeptidek bármelyike, amely az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag megfelelõ biológiai aktivitásait vagy funkcióit lényeges mértékben nem befolyásoló legalább egy szubsztitúciónak, inszerciónak vagy deléciónak megfelelõ legalább egy mutációt tartalmaz. Egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag adott esetben az (I) képletbeli P részletként legalább egy polipeptidbõl származó legalább egy funkcionális részt, az 1–30. azonosító számú szekvenciák (SEQ ID NOS: 1–30) 90–100%-ának megfelelõ szekvenciák közül legalább egyet tartalmazhat. Egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag továbbá adott esetben az (I) képletbeli P részletként az 1–30. azonosító számú szekvenciák (SEQ ID NOS: 1–30) közül egynek vagy többnek megfelelõ aminosavszekvenciát tartalmazhat. A találmány egy megvalósítási módjában a P aminosavszekvencia vagy annak egy részlete körülbelül 90–100%-ban (vagyis 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 vagy ezek közti bármely tartománynak vagy értéknek megfelelõ százalékos mértékben) azonos az 1–30. azonosító számú szekvenciák (SEQ ID NOS:1–30) közül legalább egy megfelelõ szakaszának megfelelõ aminosavszekvenciával. A 90–100%¹os (vagyis 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 vagy ezek közti bármely tartománynak vagy értéknek megfelelõ százalékos mértékû) aminosavegyezés megállapítása szakember számára ismert számítógépes algoritmussal történik. A utánzóanyagok egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag egymást követõ aminosavai közül tetszõleges számút tartalmazhatnak, ahol ez a szám egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag egymást követõ aminosavai 10–100%¹a közötti egész számok egyike. Adott esetben az egymást követõ aminosavakból álló alszekvencia 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 vagy több, vagy ezek közötti tetszõleges tartománynak vagy értéknek megfelelõ aminosavhosszúságú. Mindezek mellett az ilyen alszekvenciák száma 1 és 20 közötti tetszõleges egész szám, így legalább 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

1

HU 006 779 T2

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 vagy több lehet. A biológiailag aktív utánzóanyagok a natív (nem szintetikus), endogén vagy rokon, ismerten inszertált vagy fuzionált protein vagy specifikus része vagy variánsa specifikus aktivitásának legalább 20%, 30% vagy 40%-ával, elõnyösen legalább 50%, 60% vagy 70%-ával, legelõnyösebben legalább 80%, 90% vagy 95–1000%-ával rendelkeznek. Szakember számára jól ismertek az enzimatikus aktivitás és a szubsztrátspecifitás vizsgálatára és mennyiségi meghatározására szolgáló eljárások. A találmány szerinti emberi utánzóanyagok és ligandumkötõ fragmensek szerves gyök kovalens kötéssel történõ hozzákapcsolásával módosíthatók. E módosítás eredményeként elõnyösebb farmakokinetikai tulajdonságokkal (például megnövelt in vivo szérumbeli felezési idõvel) rendelkezõ EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy ligandumkötõ fragmens jöhet létre. A szerves gyök lehet lineáris vagy elágazódó hidrofil polimercsoport, zsírsavcsoport vagy zsírsav-észtercsoport. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban a hidrofil polimercsoport körülbelül 800-tól körülbelül 120 000 daltonig terjedõ molekulatömegû polialkánglikol [például polietilénglikol (PEG), polipropilénglikol (PPG)], szénhidrátpolimer, aminosavpolimer vagy poli(vinil-pirrolidon) lehet, a zsírsav vagy zsírsavészter-csoport pedig körülbelül 8 és körülbelül 40 közötti számú szénatomot tartalmazhat. A módosított utánzóanyagok az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyaghoz közvetve vagy közvetlenül kovalens kötéssel kapcsolódó egy vagy több szerves gyököt tartalmazhatnak. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyaghoz kovalens kötéssel kapcsolódó minden egyes szerves gyök önállóan lehet hidrofil polimercsoport, zsírsavcsoport vagy zsírsav-észter-csoport. A „zsírsav” kifejezés a monokarboxilsavakat és a dikarboxilsavakat egyaránt magában foglalja. A „hidrofil polimercsoport” kifejezés olyan szerves polimerre utal, amely vízben jobban oldódik, mint oktánban. Például a polilizin jobban oldódik vízben, mint oktánban. Ennek megfelelõen a találmány tárgyát képezi a polilizinnel kialakított kovalens kötéssel módosított EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag. A utánzóanyagok módosítására alkalmas hidrofil polimerek lehetnek lineárisak vagy elágazódók, ilyenek például többek között a polialkánglikolok (például PEG, monometoxi-polietilénglikol (mPEG), PPG stb.), szénhidrátok (például dextrán, cellulóz, oligoszacharidok, poliszacharidok stb.), hidrofil aminosavak polimerei (például polilizin, poliarginin, poliaszpartát stb.), polialkán-oxidok (például polietilénoxid, polipropilén-oxid stb.) és poli(vinil-pirrolidon). A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot módosító hidrofil polimer önálló molekulaként elõnyösen körülbelül 800 és körülbelül 150 000 közötti molekulatömeggel rendelkezik. Például a PEG2500, PEGS5000, PEG7500, PEG9000, PEG10 000, PEG12 500, PEG15 000, és PEG20 000 megnevezések használhatók, ahol az alsó kitevõ a polimer átlagos molekulatömege daltonban.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

A hidrofil polimercsoport egytõl körülbelül hatig terjedõ számú alkil¹, zsírsav- vagy zsírsav-észter-csoporttal szubsztituálható. A zsírsav- vagy zsírsav-észtercsoporttal szubsztituált hidrofil polimerek megfelelõ eljárások alkalmazásával állíthatók elõ. Például amincsoportot tartalmazó polimer zsírsav vagy zsírsav-észter karboxilátjához kapcsolható, és zsírsavon vagy zsírsav-észteren található (például N,N-karbonil diimidazollal) aktivált karboxilátpolimer hidroxilcsoportjához kapcsolható. Az utánzóanyagok módosítására alkalmas zsírsavak és zsírsav-észterek lehetnek telítettek, vagy egy vagy több telítetlen egységet is tartalmazhatnak. A utánzóanyagok módosítására alkalmas zsírsavak például az n¹dodekanoát (C12, laurát), az n¹tetradekanoát (C14, mirisztát), az n¹oktadekanoát (C18, sztearát), az n¹eikozanoát (C20, arahidrát), az n¹dokozanoát (C22, behanát), az n¹triakontanoát (C30), az n¹tetrakontanoát (C40), a cisz-9-oktadekanoát (C18, oleát), az összes cisz-5,8,11,14-eikozatetranoát (C20, arachidonát), az oktándiosav, a tetradekándiosav, az oktadekándiosav, a dokozándiosav stb. Megfelelõ zsírsavészterek például a dikarboxilsavak lineáris vagy elágazódó kis szénatomszámú alkilcsoportot tartalmazó monoészterei. A kis szénatomszámú alkilcsoport 1 és körülbelül 12 közötti, elõnyösen 1 és körülbelül 6 közötti szénatomot tartalmaz. A módosított emberi utánzóanyagok megfelelõ eljárásokkal állíthatók elõ, ilyen például az egy vagy több módosítóágenssel történõ reagáltatás. A „módosítóágens” kifejezés aktiválócsoportot tartalmazó megfelelõ szerves csoportot (például hidrofil polimert, zsírsavat, zsírsav-észtert) jelöl. Az „aktiválócsoport” olyan kémiai gyök vagy funkcionális csoport, amely megfelelõ körülmények között egy második kémiai csoporttal képes reagálni, kovalens kötést alakítva ki ezzel a módosítóágens és a második kémiai csoport között. Aminreaktív aktiválócsoportok lehetnek például elektrofil csoportok, mint a tozilát, mezilát, halo (klór, bróm, fluor, jód), N¹hidroxi-szukcinilimidil-észterek (NHS) stb. A tiolokkal reakcióképes aktiválócsoportok például a maleimid, a jód-acetil, az akriloil, a piridil-diszulfidok, az 5¹tiol-2-nitro-benzoesav tiol (TNB-tiol) stb. Egy aldehid funkcionális csoport amin- vagy hidrazidtartalmú molekulákhoz kapcsolható, egy azidcsoport pedig háromértékû foszforcsoporthoz kapcsolódva foszforamidátvagy foszforimidkötéseket hoz létre. Az aktiválócsoportok molekulákba foglalására alkalmas eljárások szakember számára ismertek [lásd például Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press> San Diego, CA (1996)]. Egy aktiválócsoport a szerves csoporthoz (például hidrofil polimerhez, zsírsavhoz, zsírsav-észterhez) közvetlenül vagy kapcsológyökön, például kétértékû C1–C12 csoporton keresztül köthetõ, utóbbiban egy vagy több szénatom heteroatommal, például oxigénnel, nitrogénnel vagy kénnel helyettesíthetõ. Megfelelõ kapcsológyökök például a tetraetilénglikol, –(CH2)3–, a –NH–(CH2)6–NH–, a –(CH2)2–NH– és a –CH2–O–CHr CHz–O–CH2–CH2–O–CH–NH–. Kapcsológyököt tartalmazó módosítóágensek elõállít-

1

HU 006 779 T2

hatók például mono-Boc-alkildiamin (például monoBoc-etilén-diamin, mono-Boc-diamino-hexán) 1¹etil-3(3¹dimetil-amino-propil) karboimid (EDC) jelenlétében zsírsavval történõ reagáltatásával, aminek során a szabad amin és a zsírsav-karboxilát között amidcsoport jön létre. A Boc védõcsoport trifluor-ecetsavval (TFA) eltávolítható a termékbõl, az így szabaddá váló elsõdleges amin a leírtak szerint egy másik karboxiláthoz kapcsolható, vagy maleinsavanhidriddel reagáltatva és a kapott terméket ciklizálva a zsírsav aktivált maleimidszármazéka nyerhetõ (lásd például Thompson és munkatársai, WO 92/16221 számú nemzetközi közzétételi irat). A módosított utánzóanyagok elõállíthatók emberi EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag módosítóágenssel történõ reagáltatásával. Például a szerves gyökök nem helyspecifikus módon az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyaghoz köthetõk aminreaktív módosítóágens, például PEG NHS észter alkalmazásával. Módosított emberi utánzóanyagok állíthatók elõ továbbá EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag diszulfidhídjainak (például láncon belüli diszulfidhídjainak) redukálásával. A módosított EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag a redukált EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag tiolreaktív módosítóágenssel történõ reagáltatásával állítható elõ. EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag specifikus helyeihez kötött szerves gyököt tartalmazó módosított emberi utánzóanyagok megfelelõ eljárások, például reverz proteolízis [Fisch és munkatársai, Bioconjugate Chem., 3:147–153 (1992); Werlen és munkatársai, Bioconjugate Chem., 5:411–417 (1994); Kumaran és munkatársai, Protein Sci 6(10):2233–2241 (1997); Itoh és munkatársai, Bioorg. Chem. 24(1): 59–68 (1996); Capellas és munkatársai, Biotechnol. Bioeng., 56(4):456–463 (1997)], valamint a Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996) címû munkájában leírt eljárások segítségével állíthatók elõ. EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag készítmények A találmány tárgyát legalább egy, legalább kettõ, legalább három, legalább négy, legalább öt, legalább hat vagy több, találmány szerinti, vagy szakember számára ismert utánzóanyagot vagy azok meghatározott részét vagy variánsát tartalmazó, természetes körülmények között elõ nem forduló készítményben, keverékben vagy alakban lévõ legalább egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagból, vagy annak részébõl vagy variánsából álló készítmény képezi. Az ilyen készítmények szakember számára ismert vagy találmány szerinti folyékony vagy szilárd oldatok, keverékek, szuszpenziók, emulziók vagy kolloidok, amelyek összetétele tömeg¹, térfogat¹, koncentráció¹, molaritásvagy molalitásszázalékban van megadva. Ezek a szakember számára ismert vagy a találmány tárgyát képezõ folyékony, gáz vagy szilárd oldat, keverék, szuszpenzió, emulzió vagy kolloid alakú készítmények tartalma 0,00001–99,9999 tömeg¹, térfogat¹, koncentráció¹, molaritás- vagy molalitásszázalék,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

valamint a fenti értékek közti bármely érték vagy tartomány, így többek között, de nem kizárólag 0,00001, 0,00003, 0,00005, 0,00009, 0,0001, 0,0003, 0,0005, 0,0009, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0,1,1,1,2,1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, vagy 99,9. Ezen találmány szerinti készítmények koncentrációja ezek alapján többek között, de nem kizárólag 0,00001–100 mg/ml és/vagy 0,00001–100 mg/g. A készítmény adott esetben a következõ vegyületek vagy proteinek legalább egyikének hatékony mennyiségét tartalmazhatja: antiinfektív drog, szív-érrendszeri (CV) drog, központi idegrendszeri (CNS) drog, autonóm idegrendszeri (ANS) drog, légzõszervi drog, gyomor-bélrendszeri drog, hormonális drog, folyadék- vagy elektrolit-egyensúlyra ható drog, hematológiai drog, daganatellenes drog, immunmoduláló drog, szem¹, fül- vagy orrkezelésre szolgáló drog, helyi kezelésre szolgáló drog, táplálkozásra ható drog stb. Ezek a drogok és kiszerelésük, indikációik, dozírozásuk és beadásuk szakember számára jól ismertek (lásd például Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21. kiadás, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional’s Drug Guide 2001, szerk., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmacotherapy Handbook, Wells és munkatársai, szerk., Appleton & Lange, Stamford, CT). Az antiinfektív drog a következõk legalább egyike lehet: amõbicid, antiprotozoikum, anthelmintikum, gombaellenes szer, maláriaellenes szer, gümõkórellenes szer vagy lepraellenes szer, aminoglikozid, penicillin, cefalosporin, tetraciklin, szulfonamid, fluorokinolon, vírusellenes szer, makrolid antiinfektívum, valamint egyéb antiinfektívum. A CV drog a következõk legalább egyike lehet: inotróp szer, aritmiaellenes szer, anginaellenes szer, magasvérnyomás-ellenes szer, lipémiaellenes szer, valamint egyéb kardiovaszkuláris drog. A CNS drog a következõk legalább egyike lehet: nem kábító fájdalomcsillapító vagy antipiretikum, nem szteroid gyulladáscsökkentõ drog, narkotikum, vagy opioid fájdalomcsillapító, nyugtató-altató szer, görcsoldó szer, antidepresszáns, anxiolytikum, antipszichotikum, központi idegrendszert stimuláló szer, Parkinson-kór-ellenes szer, egyéb központi idegrendszerre ható drog. Az ANS drog a következõk legalább egyike lehet: kolinergikum (paraszimpatomimetikum), antikolinergikum, adrenergikum (szimpatomimetikum), adrenerg blokkoló (szimpatolitikum), vázizomrelaxáns, neuromuszkuláris blokkoló. A légzõszervi drog a következõk legalább egyike lehet: antihisztamin, hörgõtágító, köptetõ vagy köhögéscsillapító, egyéb légzõszervi drog. A gasztrointesztinális drog a következõk legalább egyike lehet: savellenes szer vagy legalább egy adszorbens, vagy legalább egy flatulációellenes szer, emésztõenzim,

1

HU 006 779 T2

vagy legalább egy epekõoldó, hasmenéscsillapító, hashajtó, hányáscsillapító vagy fekélyellenes drog. A hormonális drog a következõk legalább egyike lehet: kortikoszteroid, androgén vagy legalább egy anabolikus szteroid, ösztrogén, vagy legalább egy progesztin, gonadotropin, antidiabetikum, vagy legalább egy glukagon, pajzsmirigyhormon, pajzsmirigyhormon-antagonista, hipofízishormon, mellékpajzsmirigy (hormon)szerû drog. A folyadék- és elektrolitegyensúlyra ható drog a következõk legalább egyike lehet: diuretikum, elektrolit vagy legalább egy pótlóoldat, savanyítószer vagy legalább egy lúgosítóoldat. A hematológiai drog a következõk legalább egyike lehet: vörösvértestképzõ szer, véralvadásgátló, vérszármazék, trombolitikus enzim. A daganatellenes szer a következõk legalább egyike lehet: alkilezõ drog, antimetabolit, antibiotikum típusú daganatellenes szer, hormonegyensúlyt módosító daganatellenes szer, egyéb daganatellenes szer. Az immunmoduláló drog a következõk legalább egyike lehet: immunszuppresszáns, vakcina vagy legalább egy toxoid, antitoxin, vagy legalább egy antivenin, immunszérum, biológiai válaszreakciót módosító szer. A szem¹, fül- vagy orrkezelésre alkalmazott drog a következõk legalább egyike lehet: szemészeti antiinfektívum, szemészeti gyulladáscsökkentõ, miotikum, midriatikum, szemészeti érszûkítõ, egyéb szem¹, fül- és orrgyógyászati szer. A helyi kezelésre szánt drog a következõk legalább egyike lehet: helyi antiinfektívum, rühatkaellenes szer vagy legalább egy pedikulicid szer, helyi alkalmazásra szánt kortikoszteroid. A táplálkozásra ható drog a következõk legalább egyike lehet: vitamin, ásványi anyag vagy kalorikum. Lásd például a Nursing 2001 Drug Handbook tartalmát fentebb. A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag ellenanyag vagy polipeptid készítmények tartalmazhatnak továbbá egy ilyen módosításra, kezelésre vagy terápiára szoruló sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens ellen irányuló, legalább egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag proteint vagy ellenanyagot tartalmazó megfelelõ és/vagy hatékony mennyiségû készítményt vagy gyógyászati készítményt, amely adott esetben a következõk legalább egyikét is tartalmazza: TNF-antagonista (például, de nem kizárólag kémiai vagy protein TNF-antagonista, TNF elleni monoklonális vagy poliklonális ellenanyag vagy fragmens, oldható TNF-receptor (például p55, p70 vagy p85) vagy fragmense, mindezek fúziós polipetidei, vagy kismolekulájú TNF-antagonista, például TNF kötõ protein I vagy II (TBP¹I vagy TBP¹II), nerelimomab, infliximab, enteracept, CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenerecept stb.), reumaellenes szer (például metotrexát, auranofin, aurotioglükóz, azatioprin, etanercept, arany nátrium tiomalát, hidroxi-klorokvin-szulfát, leflunomid, szulfaszalazin), izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid gyulladáscsökkentõ drog (NSAID), fájdalomcsillapító, altatószer, nyugtató, helyi érzéstelenítõ, neuromuszkuláris blokkoló, antimikrobiális szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, antiparazitikum, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, fluorokinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb antimikro-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

2

biális szer), övsömörellenes szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, cukorbetegséggel kapcsolatos hatóanyag, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigyágens, vitamin, kalciumhoz kapcsolódó hormon, hasmenésellenes szer, köhögéscsillapító, hányáscsillapító, fekélyellenes szer, hashajtó, véralvadásgátló, eritropoietin (például epoetin alfa), filgrastim (például G¹CSF, Neupogen), sargramostim (GM-CSF, Leukine), immunizálás, immunglobulin, immunszuppresszív anyag (például basiliximab, ciklosporin, daklizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítõ drog, ösztrogénreceptormodulátor, midriatikum, cikloplegikum, alkilezõágens, antimetabolit, mitózisgátló, radiofarmakon, antidepresszáns, mániaellenes ágens, antipszichotikum, feszültségoldó szer, altatószer, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmaellenes szer, béta-antagonista, inhalációs szteroid, leukotriéninhibitor, metilxantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, dornáz alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokinantagonista. Citokin lehet például, de nem kizárólagosan az IL–1 – IL–23 citokinek bármelyike. A megfelelõ dózisok szakember számára jól ismertek. Lásd például Wells és munkatársai, szerk. Pharmacotherapy Handbook, 2. kiadás, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000). Ezek a készítmények tartalmazhatnak továbbá legalább egy találmány szerinti ellenanyaggal vagy polipeptiddel társult, kapcsolt, együtt kiszerelt vagy együttesen adagolt toxinmolekulákat is. Adott esetben a toxin képes lehet a kóros sejt vagy szövet szelektív elpusztítására. A kóros sejt ráksejt vagy egyéb sejt egyaránt lehet. A toxin többek között, de nem kizárólag egy toxin, például ricin, diftériatoxin, méregtoxin, vagy bakteriális toxin legalább egy funkcionális citotoxikus doménjét tartalmazó tisztított vagy rekombináns toxin vagy toxinfragmens is lehet. A toxin kifejezés magában foglalja az emberben és más emlõsökben bármely kóros állapotot, így például halálra vezetõ toxikus sokkot elõidézni képes bármely természetes körülmények között elõforduló, mutáns vagy rekombináns baktérium vagy vírus által termelt endotoxinokat és exotoxinokat. Ilyen toxinok többek között, de nem kizárólag az enterotoxigenikus E. coli által termelt hõérzékeny enterotoxin (LT), hõstabil enterotoxin (ST), Shigella citotoxin, Aeromonas enterotoxinok, toxikus sokk szindróma toxin¹1 (TSST–1), Staphylococcus enterotoxin A (SEA), B (SEB) vagy C (SEC), Streptococcus enterotoxinok stb. Ilyen baktériumok lehetnek például, de nem kizárólag enterotoxigenikus E. coli (ETEC) törzsek, enterohemorrágiás E. coli (például 0157:H7 szerotípusbeli törzsek), Staphylococcus fajok (például Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), Shigella fajok (például Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, és Shigella sonnei), Salmonella fajok (például Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis), Clostridium fajok (például Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum), Campylobacter fajok (például Campylobacter jejuni,

1

HU 006 779 T2

Campylobacter fetus), Helicobacter fajok (például, Helicobacter pylori), Aeromonas fajok (például, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrio fajok (például Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus), Klebsiella fajok, Pseudomonas aeruginosa és Streptococcusok. Lásd például Stein, szerk., INTERNAL MEDICINE, 3. kiadás, pp 1–13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans és munkatársai, szerk., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2. kiadás, pp 239–254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell és munkatársai, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3. kiadás., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow és munkatársai, szerk., The Merck Manual, 16. kiadás, Merck and Co., Rahway, N. J., 1992; Wood és munkatársai, FEMS Microbiology Immunology, 76:121–134 (1991); Marrack és munkatársai, Science, 248:705–711 (1990). A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag készítmények tartalmazhatnak továbbá legalább egy megfelelõ kiegészítõanyagot, többek között, de nem kizárólag hígítószert, kötõanyagot, stabilizálószert, puffert, sót, lipofil oldószert, tartósítószert, adjuvánst stb. Elõnyös a gyógyászati szempontból elfogadható kiegészítõanyagok alkalmazása. Szakember számára jól ismertek az ilyen steril oldatok és azok elõállítására szolgáló eljárások, lásd például Gennaro, szerk., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Szakember számára ismert, vagy a találmány szerinti megoldás részét képezõ módokon rutinszerûen kiválaszthatók a beadási mód, oldhatóság és/vagy az EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag készítmény stabilitása szempontjából megfelelõ, gyógyászati szempontból elfogadható vivõanyagok. A találmány szerinti készítményben alkalmazható gyógyászati vehikulumok és adalékanyagok lehetnek többek között, de nem kizárólag proteinek, peptidek, aminosavak, lipidek, valamint szénhidrátok (például cukrok, ideértve a monoszacharidokat, a di¹, tri¹, tetraés oligoszacharidokat; a derivatizált cukrokat, például az alditolokat, aldonsavakat, észterezett cukrokat stb., valamint a poliszacharidokat vagy cukorpolimereket), amelyek jelen lehetnek önmagukban vagy kombinációban, és amelyek egyedül vagy kombinációban a készítmény 1–99,99 térfogat vagy tömegszázalékát tehetik ki. Példaértékû proteinvehikulumok például a szérumalbumin, például az emberi szérumalbumin (HSA), a rekombináns emberi albumin (rHA), a zselatin, a kazein stb. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy annak specifikus részét vagy variánsát alkotó, puffer szerepet is betöltõ reprezentatív aminosavak az alanin, glicin, arginin, betain, hisztidin, glutaminsav, aszpartámsav, cisztein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenil-alanin, aszpartám stb. Egy elõnyös aminosav a glicin. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható szénhidrát-vehikulumok többek között lehetnek monoszacharidok, például fruktóz, maltóz, galaktóz, glükóz, D¹mannóz, szorbóz stb., diszacharidok, például laktóz,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 17

2

szacharóz, trehalóz, cellobióz stb., poliszacharidok, például raffinóz, melezitóz, maltodextrinek, dextránok, keményítõk stb., valamint alditolok, így például mannitol, xilitol, maltitol, laktitol, xilitol szorbitol (glucitol), mioinozitol stb. A találmány szerinti megoldásban elõnyösen alkalmazható szénhidrát-vehikulumok a mannitol, a trehalóz és a raffinóz. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag készítmények tartalmazhatnak továbbá puffert vagy pH¹módosítóágenst; a puffer jellemzõen szerves savból vagy bázisból elõállított só. Reprezentatív pufferek a szerves savak, például a citromsav, az aszkorbinsav, a glükonsav, a szénsav, a borkõsav, a borostyánkõsav, az ecetsav vagy a ftálsav sói; a trisz, a trometamin-hidroklorid vagy a foszfátpufferek. A találmány szerinti készítményekben elõnyösen alkalmazható pufferek a szerves savak sói, mint például a citrát. Mindezeken túl a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag készítmények tartalmazhatnak polimer vehikulumokat/adalékanyagokat, így például poli(vinil-pirrolidon)-okat, fikollokat (cukorpolimerek), dextrátokat (például ciklodextrineket, például 2¹hidroxi-propil-6-ciklodextrint), polietilénglikolokat, ízesítõanyagokat, antimikrobiális ágenseket, édesítõszereket, antioxidánsokat, antisztatikus ágenseket, szörfaktánsokat (például poliszorbátokat, amilyen például a „TWEEN 20” és a „TWEEN 80”), lipideket (például foszfolipideket, zsírsavakat), szteroidokat (például koleszterolt) és kelátképzõ ágenseket (például EDTA¹t). Ezek és a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag készítményekben alkalmazható további gyógyászati vehikulumok és/vagy adalék anyagok szakember számára ismertek, például a következõ forrásokból: „Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19. kiadás, Williams & Williams, (1995); „Physician’s Desk Reference”, 52. kiadás, Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Elõnyösnek tekintett vivõanyagok vagy vehikulumanyagok a szénhidrátok (például szacharidok vagy alditolok) és a pufferek (például citrát) vagy polimer ágensek. Kiszerelések Amint a fentiekbõl kitûnik, a találmány tárgyát elõnyösen megfelelõ fiziológiás sóoldatot vagy más kiválasztott sót tartalmazó puffert magukban foglaló stabil kiszerelések, valamint adott esetben tartósítószert tartalmazó tartósított oldatok vagy kiszerelések, valamint többcélú, gyógyászati vagy állatgyógyászati felhasználásra egyaránt alkalmas, az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot gyógyászati szempontból elfogadható kiszerelésben tartalmazó tartósított kiszerelések képezik. A tartósított kiszerelések legalább egy ismert tartósítószert tartalmaznak, amely adott esetben a következõk legalább egyike: fenol, m¹krezol, p¹krezol, o¹krezol, klorokrezol, benzil-alkohol, fenil-higany-nitrit, fenoxietanol, formaldehid, klór-butanol, magnézium-klorid (például hexahidrát), alkilparaben (metil, etil, propil, butilparaben stb.), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát, timerozál vagy mindezek vi-

1

HU 006 779 T2

zes oldószeres keverékei. A készítményekben bármely, szakember számára ismert koncentráció vagy keverék igénybe vehetõ 0,001–5%¹os vagy ezek közötti bármely koncentrációértékben vagy ¹tartományban, amilyen például, de nem kizárólag a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8 vagy 4,9%. Nem korlátozó érvényû példák például a tartósítószer nélküli, illetve a következõ tartósítószereket tartalmazó készítmények: 0,1–2% m¹krezol (például 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1–3% benzil-alkohol (például 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001–0,5% timerozal (például 0,005, 0,01), 0,001–2,0% fenol (például 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005–1,0% alkilparaben (például 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) stb. Amint a fentiekbõl kitûnik, a találmány tárgyát csomagolóanyagot és az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot az elõírt pufferekkel és/vagy tartósítószerekkel, adott esetben vizes oldószerrel együtt tartalmazó oldatot magában foglaló edényt tartalmazó gyártmány képezi, amelyben a csomagolóanyagban lévõ címkén fel van tüntetve, hogy az oldat 1, 2, 3,4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 óráig vagy tovább tartható el. A találmány tárgyát képezi továbbá egy gyártmány, amely csomagolóanyagot és liofilizált EPOutánzó kapocsmag utánzóanyagot tartalmazó elsõ tárolóedényt és az elõírt puffert vagy tartósítószert magában foglaló vizes oldószert tartalmazó második tárolóedényt tartalmaz, ahol a csomagolóanyagban lévõ címke a páciens számára az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy annak meghatározott része vagy variánsa vizes oldatban történõ helyreállítására (rekonstituálására) ad utasítást, amely oldat elkészítve 24 órán keresztül vagy tovább is eltartható. A találmány szerinti módon alkalmazott EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag rekombináns úton emlõssejtekbõl vagy transzgenikus preparátumokból, vagy találmány szerinti vagy szakember számára ismert egyéb biológiai forrásokból állítható elõ. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy specifikus része, vagy variánsa találmány szerinti termékben foglalt mennyisége száraz/nedves rendszer esetében helyreállítás után körülbelül 1,0 mg/ml-tõl körülbelül 1000 mg/ml¹ig terjed, bár alacsonyabb és magasabb koncentrációk is mûködõképesek lehetnek, mindez a bejuttatásra igénybe venni kívánt vehikulum függvénye, például az oldatkiszerelések transzdermális tapasz, pulmonáris, nyálkahártyán át történõ, ozmotikus vagy mikropumpás eljárások esetében eltérõek. A vizes oldószer elõnyösen gyógyászati szempontból elfogadható tartósítószert is tartalmaz. Elõnyösnek tekintett tartósítószer a következõk bármelyike: fenol, m¹krezol, p¹krezol, o¹krezol, klorokrezol, benzil-alkohol, alkilparaben (metil, etil, propil, butilparaben stb.), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidro-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 18

2

acetát, timerozál vagy mindezek keverékei. A kiszerelésben alkalmazott tartósítószer koncentrációja az antimikrobiális hatás kifejtéséhez szükséges koncentrációval egyezik meg. A koncentráció a kiválasztott tartósítószer függvénye, megállapítása gyakorlott szakember számára nem okoz nehézséget. Adott esetben elõnyösen az oldószerhez keverhetõk egyéb vehikulumok, például izotóniát biztosító ágensek, pufferek, antioxidánsok, tartósítást fokozó szerek. Izotóniát biztosító ágenst, például glicerint gyakran alkalmaznak ismert koncentrációkban. A jobb pH¹szabályozás érdekében elõnyösen élettani szempontból tolerált puffer hozzáadására is sor kerül. A kiszerelések pH¹értéke széles határok között változhat, például körülbelül pH=4 és körülbelül pH=10 között, elõnyösen a pH¹tartomány körülbelül pH=5 és körülbelül pH=9 közötti, legelõnyösebben pedig körülbelül pH=6,0 és körülbelül pH=8,0 közötti. A találmány szerinti kiszerelések pH¹értéke elõnyösen körülbelül pH=6,8 és körülbelül pH=7,8 közötti. Elõnyösnek tekintett pufferek például a foszfátpufferek, a legelõnyösebb a nátrium-foszfát, különösen a foszfátpufferelt sóoldat (PBS). Az aggregáció mérséklése céljából a kiszerelésekhez vagy készítményekhez adott esetben további adalékanyagok, mint például gyógyászati szempontból elfogadható oldásgyorsító szerek, például Tween 20 (poli(oxi-etilén) (20) szorbitán monolaurát), Tween 40 (poli(oxi-etilén) (20) szorbitán monopalmitát), Tween 80 (poli(oxi-etilén) (20) szorbitán monooleát), Pluronic F69 (poli(oxi-etilén) polioxi-propilén blokk-kopolimer), valamint PEG (polietilénglikol) vagy nemionos szörfaktánsok, mint például poliszorbát 20 vagy 80, vagy poloxamer 184 vagy 188, Pluronic® poliolok, egyéb blokkkopolimerek, valamint kelátképzõ anyagok, például EDTA és EGTA adhatók. Ezek az adalék anyagok különösen hasznosak, ha a kiszerelés beadása pumpa vagy mûanyag tárolóedény alkalmazásával történik. A gyógyászati szempontból elfogadható szörfaktáns jelenléte csökkenti a protein aggregációs készségét. A találmány szerinti kiszerelések elõállíthatók az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag és a következõ tartósítószerek bármelyikének vizes oldószerben történõ összekeverését alkalmazó folyamattal: fenol, m¹krezol, p¹krezol, o¹krezol, klorokrezol, benzil-alkohol, alkilparaben (metil, etil, propil, butilparaben stb.), benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, nátrium-dehidroacetát, timerozál vagy mindezek keverékei. Az EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag és a tartósítószer vizes oldószerben történõ összekeverése hagyományos oldási és keverési eljárásokkal valósítható meg. Megfelelõ kiszerelés elõállítása érdekében például pufferelt oldatban lévõ megmért mennyiségû EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag és pufferelt oldatban lévõ kívánt tartósítószer olyan mennyiségeit keverjük össze, amelyek a protein és a tartósítószer kívánt koncentrációját biztosítják. Átlagosan képzett szakember számára nyilvánvalóak az említett folyamat lehetséges változatai. Például az összetevõk hozzáadásának sorrendje, a további adalék anyagok használata, a kiszerelés elõállí-

1

HU 006 779 T2

tásához alkalmazott hõmérséklet és pH mind olyan faktorok, amelyek az adott koncentráció és beadási mód figyelembevételével optimalizálhatók. A találmány szerinti kiszerelések tiszta oldatként vagy kettõs tárolóedényben biztosíthatók a páciensnek, utóbbiak közül az elsõ liofilizált EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot tartalmaz, a másikban ennek helyreállítására szolgáló víz, tartósítószer és/vagy vehikulumok, elõnyösen foszfátpuffer és/vagy fiziológiás sóoldat található vizes oldószerben. A különálló oldatot tartalmazó tárolóedény vagy a helyreállítást igénylõ kettõs tárolóedény egyaránt többször is újra felhasználható, egy páciens egyszeri vagy többszöri kezelési ciklusára elegendõ lehet, így a jelenlegieknél kényelmesebb kezelési elrendezést biztosít. A találmány szerinti gyártmányok azonnali vagy huszonnégy óra múlva, vagy még késõbb történõ beadásra alkalmazhatók. Ennek megfelelõen a találmány szerinti gyártmányok lényeges elõnyöket jelentenek a páciens számára. A találmány szerinti kiszerelések adott esetben biztonsággal tárolhatók körülbelül 2 °C és körülbelül 40 °C közötti hõmérsékleten, és hosszú ideig megtartják a protein biológiai aktivitását, így a csomagolócímkén feltüntethetõ, hogy az oldat 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 vagy 96 órán keresztül vagy tovább tárolható és/vagy felhasználható. Ha tartósítószert tartalmazó oldószer alkalmazására kerül sor, a címkén feltüntethetõ felhasználhatósági idõ 1–12 hónap, fél¹, másfél és/vagy két év. A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag oldatai elõállíthatók az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vizes oldószerben történõ keverését tartalmazó folyamattal. A keveréshez hagyományos oldási és keverési eljárások vehetõk igénybe. Megfelelõ oldószer elõállítása érdekében például vízben vagy pufferelt oldatban lévõ megmért mennyiségû EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag vagy meghatározott része vagy variánsa olyan mennyiségeit keverjük össze, amelyek a protein és adott esetben a tartósítószer vagy puffer kívánt koncentrációját biztosítják. Átlagosan képzett szakember számára nyilvánvalóak az említett folyamat lehetséges változatai. Például az összetevõk hozzáadásának sorrendje, a további adalék anyagok használata, a kiszerelés elõállításához alkalmazott hõmérséklet és pH mind olyan faktorok, amelyek az adott koncentráció és beadási mód figyelembevételével optimalizálhatók. A találmány szerinti kiszerelések elõállíthatók az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag egy kiválasztott pufferrel, elõnyösen fiziológiás sóoldatot vagy egy kiválasztott sót tartalmazó foszfátpufferrel történõ keverését tartalmazó folyamattal. Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag és a puffer vizes oldószerben történõ keveréshez hagyományos oldási és keverési eljárások vehetõk igénybe. Megfelelõ kiszerelés elõállítása érdekében például vízben vagy pufferelt oldatban lévõ megmért mennyiségû EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag és vizes oldatban lévõ kívánt pufferelõágens olyan mennyiségeit keverjük össze, amelyek a protein és a puffer kívánt koncentrációját biztosítják. Átlagosan

2

képzett szakember számára nyilvánvalóak az említett folyamat lehetséges változatai. Például az összetevõk hozzáadásának sorrendje, a további adalék anyagok használata, a kiszerelés elõállításához alkalmazott hõ5 mérséklet és pH mind olyan faktorok, amelyek az adott koncentráció és beadási mód figyelembevételével optimalizálhatók. A találmány szerinti, stabil vagy tartósított kiszerelésben vagy oldatban lévõ EPO-utánzó kapocsmag 10 utánzóanyag számos beadási eljárással bejuttatható egy páciens szervezetébe, ilyenek a szubkután (SC) vagy intramuszkuláris (IM) injekció, a transzdermális beadás, a pulmonáris, a nyálkahártyán keresztül történõ, az implantátumban történõ, az ozmotikus pumpát 15 alkalmazó, a kazettás, a mikropumpás vagy az egyéb, képzett szakember számára jól ismert egyéb módok.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

Gyógyászati alkalmazások A találmány tárgyát képezi a utánzóanyagok egy sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens anémiájának módosítására vagy kezelésére szolgáló eljárásban történõ alkalmazása, amely anémia nem kizárólagosan a következõk bármelyike lehet: bármely eredetû anémia, rákkezeléshez kapcsolódó anémia, sugárkezeléshez vagy kemoterápiához kapcsolódó anémia, vírusos vagy bakteriális fertõzés kezeléséhez kapcsolódó anémia, veseeredetû anémia, koraszülöttséghez kapcsolódó anémia, gyermek- és/vagy felnõttkori rákhoz kapcsolódó anémia, limfómához, mielómához, mieloma multiplexhez kapcsolódó anémia, AIDS-hez kapcsolódó anémia, választott idõben történõ (elektív) mûtétre váró pácienseknek autológ véradás mellett vagy anélküli egyidejû kezelés, mûtétek preoperatív vagy posztoperatív szakaszában, autológ véradás vagy transzfúzió, perioperatív menedzsment, ciklikus neutropénia vagy Kostmann-szindróma (veleszületett agranulocitózis), végsõ stádiumú vesebetegség, dialízishez kapcsolódó anémia, idült veseelégtelenség, elsõdleges vérképzõszervi megbetegedések, így például veleszületett hipopláziás anémia, talasszémia major vagy sarlósejtes anémia, sarlósejtes anémia vérérelzáródásos komplikációi. Furman és munkatársai, Pediatrics 1992; 90:716–728, Goldberg Science 1988; 242:1412–1415; Paul és munkatársai, Exp. Hematol. 1984; 12:825–830; Erslev és munkatársai, Arch. Intern. Med. 1968; 122:230–235; Ersley és munkatársai, Ann. Clin. Lab. Sci. 1980; 10:250–257; Jacobs és munkatársai, Nature 1985; 313:806–810; Lin és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985; 82:7580–7584; Law és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83:6920–6924; Goldwasser és munkatársai, J. Biol. Chem. 1974; 249:4202–4206; Eaves és munkatársai, Blood 1978; 52:1196–1210; Sawyer és munkatársai, Blood 1989; 74:103–109; Winearls és munkatársai, Lancet 1986; 2:1175–1178; Eschbach és munkatársai, N. Engl. J. Med. 1987; 316: 73–78; Eschbach és munkatársai, Ann. Intern. Med. 1989; 111:992–1000. A találmány szerinti utánzóanyagok nem veseeredetû anémiák esetében is alkalmazhatók, ilyenek például az idült fertõzések, a gyulladásos folyamatok, a

1

HU 006 779 T2

sugárterápia és a citosztatikus droggal végzett kezelés, nem veseeredetû anémiás páciensek kezelése során biztató eredményekrõl számoltak be. Lásd például Abels RI és Rudnick SA Eritropoietin: evolving clinical applications. Experimental Hematology 19: 842–50 (1991); Graber SE és Krantz SB Eritropoietin: biology and clinical use. Hematology/Oncol. Clin. North Amer. 3:369–400 (1989); Jelkman W és Gross AJ (szerk.) Eritropoietin. Springer, Berlin 1989; Koury MJ és Bondurant MC The molecular mechanism of eritropoietin action. European Journal of Biochemistry 210:649–63 (1992); Krantz SB Eritropoietin. Blood 77: 419–34 (1991); Tabbara IA Eritropoietin. Biology and clinical applications. Archives of Internal Medicine 153: 298–304 (1993). A találmány tárgyát képezi továbbá a utánzóanyag sejt, szövet, szerv, állat vagy páciensbeli anémia vagy vérsejtekkel kapcsolatos állapot módosítására vagy kezelésére történõ alkalmazása, ahol az anémia vagy vérsejtekkel kapcsolatos állapot többek között, de nem kizárólag a következõk bármelyike: immunológiai eredetû betegség, szív-érrendszeri betegség, fertõzõ, malignus és/vagy neurológiai betegség. Ez az eljárás adott esetben magában foglalja az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot tartalmazó legalább egy készítmény vagy gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének ilyen módosítást, kezelést vagy terápiát igénylõ sejt, szövet, szerv vagy páciens részére történõ beadását. A találmány tárgyát képezi továbbá a utánzóanyag sejt, szövet, szerv, állat vagy páciens daganatos/fertõzõ betegségének módosítására vagy kezelésére történõ alkalmazása, ahol a betegség többek között, de nem kizárólag a következõk bármelyike lehet: heveny vagy idült bakteriális fertõzés, heveny vagy idült parazitás vagy fertõzõ folyamat, ideértve a bakteriális, vírusos és gombás fertõzéseket, HIV-fertõzés/HIV-neuropátia, meningitisz, hepatitisz, szeptikus artritisz, peritonitisz, pneumónia, epiglottitisz, E. coli O157:H7 (fertõzés), hemolitikus urémiás szindróma/trombolitikus trombocitopéniás purpura, malária, dengue vérzéses láz, leishmaniázis, lepra, toxikus sokk szindróma, streptococcusos miozitisz, gázgangréna, Mycobacterium tuberculosis (fertõzés), Mycobacterium avium intracellulare (fertõzés), Pneumocystis carinii pneumónia, medencei gyulladásos megbetegedés, orchitis/epidydimitis, Legionella (fertõzés), Lyme-kór, influenza A (vírusfertõzés), Epstein–Barr-vírus (fertõzés), vírusfertõzéshez kapcsolódó hemofagocitózisos szindróma, vírusos encefalitisz/aszeptikus meningitisz stb.; (ii) leukémia, akut leukémia, akut limfoblasztos leukémia (ALL), B¹sejtes, T¹sejtes vagy FAB ALL, akut mieloid leukémia (AML), krónikus mielocitás leukémia (CML), krónikus limfocitás leukémia (CLL), hajas sejtes leukémia, mielodiszpláziás szindróma (MDS) limfóma, Hodgkin-kór, malignus limfóma, nem-Hodgkin limfóma, Burkitt limfóma, mieloma multiplex, Kaposi-szarkóma, kolorektális karcinóma, hasnyálmirigy-karcinóma, nazofaringeális karcinóma, malignus hisztiocitózis, paraneoplasztikus szindróma/malignitáshoz kapcsolódó hi-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 20

2

perkalcémia, szolid tumorok, adenokarcinómák, szarkómák, malignus melanoma stb., vagy (iii) neurodegeneratív megbetegedések, szklerózis multiplex, migrénes fejfájás, AIDS demencia komplex, demielinizációval járó betegségek, mint például szklerózis multiplex és heveny transzverz mielitisz, extrapiramidális és cerebelláris rendellenességek, mint például a kortikospinális rendszer elváltozásai, a bazális ganglionok rendellenességei vagy cerebelláris rendellenességek, hiperkinetikus mozgászavarok, mint például a Huntington-féle chorea és az idõskori chorea, drog elõidézte mozgászavarok, így például a CNS dopaminreceptorait blokkoló drogok által kiváltott kórképek; hipokinetikus mozgászavarok, amilyen például a Parkinson-kór, a progresszív szupranukleáris bénulás, a kisagy strukturális sérülései, spinocerebelláris degenerációk, mint például spinális ataxia, Friedrich-féle ataxia, cerebelláris kortikális degenerációk, több rendszerre kiterjedõ degenerációk (Mencel¹, Dejerine-Thomas¹, Shi-Drager- és Machado-Joseph-féle degeneráció); szisztémás rendellenességek (Refsum-kór, abétalipoproteinémia, ataxia, teleangiektázia és mitokondriális multiszisztémás rendellenesség); demielinizációval járó magbetegségek, például szklerózis multiplex, heveny transzverz mielitisz; a mozgatóegység rendellenességei, például neurogén izomatrófiák (elülsõ szarvbeli sejtdegeneráció, például amiotrófiás laterális szklerózis, infantilis spinális izomatrófia és juvenilis spinális izomatrófia); Alzheimer-kór, középkorúak Down-szindrómája, diffúz Lewy-testes betegség, Lewy-testes idõskori demencia, Wernicke–Korsakoff-szindróma, idült alkoholizmus, Creutzfeldt–Jakob-betegség; szubakut szklerotizáló panencefalitisz, Hallerrorden–Spatz-betegség, dementia pugilistica stb. Ez az eljárás adott esetben magában foglalhatja legalább egy TNF-ellenanyagot vagy annak meghatározott részét, vagy változatát tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének ilyen módosítást, kezelést vagy terápiát igénylõ sejt, szövet, szerv vagy páciens részére történõ beadását. Lásd például Merck Manual, 16. kiadás, Merck & Company, Rahway, NJ (1992). Ez az eljárás adott esetben magában foglalja az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot tartalmazó legalább egy készítmény vagy gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének ilyen módosítást, kezelést vagy terápiát igénylõ sejt, szövet, szerv vagy páciens részére történõ beadását. A találmány tárgyát képezi továbbá a utánzóanyag legalább egy kardiovaszkuláris megbetegedés sejt¹, szövet¹, szerv¹, állat- vagy páciensbeli módosítására vagy kezelésére történõ alkalmazása, amely megbetegedés például, de nem kizárólag az alábbiak bármelyike lehet: cardiac stun szindróma, szívizominfarktus, pangásos szívelégtelenség, stroke, isémiás stroke, vérzés, arterioszklerózis, ateroszklerózis, diabéteszhez társuló arterioszklerotikus megbetegedés, magas vérnyomás, artériás magas vérnyomás, veseér-eredetû magas vérnyomás, szinkópe, sokk, kardiovaszkuláris szifilisz, szívelégtelenség, cor pulmonale, elsõdleges pulmonáris magas vérnyomás, szívaritmiák, pitvari ek-

1

HU 006 779 T2

tópiás ütések, pitvarlebegés, pitvarfibrilláció (tartós vagy paroxizmális), kaotikus vagy multifokális pitvari tahikardia, szabályos keskeny QRS tahikardia, specifikus aritmiák, kamrafibrilláció, His-köteg-aritmiák, atrioventrikuláris blokk, kötegágblokk, miokardiális isémiás rendellenességek, koronáriabetegség, angina pectoris, szívizominfarktus, kardiomiopátia, dilatatív pangásos kardiomiopátia, restriktív kardiomiopátia, szívbillentyûmegbetegedések, endokarditisz, perikardiális betegség, szívdaganatok, aorta és perifériás aneurizmák, aortarepedés, aortagyulladás, az aorta abdominális vagy ágainak elzáródása, perifériásvérér-rendellenességek, elzáródásos artéria-rendellenességek, perifériás ateroszklerotikus betegség, thromboangitis obliterans, perifériás artériák funkcionális rendellenességei, Raynaud-jelenség és betegség, akrocianózis, erythromelalgia, vénás betegségek, vénás trombózis, visszér, arteriovenózus fisztula, limfodéma, lipödéma, instabil angina, reperfúziós sérülés, „post pump” szindróma, isémiás-reperfúziós sérülés stb. Ez az eljárás adott esetben magában foglalja legalább egy EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot vagy meghatározott részét vagy variánsát tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének ilyen módosítást, kezelést vagy terápiát igénylõ sejt, szövet, szerv vagy páciens részére történõ beadását. A találmány szerinti bármely gyógyászati alkalmazás magában foglalhatja az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének ilyen módosítást, kezelést vagy terápiát igénylõ sejt, szövet, szerv vagy páciens részére történõ beadását. Az ilyen alkalmazás adott esetben tartalmazhat továbbá immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes gyógyszerbeadást vagy kombinációs terápiát, ahol az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag beadása elõtt, azzal egy idõben és/vagy azt követõen a következõk legalább egyikének beadására kerül sor: TNF-antagonista (például, de nem kizárólag TNF-elleni ellenanyag vagy fragmense, oldható TNF-receptor vagy fragmense, mindezek fúziós proteinjei, vagy kis molekulájú TNF-antagonista), reumaellenes szer, izomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid gyulladáscsökkentõ drog (NSAID), fájdalomcsillapító, altatószer, nyugtató, helyi érzéstelenítõ, neuromuszkuláris blokkoló, antimikrobiális szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, antiparazitikum, vírusellenes szer, karbapenem, cefalosporin, fluorokinolon, makrolid, penicillin, szulfonamid, tetraciklin, egyéb antimikrobiális szer), övsömörellenes szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, cukorbetegséggel kapcsolatos hatóanyag, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmirigyágens, vitamin, kalciumhoz kapcsolódó hormon, hasmenésellenes szer, köhögéscsillapító, hányáscsillapító, fekélyellenes szer, hashajtó, véralvadásgátló, eritropoietin (például epoetin alfa), filgrastim (például G¹CSF, Neupogen), sargramostim (GMCSF, Leukine), immunizálás, immunglobulin, immunszuppresszív anyag (például basiliximab, ciklosporin, daklizumab), növekedési hormon, hormonhelyettesítõ drog, ösztrogénreceptor-modulátor, midriatikum, cik-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

loplegikum, alkilezõágens, antimetabolit, mitózisgátló, radiofarmakon, antidepresszáns, mániaellenes ágens, antipszichotikum, feszültségoldó szer, altatószer, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmaellenes szer, béta-agonista, inhalációs szteroid, leukotriéninhibitor, metil-xantin, kromolin, epinefrin vagy analógja, dornáz alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokinantagonista. A megfelelõ dózisok szakember számára jól ismertek. Lásd például Wells és munkatársai, szerk. Pharmacotherapy Handbook, 2. kiadás, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000). A utánzóanyagok ex vivo, például autológ csontvelõtenyészetben is felhasználhatók. Röviden: kemoterápiát megelõzõen egy pácienstõl csontvelõt vesznek, amit TPO-val és/vagy EPO-val kezelnek, adott esetben utánzóanyagokkal kombináltan, adott esetben egy vagy több további citokinnel kombinációban. A kemoterápiát követõen a csontvelõ regenerációjának felgyorsítása érdekében a kezelt csontvelõt visszajuttatják a betegbe. Mindemellett önmagában és EPO utánzóanyagokkal és/vagy EPO-val kombináltan a TPO szintén felhasználható a csontvelõ vagy perifériás vérbeli progenitor sejtek (PBPC) ex vivo elszaporítására. A kemoterápiás kezelés elõtt a korai progenitor sejtek perifériás keringésbe bocsátása érdekében a csontvelõ õssejtfaktorral (SCF) vagy G¹CSF-fel stimulálható. A progenitor sejtek adott esetben a perifériás vérbõl kinyerhetõk és koncentrálhatók, majd a magas dózisú kemoterápiát követõen a páciensbe visszajuttatható nagy sûrûségû megakariocitatenyészetté történõ differenciálódásuk és proliferációjuk elõsegítése érdekében a tenyészetben TPO-val és utánzóanyagokkal, adott esetben pedig kombinációban egy vagy több egyéb citokinnel, például, de nem kizárólag SCF, G¹CSF, IL–3, GM¹CSF, IL–6 vagy IL–11 citokinekkel kezelhetõk. A csontvelõ ex vivo kezelésére szolgáló TPO-adag a 100 pg/ml és 10 ng/ml közötti, elõnyösen pedig az 500 pg/ml és 3 ng/ml közötti tartományba esik. A utánzóanyagok adagja az EPO aktivitásának megfelelõen 0,1 egység/ml és 20 egység/ml közötti, elõnyösen 0,5 egység/ml és 2 egység/ml közötti, vagy bármely köztes érték vagy tartomány lehet. A készítmények, kombinációs terápia, együttes adagolás, szerkezetek és/vagy (legalább egy találmány szerinti utánzóanyagot is tartalmazó) eljárások céljára megfelelõ TNF-antagonisták például, de nem kizárólag az anti-TNF ellenanyagok, azok ligandumkötõ fragmensei, valamint a specifikusan TNF-hez kötõdõ receptormolekulák; a TNF-szintézist, TNF-kibocsátást vagy a TNF célsejtekre gyakorolt hatását megakadályozó vagy gátló vegyületek, mint például a talidomid, a tenidap, a foszfodieszteráz-gátlók (például a pentoxifillin és a rolipram), az A2b adenozinreceptor agonisták és A2b adenozinreceptor enhenszerek; a TNF-receptor jelátvitelt megakadályozó és/vagy gátló vegyületek, például a mitogén aktivált protein (MAP) kináz gátlók; a membránbeli TNF-hasítást blokkoló és/vagy gátló vegyületek, például a metalloproteáz-gátlók; a TNF-aktivi-

1

HU 006 779 T2

tást blokkoló és/vagy gátló vegyületek, például az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) gátlók (például a kaptopril), valamint a TNF-termelést és/vagy szintézist blokkoló és/vagy gátló vegyületek, mint például a MAP kináz gátlók. A találmány szerinti értelemben a „tumornekrózis faktor ellenanyag”, „TNF ellenanyag”, TNFa ellenanyag” vagy ezek fragmense stb. in vitro, in situ és/vagy elõnyösen in vivo csökkenti, blokkolja, gátolja, módosítja vagy akadályozza a TNFa aktivitását. Például a találmány szerinti megfelelõ emberi TNF ellenanyag képes a TNFa-hoz történõ kötõdésre, és magában foglalja az anti-TNF ellenanyagokat, azok antigénkötõ fragmensét, valamint a TNFa-hoz specifikusan kötõdni képes meghatározott mutánsait vagy azok doménjeit. Egy megfelelõ TNF ellenanyag vagy ¹fragmens is képes csökkenteni, blokkolni, módosítani, akadályozni, megelõzni és/vagy gátolni a TNF- RNS¹, DNS- vagy proteinszintézist, a TNF-kibocsátást, a TNF-receptorjelátvitelt, a membránbeli TNF-hasítást, a TNF-aktivitást, a TNF-termelést és/vagy TNF-szintézist. A cA2 jelû kiméra ellenanyag az A2 jelû, nagy affinitással neutralizáló egéreredetû anti-humán TNFa IgG1 ellenanyag antigénkötõ variábilis régióját és az emberi IgG1 kappa immunglobulin konstans régióit tartalmazza. Az emberi IgG1 Fc régió javítja az allogén ellenanyag effektor funkciót, fokozza a szérumbeli keringõ felezési idõt és csökkenti az ellenanyag immunogenitását. A cA2 jelû kiméra ellenanyag aviditása és epitópspecifitása az egéreredetû A2 ellenanyag variábilis régiójából származik. A találmány meghatározott megvalósítási módjaiban az A2 jelû egéreredetû ellenanyag variábilis régióját kódoló nukleinsavak forrása elõnyösen az A2 hibridóma sejtvonal. A kiméra A2 (cA2) dózisfüggõ módon neutralizálja mind a természetes, mind a rekombináns emberi TNFa citotoxikus hatását. A cA2 kiméra ellenanyag és a rekombináns emberi TNFa-kötõdést vizsgálatai alapján a cA2 kiméra ellenanyag számított affinitási hányadosa 1,04×1010 M–1. A monoklonális ellenanyagok specifitásának és affinitásának megállapítására szolgáló, kompetitív gátláson alapuló, elõnyösnek tekintett eljárások a megtalálhatók a következõ szakirodalmi forrásokban: Harlow és munkatársai, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan és munkatársai, szerk., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, New York, (1992–2003); Kozbor és munkatársai, Immunol. Today, 4: 72–79 (1983); Ausubel és munkatársai, szerk. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987–2003); és Muller, Meth. Enzymol., 92:589–601 (1983). A találmány egyik megvalósítási módjában az A2 jelû egéreredetû monoklonális ellenanyagot a c134A jelzésû sejtvonal termeli. A cA2 jelû kiméra ellenanyagot a c168A jelzésû sejtvonal termeli. Szakember számára ismertek a találmány szerinti megoldásban alkalmazható további monoklonális antiTNF ellenanyagok [lásd például 5231024 számú ame-

2

rikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Möller, A. és munkatársai, Cytokine 2(3):162–169 (1990); 1992. szeptember 11¹én benyújtott 07/943852 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; Rath5 jen és munkatársai, WO 91/02078 számú nemzetközi közzétételi irat (közzététel idõpontja 1991. február 22.); Rubin és munkatársai, EPO 0218868 számú európai közzétételi irat (közzététel idõpontja: 1987. április 22.); Yone és munkatársai, EPO 0288088 számú európai 10 közzétételi irat (közzététel idõpontja: 1988. október 26.); Liang és munkatársai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847–854 (1986); Meager és munkatársai, Hybridoma 6:305–311 (1987); Fendly és munkatársai, Hybridoma 6:359–369 (1987); Bringman és munkatár15 sai, Hybridoma 6:489–507. (1987); and Hirai, és munkatársai, J. Immunol. Meth. 96:_57–62 (1987)].

20

25

30

35

40

45

50

55

60 22

TNF-receptor-molekulák A találmány szempontjából hasznos TNF-receptormolekulák azok, amelyek nagy affinitással kötik meg a TNFa¹t [lásd például Feldmann és munkatársai WO 92/07076 számú nemzetközi közzétételi irat (közzététel idõpontja 1992. április 30.); Schall és munkatársai, Cell 61:361–370 (1990); és Loetscher és munkatársai, Cell 61:351–359 (1990)] és adott esetben gyenge immunogenitással bírnak. Közelebbrõl, az 55 kDa (p55 TNF¹R) és a 75 kDa (p75 TNF¹R) TNF sejtfelületi receptorok hasznosak a találmány szerinti megoldás szempontjából. Hasonlóképpen hasznosak az említett receptorok extracelluláris doménjeit (ECD) vagy azok funkcionális részeit tartalmazó csonka receptoralakok [lásd például Corcoran és munkatársai Eur. J. Biochem. 223:831–840 (1994)]. A TNF-receptorok ECD¹t tartalmazó csonka alakjait 30 kDa és 40 kDa nagyságú TNFa-gátló kötõproteinként kimutatták vizeletbõl és szérumból [Engelmann, H. és munkatársai, J. Biol. Chem. 265:1531–1536 (1990)]. További hasznosan alkalmazható TNF-receptor-molekulák a multimer TNFreceptor-molekulák, a TNF immunreceptor fúziós molekulák, valamint mindezek származékai és fragmensei vagy részei. Az igénybe vehetõ TNF-receptor-molekulákra hosszú kezelési idõtartam mellett a tünetek jó vagy kiváló mértékû enyhítése és alacsony szintû toxicitás jellemzõ. Az elért terápiás eredményekhez az alacsony fokú immunogenitás és/vagy a nagy affinitás, valamint egyéb, nem definiált tulajdonságok is hozzájárulhatnak. A találmány szerinti megoldás szempontjából hasznos multimer TNF-receptor-molekulák kettõ vagy több TNF-receptor ECD¹t vagy azok funkcionális részét tartalmazzák egy vagy több polipeptidlinkeren vagy nem peptidlinkeren [például polietilénglikolon (PEG)] keresztül összekapcsolva. A multimer molekulák expressziójuk irányítása érdekében tartalmazhatnak továbbá egy szekretált proteinbõl származó szignálpeptidet is. Az említett multimer molekulák és az elõállításukra szolgáló eljárások leírása megtalálható a 08/437533 számú, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (benyújtás idõpontja 1995. május 9.). A találmány szerinti megoldás szempontjából

1

HU 006 779 T2

hasznos TNF immunreceptor fúziós molekulák egy vagy több immunglobulinmolekula legalább egy részét és egy vagy több TNF-receptor egészét vagy egy funkcionális részét tartalmazzák. Ezek az immunreceptor fúziós molekulák monomerként, vagy hetero- vagy homomultimerként is elõállíthatók. Az immunreceptor fúziós molekulák monovalensek és multivalensek egyaránt lehetnek. TNF immunreceptor fúziós molekula például a TNF-receptor/IgG fúziós protein. Szakember számára ismertek a TNF immunreceptor fúziós molekulák és az elõállításukra szolgáló eljárások (Lesslauer és munkatársai, Eur. J. Immunol. 21:2883–2886 (1991); Ashkenazi és munkatársai, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:10 535–10 539 (1991); Peppel és munkatársai, J. Exp. Med. 174:1483–1489 (1991); Kolls és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215–219 (1994); Butler és munkatársai, Cytokine 6 (6):616–623 (1994); Baker és munkatársai, Eur. J. Immunol. 24:2040–2048 (1994); Beutler és munkatársai, 5447851 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és 08/442133 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtás idõpontja 1995. május 16.). Immunreceptor fúziós molekulák elõállítására szolgáló eljárásokat ismertetnek továbbá Capon és munkatársai, 5116964 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Capon és munkatársai, 5225538 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és Capon és munkatársai, Nature 337:525–531 (1989). A TNF-receptor-molekula funkcionális ekvivalense, származéka, fragmense vagy régiója megnevezés a TNF-receptor-molekula vagy a TNF-receptor-molekula szekvencia TNF-receptor-molekulát kódoló azon részére utal, amely elegendõ méretû vagy elegendõ hosszúságú szekvenciát tartalmaz ahhoz, hogy funkcionálisan az alkalmazható TNF-molekulákra hasonlítson (nagy affinitással kötõdjön a TNFa-hoz és alacsony mértékû immunogenitással rendelkezzen). Egy TNF-molekula funkcionális ekvivalense magában foglalja az alkalmazható TNF-molekulákhoz funkcionálisan hasonlító (a TNFa-hoz nagy affinitással kötõdõ és alacsony mértékû immunogenitással rendelkezõ) módosított TNF-receptor-molekulákat is. Például a TNFreceptor-molekula funkcionális ekvivalense tartalmazhat „NÉMA” kodont vagy egy vagy több aminosavszubsztitúciót, ¹deléciót vagy ¹addíciót (például egy savas aminosav másik savas aminosavval történõ helyettesítését, vagy ugyanazon vagy eltérõ hidrofób aminosavat kódoló kodon hidrofób aminosavat kódoló másik kodonnal történõ helyettesítését). Lásd Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987–2003). Citokin többek között, de nem kizárólag az összes ismert citokin lehet. Lásd például CopewithCytokines.com. Citokinantagonista lehet többek között, de nem kizárólag bármely ellenanyag, ¹fragmens vagy ¹mimetikum, bármely oldható receptor, ¹fragmens vagy ¹mimetikum, bármely kis molekula antagonista, vagy mindezek tetszõleges kombinációja.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 23

2

A találmány szerinti megoldás bármely gyógyászati alkalmazása magában foglalhat proteinközvetített rendellenesség kezelésére szolgáló eljárást, amely során EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatékony mennyiségének ilyen módosítást, kezelést vagy terápiát igénylõ sejt, szövet, szerv vagy páciens részére történõ beadására kerül sor. Ez az eljárás adott esetben tartalmazhat továbbá együttes beadáson vagy kombináción alapuló immunológiaibetegség-terápiát, ahol az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag, annak meghatározott része vagy változata beadása elõtt, azzal egy idõben és/vagy azt követõen legalább egy további citokin, például IL–3, –6 vagy –11, õssejtfaktor; G¹CSF vagy GM¹CSF beadására kerül sor. A kóros állapotok kezelése jellemzõen az EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag készítmény hatékony mennyiségének vagy adagjának beadásával valósítható meg, amelynek mennyisége adagonként összesen átlagosan legalább körülbelül 0,1 és 500 milligramm közötti tartománybeli EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag/páciens testsúly¹kg, elõnyösen pedig 0,1 és 100 milligramm közötti tartománybeli EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag/páciens testsúly¹kg egyszeri vagy többszöri beadással alkalmazva, a készítmény specifikus aktivitásának függvényében. Alternatív módon a hatékony szérumkoncentráció 0,1–5000 mg/ml közötti lehet egyszeri vagy többszöri beadás mellett. A megfelelõ dózisok orvosok számára ismertek, és természetesen függnek az adott megbetegedéstõl, a beadandó készítmény specifikus aktivitásától, illetve a kezelés alatt álló adott pácienstõl. Egyes esetekben a kívánt terápiás mennyiség elérése érdekében ismételt beadásra lehet szükség, például egy adott, ellenõrzött vagy mért adag ismételt egyedi beadására, ahol az egyedi beadásokat a kívánt napi adag vagy hatás eléréséig ismétlik. Elõnyös adag adott esetben a 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 és/vagy 30 mg/kg/beadás, vagy ezek közötti bármely érték, tartomány vagy frakció, vagy a 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 és/vagy 5000 pg/ml szérumkoncentráció eléréséhez egyszeri vagy többszöri beadás mellett szükséges mennyiség, vagy ezek közötti bármely érték, tartomány vagy frakció. Alternatív módon a beadandó adag ismert tényezõktõl függõen változhat, ilyenek az adott ágens farma-

1

HU 006 779 T2

kodinámiás jellemzõi, beadásának módja és útja, a recipiens életkora, egészségi állapota és súlya; a tünetek jellege és súlyossága, az egyidejû kezelések típusa, a kezelés gyakorisága, valamint a kívánt hatás. Általában az aktív összetevõ adagja körülbelül 0,1–100 mg/testsúly¹kg. A kívánt eredmények hatékony eléréséhez rendszerint 0,1–50, elõnyösen 0,1–10 mg/kg mennyiség szükséges beadásonként vagy nyújtott kibocsátású kiszerelésben. Nem korlátozó erejû példaként emberek vagy állatok kezelése megvalósítható legalább egy, találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy meghatározott része vagy változata 0,01–100 mg/kg közötti mennyiségének egyszeri vagy ismétlõdõ adagban, így például 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/kg/nap adagban, vagy legalább 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 vagy 40 napig, vagy alternatív módon legalább 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 vagy 20 hétig vagy ezek tetszõleges kombinációjában, egyszeri vagy ismételt adagban vagy infúzióban történõ beadásával. A belsõ alkalmazásra igénybe vehetõ dózisalakok (készítmények) általában körülbelül 0,0001 mg és 500 mg aktív hatóanyagot tartalmaznak egységenként vagy tárolóedényenként. Ezekben a gyógyászati készítményekben az aktív hatóanyag rendszerint a készítmény teljes tömegéhez viszonyítva körülbelül 0,5–95 tömegszázalék közötti mennyiségben van jelen. Parenterális beadás céljából az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag kiszerelhetõ oldat, szuszpenzió, emulzió vagy liofilizált por formájában, utóbbi gyógyászati szempontból elfogadható parenterális vehikulummal együtt vagy attól különállóan is biztosítható. Ilyen vehikulumok a víz, a fiziológiás sóoldat, a Ringeroldat, a dextrózoldat és az 5%¹os emberi szérumalbumin. Alkalmazhatók továbbá liposzómák és nemvizes vehikulumok, például zsírosított olajok is. A vehikulumok vagy liofilizált porok tartalmazhatnak az izotóniás állapotot (például nátrium-klorid, mannitol), vagy a kémiai stabilitást (például pufferek és tartósítószerek) fenntartó adalék anyagokat. A kiszerelés sterilizálására ismert vagy megfelelõ technikák vehetõk igénybe. A megfelelõ gyógyászati vivõanyagok leírása megtalálható az ezen a szakterületen standard referenciának számító Remington’s Pharmaceutical Sciences (szerk. A. Osol és munkatársai) legújabb kiadásában. Gyógyászati adagolás A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag gyógyászati szempontból hatékony mennyiségeinek beadására számos ismert és kidolgozott módszer igénybe vehetõ. Bár a következõ leírásban tüdõbe történõ beadását ismertetjük, egyéb beadási módok is megfelelõ eredménnyel alkalmazhatók. A találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vivõanyagban oldat, emulzió, kolloid, szusz-

2

penzió vagy por alakban, inhalációs vagy egyéb, találmány tárgyát képezõ, vagy szakember számára ismert módon történõ beadásra alkalmas számos eszköz és eljárás bármelyikével beadható. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 24

Parenterális kiszerelések és adagolás A parenterális beadásra szánt készítmények gyakori vivõanyagként steril vizet vagy fiziológiás sóoldatot, polialkilénglikolokat, például polietilénglikolt, növényi eredetû olajokat, hidrogénezett naftalinokat stb. tartalmazhatnak. Az injekciókészítésre szolgáló vizes vagy olajos szuszpenziók megfelelõ emulgeálószer vagy nedvesítõszer és szuszpendálóágens alkalmazásával, ismert eljárásokkal állíthatók elõ. Az injekciókészítésre szolgáló ágens nem toxikus, nem szájon át adagolható oldószer, például vizes oldat vagy steril injektálható oldat, vagy oldószeres szuszpenzió lehetnek. Az alkalmazható vehikulum vagy oldószer lehet víz, Ringer-oldat, izotóniás fiziológiás sóoldat; hagyományos vagy szuszpendáló oldószerként steril nemilló olaj is alkalmazható. Ezekre a célokra bármely nemilló olaj vagy zsírsav igénybe vehetõ, ideértve a természetes vagy szintetikus, vagy félszintetikus zsíros olajokat vagy zsírsavakat; természetes vagy szintetikus, vagy félszintetikus mono- vagy di¹, vagy triglicerideket. A parenterális beadás szakember számára ismert, és magában foglalja többek között, de nem kizárólag a hagyományos injekciós beadásokat, egy gáztöltésû tû nélküli injekciós eszközt (5851198 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), valamint a teljes egészében a kitanítás részét képezõ 5839446 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírt lézeres lyukasztóeszközt. Alternatív beadási mód Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás úton, bóluszban, vaginálisan, rektálisan, bukkálisan, szublingválisan, intranazálisan vagy transzdermálisan adható be. Proteint, EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot vagy meghatározott részét vagy változatát tartalmazó készítmények parenterális (szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás) beadás céljára elsõsorban folyékony oldatok vagy szuszpenziók alakjában készíthetõk el, vaginális vagy rektális beadás céljára elsõsorban félszilárd formában, például krém vagy kúp alakban alkalmazhatók, bukkális vagy szublingvális beadás céljából elsõsorban tabletta vagy kapszula formában alkalmazhatók, intranazálisan elsõsorban por, orrcsepp vagy aeroszol, vagy bizonyos ágensek alakjában, transzdermálisan elsõsorban gél, kenõcs, oldat, szuszpenzió vagy tapaszos bejuttató rendszer alakjában, amelyek a bõr szerkezetének módosítása vagy a drog koncentrációjának növelése céljából kémiai fokozóanyagokat, például dimetil-szulfoxidot is tartalmazhatnak [Junginger és munkatársai In „Drug permeation Enhancement”; Hsieh, D. S., szerk., pp. 59–90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994)], vagy a proteineket és peptideket tartalmazó kiszerelések bõrre juttatását lehetõvé tevõ oxidálóágenseket is magukban foglalhat-

1

HU 006 779 T2

nak (WO 98/53847 számú nemzetközi közzétételi irat), vagy elektromos mezõ alkalmazásával, amely átmeneti transzportutat biztosíthat például elektroporáció esetén, vagy fokozhatja a töltött drogok bõrön keresztül jutását, például iontoforézis során vagy ultrahang alkalmazásával, például szonoforézis során (4309989 és 4767402 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok).

5

Nyújtott adagolás és kiszerelései Kívánt esetben szükség lehet a találmány szerinti vegyületek páciensnek hosszabb idõn keresztül történõ, például egyszeri beadással egy héttõl egy évig terjedõ idõtartamú adagolására. Erre a célra különféle lassú kibocsátású, depó vagy implantátum dózisalakok vehetõk igénybe. Így például a dózisalak tartalmazhatja a vegyületek gyógyászati szempontból elfogadható, nem toxikus, testfolyadékokban alacsony oldhatóságú sóját, ami lehet például (a) polibázikus savval, például foszforsav, kénsav, citromsav, borkõsav, csersav, pamoesav, alginsav, poliglutaminsav, naftalin mono- vagy diszulfonsavak, poligalakturonsav stb. alkotott savaddíciós só; (b) polivalens fémkationt, például cinket, kalciumot, bizmutot, báriumot, magnéziumot, alumíniumot, rezet, kobaltot, nikkelt, kadmiumot stb. tartalmazó só, vagy például N,N-dibenzil-etilén-diaminból vagy etiléndiaminból képzett szerves kationt tartalmazó só; (c) vagy (a) és (b) kombinációi, például cink-tannát só. Mindemellett a találmány szerinti vegyületek, vagy elõnyösen az elõbbiekben leírt, viszonylag oldhatatlan sóik kiszerelhetõk gél formában, például alumínium-monosztearát-gélként, injekciós célra alkalmas szezámolajjal. Különösen elõnyös sók a cinksók, a cink-tannát sók, a pamoátsók stb. Az injekciós célra szolgáló lassú kibocsátású depó kiszerelés egy további típusa a vegyületet vagy sót lassan lebomló, nem toxikus, nem antigén hatású polimerbe, például politejsavba/poliglikolsavba zártan diszpergálva tartalmazza (például lásd 3773919 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). A találmány szerinti vegyületek, vagy elõnyösen az elõbbiekben leírt viszonylag oldhatatlan sók különösen állatokban történõ felhasználás esetén kiszerelhetõk koleszterinmátrixú Silastic pelletekben. A szakirodalomból ismertek további lassú kibocsátású, depó- vagy implantátumkiszerelések, például gáz vagy folyékony liposzómák (5770222 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J. R. Robinson szerk., Marcel Dekker, Inc. N. Y., 1978). A fentiekben általánosságban ismertettük a találmány szerinti megoldást, amelynek jobb megértését segítik a következõ, illusztratív, nem korlátozó érvényû példák.

10

1. példa: EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag klónozása és expressziója emlõssejtekben Egy tipikus emlõseredetû expressziós vektor az mRNS transzkripciójának megkezdését irányító legalább egy promoterelemet, EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag kódoló szekvenciát, valamint a transz-

55

15

20

25

30

35

40

45

50

2

kripció befejezéséhez és a transzkript poliadenilációjához szükséges szignálokat tartalmaz. További elemként enhenszerek, Kozak-szekvenciák és RNS-szplájszing érdekében donor- és akceptorhelyekkel szegélyezett köztes szekvenciák is elõfordulhatnak. Nagymértékben hatékony transzkripció érhetõ el SV40 korai és késõi promoterekkel, retrovíruseredetû hosszú terminálisismétlõdésekkel (LTRS), például RSV, HTLVI, HIVI és a citomegalovírus (CMV) korai promoterével. Ugyanakkor sejtes elemek is igénybe vehetõk, ilyen például az emberi aktinpromoter. A találmány szerinti megoldás gyakorlása szempontjából hasznos expressziósvektorok például a következõk: pIRES1neo, pRetro-Off, pRetro¹On, PLXSN, vagy pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1(+/¹), pcDNA/Zeo (+/–) vagy pcDNA3.1/Hygro (+/–) (Invitrogen), PSVL és PMSG (Pharmacia, Uppsala, Svédország), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) és pBC12MI (ATCC 67109). Alkalmazható emlõssejtek például az emberi Hela 293, H9 és Jurkat-sejtek, az egér NIH3T3 és C127 sejtek, a Cos 1, a Cos 7 és a CV 1, a fürj QC1–3 sejtek, az egér L sejtek és a kínai hörcsög petefészek (CHO¹) sejtek. A gén alternatív módon a gént kromoszómába integrálva tartalmazó stabil sejtvonalakban is expresszálható. Kimutatást elõsegítõ markert (például dhfr, gpt, neomicin vagy higromicin) alkalmazó kotranszfekció segítségével a transzfektált sejtek azonosíthatók és izolálhatók. A transzfektált gén amplifikációjával a kódolt EPOutánzó kapocsmag utánzóanyag nagy mennyiségben expresszálható. A DHFR (dihidrofolátreduktáz)-marker segítségével olyan sejtvonalak hozhatók létre, amelyek a kérdéses gént többszázas vagy akár többezres kópiaszámban hordozzák. További hasznos szelekciós marker a glutaminszintetáz-enzim (GS) [Murphy és munkatársai, Biochem. J. 227:277–279 (1991); Bebbington és munkatársai, Bio/Technology 10:169–175 (1992)]. Ezekkel a markerekkel a szelektív tápközegben tenyésztett emlõssejtek közül a legnagyobb rezisztenciát mutató sejtek szelektálhatók. Ezek a sejtvonalak az amplifikált géneket kromoszómába integráltan tartalmazzák. A kínai hörcsög petefészek (CHO¹) és NSO-sejteket gyakran veszik igénybe EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag vagy meghatározott része vagy változata elõállítására. A pC1 és pC4 expressziós vektorok a Rous-szarkóma-vírus erõs promoterét (LTR) [Cullen és munkatársai, Molec. Cell. Biol. 5:438–447 (1985)] és a CMV-enhenszer egy fragmensét (Boshart és munkatársai, Cell 41:521–530 (1985)] tartalmazzák. A kérdéses gén klónozását elõsegítik a többszörös klónozóhelyek, például a BamHI, Xbal és Asp718 restrikciós enzim hasítási helyekkel. A vektorok mindemellett a 3’ intront, a patkány-preproinzulingén poliadenilációs és terminátorszignálját is tartalmazzák.

Klónozás és CHO-sejtekben történõ expresszió Az EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag exp60 ressziójára a pC4 vektort alkalmaztuk. A pC4 plazmid a 25

1

HU 006 779 T2

pSV2-dhfr plazmid származéka (ATCC elérési szám 37146). A plazmid az egér-DHFR-gént az SV40 korai promoter ellenõrzése alatt tartalmazza. Az ezekkel a plazmidokkal transzfektált, kínai hörcsög petefészek vagy más, dihidrofolát aktivitással nem rendelkezõ sejtek a kemoterápiás ágens metotrexáttal kiegészített szelektív tápközegen történõ tenyésztéssel szelektálhatók (például alpha minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD). A DHFR-gének metotrexátrezisztens (MTX) sejtekben történõ amplifikációja jól dokumentált a szakirodalomban [lásd például F. W. Alt és munkatársai, J. Biol. Chem. 253:1357–1370 (1978); J. L. Hamlin és C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107–143 (1990); és M. J. Page és M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64–68 (1991)]. Az emelkedõ MTX-koncentráció mellett tenyésztett sejtek a célpontenzim, a DHFR fokozott termelésének köszönhetõen rezisztenssé válnak a drogra, ami a DHFR-gén amplifikációjának eredménye. Ha a DHFR-génhez egy másik gént kapcsolunk, akkor az is rendszerint együtt amplifikálódik és fokozott mértékben expresszálódik. Szakember számára ismert, hogy ezzel az eljárással az amplifikált gének több mint 1000 kópiáját hordozó sejtvonalak is kialakíthatók. Mindezeket követõen a metotrexát elvonásakor az amplifikált gént a gazdasejt egy vagy több kromoszómájába integrált sejtvonalakat kapunk. A pC4 plazmid a kérdéses gén expresszálásának céljából a Rous-szarkóma-vírus hosszú terminális ismétlõdésének [long terminal repeat (LTR)] erõs promoterét [Cullen és munkatársai, Molec. Cell. Biol. 5:438–447 (1985)], valamint az emberi citomegalovírus azonnali korai génjének enhenszerébõl izolált fragmenst [Boshart és munkatársai, Cell 41:521–530 (1985)] tartalmazzák. A promotertõl 3’ irányultságban a gének integrációját elõsegítõ BamHI, Xbal és Asp718 restrikciós enzim hasítási helyek találhatók. Ezen klónozóhelyek mögött a plazmid a patkány-preproinzulingén 3’ intronját és poliadenilációs helyét is tartalmazza. Az expresszióra egyéb nagy hatékonyságú promoterek is igénybe vehetõk, ilyenek például az emberi b¹aktinpromoter, az SV40 korai vagy késõi promoterek, vagy az egyéb retrovírusokból, például HlVbõl és HTLV I¹bõl származó hosszú terminális ismétlõdések. Az EPO emlõssejtekben szabályozott módon történõ expressziójára a Clontech-féle Tet-Off és Tet¹On génexpressziós rendszerek vagy hasonló rendszerek is igénybe vehetõk [M. Gossen és H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547–5551 (1992)]. Az mRNS poliadenilációjára egyéb, például az emberi növekedési hormon vagy globingénekbõl származó szignálok is alkalmazhatók. A kérdéses gént kromoszómába integrálva hordozó stabil sejtvonalak szelektálhatók továbbá szelekciót elõsegítõ markerrel végzett, például gpt, G418 vagy higromicin kotranszfekciót követõen is. Kezdetben elõnyös az egynél több kiválasztást elõsegítõ marker, például G418 plusz metotrexát alkalmazása. A pC4 plazmidot restrikciós enzimekkel emésztettük, majd borjúbélfoszfatázzal, szakember számára is-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 26

2

mert eljárásokkal defoszforiláltuk. A vektort ezután 1%¹os agarózgélbõl izoláltuk. Ismert eljárási lépésekben a teljes EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagot kódoló DNS-szekvenciát alkalmaztuk, ami megfelel a találmány szerinti EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyag HC és LC variábilis régióinak. A szerkezet megfelelõ emberi konstans régiót (vagyis HC és LC régiót) kódoló izolált nukleinsavat is tartalmazott. Az izolált variábilis és konstans régiót kódoló DNS¹t és a defoszforilált vektort ezután T4 DNS-ligázzal összekapcsoltuk. Ezután E. coli HB101 vagy XL¹1 Blue sejteket transzformáltunk, majd a pC4 plazmidba inszertált fragmenst tartalmazó baktériumokat például restrikciósenzim-elemzéssel azonosítottuk. A transzfekcióra aktív DHFR-gént nem hordozó kínai hörcsög petefészek (CHO¹) sejteket alkalmaztunk. A pC4 expressziós plazmid 5 mg-ját 0,5 mg pSV2-neo plazmiddal, lipofektin alkalmazásával kotranszfektáltuk. A pSV2neo plazmid domináns szelekciót elõsegítõ markert tartalmaz, ez a Tn5-eredetû neo gén, amely egy antibiotikumcsoport, beleértve a G418 elleni rezisztenciát alakít ki. A sejteket 1 mg/ml G418-cal kiegészített „alpha minus MEM” tápközegbe juttattuk. Két nap elteltével a sejteket tripszinnel kezeltük, majd 10, 25 vagy 50 ng/ml metotrexáttal és 1 mg/ml G418-cal kiegészített „alpha minus MEM” tápközegben hibridómaklónozó tálcákra vittük (Greiner, Németország). 10–14 nap elteltével különálló klónokat tripszinizáltunk, majd különféle (50 nm, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) koncentrációjú metotrexátoldatok alkalmazása mellett hatüregû Petri-csészékbe vagy 10 ml¹es palackokba juttattuk. A legmagasabb metotrexátkoncentráció mellett növekedõ klónokat még magasabb koncentrációjú (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) metotrexátot tartalmazó, újabb hatüregû tálcákra vittük. Ugyanezt a procedúrát ismételtük, amíg 100–200 mM koncentráció mellett növekedni képes klónokat kaptunk. A kívánt géntermék expresszióját például SDSPAGE és Western-blot vagy reverz fázisú HPLC alkalmazásával elemeztük. 2. példa: EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagok Háttér: Az EMP–1 (EPO-utánzó polipeptid 1) 20 aminosavból álló peptid, amely nem mutat szekvenciahomológiát az emberi eritropoietinnel (HuEPO), de képes (dimerként) az EPO-receptor aktiválására (Wrighton és munkatársai, 1996, Science, 273, 458–463). Terápiás alkalmazhatóságát korlátozza azonban viszonylag alacsony aktivitása (a HuEPO aktivitásának tízezred vagy százezred része) és rövid felezési ideje (ex-vivo felezési ideje 8 óra 50%¹os szérumban, in vivo felezési ideje ismeretlen). Szükség volt tehát a peptid felezési idejének meghosszabbítására hatóképességének károsítása nélkül, esetlegesen azt fokozva. Ez idáig számos kísérlet történt az EMP–1 aktivitásának fokozására a peptid dimerizációjának stabilizálásával, vagy felezési idejének növelésére nagyobb szerkezetekbe történõ foglalásával. Wrighten és munkatársai (1997, Nature Biotechnology, 15, 1261–65) a dimerizáció stabilizálása érdekében biotinnal jelölt

1

HU 006 779 T2

EMP–1 és streptavidin kombinációját alkalmazták. A szerzõk in vitro sejtproliferációs vizsgálati eljárásban az aktivitás százszoros fokozódását figyelték meg. A peptiddimer stabilizálása érdekében antibiotin ellenanyagokat is felhasználtak, de ekkor csupán tízszeres aktivitásfokozódást tapasztaltak. Ugyanezen szerzõk az EMP–1 kémiailag meghatározott dimer formáját is elõállították. Ebben az esetben az aktivitás százszoros növekedését tapasztalták in vivo. Egy másik kutatócsoport az EMP–1 aktivitását polietilénglikolhoz (PEG) történõ kovalens kapcsolásával kívánta javítani [Johnson és munkatársai, 1997, Chem. & Bio., 4(12), 939–50)]. A hatáserõsség akár ezerszeres növekedésérõl számoltak be, ugyanakkor a szerkezet egérben immunogénnek bizonyult (az ellenanyagok a peptid ellen irányultak) (Dana Johnson, személyes közlés). Kuai és munkatársai (2000, J. Peptide Res., 56, 59–62) az EMP–1 peptidet a plazminogén aktivátor inhibitor¹1 (PAI–1) szekvenciájába inszertálták. Az volt az elképzelésük, hogy az EMP–1 ezen támasztófelszínre történõ inszertálása egyaránt stabilizálni fogja a dimerizációt és fokozza a felezési idõt. Egy in vitro vizsgálati eljárásban a szerkezet hatáserõssége lényegesen, akár több mint 2500-szor magasabbnak bizonyult, mint az EMP–1¹é. Fontos megjegyezni, hogy a felsorolt vizsgálatokban eltérõ in vitro vizsgálati eljárásokat és in vivo modelleket alkalmaztak, így a közölt hatáserõsségek nem szükségszerûen hasonlíthatók össze egymással vagy a leírásban közölt eredményekkel.

5

10

15

20

25

30 EPO-utánzó kapocsmag utánzóanyagok A találmány szerinti megoldásra specifikus, nem korlátozó érvényû példa az EMP-kapocsmag utánzóanyag szerkezet, ahol V a természetes körülmények között elõforduló HC vagy LC ellenanyag elsõ néhány N¹terminális aminosava, a P a bioaktív EMP–1 peptid egy példánya, L pedig a Gly-Ser vagy a Gly-Gly-GlySer flexibilis kapcsolószekvencia tandem ismétlõdése, a H kapocsmagrégió, a CH2 és a CH3 pedig IgG1 vagy IgG4 izotípus-alosztályok. Az elképzelések szerint ez a szerkezet rögzíti az EMP–1 peptidet, de megfelelõ mértékû flexibilitást biztosít ahhoz, hogy a dimerizált peptidek az összeállított homodimer részeként stabilak legyenek. Ezt támasztja alá, hogy az EMP-kapocsmag utánzóanyag aktivitása in vitro sejtproliferációs vizsgálati eljárásban az EMP–1 peptidének több, mint ötszázszorosa és alapvetõen hasonlít a rekombináns HuEPO (rHuEPO) aktivitásához. Mindemellett az említett szerkezet felezési ideje várhatóan sokszorosa lesz a különálló rHuEPO vagy EMP–1 felezési idejének, és megközelítheti az IgG felezési idejét. Mindezekkel megegyezõen egyenlõ aktivitási egységekben számolva az EMP-kapocsmag utánzóanyaggal kezelt normálegerekben lényegesen magasabb maximális hematokritérték érhetõ el, mint a rHuEPO-val kezelt egerekben, a megemelt szintek pedig hosszabb ideig állnak fenn. A szerkezet hatékonyan szekretálódik a sejtekbõl és megfelelõen hajtogatódottnak tûnik, ami az elsõ generációs utánzóanyagokkal kapcsolatos problémák kiküszöbölését jelenti.

35

40

45

50

55

60 27

2

A fenti alapszerkezet mellett a találmány tárgyát képezik a potenciálisan kedvezõ biológiai jellemzõkkel rendelkezõ változatok is. Az idetartozó szerkezetek csökkentett hajlandóságot mutathatnak az önmagukkal való összekapcsolódásra, csökkentett immuneffektorfunkcióval vagy csökkentett immunogenitással rendelkeznek. További kívánt jellemzõket, például a biológiailag aktív peptid jobb konformációját, vagy a vér-agy gáton történõ átjutást biztosító módosításokat is elképzelhetõnek tartunk. A kívánt aktivitásokkal rendelkezõ szerkezetek elõállítása érdekében a bemutatott változatok és módosítások tetszõlegesen kombinálhatók. Rekombináns-DNS-eljárásokkal az EMP–1 peptidet egy immunglobulin szignálpeptid és egy emberi J szekvencia közötti köztes vektorba inszertáltuk. Ezt komplementer szintetikus oligonukleotidokkal végeztük, amelyek végei a vektorbeli restrikciós helyekkel kompatibilisek voltak. Ezek az oligonukleotidok a szignálpeptidáz konszenzus helynek (QIQ), az EMP¹1 peptidnek (2. azonosító számú szekvencia, SEQ ID NO. 2.) és GS¹ vagy GGGS-tartalmú flexibilis linkernek megfelelõ kódolószekvenciákat tartalmaztak. A fentiekben említett funkcionális elemeket tartalmazó restrikciós fragmenst ezután expressziósvektorba vittük. Ez a vektor anti-CD4 immunglobulinpromotert és enhenszert, emberi IgG1 kapocsmag szekvencia kódoló szekvenciát, és IgG1 kapocsmag régiórészletet (CPPCP, 66. azonosító számú szekvencia (SEQ ID:66) 109–113. pozíciók, lásd a 36C. ábrát), HC 2 (CH2), valamint HC 3 (CH3) konstans régiókat, valamint a plazmid replikációjához, baktériumokban történõ szelekciójához és emlõssejtekben a stabilan expresszáló klónok kimutatásához szükséges elemeket tartalmazott. A plazmidot linearizáltuk és elektroporációval NSO egérmieloma-sejtvonalba juttattuk. Szelektáltuk a rezisztens sejteket és az EMP-kapocsmag utánzóanyagot nagy mennyiségben expresszáló sejteket a tenyészetek felülúszóinak ELISA-vizsgálatával azonosítottuk. A sejttenyészetek felülúszóiból a szerkezetet standard protein A affinitáskromatográfiával tisztítottuk ki. A tisztított termék denaturáló és redukálókörülmények között SDS-tartalmú poliakrilamid géleken történõ átjuttatásával igazoltuk annak méretét. A tisztított protein azonosságát tömegspektrometriával és N¹terminálisszekvenálással is igazoltuk. Az alábbiakban az EMP-kapocsmag utánzóanyagok aminosavszekvenciáit mutatjuk be. A találmány tárgyát képezi a 88. azonosító számú szekvencia (SEQ ID:NO 88.) szerinti utánzóanyag. A funkcionális doméneket a peptid kódoló szekvencia felett jeleztük. A három aminosavból álló szignálpeptid konszenzusszekvencia megegyezik egy természetes körülmények között elõforduló immunglobulin elsõ három aminosavával. Ezek az aminosavak feltételezhetõen elõsegítik a szignálpeptidnek az endoplazmatikus retikulumban a szignálpeptidáz által történõ hatékony eltávolítását. Ezt a szekvenciát közvetlenül követi az EMP–1 kódoló szekvencia. Az EMP–1 szekvencia két C¹terminális aminosava a következõ hat aminosavval együtt Gly-

1

HU 006 779 T2

Gly-Gly-Ser ismétlõdéssel jellemzett flexibilis kapcsolószekvenciát alkot. Ezt követi egy emberi csatoló- (J) régió szekvenciája. Feltételezhetõen a J szekvencia még további flexibilitást biztosít, ami lehetõvé teszi az EMP–1 dimer számára a megfelelõ konformáció felvételét, és lehetõvé teszi, hogy az immunglobulin gömbszerkezetébõl kitüremkedve két EPO-receptor közötti hasadékba hatoljon. A J régiót közvetlenül követõ HC kapocsrégió szintén a szerkezet része. Az IgG1 kapocsrégióban három cisztein fordul elõ (kiemelve). Az elsõ normálkörülmények között az immunglobulin könnyûlánccal (LC) alkot párt, a másik kettõ pedig a két HC közötti lánc közötti kötésekben szerepel.

2

A szekvencia maradékát a protein zömét kitevõ CH2 és CH3 régiók alkotják. Az immunglobulinok hosszú szérumbeli felezési idejének egyik feltételezett oka abban a tulajdonságukban keresendõ, hogy képe5 sek megkötni az FcRn¹t, ami a pinocitózison átesett immunglobulin extracelluláris térbe történõ visszajuttatásával megnöveli a szérumbeli felezési idõt. Az FcRn kötõdési helye átfedi a CH2 és CH3 régiók kapcsolódását (Shelids és munkatársai, 2001, J. Biol. Chem., 10 276(9), 6591–6604). Az alábbiakban az EMP-kapocsmag utánzóanyag peptidszekvenciája látható a fontos funkcionális domének feltüntetésével.

28

HU 006 779 T2

29

1

HU 006 779 T2

Köztudott, hogy két IgG nehézlánc a sejten belüli feldolgozás során a kapocsrégióban lévõ cisztinek között kialakított diszulfidhidakon keresztül összekapcsolódva homodimert alkot. Várhatóan a módosított peptidek között is ez következik be, az összeállított EMPkapocsmag utánzóanyag szerkezetet kialakítva. Emellett az is várható, hogy az EMP–1 peptid két cisztinje közötti láncon belüli diszulfidhíd szintén kialakul. Az EMP-kapocsmag utánzóanyag várható szerkezete két EMP–1 peptidet tartalmaz. A peptidek N¹terminálison való térbeli elrendezõdése a kapcsolódó szekvenciák flexibilitásával együtt lehetõvé teszi, hogy a peptidek bioaktív dimert alakítsanak ki. Az EMP-kapocsmag utánzóanyag aktivitását elõször in vitro bioaktivitási vizsgálati eljárásban vizsgáltuk. Ezen vizsgálati eljárás céljára a heveny megakarioblasztos leukémiás betegbõl származó EPO-függõ UT¹7/EPO sejtvonalat alkalmaztuk (Komatsu és munkatársai, 1993, Blood, 82(2), 456–464). Ezek a sejtek az rHuEPO-val kiegészített tápközeg megvonását követõen 48–72 órán belül programozott sejthalált szenvednek. A 24 órán keresztül rHuEPO nélkül inkubált sejtek megmenthetõk rHuEPO vagy EPO-agonista kezeléssel. RHuEPO hiányában tenyésztett sejtekhez EMP-kapocsmag utánzóanyagot adtunk, majd a sejtek életképességét 48 óra elteltével MTS tetrazóliumvegyülettel (CellTiter 96 Aqueous One solution, Promega) vizsgáltuk, amelyet az élõ sejtek mérhetõ abszorbanciájú termékké metabolizálnak. Egy vizsgálati eljárásban jellemzõ eredményként azt kaptuk, hogy az EMP-kapocsmag utánzóanyag aktivitása moláris alapon az EMP–1 peptidhez képest ötszázszor nagyobb volt, míg az rHuEPO aktivitásának csak ötödét tette ki. Mindezek mellett ugyanezen sejteket EMP-kapocsmag utánzóanyaggal stimuláltuk és a tirozin foszforilációs mintázatot a sejtlizátum poliakrilamid gélen történõ átjuttatásával tettük megfigyelhetõvé. Az EMP-kapocsmag utánzóanyag által kialakított mintázat az rHuEPO esetében megfigyelthez hasonlított, ami arra utal, hogy az EMP-kapocsmag utánzóanyag által a sejtekre gyakorolt hatásmechanizmusa is feltehetõen megegyezik az rHuEPO-éval. Egészséges egerekben az EMP-kapocsmag utánzóanyag és a rHuEPO felezési idejének és eritropoézisre gyakorolt hatásának összehasonlítása érdekében in vivo kísérleteket végeztünk. Az azonos adaggal ke-

20

25

30

35

40

45

50

55

60 30

2

zelt egerek esetében az EMP-kapocsmag utánzóanyag magasabb maximális válaszreakciót idézett elõ, amely elnyújtottabb volt, mint az rHuEPO esetében tapasztalt. Az rHuEPO és az EMP-kapocsmag utánzóanyag szérumkoncentrációját ELISA-val határoztuk meg. Az EMP-kapocsmag utánzóanyagok becsült felezési ideje az rHuEPO-énak legalább többszöröse volt. Kimutattuk, hogy az IgG1 alsó kapocsrégiójában két lizin (L) reziduum, az L234 és az L235 alanin (A) mutációja csökkenti az immunglobulin komplementfüggõ citotoxicitásban (CDC) és ellenanyagfüggõ sejtes citotoxicitásban (ADCC) való közremûködésének képességét [Hezereh és munkatársai, 2001, J. Virol. 75(24), 12161–68)]. Elõzetes vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy az EMP-kapocsmag utánzóanyag nem segíti elõ az EPO-receptort hordozó sejtek komplementfüggõ lízisét. Ez az eritroid progenitor sejtek felületén található receptorok kis számával lehet összefüggésben. Emellett az eritroid progenitorsejteknek a hematokritérték jelentõs mértékû növekedése alapján megállapítható in vivo elszaporodása arra utalhat, hogy az immuneffektor funkciók funkcionálisan nem játszanak lényeges szerepet. Bár nem figyeltünk meg effektorfunkcióhoz kapcsolódó hatásokat, az említett mutációk kialakítása ugyanakkor elõvigyázatosságból továbbra is érdeklõdésre tart számot. Az immuneffektor funkciókban játszott szerep csökkentését eredményezõ további módosítás a glikozilációs kapcsolódási hely eltávolítása. Ez a 297. pozícióban (N297) lévõ aszparagin glutaminra (Q) történõ mutációjával valósítható meg. További változtatások lehetnek adott esetben a treonin (T) például T34 vagy T47 egy alternatív aminosavval történõ helyettesítése az O¹glikoziláció csökkentése vagy módosítása érdekében. Ismert, hogy az IgG1 alosztály aglikozilált változatai kevésbé hatékony mediátorai az immuneffektor funkciónak (Jefferis és munkatársai 1998, Immol. Rev., 163, 50–76). Elõnyök: A fentiekben leírt új szerkezet, az EMP-kapocsmag utánzóanyag az EMP–1 bioaktív peptid alternatív bemutatására nyújt lehetõséget. A szerkezet aktivitása az rHuEPO-tartományában van, in vivo felezési ideje pedig IgG-molekuláéhoz hasonló. Mindemellett a javasolt módosítások várhatóan az EMP-kapocsmag utánzóanyag új jellemzõi mellett, azokkal kombinációban fokozzák az

1

HU 006 779 T2

2

A fenti kitanítások alapján a találmány szerinti megoldásnak számos módosítása és variációja lehetséges, amelyek mind a találmány tárgyát képezik.

EMP-kapocsmag utánzóanyag szerkezet alkalmazhatóságát. Egyértelmû, hogy a találmány szerinti megoldás a fentiektõl eltérõ módon is megvalósítható.

A szekvencialistában található kötetlen szövegek (<223> kód) magyar fordítása 1. azonosító számú szekvencia: <223> Peptid <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet 2–8., 10–17., 22–29., 73–89. azonosító számú szekvencia: <223> Peptid 9.. 18–20., 30. azonosító számú szekvencia: <223> Peptid <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet 21. azonosító számú szekvencia: <223> Peptid <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet <223> Xaa bármely természetesen elõforduló aminosav lehet 31. azonosító számú szekvencia: <223> Vh1 nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (5) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 25–55 (42) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 32. azonosító számú szekvencia: <223> Vh2 nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (16) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (16) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 33. azonosító számú szekvencia: <223> Vh3a nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (5) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (18) tetszõleges aminosav <223> 3. keret 31

HU 006 779 T2

<223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 20–40 (31) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 34. azonosító számú szekvencia: <223> Vh3b nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (5) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 5–25 (11) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (23) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 35. azonosító számú szekvencia: <223> Vh3c nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (5) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (19) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (25) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 36. azonosító számú szekvencia: <223> Vh4 nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (16) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 20–45 (32) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 37. azonosító számú szekvencia: <223> Vh5 nehézlánc variábilis régió <223> különféle_jellemzõk (misc_feature) <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (5) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (23) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 38. azonosító számú szekvencia: <223> Vh6 nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (18) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 5–30 (13) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 39. azonosító számú szekvencia: <223> Vh7 nehézlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–20 (5) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 3. keret 32

HU 006 779 T2

<223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 5–30 (13) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 40. azonosító számú szekvencia: <223> Kappa 1_4 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 20–40 (30) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 41. azonosító számú szekvencia: <223> Kappa2 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 20–40 (29) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 42. azonosító számú szekvencia: <223> Kappa3 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–30 (13) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 20–40 (30) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 43. azonosító számú szekvencia: <223> Kappa5 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–20 (11) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 10–30 (19) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 44. azonosító számú szekvencia: <223> KappaÚj1 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 10–30 (21) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 45. azonosító számú szekvencia: <223> KappaÚj2 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 10–30 (18) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret 33

HU 006 779 T2

<223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 10–30 (21) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 46. azonosító számú szekvencia: <223> KappaÚj3 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 10–30 (17) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 3–30 (9) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 47. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda1a könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (14) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 30–50 (39) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 48. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda1b könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 3–25 (13) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 30–50 (41) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 49. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda2 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 8–25 (14) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 25–50 (38) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 50. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda3a könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–20 (11) tetszõleges aminosav <223> 2vv keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (26) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 51. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda3b könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–20 (11) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret 34

HU 006 779 T2

<223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (27) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 52. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda3c könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–20 (11) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 25–50 (37) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 53. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda3e könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–20 (11) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (26) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 54. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda4a könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (12) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 5–25 (11) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 10–40 (23) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 55. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda4b könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (12) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 5–25 (11) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (25) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 56. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda5 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (14) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 5–20 (10) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 10–35 (22) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 57. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda6 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (13) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret 35

HU 006 779 T2

<223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 25–50 (38) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 58. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda7 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (14) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 10–35 (23) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 59. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda8 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (14) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–35 (25) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 60. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda9 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (12) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 5–25 (12) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (28) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 61. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda10 könnyûlánc variábilis régió <223> 1. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 1 (CDR1), az X 5–25 (13) tetszõleges aminosav <223> 2. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 2 (CDR2), az X 3–20 (7) tetszõleges aminosav <223> 3. keret <223> Komplementaritást meghatározó régió 3 (CDR3), az X 15–40 (27) tetszõleges aminosav <223> 4. keret 62. azonosító számú szekvencia: <223> IgA1 nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> kapocs <223> CH2 <223> CH3 63. azonosító számú szekvencia: <223> IgA2 nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> kapocs <223> CH2 <223> CH3 64. azonosító számú szekvencia: <223> IgD nehézlánc konstans régió <223> CH1 36

HU 006 779 T2

<223> kapocs1 <223> kapocs2 <223> CH2 <223> CH3 65. azonosító számú szekvencia: <223> IgE nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> CH2 <223> CH3 <223> CH4 66. azonosító számú szekvencia: <223> IgG1 nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> kapocs <223> CH2 <223> CH3 67. azonosító számú szekvencia: <223> IgG2 nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> kapocs <223> CH2 <223> CH3 68. azonosító számú szekvencia: <223> IgG3 nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> kapocs1 <223> kapocs2 <223> kapocs3 <223> kapocs4 <223> CH2 <223> CH3 69. azonosító számú szekvencia: <223> IgG4 nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> kapocs <223> CH2 <223> CH3 70. azonosító számú szekvencia: <223> IgM nehézlánc konstans régió <223> CH1 <223> CH2 <223> CH3 <223> CH4 71. azonosító számú szekvencia: <223> Kappa könnyûlánc konstans régió (IgKc) 72. azonosító számú szekvencia: <223> Lambda könnyûlánc konstans régió (IgLambda)

37

1

HU 006 779 T2

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Nukleinsav, amely a 88. azonosító számú szekvenciaként (SEQ ID NO:88) megadott aminosavszekvenciát kódolja. 2. Polipeptid, amely tartalmazza a 88. azonosító számú szekvenciaként (SEQ ID NO:88) megadott szekvencia összes egymást követõ aminosavát. 3. Vektor, amely tartalmazza az 1. igénypont szerinti nukleinsavat. 4. Gazdasejt, amely tartalmazza az 1. igénypont szerinti nukleinsavat. 5. Eljárás 2. igénypont szerinti polipeptid elõállítására, amely során 1. igénypont szerinti nukleinsav in vitro transzlációjára a polipeptid detektálható vagy kinyerhetõ mennyiségben történõ expresszióját lehetõvé tevõ körülmények között kerül sor. 6. Készítmény, amely 2. igénypont szerinti polipeptidet tartalmaz.

2

7. A 6. igénypont szerinti készítmény, amely készítmény legalább egy gyógyászati szempontból elfogadható vivõanyagot vagy hígítószert is tartalmaz. 8. A 2. igénypont szerinti polipeptid ember EPO-li5 gandummal kapcsolatos állapotának kezelésére, amely állapot anémia, vérsejttel kapcsolatos állapot, rák, fertõzõ betegség, vagy szív-érrendszeri betegség. 9. A 8. igénypont szerinti polipeptid 10 0,000001–500 mg per kilogramm mennyiségben történõ beadásra. 10. A 8. igénypont szerinti polipeptid parenterális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás, bóluszban történõ, vaginális, rektális, bukkális, szublingvális, 15 intranazális vagy transzdermális módon történõ beadásra. 11. A 2. igénypont szerinti polipeptid, amely elõállítható az 5. igénypont szerinti eljárás alkalmazásával.

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest