(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000005921T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 005 921

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA A61K 38/57

(21) Magyar ügyszám: E 04 700828 (22) A bejelentés napja: 2004. 01. 08. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040700828 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1599222 A1 2004. 07. 29. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1599222 B1 2009. 03. 04.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 438519 P 494577 P 509260 P 512090 P

(73) Jogosult: Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville, CA 94608 (US)

2003. 01. 08. 2003. 08. 13. 2003. 10. 08. 2003. 10. 20.

US US US US

(72) Feltaláló: CHEN, Bao-Lu, San Ramon, CA 94583 (US) (54)

(2006.01) A61K 47/18 (2006.01) A61K 47/12 (2006.01) C07K 14/81 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04062689 PCT/US 04/000233

(74) Képviselõ: dr. Gyõrffy Béla, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Szövetifaktor-útvonal inhibitorát (TFPI) vagy szövetifaktor-útvonal inhibitorának változatát tartalmazó stabilizált vizes készítmények

(57) Kivonat

HU 005 921 T2

Szövetifaktor-útvonal inhibitorát („Tissue Factor pathway inhibitor”, TFPI) vagy TFPI-változatot tartalmazó stabilizált vizes készítmények, amelyek tartalmaznak szolubilizálószert, antioxidánst és puffert. Az antioxidáns és szolubilizálószer kombinációja vezethet a

TFPI vagy TFPI-változat készítmények tárolási idejének szignifikáns javulásához. A szolubilizálószer és az antioxidáns lényegében ellene hat a TFPI vagy TFPI-változat aggregáció és oxidáció általi lebomlásának.

A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 7 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 005 921 T2

A találmány területe A találmány tárgyát képezik szövetifaktor-útvonal inhibitorát („Tissue Factor pathway inhibitor”, TFPI) tartalmazó stabilizált készítmények. A találmány tárgyát képezik, különösen, TFPI¹t vagy TFPI-változatot, szolubilizálószert és antioxidánst tartalmazó készítmények. A találmány háttere A szövetifaktor-útvonal inhibitora („Tissue Factor pathway inhibitor”, TFPI) 276 aminosav hosszúságú, és a szöveti faktor által közvetített véralvadás inhibitoraként mûködik. Az aminosavszekvenciáját az 1. szekvencián (SEQ ID NO: 1) mutatjuk be. A TFPI aminoterminális vége negatívan töltött, és a karboxiterminális vége pozitívan töltött. A TFPI fehérje három Kunitz-típusú enziminhibitor domént tartalmaz. A TFPI 18 ciszteint tartalmaz, és 9 diszulfidhidat alakít ki, ha megfelelõen van feltekeredve. Az elsõdleges szekvencia három N¹kapcsolt konszenzus glikozilezési helyet (AsnX¹Ser/Thr) tartalmaz. A glikozilezési helyek aszparaginjai a 145., 195. és 256. helyeken találhatóak. A TFPI ismert úgy is, mint lipoprotein kapcsolt koagulációs inhibitor (LACI), szövetifaktor-inhibitor (TFI) és külsõ útvonal inhibitor (EPI). Különbözõ indikációk kezelésére javasolták már a TFPI alkalmazását, idetartozik a szepszis (6,063,764 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és WO 93/24143 számú nemzetközi közzétételi irat), mélyvénás trombózis (5,563,123, 5,589,359 amerikai egyesült államokbeli szabadalmak és WO 96/04378 nemzetközi közzétételi irat), ischaemia (5,885,781, 6,242,414 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak és WO 96/40224 számú nemzetközi közzétételi irat), resztenózis (5,824,644 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és WO 96/01649 számú nemzetközi közzétételi irat) és rák (5,902,582 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és WO 97/09063 számú nemzetközi közzétételi irat). Egy TFPI-változatról, amely a TFPI-tõl az aminoterminushoz hozzáadott alaninban különbözik („ala-TFPI”), kimutatták, hogy hatásos állatmodelleken szepszis kezelésére. Carr és munkatársai, Circ Shock 1994 Nov; 44(3): 126–37. Az elõállítást követõen a TFPI vagy TFPI-változat készítményei vizes formában vagy fagyasztott állapotban csomagolhatóak tárolásra. A TFPI vagy TFPI-változatok azonban a tárolás során aggregátumokat tudnak kialakítani vizes kiszerelésekben. Az aggregációt a TFPI vagy TFPI-változat molekulák közötti kölcsönhatások okozzák, amelyek oligomerek kialakulását eredményezik. Ezen oligomerek oldhatóak maradhatnak, vagy kialakíthatnak nagy, látható aggregátumokat, amelyek kicsapódnak az oldatból a tárolás során. A TFPI vagy TFPI-változat aggregátumának kialakulása vizes készítmény tárolása során hátrányosan érintheti a biológiai aktivitását, amely a különbözõ állapotok, ideértve a szepszist, kezelésére hatásos véralvadásgátló terápiás hatás elvesztését eredményezi. Továbbá az aggregátumok kialakulása egyéb problémá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

kat is okozhat, mint például a csövezés, membránok vagy pumpa eltömõdése, ha a TFPI¹t vagy TFPI-változatot tartalmazó készítmény infúziós rendszer alkalmazásával volt beadva. Ezen problémák minimalizálására a szakterületen szükség van a TFPI és TFPI-változat készítményeinek javított stabilizálására. A találmány összefoglalása A jelen találmány TFPI vagy TFPI-változatot tartalmazó vizes készítmények stabilitásának szignifikáns javításán alapul, amely akkor valósul meg, ha az ilyen készítmények tartalmaznak szolubilizálószert és antioxidánst. Az antioxidáns lehet oxigént kiszorító gáz, oxigén- vagy szabadgyök-megkötõ, vagy kelálószer formájában. A találmány tárgyát képezik legalább a következõ megvalósítási módok. A találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgya vizes készítmény, amely tartalmaz körülbelül 0,05–körülbelül 15 mg/ml TFPI¹t vagy TFPIváltozatot; körülbelül 50–körülbelül 600 mM a következõk alkotta csoportból választott szolubilizálószert: (i) arginin vagy analógja, (ii) lizin vagy analógja és (iii) az (i) és (ii) keverékei; a következõk alkotta csoportból választott antioxidánst: (i) oxigént kiszorító gáz, (ii) oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szer, (iii) kelálóágens és (iv) ezek keverékei; ahol a vizes készítmény (a) százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb; (b) százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb; és (c) a pH¹értéke körülbelül 4–körülbelül 8. A találmány egy további megvalósítási módja eljárás vizes TFPI vagy TFPI-változat készítményének elõállítására, amely eljárás tartalmazza körülbelül 0,05–körülbelül 15 mg/ml TFPI¹t vagy TFPI-változatot tartalmazó készítményhez a következõk hozzáadását: körülbelül 50–körülbelül 600 mM a következõk alkotta csoportból választott szolubilizálószert: (i) arginin vagy származéka, (ii) lizin vagy származéka és (iii) az (i) és (ii) keverékei; a következõk alkotta csoportból választott antioxidánst: (i) oxigént kiszorító gáz, (ii) oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szer, (iii) kelálóágens és (iv) ezek keverékei; ahol a vizes készítmény (a) százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb; (b) százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb; és (c) a pH¹értéke körülbelül 4–körülbelül 8. Egy még további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely tartalmazza a vizes készítményt és gyógyszerészetileg elfogadható excipienst. A vizes készítmény tartalmaz körülbelül 0,05–körülbelül 15 mg/ml TFPI¹t vagy TFPI-változatot; körülbelül 50–körülbelül 600 mM a következõk alkotta csoportból választott szolubilizálószert: (i) arginin vagy analógja, (ii) lizin vagy analógja és (iii) az (i) és (ii) keverékei; a következõk alkotta csoportból választott antioxidánst: (i) oxigént kiszorító gáz, (ii) oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szer, (iii) kelálóágens és (iv) ezek keverékei; ahol a vizes készítmény (a) százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45% vagy na-

1

HU 005 921 T2

gyobb; (b) százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb; és (c) a pH¹értéke körülbelül 4–körülbelül 8. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábra a féléletidõt mutatja a tárolás során (t1/2, napokban), négy standard ala-TFPI készítmény esetén, amelyeket ioncserével analizáltunk nagynyomású folyadékkromatográfiával (IEX HPLC), az argininkoncentráció függvényében, 50 °C¹on. Mindegyik kiszerelés 0,15 mg/ml alaTFPI¹t tartalmazott, amely 5,5 pH¹értékre volt pufferezve, vagy L¹arginin-bázissal és citromsavval vagy L¹arginin HCl-dal és 10 mM citromsav/nátrium-citráttal. Az egyedi ala-TFPI kiszerelések a következõket tartalmazták: (a) 20–150 mM L¹arginin HCl, 10 mM citromsav/nátrium-citrát pufferként; (b) 20–150 mM L¹arginin-bázis, citromsavval titrálva; (c) 100–300 mM L¹arginin HCl, 10 mM citromsav/nátriumcitrát pufferként; (d) 100–300 mM L¹arginin-bázis citromsavval titrálva. A 2. ábra standard ala-TFPI készítmény stabilitását mutatja a beoldott oxigénkoncentráció függvényében, a levegõvel történõ teljes telítettség százalékában kifejezve. Az oldható ala-TFPI százaléka, amely a stabilitási mintákban maradt, amelyeket 30 °C¹on tároltunk, fordított fázisú (RP) HPLC-vel volt analizálva. A standard alaTFPI készítmény 0,15 mg/ml ala-TFPI¹t, 20 mM citromsav/nátrium-citrátot és 300 mM L¹arginint tartalmazott. A pH¹értéke 5,5 volt. A 3. ábra a tárolás során tapasztalt féléletidõt (t1/2, hetekben) mutatja a standard ala-TFPI készítményre a beoldott oxigénkoncentráció függvényében, amely a levegõvel történõ teljes telítettség százalékában van kifejezve. A 30 °C¹on tárolt stabilitás mintákban lévõ oldható ala-TFPI százalékát RP¹HPLC-vel analizáltuk. A standard ala-TFPI készítmény 0,15 mg/ml ala-TFPI¹t, 20 mM citromsav/nátrium-citrátot és 300 mM L¹arginint tartalmazott. A pH¹értéke 5,5 volt. A 4. ábra a 0, 1 vagy 4 mM mennyiségben hozzáadott EDTA és DTPA kelálószereket tartalmazó standard ala-TFPI készítmények stabilitását mutatja. A 30 °C¹on tárolt stabilitás mintákban lévõ oldható alaTFPI százalékát RP¹HPLC-vel analizáltuk. A standard ala-TFPI készítmény 0,15 mg/ml ala-TFPI¹t, 20 mM citromsav/nátrium-citrátot és 300 mM L¹arginint tartalmazott. A pH¹értéke 5,5 volt. Az 5. ábra 0, 2, 5 vagy 10 mM mennyiségben hozzáadott oxigént megkötõ metionint tartal-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

mazó TFPI készítmények stabilitását mutatja. A 30 °C¹on tárolt stabilitás mintákban lévõ oldható ala-TFPI százalékát RP¹HPLC-vel analizáltuk. A standard ala-TFPI készítmény 0,15 mg/ml alaTFPI¹t, 20 mM citromsav/nátrium-citrátot és 300 mM L¹arginint tartalmazott. A pH¹értéke 5,5 volt. A 6. ábra egy ala-TFPI minta RP¹HPLC kromatogramja. Az A¹F csúcsokat az 1. példában ismertettük. A 7. ábra Kaplan–Meier túlélési görbe. X tengely, túlélés; Y tengely, idõ (óra). A találmány részletes ismertetése A találmány szerinti vizes készítmények azon a felismerésen alapulnak, hogy vizes TFPI vagy TFPI-változat készítményéhez i) aminosav szolubilizálószer (például arginin, lizin vagy analógjaik) és ii) antioxidáns hozzáadása, ahol a vizes készítmény pH¹értéke körülbelül 4–körülbelül 8, olyan TFPI¹t tartalmazó vagy TFPI-változatot tartalmazó készítményt eredményez, amelynek lényegesen megnövekedett a tárolás során tapasztalt stabilitása azokhoz a TFPI¹t tartalmazó vagy TFPI-változatot tartalmazó készítményekhez képest, amelyek ezen két addicionális összetevõ nélkül lettek elõállítva. A készítménynek ez az általánosan megnövekedett stabilitása az antioxidánssal kombinált szolubilizálószer hatásán keresztül jön létre, miáltal egy olyan készítmény jön létre, amely nemcsak a tárolás során fellépõ aggregációnak áll ellen, hanem a káros oxidációnak is, különösen a TFPI metionin aminosavakon. A találmány szerinti vizes készítmények egyéb káros hatásoknak (például letekeredés, újratekeredés és denaturáció) is ellenállnak, amelyek a biológiai aktivitás elvesztését vagy egyéb elõnytelen jellemzõket eredményeznek. Mivel a szolubilizálószer és az antioxidáns elsõdlegesen a TFPI vagy TFPI-változat lebomlásának független mechanizmusaira hatnak (rendre aggregáció és metioninoxidáció), ezért a szolubilizálószer és az antioxidáns kombinációja stabilabb TFPI vagy TFPI-változat készítményt ad, mint ami ezen kombináció nélkül lenne lehetséges, vagy akárcsak ezen két komponens egyike nélkül lehetséges. Például a TFPI vagy TFPIváltozat metioninjainak az oxidációja nemkívánatos lehet abban az esetben is, ha a TFPI vagy TFPI-változat biológiailag aktív.

Vizes készítmények stabilitása A találmány szerinti vizes TFPI-tartalmú vagy TFPIváltozat-tartalmú készítményeknek jellemzõen megnövekedett a tárolás során tapasztalt stabilitásuk egy vagy több TFPI lebontási hatásra tekintettel (például 55 aggregáció és metioninoxidáció), azon készítményekhez képest, amelyek szolubilizálószer és antioxidáns itt ismertetett kombinációja nélkül lettek elõállítva. Tehát, mivel a találmány szerinti TFPI¹t és TFPI-változatot tartalmazó készítményeknek megnövekedett a százalé60 kos aggregációs stabilitása és a százalékos oxidációs 50

3

1

HU 005 921 T2

stabilitása, ezért a nem oxidált, nem aggregált TFPI vagy TFPI-változat féléletideje megnövekedett. Egy TFPI vagy TFPI-változat minta százalékos aggregációs stabilitása és százalékos oxidációs stabilitása egymástól függetlenül változhat. Elõnyösen a találmány szerinti vizes készítményben lévõ TFPI vagy TFPI-változat biológiailag aktív, amint az meghatározható, például protrombinidõ-vizsgálattal, amint azt alább ismertetjük. A találmány szerinti vizes készítményeknek legalább 45%¹os aggregációs stabilitásuk van. A „százalékos aggregációs stabilitás” kifejezés a TFPI vagy TFPI-változat minta azon részére utal, amely oldható, amely 40 °C¹on végzett gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. Egy 40 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálat során egy TFPI vagy TFPI-változat minta inkubálva van nyolc hétig 40 °C hõmérsékleten. Az inkubálást követõen a TFPI vagy TFPI-változat minta 0,2 mm¹es szûrõn van átszûrve, és ezt követõen ioncserés nagy teljesítményû folyadékkromatográfiás (IEX¹HPLC) vizsgálatnak van alávetve az oldatban maradó oldható TFPI vagy TFPI-változat mennyiségének meghatározására. Egy IEX¹HPLC vizsgálat 45% alatt van ismertetve. Tehát például egy TFPI vagy TFPI-változat készítmény, amelynek az aggregációs stabilitása 60%, egy olyan készítmény, amelyben a TFPI vagy TFPIváltozat 60%¹a oldható, ami 40 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. Egy TFPI vagy TFPI-változat készítmény, amelynek az aggregációs stabilitása 80%, egy olyan készítmény, amelyben a TFPI vagy TFPI-változat 80%¹a oldható, ami 40 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. A találmány szerinti TFPI vagy TFPI-változat készítmények százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45, 50, 60, 70 vagy 75% vagy nagyobb, elõnyösebben körülbelül 80, 82, 84, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 vagy 99% vagy nagyobb, ami a 40 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve, és lehet például körülbelül 45% vagy nagyobb–körülbelül 99% vagy nagyobb, körülbelül 45% vagy nagyobb–körülbelül 70% vagy nagyobb, körülbelül 60% vagy nagyobb–körülbelül 80% vagy nagyobb, körülbelül 70% vagy nagyobb–körülbelül 90% vagy nagyobb, körülbelül 80% vagy nagyobb–körülbelül 90% vagy nagyobb, vagy körülbelül 45% vagy nagyobb–körülbelül 70% vagy nagyobb, ami a 40 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. A találmány szerinti vizes készítményeknek legalább 45%¹os oxidációs stabilitásuk van. A „százalékos oxidációs stabilitás” kifejezés a TFPI vagy TFPI-változat minta azon részére utal, amely nem tartalmaz oxidált metionint, amely 30 °C¹on végzett gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. Egy 30 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálat során egy TFPI vagy TFPI-változat minta inkubálva van nyolc hétig 30 °C hõmérsékleten. Az inkubálást követõen a TFPI vagy TFPI-változat minta fordított fázisú nagy teljesítményû folyadékkromatográfiás (RP-HPLC) vizsgálatnak van alávetve a metionin oxidált TFPI vagy TFPI-változat mennyiségének meghatározására. Egy RP¹HPLC vizsgálatot alább ismertettünk. Tehát például egy TFPI vagy TFPI-változat

5

10

15

20

25

30

35

2

készítmény, amelynek az oxidációs stabilitása 60%, egy olyan készítmény, amelyben a TFPI vagy TFPIváltozat 60%¹a nem tartalmaz oxidált metionint, ami a 30 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. Egy TFPI vagy TFPI-változat készítmény, amelynek az oxidációs stabilitása 80%, egy olyan készítmény, amelyben a TFPI vagy TFPI-változat 80%¹a nem tartalmaz oxidált metionint, ami a 30 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. A találmány szerinti TFPI vagy TFPI-változat készítmények százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45, 50, 60, 70 vagy 75% vagy nagyobb, elõnyösebben körülbelül 80, 82, 84, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 vagy 99% vagy nagyobb, ami a 30 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve, és lehet például körülbelül 45% vagy nagyobb–körülbelül 99% vagy nagyobb, körülbelül 45% vagy nagyobb–körülbelül 70% vagy nagyobb, körülbelül 60% vagy nagyobb–körülbelül 80% vagy nagyobb, körülbelül 70% vagy nagyobb–körülbelül 90% vagy nagyobb, körülbelül 80% vagy nagyobb–körülbelül 90% vagy nagyobb, vagy körülbelül 45% vagy nagyobb–körülbelül 70% vagy nagyobb, ami a 30 °C¹os gyorsított stabilitási vizsgálatban van mérve. A találmány szerinti készítményekben a tárolás során tapasztalt TFPI vagy TFPI-változat féléletidõ jellemzõen a körülbelül 1–körülbelül 36 hónap tartományban van (például legfeljebb körülbelül 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 vagy 36 hónap), a tárolási hõmérséklettõl függõen. A TFPI¹t vagy a TFPI-változatot, szolubilizálószert és antioxidánst tartalmazó készítmények, amelyeknek a pH¹értéke körülbelül 4–körülbelül 8 a találmánynak megfelelõen, féléletideje a tárolás során az aggregációs és/vagy oxidációs stabilitásra tekintettel nagyobb, mint körülbelül 8 hét körülbelül 15 °C hõmérsékleten. Például TFPI vagy a TFPI-változat féléletideje tároláskor körülbelül 1 hónap–körülbelül 24 hónap (például körülbelül 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 vagy 24 hónap) körülbelül 15 °C vagy körülbelül 30 °C hõmérsékleten.

40

45

50

55

60 4

Tárolási hõmérséklet A megnövelt tárolási stabilitás elérhetõ attól függetlenül, hogy a találmány szerinti vizes készítmények késõbbi alkalmazásra folyadékként vannak tárolva, vagy le vannak fagyasztva és alkalmazás elõtt vannak felengedve. A tárolási hõmérséklet lehet körülbelül –70 °C–körülbelül 25 °C (például körülbelül –70, –60, –50, –40, –30, –20, –10, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24 vagy 25 °C). Elõnyösen a találmány szerinti vizes készítmények folyadék formában vannak tárolva, hogy teljes mértékben kihasználásra kerüljön az az elõnye, hogy ezen formában megnövelt a tárolási stabilitása, könnyû a beadása újraoldás nélkül és az a képessége, hogy a kiszerelések biztosíthatóak elõtöltött alkalmazásra kész fecskendõként vagy többszörös dóziskiszerelésként, ha a kiszerelés kompatibilis bakteriosztatikus ágensekkel. A folyadékkiszerelés elõnyös tárolási hõmérséklete körülbelül 2 °C–körülbelül 8 °C (például körülbelül 2, 3, 4, 5, 6, 7 vagy 8 °C).

1

HU 005 921 T2

TFPI és TFPl-változatok A TFPI egy polipeptid, amelynek az aminosavszekvenciáját az 1. azonosító számú szekvencián mutattuk be (SEQ ID NO: 1). Elõnyösen a TFPI rekombináns humán fehérje, amely mikrobiális gazdában volt elõállítva. A TFPI¹t tovább jellemezték és ismertették a biológiai aktivitása tekintetében a WO 01/24814 számú nemzetközi közzétételi iratban. A TFPI-változatok közé tartoznak a TFPI származékai és analógjai, valamint a TFPI fragmensei, TFPI analógok és a TFPI-származékok. TFPI-változatok beszerezhetõek humán vagy egyéb emlõsforrásból, szintetizálhatóak, vagy elõállíthatóak rekombináns technikákkal. Az egy vagy több aminosavszubsztitúciós, inszerciós, deléciós és/vagy hozzáadások TFPI molekula analógok. Elõnyösek a konzervatív szubsztitúciók, melyeknek során egy aminosav egy másik hasonló tulajdonságú aminosavra van cserélve. A konzervatív szubsztitúciók közé tartoznak nem korlátozó módon a következõk: GlyÛAla, ValÛIleÛLeu, AspÛGlu, LysÛArg, AsnÛGlm és PheTrpÛTyr. Ezek jellemzõen a körülbelül 1–5 aminosav tartományba esnek (például 1, 2, 3, 4 vagy 5 aminosav). A molekula bármely pozíciójához adható addicionális aminosav, különösen a C¹ vagy N¹terminális végen. Például egy TFPI analóg, N¹L-alaniI-TFPI („ala-TFPI”), esetében egy addicionális alanin aminosav van az aminoterminális végen. Aminosavaddíciók lehetnek 1, 2, 5, 10, 25, 100 vagy több addicionális aminosavasak. A fúziós fehérjék a találmány definíciójának oltalmi körén belül vannak. A fragmensek a TFPI, TFPI analógok, vagy TFPIszármazékok részei. A fragmensek példái közé tartoznak a Kunitz-domének, 1, 2 vagy 3, Kunitz-domének 1 és 2 vagy 2 és 3, vagy az N¹terminus, C¹terminus vagy mindkettõ deléciói. A változatok elõállítására szolgáló lényegi iránymutatás megtalálható az U.S. 5,106,833 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. A TFPI fragmensei legalább 20 egymás utáni aminosavat tartalmaznak a SEQ ID NO: 1 szerint. Például egy fragmens lehet 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250 vagy 275 hosszában egymást követõ aminosav. Olyan TFPI fragmenseket, amelyeknek nincs biológiai aktivitásuk, ismertet az U.S. 5,106,833 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. Szintén a találmány tárgyát képezik az ilyen találmány szerinti fragmensek. A származékok definíció szerint TFPI, TFPI analógok, vagy TFPI fragmensek, amelyeknek további részeik vannak. Az ilyen addíciók közé tartoznak a következõk: glikozilezés, foszforiláció, acetilezés vagy amidálás. A TFPI-változat és a SEQ ID NO: 1 közötti százalékos homológia meghatározható a Blast2 egymás alá rendezõ program (Blosum62, Expect 10, standard genetikai kódok, open gap 11, extension gap 1, gap x_dropoff 50, és ki van kapcsolva a kis komplexitású szûrõ). A TFPI-változatoknak általánosan körülbelül 70% vagy nagyobb, elõnyösen körülbelül 80% vagy nagyobb, elõnyösebben körülbelül 90%–95% (például

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

90, 91, 92, 93, 94 vagy 95%) vagy nagyobb és legelõnyösebben körülbelül 98% vagy 99% aminosavszekvencia-azonosságuk van a SEQ ID NO: 1¹hez képest. A TFPI aminosavszekvencia-változatai elõállíthatóak a TFPI¹t kódoló DNS-szekvenciában módosulások létrehozásával. A szakterületen jól ismertek eljárások nukleotidszekvencia-eltérések elõállítására. Lásd például: Walker és Gaastra, szerk. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488–492, Kunkel és munkatársai (1987) Methods Enzymol. 154: 367–382, Sambrook és munkatársai (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York), U.S. 4,873,192 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és az itt hivatkozott hivatkozások. A TFPI-változatoknak elõnyösen lényeges mértékû biológiai aktivitásuk van, például 10%, 30%, 5%, 60%, 80%, 90% vagy több TFPI biológiai aktivitás, ami például protrombin (PT) vizsgálatban van mérve, alább ismertetve. Nyilvánvalóan a TFPI-változatot kódoló DNS-ben létrehozott változások nem helyezhetik a szekvenciát a leolvasási kereten kívülre, és elõnyösen nem hoznak létre komplementer szakaszokat, amelyek másodlagos mRNS-szerkezeteket hoznának létre. Iránymutatás arra, hogy mely aminosavak szubsztituálhatóak, inszertálhatóak vagy törölhetõek a TFPI vagy TFPI-változat biológiai vagy immunológiai aktivitásának eltüntetése nélkül, megtalálhatóak számítógépes programok alkalmazásával, amelyek jól ismertek a szakterületen, mint például a DNASTAR szoftver vagy Dayhoff és munkatársai (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.). Szintén megfontolás tárgyát képezik az olyan TFPI-változatok, amelyek biológiailag nem aktívak. A TFPI vagy TFPI-változatok elõállíthatóak rekombinánsan, ahogy ez be lett mutatva az U.S. 4,966,852 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. Például a cDNA a kívánt fehérjére beépíthetõ prokarióta vagy eukarióta expresszióra szolgáló plazmidba. A szakterületen jártas szakember számára számos hivatkozás van, amelyek részletekkel szolgáltatnak fehérjék mikroorganizmusok alkalmazásával történõ expressziójára. Lásd U.S. 4,847,201 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és Maniatas és munkatársai, 1982, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor, New York). Számos technika érhetõ el mikroorganizmusok transzformálására és a transzformált mikroorganizmusok alkalmazására TFPI vagy TFPI-változatok expressziójára. A következõk csupán a különbözõ megközelítési módok lehetséges példái. A TFPI vagy TFPIváltozat DNS-szekvenciája megfelelõ kontrollszekvenciához kapcsolható. A TFPI vagy TFPI-változat DNSszekvenciája beépíthetõ plazmidba, mint például pUC13 vagy pBR322, amelyek kereskedelmileg elérhetõek az olyan cégektõl, mint például a BoehringerMannheim. Amint a TFPI vagy TFPI-változat DNS¹e egy vektorba van inszertálva, akkor megfelelõ gazdába

1

HU 005 921 T2

klónozható. A DNS amplifikálható olyan technikákkal, mint amilyeneket az U.S. 4,683,202 és U.S. 4,683,195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések mutatnak be. cDNS állítható elõ sejtek indukálásával, mint például HepG2 vagy SKHep hepatoma sejtek, mRNS elõállítására, ezután az mRNS azonosítása és izolálása, és ezt követõen reverz transzkripciója a cDNS elõállítására. Az expressziós vektor gazdasejtbe történõ transzformációját követõen, mint például E. coli, a baktérium tenyészthetõ és a fehérje expresszáltatható. A baktériumok az elõnyös prokarióta mikroorganizmusok és különösen elõnyös az E. coli. A találmányban alkalmazható egyik elõnyös mikroorganizmus az E. coli K¹12, MM294 törzs a Budapesti Szerzõdés elõírásai szerint letétbe helyezve 1984. február 14¹én, 1984 az American Type Culture Collection törzsgyûjteményben, amely jelenleg a következõ helyen található: 10801 University Blvd., Manassas, Virginia (regisztrációs szám: 39607). A TFPI vagy TFPI-változatok elõállíthatóak baktériumokban vagy élesztõben, és ezt követõen tisztíthatóak. Általánosan alkalmazhatóak a következõ dokumentumokban bemutatott eljárások: U.S. 5,212,091, U.S. 6,063,764 és U.S. 6,103,500 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak vagy WO 96/40784 számú nemzetközi közzétételi irat. A TFPI vagy TFPI-változatok tisztíthatóak, szolubilizálhatóak és újra feltekerhetõek a WO 96/40784 számú közzétételi irat és Gustafson és munkatársai, Prot. Express. Pur. 5: 233 (1994) dokumentumának megfelelõen. Például ha a WO 96/40784 nemzetközi közzétételi irat 9. példája szerint vannak elõállítva, akkor olyan ala-TFPI készítmények jönnek létre, amelyek körülbelül 85%–90% biológiailag aktív ala-TFPI¹t tartalmaznak a fehérje teljes tömegére vetítve. A találmány szerinti vizes készítményekhez a TFPI vagy TFPI-változat jellemzõen körülbelül 0,05 mg/ml–körülbelül 15 mg/ml (például 0,05, 0,15, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 vagy 15 mg/ml) mennyiségben van hozzáadva. Aminosav szolubilizálószer A találmány szerinti TFPI-tartalmú vagy TFPI-változatot tartalmazó készítményekbe beépített aminosav szolubilizálószer elsõdlegesen megvédi a TFPI¹t vagy a TFPI-változatot az aggregációtól, ezáltal növelve a tárolás során a stabilitását. A lecsökkent aggregátumkialakulás az aminosav szolubilizálószer hozzáadásával koncentrációfüggõ módon történik. Tehát az aminosav szolubilizálószer növekvõ koncentrációja a TFPI vagy TFPI-változat készítmény növekvõ stabilitásához vezet a tárolás során fellépõ aggregátumkialakulás csökkenése következtében. Az elõnyös aminosav szolubilizálószerek a következõk: arginin, lizin, vagy arginin vagy lizin analógok. Az arginin vagy lizin lehet jelen szabad bázis formában vagy só formában, például sósavsó formában. Az arginin vagy lizin analógok szintén lehetnek szabad bázis vagy só formában. Az arginin analógok közé tartoznak például a következõk: aminoguanidin-arginin-etil-ész-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2

ter, arginin-hidroxamát és arginin-p-nitroanilid. A lizin analógok közé tartoznak például a következõk: lizinamid, lizin-etil-észter, lizin-hidroxamát és lizin-p-nitroanilid. Elõnyösen a szolubilizálószer arginin, amely vagy szabad bázis formában vagy sósav sója formájában van jelen. Szintén elõnyösek szolubilizálószerként történõ alkalmazásra a természetben elõforduló L¹sztereoizomerjei az argininnek vagy lizinnek, habár a találmány szerinti stabilizált készítmények D¹sztereoizomert vagy L¹ és D¹sztereoizomerek keverékét is tartalmazhatják. Az arginin vagy lizin szolubilizálószerek vagy az analógjaik olyan mennyiségben vannak a vizes készítménybe építve, amely körülbelül a kívánt stabilizálóhatást váltja ki a TFPI vagy TFPI-változat készítményekre a tárolás során, tehát a hozzáadott szolubilizálószer nélküli hasonló készítményekhez képest a kiszerelés javított ellenállást mutat a lebomlásra. Elõnyösen a szolubilizálószer összes mennyisége a készítményben körülbelül 50–körülbelül 600 mM (például 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 vagy 600 mM), elõnyösebben körülbelül 100 mM–körülbelül 400 mM és legelõnyösebben körülbelül 300 mM. A TFPI-tartalmú vagy TFPI-változat-tartalmú vizes készítményekhez az aggregátumkialakulás csökkentésére, a polipeptidstabilitás növelésére és a készítmény stabilitásának növelésére a tárolás során hozzáadandó adott aminosavbázis mennyiségének meghatározása elvégezhetõ szakember számára általánosan ismert eljárásokkal, és ismertetve vannak például az alábbi 6. példában. Például az arginin vagy lizin szolubilizálószer hatása a TFPI vagy TFPI-változat stabilitására a tárolás során a vizes készítményben egyszerûen meghatározható a TFPI vagy TFPI-változat készítmény egy vagy számos lehetséges tulajdonságának változásának idõbeli mérésével, mint például az oldható polipeptid koncentrációja. Az oldható polipeptid oldatban lévõ mennyisége meghatározható kvantitatívan ionkizárásos (IEC)-HPLC-vel. Azokban az esetekben, amikor a TFPI vagy TFPI-változat lebomlásához vezetõ fõ útvonal az aggregáció, ott a javított stabilitás eléréséhez a TFPI-tartalmú vagy TFPI-változat-tartalmú készítményhez hozzáadott szolubilizálószer hatásos mennyisége olyan mennyiség, amely idõben csökkent aggregátumkialakuláshoz vezet, és ezáltal az oldható polipeptid idõben nagyobb oldatbeli visszatartásához a nem aggregált (azaz monomer) molekuláris formájában.

Antioxidánsok A találmány szerinti vizes TFPI vagy TFPI-változat készítmények antioxidánst is tartalmaznak. Egy „antioxidáns” egy olyan összetevõ, amely csökkenti a TFPI vagy TFPI-változat oxidációját, különösen a molekulán belüli metionin aminosavakét. A TFPI vagy TFPI-válto55 zat molekulában jelen lévõ metionin aminosavak oxidációja a tárolás során az egyik fõ lebomlási útvonal a TFPI vagy TFPI-változat készítmények esetében. Az oxidáció a készítményben lévõ szennyezõdésekhez kapcsolódik, amelyek vagy reagálnak közvetlenül a 60 metionin aminosavakkal, vagy katalizálják az oxidációs 50

6

1

HU 005 921 T2

reakciókat. Tehát az ilyen szennyezõdések ellen alkalmazott egyes hozzáadott antioxidánsok a TFPI vagy TFPI-változat készítmények sokkal nagyobb stabilitásához vezetnek, még azon készítmények esetében is, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti szolubilizálószert. Elõnyösen az antioxidáns gyógyszerészetileg elfogadható és körülbelül 0,01–körülbelül 50 mM (például körülbelül 0,01, 0,1, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 vagy 50 mM) koncentrációban van jelen, elõnyösebben körülbelül 1–körülbelül 10 mM (például körülbelül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 mM) koncentrációban. A „gyógyszerészetileg elfogadható” kifejezés azt jelenti, hogy nincsen jelentõs hátrányos biológiai hatás, ha a kiszerelés páciensnek van beadva. A „páciens” kifejezés magában foglal mind humán, mind állatorvosi pácienseket. A találmány szerinti TFPI vagy TFPI-változat készítményekben hatásos általános típusú antioxidánsok a következõk: oxigénkiszorító gázok, oxigén- vagy szabadgyök-megkötõk és kelálószerek. Oxigént kiszorító gázok A vizes TFPI vagy TFPI-változat készítményekben jelen lévõ oldott oxigén végül metioninoxidációhoz vezethet, és ezáltal a TFPI-hatásosság elvesztéséhez a kívánt terápiás funkció tekintetében, vagy oxidált típusok beépüléséhez (például metionin-szulfoxid) a TFPI vagy TFPI-változat polipeptidbe, amelynek lehetnek ismeretlen vagy elõnytelen fiziológiai hatásai. Az oxigént kiszorító gázok olyan gázok, amelyek hatásosak az oldódott oxigén kiszorítására vagy megtisztítására. Elõnyösen egy oxigénkiszorító gáz jelentõsen csökkenti az oldható oxigénkoncentrációt ahhoz az oxigénkoncentrációhoz képest, amely akkor lép fel, ha a készítményt közömbös körülmények között levegõn ekvilibráljuk. Elõnyösen az oxigént kiszorító gáz kevesebb mint körülbelül 10%¹ra csökkenti az oldott oxigénkoncentrációt ahhoz képest az oxigénkoncentrációhoz képest, amely a TFPI vagy TFPI-változat vizes készítményében lenne, ha nem tartalmazna oxigént kiszorító gázt. Ez a körülmény drámaian javítja a stabilitást. Az elõnyös oxigént kiszorító gázok lényegében közömbösek a TFPI vagy TFPI-változat készítményre, azaz nem történik szignifikáns mennyiségû kémiai reakció, ha a TFPI készítményt kitesszük az oxigént kiszorító gáznak, hogy a TFPI biológiai aktivitása fennmaradjon. A megfelelõ oxigént kiszorító gázok közé tartoznak a következõk: nitrogén, nitrogénben dúsított levegõ, nitrogénben dúsított oxigén, nemesgázok (például hélium vagy argon), metán, etán, propán, szén-dioxid és ezen gázok keverékei. A „nitrogénben dúsított levegõ” és „nitrogénben dúsított oxigén” rendre olyan nitrogén és levegõ vagy oxigén keverékek, amelyekben a nitrogénkoncentráció nagyobb, mint ami a légkörben található (azaz nagyobb, mint körülbelül 79 térfogat%). A nitrogén az elõnyös oxigént kiszorító gáz. Az oxigént kiszorító gáz bármilyen koncentrációban jelen lehet a készítményben egészen akár az oldhatósági határnak megfelelõ mennyiségben is. A TFPI vagy TFPI-változat készítményben az oxigént kiszorító gáz

2

oldhatósága növelhetõ, ha a készítményt nyomás alatti légkörben tartjuk, mint például egy zárt edényben, amely a készítmény folyadékszintje felett tartalmazza a kiszorító gázt. Alternatív esetben légköri nyomás alatti 5 nyomás is fenntartható a fejtérben az oxigént kiszorító gáz oldhatóságának csökkentésére. Az oxigént kiszorító gázok bevihetõek a TFPI vagy TFPI-változat készítménybe bármilyen hagyományos módon, mint például a folyadékszint feletti fejtér átöblí10 tése a kiszorító gázzal egy edényben vagy egyéb tárolóban, amely a TFPI vagy TFPI-változat készítményt tárolja, a kiszorító gáz permetezése vagy buborékoltatása a TFPI vagy TFPI-változat készítményen át, nyomás alá helyezés/nyomáscsökkentés ciklusok alkalmazásá15 val a kiszorító gázzal, kiürítés, amelyet a kiszorító gázzal történõ nyomás alá helyezés követ és a hasonlók. Az oxigénkiszorítás fent ismertetett módon történõ kivitelezését követõen az oxigén visszaoldódása a TFPI vagy TFPI-változat készítménybe az oxigénkiszo20 rító gáz általi levegõtõl való elszigeteléssel van megakadályozva.

25

30

35

40

45

50

55

60 7

Oxigén- vagy szabadgyök-megkötõk A találmányban alkalmazható további antioxidánstípus az oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szer. Általánosan az ilyen megkötõszerek jobban reagálnak az oxigénnel és/vagy a szabad gyökökkel, mint a TFPI vagy TFPI-változat. „Önfeláldozó” molekulákként szolgálnak, amelyek az elérhetõ oxigénnel reagálnak, ezáltal megakadályozva a káros oxigén-TFPI vagy oxigénTFPI-változat kölcsönhatásokat, elsõsorban is a metionin aminosavak oxidációját. Egy elõnyös megvalósítási mód szerint az oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szer koncentrációja körülbelül 0,1–körülbelül 10 mM. A megfelelõ oxigént és szabad gyököket megkötõ szerek stabilisak a találmány szerinti TFPI vagy TFPIváltozat készítményekben. Az elõnyös gyógyszerészetileg elfogadható oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szerek közé tartoznak a következõk: metionin, aszkorbinsav vagy nátrium-aszkorbát, L¹, DL¹ vagy D¹alfa-tokoferol és L¹, DL¹ vagy D¹alfa-tokoferol-acetát, béta-karotin, szelén, piritinol, propil-gallát, butilezett hidroxianizol (BHA) és butilezett hidroxitoluol (BHT). Az oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szer megfelelõ fázisa természetesen függ a kompatibilitásától a TFPI vagy TFPI-változat készítménnyel. Általánosan a hidrofil antioxidánsok, mint például az aszkorbinsav vagy az alfatokoferol acetátsója (azaz alfa-tokoferol-acetát) megfelelõ módon beépíthetõ a találmány szerinti készítményekbe. A metionin bármely sztereoizomerje (L¹, D¹ vagy DL¹ izomer) vagy izomerek kombinációja is alkalmazható. Egy különösen elõnyös antioxidáns a metionin, különösen az L¹metionin. Általánosan jobb eredmények érhetõek el, ha a hozzáadott metionin moláris szinten legalább azonos mennyiséget képvisel a TFPIhez vagy TFPI-változathoz. A TFPI a natív formájában 5 metionin aminosavat tartalmaz egy fehérjemolekulában. A TFPI vagy TFPI-változat fehérjerészét képezõ metionint „TFPI vagy TFPI-változat metionin”-nak ne-

1

HU 005 921 T2

vezzük, hogy megkülönböztessük attól a metionintól, amelyet antioxidánsként adtunk a készítményhez, és amely nem része a TFPI vagy TFPI-változat fehérjének. Természetesen egy polipeptidben lévõ metionin, amely polipeptid nem a TFPI vagy TFPI-változat, szintén szolgálhat oxigént vagy szabad gyököt megkötõ szerként a találmány céljaira. Például a poli(metionin)¹t tartalmazó polipeptid csökkentheti a TFPI vagy TFPIváltozat metioninjának oxidációját a készítményhez adott szabad metioninhez hasonló módon. Tehát fontos, hogy különbséget tegyünk a fent definiált „TFPI vagy TFPI-változat metionin” és a „nem TFPI vagy nem TFPI-változat” metionin között, amely bármilyen a készítményhez adott metionint tartalmaz, akár szabad formában, akár polipeptidhez kötötten, amely polipeptid nem TFPI vagy TFPI-változat. Elõnyösen a metionin olyan mennyiségben van jelen, hogy a nem TFPI vagy nem TFPI-változat metionin aránya a TFPI vagy TFPI-változat metioninhez képest körülbelül 1:1–körülbelül 10 000:1, elõnyösebben körülbelül 1:1–körülbelül 5000:1, még elõnyösebben körülbelül 100:1–körülbelül 1000:1 és még elõnyösebben körülbelül 300:1–körülbelül 1000:1, és még ennél is elõnyösebben körülbelül 500:1–körülbelül 1000:1. Az abszolút koncentrációja tekintetében a metionin elõnyösen a készítményben körülbelül 1–körülbelül 10 mM (például körülbelül 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 mM) koncentrációban van jelen. Azonban a metionin alkalmazott koncentrációja változhat a találmány szerinti készítményben lévõ TFPI vagy TFPI-változat mennyiségétõl függõen. A metionin vagy egyéb oxigénmegkötõ egy fontos tulajdonsága, hogy megakadályozza a TFPI vagy TFPI-változat metionin-szulfoxid aminosavakat, amelyek nem kívánt vagy ismeretlen hatásokat okozhatnak fiziológiai körülmények között, még azokban az esetekben is, ahol a TFPI vagy TFPI-változat biológiailag aktív lehet. Tehát a hozzáadott antioxidáns mennyisége olyan mennyiség kell hogy legyen, amely elég a metionin aminosavak oxidációjának gátlására, hogy ezáltal a metionin-szulfoxid mennyisége, amely oxidáció révén jön létre a hozzáadott metionin oxidációjával, elfogadható a szabályozó hivatalok számára. Jellemzõen ez azt jelenti, hogy a készítmény nem tartalmaz több mint körülbelül 10%–körülbelül 30% metionin aminosavat metionin-szulfoxid formában. Kelálószerek A találmányban alkalmazható további antioxidánstípus a kelálószer, amely ismert mint szekvesztrálószer is, amely hatásosan köti meg az átmenetifém-ionokat (például Fe3+). Átmenetifém-ionok lehetnek jelen a készítményben és katalizálhatják a káros oxidációs reakciókat, amelyek fehérjelebomláshoz és aggregációhoz vezetnek. A kelálószerek úgy vannak kiválasztva, hogy ne legyen, vagy kicsi legyen a kémiai reaktivitásuk a készítmény egyéb összetevõivel és, hogy általánosan kompatibilisek legyenek a készítmény kívánt fiziológiai tulajdonságainak fenntartásával (például pH és ozmolaritás). Tehát elõnyös, ha kelálószerek vannak alkalmazva a készítményekben, ha az átmenetifém-katio-

2

nok nem szándékosan vannak a készítményhez adva olyan célokból, mint a pH vagy az ozmolaritás fenntartása. A kelálószerek elõnyösen gyógyszerészetileg elfo5 gadhatóak. Elõnyös gyógyszerészetileg elfogadható kelálószerek közé tartoznak a következõk: amino-karboxilát-vegyületek, amelyek képesek fém-ligand komplexek kialakítására oldatban egy vagy több átmenetifém-ionnal. Ilyen amino-karboxilátok közé tartoznak a 10 következõk: etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) és dietil-triamin-pentaecetsav (DTPA), 1,2-bisz(2¹amino-fenoxi)-etán¹N,N,N’,N’-tetraecetsav (BAPTA), etilénglikol-bisz(2¹amino-etil)¹N,N,N’,N’-tetraecetsav (EGTA) és egyéb karboxilátvegyületek, amelyeknek egy vagy 15 több karboxilátcsoportjuk van. Ezen amino-karboxilát kelálószerek bármely só származéka, például a dinátriumsó forma szintén alkalmazható, feltéve, hogy marad valamennyi kapacitása a kelálószernek a TFPI vagy TFPI-változat készítménybe lévõ átmenetifém-io20 nokkal történõ kapcsolat kialakítására. Ezen kelálószereknek a sóformáktól eltérõ alakjai szintén hatásosak, és idetartoznak különbözõ észter, anhidrid és halogénezett formái ezen vegyületeknek. 25

30

35

40

45

50

55

60 8

Puffer A TFPI vagy TFPI-változat készítmények pH¹értéke befolyásolja a fehérje oldhatóságát, és ezáltal a stabilitását. Lásd Chen és munkatársai (1999) J. Pharm. Sciences 88 (9): 881–888. A találmány szerinti készítmények esetén elõnyös pH¹tartomány a körülbelül 4–körülbelül 8 (például 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 vagy 8), elõnyösebben a körülbelül 5–körülbelül 6,5. Mivel a pH¹érték egy szignifikáns tényezõ a TFPI oldhatóságában, ezért a megfelelõ pH¹érték fenntartására alkalmazott puffer tovább javíthatja a kiszerelések stabilitását. Tehát a találmány szerinti vizes készítmények tartalmazhatnak továbbá puffert az oldat pH¹értékének fenntartására. Elõnyösen a puffer a só formájától lényegében mentes sav, sav a sója formájában, vagy sav és sójának keveréke. Elõnyösen a készítmény pH¹értéke arginin vagy lizin aminosav szolubilizálószerrel van fenntartva, amely a bázis formájában van egy olyan savval kombináltan, amely lényegében mentes a sójától. Egy ilyen kombináció kisebb ozmolaritást ad az oldatnak, mint ha egy sav és sója van alkalmazva pufferként egy aminosavbázissal kombinálva. Egy ilyen kombináció elõnye, hogy nagyobb koncentrációban lehet hozzáadni arginin vagy lizin aminosav szolubilizálószert és/vagy antioxidánst (például metionint) a vizes készítményhez, anélkül hogy meghaladnánk az oldat izotonikusságát. A „só formájától lényegében mentes sav” kifejezés azt jelenti, hogy a vizes készítményben pufferezõszerként szolgáló sav jellemzõen kevesebb mint körülbelül 2%¹át tartalmazza a sójának. Jellemzõen, ha savat tartalmazó puffert alkalmazunk a vizes készítményben, akkor a sav só formájából van elõállítva, vagy a sav és a sav konjugált bázisának kombinációjából. Tehát például a puffer elõállítható a savnak és konjugált bázisa nátrium, kálium, ammó-

1

HU 005 921 T2

nium, kalcium és/vagy magnézium sójaként. Ha a puffer úgy van megválasztva, hogy tartalmazza az arginin vagy lizin szolubilizálószer bázikus formáját kombinációban egy savval, amely lényegében mentes a sójától, akkor az elõnyös pufferek a következõk közül választottak: citromsav, borostyánkõsav, foszforsav, glutaminsav, maleinsav, almasav, ecetsav, borkõsav és aszparaginsav. Különösen elõnyös a citromsav és borostyánkõsav pufferként történõ alkalmazásra argininnel kombinációban a szabad bázis formában. Egyébként, amint azt korábban említettük, az arginin alkalmazható sója formájában, mint például az arginin HClsója. Ebben az esetben a puffer általánosan egy fent ismertetett sav és a konjugált bázisa kombinációját fogja tartalmazni. Egyéb alkalmazható pufferek közé tartozik a hisztidin és imidazol. Általánosan a puffer elõnyös koncentrációja körülbelül 0–körülbelül 50 mM (például 0, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 vagy 50 mM); elõnyösebben a koncentráció körülbelül 5–körülbelül 30 mM. Ha az alkalmazott puffer aminosavbázis és a sójától lényegében mentes sav, akkor elõállíthatóak olyan TFPI-tartalmú vagy TFPI-változat-tartalmú készítmények, amelyek lényegében izotóniásak, anélkül hogy további izotonizálószereket adnánk hozzá, mint például nátrium-kloridot. Egy készítmény, amely lényegében izotóniás, minimális vízáramot vált ki, vagy nem vált ki vízáramot az in vivo beadást követõen a környezõ sejtek membránjában. Általánosan a vizes készítmények izotonikussága kívánatos, mivel csökkenti a beadáskor jelentkezõ fájdalmat, és minimalizálja a hipertóniás vagy hipotóniás készítményekhez kapcsolódó potenciális hemolitikus hatásokat. Az izotóniás állapot megfelel egy oldat ozmolaritásának, amely körülbelül 240 mOsmol/L–körülbelül 340 mOsmol/L (például 240, 250, 260, 270; 280, 290, 300, 310, 320, 330 vagy 340 mOsmol/L), amely elõnyös a jelen találmány során. Elõnyösebben, egy lényegében izotóniás állapot elérhetõ, ha az ozmolaritás körülbelül 290 mOsmol/L. Néhány esetben azonban a TFPI vagy TFPI-változat készítmény kívánt fenntartandó tulajdonságaitól (például pH és ozmolaritás) függõen a pufferezõszerként alkalmazott sav lehet a sav só formája vagy a sav és a sójának keveréke. Ebben az esetben egy elõnyös puffer egy sav és sójának a keveréke. A sav lehet például citromsav, borostyánkõsav, foszforsav, glutaminsav, maleinsav, almasav, ecetsav, borkõsav és aszparaginsav. A sav só formája lehet a konjugált bázisa nátrium, kálium, ammónium, kalcium és/vagy magnézium sója. Különösen elõnyös pufferek azok, amelyek esetében a konjugált bázis sója nátriumsó. Ilyen pufferek közé tartoznak a következõk: citromsav/nátrium-citrát, borostyánkõsav/nátrium-szukcinát, foszforsav/nátriumfoszfát, glutaminsav/nátrium-glutamát, maleinsav/nátrium-maleát, almasav/nátrium-malát, ecetsav/nátriumacetát, borkõsav/nátrium-tartarát és aszparaginsav/nátrium aszpartát, ha arginin van alkalmazva szolubilizálószerként, még a bázis formájában is, akkor elõnyös a citromsav/nátrium-citrát vagy a borostyánkõsav/nátrium-szukcinát. Ebben az esetben a puffer kon-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

centrációja elõnyösen körülbelül 5 mM–körülbelül 30 mM (például 5, 10,15, 20, 25 vagy 30 mM), elõnyösebben körülbelül 20 mM. Ha aminosavbázis, amely a sójától lényegében mentes savval van pufferezve, kombináció van alkalmazva, akkor lehetségesek közel izotóniás kiszerelések, amelyekben magasabb a stabilizáló aminosavkoncentráció, mint ami úgy érhetõ el, ha olyan pufferrendszert alkalmazunk, amely sav és sójának keveréke. A lényegében izotóniás készítményekhez kapcsolódó nagyobb szolubilizálószer-koncentrációk ezekben az esetekben jobb TFPI- vagy TFPI-változat-stabilitást eredményeznek, és ezáltal növelik a tárolási idõt. Például ha citromsav van alkalmazva argininbázis pufferezésére, amely TFPI- vagy TFPI-változat-tartalmú vizes készítményhez van adva, és a pH¹értéke 5,5, akkor az arginin koncentrációja 300 mM¹ra növelhetõ, miközben megmarad a kiszerelés izotonikussága. Ez közel 35%¹os növekedést eredményez TFPI vagy TFPI-változat eltarthatósági idejében 50 °C hõmérsékleten. Habár hasonló TFPI vagy TFPI-változat eltarthatósági idõ érhetõ el azonos argininkoncentráció és pufferként citromsav/nátrium-citrát alkalmazásával, de az arginint a savas formájában kell hozzáadni, hogy hasonló pH¹értéket érjünk el, és az eredményül kapott kiszerelés hipertóniás lesz. Az a lehetõség, hogy egy aminosavnak nagyobb koncentrációi alkalmazhatóak, mint elsõdleges stabilizálószer, megszünteti a szükségét a további hagyományosabb TFPI vagy TFPI-változat szolubilizálószereknek, mint például borjúszérumalbumin vagy humán szérumalbumin, amelyek kevésbé kívánatos stabilizálószerek a potenciális virális szennyezõdés miatt. További stabilizálószerek A találmány szerinti TFPI vagy TFPI-változat készítmények tartalmazhatnak egyéb vegyületeket, amelyek a TFPI vagy TFPI-változat hatásosságát növelik vagy egyéb elõnyös tulajdonságukat javítják, mindaddig, amíg az elsõdleges stabilizálóhatás, amelyet az antioxidánssal kombinált aminosav szolubilizálószerrel lett elérve, nem változik hátrányosan. Például a TFPI vagy TFPI-változat polipeptid lebomlása a fagyasztás és felengedés következtében vagy a találmány szerinti TFPI vagy TFPI-változat készítmények elõállítása során fellépõ mechanikai nyírás következtében gátolható felületaktív anyagok hozzáadásával, annak érdekében, hogy csökkenjen a felszín-levegõ felületi feszültség. A megfelelõ felületaktív anyagok a nemionos felületaktív anyagok, ideértve a következõket: poli(oxi-etilén)szorbitol-észterek, mint például poliszorbát 80 (Tween 80) és poliszorbát 20 (Tween 20); polioxi-propilén-poli(oxi-etilén)-észterek, mint például Pluronic F68; poli(oxi-etilén)-alkoholok, mint például Brij 35; szimetikon; polietilénglikol, mint például PEG400; lizofoszfatidilkolin; és poli(oxi-etilén)-p-t-oktil-fenol, mint például Triton X¹100. Gyógyszerek klasszikus stabilizálását felületaktív anyagokkal vagy emulgeálószerekkel ismertetik például Levine és munkatársai (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160–165. A találmány gyakor-

1

HU 005 921 T2

2

latba vétele során alkalmazott elõnyös felületaktív anyag a poliszorbát 80. További stabilizálószerek, mint például albumin adott esetben hozzáadhatóak a TFPI vagy TFPI-változat készítmények stabilitásának további javítására. A hozzáadott albumin koncentrációja lehet körülbelül 1% tömeg/térfogat vagy kevesebb. Cukrok vagy cukoralkoholok is hozzáadhatóak a találmány szerinti TFPItartalmú vagy TFPI-változat-tartalmú készítményekhez. Bármilyen cukor, mint például mono¹, di¹ vagy poliszacharid vagy vízoldható glükán (például fruktóz, glükóz, mannóz, szorbóz, xilóz, maltóz, laktóz, szacharóz, dextrán, pullulán, dextrin, ciklodextrin, oldható keményítõ, hidroxi-etil-keményítõ és karboxi-metilcellulóz¹Na) alkalmazható. A szacharóz a legelõnyösebb cukoradalék. A cukoralkoholok (például C4–C8 szénhidrogének, amelyeknek van –OH csoportjuk), például mannitol, szorbitol, inozitol, galakititol, dulcitol, xilitol vagy arabitol alkalmazhatóak. A mannitol a legelõnyösebb cukoralkohol-adalék. A fent említett cukrok vagy cukoralkoholok alkalmazhatóak egyedileg vagy kombinációban. Nincs meghatározott korlát az alkalmazott mennyiségre, mindaddig, amíg a cukor vagy cukoralkohol oldható a folyadékkészítményben, és nem befolyásolja hátrányosan a találmány szerinti eljárásokkal elért stabilizálóhatásokat. Elõnyösen a cukorvagy cukoralkohol-koncentráció körülbelül 1% tömeg/térfogat–körülbelül 15% tömeg/térfogat, elõnyösebben körülbelül 2% tömeg/térfogat–körülbelül 10% tömeg/térfogat.

a találmánynak megfelelõen lett elérve, és amint azt az alábbiakban ismertetjük. A TFPI vagy TFPI-változat gyógyászati készítmény elõnyösen sterilizett membránszûréssel és egységdózis- vagy többszörösdózis5 tároló edényben van tárolva, mint például lezárt üvegedények vagy ampullák. Az ilyen készítmények fagyaszthatóak is. Készítmények kiszerelésére szolgáló további eljárások ismertek a szakterületen, és alkalmazhatóak a 10 vizes TFPI vagy TFPI-változat gyógyászati készítmények tárolási stabilitásának további növelésére, feltéve, hogy nem befolyásolják hátrányosan az itt ismertetett szolubilizálószerek, antioxidánsok és pufferek elõnyös tulajdonságait. A kiszerelés és a gyógyászatilag elfo15 gadható hordozók, szolubilizálószerek stb. alapos tárgyalása megtalálható a következõ kézikönyvben: Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) (18. kiadás, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania). A következõ példákat jellemzésként ajánljuk, és 20 nem korlátozásként. Az összes szabadalom, szabadalmi bejelentés és az ezen leírásban hivatkozott hivatkozások teljes terjedelmükben hivatkozásként a leírás részét képezik.

A készítmények elõállítása A találmány szerinti készítmények elõnyösen a szolubilizálószer, antioxidáns, adott esetben puffer és bármely egyéb excipiens a TFPI vagy TFPI-változat hozzáadása elõtti összekeverésével állíthatóak elõ. A TFPI vagy TFPI-változat megnövekedett stabilitásának eléréséhez elõnyös mennyiségû szolubilizálószer és antioxidáns hozzáadását követõen a készítmény pH¹értéke beállítható, elõnyösen az itt ismertetett tartományon belülre, amely optimális a TFPI vagy TFPI-változat számára. Habár a pH beállítható a TFPI vagy TFPI-változat hozzáadását követõen, elõnyösen a hozzáadást megelõzõen van beállítva, mivel ez csökkenti a denaturáció kockázatát. Ezt követõen megfelelõ mechanikai eszközök alkalmazhatóak az összetevõk megfelelõ elkeveredésének elérésére.

Fordított fázisú (RP) HPLC RP-HPLC¹t végeztünk Waters 626 LC rendszeren, amely fel volt szerelve egy 717 automata mintavevõvel 35 (Waters Corporation, Milford, Maine) Vydac 214BTP54 C4 oszlop és Vydac 214GCC54 elõoszlop (Separations Group, Hesparia, California) alkalmazásával. Az oszlopokat kezdetben az ’A’ mobil fázissal ekvilibráltuk (10% acetonitril, 0,1% TFA). Ez a 40 RP¹HPLC eljárás detektálja a monomer TFPI vagy TFPI-változatokat fõcsúcsként. Egyéb csúcsok, amelyek egyszeresen vagy többszörösen oxidált metionin aminosavai ezen fehérjének feloszthatóak, valamint a TFPI vagy TFPI-változat acetilezett és karbamilezett 45 formáit képviselõ csúcsok is.

Gyógyászati készítmények Elõnyösen a találmány szerinti vizes készítmények vagy olyan formában vannak, amely beadható alanynak, vagy olyan formában vannak, amely forma alkalmazható olyan kiszerelés elõállítására, amely beadható alanynak. A TFPI¹t vagy TFPI-változatokat tartalmazó vizes készítmények kiszerelhetõek egységdózisként, és lehetnek injektálható vagy infúzióként adható formában, mint például oldat, szuszpenzió vagy emulzió. Elõnyösen egy találmány szerinti vizes készítmény vizes kiszerelésben van tárolva, hogy ki legyen használva a megnövekedett tárolás soráni stabilitás, amely

Kísérletek A következõ protokollokat alkalmaztuk az alábbi 1–6. példákban az egyedi szolubilizálószerek és/vagy antioxidánsok TFPI vagy TFPI-változat vizes készítménybeli lebomlására és tárolás során tapasztalt stabi30 litására kifejtett hatásának meghatározására. 25

Ioncsere HPLC (IEX¹HPLC) Ioncsere (IEX)-HPLC¹t végeztünk Pharmacia Moho¹S HR 5/5 üvegoszlopon Waters 626 LC rendszer 50 alkalmazásával 717 fûtõ/hûtõ automata mintavevõvel, amint ezt Chen és munkatársai ismertették (fent). Az oszlopot 80% ’A’ mozgófázissal ekvilibráltuk (70:30 térfogat/térfogat, 20 mM nátrium-acetát:acetonitril, pH=5,4) és 20% ’B’ mozgófázis (70:30 térfogat/térfo55 gat, 20 mM nátrium-acetát és 1 M ammónium-klorid:acetonitril, pH=5,4). Az injektálást követõen a TFPI vagy TFPI-változat a ’B’ mozgófázis 21 perc alatti 85%¹ra történõ növelésével volt eluálva 0,7 ml/perc áramlási sebességgel. A TFPI vagy TFPI-változat kö60 rülbelül 16,5 percnél eluálódott egyetlen csúcsként, és 10

1

HU 005 921 T2

UV¹abszorbanciával detektáltuk 280 nm¹en Waters 486 abszorbanciadetektorral. Az adatgyûjtést és feldolgozást Perkin-Elmer Turbochrom rendszeren végeztük. A fehérjekoncentrációt a csúcsterület integrálásával és egy standard görbével történõ összehasonlításával határoztuk meg, ahol a standard görbét ismert koncentrációjú mintákból hoztuk létre. pH- és ozmolaritásmérések A különbözõ kiszerelések oldatbeli pH¹értékét Orion pH¹mérõ készülékkel határoztuk meg (Model 611, Orion Research Incorporated Laboratory Products Group, Boston, Massachusetts). A pH¹mérõ két pufferkalibrációs eljárással volt kalibrálva, a gyártó javaslatának megfelelõen pH=4 standard alkalmazásával (Fisher Scientific, Cat. No. SB101–500) és pH=7 standard alkalmazásával (Fisher Scientific, Cat. No. SB107–500). Ezen kiszerelések oldatbeli ozmolaritását Wescor gõznyomás ozmométerrel határoztuk meg (Model 5500, Wescor Inc., Logan, Utah). Az ozmométert két standarddal kalibráltuk, amelyet a gyártó szállított: 290 mmol/kg standard (Wescor, Reorder No. OA¹010) és 1000 mmol/kg standard (Wescor, Reorder No. OA¹029).

sával indítottuk be. A készülék ezt követõen rögzíti az alvadási idõt. Egy lineáris TFPI standard görbét kaptunk a log alvadási idõ – log TFPI koncentráció ábrázolásból. A standard görbét a TFPI standard tisztasága 5 szerint állítjuk be, hogy megfeleljen az ekvivalens TFPI-koncentrációnak egy 100% tiszta standardra. Például ha a standard egy ala-TFPI készítmény, amely 97%-ban tiszta biokémiailag (azaz 3 tömeg%-ban tartalmaz biológiai aktivitás nélküli TFPI molekuláris for10 mákat), ezt követõen a standard egyes hígításainak koncentrációja meg van szorozva 0,97-dal, hogy megadja az aktuális TFPL-koncentrációt. Tehát egy TFPI standard, amely 1,0 mg/ml, a 97%-ban tiszta készítmény ml¹enkénti aktuális tömege alapján ekvivalens 15 lesz, és ennek megfelelõen lesz kezelve 1,0×0,97 vagy 0,97 mg/ml koncentrációval. A TFPI-hatásosság egyéb mértékei a szepszis kezelése során, valamint számos egyéb indikációban szintén lehetséges, ideértve az olyan méréseket, mint a 28 napos minden ok általi mor20 talitási arány csökkenése és egyes többszörös szervi mûködészavar (’multiple organ dysfunction’, MOD) értékek javulásában a placebóhoz képest.

25 Egyéb anyagok és módszerek A kiszerelés-pufferoldatot a Chiron Tech Service állította elõ. Tíz köbcentiméteres I¹es típusú kémcsõ üvegedényt és Daikyo Gummi laminált, nem szilikonozott dugót szereztünk be a következõ vizsgálatokhoz. A TFPI vagy TFPI-változat edényekbeli oldott oxigénszintet Nova BioProfile 200 készülékkel határoztuk meg. A látszólagos elsõrendû sebességi állandó megbecsülését KaleidaGraph® (Synergy Software, Reading Pennsylvania) szoftverprogram alkalmazásával határoztuk meg a TFPI-oxidációra. 1. példa Protrombinidõ-vizsgálatok Megfelelõ protrombinidõ-vizsgálatokat ismertet az 5,888,968 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és a WO 96/40784 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés. Röviden, a protrombinidõ meghatározható koagulométer alkalmazásával (például Coag-A-Mate MTX II, gyártó: Organon Teknika). Egy megfelelõ vizsgálati puffer a következõ: 100 mM NaCl, 50 mM Tris a pH=7,5 értékre állítva, amely 1 mg/ml borjúszérum-albumint tartalmaz. További szükséges reagensek a normális humán plazma (például „Verify 1”, Organon Teknika), tromboplasztin reagens (például „Simplastin Excel”, Organon Teknika) és TFPI standard oldat [például 20 mg 100%¹os tiszta alaTFPI (vagy ekvivalense)] egy ml vizsgálati pufferre. Egy standard görbét állítunk elõ a TFPI standard oldat hígítási sora koagulációs idejének elemzésével, amely hígítási sor 1–5 mg/ml végkoncentrációkig tartott. Az alvadási idõ meghatározására a mintát vagy TFPI standardot elõször a vizsgálati pufferbe hígítottuk. Ezt követõen normális humán plazmát adtunk hozzá. Az alvadási reakciót a tromboplasztin reagens hozzáadá-

2

30

35

40

45

50

55

60 11

2. példa Az L¹arginin-koncentráció hatása különbözõ készítményekben az ala-TFPI stabilitásra 0,15 mg/ml ala-TFPI végkoncentrációjú Ala-TFPI készítményeket (pH=5,5) állítottunk elõ 0,6 mg/ml törzsoldatokból, amelyeken puffercserét végeztünk dialízissel, elemeztük õket az eredményül kapott ala-TFPI koncentrációkra UV/Vis spektroszkópia alkalmazásával, és 0,15 mg/ml kiindulási célkoncentrációra hígítottuk õket citromsavpuffer alkalmazásával, nátrium-citrát hozzáadásával vagy anélkül. A nátrium-citrát hozzáadását csak azon minták esetében alkalmaztuk, ahol az L¹arginin szolubilizálószer L¹arginin HCl formában volt jelen, miközben önmagában citromsavat alkalmaztunk az L¹arginin-bázist tartalmazó készítményekhez. Ezeket az oldatokat ezt követõen részekre osztottuk (egyenként 1 ml) 3 köbcentiméteres üvegedényekbe a stabilitástárolásra. Elég üvegedényt tettünk félre a kiindulási idõpont koncentráció mérésekhez. A maradék üvegedényt 50 °C¹os inkubátorba helyeztük gyorsított stabilitásvizsgálatra. A szolubilizálószer- és pufferkoncentrációk a négy mintakészítményben, amelyekben 0,15 mg/ml ala-TFPI volt, pH=5,5 értéken, van felsorolva az alábbiakban: 1. 20–150 mM L¹arginin HCl szolubilizálószer és 10 mM citromsav/nátrium-citrát puffer; 2. 20–150 mM L¹arginin-bázis szolubilizálószer pH=5,5¹re titrálva citromsavval; 3. 100–300 mM L¹arginin HCl szolubilizálószer és 10 mM citromsav/nátrium-citrát puffer; és 4. 100–300 mM L¹arginin-bázis szolubilizálószer pH=5,5¹re titrálva citromsavval. A 3., 7., 14. és 30. napokon az egyes edények tartalmát 1,7 ml¹es mikrocentrifugacsõbe helyeztük, és ezután 10 000 fordulat/perc sebességgel körülbelül 2 percig centrifugáltuk. A centrifugálást követõen az oldható fehérje a mintákban el lett választva az aggre-

1

HU 005 921 T2

gált/kicsapott fehérjétõl. Az oldható fehérje mennyiségét az IEX¹HPLC eljárás [Chen és munkatársai (1999) J. Pharm. Sci. 88 (9): 881–888] alkalmazásával határoztuk meg. A koncentrációadat a tárolási idõ függvényében ezt követõen elsõrendû exponenciális bomlási modell görbére lett illesztve (Y=Y0e–kt) a tárolás során tapasztalt féléletidõ kiszámolására a visszamaradó oldható fehérjére a KaleidaGraph® grafikus szoftver alkalmazásával. A tárolás során tapasztalt féléletidõ (t1/2) értékeket az ala-TFPI kiszerelésekre az L¹arginin-koncentráció függvényében ábrázoljuk az 1. ábrán. Ezek az adatok növekedést mutatnak az ala-TFPI féléletidõre a tárolás során a növekvõ L¹arginin-koncentrációval. Az L¹arginin szolubilizálószert önmagában alkalmazva a készítmények szignifikáns féléletidõ-növekedést mutatnak a tárolás során azon készítményekhez képest, ahol kevés vagy semennyi szolubilizálószer nem volt hozzáadva.

nyek esetén az elérhetõ detektálási eljárások alapján. Az 1. táblázatban mutatott eredmények is azt mutatják, hogy a MetSO formák kialakulása növekszik a hõmérséklettel. 5

1. táblázat A hõmérséklet hatása az Ala-TFPI oxidációra Hõmérséklet

10

15

20 3. példa Ala-TFPI kiszerelések lebomlási kinetikái Az ala-TFPI egyik fõ lebomlási útvonala 2–8 °C¹os tárolás során a metionin aminosavak oxidációja. A metionin oxidatív formák elválaszthatóak a fõcsúcs formáktól korábban eluálódó formákként fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) eljárással. A 6. ábra egy RP¹HPLC kromatogram egy ala-TFPI mintára, ami az oxidált formák elválasztását mutatja be. Az A csúcs számos MetSO formát tartalmaz, a C csúcs egyetlen MetSO formát, a D csúcs norvalinszubsztituált ala-TFPI¹t tartalmazó anyagot, az E és F csúcsok acetilezett és/vagy karbamilezett ala-TFPI formát tartalmaznak. Az A és C csúcs formáit különállóan integráltuk. Az összes többi formát, ideértve a fõcsúcsot és a D, E és F csúcsokat összekapcsoltuk, mint fõcsúcs formák. A 30 °C¹os lebomlási kinetika megértéséhez 2 ml ala-TFPI mintákat állítottunk elõ a 2. példa szerint, amelyek mindegyike 0,15 mg/ml TFPI¹t, 20 mM citromsav/nátrium-citrát puffert és 300 mM L¹arginint tartalmazott. Ezeket a mintákat 10 köbcentiméteres üvegedényekbe töltöttük (egyenként 2 ml minta) és 30 °C¹on inkubáltuk. Az aggregáció/kicsapódás következtében történõ oldható fehérjevesztést vizsgáltuk elõször, mivel ez a jelenség a HPLC alapján a teljes csúcsterület csökkenését eredményezte volna. 8 hét, 30 °C¹os tárolás elteltével a stabilitási minták 2–5% csökkenést mutattak a teljes csúcs alatti területre, mind az IEX¹HPLC, mind az RP¹HPLC esetében, amely azt jelzi, hogy viszonylag kevés alaTFPI aggregáció/kicsapódás következett a fenti kiszerelés alkalmazásakor. A metioninoxidáció révén megvalósuló lebomlást RP¹HPLC fõcsúcs formák, az A csúcs formák és a C csúcs formák a 30 °C¹os tárolási idõ függvényenkénti ábrázolásával határoztuk meg. A fõcsúcs formák csökkenését kísérte a C csúcs formák és az A csúcs formák növekedése. Körülbelül 11% és 9% oxidált forma jött létre rendre egyetlen MetSO és többszörös MetSO formaként 8 hetes tárolást követõen. Ez azt sugallja, hogy a metioninoxidáció egy jelentõs lebomlási útvonal standard tárolási körülmé-

2

25

30

35

40

45

50

55

60 12

Ala-TFPI MetSO csúcsterület (C csúcs, [Peak C]) RP¹HPLC-vel (%) kiindulási anyag

4 hét elteltével

40 °C

6,8

23,7

30 °C

6,8

10,4

2–8 °C

6,8

7,0

4. példa Az oldott oxigén hatása az ala-TFPI stabilitásra A 3. példa szerinti készítményeket tartalmazó mintákat állítottunk elõ. Ezt követõen változtattuk az oldott oxigén szintjét az üvegedény fejterének nitrogén/levegõ kiszorító keverékkel történõ öblítésével egy fermentorbeállítás segítségével. Minden egyes mintát pH=5,5 értékre puffereztünk. A kiszorító gáz fejtér és folyadék közötti ekvilibrálásának segítésére az edényeket 200 fordulat/perc sebességgel kevertük egy órát az átöblítés során. Az edényeket ezt követõen 30 °C¹on tartottuk, és ala-TFPI mintákat vettünk belõlük a meghatározott idõpontokban a stabilitásvizsgálatokhoz. Az egyes edényekbeli oldott oxigénszintet ezt követõen újra megmértük a stabilitásvizsgálat idõpontjaiban. Egy kezdeti kísérleti vizsgálatban ala-TFPI edényeket állítottunk elõ, amelyeknek az oxigénszintje megfelelt 0%, 20%, 100% és 200% levegõtelítettségnek (21% oxigéntartalmat feltételezve a 100%¹os telítettség esetére). A 30 °C¹os stabilitásértékelés eredményeit a 2. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy az ala-TFPI oxidáció lényegében gátolt volt, ha az oxigénszint közel 0% levegõtelítettségre volt csökkentve, ami azt jelenti, hogy a folyadék feletti légkör lényegében tiszta nitrogénkiszorító gáz volt. Az oldott oxigén 200%¹os levegõtelítettségrõl 20%-osra csökkentésébõl eredõ stabilitásjavulás ezzel szemben viszonylag kicsi volt. Egy második vizsgálatot hajtottunk végre ezt követõen, hogy specifikusabban értékeljük az ala-TFPI minták stabilitási teljesítményét, amely mintákban az oldott oxigén 0%–12% levegõtelítettségû volt. Lényeges hatást találtunk ebben a tartományban. Az ala-TFPI 30 °C¹os tárolása során tapasztalt féléletidõ és az oldott oxigénszint közötti kapcsolatot a 3. ábrán mutatjuk be. Drámai javulást értünk el az ala-TFPI stabilitásban, ha az oxigénszint a mintában 5% levegõtelítettség alá volt csökkentve (körülbelül 1% oxigéntartalom). Az oldott oxigén szintjét szintén mértük az egyedi mintaedényekben az ala-TFPI koncentráció elemzéseknek megfelelõ idõpontokban, és nem tapasztaltunk szignifikáns változást az edényekben az oldott oxigénszintbe. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az olyan kiszorító

1

HU 005 921 T2

gázok, mint a nitrogén, alkalmazása elégséges mennyiségû oxigén kiszorítására drámaian javíthatja az ala-TFPI tárolási stabilitását, ha az oldott oxigénkoncentráció elég alacsony szintre van csökkentve. Tehát kiszorító gázok, mint például a nitrogén, tekinthetõek antioxidánsoknak, mivel gátolják az ala-TFPI oxidációt. 5. példa Fém kelálószerek hatása az ala-TFPI oxidációra 10 mg/ml¹es ala-TFPI törzsoldatot hígítottunk 0,15 mg/ml¹re pufferrel, amely EDTA és DTPA fémkelátorokat tartalmazott vagy 1 mM vagy 4 mM koncentrációban. Ezek a készítmények tartalmaztak továbbá 20 mM citromsav/nátrium-citrátot és 300 mM L¹arginint szolubilizálószerként. A hígított ala-TFPI oldatokat 10 köbcentiméteres üvegedényekbe töltöttük (egyenként 2 ml minta), és vagy 2–8 °C, vagy 30 °C hõmérsékleten tároltuk stabilitási vizsgálatokhoz. A 4. ábrán RP¹HPLC analízis alkalmazásával meghatározott 30 °C tárolási hõmérsékleten megmaradó fõ csúcsterület stabilitási görbéket mutatunk be. A tárolás során tapasztalt féléletidõ-adatot, amelyet ebbõl a vizsgálatból kaptunk a 2–8 °C és a 30 °C körülményekre, az alábbi 2. táblázatban adtuk meg. A fémkelátorok által stabilizált ala-TFPI jelenléte koncentrációfüggõ módon azt sugallja, hogy az ala-TFPI metionin aminosav oxidációját katalizálják az oldatban lévõ fémionok. Az aktuális mechanizmustól függetlenül a fémkelátorok az ala-TFPI oxidáció gátlószereként szolgálnak, és ezért hatásosak, mint antioxidánsok. 6. példa A szabad metionin aminosav hatása az ala-TFPI oxidációra 10 mg/ml¹es ala-TFPI törzsoldatot hígítottunk 0,15 mg/ml¹re metionint tartalmazó pufferrel. Ezek a készítmények tartalmaztak továbbá 20 mM citromsav/nátrium-citrátot és 300 mM L¹arginint szolubilizálószerként. A hígított ala-TFPI oldatokat 10 köbcentiméteres üvegedényekbe töltöttük (egyenként 2 ml minta), és/vagy 2–8 °C, vagy 30 °C hõmérsékleten tároltuk stabilitási vizsgálatokhoz. Az 5. ábrán RP¹HPLC analízis alkalmazásával meghatározott 30 °C tárolási hõmérsékleten megmaradó fõ csúcsterület stabilitási görbéket mutatunk be. A tárolás során tapasztalt féléletidõ-adatot, amelyet ebbõl a vizsgálatból kaptunk a 2–8 °C és a 30 °C körülményekre, az alábbi 2. táblázatban adtuk meg. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ala-TFPI metionin aminosav oxidáció hatásosan gátolt a készítményhez történõ 2–10 mM metionin-hozzáadással. Valójában a 2–8 °C¹os tárolási hõmérsékleten nem is detektáltunk oxidatíve ala-TFPI lebomlást 2–10 mM metionin jelenlétében 6 hónapos tárolást követõen. Az L¹arginin szolubilizálószert tartalmazó ala-TFPI készítmények tovább javultak egy antioxidáns alkalmazásával, ez esetben az oxigénmegkötõ metionin alkalmazásával. Anélkül hogy bármilyen elmélet korlátozna, azt gondoljuk, hogy a szabad metionin gátolja az ala-TFPI oxidációt

5

10

15

20

25

30

2

„önfeláldozó” metionin biztosításával, hogy a fehérjében kötött metionin aminosavak kisebb valószínûséggel lesznek érintettek. A metioninoxidációt számos tényezõ okozhatja, amelyek közé tartozik a fémionok jelenléte, oldott oxigén és és peroxid. Számos antioxidánst azonosítottak fehérjékben lévõ metionin oxidációjának gátlására, mint például kelálószerek, oxigénmegkötõk, redukálószerek és kiszorító gázok. A kelálószerek fémionokhoz kötõdnek, amelyek oxidatív reakciókat katalizálnak. Az oxigénmegkötõk oxigénnel reagálnak elsõdleges oxidációval, és így védik a fehérjét az oxidáció forrásának eltávolításával. A redukálószerek enyhítik az oxidálószerek fehérjeoxidációra kifejtett hatását. A kiszorító gázok csökkentik a fejtér parciális oxigénnyomását, és ezáltal az oldott oxigénkoncentrációt. A fém kelálószerek hatásossága, mint amilyeneket a 4. példában vizsgáltunk, és az oxigénmegkötõ metionin hatása az ala-TFPI oxidációra a 2. táblázatban van összehasonlítva. A kontrollmintához képest (a 3. példában megadott kiszerelés), amely 0,15 mg/ml alaTFPI¹t, 20 mM citromsav/nátrium-citrát puffert és 300 mM L¹arginint tartalmazott, az összes antioxidáns növelte az ala-TFPI tárolás során tapasztalt féléletidejét. Az összes értékelt állapot között a 10 mM metionin hozzáadása az ala-TFPI kiszereléshez különösen hatásosnak bizonyult az ala-TFPI fehérjeoxidáció elleni stabilizálásában. 2. táblázat Antioxidánsok hatásainak összehasonlítása az ala-TFPI stabilitásra Antioxidáns

Féléletidõ 2–8 °C¹os tárolás során (hónap)

35

Féléletidõ 2–8 °C¹os tárolás során (hónap)

fém kelálószerek (4. példa)

40

1 mM EDTA

63

25

4 mM EDTA

157

28

1 mM DTPA

52

11

160

23

4 mM DTPA

oxigénmegkötõk (5. példa)

45

2 mM metionin 5 mM metionin 10 mM metionin

nem detektáltunk lebomlást hat hónapos tárolás során

23 24 39

kontroll kiszerelés

50

20 mM citrát, 300 mM arginin, pH=5,5

36

5,3

7. példa Az ala-TFPI fehérjekoncentráció hatása az alaTFPI oxidációra Vizsgáltuk az ala-TFPI koncentráció hatását az alaTFPI oxidációra 0,15 mg/ml–10 mg/ml ala-TFPI koncentrációkra. A stabilitásmintákat egy 10 mg/ml ala60 TFPI törzskészítmény hígításával állítottuk elõ 3, 1, 55

13

1

HU 005 921 T2

0,6, 0,3 és 0,15 mg/ml koncentrációkra a 3. példában alkalmazott 20 mM citromsav/nátrium-citrát pufferrel. A minták tartalmaztak 300 mM L¹arginint is. Ezt követõen nem hígított és hígított törzsmintákat töltöttünk 10 köbcentiméteres üvegedényekbe (egyenként 2 ml minta), stopperrel mértük, és vagy 2–8 °C¹on, vagy 30 °C¹on tároltuk a stabilitás meghatározásához. Az RP¹HPLC maradó fõcsúcsának stabilitási görbéi, mind a 30 °C gyorsított hõmérsékletû feltételek mellett, mind a 2–8 °C tényleges tárolási feltételek ese-

2

tén azt mutatják, hogy az ala-TFPI féléletideje a tárolás során erõsen függ fordított kapcsolattal a fehérjekoncentrációtól. Ezen stabilitásgörbékhez tartozó féléletidõket soroltuk fel a 3. táblázatban. Az oxidáció sebes5 sége növekszik alacsonyabb fehérjekoncentrációk esetén. Anélkül hogy bármilyen elmélettel korlátoznánk magunkat, úgy véljük, hogy lehetséges, hogy bármi is legyen a sebességnövekedés, azt okozhatja az oldatban lévõ oxidáns-fehérje molekulák arányának növeke10 dése.

3. táblázat RP-HPLC maradó fõcsúcsának tárolás során tapasztalt féléletideje 3. fázisú TFPI esetén különbözõ koncentrációkban a tárolást követõen vagy 30 °C¹on, vagy 2–8 °C¹on Tárolási hõmérséklet

T1/2 (hónap) a tárolás során a következõ fehérjekoncentrációk esetén 10 (mg/ml)

3 (mg/ml)

30 °C

22

28

2–8 °C

195

157

1 (mg/ml)

9,3 98

8. példa Túlélési vizsgálatok Rágcsáló vakbél elkötés és csapolás vizsgálatot végeztünk a frissen elkészített klinikai fokozatú rekombináns ala-TFPI (rTFPI) (TFPI 92) és részlegesen deamidált és oxidált klinikai szintû anyag (TFPI 78) összehasonlítására. Ez a modell polimikrobiális intraperitoneális és szisztémás fertõzést vált ki közvetlen fekális fertõzéssel és vakbélnekrózissal, ami jól utánozza a humán hasüregi szepszist. Opal és munkatársai, Critical Care Medicine 29, 13–18, 2001. Mindkét TFPI készítményt a 60/494,546 sorozatszámú 2003. augusztus 13¹án benyújtott, 60/509,277 sorozatszámú 2003. október 8¹án benyújtott és 60/512,199 sorozatszámú 2003. október 20¹án benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben ismertetettek szerint állítottuk elõ. Ezek a szabadalmi bejelentések hivatkozásként teljes terjedelmükben be vannak építve jelen bejelentésbe. Vagy rTFPI 78¹at, rTFPI 92¹t vagy diluens kontrollt adtunk vak módon 48 óra alatt (SQ q12 óra×négy dózis). A mûtéti eljárást megelõzõen és azt követõen 48 órával vért vettünk a kvantitatív bakterémia¹, endotoxin- és citokin- (tumor-

25

30

35

40

45

0,6 (mg/ml)

8,5 85

0,3 (mg/ml)

6,4 59

0,15 (mg/ml)

5,6 44

nekrózisfaktor-alfa és interleukin–6) szintek meghatározására. Az állatokat naponta megfigyeltük, és regisztráltuk az elhullást, amikor megtörtént. Minden állatot alávetettünk szervsérülés hisztológiai bizonyítékának nekroszkópiás értékelésének és kvantitatív bakteriológiának a kísérleti idõszak végén. A Kaplan–Meier túlélési görbéket a 7. ábrán mutattuk be. Szignifikáns túlélési esélyük volt azoknak az egereknek, akik frissen elkészített rTFPI¹t kaptak a részlegesen oxidált, deamidált rTFPL formához képest. Mindkét rTFPI csoport tovább élt, mint azok az egerek, amelyek diluenst kaptak a kontrollcsoportban. Amint az várható, a mûoperált egerek (sebészi beavatkozás a vakbél azonosítására, de nincs elkötés és csapolás) túlélték a hétnapos vizsgálati idõszakot. Nem volt szignifikáns különbség a bakterémia¹, endotoxémia- vagy citokintermelés másodlagos végpontjaiban a két rTFPIkezelt csoport esetén. Ez a vizsgálat azt igazolja, hogy a TFPI, úgy tûnik, hogy túlélési elõnyt ajánl egy olyan mechanizmus révén, amelyet nem magyaráz a bakteria, endotoxin vagy citokin vérbeli szintje. Deamidált, oxidizált TFPI kevesebb védelmet nyújtott, mint a frissen elkészített TFPI.

Szekvencialista <110> Chen, Bao¹Lu <110> Huang, Chin¹Yi <120> Stabilized Compositions Comprising Tissue Factor Pathway Inhibitor Protein or Tissue Pactor Pathway Inhibitor Variant Proteins <130> 12441.00054 <150> US 60/438,519 <151> 2003–01–08

14

HU 005 921 T2

<150> US 60/474,577 <151> 2003–08–13 <150> US 60/509,260 <151> 2003–10–08 <150> US 60/512,090 <151> 2003–10–20 <160> 1 <170> SeqWin99, version 1.02 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30 Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140 Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys 165 170 175 Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185 190 Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn 195 200 205

15

1

HU 005 921 T2

2

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly 210 215 220 Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225 230 235 240 Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys 245 250 255 Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe 260 265 270 Val Lys Asn Met 275 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Vizes készítmény, amely tartalmaz: körülbelül 0,05–körülbelül 15 mg/ml TFPI¹t vagy TFPIváltozatot; körülbelül 50–körülbelül 600 mM arginint vagy analógját; és körülbelül 2 mM–körülbelül 10 mM metionint; ahol a vizes készítmény pH¹értéke körülbelül 4–körülbelül 8. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely TFPIváltozatot tartalmaz, ahol a TFPI-változat körülbelül 70% vagy ennél nagyobb mértékben homológ a TFPIvel (SEQ ID NO: 1). 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, ahol a TFPIváltozat ala-TFPI. 4. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, ahol az arginin a következõk alkotta csoportból választott formában van: sósav só, L¹arginin és szabad bázis. 5. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz körülbelül 100 mM–körülbelül 400 mM arginint vagy analógját. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amely körülbelül 300 mM arginint tartalmaz. 7. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amelynek a százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb, és a százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45% vagy nagyobb. 8. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, ahol a metionin L¹metionin. 9. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amelynek a pH¹értéke körülbelül 5–körülbelül 6,5. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, amelynek a pH¹értéke körülbelül 5,5. 11. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amelynek az ozmolaritása körülbelül 240 mOsmol/L–körülbelül 600 mOsmol/L. 12. A 11. igénypont szerinti készítmény, amelynek az ozmolaritása körülbelül 290 mOsmol/L. 13. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amelynek a tárolás során tapasztalt féléletideje körülbelül 1–körülbelül 24 hónap körülbelül 30 °C hõmérsékleten.

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

14. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá a következõk alkotta csoportból választott puffert: (i) a só formájától lényegében mentes sav; (ii) sav a sója formájában; és (iii) sav és só formájának keveréke. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, ahol a puffer savat tartalmaz sója formájában. 16. A 15. igénypont szerinti készítmény, ahol a puffer nátrium-citrátot tartalmaz. 17. A 14. igénypont szerinti készítmény, ahol a puffer a só formájától lényegében mentes sav és a sav a következõk alkotta csoportból választott: citromsav, borostyánkõsav, foszforsav, glutaminsav, maleinsav, almasav, ecetsav, borkõsav és aszparaginsav. 18. A 14. igénypont szerinti készítmény, ahol a puffer sav és sója formájának keverékét tartalmazza, ahol: a sav a következõk alkotta csoportból választott: citromsav, borostyánkõsav, foszforsav, glutaminsav, maleinsav, almasav, ecetsav, borkõsav és aszparaginsav; és a sav sójának formája a következõk alkotta csoportból választott: nátrium, kálium, kalcium és magnézium sója a sav konjugált bázisának. 19. A 18. igénypont szerinti készítmény, ahol a puffer a következõk alkotta csoportból választott: citromsav/nátrium-citrát, borostyánkõsav/nátrium-szukcinát, foszforsav/nátrium-foszfát, glutaminsav/nátrium-glutamát, maleinsav/nátrium-maleát, almasav/nátrium-malát, ecetsav/nátrium-acetát, borkõsav/nátrium-tartarát és aszparaginsav/nátrium-aszpartát. 20. A 14–19. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a puffer koncentrációja körülbelül 5–körülbelül 30 mM. 21. A 20. igénypont szerinti készítmény, ahol a puffer koncentrációja körülbelül 20 mM. 22. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amelynek a százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45%–körülbelül 99%. 23. A 22. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos aggregációs stabilitás körülbelül 60%–körülbelül 80%. 24. A 22. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos aggregációs stabilitás körülbelül 70%–körülbelül 90%.

1

HU 005 921 T2

25. A 24. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos aggregációs stabilitás körülbelül 80%–körülbelül 90%. 26. A 22. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos aggregációs stabilitás körülbelül 45%–körülbelül 70%. 27. Bármely elõzõ igénypont szerinti készítmény, amelynek a százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45%–körülbelül 99%. 28. A 27. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos oxidációs stabilitás körülbelül 60%–körülbelül 80%. 29. A 27. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos oxidációs stabilitás körülbelül 70%–körülbelül 90%. 30. A 29. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos oxidációs stabilitás körülbelül 80%–körülbelül 90%. 31. A 27. igénypont szerinti készítmény, ahol a százalékos oxidációs stabilitás körülbelül 45%–körülbelül 70%. 32. Gyógyászati készítmény, amely tartalmaz: bármely elõzõ igénypont szerinti vizes készítményt; és gyógyászatilag elfogadható excipienst.

2

33. A 32. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelynek a százalékos aggregációs stabilitása körülbelül 45%–körülbelül 99%. 34. A 32. igénypont szerinti gyógyászati készít5 mény, amelynek a százalékos oxidációs stabilitása körülbelül 45%–körülbelül 99%. 35. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely körülbelül 0,15 mg/ml–körülbelül 10 mg/ml TFPI¹t vagy TFPI-változatot tartalmaz. 36. A 35. igénypont szerinti készítmény, amely kö10 rülbelül 0,15 mg/ml TFPI¹t vagy TFPI-változatot tartalmaz. 37. A 35. igénypont szerinti készítmény, amely körülbelül 0,5 mg/ml TFPI¹t vagy TFPI-változatot tartal15 maz. 38. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a metionin 5 mM koncentrációban van jelen. 39. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz: 0,15 mg/ml ala-TFPI¹t; 20 300 mM L¹arginint; 5 mM metionint; és 20 mM citromsav/nátrium-citrátot; ahol a vizes készítmény pH¹értéke 5,5.

17

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

18

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

19

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

20

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

21

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

22

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

23

HU 005 921 T2 Int. Cl.: A61K 38/57

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest