!HU000007928T2! (19)
HU
(11) Lajstromszám:
E 007 928
(13)
T2
MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal
EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (51) Int. Cl.:
(30) Elsõbbségi adatok: 636575 P 2004. 12. 16.
(73) Jogosult: JANSSEN PHARMACEUTICA N. V., 2340 Beerse (BE)
US
(72) Feltalálók: MOYER, John, Allen, Buck County, PA 18901 (US); ASHTON, David, B-2300 Turnhout (BE); KALIVAS, Peter, Charleston, SC 29425 (US); KLITENICK, Mark, Bridgewater, NJ 08807 (US) (54)
HU 007 928 T2
A61K 31/341
(21) Magyar ügyszám: E 05 849954 (22) A bejelentés napja: 2005. 12. 15. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20050849954 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1830833 A2 2006. 06. 22. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1830833 B1 2010. 01. 27.
(2006.01) A61K 31/381 (2006.01) A61K 31/517 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01) A61P 25/18 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 06066121 PCT/US 05/045749
(74) Képviselõ: dr. Molnár István, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest
Egy glicintranszporter (glyt1)inhibitor és egy antipszichotikum kombinációja skizofrénia tüneteinek kezelésére, eljárás annak elõállítására és alkalmazása
A leírás terjedelme 8 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1
HU 007 928 T2
Szabadalmi leírás Kereszthivatkozás rokon szabadalmi bejelentésekre A jelen szabadalmi bejelentés a 60/636 575 számú, 2004. december 16¹án benyújtott szabadalmi bejelentés elsõbbségét igényli. A találmány szerinti szakterület A jelen találmány skizofrénia tüneteinek megelõzésére és kezelésére vonatkozik. Konkrétabban, a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények és kezelések, amelyek egy antipszichotikumot és egy GlyT1 inhibitort tartalmaznak skizofrénia tüneteinek kezelésére, amely olyan rendellenességekkel függ össze, mint amilyen a skizofrénia, a demencia, a depresszió, az Alzheimer-kór, az ADHD, a hatóanyagokkal való visszaélés és szorongás. A találmány hátterének ismertetése A skizofrénia és a bipoláris rendellenesség tradicionális modelljei dopaminerg rendszerekre fókuszáltak. A dopaminantagonisták és/vagy a dopaminfolyamatok károsodásai csökkentik a fenciklidin (PCP) hatásait két olyan viselkedési jellegzetességben, amelyekrõl úgy gondolják, hogy relevanciával bírnak a skizofrénia klinikai tünettanához: érzékelési feladatok, ezen belül a munkamemória és a lokomotoros aktivitás [Adams és munkatársai (1998)]. Adams és munkatársai ismertetik azon felismeréseket, amelyek jelzik, hogy a dopaminneurotranszmisszió aktiválása nem elégséges a PCP által kiváltott lokomotoros aktivitás fenntartására és a munkamemória károsodásának javítására, és hogy a glutamaterg hiperstimuláció felelõs lehet a PCP pszichotomimetikus és érzékelést károsító hatásaiért. A PCP egy olyan pszichotikus állapotot indukál, amely nagyon hasonlít a skizofréniára az N¹metil-D-aspartát (NMDA)-típusú glutamátreceptoroknál közvetített neurotranszmisszió blokkolása útján [Javitt és munkatársai (1997)]. A PCP-szerû hatóanyagok különlegesen reprodukálják a skizofrénia negatív, kognitív és pozitív tüneteit. A pozitív tünetek olyan viselkedési extremitások, amelyeket általában pszichotikusként tekintenek (például hallucinációk, érzéki csalódások, bizarr magatartás), míg a negatív tünetek a normális magatartás hiányát jelentik (például normális szociális reakciókészség hiánya, érzelmi reaktivitás hiánya). A kognitív diszfunkciók körébe tartoznak a munkamemória, a végrehajtó funkciók, a fenntartott figyelem, az érzékelési jelek alapvetõ feldolgozása, a verbális epizódos memória és a sima fenntartott szemmozgások károsodása. A skizofrénia újabb modelljei ma megkövetelik, hogy a skizofrénia összefüggésben álljon az agy NMDA-típusú glutamátreceptorainál szabályozott neurotranszmisszió diszfunkciójával vagy diszregulációjával. A skizofrénia NMDA-modellje feltárta a lehetõséget, hogy azon szerek, amelyek fokozzák az NMDA-receptor által szabályozott neurotranszmissziót, terápiásan elõnyösek lehetnek a skizofréniában. Az NMDA-receptornál ható primer neurotranszmitter a glutamát. Azonban az
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 2
2
NMDA-receptor-aktivitást modulálja az aminosav glicin is, amely hozzákötõdik egy szelektív modulátor helyhez, amely az NMDA-receptor komplex integráns komponense. Az 5 854 286 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti az étkezési mennyiségekben orálisan beadott glicin alkalmazását skizofrénia kezelésére. A glicint teljes antagonistának tekintik az NMDA-val összefüggõ glicin-kötõhelynél (McBain és munkatársai, 1989). A D¹szerin, mint a glicin, az agyban nagy koncentrációban van jelen, és endogén ligandumként szolgálhat az NMDA-receptor komplex glicin-kötõhelyéhez [Schell és munkatársai (1995)]. A 6 162 827 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti a D¹szerin alkalmazását pszichózis tüneteinek kezelésében. Bár a glicinnel és D¹szerinnel összefüggõ felismerés alátámasztja a teljes glicinhely-antagonisták alkalmazását, mások azt feltételezték, hogy részleges antagonisták a glicinhelynél, így például a D¹cikloszerin nevû hatóanyag hatásosabb, mint a teljes antagonisták a skizofrénia kezelésében (lásd például: 5 187 171 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A részleges antagonisták ugyanahhoz a helyhez kötõdnek, mint a teljes antagonisták (azaz az NMDAreceptor komplex glicinfelismerési helyéhez), de a csatornanyitást kisebb százalékos értékig fokozzák (tipikusan a teljes antagonistáknál látott aktiváció 40–70%áig; McBain és munkatársai, 1989). Klinikai vizsgálatok a D¹cikloszerinnel alátámasztották azt a koncepciót, hogy a parciális glicinhely-antagonisták hatásosak lehetnek skizofrénia kezelésében (lásd a D’Souza és munkatársai, 1995, szakirodalmi hely szerinti áttekintést), és a D¹cikloszerin vizsgálataiban látott javulási fok (lásd: a D’Souza és munkatársai, 1995, szakirodalmi hely szerinti áttekintést) összehasonlítható bizonyos körülmények között a glicinnel végzett vizsgálatoknál tapasztalt javulási fokkal (lásd: a D’Souza és munkatársai, 1995, szakirodalmi hely szerinti áttekintést) vagy a D¹szerinnel [Tsai és munkatársai (1998)]. Az NMDA-receptor által szabályozott neurotranszmisszió fokozásához egy második potenciális közelítés az olyan hatóanyagok beadása, amelyek gátolják a glicintranszportereket az agyban, ezáltal megakadályozzák a glicin eltávolítását a központi idegrendszeren belül aktív helyekrõl. Sok éve ismert, hogy az agy aktív transzport-rendszereket tartalmaz glicinre, amely szabályozhatja az agyi szinteket (D’Souza, 1995). Az újabb vizsgálatok demonstrálták, hogy glicintranszporterek különbözõképpen expresszáltak különbözõ agyi régiókban [Liu és munkatársai (1993); Zafra és munkatársai (1995)] és lehetséges, hogy együttesen helyezkednek el NMDA-receptorokkal [Smith és munkatársai (1992)]. Azonban sok éve ismert, hogy az extracelluláris glicinszintek felette vannak annak a szintnek, amely az NMDA-val összefüggõ glicin-kötõhely telítéséhez szükséges, tisztázatlanná téve, hogy vajon a glicintranszporterek valójában képesek¹e fenntartani az alultelített glicinszinteket az NMDA-receptorok közvetlen szomszédságában. Ez egy annyiban központi kérdés,
1
HU 007 928 T2
hogy amennyiben a glicinszintek már a telítési szinteknél vagy azok felett voltak, további glicin elméleti alapokon nem lenne képes az NMDA funkcionálás serkentésére (Wood, 1995). Mivel a glicin egy kötelezõ együttes agonista a glutamáttal, az NMDA-receptornál feltételezték, hogy a Gly¹T1 a szinaptikus lehasításnál az alultelítettségi szintek fenntartása érdekében funkcionál [Bergeron és munkatársai (1998)]. Ha pszichológiai körülmények között az NMDA-receptor glicin-kötõhelye valójában telítetlen, akkor a szinaptikus glicinkoncentráció modulálása egy Gly¹T1 inhibitor alkalmazásával egy eljárás lenne az NMDA-receptor-funkció fokozására. [Slassi és munkatársai (2004)]. Ez egy vonzó közelítés, mivel képes lenne elkerülni azon antagonisták toxikus hatásait, amelyek közvetlenül hatnak az NMDA-receptorra. A skizofrénia egy érzékelési és viselkedési rendellenesség, amely az emberi népesség legfeljebb 1%¹át érinti. Más betegállapotok olyan tüneteket mutatnak, amelyeket skizofréniában is láttunk. A skizofrénia és hasonló betegállapotok tünetei etiológiájának jelenlegi megértése tisztázatlan marad, de rámutat genetikai és környezeti tényezõk kombinációjára. A skizofrénia és hasonló betegállapotok kezelésére szolgáló gyógyszerek iránti kutatás hagyományosan dopaminreceptorantagonistákra fókuszált, és újabban olyan hatóanyagokra, amelyek kombinálják a dopaminreceptor-blokádot más receptoroknál antagonista/agonista hatásokkal. Állatmodellekkel való munka alapján és annak a ténynek az alapján, hogy NMDA glutamátreceptorok blokádja normál emberi alanyokban skizofréniaszerû tüneteket produkál, feltételezték, hogy a glutamátrendszer alulmûködése – különösen az NMDA-receptornál – alapjául szolgál néhány tünetnek a skizofréniában [Goff és Coyle (2001)]. Azonban azok a hatóanyagok, amelyek közvetlenül gátolják vagy serkentik az NMDAreceptorokat, nem bizonyultak biztonságosnak a rutinszerû pácienskezelésre állatmodellekben és korai klinikai vizsgálatokban. Szerencsére, az NMDA-receptor egy komplex heteromer csatorna, amely farmakológiailag modulálható, finomabb módon, mint egyszerûen a glutamát-kötõhely blokkolásával vagy serkentésével [Nakanishi és munkatársai (1998)]. A glicin egy szükségképpeni társagonista az NMDA-típusú glutamátreceptor-komplex NR1 alegységénél. Ennélfogva, a növekvõ tónus a glicin-kötõhelyen (azaz, a növekvõ extracelluláris glicin) fokozza a glutamátkapacitást, így felnyitja az NMDA-csatornát. Mivel adott a javasolt csökkentés az NMDA-aktivitásban skizofrénia esetén, feltették, hogy a növekvõ mennyiségû extracelluláris glicin növelheti az NMDA-konduktanciákat, és ezáltal enyhíti a skizofrénia és hasonló betegállapotok néhány tünetét. Parsons és munkatársai (1998) és Danysz és munkatársai (1998) áttekintést ismertettek az NMDA-receptor szerepére vonatkozó adatokról központi idegrendszeri rendellenességek széles körében. A 6 355 681 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti a glicin és prekurzorok alkalmazását pszichózis tüneteinek kezelésében.
5
10
15
20
25
30
2
A 20020161048 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismerteti helyettesített glicin és prekurzorok alkalmazását pszichózis tüneteinek kezelésében. A 20020183390 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés eljárást és készítményt ismertet NMDA-receptor által közvetített transzmisszió fokozására, amely magában foglalja egy D¹szerin-transzport inhibitor alkalmazását. A 20020183390 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismerteti, hogy az eljárás és készítmény alkalmazható neuropszichiátriás rendellenességek, így például skizofrénia kezelésében. Egy mechanizmus az extracelluláris glicin mennyiségének növelésére annak az extracelluláris térbõl való kiürülésének megakadályozása a glicin transzporter 1 (GlyT1) segítségével történõ felvételen keresztül [Javitt és Frusciante (1997)]. Aragon és munkatársai (2003) áttekintették a glicintranszport-inhibitorok lokalizációját, transzportmechanizmusát, struktúráját, szabályozását és farmakológiáját. Javitt (2002) ismerteti, hogy az NMDA-receptor-diszfunkció szerepet játszhat a skizofrénia pathofiziológiájában. Javitt (2002) ismerteti azt is, hogy a GlyT1 inhibitorok egy „következõ generációs” közelítést jelenthetnek a skizofrénia tartós negatív és kognitív tüneteinek kezeléséhez. Az 5 837 730 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, hogy egy glicintranszportinhibitor, a glicil-dodecil-amid (GDA) képes glicinszerû viselkedési hatásokat kiváltani rovarokban. Az ismertetett referenciák egyike sem ismerteti vagy javasolja a találmány szerinti GlyT1 inhibitor és antipszichotikum kombinációját.
35 A találmány rövid ismertetése A jelen találmány célja egy gyógyászati készítmény, amely egy antipszichotikumot és egy GlyT1 inhibitort tartalmaz az 1. igénypont szerint. A jelen leírásban – csak információs célokból – eljá40 rást ismertetünk skizofrénia tüneteinek kezelésére, amely magában foglalja egy antipszichotikum és egy GlyT1 inhibitor kombinációjának beadását. A jelen leírásban – csak információs célokból – eljá45 rást ismertetünk extracelluláris glicinszintek növelésére emlõsökben, amely magában foglalja egy antipszichotikumnak egy GlyT1 inhibitorral kombinációban történõ beadását. A jelen leírásban – csak információs célokból – eljá50 rást ismertetünk extracelluláris dopaminszintek növelésére emlõsökben, amely magában foglalja egy antipszichotikumnak egy GlyT1 inhibitorral kombinációban történõ beadását. Az ábrák rövid ismertetése 1A–1D. összehasonlító ábrák 1. számú kísérlet, risperidon hatásai extracelluláris glicinre (felsõ panelek) és dopaminra (alsó panelek) a patkánystriatumban. A dózisokat a nyilak által jelölt nö60 vekvõ rendben adtuk be. A jobb panelekben lévõ ada55
3
1
HU 007 928 T2
tokat normalizáltuk a százalékos változásra a három alapvonalérték átlagáról (azaz az elsõ nyíl elõtt kapott adatok). Az adatokat középérték ± átlagos eltérés formájában mutatjuk be, és azokat statisztikailag egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltük idõben megismételt mérésekkel. 2A–2D. összehasonlító ábrák 2. számú kísérlet, az 1. számú vegyület hatásai extracelluláris glicinre (felsõ panelek) és dopaminra (alsó panelek) a patkánystriatumban. A dózisokat a nyilak által jelölt növekvõ rendben adtuk be. A jobb panelekben lévõ adatokat normalizáltuk a százalékos változásra a három alapvonalérték átlagáról (azaz az elsõ nyíl elõtt kapott adatok). Az adatokat középérték ± átlagos eltérés formájában mutatjuk be, és azokat statisztikailag egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltük idõben megismételt mérésekkel.
2
1. számú vegyület, amelyet a 6 426 364; 6 525 085 és 6 579 987 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetnek. 5
10 C24H20NNaO3 (molekulatömeg 393,42) 2. számú vegyület, amelyet a 6 426 364; 6 525 085 és 6 579 987 számú amerikai egyesült álla15 mokbeli szabadalmi leírásokban ismertetnek.
3A–3D. ábrák 3. kísérlet, risperidon és az 1. számú vegyület kombinációjának hatásai extracelluláris glicinre a striatumban. A hatóanyag együttes beadását a nyílnál végeztük el. A jobb panelekben lévõ adatokat normalizáltuk a százalékos változásra a három alapvonalérték átlagáról (azaz az elsõ nyíl elõtt kapott adatok). Az adatokat középérték ± átlagos eltérés formájában mutatjuk be, és azokat statisztikailag egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltük idõben megismételt mérésekkel. Risperidon és az 1. számú vegyület kombinációjának hatásai az extracelluláris dopaminra a striatumban. A hatóanyag együttes beadást a nyílnál végeztük el. A jobb panelekben lévõ adatokat normalizáltuk a százalékos változásra a három alapvonalérték átlagáról (azaz az elsõ nyíl elõtt kapott adatok). Az adatokat középérték ± átlagos eltérés formájában mutatjuk be, és azokat statisztikailag egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltük idõben megismételt mérésekkel.
20
Az elõnyös kiviteli alakok részletes ismertetése Azt találtuk, hogy egy antipszichotikum egy GlyT1 inhibitorral történõ kombinálásával skizofrénia tüneteinek kezelésében váratlan növekedést tapasztalunk az extracelluláris glicinben. A jelen találmány egy antipszichotikum/GlyT1 inhibitor kombinációra irányul az 1. igénypont szerint. A kombináció szerinti antipszichotikum és GlyT1 inhibitor egyaránt beadható külön, vagy lehet együtt egy egység gyógyászati készítményben. Az antipszichotikum/GlyT1 inhibitor kombináció alkalmazható a skizofrénia tüneteinek kezelésében, amely tünetek olyan rendellenességekkel függnek össze, mint például skizofrénia, demencia, depresszió, Alzheimer-kór, ADHD, hatóanyagokkal való visszaélés és szorongás. Számos vegyület, ezen belül az 1. számú vegyület és a 2. számú vegyület megkötõdik és gátolja a glicinfelvételt a GlyT1¹en keresztül. A GlyT1 inhibitorok – amelyek a találmánnyal összhangban alkalmazhatók – ezért a következõk:
40
C24H21NO3 (molekulatömeg 371,44) 25 Az antipszichotikumok, amelyek a találmánnyal összhangban alkalmazhatók, atipikus antipszichotikumok. Az atipikus antipszichotikumok körébe tartozik a ris30 peridon, 3¹[2¹[4¹(6¹fluor-1,2-benzizoxazol-3¹il)-piperidin]-etil]-2-metil-6,7,8,9-tetrahidro-4H-pirido[1,2¹a]pirimidin-4¹on és annak alkalmazását pszichotikus betegségek kezelésében a 4,804,663 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik. Idetartoznak a vegyület gyógyászatilag elfogadható 35 sói, gyógyászatilag elfogadható észterei és enantiomer formái.
45
50
55
60 4
Példák Az eredmények összegzése Dopamin transzmissziós mikrodialízis vizsgálatokat végeztünk annak meghatározására, hogy az 1. számú vegyület befolyásolja¹e a dopamintranszmissziót az agyban. Napjainkig a dopamintranszmissziót gátló vegyületek a leghatásosabb gyógyszerek a skizofrénia ellen. Hasonlóan az is ismert, hogy a legtöbb hatóanyag, amely skizofréniában hatásos, antagonista hatást vált ki a D2 dopamin autoreceptorokon, ezáltal növeli az extracelluláris dopamint [Ferre és munkatársai (1995)]. Annak meghatározására, hogy az 1. számú vegyület szinergetikus¹e ezzel a hatással, az 1. számú vegyületet kombináltuk az antipszichotikum risperidonnal, és mind a glicinre, mind a dopaminra gyakorolt hatásukat kvantifikáltuk a striatumban. Egy kumulatív dózis-válasz görbe az 1. számú vegyületre feltárta a várt dózisfüggõ növekedést az extracelluláris glicinszintekben a striatumban. Míg a legalacsonyabb dózis (0,63 mg/kg) hatás nélküli maradt, az 1. számú vegyület legmagasabb dózisa (10 mg/kg) 2,5-szeres növekedést okozott a glicinben. Bár a glicin-
1
HU 007 928 T2
re nem gyakorolt hatást, az 1. számú vegyület legalacsonyabb dózisa szignifikáns csökkenést produkált az extracelluláris dopaminban, és 2,5 mg/kg beadása után a dopaminszintek normalizálódtak és változatlanok maradtak még az 1. számú vegyület legmagasabb dózisa hatására is. A risperidon dózisfüggõ növekedést eredményezett mind az extracelluláris dopaminban, mind a glicinben; bár a dopaminra gyakorolt hatást vártuk a D2 autoreceptorok blokádjának megfelelõen, a megjelölt emelkedés glicinben váratlan volt. A dopaminhoz hasonló módon a glicinben a növekedés 0,16 mg/kg risperidon küszöbdózisánál következett be. Valójában a risperidon egyenlõen hatásos az extracelluláris glicinben való növekedés produkálásában az 1. számú vegyülettel, amint azt a 2,5-szeres növekedés jelzi a glicinben 2,5 mg/kg risperidon után. Minden egyes hatóanyag hatása önmagában additív volt, amikor a hatóanyagokat együtt adtuk be. Azaz az 1. számú vegyület és a risperidon kombinációja nagyobb növekedést okozott a glicinben, mint bármelyik hatóanyag önmagában, elérve egy 6¹szoros növekedést 1 mg/kg risperidon és 10 mg/kg 1. számú vegyület kombinációja után. Továbbá összhangban a dopaminban a kétfázisú csökkenéssel 1. számú vegyület hatására azt találtuk, hogy kis dózisú 1. számú vegyület (0,63 mg/kg) kombinációja hajlamos volt gátolni a növekedést, amelyet 1 mg/kg risperidon eredményezett, míg az 1. számú vegyület nagyobb dózisa nem módosította a risperidon által kiváltott növekedést a dopaminban. Kísérleti eljárások A vegyületeket (nátrium¹só formájában) minden egyes vegyülettel a kapott részletes instrukciók szerint tároltuk, oldottuk fel és adtuk be. A vegyületeket 10% BCD-bõl (béta ciklodextrin) álló oldószerben oldottuk fel és szubkután úton adtuk be. Hím Sprague–Dawley-patkányokat, amelyek tömege a kísérlet kezdetekor 275–325 g volt, egyedileg helyeztük el egy hõmérséklet-kontrollált társas ketrecben 12 órás világos/sötét ciklussal. Élelem és víz az egész kísérlet alatt igény szerint volt hozzáférhetõ. Az elhelyezési körülmények és az állatok kezelése összhangban volt a laboratóriumi állatok gondozására és alkalmazására vonatkozó útmutatónak [Institute of Laboratory Animal Resources on Life Sciences, National Research Council (1996)]. A vezetõkanült 95%¹os ETOH-ban tároltuk a mûtéti beavatkozás elõtt, míg a mûtõeszközöket hõ segítségével sterilizáltuk (250 °C) közvetlenül minden egyes mûtét elõtt. A patkányokat elaltattuk egy ketamin-hidroklorid (100 mg/kg, IP) xilazin (12 mg/kg) elegy alkalmazásával. Az adekvát altatásról való meggyõzõdés után (lábujj- és farokcsípési eljárások alkalmazásával) a patkányokat sztereotaxikus mûszerbe helyeztük. A koponyarégiót letöröltük 2%¹os Betadin-oldattal és egy rostrokaudális metszést hajtottunk végre a koponya felületének felnyitására. Bilaterális vezetõkanült (20 gauge; Plastics One) krónikusan implantáltunk a mediális
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 5
2
striatum fölé (A/P: + 0,5; M/L: 2,5; D/V: –2,0; Paxinos & Watson, 1998) és rögzítettük négy koponyacsavar és kranioplasztikus cement alkalmazásával. A kanülöket egy sarokban kell implementálni, annak érdekében, hogy a minimális kanülök közötti távolságot kapjuk, amely a próbavezetékhez volt szükséges, amelyet a mikrodialízis mintázás során alkalmaztunk. A mûtét után a testhõmérsékletet fenntartottuk egy melegítõpárna alkalmazásával, és a patkányokat a teljes eszmélet visszanyeréséig követtük. A patkányokat ezután egyedileg helyeztük el és naponta vizsgáltuk követve a generális aktivitást, a testtömeget és az ürüléket. A patkányokon figyeltük a fertõzés jeleit és cefazolin (100 mg/kg; intramuszkuláris) volt elérhetõ szükség esetén. Ha bármely állat antibiotikumot kapott, azt feljegyeztük. A patkányok legalább öt napot kaptak a gyógyulásra a mikrodialízis mintavétel elõtt. Körülbelül 18 órával a mintavétel elõtt egy mikrodialízis próbát (24 gauge; 2¹3 mm exponált membrán; 13000 MWCO), amely egy rugalmas vezetékbe zárt és egy kiegyensúlyozó karhoz kapcsolódó likvid kötéshez van erõsítve, illesztettünk az ébren lévõ patkány vezetõkanüljébe. A patkányt ezután egy viselkedésvizsgáló kamrába (Omnitech, Columbus OH) helyeztük, amely egy ventilátorral és világítással (10 W) felszerelt, és élelem és víz igény szerint volt elérhetõ. A kísérlet napján 5 mM glükózból, 140 mM NaCl-ból, 1,4 mM CaCl2-ból, 1,2 mM MgCl2ból és 0,15% foszfátpufferelt sóoldatból álló, pH=7,4 kémhatású dialízispuffert engedtünk keresztül a próbán (2,0 ml/perc) legalább két órával a mintagyüjtés elõtt. Ezután 20 perces dialízismintákat gyûjtöttünk össze két óráig, az alapglicinszintek meghatározása érdekében. A patkányoknak ezután (intraperitoneális) injekciót adtunk vivõanyaggal vagy a tesztvegyület egy dózisával, és 30 perces mintákat gyûjtöttünk össze 10 óráig. A mintákat felosztottuk a glicin és a dopamin szeparált kromatográfiás vizsgálatához, és lefagyasztottuk (–80 °C) az analízisig. A patkányoknak a dialízispróbákat a helyükön hagyva túladagolt pentobarbitált adtunk és az agyakat PBS-formalin szívbe adott infúziója segítségével fixáltuk. A koronális agyszekciók 100 mM sûrûségûek voltak és krezil ibolyával festettük õket a próba elhelyezkedések verifikálására. A próbákat a helyükön hagytuk, mivel az állatot perfuzionáltuk annak ellenõrzése érdekében, hogy jelen van¹e vér a próbatraktusban. A glicin és dopamin koncentrációit a dializátummintákban sorrendben Waters Alliance 2690 HPLC rendszer alkalmazásával határoztuk meg fluorometrikus detektálással, vagy egy ESA coulometrikus elektrokémiaia detekciós HPLC rendszerrel. A dialízismintákat felosztottuk a két rendszer között, lehetõvé téve, hogy mind a dopamint, mind a glicint mérjük minden egyes mintában. Egy Waters Spherisorb ODS2 oszlopot (5 mM, 4,6×250 mm) alkalmaztunk az aminosavak szeparálására. A glicint Waters 474 Fluorescencia Detektor alkalmazásával detektáltuk 320 nm gerjesztési hullámhosszal és 400 nm emissziós hullámhosszal. A mozgó fázis 80% H2O-ból, 20% acetonitrilbõl, 0,1 M Na2H-
1
HU 007 928 T2
PO 4 -bõl és 0,1 mM etilén-diamin-tetraecetsavból (pH=5,8 foszforsavval; 0,2 mm szûrõ) áll, 0,75 ml/perces áramlási sebességgel. A mintákat hûtött automata mintaadagolóba (4 °C) helyeztük, és az aminosavak oszlop elõtti származékképzését o¹ftáldehiddel végrehajtottuk Waters Alliance System alkalmazásával. Összesen 15 ml (5 ml minta és 15 ml OPA) injektáltunk az oszlopba. Valamennyi mintát analizáltunk, amelyet 2 órával a kezelés elõtt és 2 órával a kezelés után gyûjtöttünk. A kezelés utáni 2–24 óra alatt összegyûjtött mintákra egy 20 perc minta/óra analízist hajtottunk végre; a másik két mintát megtartottuk a mintában lévõ vegyület vizsgálatára. A glicincsúcsmagasságokat összevetettük egy külsõ standard görbével a kvantifikálás érdekében. Minden nap új standard görbét generáltunk. Dopaminanalízisre a mintákat egy ESA (Chelmsford, MA) Model 540 automata mintaadagolóba helyeztük, amely egy HPLC rendszerhez elektrokémiai detektálással kapcsolódik. A szeparálást a mintáknak egy 15 cm hosszú, C18 fordított fázisú oszlopon (ESA, Inc.) keresztül történõ pumpálásával értük el, majd a mintákat redukáltuk/oxidáltuk coulometriás detektálás alkalmazásával. Három elektródot alkalmaztunk. Egy õrcella (+400 mV), egy redukciós analitikai elektród (–150 mV) és egy oxidációs analitikai elektródot (+250 mv). A csúcsokat felvettük és a görbe alatti területet ESA Cromatography Data System futtatásával mértük. Ezen értékeket normalizáltuk egy belsõ standard görbéhez való hasonlítással izoproteronolra és kvantifikáltuk egy külsõ standard görbéhez való hasonlítás útján. A csúcsmagasságokat egy külsõ standard görbével hasonlítottuk össze a kvantifikálás érdekében. Az adatokat normalizáltuk százalékos változásra az alapvonaltól (három 30 perces minta átlaga a kezelés elõtt). Továbbá, a nyers adatokat feldolgoztuk és a különbségeket megjelentettük a normalizált adatokkal együtt. Valamennyi adatot egy egyutas ANOVA alkalmazásával értékeltünk, idõben megismételt mérésekkel a Statview program alkalmazásával egy G4 Macintosh számítógépen. 1. összehasonlító kísérlet A dopamin és a glicin extracelluláris szintjeit mértük meg a patkánystriatumban (N=5) risperidon három (3) dózisban (növekvõ; 0,16; 0,63 és 2,5 mg/kg) beadását követõen. Dialízismintákat vettünk minden 30 percben, minden egyes dózist 2 óráig mértünk (összesen 8 óra). Az 1A–1D. összehasonlító ábrák a risperidonnak a glicinre és a dopaminra gyakorolt hatását mutatják. Az adatokat mind az analizátum mintánkénti mennyiségeként, mind az alapvonalértékek átlagához képest (azaz az elsõ hatóanyag-injekció elõtt vett minták) bekövetkezett normalizált százalékos változásként bemutatjuk. A risperidon a várt növekedést eredményezte az extracelluláris dopaminban, ahol a legalacsonyabb dózis kiváltja a közelítõleg 50%¹os küszöbemelkedést, és a két nagyobb dózis 3–4-szeres növekedést eredményez domaminban. Meglepõ módon hasonló növekedés volt
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 6
2
tapasztalható az extracelluláris glicinben a risperidon beadása után. Bár a legalacsonyabb dózis hatás nélkül maradt, a két nagyobb risperidondózis kiváltott egy dózisfüggõ emelkedést a glicinben legfeljebb 2,5-szeres növekedésig. 2. összehasonlító kísérlet A dopamin és a glicin extracelluláris szintjeit mértük a patkánystriatumban (N=5) az 1. számú vegyület három (3) dózisban (növekvõ: 0,63; 2,5 és 10 mg/kg) történõ beadása után. Dialízismintákat vettünk minden 30 percben, minden egyes dózist 2 óráig mértünk (összesen 8 óra). A 2A–2D. összehasonlító ábrák mutatják ezen kísérlet eredményeit. Amint azt vártuk, az 1. számú vegyület dózisfüggõ növekedést váltott ki az extracelluláris glicinben. Egy küszöbhatást láttunk 0,63 mg/kg után és 10 mg/kg, 2,5-szeres növekedést eredményezett glicinben. Az 1. számú vegyület hatása az extracelluláris dopaminra kétfázisú volt, tekintettel a dózisra (N=7). Az 1. számú vegyület legalacsonyabb dózisa közel 50%¹os csökkenést eredményezett az extracelluláris dopaminban. A dopamin szintjei normál értékre változtak vissza egy 2,5 mg/kg injekcióját követõen, és változatlanul maradtak az 1. sz. vegyület legmagasabb dózisa hatására. 3. kísérlet Az 1. és 2. kísérletekbõl származó adatokat értékeltük az 1. számú vegyület és a risperidon dózisának legjobb kombinációjának meghatározása érdekében, hogy meghatározzuk a szinergizmust és antagonizmust a két vegyület között. Két adagolási rendet azonosítottunk. Az 1. számú vegyület alacsony dózisa dopaminra gyakorolt hatásának értékelése érdekében (lásd: 2A–2D. összehasonlító ábrák), 0,63 mg/kg 1. számú vegyület és 1,0 mg/kg risperidon kombinációját adtuk be egy egység boluszinjekcióban. Az 1. számú vegyület és a risperidon közötti extracelluláris glicin növelésében megnyilvánuló, potenciális szinergizmus vizsgálata érdekében (lásd: 1A–1D. és 2A–2D. összehasonlító ábrák), 10 mg/kg 1. számú vegyületet és 1,0 mg/kg risperidont adtunk be egy egység boluszinjekcióban. A glicinre gyakorolt hatás: az 1. számú vegyület alacsonyabb vizsgált dózisa (0,63 mg/kg) és a risperidon vizsgált dózisa mindegyike közepes emelkedést eredményez glicinben, önmagában beadva (lásd sorrendben: 1A–1D. összehasonlító ábrák és 2A–2D. összehasonlító ábrák). Amikor a hatóanyag két dózisát együtt adtuk be (N=5) tapasztalható volt egy közelítõleg megduplázott extracelluláris glicin, amely összhangban volt a risperidon önmagában gyakorolt hatásával. Azonban kombinálva a risperidont az 1. számú vegyület nagyobb dózisával (10 mg/kg) tiszta additív hatást (N=6) okozott. így, bár minden egyes hatóanyag önmagában 2–3-szoros emelkedést eredményezett a glicinben, kombinálva 6¹szoros növekedés következett be az extracelluláris glicinben. A dopaminra gyakorolt hatások: A 3A–3D. ábrák szemléltetik mindkét hatóanyag-kombináció hatását az
1
HU 007 928 T2
extracelluláris dopaminra a striatumban. A felsõ panelek szemléltetik az 1. számú vegyület alacsonyabb dózisának (0,63 mg/kg) risperidonnal való kombinálását (N=6). Az 1. számú vegyület ezen dózisa csökkentette az extracelluláris dopamint, és látható, hogy bár szignifikáns növekedés volt mérhetõ, az 1. számú vegyület részben antagonista hatást gyakorolt a várt dopaminnövekedésre 1,0 mg/kg risperidon után. Így a várt 300% növekedést a dopaminban a risperidon ezen dózisa után (lásd 1C–1D. összehasonlító ábrák) 150%¹ra csökkent, amikor azt az 1. számú vegyülettel (0,63 mg/kg) kombinációban adtuk. Ezzel szemben az 1. számú vegyület nagyobbik dózisa (10 mg/kg) önmagában hatás nélkül maradt dopaminra (2C–2D. összehasonlító ábrák), és amikor együttesen adtuk be, nem változtatta meg a risperidon kapacitását az extracelluláris dopamin növelésére (N=6). Diszkusszió és következtetések Ezen adatok megerõsítik a GlyT1 antagonista 1. számú vegyület kapacitását dózisfüggõ emelkedés kiváltására az extracelluláris glicinben, és demonstrálják, hogy alacsonyabb dózisoknál ezen hatóanyag csökkenti az extracelluláris dopamint. A jelen adatok megerõsítik mások azon felismeréseit is, hogy a risperidon megnöveli az extracelluláris dopamint; és azt a meglepõ és fontos tapasztalatot eredményezik, hogy a risperidon dózisfüggõ emelkedést vált ki az extracelluláris glicinben. Továbbá, kombinációban a két hatóanyag additívnak tûnik hatásaikban glicinre, különbözõ hatásmechanizmust jelezve. 1. számú vegyület és dopamin Meglepõ volt, hogy az 1. számú vegyület csökkentette az extracelluláris dopamint. Az a tény, ezt csak alacsonyabb dózisoknál tapasztaltuk, a GlyT1 blokádtól eltérõ, szeparált hatásmechanizmust jelezhet. Tekintet nélkül a mechanizmusra, ez a hatás szinergetikus az antipszichotikus gyógyszerek ismert terápiás hatásaival. Ezáltal a dopamintranszmisszió csökkentése a striatumban indikatív lehet egy mechanizmusra a dopaminreceptor-tónus csökkentésére, amely különbözik a klasszikus D2 receptor blokádtól, amely a legtöbb antipszichotikus hatóanyaggal kapcsolatos. Míg errõl a hatásról a striatumban (különösen a ventrális striatumban) úgy gondoljuk, hogy az antipszichotikus hatóanyagok fontos terápiás hatása, a dopamintranszmisszió csökkentése a prefrontális cortexben várhatóan súlyosbítaná a skizofréniával összefüggõ kognitív károsodást. Azonban vannak ismert esetek, ahol a farmakológiai és környezeti kihívások különbözõen befolyásolják a prefrontális kortikális és striatalis dopamintranszmissziót, az NMDA-receptor-blokáddal összefüggésben [Cabib and Puglisi-Allegga (1996); Moghaddam és Adams (1998)], és az 1. számú vegyület hatásai az extracelluláris dopaminra a striatumban nem biztos, hogy elõre jeleznek hatásokat prefrontális cortexben. Ez különösen igaz lenne, ha a dopaminra gyakorolt hatások közvetettek lennének, mivel a prefrontális cortex szinaptikus elrendezése jelentõsen különbözik a striatumétól.
5
10
15
20
25
30
35
40
2
Az alacsony dózisú 1. számú vegyület (0,63 mg/kg) kismértékû antagonizmusa a risperidon dopaminnövelõ hatására a striatumban potenciálisan fontos, különösen, ha az 1. számú vegyület hatása különbözõ a cortexben és a striatumban. Ennélfogva a risperidon antagonizmusa a striatumban, de annak hiánya a cortexben rendelkezhet terápiásan elõnyös hatással, miután a risperidon hatásairól a striatumban úgy gondolják, hogy nem célzott motoros mellékhatásokat közvetít. A risperidon általi glicinnövekedés váratlan. A mechanizmus tisztázatlan maradt. Miután a glicin eliminációja az extracelluláris térbõl elsõdlegesen glicinfelvétel, a transzporter antagonista gátlása egy lehetõség. Míg az valószínûtlen, hogy a risperidon közvetlenül a GlyT-hez kötõdik (Goff és Coyle, 2001), lehetséges, hogy dopamin (vagy szerotonin) receptorok blokádja szabályozhatja a GlyT¹t. Tekintet nélkül a mechanizmusra, amely útján a risperidon növeli a glicint, tiszta additív hatás van az 1. számú vegyület és risperidon között az extracelluláris glicin növelése tekintetében. Amennyiben a skizofrénia részben csökkent NMDAkonduktancia eredménye lehet, az extracelluláris glicinre gyakorolt additív hatás terápiás elõnyt biztosíthat közvetve erõsítve az NMDA-konduktanciákat. Ennélfogva, ha a glicin mennyiségének növelése valójában egy terápiás elõny, az 1. számú vegyület risperidonnal való kombinációja lehetõvé teheti a risperidon alacsonyabb dózisainak alkalmazását. Ez a vizsgálat az 1. számú vegyület és a risperidon két új hatását azonosította. Az 1. számú vegyületet alacsony dózisai csökkentették a dopaminszinteket és a risperidon dózisfüggõ növekedést eredményezett glicinben. Míg az ezen hatásokat szabályozó celluláris mechanizmusok tisztázatlanok maradtak, azok potenciálisan fontos interakciókat eredményeznek két hatóanyag között. Ennélfogva az 1. számú vegyület (0,63 mg/kg) gyengén antagonista hatást gyakorol a risperidon dopaminnövelõ kapacitására, míg a két hatóanyag kapacitása a glicin növelésére additív volt. Amennyiben dopamin és glutamát részt vesz a skizofrénia etiológiájában vagy szimptomatológiájában, az 1. számú vegyületnek az ismert antipszichotikum risperidonnal való interakciói terápiásan relevánsak.
45 Hivatkozások Adams és munkatársai, 1998: Corticolimbic dopamine neurotransmission is temporarily dissociated from the cognitive and locomotor effects of phencyclidine. J. 50 Neuroscience, 18(14):5545–5554. Aragon és munkatársai, 2003: Structure, function and regulation of glycine neurotransmitters. European Journal of Pharmacology, 479:249–262. Bergeron és munkatársai, 1998: Modulation of 55 N¹methyl-D-aspartate receptor function by glycine transport. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95(26):15 730–15 735. Cabib S, Publisi-Allegra S, 1996: Stress, depression and the mesolimbic dopamin system. Psychophar60 macology, 128:331–342. 7
1
HU 007 928 T2
Danysz és munkatársai, 1998: Glycine and N¹methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. D’Souza és munkatársai, 1995. Glycine site agonists of the NMDA receptor: a review. CNS Drug Revs., 1:227–260. Ferre S, és munkatársai, 1995: Antagonistic interaction between A2a receptors and D2 receptors: implications for the treatment of schizophrenia. Neuroscience, 63:765–773. Goff D. C., Coyle J. T., 2001: The emerging role of glutamate in the pathophysiology and treatment of schizophrenia. Am. J. Psychiatry, 158:1367–1377. Javitt D. C., Frusciante M., 1997: Glycyldodecylamide, a phencyclidine behavioral antagonist, blocked cortical glycine uptake: implications for schizophrenia and substance abuse. Psychopharmacology, 129:96–98. Javitt D. C., 2002: Glycine modulators in schizophrenia. Current Opinion in Investigational Drugs, 3(7): 1067–1072. McBain és munkatársai, 1989: Structural requirements for gly-cine co¹agonist site of N¹methyl-D-aspartate receptors expressed in Xenopus oocytes. Mol. Pharmacol., 36:556–65. Liu és munkatársai, 1993: Cloning and expression of a spinal cord – and brain – specific glycine transporter with novel structural features. J. Biol. Chem., 268:22 802–22 808. Moghaddam B., Adams B., 1998: Corticolimbic dopamine transmission is temporally dissociated from the cognitive and locomotor effects of phencyclidine. J. Neuroscience, 18:5545–5555. Newcomer és munkatársai, 2001: NMDA receptor regulation of memory and behavior in humans. Hippocampus, 11:529–542 (2001). Nakanishi Y. és munkatársai, 2001: Glutamate receptors: brain function and signal transduction. Brain Res Rev., 26:230–235. Parsons és munkatársai, 1998: Glutamate in CNS disorders as a target for drug development: an update. Drug News Perspect., 11(9):523–579. Schell M. J. és munkatársai, 1995: D-serine, an endogenous synaptic modulator: localization to astrocytes and glutamate-stimulated release. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:3948–3952. Slassi és munkatársai, 2004: Recent progress in the use of glycine transporter¹1 inhibitors for the treatment of central and peripheral nervous system diseases. Ashley Publications Ltd. ISSN 1354–3776:201–214. Smith és munkatársai, 1992: Cloning and expression of a glycine transporter reveal colocalization with NMDA receptors. Neuron, 8:927–935. Tsai és munkatársai, 1998: D-serine in the treatment of schizophrenia. Biol. Psychiatry, 44:1081–1089. Zafra és munkatársai, 1995: Glycine transporters are differentially expressed among CNS cells. J. Neuroscience, 15:3952–3969.
2
SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Egy orvosi termék, amely tartalmazza a következõket: (a) egy antipszichotikum a következõk körébõl vá5 lasztva: risperidon, paliperidon és gyógyászatilag elfogadható sóik, gyógyászatilag elfogadható észtereik és enantiomer formáik, és (b) egy GlyT1 inhibitor a következõk körébõl vá10 lasztva: 1. számú vegyület 15
20 C24H20NNaO3 (molekulatömeg: 393,42) 2. számú vegyület 25
30
35
40
45
50
55
C24H21NO3 (molekulatömeg: 371,44) és azok gyógyászatilag elfogadható sói, gyógyászatilag elfogadható észterei és enantiomer formáik; mint kombinált készítmény egyidejû, szeparált vagy egymást követõ alkalmazásra skizofrénia tüneteinek kezelésében vagy megelõzésében, amelyek összefüggnek olyan rendellenességekkel, mint amilyen a skizofrénia, demencia, depresszió, Alzheimer-kór, ADHD, hatóanyaggal való visszaélés és szorongás. 2. Az 1. igénypont szerinti orvosi termék olyan mennyiségben beadva, amely hatásos az említett tünetek kezelésére vagy megelõzésére. 3. Az 1. igénypont szerinti orvosi termék egy emlõsnek beadva, extracelluláris glicin szintjének növelésére egy emlõsben. 4. A 3. igénypont szerinti orvosi termék, ahol az említett extracelluláris glicin olyan mennyiségre nõ, amely több, mint ha az említett antipszichotikumot vagy említett GlyT1 inhibitort önmagában adtuk volna be. 5. A 3. igénypont szerinti orvosi termék, ahol az említett GlyT1 inhibitor minimális hatású vagy nem rendelkezik hatással az extracelluláris dopaminra.
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest
