!HU000005800T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 005 800
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 05 814242 (22) A bejelentés napja: 2005. 09. 23. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050814242 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1791852 A1 2006. 03. 30. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1791852 B1 2008. 12. 31.
(51) Int. Cl.: C07H 7/04 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06034489 PCT/US 05/034359
(30) Elsõbbségi adatok: 612599 P 2004. 09. 23.
(73) Jogosult: Bristol-Myers Squibb Company, Princeton NJ 05843-4000 (US)
US
(72) Feltalálók: WASHBURN, William, Titusville, NJ 08560 (US); MENG, Wei, Pennington, NJ 08534 (US)
(54)
(74) Képviselõ: dr. Kiss Ildikó, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
C-aril-glükozid SGLT2 inhibitorok és eljárás ezek elõállítására
(57) Kivonat
HU 005 800 T2
(1)
A találmány (I) képletû vegyületre és annak alkalmazására vonatkozik cukorbetegség és hasonló betegségek kezelésére önmagában vagy egyéb terápiás anyaggal kombinációban.
A leírás terjedelme 20 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 005 800 T2
A találmány területe A jelen találmány C¹aril-glükozidokra vonatkozik, amelyek a vesében található nátriumfüggõ glükóz transzporterek szelektív inhibitorai, valamint eljárásra cukorbetegség vagy hasonló rendellenességek kezelésére a fent említett C¹aril-glükozidok alkalmazásával önmagukban, vagy egy vagy több egyéb típusú terápiás szerrel kombinációban. A találmány háttere Mintegy 100 millió ember szenved világszerte II¹es típusú diabetesben (NIDDM), amelyre jellemzõ a máj túlzott glükóztermelése következtében fellépõ hiperglikémia és a periferiális inzulinrezisztencia, amelynek gyökerei még nem ismertek. A diabeteses betegek plazma glükóz szintjeinek következetes szabályozása ellensúlyozhatja a diabetikus szövõdmények kifejlõdését és a bétasejt-elégtelenséget, amely elõrehaladott betegség esetén látható. A plazma glükóz normális esetben a vesében, a glomerulusokban szûrõdik át, és a proximális tubulusban aktívan reabszorbeálódik. A vesében a glükóz újrafelvétel 90%¹a a vesekérgi proximális tubulus kezdeti S1 szakaszának hámsejtjeiben megy végbe. A fenti újrafelvételért felelõs fõ transzporter valószínûleg az SGLT2, egy 672 aminosavat tartalmazó protein, amely 14 membránátívelõ szegmenst tartalmaz, és döntõen a vese proximális tubulusainak kezdeti S1 szakaszában expresszálódik. Az SGLT2 szubsztrátspecificitása, nátriumfüggõsége és lokalizációja összhangban van a humán kortikális proximális vesetubulusokban korábban jellemzett nagy kapacitású, kis affinitású, nátriumfüggõ glükóz transzporter tulajdonságaival. Ezenkívül, a hibrid kimentési („depletion”) vizsgálatok eredményei azt sugallják, hogy az SGLT2 a proximális vesetubulus S1 szakaszának legfõbb Na+/glükóz kotranszportere, mivel a patkány vesekéregbõl származó mRNS által kódolt lényegében valamennyi Na¹függõ glükóz transzport aktivitást gátolja egy – patkány eredetû SGLT2¹re specifikus – antiszensz oligonukleotid. Emberben az SGLT2-ben bekövetkezõ mutációk a renális glükózuria örökletes formáival társultak, ami további bizonyítékot szolgáltatott az SGLT2 primer szerepére a renális glükóz reabszorpcióban. Az ilyen betegekben a vese morfológiája és a vesemûködés egyébként normális. Az SGLT2 gátlása cukorbetegekben – a megnövekedett glükózkiválasztás révén – várhatóan csökkenti a vérplazma glükóz koncentrációját. Egy másik Na¹függõ glükózkotranszporter, az SGLT1 – amely aminosav szinten 60%-ban azonos az SGLT2-vel – a vékonybélben, valamint a proximális vesetubulus távolabbi S3 szakaszában termelõdik. A humán SGLT1 és SGLT2 – szekvenciájuk hasonlóságai ellenére – biokémiailag megkülönböztethetõek. A phlorizin (az SGLT-aktivitás specifikus inhibitora) alkalmazása az elmélet in vivo bizonyítékát szolgáltatta, amennyiben számos, cukorbetegséggel összefüggõ rágcsálómodellben és egy kutya diabetesmodellben elõsegítette a glükózkiválasztást, csökkentette az éhgyomri és evés utáni plazma glükóz koncentrációt és
5
10
15
20
25
30
35
2
serkentette a glükózfelhasználást anélkül, hogy hipoglikémiás mellékhatások jelentkeztek volna. A phlorizines kezelés következtében kéthetes idõtartamban nem voltak tapasztalhatók a vérplazma ionegyensúlyára, a vesemûködésre vagy a vese morfológiájára vonatkozó káros hatások. Ezenfelül a phlorizin – a glükózuriától eltekintve normális – állatoknak történõ adagolásakor sem voltak tapasztalhatók hipoglikémiás vagy egyéb zavaró hatások. A vese eredetû SGLT¹k inhibitorának 6 hónapos idõtartamban történõ adagolásáról (Tanabe Seiyaku) leírták, hogy elhízott NIDDM patkánymodellben fokozta az éhgyomri és evés utáni plazma glükóz koncentrációt, növelte az inzulinszekréciót és hipoglikémiás vagy vese eredetû mellékhatások nélkül késleltette a nefropátia és a neuropátia kialakulását. Az SGLT1 és 2 aktivitás általános inhibitorai terápiás szempontból nem vonzóak, mivel az SGLT1 gátlása súlyos következményeket is maga után vonhat, amelyek példája az örökletes glükóz/galaktóz felszívódási zavar (GGM), amelyre jellemzõ, hogy az SGLT1 kotranszporterben bekövetkezett mutációk a bélben csökkent glükózfelvételt, valamint életveszélyes hasmenést és dehidratációt eredményeznek. Az SGLT2 szelektív gátlása cukorbetegekben várhatólag normalizálja a plazma glükóz szintet a glükóz vizeletbe való ürítésének fokozásával, ezáltal javítván az inzulinszenzitivitást, és késleltetvén a cukorbetegség szövõdményeinek kifejlõdését a jelentõs gyomor-bél rendszeri mellékhatások nélkül. Ennek megfelelõen az olyan vegyületek, amelyek az SGLT2 transzporterre nézve szelektívek, a plazma glükóz szintek szabályozásával kapcsolatos betegségek vagy rendellenességek, mint például a cukorbetegség, kezelésére vagy megelõzésére alkalmasnak bizonyulhatnak. A WO 03/099836 számú szabadalmi publikációban ismertetik a következõ képletû C¹aril-glükozid vegyületet:
40
45 Leírták, hogy ez a vegyület SGLT2 inhibitor, és ezért cukorbetegség, annak szövõdményei és cukorbetegséggel kapcsolatos betegségek kezelésére alkalmazható. A WO 2004/063209 számú nemzetközi szabadalmi 50 publikációban eljárásokat ismertetnek a következõ képletû C¹aril-glükozid SGLT2 inhibitorok elõállítására:
55
60 2
1
HU 005 800 T2
Egy elõnyös kiviteli mód szerint a WO 2004/063209 szabadalmi publikációban ismertetett eljárások lehetõvé teszik a következõ képletû vegyületek szintézisét: 5
10
ahol 1) R1 jelentése hidrogénatom és R2 jelentése etilcsoport; 2) R1 jelentése klóratom és R2 jelentése etoxicsoport; vagy 3) R1 jelentése metilcsoport és R2 jelentése metil-tio-csoport.
15
A találmány összefoglalása A találmány tárgyát (I) képletû C¹aril-glükozid vegyület
20
I
25
képezi. Az (I) képletû vegyület magában foglalja annak gyógyszerészetileg elfogadható sóit, komplexeit, sztereoizomerjeit és prodrog észtereit is. Az (I) képletû vegyület szelektív SGLT2 inhibitor aktivitással rendelkezik, és ezért plazma glükóz szintek
Protokoll
2
szabályozásával kapcsolatos betegségek vagy rendellenességek megelõzésére vagy kezelésére alkalmazhatók. Az ilyen betegségekre vagy rendellenességre példaként említhetõk a cukorbetegség és a cukorbetegség mikro- és makrovaszkuláris szövõdményei. A jelen találmány tárgyát képezik az (I) képletû vegyület, az ilyen vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárások az ilyen vegyület alkalmazására. A jelen találmány tárgyát fõleg az (I) képletû vegyület gyógyászatilag hatásos mennyiségét önmagában vagy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval kombinációban tartalmazó gyógyszerkészítmény képezi. Ezenkívül, a jelen találmány tárgyát képezi az (I) képletû vegyület alkalmazása az itt ismertetett betegségek vagy rendellenességek kezelésére vagy kifejlõdésének vagy fellépésének késleltetésére alkalmas gyógyszer elõállítására humán betegek számára. A találmány szerinti vegyület önmagában vagy egy vagy több, az itt ismertetett gyógyászati területeken hatékony anyaggal kombinációban alkalmazható. A jelen találmány tárgyát képezi továbbá mind az (I) képletû vegyület, mind egy más típusú antidiabetikus anyag és/vagy más típusú terápiás anyag, például hipolipidémiás anyag alkalmazása a fentiekben és az alábbiakban ismertetett betegségek kezelésére alkalmas gyógyszer elõállítására humán betegek számára.
A találmány részletes ismertetése A következõ táblázat a találmány szerinti vegyület 30 (1. vegyület, 4. oszlop) alapvetõ összehasonlítását tartalmazza hasonló szerkezetû vegyületekkel, a vegyület alkalmazhatóságára és kereskedelmi életképességére vonatkozó több jellemzõ figyelembe vételével. Az 1. vegyület (találmány szerinti vegyület) és a 3–5. vegyü35 let képletét az alábbiakban közöljük.
Tulajdonság
Vegyület száma 5.
4.
3.
1. (I)
A
plazma glükóz %¹os csökkenése STZ cukorbeteg patkányokban 0,1 mg/kg orális dózis beadása után 5 órával, a hordozóanyaggal kezelt kontrollokhoz képest
34%
60%
59%
62%
B
stabilitás egy prototípus készítményben
igen
igen
nem
igen
C
in vitro klasztogén aktivitás
igen
igen
–
nem
5. vegyület
4. vegyület 3
1
HU 005 800 T2
2
3. vegyület
1. vegyület [(I) képletû vegyület].
Amint azt a fenti táblázat mutatja, csak az (I) képletû vegyület mutat kedvezõ tulajdonságokat az összes vizsgált kategóriában. Azaz, csak az (I) képletû vegyület mutatja a plazma glükóz szint kedvezõ csökkenését cukorbeteg patkányokban (hatás), stabilitást a prototípus készítményben (ami a tárolhatóságot jelzi) és negatív eredményeket az in vitro klasztogén aktivitási vizsgálatokban (csökkent onkogén hatás). Összehasonlító vizsgálatokban alkalmazott protokollok I. Az A) vizsgálat protokollja: vérglükózszintre kifejtett hatás meghatározása streptozotocinnal kezelt cukorbeteg patkányokban A következõ analízist alkalmaztuk a vizsgált vegyületek plazma glükóz koncentrációjára kifejtett hatásának elfogadható elõrejelzésére a fenti összehasonlításban. 250–275 g testtömegû hím Sprague-Dawley patkányokat (Charles River) cukorbeteggé tettünk 65 mg/kg streptozotocin (Sigma) egyszeri intraperitoneális injektálásával, friss, hideg (4 °C¹os) 0,01 mol/l citrátpufferrel elkészítve. Négy nap elteltével az állatokat evés utáni állapotban elvéreztettük. A farokvégbõl teljes vért gyûjtöttünk, és glükóz oxidációs módszerrel analizáltuk glükózra Glucometer Elite (Bayer) alkalmazásával. Az átlagos vérglükózszintek 450–550 mg/dl tartományban voltak. A kísérlet napján a vegyületet 5% m¹Pirolt, 20% PEG 400¹at és 20 mmol/l nátrium-difoszfátot tartalmazó hordozóanyagban oldottuk. A patkányokat lemértük, véletlenszerûen négy csoportba osztottuk, csoportonként 6 állattal, és orálisan kezeltük a hordozóanyaggal vagy 0,1 mg/kg vegyülettel. Az orális adagolást gyomorszondával 1 ml/testtömeg¹kg össztérfogatban végeztük. Adagolás után a ketrecekbõl eltávolítottuk a táplálékot, és a patkányok vízhez ad libitum hozzáfértek a kísérlet alatt. A farokvégbõl vérmintákat vettünk a hatóanyag beadása után 0, 35, 60, 120, 180, 240 és 300 perccel. A vérglükózt glükóz oxidációs eljárással analizáltuk Glucometer Elite (Bayer) alkalmazásával.
20
A) Statisztikai adat analízis Az átlagos vérglükózértékek és a százalékos változások kiszámítását a hordozóanyaggal szemben az egyes idõpontokban Microsoft Excel alkalmazásával végeztük. Statisztikai analíziseket (T¹próbák, vagy 25 ANOVA, majd Fisher-próba) hajtottunk végre, amelyekben a hatóanyaggal kezelt csoportokat a hordozóval kezelt kontrollokkal hasonlítottuk össze, Microsoft Excel vagy Stat View statisztikai program alkalmazásával. Egy p<0,05 értéket tekintettünk statisztikusan szig30 nifikánsnak.
35
40
45
50
55
60 4
II. A B) vizsgálat protokollja: oxidatívan labilis terápiás szer stabilitásának meghatározása szokásosan alkalmazott szilárd segédanyagok jelenlétében, gyorsított öregítési körülmények között A következõ eljárást alkalmaztuk a 3. vegyület kémiai stabilitásának meghatározására szokásosan alkalmazott segédanyagok és tipikus antioxidánsok jelenlétében. A gyógyszerhatóanyagot egy mozsárban eldörzsöltük a megfelelõ antioxidánssal, majd száraz állapotban összekevertük a többi segédanyaggal, amelyeket a következõ táblázatban sorolunk fel. Antioxidánsként nátrium-metabiszulfitot és butilezett hidroxilanizolt (BHA) alkalmaztunk ebben a vizsgálatban. A BHA¹t két, 0,01 tömeg% és 0,5 tömeg% koncentrációban alkalmaztuk, és a nátrium-metabiszulfitot 0,01 tömeg% koncentrációban alkalmaztuk. A 40 °C/73% RH és a HIL/uv körülmények között tárolt minták esetén oxigéngázt buborékoltattunk a kémcsövekbe, és ezeket szorosan lekupakoltuk. A hatóanyag-segédanyag keverékeket (A –D) eltérõ gyorsított öregedési körülmények közé helyeztük, amelyeket a 2. táblázatban adunk meg, 1 és 3 hét idõtartamra a HPLC-analízis elõtt. Azokat a vegyületeket, amelyek nem mutattak látható oxidatív instabilitást (1., 4. és 5. vegyület) kémiailag stabilnak találtuk szilárd dózisformában szokásosan alkalmazott segédanyagok jelenlétében.
1
HU 005 800 T2
2
1. táblázat A prototípus hatóanyag-segédanyag keverékek stabilitásának kiértékelése során alkalmazott szokásos segédanyagok, antioxidánsok jelenlétében vagy távollétében Komponens
Hatóanyag-segédanyag keverék (tömeg%) A
B
C
D
3. vegyület
12,9
12,9
12,9
12,9
Laktóz vizes
59,6
21,4
59,6
21,4
Mikrokristályos cellulóz
20,0
42,7
20,0
42,7
–
5,0
PVP
5,0
Elõzselatinált keményítõ
–
Crospovidone XL–10
2,0
–
Nátrium-keményítõ-glikolát
–
Magnézium-sztearát
0,5
Szilícium-dioxid
–
20,0
–
– 20,0
2,0
–
2,0
–
2,0
–
0,5
–
0,5
–
0,5
Nátrium-sztearil-fumarát
–
0,5
–
0,5
Antioxidáns
0,01
0,01
–
–
2. táblázat Hatóanyag-segédanyag keverékek stabilitásának vizsgálatára gyorsított öregítési körülmények között alkalmazott körülmények Körülmények
Idõ (hét) 0
5 °C (zárt)
1 3
25 °C/60% RH (zárt)
1 3
40 °C/75% RH–O2 (zárt)
1 3
25 °C–O2–HIL/uv (zárt)
1 3
III. A C) vizsgálat protokollja: citogenetikai vizsgálat kínai hörcsög petefészek sejtekben Nagyon jó lenne korán azonosítani azokat a potenciális terápiás szereket, amelyek emberben onkogének lehetnek. Az in vitro klasztogenicitási vizsgálatok egy vegyület potenciális karcinogenitásának korai felismerését biztosítják1. A következõ protokollt alkalmaztuk a terápiás szempontból érdekes vegyületek in vitro klasztogén hatásának elõrejelzésére. A klasztogén hatás elõrejelzésére meghatároztuk a vizsgált vegyületek strukturális kromoszómakárosodást indukáló hatását kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben. Ha a kromoszómakárosodás szignifikánsan nagyobb, mint a háttérszint, ez azt bizonyítja, hogy a vegyület klasztogén hatással rendelkezik. A kromoszómakárosodás szignifikánsan megnövekedett szintjének
kimutatását ebben a vizsgálatban a genetikai károso25 dás egy indikátorának tekintjük. A) A vizsgált vegyület hordozóanyaga és a kontrollvegyületek A hordozóanyag-kontroll a dimetil-szulfoxid 30 (DMSO). A pozitív kontrollok a mitomicin C 3 órás és 20 órás behatás esetén S9 aktiválás nélkül, és a ciklofoszfamid 3 órás behatás esetén S9 patkánymáj enzimekkel. Mind a mitomicin C¹t, mind a ciklofoszfamidot steril vízzel hígítottuk. 35 B) A vizsgált vegyület adagolása A koncentráció megválasztása Két törzsoldatot készítettünk DMSO-val a vizsgált vegyületbõl – az egyik magas koncentrációjú, a másik 40 alacsony koncentrációjú. A CHO sejtek kezelése után összegyûjtöttük a hordozóanyag-kontroll, az alacsony és a magas koncentrációjú oldatok aliquotjait, és ezután analizáltuk a vizsgált vegyület koncentrációjának meghatározására. Az alkalmazott koncentrációkat egy, 45 a vizsgálandó vegyülettel végzett nem GLP oldhatóság/elegyíthetõség/tartománykeresõ citotoxicitás (ATP) vizsgálat eredményei alapján választottuk meg. Miután a vizsgált vegyület oldhatóságának felsõ határát DMSO-ban meghatároztuk, ezt a DMSO-oldatot ad50 tuk a tenyészközeghez, hogy meghatározzuk a pH¹ra vagy ozmolalitásra kifejtett hatásokat. A vizsgált vegyületet tizenegy koncentrációban teszteltük a tartománykeresõ citotoxicitás vizsgálatban mind patkánymáj (S9) enzimek jelenlétében (3 óra), mind azok távollétében 55 (20 óra). A legmagasabb vizsgált koncentráció 10 mmol/l, 5000 mg/ml vagy az oldhatósági határ volt. Az oldhatóság/elegyíthetõség/tartománykeresõ citotoxicitás (ATP) vizsgálati eredmények alapján hat koncentrációt választottunk ki a teljes citogenetikai vizsgá60 lat céljára. 5
1
HU 005 800 T2
Vizsgált vegyület koncentrációi A vizsgált vegyület DMSO-val készült törzsoldatának koncentrációja a teljes vizsgálatban alkalmazandó legmagasabb vizsgált vegyület koncentráció 100-szorosa volt. Hat koncentrációban végeztük el a vizsgálatot. A tartománykeresõ vizsgálatban kapott citotoxicitás-dózis válasz határozta meg a sorozathígítási faktort
2
az öt alacsonyabb dózisra. Összesen 50 ml dózistérfogatot (törzsoldat plusz DMSO) adtunk 5 ml tenyésztõközeghez az összes kezelt csoportnál. 5
Kezelt csoport
Kísérlet tervezése Duplikát tenyészeteket alkalmazunk minden egyes kezelt csoportra. A kísérleti terv a következõ volt:
Lombikazonosító adatok 3 óra S9¹cel
3 óra S9 nélkül
20 óra S9 nélkül
Adagolt oldat koncentrációja (mg/ml)
Végsõ névleges koncentráció (mg/ml)
DMSO
1–2
17–18
33–34
–
–
Vizsgált vegyület A koncentrációja
3–4
19–20
35–36
–
–
Vizsgált vegyület B koncentrációja
5–6
21–22
37–38
–
–
Vizsgált vegyület C koncentrációja
7–8
23–24
39–40
–
–
Vizsgált vegyület D koncentrációja
9–10
25–26
41–42
–
–
Vizsgált vegyület E koncentrációja
11–12
27–28
43–44
–
–
Vizsgált vegyület F koncentrációja
13–14
29–30
45–46
–
–
–
31–32
–
0,01
0,1
3 óra S9¹cel
3 óra S9 nélkül
20 óra S9 nélkül
Adagolt oldat koncentrációja (mg/ml)
Végsõ névleges koncentráció (mg/ml)
–
–
47–48
0,005
0,05
15–16
–
–
1
10
Mitomicin C
Mitomicin C Ciklofoszfamid
D) Vizsgálati rendszer A CHO sejtvonal egy nõstény kínai hörcsög petefészek biopsziából származott. A vizsgálatban alkalmazott sejteket (CHO–WBL) eredetileg Dr. S. Wolff (University of California, San Francisco) laboratóriumából kaptuk. A sejteket ezután szubklónoztuk, hogy fenntartsuk a kariotípusos stabilitást. Ennek a sejtvonalnak az átlagos ciklusideje 12–14 óra, a modális kromoszómaszám 21. A sejteket rutinszerûen ellenõriztük kariotípusos stabilitás és a potenciális mikoplazmaszennyezõdés szempontjából. E) Azonosítás A vizsgálatban alkalmazott összes tenyésztõlombikot és/vagy csövet számokkal jelöltük. A sejtek összegyûjtésére, a hipotóniás kezelésre és a fixálásra alkalmazott centrifugacsöveket ugyanazzal a számmal jelöltük, mint a megfelelõ lombikot. Ezenkívül, a fixált sejtekkel készített mikroszkóplemezek ugyanazt a számot viselték, mint a centrifugacsõ. A mikroszkóplemezek kódolva voltak egy független megfigyelõ által, a kromoszómaaberrációk torzítatlan citogenetikai analízise céljából. A kódolt lemezekhez permanens jelöléseket rögzítettünk.
F) Kísérleti módszer A kromoszómaaberrációk vizsgálatát standard módszerek2–6 alkalmazásával hajtottuk végre oly mó40 don, hogy a CHO sejteket a vizsgált vegyület legalább négy koncentrációjával, valamint pozitív és hordozóanyag-kontrollokkal kezeltük. A nem aktivált vizsgálati rendszerben a kezelés közelítõleg 3 óra és 20 óra, és az S9¹cel aktivált vizsgálati rendszerben a kezelés 45 3 óra volt7, 8. S9 metabolikus aktiválás Az exogén metabolikus aktiváló (S9) rendszer Aroclor 1254-indukálta patkánymáj S9 (posztmitokondriális) 50 frakcióból, valamint sókból és kofaktorokból állt. Az S9, a sók és a kofaktorok végkoncentrációja az exogén metabolikus aktiváló (S9) rendszerben a következõ volt: 10 ml/ml (1 térfogat%) Aroclor 1254 által indukált patkánymáj S9 (posztmitokondriális) frakció, 2,5 mmol/l 55 MgCl2·6H2O, 1,25 mmol/l glükóz-6-foszfát, 10,3 mmol/l KCl, 1 mmol/l NADP és 12,8 mmol/l Na2HPO4. Célsejtek preparálása Az exponenciálisan szaporodó CHO–WBL sejteket 60 mintegy 0,5×106 sejt/25 cm2 lombik sûrûségben oltot6
1
HU 005 800 T2
tuk le 10% magzati marharészummal, 2 mmol/l L¹glutaminnal, 100 egység/ml penicillin G¹vel és 100 mg/ml streptomicinnel kiegészített McCoy-féle 5A közegbe. A lombikokat mintegy 37 °C¹on, nedvesített atmoszférában mintegy 5% CO2-tartalmú levegõben 16–24 órán keresztül inkubáltuk. Célsejtek kezelése A tenyésztés megkezdése utáni napon a tenyésztõközeget friss közeggel helyettesítettük. A metabolikus aktiválás nélküli 3 órás és 20 órás kezelésekhez az adagolást a fentiekben leírt komplett közegben végeztük. Az S9 metabolikus aktiválás melletti 3 órás kezelésekhez a közeg a fentiekben ismertetettel azonos volt, azzal az eltéréssel, hogy hiányzott belõle a magzati marhaszérum, és S9¹et, sókat és kofaktorokat tartalmazott. A metabolikus aktiválással vagy anélkül végzett 3 órás kezelés után a közeget leszívtuk, a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, újra komplett közegbe helyeztük, és visszahelyeztük az inkubátorba. Metafázis sejtek összegyûjtése A kezdeti kezeléstõl számítva egyetlen idõpontban végeztük a begyûjtést, mintegy 20 óra elteltével. Ez a begyûjtési idõ egy mintegy 13 órás sejtciklus 1,5-szeresének felel meg8. A tenyészetekhez Colcemid®¹et adtunk 0,1 mg/ml végkoncentrációban a sejtek összegyûjtése elõtt. A sejteket tripszinezéssel választottuk le, centrifugálással gyûjtöttük össze, és egy aliquotot kivettünk a sejtszám és az életképes sejtek százalékának meghatározására. A sejtszámot és a százalékos életképességet alkalmaztuk a sejtszaporodás gátlásának meghatározására a hordozóanyag-kontrollhoz viszonyítva (citotoxicitás). A maradék sejteket 0,075 mol/l KCl-lel duzzasztottuk, háromszor mostuk fixálóval (metanol/jégecet, 3:1 v/v), lekupakoltuk, és egy éjszakán vagy ennél hosszabb idõn át mintegy 2–8 °C¹on tároltuk. A lemezek elkészítéséhez a sejteket centrifugálással összegyûjtöttük, és friss fixálóban újraszuszpendáltuk. A fixált sejtek szuszpenzióját üveg mikroszkóplemezekre felvittük, és levegõn szárítottuk. A lemezeket Giemsa-val megfestettük, és permanensen rögzítettük. G) Kromoszómaaberrációk analízise A megfigyelt citotoxicitás alapján legalább három koncentrációt választottunk a kromószaaberrációk analízisére. Általában azokat a koncentrációkat, amelyek a sejtszámot vagy a mitotikus indexet >50%-kal csökkentik, nem értékeltük ki kromoszómaaberrációk szempontjából, mivel bizonyított, hogy a túlzott citotoxicitás olyan kromoszómaaberrációkat indukálhat, amelyek a vizsgálandó vegyület közvetlen klasztogén hatásával nincsenek kapcsolatban9, 10. Minden egyes lemezrõl legalább 500 sejtet és lombikonként két lemezt értékeltünk ki a mitózisban lévõ sejtek gyakoriságára (mitotikus index), és minimálisan 100 mitotikus sejtet értékeltünk ki a numerikus aberrációk (poliploiditás és endoreduplikáció) gyakorisága szempontjából. Minden egyes duplikát lombikból, különálló lemezekrõl 50 me-
5
2
tafázist pontoztunk szerkezeti kromoszómaaberrációkra két független kiértékeléssel. Csak a 21±2 kromoszómát tartalmazó metafázisokat értékeltük ki. A két független kiértékelést kombinálva 100 metafázis/lombik és 200 metafázis/koncentráció eredményt kaptunk a szerkezeti kromoszómaaberrációhoz. Feljegyeztük, ha ezeket a számokat nem tudtuk elérni a citotoxicitás vagy az elsõ 25 metafázis/lemez esetén észlelt >50% aberráns metafázis miatt.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 7
H) Statisztikai adat analízis A teljes sejtpopulációban megvizsgáltuk a talált aberrációk számát és típusát, és a szerkezetileg károsodott sejtek százalékos arányát (százalék aberráns sejt), és kiszámítottuk a sejtenkénti átlagos aberrációkat, és ezt minden egyes kezelt csoportra megadtuk. Az adatok között prezentáltuk a kromatid és izokromatid léziókat (gap), azonban ezeket nem számítottuk be az egy vagy több aberrációt mutató sejtek összes százalékába, vagy a sejtenkénti szerkezeti aberrációk gyakoriságába. A (strukturálisan vagy numerikusan) aberráns sejtek gyakoriságának statisztikai analízisét Fisher-féle egzakt próba alkalmazásával hajtottuk végre. A Fisherpróbát alkalmaztuk az aberráns sejtek gyakoriságának páronkénti összehasonlítására minden egyes kezelt csoportban az oldószeres kontrollhoz viszonyítva. Egy pozitív-Fisher próba esetében bármely vizsgált vegyület dózis szinten a Cochran-Armitage próbát alkalmaztuk a dózishatás meghatározására. Az adatok értelmezésének megkönnyítésére a vizsgált vegyületet akkor tekintettük pozitív választ kiváltónak, ha az aberrációt mutató sejtek százalékos értéke dózisfüggõ módon növekedett, egy vagy több koncentrációval statisztikusan szignifikáns mértékben (p<0,05). Azonban azokat az értékeket, amelyek statisztikusan szignifikánsak voltak, azonban nem haladták meg az ismert negatív vagy hordozókontrollok tartományát, nem tekintettük biológiailag szignifikánsnak. Azokat a vizsgált vegyületeket, amelyek nem mutattak statisztikusan szignifikáns növekedést az aberrációkban, negatívnak tekintettük. I) Elfogadható vizsgálat kritériumai A teljes kromoszómaaberráció-vizsgálatot akkor tekintettük elfogadhatónak, ha a következõ kritériumok teljesültek: 1) A pozitív kontrolltenyészetekben a kromoszómaaberráció gyakoriságának olyan növekedést kell mutatnia, amely statisztikusan szignifikáns 5% szinten. 2) A károsodott metafázisok százalékos értékének a hordozóanyag-kontrolltenyészetekben nem szabad meghaladnia a 6%¹ot (átlagosan). 3) A vizsgált vegyületnek legalább a legmagasabb dózisban valamilyen citotoxicitást (azaz csökkent sejtszámot vagy mitotikus indexet) kell mutatnia. Ha citotoxitást nem észleltünk a legmagasabb koncentrációnál, azonban a vizsgált anyag vagy az oldhatóság határán vagy dóziskoncentrációjának határán (azaz 10 mmol/l vagy 5000 mg/ml), vagy térfogati határán (20%) volt, a vizsgálatot elfogadhatónak tekintettük.
1
HU 005 800 T2
J) Pozitív válasz kritériumai A vizsgált vegyület válaszát akkor tekintettük pozitívnak, ha a következõ kritériumok teljesültek: 1) Statisztikusan szignifikáns (p<5%) növekedés az aberráns sejtek százalékában Fisher-féle egzakt próba alkalmazásával. 2) Statisztikusan szignifikáns (p<5%) növekedést mutattunk ki a kromoszómaaberráció gyakoriságában a dózisválasz meghatározására alkalmazott Cochran-Armitage próbában. 3) A károsodott metafázis sejtek átlagos százaléka meghaladta az ismert negatív kontrollszintek felsõ határát (azaz átlag+2 standard deviáció a hordozóval kezelt csoportra).
5
10
15 Irodalmi hivatkozások a citogenetikai vizsgálatokra vonatkozó részben 1. Snyder RD, and Green JW. A review of the genotoxicity of marketed pharmaceuticals, Mutation Research. 488, 151–169 (2001). 2. Evans HJ. Cytological methods for detecting chemical mutagens. In: A. Hollaender editor. Chemical mutagens, principals and methods for their detection. New York and London, Plenum Press. 4. kötet, 1–29 (1976). 3. Preston RJ, Au W, Bender MA, Brewen JG, Carrano AV, Heddle JA, McFee AF, Wolff S and Wassom JS. Mammalian in¹vivo and in¹vitro cytogenetic assays: a report of the U. S. EPA’s Gene-Tox Program. Mutation Res. 87, 143–188 (1981). 4. Galloway SM, Bloom AD, Resnick M, Margolin BH, Nakamura F, Archer P, and Zeiger E. Development of a standard protocol for in vitro cytogenetic testing in Chinese hamster ovary cells: Comparison of 22 compounds in two laboratories. Environ Mutagen. 7, 1–51 (1985). 5. Scott, D., Danford, N., Dean, B., Kirkland, D., and Richardson, C. In¹vitro chromosome aberration assays. In B. J. Dean (ed.), Report of the UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, The United Kingdom Environmental Mutagen Society., 41–64 (1983). 6. OECD. Guidelines for testing chemicals: No. 473, In vitro mammalian chromosome aberration test: Organization for Economic Cooperation and Development, Paris, Adopted 21st July, 1997. 7. Swierenga SHH, Heddle JA, Sigal EA, Gilman JPW, Brillinger RL, Douglas GR and Nestmann ER. Recommended protocols based on a survey of current practice in genotoxicity testing laboratories, IV. Chromosome aberration and sister-chromatid exchange in Chinese hamster ovary, V79 Chinese lung and human lymphocyte cultures. Mutation Research. 246, 301–322 (1991). 8. Galloway SM, Aardema MJ, Ishidate Jr. M, Ivett JL, Kirkland DJ, Morita T, Mosesso P, and Sofuni T. Report from working group on in vitro test for chromosome aberrations. Mutation Research. 312, 241–261 (1994).
20
25
30
35
40
45
50
55
60 8
2
9. Hillard CA, Armstrong MJ, Bradt CI, Hill RB, Greenwood SK, and Galloway SM. Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons. Environ Mol Mutagen. 31, 16–326 (1998). 10. Galloway SM. Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay. Environ Mol Mutagen. 15, 191–201 (2000). A leírásban a következõ rövidítéseket alkalmaztuk: Me=metil Et=etil TBS=terc-butil-dimetil-szilil THF=tetrahidrofurán Et2O=dietil-éter EtOAc=etil-acetát DMF=dimetil-formamid MeOH=metanol EtOH=etanol DMAP=4-dimetil-amino-piridin n-BuLi=n-butil-lítium min=perc h vagy hr=óra vagy órák L=liter mL=milliliter g=gramm mg=milligramm mol=mól mmol=millimól meq=milliekvivalens sat vagy sat’d=telített aq.=vizes TLC=vékonyréteg-kromatográfia NMR=magmágneses rezonancia HPLC=nagy teljesítményû folyadékkromatográfia LC/MS=nagy teljesítményû folyadékkromatográfia/tömegspektrometria MS vagy Mass Spec=tömegspektrometria A találmány leírásában alkalmazott különféle kifejezések definícióit az alábbiakban adjuk meg. Ezek a definíciók alkalmazandók a leírásban alkalmazott kifejezésekre (egyéb korlátozás hiányában speciális esetekben) akár önmagukban, akár nagyobb csoport részeként fordulnak elõ. A találmány értelmében prodrognak tekintünk bármely vegyületet, amely in vivo biológiailag aktív vegyületté [azaz (I) képletû vegyületté] alakítható át. A szakirodalomban a prodrogok különféle formái ismertek. A prodrogok és prodrogszármazékok kimerítõ leírását a következõ helyeken találhatjuk: a) The Practice of Medicinal Chemistry, Camille G. Wermuth és munkatársai, 31. fejezet (Academic Press, 1996); b) Design of Prodrugs, szerk. H. Bundgaard, (Elsevier, 1985); és c) A Textbook of Drug Design and Development, szerk. P. Krogsgaard-Larson és H. Bundgaard, 5. fejezet, 113–191. oldal (Harwood Academic Publishers, 1991). A találmány szerinti terápiás anyag beadása a találmány szerinti anyag terápiásan hatékony mennyiségének beadását jelenti. A „terápiásan hatékony mennyi-
1
HU 005 800 T2
ség” kifejezés a leírásban a terápiás anyag azon mennyiségét jelenti, amely a találmány szerinti készítmény beadásával kezelhetõ állapot kezelésére vagy megelõzésére elegendõ. Ez a mennyiség egy olyan mennyiség, amely kimutatható terápiás vagy preventív vagy javulást elõidézõ hatás kiváltására elegendõ. Ez a hatás magában foglalhatja például a leírásban felsorolt állapotok kezelését vagy megelõzését. Az egyed esetében alkalmazott pontos, hatékony mennyiség az egyed méretétõl és egészségi állapotától, a kezelendõ állapot természetétõl és mértékétõl, a kezelést végzõ
2
orvos elõírásaitól és a kezelésre kiválasztott gyógyszerektõl vagy gyógyszer-kombinációktól függ. Ezért nem hasznos a pontos, hatékony mennyiséget elõre meghatározni. 5 A találmány szerinti (I) képletû vegyületet az alábbi 1. reakcióvázlaton bemutatott módon, valamint a kapcsolódó szabadalmi publikációkban ismertetett eljárások szerint állíthatjuk elõ, amelyeket szakember aránytalanul sok kísérletezés nélkül alkalmazhat a találmány szerinti 10 vegyületek elõállítására. A fenti reakciókhoz szükséges reagensek és eljárások a kiviteli példákban találhatók.
1. reakcióvázlat
Ia
II III
I
IV Az (I) képletû vegyületet az 1. reakcióvázlat értelmében úgy állíthatjuk elõ, hogy a (II) képletû vegyületet
gyületet Ac 2 O-val kezeljük oldószerben, például CH2Cl2-ben, amely piridint és egy katalizátort, például dimetil-amino-piridint (DMAP) tartalmaz. 45
50 II bázissal, például LiOH-val vagy NaOH-val kezeljük oldószerben, például 1:2:3 arányú H 2 O/THF/MeOH elegyben, vagy vizes MeOH-ban vagy vizes EtOH-ban. A (II) képletû vegyület megfelelõ eszközt jelent a nyers (Ia) képletû vegyület tisztítására, amelyet alfa- és béta-anomerek keverékeként kaptunk. A (II) képletû vegyületet úgy állíthatjuk elõ, hogy az (Ia) képletû ve-
Ia 55 Az (Ia) képletû vegyületet úgy állíthatjuk elõ, hogy a (III) képletû vegyületet redukálószerrel, például Et3SiHval redukáljuk oldószerben, például 1:1 arányú CH2Cl2/MeCN elegyben –10 °C¹on Lewis-sav katalizá60 tor, például BF3-Et2O jelenlétében. 9
1
HU 005 800 T2
2
5
III 10 A (II) képletû vegyületet alternatív módon (III) képletû vegyületbõl is elõállíthatjuk oly módon, hogy a (III) képletû vegyületet elõször Ac2O-val acilezzük oldószerben, például toluolban vagy CH2Cl2-ben, amely bázist, például Hunig-bázist vagy Et3N¹t és katalizátort, például DMAP¹t tartalmaz, ily módon (IV) képletû vegyületet kapunk.
IV A (IV) képletû vegyületet ezután (II) képletû vegyületté alakíthatjuk oly módon, hogy 20 °C¹on redukáló15 szerrel, például Et3SiH-val kezeljük oldószerben, például MeCN-ben, amely 1 ekvivalens H2O¹t és Lewissav katalizátort, például BF3Et2O¹t tartalmaz.
2. reakcióvázlat
VIII
VII
V
VI III A (III) képletû vegyületet a 2. reakcióvázlatban ismertetett módon állíthatjuk elõ úgy, hogy egy (V) képletû aril-lítium hideg, THF-fel készült oldatát egy (VI) képletû perszililezett glükonolaktonhoz adjuk oldószerben, például toluolban, –75 °C¹on. Ezt követõen 30 perc elteltével hozzáadjuk egy protikus sav, például metánszulfonsav (MSA) metanolos oldatát, és az oldatot 20 °C¹on addig keverjük, amíg a köztes laktol teljes mértékben (III) képletû vegyületté alakul át.
A (VI) képletû vegyületet úgy állíthatjuk elõ, hogy a kereskedelmileg hozzáférhetõ D¹glükonolaktont szilile40 zõszerrel, például trimetil-szilil-kloriddal kezeljük oldószerben, például THF-ben, amely bázist, például N¹metil-morfolint tartalmaz. Az (V) képletû vegyületet úgy állíthatjuk elõ, hogy a (VII) képletû vegyületet egy alkil-lítiummal, például 45 n¹BuLi-vel vagy t¹BuLi-vel kezeljük oldószerben, például THF-ben –75 °C¹on.
50
V VII 55
VI
A (VII) képletû vegyületet egyszerûen elõállíthatjuk oly módon, hogy a (VIII) képletû vegyületet redukálószerrel, például Et3SiH-val kezeljük oldószerben, például TFA-ban 60 °C¹on Lewis-sav katalizátor, például 60 BF3·Et2O vagy CF3SO3H jelenlétében. 10
1
HU 005 800 T2
5 VIII A (VIII) képletû vegyületet úgy állíthatjuk elõ, hogy a kereskedelmileg hozzáférhetõ etil-benzolt 2¹klór-5bróm-benzoil-kloriddal Friedel-Craft acilezésnek vetjük alá oldószerben, például etil-benzolban, amely egy ekvivalens Lewis-savat, például AlCl3¹at vagy AlBr3¹at tartalmaz. A 2¹klór-5-bróm-benzoil-kloridot egyszerûen elõállíthatjuk a kereskedelmileg beszerezhetõ 2¹klór-5bróm-benzoesavból, oxalil-kloriddal történõ kezeléssel oldószerben, például CH2Cl2-ben, amely katalitikus mennyiségû DMF¹et tartalmaz. Alkalmazások és kombinációk A) Alkalmazások A találmány szerinti vegyület emlõsök belében és veséjében található, nátriumfüggõ glükóztranszportereket gátló aktivitást mutat. Elõnyösen a találmány szerinti vegyület a renális SGLT2 aktivitás szelektív inhibitora, és ezért SGLT2 aktivitással kapcsolatos betegségek vagy rendellenességek kezelésében alkalmazható. Ennek megfelelõen a találmány szerinti vegyület emlõsöknek, elõnyösen embernek különféle állapotok és rendellenességek kezelésére adagolható, többek között – a korlátozás szándéka nélkül – a cukorbetegség (beleértve az l¹es típusú és II¹es típusú cukorbetegséget, a csökkent glükóztoleranciát, az inzulinrezisztenciát és a diabetikus szövõdményeket, például nefropátiát, retinopátiát, neuropátiát és hályogokat), hiperglikémia, hiperinzulinémia, hiperkoleszterinémia, szabad zsírsavak vagy glicerin megnövekedett vérszintjei, hiperlipidémia, hipertrigliceridémia, elhízás, sebgyógyulás, szöveti ischaemia, atherosclerosis és magas vérnyomás kezelésére, vagy fellépésének vagy kifejlõdésének késleltetésére. Ezenkívül, az összefoglalóan „X¹szindróma”-ként vagy „metabolikus szindróma”-ként említett állapotok, betegségek és károsodások is kezelhetõk a találmány szerinti vegyület alkalmazásával, amelyek részletezését lásd Johannsson J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 727–34 (1997). B) Kombinációk A jelen találmány tárgykörébe tartoznak a gyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagként terápiásan hatékony mennyiségben (I) képletû vegyületet tartalmaznak önmagában, vagy gyógyszerészeti hordozóval vagy hígítóanyaggal kombinációban. Kívánt esetben a találmány szerinti vegyület alkalmazható önálló kezelésként, vagy alkalmazható kombinációban egy vagy több egyéb terápiás anyaggal. Az egyéb „terápiás anyag(ok)”, amelyek a találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazhatók, a fent említett rendellenességek kezelésére alkal-
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 11
2
mas ismert terápiás anyagok: antidiabetikus hatóanyagok; antihiperglikémiás hatóanyagok; hipolipidémiás/lipidcsökkentõ hatóanyagok; elhízás elleni hatóanyagok; vérnyomáscsökkentõ hatóanyagok és étvágycsökkentõk csoportjából választhatók. A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható megfelelõ antidiabetikus hatóanyagokra példaként említhetõk a biguanidek (például metformin vagy fenformin), a glükozidáz inhibitorok (például akarbóz vagy miglitol), inzulinok (például inzulin szekretagógok vagy inzulin szenzitívizálók), meglitinidek (például repaglinid), szulfonil-karbamidok (például glimepirid, gliburid, gliklazid, klór-propamid és glipizid), biguanid/gliburid kombinációk (például Glucovance®), tiazolidindionok (például troglitazon, roziglitazon és pioglitazon), PPAR-alfa agonisták, PPAR-gamma agonisták, PPARalfa/gamma kettõs agonisták, glikogén-foszforiláz inhibitorok, zsírsavat kötõ protein (aP2) inhibitorai, glükagonszerû peptid¹1 (GLP¹1) vagy a GLP¹1 receptor egyéb agonistái, és dipeptidil-peptidáz IV (DPP4) inhibitorok. Úgy véljük, hogy az (I) képletû vegyület egy vagy több egyéb antidiabetikus hatóanyaggal kombinációban való alkalmazása nagyobb vércukorszint-csökkentõ hatást eredményez, mint amely e gyógyszerek külön-külön történõ alkalmazásától várható, illetve mint e gyógyszerek kombinált additív vércukorszint-csökkentõ hatása. Az egyéb alkalmas tiazolidindionok közé tartozik az MCC–555 (a Mitsubishi vegyülete; lásd 5594016 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), a GL–262570 (a Glaxo-Welcome vegyülete), az englitazon (CP–68722, Pfizer), vagy a darglitazon (CP–86325, Pfizer), izaglitazon (MIT/J&J), JTT–501 (JPNT/P&U), L–895645 (Merck), R–119702 (Sankyo/WL), NN–2344 (Dr. Reddy/NN) vagy YM–440 (Yamanouchi). A PPAR-alfa agonisták, PPAR-gamma agonisták és PPAR-alfa/gamma kettõs agonisták példái közé tartoznak a muraglitizar, perligitazar, AR–HO39242 (Astra/Zeneca), GW–409544 (Glaxo-Wellcome), GW–501516 (Glaxo-Wellcome), KRP297 (Kyorin Merck), Valamint a Murakami és munkatársai által leírt [„A Novel Insulin Sensitizer Acts As a Coligand for Peroxisome Proliferation – Activated Receptor Alpha (PPAR alpha) and PPAR gamma. Effect on PPAR alpha Activation on Abnormal Lipid Metabolism in Liver of Zucker Fatty Rats”, Diabetes 47, 1841–1847 (1998)] és a WO 01/21602 számú szabadalmi publikációban és az US 6653314 számú szabadalmi iratban ismertetett vegyületek, amelynek tartalma referenciaként leírásunk részét képezi, az ott kinyilvánított dózisok alkalmazásával, és az ott elõnyösként említett vegyületek elõnyösek a találmány szerinti alkalmazásra is. Megfelelõ aP2 inhibitorok közé tartoznak az US 09/391053 számon 1999. szeptember 7¹én benyújtott és az US 09/519079 számon 2000. március 6¹án benyújtott szabadalmi bejelentésekben ismertetettek, az itt megadott dózisok alkalmazásával. Megfelelõ DPP4 inhibitorok közé tartoznak a WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/67279 (PRO-
1
HU 005 800 T2
BIODRUG), WO 99/67278 (PROBIODRUG), WO 99/61431 (PROBIODRUG) számú dokumentumokban feltártak, valamint az NVP–DPP728A (1¹[[[2¹[(5¹ciano-piridin-2¹il)-amino]-etil]-amino]-acetil]2-ciano¹(S)-pirrolidin) (Novartis) [melynek leírását lásd Hughes és munkatársai, Biochemistry 38 (36), 11597–11603 (1999)], a TSL–225 (triptofil-1,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karbonsav [leírását lásd Yamada és munkatársai, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 8 (1998) 1537–1540], a 2¹ciano-pirrolidinek és 4¹ciano-pirrolidinek [leírásukat lásd Ashworth és munkatársai, Bioorg. & Med. Chem. Lett., 6 (22), 1163–1166. oldal és 2745–2748. oldal (1996)], az US 10/899641, WO 01/868603 és US 6395767 számú dokumentumokban ismertetett vegyületek, a fenti hivatkozásokban megadott dózisokban alkalmazva. Az egyéb alkalmas meglitinidek közé tartozik a nateglinid (Novartis) vagy KAD1229 (PF/Kissei). A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható, megfelelõ vércukorszint-csökkentõ hatóanyagok példái közé tartozik a glükagonszerû peptid¹1 (GLP¹1), mint például a GLP-1(1–36)-amid, GLP1(7–36)-amid, GLP-1(7–37) (lásd az US 5614492 számú szabadalmi leírást), valamint az exenatid (Amylin/Lilly), LY–315902 (Lilly), MK–0431 (Merck), liraglutide (NovoNordisk), ZP–10 (Zealand Pharmaceuticals A/S), CJC–1131 (Conjuchem Inc.) és a WO 03/033671 számon publikált szabadalmi iratban ismertetett vegyületek. A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható, megfelelõ hipolipidémiás/lipidcsökkentõ hatóanyagok példái közé tartoznak az MTP inhibitorok, a HMG-CoA reduktáz inhibitorok, a szkvalén szintetáz inhibitorok, a fibrinsavszármazékok, ACAT inhibitorok, lipoxigenáz inhibitorok, koleszterin abszorpció inhibitorok, csípõbéli Na+/epesav kotranszporter inhibitorok, az LDL receptor aktiváló szabályozói, epesavmegkötõk, koleszterin-észter transzfer protein [például CETP inhibitorok, például CP–529414 (Pfizer) és JTT–705 (Akros Pharma)], PPAR agonisták (lásd fentiekben) és/vagy nikotinsav és származékai. Az MTP inhibitorok, amelyek a fentiekben megadott módon alkalmazhatók, például az US 5595872, US 5739135, US 5712279, US 5760246, US 5827875, US 5885983 és US 5962440 számú szabadalmi iratokban ismertetett vegyületek. Az (I) képletû vegyülettel kombinációban alkalmazható HMG-CoA reduktáz inhibitorok közé tartoznak a mevastatin és rokon vegyületek, amelyeket az US 3983140 számú szabadalmi iratban ismertetnek, a lovastatin (mevinolin) és rokon vegyületek, amelyeket az US 4231938 számú szabadalmi iratban ismertetnek, a pravastatin és rokon vegyületek, például az US 4346227 számú szabadalmi iratban leírtak, a simvastatin és rokon vegyületek, amelyeket az US 4448784 és US 4450171 számú szabadalmi iratokban ismertetnek. Az itt alkalmazható egyéb HMG-CoA reduktáz inhibitorok közé tartoznak – a korlátozás szándéka nélkül – a fluvastatin, amelyet az US 5354772 számú szabadalmi iratban, a cerivastatin,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 12
2
amelyet az US 5006530 és 5177080 számú szabadalmi iratokban, az atorvastatin, amelyet az US 4681893, 5273995, 5385929 és 5686104 számú szabadalmi iratokban ismertetnek, az atavastatin [Nissan/Sankyo-féle nisvastatin (NK–104)], amelyet az US 5011930 számú szabadalmi iratban ismertetnek, a visastatin [ShionogiAstra/Zeneca (ZD–4522)], amelyet az US 5260440 számú szabadalmi iratban ismertetnek és a rokon statinvegyületek, amelyeket az US 5753675 számú szabadalmi iratban tártak fel, a mevalonolakton-származékok pirazolanalógjai, amelyeket az US 4613610 számú szabadalmi iratban ismertetnek, a mevalonolakton-származékok indénanalógjai, amelyeket a WO 86/03488 számú PCT publikációban ismertetnek, a 6¹[2¹(szubsztituált pirrol-1¹il)-alkil]-pirán-2-onok és származékaik, amelyeket az US 4647576 számú szabadalmi iratban ismertetnek, a Searle-féle SC–45355 (egy 3¹szubsztituált pentándisav-származék)-diklór-acetát, a mevalonolakton imidazolanalógjai, amelyeket a WO 86/07054 számú PCT közzétételi iratban ismertetnek, a 3¹karboxi-2-hidroxi-propán-foszfonsav-származékok, amelyeket a 2596393 számú francia szabadalmi leírásban tártak fel, a 2,3-diszubsztituált pirrol¹, furán- és tiofénszármazékok, amelyeket az EP 0221025 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetnek, a mevalonolakton naftilanalógjai, amelyeket az US 4686237 számú szabadalmi iratban tártak fel, az oktahidro-naftalinok, amelyeket az US 4499289 számú szabadalmi irat ismertet, a mevinolin (lovastatin) ketoanalógjai, amelyeket az EP 0142146 A2 számú szabadalmi bejelentésben ismertetnek és kinolin- és piridinszármazékok, amelyeket az US 5506219 és 5691322 számú szabadalmi iratokban ismertetnek. Elõnyös lipidcsökkentõ hatóanyagok a pravastatin, lovastatin, simvastatin, atorvastatin, fluvastatin, cerivastatin, atavastatin és a ZD–4522. Ezenkívül, HMG-CoA reduktáz inhibitor hatású foszfinsavvegyületek, például a GB 2205837 számú dokumentumban ismertetettek is megfelelnek a találmány szerinti vegyülettel kombinációban való alkalmazásra. A találmány céljaira elõnyösen alkalmazható szkvalén szintetáz inhibitorok közé tartoznak többek között az US 5712396 számú szabadalmi iratban feltárt, illetve a Biller és munkatársai [J. Med. Chem., Vol. 31, No. 10, 1869–1871. oldal (1988)] által leírt a¹foszfono-szulfonátok, ideértve az izoprenoid (foszfinil-metil)-foszfonátokat, valamint az egyéb ismert szkvalén szintetáz inhibitorok, mint például a következõ forrásokban leírtak: US 4871721 és 4924024 számú szabadalmi iratok, és Biller, S. A., Neuenschwander, K., Ponpipom, M. M., és Poulter, C. D., Current Pharmaceutical Design, 2, 1–40 (1996). Ezenkívül, a találmány céljaira alkalmazható egyéb szkvalén szintetáz inhibitorok közé tartoznak a P. Ortiz de Montellano és munkatársai [J. Med. Chem., 20, 243–249 (1977)] által leírt terpenoid pirofoszfátok, a farnezil-difoszfát-analóg A és a preszkvalén-pirofoszfát- (PSQ¹PP) analógok, amelyeket Corey és Volante [J. Am. Chem. Soc., 98, 1291–1293 (1976)] ismertet-
1
HU 005 800 T2
nek, a McClard, R. W. és munkatársai [J. A. C. S., 109, 5544 (1987)] által leírt foszfinil-foszfonátok és a Capson, T. L. által leírt ciklopropánok [PhD disszertáció, 1987. június, Dept. Med. Chem. U of Utah, Kivonat, Tartalomjegyzék, 16., 17., 40–43., 48–51. oldal, Összefoglalás]. Az (I) képletû vegyülettel kombinációban alkalmazható fibrinsavszármazékok közé tartoznak a fenofibrát, gemfibrozil, klofibrát, bezafibrát, ciprofibrát, klinofibrát és hasonlók, a probukol és rokon vegyületek (lásd US 3674836 számú szabadalmi iratot), elõnyös a probukol és a gemfibrozil, az epesavmegkötõk, például cholesztiramin, kolestipol és DEAE-Sephadex (Secholex®, Policexide®), Valamint a lipostabil (Rhone-Poulenc), az Eisai E–5050 (egy N¹szubsztituált etanol-amin-származék), az imanixil (HOE–402), a tetrahidrolipsztatin (THL), az istigmastanil-foszforil-kolin (SPC, Roche), az amino-ciklodextrin (Tanabe Seiyoku), az Ajinomoto AJ–814 (azulénszármazék), a melinamid (Sumitomo), a Sandoz 58–035, az American Cyanamid CL–277,082 és CL–283,546 (diszubsztituált karbamidszármazékok), a nikotinsav, acipimox, acifran, neomicin, p¹amino-szalicilsav, aszpirin, poli(diallil-metil-amin)-származékok (lásd például az US 4759923 számú szabadalmi iratot), kvaterner amin poli(diallil-dimetil-ammóniumklorid) és ionének (például az US 4027009 számú szabadalmi iratban ismertetettek) és egyéb ismert szérumkoleszterin-szintet csökkentõ anyagok. Az (I) képletû vegyülettel kombinációban alkalmazható ACAT inhibitorok például azok, amelyeket a következõ irodalmi helyeken ismertetnek: Drugs of the Future 24, 9–15 (1999), (Avasimibe); „The ACAT inhibitor, C1–1011 is effective in the prevention and regression of aortic fatty streak area in hamsters”, Nicolosi és munkatársai, Atherosclerosis (Shannon, Irel). 137 (1), 77–85 (1998); „The pharmacological profie of FCE 27677: a novel ACAT inhibitor with potent hypolipidemic activity mediated by selective suppression of the hepatic secretion of ApoB 100-containing lipoprotein”, Ghiselli, Giancarlo, Cardiovasc. Drug Rev. 16 (1), 16–30 (1998); „RP 73163: a bioavailable alkylsulfinyldiphenylimidazole ACAT inhibitor”, Smith, C., és munkatársai, Bioorg. Med. Chem. Lett. 6 (1), 47–50 (1996); „ACAT inhibitors: physiologic mechanisms for hypolipidemic and anti-atherosclerotic activities in experimental animals”, Krause és munkatársai, Editor(s): Ruffolo, Robert R., Jr.; Hollinger, Mannfred A., Inflammation: Mediators Pathways, 173–98 (1995), Publisher: CRC, Boca Raton, Fia.; „ACAT inhibitors: potential anti-atherosclerotic agents”, Sliskovic és munkatársai, Curr. Med. Chem. 1 (3), 204–25 (1994); „Inhibitors of acylCoA:cholesterol O¹acyl transferase (ACAT) as hypocholesterolemic agents. 6. The first water-soluble ACAT inhibitor with lipid-regulating activity. Inhibitors of acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT). 7. Development of a series of substituted N¹phenyl-N’[(1¹phenylcyclopentyl)methyl]ureas with enhanced hypocholesterolemic activity”, Stout és munkatársai, Chemtracts: Org. Chem. 8 (6), 359–62 (1995), vagy TS–962 (Taisho Pharmaceutical Co. Ltd).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 13
2
Lipidcsökkentõ hatóanyagként egy LD2 receptor aktivitást serkentõ anyag is alkalmazható, mint például az MD–700 (Taisho Pharmaceutical Co. Ltd) és az LY295427 (Eli Lilly). A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható, alkalmas koleszterinabszorpció-gátló hatóanyag lehet például az SCH48461 (ScheringPlough), valamint az alábbi hivatkozásokban leírtak: Atherosclerosis 115, 45–63 (1995) és J. Med. Chem. 41, 973 (1998). A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható, megfelelõ csípõbéli Na+/epesav kotranszporter inhibitorokra példaként említhetõk a következõ hivatkozásban leírtak: Drugs of the Future, 24, 425–430 (1999). Az (I) képletû vegyülettel kombinációban alkalmazható lipoxigenáz inhibitorok közé tartoznak a 15¹lipoxigenáz (15¹LO) inhibitorok, például a WO 97/12615 számú közzétételi iratban leírt benzimidazolszármazékok, a WO 97/12613 számú közzétételi iratban leírt 15¹LO inhibitorok, a WO 96/38144 számú közzétételi iratban leírt izotiazolonok és a következõ irodalmi helyeken ismertetett 15¹LO inhibitorok: Sendobry és munkatársai: „Attenuation of diet-induced atherosclerosis in rabbits with a highly selective 15¹lipoxygenase inhibitor lacking significant antioxidant properties”, Brit. J. Pharmacology 120, 1199–1206 (1997); és Cornicelli és munkatársai, „15-Lipoxygenase and its Inhibition: A Novel Therapeutic Target for Vascular Disease”, Current Pharmaceutical Design 5, 11–20 (1999). A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható, megfelelõ vérnyomáscsökkentõ hatóanyagokra példaként említhetõk a béta-adrenerg blokkolók, a kalciumcsatorna blokkolók (L¹típusú és T¹típusú; például diltiazem, verapamil, nifedipin, amlodipin és mibefradil), diuretikumok (például klorotiazid, hidroklorotiazid, flumetiazid, hidroflumetiazid, bendroflumetiazid, metilklorotiazid, triklorometiazid, politiazid, benztiazid, etakrinsav trikrinafen, klórtalidon, furoszemid, muszolimin, bumetanid, triamtrenen, amilorid, spironolakton), renin inhibitorok, ACE inhibitorok (például, kaptopril, zofenopril, foszinopril, enalapril, ceranopril, cilazopril, delapril, pentopril, kvinapril, ramipril, lizinopril), AT¹1 receptor antagonisták (például losartan, irbesartan, valsartan), ET receptor antagonisták (például sitaxsentan, atrsentan és az US 5612359 és 6043265 számú szabadalmi iratokban leírt vegyületek), kettõs ET/AII antagonisták (például a WO 00/01389 számú szabadalmi publikációban leírt vegyületek), a semleges endopeptidáz (NEP) inhibitorok, vazopeptidáz inhibitorok (kettõs NEP-ACE inhibitorok) (például omapatrilat és gemopatrilat) és a nitrátok. A találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazható elhízás elleni hatóanyagok példái közé tartoznak a béta¹3 adrenerg agonisták, a lipáz inhibitorok, a szerotonin (és dopamin) újrafelvétel inhibitorok, a pajzsmirigy receptor-béta hatóanyagok, az 5HT2C agonisták (például Arena APD–356); az MCHR1 antagonisták, például Synaptic SNAP–7941 és Takeda T¹226926, a melanokortin receptor (MS4R) agonisták,
1
HU 005 800 T2
a melaninkoncentráló hormon receptor (MCHR) antagonisták (például Synaptic SNAP–7941 és Takeda T–226926), a galanin receptor módosítók, orexin antagonisták, CCK agonisták, NPY1 és NPY5 antagonisták, NPY2 és NPY4 módosítók, kortikotropin felszabadító faktor agonisták, hisztamin receptor¹3 (H3) módosítók, 11¹béta-HSD¹1 inhibitorok, adinopektin receptor módosítók, monoamin újrafelvétel inhibitorok vagy felszabadító anyagok, ciliáris neurotróf faktor (CNTF, például AXOKINE®, Regeneron), a BDNF (agyból származó neurotróf faktor), leptin és leptin receptor módosítók, kannabinoid¹1 receptor antagonisták [például SR–141716 (Sanofi) vagy SLV–319 (Solvay)] és/vagy anorektikumok. A találmány szerinti vegyülettel adott esetben kombinációban alkalmazható béta¹3 adrenerg agonisták közé tartozik az AJ9677 (Takeda/Dainippon), az L750355 (Merck) vagy a CP331648 (Pfizer) vagy az US 5541204, 5770615, 5491134, 5776983 és 5488064 számú szabadalmi iratokban leírt egyéb ismert béta¹3 agonisták. A találmány szerinti vegyülettel adott esetben kombinációban alkalmazható lipáz inhibitorok közé tartozik az orlistat vagy ATL–962 (Alizyme). A találmány szerinti vegyülettel adott esetben kombinációban alkalmazható szerotonin (és dopamin) újrafelvétel gátló (vagy szerotonin receptor agonista) például a BVT–933 (Biovitrum), sibutramin, topiramát (Johnson & Johnson) vagy axokine (Regeneron) lehet. A találmány szerinti vegyülettel adott esetben kombinációban alkalmazható pajzsmirigy receptor-béta vegyületek példái közé tartoznak a pajzsmirigy receptor ligandumok, például a WO 97/21993 (U. Cal SF), WO 99/00353 (KaroBio) és GB98/284425 (KaroBio) számú szabadalmi publikációkban leírtak. A találmány szerinti vegyülettel adott esetben kombinációban alkalmazható monoamin újrafelvétel inhibitorok közé tartozik a fenfluramin, dexfenfluramin, fluvoxamin, fluoxetin, paroxetin, sertralin, klorfentermin, cloforex, clortermin, picilorex, sibutramin, dexamfetamin, fentermin, fenil-propanol-amin vagy mazindol. A találmány szerinti vegyülettel adott esetben kombinációban alkalmazható anorektikumok közé tartozik a topiramát (Johnson & Johnson), a dexamfetamin, fentermin, fenil-propanol-amin vagy mazindol. A fenti egyéb terápiás hatóanyagokat, a találmány szerinti vegyülettel kombinációban alkalmazva például a Physician’s Desk Reference kézikönyvben megadott mennyiségekben, a fent felsorolt szabadalmi leírásokban megadott mennyiségekben vagy szakember által egyéb módon meghatározott mennyiségekben adagolhatjuk. Ha a találmány szerinti vegyületet egy vagy több terápiás hatóanyaggal kombinációban alkalmazzuk, akár egyidejûleg, akár egymás után, elõnyösek a következõ kombinációs arányok és dózistartományok: Ha a másik cukorbetegség elleni hatóanyag egy biguanid, az (I) képletû vegyületet a biguanidhoz viszonyítva mintegy 0,01:1–mintegy 100:1, elõnyösen mint-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 14
2
egy 0,1:1–mintegy 5:1 tömegarány-tartományban alkalmazzuk. Az (I) képletû vegyületet a glükozidáz inhibitorhoz viszonyítva mintegy 0,01:1–mintegy 100:1, elõnyösen mintegy 0,5:1 és mintegy 50:1 közötti tömegarány-tartományban alkalmazzuk. Az (I) képletû vegyületet a szulfonil-karbamidhoz viszonyítva mintegy 0,01:1–mintegy 100:1, elõnyösen mintegy 0,2:1–mintegy 10:1 tömegarány-tartományban alkalmazzuk. Az (I) képletû vegyületet a tiazolidindionhoz viszonyítva mintegy 0,01:1–mintegy 100:1, elõnyösen mintegy 0,2:1–mintegy 10:1 tömegarány-tartományban alkalmazzuk. Amennyiben jelen van, a tiazolidindion cukorbetegség elleni hatóanyagot 0,01–mintegy 2000 mg/nap mennyiségben alkalmazzuk, amelyet egyetlen vagy naponta 1–4 alkalommal, osztott dózisokban adagolhatunk. Adott esetben a szulfonil-karbamidot és a tiazolidindiont az (I) képletû vegyülettel egyetlen tablettába keverhetjük be kevesebb mint körülbelül 150 mg mennyiségekben. Amennyiben jelen van, a metformint vagy annak sóját mintegy 500–mintegy 2000 mg/nap mennyiségekben alkalmazhatjuk, amelyet adhatunk egyetlen dózisban vagy naponta 1–4 alkalommal, osztott dózisban. Amennyiben jelen vannak, a GLP¹1 peptideket orális bukkális készítményekben, nazálisan vagy parenterálisan adagolhatjuk az US 5346701 (TheraTech), 5614492 és 5631224 számú szabadalmi iratokban leírtak szerint. Az (I) képletû SGLT2 inhibitort a meglitinidhez, PPAR-gamma agonistához, PPAR-alfa/gamma kettõs agonistához, aP2 inhibitorhoz vagy DPP4 inhibitorhoz viszonyítva mintegy 0,01:1–mintegy 100:1, elõnyösen mintegy 0,2:1–mintegy 10:1 tömegarány tartományban alkalmazzuk. Az (I) képletû találmány szerinti vegyületet általában a lipidcsökkentõ hatóanyaghoz (amennyiben jelen van) viszonyítva mintegy 500:1–mintegy 1:500, elõnyösen mintegy 100:1–mintegy 1:100 tömegarány tartományban alkalmazzuk. Orális adagolás céljára kielégítõ eredmény érhetõ el az MTP inhibitor mintegy 0,01 mg/kg–mintegy 500 mg mennyiségben, elõnyösen körülbelül 0,1 mg–körülbelül 100 mg mennyiségben napi 1–4 alkalommal történõ alkalmazásával. Egy elõnyös orális dózisforma, például tabletta vagy kapszula, az MTP inhibitort mintegy 1 mg és mintegy 500 mg közötti mennyiségben, elõnyösen mintegy 2 mg és mintegy 400 mg közötti mennyiségben, még elõnyösebben mintegy 5 mg és mintegy 250 mg közötti mennyiségben tartalmazza, amelyet naponta 1–4 alkalommal adunk. Orális adagolás céljára kielégítõ eredmény érhetõ el egy HMG-CoA reduktáz inhibitor mintegy 1–2000 mg, elõnyösen mintegy 4–mintegy 200 mg mennyiségben történõ alkalmazásával.
1
HU 005 800 T2
Egy elõnyös orális dózisforma, például tabletta vagy kapszula, a HMG-CoA reduktáz inhibitort mintegy 0,1–mintegy 100 mg, elõnyösen mintegy 5–mintegy 80 mg, és még elõnyösebben mintegy 10–mintegy 40 mg mennyiségben tartalmazza. A szkvalén szintetáz inhibitort mintegy 10 mg–mintegy 2000 mg, és elõnyösen mintegy 25 mg–mintegy 200 mg tartományba esõ dózisokban alkalmazhatjuk. Egy elõnyös orális dózisforma, például tabletta vagy kapszula, a szkvalén szintetáz inhibitort mintegy 10–mintegy 500 mg, elõnyösen mintegy 25–mintegy 200 mg mennyiségben tartalmazza. Az (I) képletû vegyületet a leírásban ismertetett alkalmazások bármelyikében, bármely arra alkalmas módon adagolhatjuk, például orálisan tabletták, kapszulák, granulák vagy porok formájában; szublinguálisan, bukkálisan, parenterálisan, például szubkután módon, intravénásan, intramuszkulárisan vagy intrasternális injekciós vagy infúziós technikákkal (például steril, injektálható vizes vagy nem vizes oldatok vagy szuszpenziók formájában); nazálisan, beleértve a nazális membránokra történõ adagolást, így például inhalációs spray formájában; topikálisan, például krém vagy balzsam formájában; vagy rektálisan, kúp formájában; dózisegységkészítményekben, amelyek nem toxikus, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokat vagy hígítóanyagokat tartalmaznak. Az itt ismertetett betegségek, például cukorbetegség és rokon betegségek bármelyikének kezelésére szolgáló elõnyös eljárás gyakorlati kivitelezése során egy gyógyszerkészítményt alkalmazunk, amely egy vagy több (I) képletû vegyületet és adott esetben egyéb antidiabetikus hatóanyago(ka)t és/vagy lipidcsökkentõ hatóanyago(ka)t és/vagy egyéb típusú terápiás anyago(ka)t tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal vagy hígítóanyaggal együtt. A gyógyszerkészítményt szokásos szilárd vagy folyékony hordozóanyagok vagy hígítóanyagok, valamint – a tervezett adagolási módnak megfelelõ típusú – adalék anyagok, például gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagok, segédanyagok, kötõanyagok és hasonlók alkalmazásával állíthatjuk elõ. A vegyület emlõsöknek, így embernek, majomnak, kutyának stb. orálisan például tabletták, kapszulák, granulátumok vagy porok formájában adagolhatók, vagy injektálható készítmények alakjában parenterálisan, továbbá intranazálisan vagy transzdermális tapaszok alkalmazásával adagolhatók. A szilárd készítmények rendszerint mintegy 10 – mintegy 500 mg (I) képletû vegyületet tartalmaznak. A dózis felnõttek számára elõnyösen mintegy 10 – 2000 mg/nap, amely beadható egyetlen adagban, vagy különálló adagokban, naponta 1–4 alkalommal. Egy tipikus injektálható készítményt úgy állíthatunk elõ, hogy 250 mg (I) képletû vegyületet aszeptikusan egy ampullába helyezünk, aszeptikus feltételek mellett fagyasztva szárítjuk, és végül az ampullát lezárjuk. Felhasználáskor az ampulla tartalmát 2 ml fiziológiás sóoldattal elegyítjük, miáltal injektálható készítményt kapunk.
2
Belátható, hogy az adott páciensnek beadandó specifikus dózis és a dozírozás gyakorisága különféle faktoroktól függõen változik, beleértve az alkalmazott specifikus vegyület aktivitását, a vegyület metabolikus 5 stabilitását és hatásának tartamát, a páciens faját, életkorát, testtömegét, általános egészségi állapotát, nemét és a táplálkozását, az adagolás módját és idejét, a kiürülés sebességét, a gyógyszer-kombinációt és az adott állapot súlyosságát. A találmány szerinti vegyület SGLT2 gátló aktivitá10 sa az alábbiakban bemutatásra kerülõ vizsgálati rendszer alkalmazásával határozható meg.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 15
Vizsgálati eljárás SGLT2 aktivitás meghatározására Humán SGLT2 mRNS szekvenciáját (GenBank #M95549) – standard molekuláris biológiai technikák alkalmazásával – reverz transzkripcióval és amplifikációval humán vese mRNS-bõl klónoztuk. A cDNSszekvenciát stabilan CHO sejtekbe transzfektáltuk, és a klónokat – lényegében Ryan és munkatársai leírása szerint [Ryan MJ, Johnson G, Kirk J, Fuerstenberg SM, Zager RA és Torok-Storb B. HK¹2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney International 45, 48–57. (1994)] SGLT2 aktivitásra teszteltük. Az SGLT2 aktivitás klonálisan szelektált sejtvonalban történõ gátlásának kiértékelését lényegében Ryan és munkatársai fentebb idézett leírása szerint, az alábbi módosításokkal végeztük. A sejteket 10 000 vagy 20 000 sejt/rezervoár mennyiségben oltottuk le, és 10% magzati borjúszérumot és 500 mg/ml geneticint tartalmazó Ham-féle F¹12 közegben tenyésztettük. A sejteket mintegy 90% konfluens állapot elérésekor vizsgáltuk, a leoltás után 2 vagy 3 nappal. A sejteket nátriummentes pufferrel mostuk egyszer, amely 10 mmol/l Hepes/Tris¹t, 137 mmol/l N¹metil-D-glükamint, 5,4 mmol/l KCl¹t, 2,8 mmol/l CaCl2¹t és 1,2 mmol/l MgSO4¹et tartalmazott (pH=7,4). Az inhibitorokat 10 mmol/l [14C]–AMG (ametil-D-glükopiranozid) jelenlétében vizsgáltuk 8 koncentrációban, 10 mmol/l Hepes/Tris¹t, 137 mmol/l NaCl¹t, 5,4 mmol/l KCl¹t, 2,8 mmol/l CaCl 2 ¹t és 1,2 mmol/l MgSO4¹et tartalmazó, proteinmentes pufferben (pH=7,4) 120 percen keresztüli inkubálással. A válaszgörbét egy empirikus, négyparaméteres modellhez illesztve meghatároztuk a maximális válasz feléhez tartozó inhibitorkoncentrációt, amelyet IC50-nek neveztünk. Minden meghatározáshoz három párhuzamos mintát vizsgáltunk. A vizsgálati mintákat 0,5 mmol/l fiorizint tartalmazó jéghideg 1×töménységû, foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) kezelve a reakciót leállítottuk, és a sejteket ezután 50 ml 0,1%¹os NaOH hozzáadásával lizáltuk. 200 ml MicroScint–40 szcintillációs folyadék hozzáadása után a sejteket 1 órán keresztül rázattuk, majd a [14C]–AMG mennyiségét TopCount szcintillációs számlálóval meghatároztuk. A kontrollvizsgálatokat az inhibitor távollétében, NaCl jelenlétében vagy anélkül végeztük, és florizinnel mint pozitív kontrollal dózis-válasz görbét vettünk fel minden vizsgálathoz.
1
HU 005 800 T2
A találmány kiviteli módjait a következõ kiviteli példákkal kívánjuk szemléltetni a korlátozás szándéka nélkül. 1. példa
5
2
HPLC retenciós idõ: 4,7 min, YMC S5 C–18 4,6×50 mm oszlop, 2,5 ml/min, detektálás 220 nm¹en; 4 perces gradiens 0–100% B, 2 percen keresztül tartva 100% B. A Oldószer: 10% MeOH/H 2 O+0,2% H 3 PO 4 . B Oldószer: 90% MeOH/H2O+0,2% H3PO4.
5-Bróm-2-klór-4’-etil-benzofenon (400 MHz, CDCl3) d 7,73 (d, 2H, JAB=8,2 Hz), 7,54 (dd, 1H, J=2,2 Hz, J=8,8 Hz), 7,32 (d, 1H, 10 J=8,8 Hz), 7,295 (d, 2H, JAB=8,2 Hz), 2,72 (q, 2H, J=7,7 Hz), 1,27 (t, 3H, J=7,7 Hz). 13C–NMR (100 MHz, CDCl ) d 193,13, 151,33, 140,49, 3 133,8, 133,52, 131,6, 131,44, 130,34, 130,16, 128,28, 120,44, 29,04, 15,02. 15 1H–NMR
A) 5¹Bróm-2-klór-4’-etil-benzofenon 410 g (1,74 mol) kereskedelmi forgalomból beszerezhetõ 5¹bróm-2-klór-benzoesav 700 ml CH2Cl2-vel készült, mágnesesen kevert szuszpenzióját tartalmazó 2 literes gömblombikba 235 g (1,85 mol) oxalil-kloridot, majd 1,5 ml DMF¹et adagoltunk. A képzõdõ HCl megkötésére a lombikot egy csõvel láttuk el úgy, hogy a gáz egy kevert, vizes KOH-oldat felszíne felett távozott. Amikor az élénk gázfejlõdés 2 óra elteltével megszûnt, a homogén reakcióelegyet egy éjszakán keresztül tovább kevertük, majd az illékony anyagokat vákuumban, rotációs bepárlóval eltávolítottuk. A kapott olaj megszilárdult a rákövetkezõ légtelenítés során. A nyers 5¹bróm-2-klór-benzoil-kloridot 530 ml etilbenzolban oldottuk, majd a sárga oldatot –3 °C¹ra lehûtöttük, és ezután hozzáadtunk 257 g (1,93 mol) AlCl3¹at ~30 g részletekben, 60 perc alatt, hogy a hõmérséklet ne haladja meg a 10 °C¹ot. A nagy mennyiségû HClgázt, amely az AlCl3 60%-ának hozzáadása után kezdett fejlõdni, kevert, koncentrált NaOH-oldat felett átvezetve kötöttük meg. Ha a reakció koncentráltabb lett volna, mágneses keverõvel nem lehetett volna fenntartani a keverést az AICI3 beadagolásának befejezése után. A reakcióelegyet 1 órán keresztül kevertük, miközben a fürdõ ~15 °C¹ra melegedett, és a fürdõt eltávolítottuk. A 4 óra elteltével 20 °C¹on kapott sûrû szirupot 1,5 kg jégre öntöttük. Ezután, miután a kevert szuszpenzió lehûlt, hozzáadtunk 1 liter H2O¹t, majd négyszer extraháltuk EtOAc-cal. Az egyesített szerves extraktumokat kétszer 1 N HCl-lel, háromszor 1 mol/l KOH-val és kétszer sóoldattal mostuk, majd Na2SO4 felett szárítottuk. Az illékony anyagokat elõször rotációs bepárlással, majd –60 °C¹on 1 torr (133,28 Pa) nyomáson való melegítéssel eltávolítottuk. A kapott sûrû olaj 1H–NMR-analízise azt mutatta, hogy a maradék az orto/para izomerek 1:14 arányú keveréke. Az anyagot hexánban oldottuk, majd szilikagél rétegen átszûrve eltávolítottuk a színezõanyag nagy részét. Az eluens koncentrálásával 560 g (99%) terméket kaptunk, amely 5¹bróm-2-klór-4’-etil-benzofenon/5¹bróm-2-klór-2’-etilbenzofenon 14:1 arányú keveréke.
5-Bróm-2-klór-2’-etil-benzofenon (megkülönböztetõ jelek) 1H–NMR (400 MHz, CDCl ) d 2,64 (q, 2H, J=7,7 Hz), 3 1,23 (t, 3H, J=7,7 Hz). 20 13C–NMR (100 MHz, CDCl ) d 28,9, 15,5. 3
25
30
35
40
45
50
55
60 16
B) 5¹Bróm-2-klór-4’-etil-difenil-metán 400 g (3,45 mol) Et3SiH és 534 g (1,65 mol) ~7% izomer ketont tartalmazó 5¹bróm-2-klór-4’-etil-benzofenon 300 ml TFA-val készült, kevert oldatához 30 °C¹on 1,5 g (0,01 mol) CF3SO3H¹t adunk. Perceken belül a hõmérséklet emelkedett, ami az oldat erõs refluxát váltotta ki. Ennek a közepes exoterm reakciónak a kézbentartása külsõ jégfürdõvel való hûtést igényel. 1 óra elteltével HPLC szerint a reakció 90%-ban végbement. További 20 g Et3SiH hozzáadása és 70 °C¹on egy éjszakán keresztüli melegítés után a reakció >95%-ban lejátszódott HPLC-analízis szerint. Lehûtés után az illékony anyagokat vákuumban golyós hûtõvel desztillálva távolítottuk el. A kapott ~1 liter világosszürke olajat 1 liter H2O¹ba öntöttük. Az elegyet háromszor extraháltuk hexánnal; az egyesített szerves fázisokat háromszor vízzel, kétszer vizes Na2CO3-mal és kétszer sóoldattal mostuk, majd Na2SO4 felett szárítottuk. Rotációs bepárlóval végzett koncentrálás után ~1 liter tiszta, világos borostyánszínû olaj maradt vissza. Ezt az anyagot tovább koncentráltuk; az (Et3Si)2O¹t (450 ml) desztillálással távolítottuk el 0,6 torr (79,97 Pa) nyomáson. Amikor a desztilláló fejhõmérséklete elérte a 75 °C¹ot, az edényt hûlni hagytuk. Az edényben lévõ anyag 1H–NMR-analízise azt mutatta, hogy az diaril-metán és (Et3Si)2O ~8:1 arányú keverékét tartalmazza. A fenti keveréket úgy kristályosítottuk, hogy a terméket intenzíven kevert 10 °C¹os 85%¹os EtOH/H2O (1,2 liter) elegybe öntöttük. Az elegyet több órán keresztül kevertük, majd a kristályokat szûréssel összegyûjtöttük, hideg 1:1 arányú EtOH/H2O eleggyel mostuk, és vákuumban szárítottuk. 500 g 5¹bróm-2-klór-4’-etil-difenilmetánt kaptunk, alacsony olvadáspontú, szilárd anyag-
1
HU 005 800 T2
ként, amely ~1% (Et3Si)2O¹t tartalmazott. Az anyagot további tisztítás nélkül használtuk fel. HPLC retenciós idõ: 5,3 min, YMC S5 C–18 4,6×50 mm oszlop, 2,5 ml/min, detektálás 220 nm¹en; 4 perces gradiens 0–100% B, 2 percen keresztül tartva 100% B. A oldószer: 10% MeOH/H 2 O+0,2% H 3 PO 4 . B oldószer: 90% MeOH/H2O+0,2% H3PO4. 1H–NMR (125 MHz, CDCl ) d 7,27–7,23 (m, 3H), 7,14 3 (d, 2H, JAB=7,7 Hz), 7,09 (d, 2H, JAB=7,7 Hz), 2,63 (q, 2H, J=7,7 Hz), 1,23 (t, 3H, J=7,7 Hz). 13C–NMR (100 MHz, CDCl ) d 142,46, 141,08, 135,68, 3 133,64, 133,13, 130,85, 130,55, 128,83, 128,1, 120,0, 38,62, 28,43, 15,51.
5
10
15
20 C) 2,3,4,6-Tetra(O¹trimetil-szilil)-D-glükolakton 239 g (1,34 mol) glükonolakton és 1180 ml (10,73 mol) N¹metil-morfolin 2,4 liter THF-fel készült, –5 °C¹os, kevert oldatához Ar alatt 1022 ml (8,05 mol) trimetil-szilil-kloridot adtunk csepegtetõtölcsérbõl, olyan sebességgel, hogy a hõmérséklet nem haladta meg az 5 °C¹ot. A reakcióelegyet 1 órán keresztül kevertük, majd 35 °C¹on tartottuk 5 órán keresztül, és ezután 20 °C¹ra hagytuk hûlni, miközben a reakcióelegyet egy éjszakán keresztül kevertük. 3,6 liter toluollal való hígítás után az elegyet 0–5 °C¹ra hûtöttük, majd óvatosan hozzáadtunk 7 liter H2O¹t olyan sebességgel, hogy a hõmérséklet nem haladta meg a 10 °C¹ot. A H2O elsõ részletének hozzáadása erõs exoterm reakciót eredményezett. Az elegyet összekevertük, majd a fázisokat hagytuk szétválni, és ezután elválasztottuk. A szerves fázist 2 liter vizes NaH2PO4-gyel, 1 liter H2O-val és 1 liter sóoldattal mostuk. A szerves fázist ezután vákuumban koncentráltuk rotációs bepárló alkalmazásával; a kapott halványsárga olajat kétszer felvettük 250 ml toluolban, és újrakoncentráltuk. 616 g terméket kaptunk.
25
30
35
2
ségével átvittük 153 g (0,33 mol) C) lépés szerinti 2,3,4,6-tetra(O¹trimetil-szilil)-D-glükolakton 350 ml toluollal készült, –78 °C¹on kevert oldatába olyan sebességgel, hogy a reakció-hõmérséklet –55 °C alatt maradt. Az oldatot 30 percen keresztül kevertük –78 °C¹on, majd 28 ml (0,45 mol) metánszulfonsavat tartalmazó 400 ml MeOH hozzáadásával leállítottuk a reakciót. A reakcióelegyet egy éjszakán, 18 órán keresztül kevertük 20 °C¹on. HPLC-analízis szerint egy új csúcs jelent meg, amely LC/MS szerint a várt O¹metilglükozid tömegének felelt meg. A reakció befejezõdése után 200 ml vízben 42 g (0,5 mol) NaHCO3 hozzáadásával kioltottuk a reakciót. Ha a pH nem volt enyhén bázikus, még több NaHCO3¹at adtunk hozzá, majd kétszeres mennyiségû vízzel hígítottuk, és háromszor extraháltuk EtOAc-cal. Az egyesített EtOAc¹os frakciókat sóoldattal mostuk, és Na2SO4 felett szárítottuk. Rotációs bepárlóval végzett koncentrálás után 140 g olajat kaptunk, amelynek tisztasága 90% volt HPLC-analízis szerint. A kapott olajat nem tisztítottuk tovább, hanem mint szennyezett diasztereomer elegyet vittük további reakcióba. 1H–NMR (400 MHz, CDCl ) d 7,37 (m, 1H), 7,23 (m, 3 2H), 7,02 (m, 4H), 5,14 (m, 1H), 5,06 (m, 1H), 4,07 (m, 1H), 4,03 (d, 1H, JAB=15,4 Hz), 3,97 (d, 1H, JAB=15,4 Hz), 3,80–3,70 (m, 4H), 3,60 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,31 (m, 1H), 2,84 (s, 3H), 2,53 (q, 2H, J=7,5 Hz), 1,14 (t, 3H, J=7,5 Hz). 13C–NMR (100 MHz, CDCl ) d 144,4, 140,7, 138,94, 3 136,9, 132,51, 131,6, 130,96, 130,6, 130,2, 129,16, 103,36, 77,0, 74,86, 72,48, 64,27, 51,57, 41,33, 30,75, 17,9. HPLC retenciós idõ: 4,28 min, 90% tisztaság, YMC S5 C–18 4,6×50 mm oszlop, 2,5 ml/min, detektálás 220 nm¹en; 4 perces grádiens 0–100% B, 2 percen keresztül tartva 100% B. A oldószer: 10% MeOH/H 2 O+0,2% H 3 PO 4 . B oldószer: 90% MeOH/H2O+0,2% H3PO4. LC/MS: [M–OMe]+ 391, 393; [M+Na]+ 445, 447.
40 E)
D) 45
206 g (0,49 mol) D) lépés szerinti O¹metil-glükozid 1 liter THF-fel készült oldatát, amely 465 g (3,6 mol) diizopropil-etil-amint és 0,5 g (4,1 mmol) DMAP¹t tartalmazott, 0 °C¹ra hûtöttük. Lassan hozzáadtunk 326 g (3,19 mol) ecetsavanhidridet olyan sebességgel, hogy 55 a hõmérséklet nem haladta meg az 5 °C¹ot. Miután az oldat fokozatosan 20 °C¹ra melegedett, 10 órán keresztül kevertük, és ezután a TLC-analízis azt mutatta, hogy teljes a tetraacetáttá történõ konverzió. A reakciót 1,5 liter EtOAc és 1,5 liter 10%¹os vizes H3PO4 hozzá60 adásával kioltottuk. A fázisokat szétválasztottuk, majd 50
88 g (0,28 mol) B) lépés szerinti 5¹bróm-2-klór-4’etil-difenil-metán 450 ml 1:2 arányú vízmentes THF/toluol eleggyel készült, –78 °C¹on kevert oldatához Ar alatt, lassan 136 ml (0,34 mol) 2,5 mol/l hexános n¹BuLi-oldatot adtunk olyan sebességgel, hogy a hõmérséklet –55 °C alatt maradt. Az elegyet 10 percen keresztül kevertük a beadagolás után, majd kanül segít-
17
1
HU 005 800 T2
a vizes fázist kétszer extraháltuk EtOAc-cal. Az egyesített szerves fázisokat egyszer mostuk sóoldattal, majd Na2SO4 felett szárítottuk, és vákuumban koncentráltuk. A kapott olajat kétszer oldottuk 300 ml toluolban, és újrakoncentráltuk. 300 g (95% HPLC-tisztaság) sûrû olajat kaptunk, amelyet a kapott szennyezett diasztereomer elegy további tisztítása nélkül használtunk fel. 1H–NMR (400 MHz, CDCl ) d 7,38 (d, 1H, J=8,3 Hz), 3 7,28 (dd, 1H, J=8,3 Hz, J=2,2 Hz), 7,24 (d, 1H, J=2,2 Hz), 7,11 (d, 2H, JAB=8,3 Hz), 7,04 (d, 2H, JAB=8,3 Hz), 5,56 (t, 1H, J=9,7 Hz), 5,21 (t, 1H, J=10,1 Hz), 4,93 (t, 1H, J=10,1 Hz), 4,20 (dd, 1H, J=12 Hz, J=2 Hz), 4,12 (d, 1H, JAB=15,4 Hz), 4,02 (m, 1H), 4,018 (d, 1H, JAB=15,4 Hz), 3,10 (s, 3H), 2,606 (q, 2H, J=7,7 Hz), 2,097 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,94 (s, 3H), 1,72 sd (s, 3H), c1, 21 (t, 3H, J=7,7 Hz). 13C–NMR (100 MHz, CDCl ) d 170,7, 170,05, 169,47, 3 168,9, 142,2, 138,74, 136,4, 135,1, 134,7, 129,8, 129,4, 128,6, 128,0, 126,0, 100,02, 73,83, 71,33, 68,87, 68,77, 62,11, 49,43, 38,75, 28,4, 22,64, 20,68, 20,58, 20,16, 15,5. HPLC retenciós idõ: 4,81 min, 90% tisztaság, YMC S5 C–18 4,6×50 mm oszlop, 2,5 ml/min, detektálás 220 nm¹en; 4 perces gradiens 0–100% B, 2 percen keresztül tartva 100% B. A oldószer: 10% MeOH/H 2 O+0,2% H 3 PO 4 . B oldószer: 90% MeOH/H2O+0,2% H3PO4. F)
5
10
15
20
25
2
tisztaság) tetraacetilezett béta-C-glükozidot kaptunk fehér, szilárd anyagként. A teljes konverzió a D)–F) lépésekre 61% volt. HPLC retenciós idõ: 4,74 min, 100% tisztaság, YMC S5 C–18 4,6×50 mm oszlop, 2,5 ml/min, detektálás 220 nm¹en; 4 perces gradiens 0–100% B, 2 percen keresztül tartva 100% B. A oldószer: 10% MeOH/H 2 O+0,2% H 3 PO 4 . B oldószer: 90% MeOH/H2O+0,2% H3PO4. 1H–NMR (500 MHz, CDCl ) d 7,35 (d, 1H, J=8,2 Hz), 3 7,19 (dd, 1H, J=8,2 Hz, J=2,2 Hz), 7,11 (d, 2H, JAR=8,5 Hz), 7,086 (d, 1H, J=2,2 Hz), 7,06 (d, 2H, JAB=8,5 Hz), 5,28 (t, 1H, J=9,7 Hz), 5,20 (t, 1H, J=9,7 Hz), 5,04, (t, 1H, J=9,7 Hz), 4,31 (d, 1H, J=9,9 Hz), 4,26 (dd, 1H, J=12 Hz, J=5 Hz), 4,135 (dd, 1H, J=12 Hz, J=5 Hz), 4,095 (d, 1H, JAB=7,7 Hz), 3,995 (d, 1H, JAB=7,7 Hz), 3,79 (m, 1H), 2,605 (q, 2H, J=7,7 Hz), 2,069 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,67 (s, 3H), 1,21 (t, 3H, J=7,7 Hz). 13C–NMR (125 MHz, CDCl ) d 170,64, 170,3, 169,4, 3 168,7, 142,2, 138,78, 136,4, 135,1, 134,6, 129,9, 129,8, 128,7, 128,0, 125,9, 79,45, 76,1, 74,1, 72,5, 68,45, 62,2, 38,6, 28,4, 20,7, 20,6, 20,59, 20,2, 15,55. LC–MS [M+NH4+] m/z 578,3. G)
30
35
301 g (0,51 mol) fenti nyers olaj 500 ml CH2Cl2-vel készült, kevert oldatát, amely 1 ekvivalens (9 g, 0,5 mol) H2O¹t és 188 g (1,62 mol) Et3SiH¹t tartalmazott, –20 °C¹ra hûtöttük, majd hozzáadtunk 145 g (1,02 mol) BF3·Et2O¹t. A beadagolás során a hõmérsékletet <0 °C¹on tartottuk. A reakcióelegyet ezután 2 órán keresztül 10 °C¹on és 18 órán keresztül 15–20 °C¹on kevertük, majd 500 ml CH2Cl2 és 500 ml víz hozzáadásával kioltottuk a reakciót. A fázisok szétválasztása után a vizes fázist egyszer extraháltuk CH2Cl2-vel. Az egyesített szerves fázisokat egyszer mostuk vizes NaHCO3-mal és sóoldattal, majd Na2SO4 felett szárítottuk. Az Na2SO4¹et szûréssel eltávolítottuk, majd hozzáadtunk 6,4 g (65 mmol) Ac2O¹t, 9,5 g (74 mmol) diizopropil-etil-amint és 100 mg (0,8 mmol) DMAP¹t. Az oldatot 20 °C¹on 18 órán keresztül kevertük, hogy a redukció és a feldolgozás során hidrolizálódott glükozidos hidroxilcsoportok újraacetilezõdését biztosítsuk. A vákuumban történõ koncentrálás után kapott olajat EtOH hozzáadásával kristályosítottuk. Szûrés után a kapott anyag tisztasága HPLC szerint 98%; EtOH-ból történõ átkristályosítással 180 g (99,8%
40
45
50
55
60 18
25 g (44,6 mmol) F) lépésben kapott tetraacetilezett béta-C-glükozid 350 ml 2:3 arányú THF/MeOH elegyben 5 percen keresztül való keverésével elõállított, fehér szuszpenzióhoz N2 alatt, 20 °C¹on 2,0 g (50 mmol) LiOH–H2O¹t adtunk 70 ml vízben. 15 perc elteltével a reakcióelegy opálos oldattá alakult; 2,5 óra elteltével HPLC-analízis szerint a reakció 98%-ban végbement. A konverzió 99%¹ra növekedett egy éjszakán keresztül történõ keverés után, ezután az illékony anyagokat rotációs bepárlóval eltávolítottuk, miáltal a térfogatot 150 ml¹re csökkentettük. A maradékot 100 ml 10%¹os vizes KHSO4 hozzáadása után 100 ml H2O-val tovább hígítottuk, majd háromszor extraháltuk EtOAc-cal. Na2SO4 felett történõ szárítás után az illékony anyagokat rotációs bepárló alkalmazásával eltávolítottuk, és a kapott olajat minimális mennyiségû EtOAc-ban habosítottuk vákuum alatt. A fenti anyagban visszatartott EtOAc mennyiségét vákuumszárítással lehet csökkenteni. Ezt az üveges, törtfehér színû, szilárd anyagot kikapartuk, és 0,15 torr (19,99 Pa) nyomáson, 25 °C¹on, 24 órán keresztül tovább szárítottuk. 17,3 g kívánt C¹aril-glükozidot kaptunk, amely 6,7 mol% EtOAc¹ot tartalmazott.
1
HU 005 800 T2
2
6. A 4. igénypont szerinti kombináció, ahol az antiHPLC retenciós idõ: 4,21 min, 98,8% tisztaság, YMC diabetikus hatóanyag metformin, gliburid, glimepirid, S5 C–18 4,6×50 mm oszlop, 2,5 ml/min, detektálás glipirid, glipizid, klorpropamid, gliklazid, akarboz, migli220 nm¹en; 4 perces gradiens 0–100% B, 2 percen tol, pioglitazon, troglitazon, rosiglitazon, inzulin, isaglikeresztül tartva 100% B. A oldószer: 10% MeOH/H 2 O+0,2% H 3 PO 4 . B oldószer: 90% 5 tazon, repaglinid, nateglinid, muraglitizar és peliglitazar csoportjából megválasztott legalább egy hatóMeOH/H2O+0,2% H3PO4. 1H–NMR (500 MHz, CD OD) d 7,34 (d, 1H, J=8,2 Hz), anyag. 3 7. A 4. igénypont szerinti kombináció, ahol az (I) 7,33 (d, 1H, J=1,7 Hz), 7,27 (dd, 1H, J=8,2 Hz, képletû vegyület tömegaránya az antidiabetikus hatóJ=1,7 Hz), 7,08 (részben egymásra helyezett AB kvartett, 4H), 4,1–4,0 (m, 3H), 3,86 (d, 1H, 10 anyaghoz viszonyítva mintegy 0,01–mintegy 300:1 tartományban van. J=11,6 Hz), 3,68 (dd, 1H, J=5,3, 10,6 Hz), 8. A 3. igénypont szerinti kombináció, ahol az elhí3,46–3,26 (m, 4H) Hz), 2,57 (q, 2H, J=7 Hz), 1,19 zás elleni hatóanyag béta¹3 adrenerg agonisták, lipáz (t, 3H, J=7 Hz). 13C–NMR (125 MHz, CD OD) d 143,2, 140,0, 139,7, inhibitorok, szerotonin újrafelvétel inhibitorok, pajzs3 138,1, 134,5, 131,98, 130,1, 129,8, 128,8, 128,2, 15 mirigy receptor-béta szerek, 5HT2C agonisták, MCHR1 antagonisták, melanokortin receptor agonis82,8, 82,14, 79,7, 76,4, 71,9, 63,1, 39,7, 29,4, 16,25. ták, melaninkoncentráló hormon receptor antagonisMS [M+Na+] m/z számított 415,1288; talált 415,1293. ták, galanin receptor módosítók, aorexin antagonisElemanalízis a C 21 H 25 ClO 5 ·0,07 EtOAc·0,19 H 2 O ták, CCK agonisták, NPY1 vagy NPY5 antagonisták, összegképletre: számított: C 63,51, H 6,50, Cl 8,80; talált: C 63,63, H 6,63, Cl 8,82. 20 NPY2 vagy NPY4 módosítók, kortikotropin felszabadító faktor agonisták, hisztamin receptor¹3 (H3) módosítók, 11¹beta-HSD¹1 inhibitorok, adinopektin receptor módosítók, monoamin újrafelvétel inhibitorok, SZABADALMI IGÉNYPONTOK ciliáris neurotróf faktorok, agyból származó neurotróf 1. (I) képletû vegyület 25 faktorok, leptin vagy leptin receptor módosítók, kannabinoid¹1 receptor antagonisták és anorektikumok csoportjából megválasztott legalább egy hatóanyag. 9. A 8. igénypont szerinti kombináció, ahol az elhí30 zás elleni hatóanyag rimonabant, orlistat, sibutramin, topiramat, dexamfetamin, fentermin, fenil-propanolamin és mazindol csoportjából megválasztott legalább egy hatóanyag. 10. A 3. igénypont szerinti kombináció, ahol a lipid(I) 35 csökkentõ hatóanyag MTP inhibitorok, CETP inhibitorok, HMG-CoA reduktáz inhibitorok, szkvalén szintetáz inhibitorok, fibrinsavszármazékok, LDL receptor aktivivagy gyógyszerészetileg elfogadható sója, komplexe, tás serkentõk, lipoxigenáz inhibitorok és ACAT inhibitosztereoizomerje vagy prodrog észtere. rok csoportjából megválasztott legalább egy ható2. Gyógyszerkészítmény, amely (I) képletû vegyületet és gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tar- 40 anyag. 11. A 10. igénypont szerinti kombináció, ahol a litalmaz. pidcsökkentõ hatóanyag pravastatin, lovastatin, sim3. Gyógyszer-kombináció önálló terápiás anyagok vastatin, atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, nisvastaegyidejû vagy egymás utáni beadására, amely (I) képtin, visastatin, atavastatin, rosuvastatin, fenofibrát, letû vegyületet és antidiabetikus hatóanyagok, elhízás elleni hatóanyagok, vérnyomáscsökkentõ hatóanya- 45 gemfibrozil, klofibrát és avasimib csoportjából megvágok, atherosclerosis elleni hatóanyagok és lipidcsöklasztott legalább egy hatóanyag. kentõ hatóanyagok csoportjából megválasztott leg12. A 10. igénypont szerinti kombináció, ahol az (I) alább egy terápiás anyagot tartalmaz. képletû vegyület tömegaránya a lipidcsökkentõ ható4. A 3. igénypont szerinti gyógyszer-kombináció, anyaghoz viszonyítva mintegy 0,01–mintegy 300:1 taramely (I) képletû vegyületet és legalább egy antidiabe- 50 tományban van. tikus hatóanyagot tartalmaz. 13. (I) képletû vegyület alkalmazása diabetes, dia5. A 4. igénypont szerinti kombináció, ahol az antibetikus retinopátia, diabetikus neuropátia, diabetikus diabetikus hatóanyag biguanidek, szulfonil-karbaminefropátia, késleltetett sebgyógyulás, inzulinrezisztendok, glükozidáz inhibitorok, PPAR-gamma agonisták, cia, hiperglikémia, hiperinzulinémia, zsírsavak vagy gliPPAR-alfa/gamma kettõs agonisták, aP2 inhibitorok, 55 cerin megnövekedett vérszintjei, hiperlipidémia, elhíDPP4 inhibitorok, inzulin szenzitívizálók, glükagonszezás, hipertrigliceridémia, X¹szindróma, diabetikus szörû peptid¹1 (GLP¹I), PTP1B inhibitorok, glikogén-foszvõdmények, atherosclerosis vagy magas vérnyomás foriláz inhibitorok, glükóz-6-foszfatáz inhibitorok, inzulin kezelésére vagy fellépésének vagy kifejlõdésének késés meglitinidek csoportjából megválasztott legalább leltetésére, vagy a nagy sûrûségû lipoproteinszintek egy hatóanyag. 60 növelésére alkalmas gyógyszer elõállítására. 19
1
HU 005 800 T2
14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol mind (I) képletû vegyületet, mind antidiabetikus hatóanyagok, elhízás elleni hatóanyagok, vérnyomáscsökkentõ hatóanyagok, atherosclerosis elleni hatóanyagok és lipidcsökkentõ hatóanyagok csoportjából megválasztott legalább egy további terápiás anyagot alkalmazunk az említett (I) képletû vegyület és az említett legalább egy további terápiás anyag egyidejû vagy egymás utáni beadására alkalmas gyógyszer elõállítására gyógyszerkombináció formájában. 15. (I) képletû vegyület alkalmazása II¹es típusú cukorbetegség kezelésére alkalmas gyógyszer elõállítására.
2
16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, ahol mind (I) képletû vegyületet, mind antidiabetikus hatóanyagok, diabetikus szövõdmények kezelésére alkalmas hatóanyagok, elhízás elleni hatóanyagok, vérnyomás5 csökkentõ hatóanyagok, trombocitagátló hatóanyagok, atherosclerosis elleni hatóanyagok és hipolipidémiás hatóanyagok csoportjából megválasztott legalább egy további terápiás anyagot alkalmazunk az említett (I) képletû vegyület és az említett legalább egy további te10 rápiás hatóanyag egyidejû vagy egymás utáni beadására alkalmas gyógyszer elõállítására gyógyszer-kombináció formájában. 17. Vegyület, amelynek szerkezete:
,
,
,
,
vagy .
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest
