!HU000007151T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 151
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 0509273 2005. 09. 12.
(73) Jogosult: Adisseo Ireland Ltd., Dublin 1 (IE)
(72) Feltalálók: MERCIER, Yves, F-63000 Clermont Ferrand (FR); GERAERT, Pierre-André, F-37210 Rochecorbon (FR) (54)
HU 007 151 T2
A23K 1/16
(21) Magyar ügyszám: E 06 808106 (22) A bejelentés napja: 2006. 09. 11. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20060808106 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1926391 A1 2007. 03. 22. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1926391 B1 2009. 08. 12.
FR
(2006.01) A23K 1/18 (2006.01) A61K 36/00 (2006.01) A61K 31/198 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 07031632 PCT/FR 06/002080
(74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Biológiailag hozzáférhetõ metionin és legalább egy esszenciális olaj kombinációja
A leírás terjedelme 12 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 151 T2
A találmány tárgya táplálékkészítmény, amely tenyészállatok táplálékának metioninnal történõ kiegészítésére szolgál. Az állatok bélmikroflóráját különbözõ bonyolult közösségek alkotják, idetartoznak a baktériumok, az élesztõk és a gombák. Ennek a mikroflórának nagy hatása van az állatok egészségére és a táplálékuk hatékonyságára. Általában két típusú baktériumot találunk itt meg: ezek egyrészt a patogén baktériumok (például Salmonella, Campylobacter jejuni vagy Clostridium perfringens) és másrészt az olyan baktériumok, amelyeket nem tekintünk patogénnek (ilyenek a Lactobacillus vagy a Propionibacterium). Ezeknek a baktériumoknak az összhatása a tenyészállatok képességeire negatív. Az állattenyésztéssel foglalkozó társadalmak régóta keresik az olyan lehetõségeket, amelyekkel a bél baktériumflórája orientálható, azért, hogy az állatok képességeit javítsák. Így például az US 6,322,825 számú dokumentumban esszenciális olajok alkalmazását ismertetik gyógyszerkészítmények elõállításánál az olyan készítmények helyettesítésére, amelyek például kortizon-szulfonamidokat vagy antibiotikumokat tartalmaznak. Az US 4,166,867 számú dokumentumban lovak számára ismertetnek táplálék elõállítást, amirõl azt írják, hogy illatosabb, mégpedig bevonószerként citrom esszenciális olaj alkalmazásának köszönhetõen. Itt az olaj a végtermék kevesebb mint 0,01 tömeg%¹át teszi ki. A WO 03/056935 számú szabadalmi bejelentésben táplálékkiegészítõt ismertetnek, amely kérõdzõ állatok táplálékkészítményeiben alkalmazható, és amely tartalmaz legalább egy esszenciális olajat és legalább egy szaponint, amely táplálékkiegészítõ a bendõben hat azáltal, hogy optimális koncentrációban tartja fenn a bendõfehérjéket. Általánosan elterjedt az állatok táplálékát növekedési faktor antibiotikumokkal kiegészíteni, ez lehetõvé teszi az emésztõcsatorna teljes baktériumterhelésének a csökkentését, és a növekedési vagy termelési hatékonyság javítását. Azonban az antibiotikumok növekedési faktorként történõ alkalmazása Európában 2006. január 1¹je óta tilos. Érezhetõ tehát az igény helyettesítõ termékek iránt. A találmány egyik célja olyan készítmény kidolgozása, amely tenyészállatok táplálására szolgál, és a tenyészállatok bélflórájára baktericidhatást fejt ki. A találmány további célja tenyészállatok táplálására szolgáló olyan készítmény kidolgozása, amely jótékonyan hat az állatok teljesítményére. A találmány további célja olyan táplálékkészítmény kidolgozása, amely nem tartalmaz antibiotikumokat, ugyanakkor rendelkezik azokkal a jótékony hatásokkal, amelyeket az antibiotikumok gyakorolnak általában az állatok növekedésére. A találmány további célja olyan táplálékkészítmény kidolgozása, amely a tenyészállatok bélflórájára hat. A találmány tárgya tehát biológiailag hozzáférhetõ metionint tartalmazó szinergetikus táplálékkészítmény,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
amely tenyészállatok táplálására szolgál, és amely tartalmaz: a) egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet és b) legalább 5% legalább egy esszenciális olajat. Azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti készítmény, amely ezt a két komponenst tartalmazza, szinergetikus baktericid hatást fejt ki a bélflóra aktivitására. Ugyanis a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és az esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke kölcsönösen erõsítik egymás hatását. A szakirodalomból nem ismert olyan dokumentum, amely egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és legalább egy esszenciális olaj szinergetikus baktericid hatását ismertetné. „Biológiailag hozzáférhetõ metionin”¹on olyan vegyületet értünk, amely képes a tenyészállatok napi metioninszükségletét kiegészíteni. A metionint különbözõ formákban adagolhatjuk a tenyészállatoknak. A találmány szerint a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület izolált állapotban található. Elõször is ez lehet maga a metionin, így az L¹metionin vagy a D,L-metionin. Ez lehet továbbá egy metioninszármazék. „Metioninszármazék”¹on például a metionin sóit, amidjait, alkil- és alkohol-észtereit, ketonszármazékait és hidroxianalógjait, valamint ezek származékait értjük. Ez lehet például a 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav (ezt az alábbiakban HMTBA-nak vagy metionin hidroxianalógnak nevezzük), amelyrõl ismert, hogy az állatok táplálására alkalmas metioninanalóg. Ennek az az elõnye, hogy folyékony formájú, ami megkönnyíti a táplálékgyártó cégek által történõ alkalmazását. A származék lehet továbbá a metionin hidroxianalógjának az izopropil-észtere, vagy a metionin terc-butil-észtere. A találmány szerinti táplálékkészítmény tartalmazhat több biológiailag hozzáférhetõ metioninforrást is, például tartalmazhatja a metionin és hidroxianalógjának a keverékét. A metioninforrás biológiai hozzáférhetõségét úgy határozzuk meg, hogy megállapítjuk a hatóanyag koncentrációját a vérben, az állat fejadagjában bevitt hatóanyag-mennyiséghez viszonyítva. Ez a meghatározás figyelembe veszi a felszívódási arányt a bélbõl a tápcsatornában történõ tartózkodás során, a felvett táplálékból a többgyomrú állatok különbözõ gyomraiba történõ áthaladást és a hatóanyagnak a szervezet által történõ átalakítási arányát (ez van például a metionin hidroxianalógja esetében). „Esszenciális olaj”¹on egy a növényekbõl kapott folyadékot értünk (virágok, rügyek, magok, levelek, gallyak, füvek, kérgek, fa, gyümölcsök és gyökerek). Az esszenciális olajat elõállíthatjuk például sajtolással, fermentálással, „enfleurage”-zsal (nem illó oldószerrel végzett kivonás) vagy extrakcióval. Az esszenciális olajokat néha éterolajoknak vagy illóolajoknak is nevezik, a terpének (nemaromás szénhidrátok) és oxigéntartalmú vegyületek (alkoholok, aldehidek, ketonok) jelenléte miatt, amelyek aromások. Az esszenciális olaj
1
HU 007 151 T2
lehet nyers, penténmentesített, finomított vagy összetett. Az esszenciális olaj a találmány szerint lehet esszenciális olajok keveréke is. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az esszenciális olajok több mint 5%, legalább egy következõk közül választott vegyületbõl állnak: linalil-acetát, kumin-alkohol, fahéjaldehid, borneol, kadinén, kámfén, kámfor, karvakrol, karvon, cineol, citrál, citrolellál, citronellol, kumén, dipentén, esztragol, eugenol, gerániol, limonén (D vagy L), linalol (D vagy L), mentol, metilkavikol, parakumén, fellandrén, pinén (alfa vagy béta), metil-szalicilát, terpinén (alfa és béta), terpineol (alfa és béta), tujon, timol, bornil-acetát, geranil-acetát, eugenil-acetát, kumin-aldehid, allicin, anetol, perillaldehid és szabinén. Az esszenciális olajok elõnyösen több mint 10% legalább egy említett vegyületbõl állnak. Az esszenciális olajokat elõnyösen az alábbi növények héjából hidegsajtolással vagy különbözõ részeibõl desztillációval vonják ki: fokhagyma, áfonya, aloé, kapor, zöld ánizs, teafa, bazsalikom, bergamott, rózsafa, nyírfa, boróka, sárgarépa, kurkuma, cajuput, kámfor, fahéj, réti kömény, zeller, tölgyfa, citrom, citronella, koriander, kömény, tárkony, gömb formájú eukaliptusz, édeskömény, boróka, bourbon muskátli, gyömbér, ginseng, szegfûszeg, izsóp, nemes babérlevél, valódi levendula, széles levelû levendula, fenyérfû, limett, mandarin, majoranna, borsmenta, szerecsendió, mirrha, mirtusz, niaouli, hagyma, olibánum, narancs, oregano, palmarosa, grapefuit, papaya, paprika, pacsuli, petrezselyem, erõspaprika, tengerparti fenyõ, erdei fenyõ, alma, torma, rozmaring, szantál, borsfû, sassafras, zsálya, vad kakukkfû, terpentin, vöröskakukkfû, illatos verbéna, vetiver, ilang-ilang. „Állat”¹on különösen a tenyészállatokat értjük, különösen a legeltetett állatokat (így a hús, tej, sajt és bõr miatt tenyésztett szarvasmarhát; a hús, gyapjú és sajt miatt tenyésztett juhot) a kecskét, a sertést, a nyulat, a szárnyasokat (csirke, tyúk, pulyka, kacsa, liba és egyebek), a víziállatokat (például halak, rákok, kagylók és osztriga), a szabadidõs tevékenységre való és társállatokat (ló, kutya, macska). A szarvasmarhafélék a párosujjú patás kérõdzõk egyik alcsaládja, ezek többgyomrú kérõdzõ emlõsök, amelyek több fontos tenyészállatfajtát foglalnak magukban (tejelõ fajták, húsfajták és vegyes fajták). A találmány szerinti készítmény por alakú vagy folyékony formájú. A biológiailag hozzáférhetõ metionin por vagy szemcse formájú. Ez többek között azt jelenti, hogy ezt a port az esszenciális olajjal hígítjuk a találmány szerinti készítmény elõállítása céljából. Amint már említettük, a metionin lehet hidroxianalógja formájában is, tehát folyékony formában. Ebben az esetben a két folyadékot homogénen elkeverjük, mielõtt az állatoknak adagoljuk, vagy az állatok fejadagjához hozzákeverjük. Elõnyösen az a) vegyületet a következõk közül választjuk: maga a metionin (L¹metionin vagy D,L-metionin), vagy annak valamely só, amid, alkil-észter vagy alkoholos észter típusú származéka, ketonszármazék, hidroxianalóg vagy az említettek származéka.
2
A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint az a) vegyület az (I) általános képlettel jellemezhetõ: 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 3
ahol R jelentése hidrogénatom vagy izopropilcsoport és R’ jelentése –OH vagy –NH2 csoport. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti táplálékkészítmény, amely az állatok bélflórájára szinergetikus baktericid hatású, tartalmaz: a) 5–95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, b) 5–95 tömeg% legalább egy esszenciális olajat, és c) adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. Ezen megvalósítási mód szerint a táplálékkészítmény tartalmazhat legalább egy egyéb vegyületet, például egy emulgeálószert vagy zselatint. Ezen megvalósítási mód szerint egy nyitott készítményrõl van szó. Elõnyösen a készítmény tartalmaz 10–90 tömeg%ban egy biológiailag hozzáférhetõ metionint, 10–90 tömeg%-ban legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. Egy találmány szerinti másik megvalósítási módban a készítmény tartalmaz 15–85 tömeg%-ban egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, 15–85 tömeg%-ban legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. Egy további találmány szerinti megvalósítási módban a készítmény tartalmaz 20–80 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, 20–80 tömeg% legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. A találmány egyik eltérõ megvalósítási módja szerint a táplálékkészítmény, amely az állatok bélflórájára szinergetikus baktericid hatású, az alábbiakból áll: a) 5–95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és b) 5–95 tömeg% legalább egy esszenciális olaj. Ezen megvalósítási mód szerint a táplálékkészítmény csak ezt a két vegyületet tartalmazza, és nem tartalmaz semmi mást. Ilyenkor tehát egy zárt készítményrõl van szó. Elõnyösen a találmány szerinti táplálékkészítmény 10–90 tömeg%-ban egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületbõl és 10–90 tömeg%-ban legalább egy esszenciális olajból áll. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a készítmény 15–85 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületbõl és 15–85 tömeg% legalább egy esszenciális olajból áll. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány szerinti készítmény 20–80 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, 20–80 tömeg% legalább egy esszenciális olajat és adott esetben legalább egy egyéb vegyületet tartalmaz.
1
HU 007 151 T2
2
Tehát a találmány szerint a találmány szerinti készítményt alkalmazzuk tenyészállatoknak táplálékadalék elõállítására az állatok teljesítményének javítása céljából azáltal, hogy csökkentjük az állatok bélflórájá5 nak aktivitását. Az alábbi példák és ábrák lehetõvé teszik a találmány bizonyos jellemzõinek és elõnyeinek jobb megértését. Az alábbi példák célja, hogy a kísérlet különbözõ elemei hatására összehasonlítsuk a húscsirkék csípõbelé10 ben a flóra által termelt gázt. A gáztermelés a csirke csípõbél flórája baktériumos aktivitásának indirekt jelzõje.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a biológiailag hozzáférhetõ metionin [vagyis az a) vegyület] a készítményben nagyobb mint 60 tömeg%, elõnyösen nagyobb mint 80 tömeg% arányban van jelen. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az esszenciális olaj [vagyis a b) vegyület] a készítményben kisebb mint 40 tömeg%, elõnyösen kisebb mint 20 tömeg% arányban van jelen, különösen elõnyösen kisebb mint 10 tömeg%-ban. Ugyanakkor a találmány egyik megvalósítási módja szerint a b) vegyület a készítményben nagyobb mint 5 tömeg%, elõnyösen nagyobb vagy egyenlõ 8 tömeg% arányban van jelen. A találmány további tárgya táplálékadalék, amely tartalmazza a találmány szerinti készítményt. „Táplálékadalék”¹on egy aktív vegyületet vagy aktív vegyületek keverékét értjük, amelyek a táplálékkészítményben vannak általában kisebb mint 2 tömeg%, például kisebb mint 1 tömeg% mennyiségben a táplálékra vonatkoztatva. A találmány további tárgya így napi tápanyagadag típusú állati táplálék, amely tartalmazza a fent definiált tápanyagkészítményt vagy a fent definiált táplálékadalékot. A találmány tárgya végül a fent meghatározott készítmény alkalmazása táplálékkiegészítõ elõállítására. A találmány egyik megvalósítási módja szerint az ilyen alkalmazás lehetõvé teheti az endogén flóra aktivitásának csökkentését tenyészállatoknál vagy tenyészállatok bélflórájában a patogén mikroorganizmusok káros hatásának csökkentését. A találmány egyik megvalósítási módja szerint egy ilyen alkalmazás lehetõvé teheti még a tenyészállatok képességeinek, például a növekedés, az életképesség, homogenitás és a tenyésztés hatékonysága javítását. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a készítmény javítja a teljesítõképességet oly módon, hogy csökkenti a tenyészállatok bélflórájának aktivitását.
1. példa Állatok és mintavétel 50 húscsirkét nevelünk búzaalapú étrenden. Ezeket 15 a csirkéket azonos étrenden tartjuk. A csirkéket a 35. napon leöljük, majd kivesszük csípõbelük tartalmát anaerob körülmények között. Ezt a tartalmat flakonokba helyezzük, amelyeket –18 °C¹on tárolunk. 20 In vitro tesztek Az I. táblázatban ismertetett kísérleti leírás szerint mérjük az idõ függvényében termelt gáz térfogatát. 48 flakont töltünk meg egymás után az alábbiakkal: – kezelés (a negatív összehasonlító mintánál sem25 mi, a HMTBA, a HE vagy a kísérleti tétel), – 90 ml pufferoldat, amely búzakeményítõt tartalmaz (ez tápközeg a baktériumok számára); ennek a pufferoldatnak az a szerepe, hogy állandó értéken tartsa a pH¹t és eltüntesse az oxigént, 30 – 10 ml inokulum, amely negyedrészben a csípõbél tartalmából és háromnegyed részben steril fiziológiás oldatból áll, amelyet a megtöltés elõtt leszûrünk és homogenizálunk. A vizsgált dózisokat úgy számítjuk, hogy azok rep35 rezentatívak legyenek azon termék koncentrációkra, amelyeket az állatok gyomor-bél tartalmában találnánk.
I. táblázat Negatív HMTBA összehasonlító
Kezelés
HE 1
1. kísérleti tétel
HE 2
2. kísérleti tétel
HE 3
3. kísérleti tétel
HE 4
4. kísérleti tétel
HE 5
5. kísérleti tétel
Tétel
0
HMTBA
HE 1
HMTBA +HE 1
HE 2
HMTBA +HE 2
HE 3
HMTBA +HE 3
HE 4
HMTBA +HE 4
HE 5
HMTBA +HE 5
Ismétlések száma
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Bevitt HMTBAdózis
mg
0
83
0
83
0
83
0
83
0
83
0
83
tömeg%
0
100
0
75
0
62,5
0
71,4
0
73
0
62,5
mg
0
0
28
28
50
31
31
50
tömeg%
0
0
100
25
100
100
27
100
Inokulum (ml)
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Pufferoldat (ml)
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
Bevitt HE¹dózis
50 37,5
34 100
HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke; HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában.
4
34 28,6
50 37,5
1
HU 007 151 T2
Az I. táblázatban ismertetett kísérleti leírásból kapjuk az idõ függvényében felvett gáztérfogatgörbéket, amelyek nagyobbrészt szigmoid alakúak. Ezeket a görbéket az alábbi minta szerint modelleztük: Y=A/[1+(C/t)^B] ahol Y=a képzõdött gáz térfogata, t=az idõ, A, B és C=a modell paraméterei. Ezekbõl az egyenletekbõl analizáljuk a modellezett végsõ térfogatot (Vf) (Vf=A), valamint azt az idõt, amely alatt a gáztermelés aránya maximális, ezt Trm-nek nevezzük (ezt az idõt használjuk a latenciaidõ indirekt méréseként, amelyet ebben a kísérletben nem tudunk meghatározni). Elvégzünk egy varianciaanalízist (ANOVA) a kapott adatokkal, a tételek hatásának megállapítása céljából. Ha a kezelés hatásvalószínûsége szignifikáns, vagyis ha p<0,05, az átlagokat összehasonlítjuk a PLSD-teszttel (Fisher-féle), ami lehetõvé teszi a különbözõ kezelések átlagától való eltérések meghatározását. Eredmények Az eredmények az alábbi II. táblázatban láthatók. A II. táblázatban a paraméterértékek szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbnél, amikor a kezelések nem rendelkeznek közös betûvel. Elõször megfigyeljük, hogy valamennyi vizsgált készítmény szignifikánsan eltérõ eredményt ad az összehasonlító mintától mindkét kritériumban, vagyis a Vf¹ és
5
10
15
20
25
30
2
a Trm-értékben. A készítmények tehát csökkentik a csípõbélflóra aktivitását. A cél a Trm-érték maximalizálása. Valamennyi kísérleti tétel tehát hatékony. Kimutatjuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület, jelen esetben a HMTBA és az esszenciális olaj között a baktériumaktivitásra. Tulajdonképpen a negatív összehasonlító minta Trm-értéke 10,8 óra. A HMTBA-kezelés azonos Trmértéket eredményez, amibõl kiderül, hogy a HMTBA nincs, vagy csak kis hatással van a baktériumaktivitás beindítására, amikor egyedül alkalmazzuk. A HE1-gyel végzett kezeléssel 13,5 óra Trm-értéket kapunk. A HE1-nek tehát van hatása a baktériumaktivitásra. Az 1¹es számú keverékkel viszont 19,3 óra Trm-értéket kapunk. Az 1¹es számú keveréknek tehát olyan hatása van a baktériumaktivitásra, ami nagyobb mint a HE1 és a HMTBA külön-külön gyakorolt hatásának az összege. Az 1¹es számú keverék, továbbá a 2–5¹ös számú keverék, amivel ugyanilyen típusú eredményt kapunk, tehát szinergetikus hatást gyakorol a Trm-mel mért baktériumaktivitásra. A Vf mérése a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf¹érték minimalizálása. A leghatékonyabbnak tekintett elemek azok, amelyek minimalizálják a végsõ térfogatot, és ugyanakkor maximalizálják a Trm-értéket. Ezek a 3¹as és az 5¹ös számú keverék.
II. táblázat Kezelés
Vf (ml)
Trm (óra)
Negatív HMTBA összehasonlító
HE 1
1. kísérleti tétel
HE 2
2. kísérleti tétel
HE 3
3. kísérleti tétel
HE 4
4. kísérleti tétel
HE 5
5. kísérleti tétel
átlag
586
565
496
469
238
184
460
237
302
252
308
193
tipikus eltérés
17
21
41
18
34
17
9
48
113
18
55
8
különbség
a
a
b
bc
ef
f
c
ef
d
de
d
f
átlag
10,8
10,8
13,5
19,3
28,6
46,3
21,5
39,1
28,9
35,8
30,8
37,2
tipikus eltérés
0,2
0,2
0,1
1,8
1,2
3,1
4,6
3,4
0,4
1,3
1,9
3,1
különbség
a
a
b
c
d
f
c
e
d
e
d
e
Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben), Trm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maximális (óra), n számú kísérleti elem=HE n+HMTBA.
2. példa Az 1. példa kísérleti körülményeit és paramétereit ismételjük a 2. példában az alábbi III. táblázat szerint.
60 5
1
HU 007 151 T2
2
III. táblázat Kezelés
Negatív összehasonlító
HMTBA
HE 1
1. kísérleti elem
HE 2
2. kísérleti elem
Elem
0
HMTBA
HE 1
HMTBA+HE 1
HE 2
HMTBA+HE 2
Ismétlések száma
4
4
4
4
4
4
mg
0
83
0
83
0
83
tömeg%
0
100
0
84,7
0
84,7
mg
0
0
15
tömeg%
0
0
100
Inokulum (ml-ben)
10
10
10
10
10
10
Pufferoldat (ml-ben)
90
90
90
90
90
90
Bevitt HMTBA dózis Bevitt HE dózis
15 15,3
15 100
15 15,3
HE1: vörös kakukkfû, HE2: teafa, HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában.
Eredmények Az eredményeket a IV. táblázatban adjuk meg. IV. táblázat Negatív összehasonlító
HMTBA
HE 1
1. kísérleti elem
HE 2
2. kísérleti elem
átlag
542,0
296,2
226,7
203,1
319,6
361,1
tipikus eltérés
43,9
28,6
15,5
15,6
10,8
41,3
különbség
a
b
b
b
b
e
átlag
15,3
20,3
27,7
33,1
20,2
24,8
Kezelés
Vf (ml)
Trm (óra)
tipikus eltérés különbség
1,0
0,7
1,1
0,8
0,8
0,8
a
b
c
d
b
e
Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben), Trm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maxiális (óra), n számú kísérleti elem=HE n+HMTBA.
Ami a Trm¹et illeti, amelynek maximálisnak kell lenni, valamennyi vizsgált kezelés (HMTBA, HE és a kísérleti elemek) hatékonyak. Ismét kimutatjuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület, ami a HMTBA és az esszenciális olaj között a baktériumaktivitásra. A negatív összehasonlító példánál kapott Trm-érték 15,3 óra. A HMTBA kezeléssel 20,3 óra Trm-értéket kapunk. Tehát a HMTBA hatást fejt ki a baktériumaktivitásra, amikor egyedül alkalmazzuk. A HE1-gyel végzett kezeléssel a Trm-érték 27,7 óra, tehát a HE1-nek van hatása a baktériumaktivitásra. Az 1¹es számú keverékkel (vagy 1¹es számú kísérleti elemmel) 33,1 óra Trm¹et kapunk. Tehát az 1¹es számú keveréknek olyan hatása van a baktériumaktivitásra, amely nagyobb, mint a HE1 és a HMTBA különkülön kifejtett hatásának az összege. Tehát az 1¹es számú keverék, valamint a 2¹es számú keverék, amellyel hasonló típusú eredményeket kapunk, szinergetikus hatást mutat.
40
55
A Vf mérése a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf minimalizálása. A leghatékonyabbnak tekintett elemek azok, amelyekkel minimális a végsõ térfogat, és ugyanakkor maximális a Trm. Ez tehát az 1¹es számú keverék. Megjegyzés: A jelen bejelentés különbözõ példáiban a Vf¹ és Trm-értékek közötti különbség abból adódhat, hogy eltérõ emésztett tartalmat vizsgálunk, különbözõ állatcsoportokból. Annak ellenére, hogy a tenyésztés, a táplálék és a mintavétel körülményei azonosak, a tenyészállat emésztõrendszerében található baktériumpopulációk sohasem teljesen azonosak. A példák függvényében megfigyelt értékek közötti eltérések a különbözõ mintavételekben jelen lévõ baktériumflóra típusai közötti eltéréseknek köszönhetõk.
60
3. példa Az 1. példa kísérleti körülményeit és paramétereit alkalmaztuk a 3. példában, amint az az alábbi V. táblázatból látható.
45
50
6
1
HU 007 151 T2
2
V. táblázat Kezelés
Negatív összehasonlító
HMTBA
HE 1
1. kísérleti elem
Elem
0
HMTBA
HE 1
HMTBA+HE 1
Ismétlések száma
4
4
4
4
Bevitt HMTBA-dózis mg
mg
0
83
0
83
tömeg%
0
100
0
84,7
mg
0
0
15
tömeg%
0
0
100
Inokulum (ml-ben)
10
10
10
10
Pufferoldat (ml-ben)
90
90
90
90
Bevitt HE¹dózis
15 15,3
HE1: fahéj, HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában.
Eredmények Az eredményeket az alábbi VI. táblázatban adjuk meg. VI. táblázat Kezelés
Vf (ml)
Trm (óra)
Negatív összehasonlító
HMTBA
HE 1
átlag
632,7
334,3
218,3
tipikus eltérés
23
86
82
10
különbség
a
b
c
e
átlag
14,1
28,1
53,5
>72
tipikus eltérés
0,1
2,2
10,9
nd
a
b
különbség
c
1. kísérleti elem
20,0
d
Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben), Trm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maxiális (óra), n számú kísérleti elem=HE n+HMTBA, nd: nem határoztuk meg.
Valamennyi vizsgált készítménynél szignifikánsan eltérõ eredményeket kapunk, mint az összehasonlító vizsgálatban mindkét kritérium, vagyis a Vf és a Trm szempontjából. A készítmények tehát csökkentik a csípõbélflóra aktivitását. Ami a Trm¹et illeti, amelynek maximálisnak kell lenni, valamennyi vizsgált kezelés (HMTBA, HE és a kísérleti elem) hatékony. Ismét kimutattuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metionin, itt a HMTBA, és az esszenciális olaj, itt a fahéj esszenciális olaj között a baktériumaktivitásra. A negatív összehasonlító Trm-értéke 14,1 óra. A HMTBA kezeléssel 28,1 óra Trm¹et kapunk. A HMTBA-nak tehát hatása van a baktériumaktivitásra, amikor önmagában alkalmazzuk. A HE1 kezeléssel 53,5 óra Trm-értéket kapunk. A HE1 tehát hatást gyakorol a baktériumaktivitásra. Az 1¹es számú keverék (vagy 1¹es számú kísérleti elem) „nagyobb mint 72 óra” Trm-értéket eredményez. Tehát gyakorlatilag teljesen baktericid hatása
40 van, ami megakadályozza az emésztõrendszer tartalmából származó baktériumok által termelt gázfejlõdést. A HMTBA és a fahéj esszenciális olaj kombinációja tehát nagyon erõs hatást fejt ki a baktériumaktivitásra, az a hatás nagyobb, mint a fahéj esszenciális 45 olaj és a HMTBA külön-külön kifejtett hatásának az összege. Az 1¹es számú keverék tehát erõs szinergetikus hatást mutat. Lásd a 6. ábrát. A Vf mérése a kezelés hosszú távú hatására utal. 50 A cél a Vf minimalizálása. A leghatékonyabb elemeknek azokat tekintjük, amelyek minimalizálják a végsõ térfogatot, és ugyanakkor maximalizálják a Trm-értéket. Az 1¹es számú keverék megfelel ezeknek a jellem55 zõknek, tehát különösen hatékonynak tekinthetõ. 4. példa Az 1. példa kísérleti körülményeit és paramétereit alkalmaztuk a 4. példában is, amint azt a VII. táblázat60 ban bemutatjuk. 7
1
HU 007 151 T2
2
VII. táblázat Kezelés
Negatív összehasonlító
HMTBA
MHE
1. kísérleti elem
Elem
0
HMTBA
MHE2
HMTBA + MHE2
Ismétlések száma
4
4
4
4
Bevitt HMTBA-dózis Bevitt HE¹dózis
mg
0
83
0
83
tömeg%
0
100
0
84,7
mg
0
0
15
tömeg%
0
0
100
15
Inokulum (ml-ben)
10
10
10
10
Pufferoldat (ml-ben)
90
90
90
90
15,3
MHE: 3/4 rész teafa, 1/4 rész fahéj esszenciális olaj, HMTBA: biológiailag hozzáférhetõ metionin 2¹hidroxi-4-metil-tiobutánsav formában.
Eredmények Az eredményeket a VIII. táblázatban adjuk meg. VIII. táblázat Kezelés
Vf (ml)
Negatív összehasonlító
HMTBA
MHE1
1. kísérleti elem
átlag
518
421
377
253
tipikus eltérés
35
37
21
2
a
b
b
különbség Tm (óra)
d
átlag
11,1
15,4
19,0
25,3
tipikus eltérés
1,4
1,7
2,7
2,6
különbség
a
b
d
e
Vf: a termelt gáz végsõ térfogata (ml-ben) Tm: az idõ, amikor a gáztermelés aránya maxiális (óra).
Ismét kimutatjuk, hogy szinergetikus hatás van a biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és az esszenciális olaj keverék között a baktérium aktivitására. A negatív összehasonlító minta Trm-értéke 11,1 óra. Ami a kísérleti elemet illeti, ami 84,7% HMTBA-ból és 15,3% keverékbõl áll, amely 3/4 részben teafa esszenciális olaj és 1/4 részben fahéj esszenciális olaj keveréke: – a HMTBA kezelés 15,4 óra Trm-értéket eredményez. Tehát a HMTBA-nak hatása van a baktériumaktivitásra, amikor önmagában alkalmazzuk (különbség van a negatív összehasonlító mintához képest), a különbség értéke: 4,3 óra. – az MHE kezeléssel 19,0 óra Trm-értéket kapunk. A HE1-nek tehát hatása van a baktériumaktivitásra (különbség mutatkozik a negatív összehasonlító mintához képest), a különbség értéke: 7,9 óra. – a keverék (vagyis a kísérleti elem) 25,3 óra Trmértéket ad. A keveréknek tehát olyan hatása van a baktériumaktivitásra, amely nagyobb mint az MHE2 és a HMTBA hatásának összege külön alkalmazva. Tulajdonképpen a (25,3–11,1) nagyobb, mint (4,3+7,9).
40
45
50
55
60 8
A keveréknek tehát szinergetikus hatása van a baktériumaktivitásra. A Vf mértéke a kezelés hosszú távú hatására utal. A cél a Vf minimalizálása. A leghatékonyabb elemeknek azokat tekintjük, amelyek minimalizálják a végsõ térfogatot, és ugyanakkor maximalizálják a Trm-értéket. Ebben a kísérletben alkalmazott keverék megfelel ezeknek a jellemzõknek, tehát különösen hatékonynak tekinthetõ. 5. példa Az 1. példában kimutattuk 5 esszenciális olaj keverék hatékonyságát a búzaalapú táplálékkal táplált állatokból származó csípõbélflóra aktivitásának csökkentésére. Ennek a kísérletnek a célja annak a kimutatása, hogy az említett keverékbõl három ugyancsak csökkenti az olyan csirkék csípõbél flórájának a hatását, amelyeket kukoricaalapú táplálékkal tápláltak. Állatok és mintavétel A körülmények azonosak az 1. példában alkalmazott körülményekkel.
1
HU 007 151 T2
2
Eredmények Az eredményeket a IX. táblázatban adjuk meg.
In vitro teszt A kísérleti sémát az I. táblázatban mutatjuk be a 2¹es, 3¹as, 4¹es és 5¹ös keverékre. IX. táblázat Kezelés
Vf (ml)
Tm (óra)
Negatív összehasonlító
átlag
455
tipikus eltérés
11,8
különbség átlag tipikus eltérés különbség
HE2+HMTBA
HE3+HMTBA
203
HE4+HMTBA
201
8,4
1,5
a
b
17,1
30,1
228
HE5+HMTBA
206
14,4
13,9
b
b
b
22,1
28,0
30,3
0,68
1,86
1,18
0,63
2,20
a
d
b
c
d
HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke.
A táblázatban a paraméter értékek szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbnél, amikor a kezelésekben nincsen közös betû. A 4 vizsgált keverék szignifikánsan csökkenti a Vf¹értéket és szignifikánsan növeli a Trm-értéket az összehasonlító mintához viszonyítva. Következésképpen ezek a termékek hatékonyan csökkentik a kukoricaalapú táplálékkal táplált csirkék csípõbélflórájának az aktivitását mind rövid idõ alatt, mind hosszú idõ alatt, ugyanúgy, ahogy a búzaalapú táplálékkal táplált csirkék flórája esetében (az 1. példában). Ezek a keveréket tehát hatékonyak mindkét alkalmazott tápláléktípussal. 6. példa Az 1. és 5. példában kimutattuk több esszenciális olaj keverék hatékonyságát a húscsirkékbõl származó csípõbélflóra aktivitására.
20
25
30
Ennek a vizsgálatnak a célja, hogy megismerjük ezen keverékek hatékonyságát sertés vakbélflóráján. Állatok Sertéseket nevelünk a 100. napig, majd anaerob körülmények között kivesszük a vakbelük tartalmát. In vitro tesztek A kísérleti vázlatot az I. táblázatban ábrázoltuk a 2¹es, 3¹as és 4¹es számú keveréknél.
Eredmények Az eredményeket a X. táblázatban mutatjuk be. Ebben a táblázatban a paraméterek értékei szignifi35 kánsan eltérnek az 5%¹os küszöbön, amikor a kezelésekben nincsen közös betû.
X. táblázat Kezelés
Vf (ml)
átlag tipikus eltérés különbség
Trm (óra)
átlag tipikus eltérés különbség
Negatív összehasonlító
HE2+HMTBA
HE3+HMTBA
HE4+HMTBA
430
265
344
412
48,0
2,5
ab
d
21,1
23,9
0,36
1,25
a
bc
27,4 c 25,8
17,4 b 25,2
2,04
1,30
c
c
HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke.
Valamennyi vizsgált keverék csökkenti a Vf¹értéket, szignifikánsan a 2. és 3., átlagosan a 4. keverékre, és szignifikánsan növelik a Trm-értéket az összehasonlító mintához viszonyítva. A keverékek tehát hatékonyan csökkentik sertések vakbélflórájának aktivitását mind rövid távon, mind hosszú távon.
55
Tehát 3 keverék mûködik mind a csirke, mind a sertés flóráján.
7. példa Ennek a vizsgálatnak a célja összehasonlítani leg60 alább egy esszenciális olaj és a HMTBA hatékonysá9
1
HU 007 151 T2
gát akkor, amikor a vegyületeket külön-külön alkalmazzuk, üvegekben (a két termék kis mennyiségben található 100 ml oldatban; tehát kicsi az érintkezés közvetlenül a molekulák között), vagy úgy alkalmazzuk, hogy elõzetesen az oldathoz történõ hozzáadásuk elõtt összekeverjük ezeket. Állatok Ehhez a vizsgálathoz 35 napos, búzaalapú táplálékkal táplált csirkékbõl származó csípõbélflórát alkalmazunk.
2
In vitro tesztek Ebben a vizsgálatban az 1. példában vizsgált egyik keveréket vizsgáljuk. A kísérleti adatokat az I. táblázatban adjuk meg a 2¹es számú keverékre. 5 Eredmények Az eredményeket a XI. táblázatban adjuk meg. A táblázatban a paraméter értékek szignifikánsan eltérnek az 5%¹os küszöbtõl, amikor a kezelésekben 10 nincsen közös betû.
XI. táblázat Kezelés
Negatív összehasonlító
Vf (ml)
átlag
532
tipikus eltérés
184
20,4
különbség Tm (h)
HE 2+HMTBA keverés után
átlag különbség
24,4
c
14,8
tipikus eltérés
407
23,3
a
HE 2+HMTBA külön alkalmazva
b
31,3
19,4
0,45
3,31
0,66
a
c
a
HE: esszenciális olaj vagy esszenciális olajok keveréke.
A HE2+HMTBA hatása lényegesen nagyobb, amikor a két vegyületet az üvegbe történõ adagolás elõtt keverjük össze: az elõzetes érintkezés különösen nagymértékben javítja a vegyületek flórára gyakorolt hatását. Feltételezhetjük tehát, hogy a vegyületek között fizikokémiai kölcsönhatások vannak, ezek a kölcsönhatások módosítják a hatékonyságukat. Ez igazolja, hogy egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és legalább egy esszenciális olaj keverékének szinergetikus hatása van.
8. példa Állatok Ebben a vizsgálatban 35 napos, búzaalapú táplá30 lékkal táplált csirkékbõl származó csípõbélflórát vizsgálunk. In vitro tesztek A kísérlet vázlatát a XII. táblázatban adjuk meg. 35
XII. táblázat Kezelés
Negatív összehasonlító
HMTBA
MHE
Kísérleti elem
Elem
0
HMTBA
HE
HMTBA+HE
Ismétlések száma
4
3
3
3
mg
0
113
0
113
tömeg%
0
100
20
89,7
mg
0
0
13
13
tömeg%
0
0
100
Inokulum (ml-ben)
10
10
10
10
Pufferoldat (ml-ben)
90
90
90
90
Bevitt HMTBA-dózis
Bevitt HE¹dózis
HE: oreganoolaj.
Eredmények Az eredményeket a XIII. táblázatban adjuk meg. A táblázatban a paraméterértékek szignifikánsan különbözõek az 5%¹os küszöbnél, amikor a kezelések nem tartalmaznak közös betût.
60 10
10,3
1
HU 007 151 T2
2
XIII. táblázat Kezelés
Vf (ml)
Tm (h)
HMTBA
Negatív összehasonlító
átlag
407
353
HE
300
HE+HMTBA
224
tipikus eltérés
45,1
17,7
127,6
különbség
a
a
a
a
átlag
16,0
16,2
18,3
20,3
tipikus eltérés különbség
1,9
1,67
0,71
0,99
0,67
a
a
a
a
Amikor önmagában alkalmazzuk, a HMTBA-nak nincs szignifikáns hatása a fermentációra, ugyanúgy, hogy az 1. példában volt megfigyelhetõ. Az oreganoolaj a Trm-értéket átlagosan 2,3 órával növeli meg a negatív összehasonlító mintához képest (szignifikáns hatás). Az oreganoolaj és a HMTBA keveréke a Trm-értéket 4,3 órával növeli meg a negatív összehasonlító mintához viszonyítva. A keverék hatása szinergetikus a baktériumflóra aktivitására. Az olaj és a HMTBA tehát szinergiában hatnak a flóra aktivitásának rövid távú csökkentésére.
4. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készít15 mény, ahol az a) vegyületet a következõk közül választjuk: maga a metionin (L¹metionin vagy D,L-metionin), vagy annak valamely só, amid, alkil-észter vagy alkoholos észter típusú származéka, ketonszármazék, hidroxianalóg vagy az említettek származéka. 5. Az elõzõ igénypontok bármelyike szerinti készít20 mény, ahol az a) vegyület az (I) általános képlettel jellemezhetõ:
25
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Tenyészállatok táplálására szolgáló biológiailag hozzáférhetõ metionint tartalmazó szinergetikus készítmény, amely tartalmaz: a) egy biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet és b) legalább 5 tömeg% legalább egy esszenciális olajat. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely a következõket tartalmazza: a) 5–95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyületet, b) 5–95 tömeg% legalább egy esszenciális olajat és c) adott esetben legalább egy egyéb vegyületet. 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely az alábbiakból áll: a) 5–95 tömeg% biológiailag hozzáférhetõ metioninvegyület és b) 5–95 tömeg% legalább egy esszenciális olaj.
30 ahol R jelentése hidrogénatom vagy izopropilcsoport és R’ jelentése –OH vagy –NH2 csoport. 6. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása állat táplálására szolgáló táplálék 35 elõállítására. 7. Az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása táplálékadalék elõállítására. 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás táplálékadalék elõállítására tenyészállatoknál az endogén flóra aktivi40 tásának csökkentésére. 9. A 7. igénypont szerinti alkalmazás táplálékadalék elõállítására tenyészállatok teljesítményei, így növekedés, életképesség, homogenitás, tenyésztés hatékonysága javítására. 10. A 7. igénypont szerinti alkalmazás gyógyszerol45 dat elõállítására tenyészállatok bélflórájának patogén mikroorganizmusai káros hatásai leküzdésére.
11
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
