(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000007367T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 007 367

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C12N 15/30

(21) Magyar ügyszám: E 03 292673 (22) A bejelentés napja: 2003. 10. 24. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030292673 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1526178 A1 2005. 04. 27. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1526178 B1 2009. 11. 11.

(51) Int. Cl.:

(72) Feltaláló: Druilhe, Pierre, 75015 Paris (FR)

(73) Jogosult: INSTITUT PASTEUR, 75724 Paris Cedex 15 (FR)

A61K 39/015 A61K 39/395 A61K 48/00 G01N 33/569 C12N 15/63 C07K 14/445 C07K 16/20

(2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)

(74) Képviselõ: dr. Pethõ Árpád, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (54)

MSP-3-szerû géncsalád

(57) Kivonat

HU 007 367 T2

A találmány tárgya a malária fõ kórokozójából, a Plasmodium falciparum-ból izolált, 9 génbõl álló MSP-3szerû géncsalád, melyet az epitópok nagyfokú konzerváltsága jellemez; valamint ilyen epitópokat tartalmazó antigénhatású polipeptidek, és az ezeket tartalmazó, malária elleni immunogén készítmények és vakcinák.

A találmány tárgyai továbbá rekombináns ellenanyagok és részeik, melyek az MSP-3-szerû géncsalád számos termékével keresztreagálnak, valamint eljárások a malária in vitro diagnózisára; valamint az új P. falciparum-antigéneket kódoló nukleotidszekvenciák, és ezek alkalmazása gyógyszerben.

A leírás terjedelme 120 oldal (ezen belül 68 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 007 367 T2

A találmány leírása A jelen találmány malária elleni védelemmel kapcsolatos. Közelebbrõl a szabadalmi bejelentés a már ismert MSP¹3 génnel társult új géncsaládot ír le, mely a kitett epitópok kivételes redundanciáját mutatja, ami arra utal, hogy ezen géncsalád fontos szerepet játszik a parazita immunogenitásában. A géncsalád jellemzése a P. falciparum elleni új immunogén és vakcinakészítmények kifejlesztését teszi lehetõvé. Az emberi maláriáért felelõs paraziták, beleértve különösen a Plasmodium falciparum¹ot, az emberi gazdaszervezetben különbözõ morfológiákat mutatnak, és a fertõzött gazdaszervezetben a lokalizációjuk függvényében különbözõ antigéneket expresszálnak. A paraziták morfológiai és antigénkülönbségei az emberben töltött életciklusuk folyamán legalább négy elkülönülõ fejlõdési stádium meghatározását teszik lehetõvé. A parazita fejlõdésének legelsõ stádiuma emberben a sporozoita formának felel meg, melyet a parazita rovarvektorai juttatnak a véráramba. A második stádium a parazita májba történõ településének, a májsejtek megfertõzésének felel meg, ebben a stádiumban a paraziták májschizontákat képeznek, melyek amikor megérnek (például a P. falciparum esetében a sporozoiták behatolásától számított 6. napon), májmerozoitákat bocsátanak ki sejtszétesés útján. A harmadik stádiumot a vörösvértestek aszexuális formák (merozoiták) általi fertõzése jellemzi, ez az eritrocitastádium a betegség patogén fázisának felel meg. A negyedik stádium a szexuális potenciállal rendelkezõ formák (gametociták) kialakulása, melyek a szúnyogban lesznek extracelluláris szexuális formák, azaz gaméták. A Plasmodium falciparum-malária elleni klinikai immunitás kifejlõdésében az ellenanyagok fontos szerepét mutatták ki több alkalommal is. Számos immunológiai tanulmány utal arra, hogy a citofil alosztályokhoz (IgG1 és IgG3) tartozó emberi ellenanyagok különösen kritikusak a védettség szempontjából. Ez a fajta parazitaellenes immunitás törzstõl független, nem sterilizáló típusú immunitás, mely a parazitának való hosszú kitettség (15–20 év) alatt alakul ki. Általában Afrikában és Pápua Új¹Guineában lehet megfigyelni, de legújabban Délkelet-Ázsiában is dokumentálták (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). Bár az ellenanyagok közvetlenül is képesek hatni a vörösvértestek merozoiták általi inváziójára, az ellenanyag-közvetített parazitakontroll leghatékonyabb in vivo mechanizmusa az endémiás területeken a monociták részvételét igényli (Khusmith és Druilhe 1983); (Lunel és Druilhe 1989). Az ellenanyagfüggõ sejtgátlási vizsgálat [antibody-dependent cellular inhibition (ADCI)] ezen, a monociták és a citofil parazitaspecifikus ellenanyagok közti együttmûködést utánozza, és manapság a legjobb in vitro helyettesítõ markernek tûnik a P. falciparum vérben élõ stádiumai ellen szerzett immunitás megítéléséhez. Eddig két molekulát azonosítottak az ADCI-ben hatékony emberi ellenanyagok célpontjaként, nevezetesen a 48 kDa molekulatömegû 3. számú merozoita felszíni fehérjét (Merozoite surface-protein 3, a továbbiak-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

ban MSP¹3) – (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun és munkatársai 1994) és a 220 kDa molekulatömegû, glutamátban gazdag fehérjét (a továbbiakban GLURP) – (Theisen, Soe és munkatársai 1998). Kimutatták, hogy a GLURP és az MSP¹3 képesek in vivo gátolni a paraziták növekedését P. falciparum¹ra humanizált SCID egerekbe történt passzív transzfer után (Badell, Oeuvray és munkatársai 2000). Szintén az MSP-3-elleni emberi ellenanyagok klinikai védettséggel való kapcsolatára utal számos immunológiai-járványtani tanulmány, melyek megmutatják, hogy az MSP-3¹ra specifikus citofil (IgG1 és lgG3) ellenanyagok szignifikánsan összefüggenek a maláriás rohamok alacsonyabb kockázatával (Roussillon 1999). Ezen tanulmányok megmutatták továbbá, hogy a citofil IgG3 ellenanyagok fontos szerepet játszanak a malária elleni védettségben, ily módon szolgáltatva epidemiológiai támogatást azon elméletnek, miszerint az MSP¹3 elleni ellenanyagok in vivo aktívan korlátozhatják a paraziták sokszorozódását az Fcg II receptorokat hordozó sejtek együttmûködése révén (Bouharoun-Tayoun, Oeuvray és munkatársai 1995). Ezen receptorok magasabb affinitást mutatnak az IgG3 alosztály felé, mint az IgG1 alosztály irányában (Pleass és Woof 2001). Az ezen emberi IgG ellenanyagok által felismert fontosabb B¹sejt-epitópokat az MSP-3212–257 régió konzervatív szekvenciáira lokalizálták (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun és munkatársai 1994; Theisen, Soe és munkatársai 2000; Theisen, Dodoo és munkatársai 2001). Nukleotidszekvenálás segítségével kimutatták, hogy ezen fontos epitópok nagymértékben konzerváltak számos laboratóriumi P. falciparum törzs között, valamint Afrikából és Ázsiából származó terepizolátumok között is (Huber, Felger és munkatársai 1997); (McColl és Anders 1997). Trucco és munkatársai (2001) közölték az MSP6 (jelenlegi neve MSP3.2) és az MSP3 (jelenlegi neve MSP3.1) fehérjék aminosavszekvenciáit és azok párosítását. Oeuvray és munkatársai (1994) hozták nyilvánosságra az MSP3 fehérje antigénepitópjának azonosítását, és leírták a nukleotid- és aminosavsorrendjét. Ezen antigénepitópot a MoAb 2–45 ellenanyag segítségével azonosították, és egy szintetikus MSP¹3b peptid ellen termelt ellenanyaggal történõ vizsgálattal tesztelték. A Q8IJ53 elérési szám egy 424 aminosavból álló hipotetikus fehérjét ír le, melyet elméleti úton expresszáltak egy, a Plasmodium falciparum genomszekvenciájából in silico elõre jelzett nyitott leolvasási keretbõl. A feltalálók az utóbbi idõben egy 9 P. falciparum génbõl álló sorozatot jellemeztek, melyek mindegyike a 10. kromoszóma 3’¹végén helyezkedik el, és amelyek fehérjéket és azon belül epitópokat kódolnak, melyek mind a természetben, maláriának kitett egyénekben elõforduló ellenanyagokhoz kötõdnek, és a vér monocitáival együttmûködve a P. falciparum vörösvértest-stádiumának pusztítását közvetítik, és amelyek a különféle P. falciparum izolátumok között szokatlan mértékû szekvenciakonzerválást mutatnak. A jelen szabadalmi bejelentés egy géncsaládot ismertet, melyet MSP-3-szerû géncsaládnak nevez, mely gének termékei közös szerkezeti és immunológiai

1

HU 007 367 T2

jellemzõkkel rendelkeznek, valamint ezen gének némelyikét és a megfelelõ fehérjéket, egyenként tekintve. Az igénypontokban az említett új fehérjékbõl származó epitópokat tartalmazó antigénhatású polipeptidek kerülnek nyilvánosságra, valamint antigénhatású polipeptid-készítmények, melyek legalább két ilyen epitópot tartalmaznak, és szintén tárgyai a találmánynak. A találmány más fontos megvalósításai malária elleni immunogén készítmények és vakcinák, melyek immunogénként egy elõbb említett polipeptidet vagy polipeptidkészítményt tartalmaznak. Rekombináns ellenanyagok és részeik, melyek az MSP-3-szerû géncsalád számos termékével keresztreagálnak, szintén tárgyai a találmánynak, akár önmagukban, akár egy passzív immunterápiára alkalmazott orvosság részeként, vagy a malária in vitro diagnózisára alkalmazott kit részeként. A szabadalmi bejelentés eljárásokat ismertet valamely egyénben a malária in vitro diagnózisára, akár egy antigénhatású polipeptid alkalmazásával, vagy valamely, az elõzõekben definiált ellenanyag alkalmazásával, valamint kiteket, melyek legalább részben tartalmazzák az ezen eljárások végrehajtásához szükséges reagenseket (polipeptidek, ellenanyagok…). Az új P. falciparum-antigének legalább egyikét kódoló nukleotidszekvenciák, és ezek alkalmazása valamely P. falciparum elleni gyógyszerben vagy nukleinsavvakcinában szintén tárgyai a találmánynak. A jelen szövegben egy sor szakkifejezés kerül alkalmazásra, melyeket a következõ definícióknak megfelelõen kell érteni: A következõkben a „gén” kifejezés szinonim akár egy kódolószekvenciát tartalmazó „természetben elõ-

5

10

15

20

25

30

2

forduló szekvencia” kifejezéssel, akár valamely kódolószekvenciát tartalmazó rekombináns vagy szintetikus szekvenciával. A jelen szövegben egy „gén” megengedõ módon tartalmazhat szabályozóelemeket, ellentétben ezen szónak a tudományos szakirodalomban gyakran elfogadott használatától. Ennek megfelelõen a jelen találmány szerinti gén bármely nukleotidszekvencia, mely a Plasmodium természetben elõforduló szekvenciájának nyitott leolvasási keretét tartalmazza, vagy amely emellett a természetben elõforduló szekvencia expressziójához szükséges szabályozószekvenciákat is tartalmazza. A jelen definíciónak megfelelõen a gén valamely izolált nukleinsav-molekula, azaz olyan nukleotidszekvencia, mely nem a saját természetes környezetében található. A jelen szövegben a „géncsalád” kifejezés a tudományos szakirodalomban megszokott jelentéssel bír, azaz számos gén csoportját jelöli, mely gének számos közös (szerkezeti vagy funkcionális) tulajdonsággal vagy jellemzõvel bírnak. A jelen szabadalmi bejelentés szerint az „MSP-3c/d¹szerû motívum” egy 20 aminosavból álló aminosavszekvencia, mely a SEQ ID NO 25–30 bármelyikével megegyezik, vagy amely ezen szekvenciákból legalább kettõnek a pozíciókat megtartó összevágásával nyerhetõ. Például a SEQ ID NO 25¹bõl az 1–5. aminosavakat tartalmazó szekvencia, melyet a SEQ ID NO 19¹bõl a 6–12. aminosavak követnek, majd a SEQ ID NO 27¹bõl a 13–20. aminosavak, MSP-3-c/d¹szerû motívumnak számít. Más szavakkal kifejezve egy „MSP-3c/d¹szerû motívum” valamely, 20 aminosavból álló szekvencia, ahol az aminosavakat a következõkbõl választjuk:

1. táblázat Aminosavpozíció

1

2

3

Aminosav

L

E

L

S

H S

L

Q

4

5

6

7

8

I

K

V

N Y

9

10

11

L

T

I

S

V

P

S

K

D

L

W S

R

P

12

13

14

E

E

D

I

K

N

N Q

S

N

I

15

16

17

18

19

20

I

K

H

N

E

D

V

D

E

S

D

Q

P A

Ezen aminosavak közül számos hasonló töltéssel bír, és nem valószínû, hogy megváltoztatná a molekula általános szerkezetét vagy ellenanyagok általi felismerését, például a valin, izo-leucin, leucin. Bármely, 50 20 aminosavból álló aminosavszekvencia, mely a fent jelzett legkonzervatívabb aminosavakat tartalmazza (azaz az 1, 2, 8, 10, 12, 14 és 17–20 pozíciókon lévõket), és ahol a többi aminosavpozíción más aminosav van, mint a fent jelzettek, és amelyet az MSP-3-c/d mo- 55 tívumok vagy a SEQ ID No: 25–30 bármelyike ellen termelt ellenanyag felismer, szintén „MSP-3-c/d¹szerû motívum”-nak minõsül a jelen találmány szerint. Az utóbbi funkcionális tulajdonságot tetszõleges immunoassay segítségével lehet vizsgálni, amint azt a témá- 60 3

ban jártas szakember tudni fogja, vagy ahogyan alább leírásra kerül. A jelen szövegben az „MSP-3-b-szerû motívum” 11–14 aminosavból álló szekvenciát jelöl, mely a SEQ ID NO 17–24 bármelyikével megegyezik, vagy amely ezen szekvenciákból legalább kettõnek a pozíciókat megtartó összevágásával nyerhetõ. Például a SEQ ID NO 17¹bõl az 1–5. aminosavakat tartalmazó szekvencia, melyet a SEQ ID NO 22¹bõl a 6–12. aminosavak követnek, MSP-3-b-szerû motívumnak minõsül. Más szavakkal kifejezve egy „MSP-3-b-szerû motívum” valamely, 11–14 aminosavból álló szekvencia, ahol az aminosavakat a következõkbõl választjuk, ahol a „–” az aminosav hiányát jelöli:

1

HU 007 367 T2

2

2. táblázat Aminosavpozíció

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Aminosav

I

L

E

R

G

W

E

F

G

G

G

V

P

E

Y

F

D

D

A

G

L

I

S

S

A

Y

F

–

–

P

–

L

S

A

G

A

A

L

L

–

–

I

L

I

E

S

S

–

Ezen aminosavak közül számos hasonló töltéssel bír, és nem valószínû, hogy megváltoztatná a molekula általános szerkezetét vagy ellenanyagok általi felisme15 rését, például a valin, izo-leucin, leucin.

A MSP-3-b-szerû motívumok egy csoportja megfelel a SEQ ID No: 17, 18 és 22 szekvenciáinak és ezek kombinációinak, azaz az alábbiakból választott 11 aminosavas szekvenciáknak:

3. táblázat Aminosavpozíció

Aminosav

1

2

3

4

5

6

7

8

9

I

L

G

W

E

F

G

G

G

Y

F

A

Bármely, 11–14 aminosavból álló aminosavszekvencia, mely a fent jelzett legkonzervatívabb aminosavakat tartalmazza (azaz a 3. táblázatban jelzett aminosavak, melyek a 2. táblázat szerinti 1., 2., 5. és 13. pozícióknak felelnek meg), és ahol a többi aminosavpozíción más aminosav van, mint a fent jelzettek, és amelyet az MSP-3¹b motívumok vagy a SEQ ID No: 17–24 bármelyike ellen termelt ellenanyag felismer, szintén „MSP-3-b-szerû motívum”-nak minõsül a jelen találmány szerint. Az utóbbi funkcionális tulajdonságot tetszõleges immunoassay segítségével lehet tesztelni, amint azt a témában jártas szakember tudni fogja, vagy ahogyan alább leírásra kerül. A következõkben idõnként utalás történik egy-egy génre vagy fehérjére, mely „homológja” egy adott génnek vagy fehérjének, melynek a szekvenciája ismertetésre kerül. Ez a szó itt és most különbözõ Plasmodium törzsek (különösen P. falciparum törzsek) között közeli rokonságot mutató szekvenciákat jelöl, azaz a hivatkozott szekvenciával legalább 70%¹os, elõnyösen legalább 90%¹os szekvencia-azonosságot mutató szekvenciákat. A „konzervatív” helyettesítés valamely aminosavszekvenciában valamely aminosavmaradék helyettesítését jelenti egy másikkal, mely hasonló tulajdonságokkal bír hidrofobicitás és/vagy térbeli gátlás tekintetében, miáltal a fehérje harmadlagos szerkezete nem változik számottevõen. Például konzervatív helyettesítésnek minõsül egy guanin helyettesítése egy alaninnal vagy fordítva. A valin, leucin és az izo-leucin szintén olyan aminosavak, melyek konzervatív módon helyettesíthetik egymást. A konzervatív helyettesítés más csoportjai korlátozás nélkül a (D, E), (K, R), (N, Q) és (F, W, Y) helyettesítések. Valamely polipeptid egy variánsa, melyet a polipeptid legalább egy aminosavjának konzervatív helyettesítésével nyerhetõ, a polipeptid „konzervatív variánsa” megjelölést kapja.

I

25

30

35

40

45

50

55

60 4

10

11

V

P

A

További definíciók is találhatók az alábbi szövegben, szükség szerint. A feltalálók a jelen dokumentumban egy 9 génbõl álló csoportot írnak le, mely 9 génbõl 6 még sohasem került leírásra, és amelyek a 10. kromoszóma ugyanazon régiójában csoportosulnak. Ez a kromoszóma valóban tartalmaz 9 nyitott leolvasási keretet egy sorozatban, melyeket nem kódolórégiók választanak el, és 5’–3’ irányban haladva rendre tartalmazza a következõ fehérjéket kódoló géneket: elsõbben a GLURP, majd 1300 bázispárra az MSP¹3 (újabb nevén MSP-3–1), továbbá 7 további gén, melyek jelölése MSP-3–2, MSP3–3, MSP-3–4, MSP-3–5, MSP-3–6, MSP-3–7, MSP3–8. Ezt a szervezõdést az 1. ábra mutatja be. Amellett, hogy ugyanazon kromoszómaszakaszon csoportosulnak, ez a 9 gén egyedülálló tulajdonságokkal bír, melyek azt jelzik, hogy a P. falciparum vérben található fertõzõ stádiumai ellen kiemelt jelentõségûek a vakcinatermelés szempontjából: Kimutatásra került, hogy mind a 9 gén egyidejûleg expresszálódik valamennyi tanulmányozott parazitában, tehát a megfelelõ fehérjék a P. falciparum eritrocitastádiumban észlelhetõk, és mindegyik fehérje a merozoita felszínén található. Ez már korábban kimutatásra került a GLURP, MSP-3–1 és MSP-3–2 (Trucco, Fernandez-Reyes és munkatársai 2001. jelölése szerint „MSP6”) esetében; emellett kimutatásra került a többi esetében is, minden egyes gén N¹terminális régiójából egyedi, keresztreagáló epitópokat nem tartalmazó szekvenciák szintézise révén, amelyeknek megfelelõ ellenanyagok mind a merozoiták felszínén reagálnak. Továbbá a transzkripciójuk is kimutatásra került RT¹PCR útján, mindegyikükre külön-külön specifikus primerekkel. Továbbá a 8 MSP-3-szerû gén ugyanazt a génszervezõdést mutatja, amit az 1. ábra illusztrál, egy kezdeti N¹terminális, 4 aminosavból álló „aláírással” vagy azo-

1

HU 007 367 T2

nosítóval („s” jelzéssel az 1. ábrán), mely mindegyikükben azonos, és azonos a Plasmodium vivax-ban és Plasmodium Knowlesi-ben leírt hasonló MSP-3-homológ fehérjékben is. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgya elsõdlegesen: izolált gének egy családja vagy csoportja, melyek a következõ tulajdonságokkal rendelkeznek: A Plasmodium falciparum 10. kromoszómáján helyezkednek el; nagymértékben konzerváltak a Plasmodium falciparum törzsekben; A Plasmodium falciparum eritrocita-stádiumaiban expresszálódnak; az általuk kódolt fehérjék N¹terminálisa egy NLRN vagy NLRK azonosítóval kezdõdik, és a merozoita felszínén található, ahol a géncsalád legalább 3 génbõl áll. A NLRN vagy NLRK azonosító a leggyakrabban A vagy G aminosavakkal folytatódik a találmány szerinti MSP¹3 géncsalád által kódolt fehérjékben. A géncsalád génjei elõnyösen ugyanazon génszervezõdést mutatják, amint azt az 1. ábra illusztrálja. Az ilyen géncsaládra példa a teljes MSP-3-szerû géncsalád, mely tartalmazza a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 és 15 szekvenciák génjeit. Bármely csoport, mely legalább 3 gént tartalmaz ezen gének közül, szintén géncsaládnak számít. Eltekintve a fent említett N¹terminális azonosítótól, az N¹terminális rész nagymértékben különbözik az egyes géntermékekben, miközben ezzel ellentétesen, a C¹terminális régió szervezõdése azonos minden génben, kivéve kettõt (MSP-3–5 és MSP-3–6), beleértve a „b” epitópszerû hajlatot („b”), a „c/d” epitópszerû régiót („c/d”), a glutaminban gazdag régiót, és a C¹terminális legvégén a leucin-ollószerû struktúrát. A fent leírt géncsaládok közül a találmány szempontjából különösen fontos géncsaládok azok, ahol a gének a következõ további tulajdonságokkal rendelkeznek: az általuk kódolt fehérjék MSP-3-b-szerû motívumot és/vagy egy MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaznak. Az ilyen géncsaládra példa a SEQ ID No 1, 3, 5, 7, 13 és 15 szekvenciák családja, vagy bármely, ezen szekvenciák közül kiválasztott 3 gén által alkotott géncsalád. Mind a 7 fehérje (a GLURP és a 6 homológ MSP-3szerû molekula) kivált ellenanyagválaszt a maláriának kitett egyénekben. Azon géntermékek esetében, melyekre nézve vizsgálatok történtek, különösen a GLURP, MSP-3–1 és MSP-3–2 esetében, a valós körülmények között kiváltott immunválaszok a maláriás rohamok elleni klinikai védettséggel párosulnak. Ez az összefüggés statisztikailag nagymértékben szignifikáns, különösen az IgG3 izotípusba tartozó ellenanyagok esetében, és három helyzetben, Afrikában Dielmóban és Ndiopban, valamint Burmában, Oo¹Do-ban került megerõsítésre. Az alább leírt homológiákkal kapcsolatos okokból rendkívül valószínû, hogy ugyanezen eredmény születik majd a további 5 gén esetében. A GLURP, MSP-3–1 és MSP-3–2 esetében a védettséggel kapcsolatos ellenanyagok által megcélzott

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

régiók az R0 ismétlõdõ régió a GLURP-ben és a C¹terminális nem ismétlõdõ régió az MSP-3–1-ben, valamint az MSP-3–2. Az MSP-3–1-bõl származó különféle peptideket a 2. ábra mutatja. A védettség az MSP-3¹b, c és d régiókkal reagáló ellenanyagokhoz kapcsolódik. Mind a 7 géntermékkel reagáló ellenanyagok hatékonyak a P. falciparum vérben élõ stádiumainak elpusztításában, a monocitafüggõ, ellenanyag-közvetített ADCI mechanizmus által, in vitro körülmények között. Ezen, az 1. példában leírt eredmények azt mutatják, hogy az összes ilyen régió elleni ellenanyagok egyenlõ mértékben hatékonyan érik el a P. falciparum eritrocitastádiumának növekedési gátlását in vitro körülmények között. Az elõnyös géncsaládok továbbá a következõ tulajdonsággal bírnak: a fenti génekkel reagáló ellenanyagok a Plasmodium falciparum vérben élõ stádiumainak elpusztítását közvetítik a monocitafüggõ, ellenanyagközvetített ADCI mechanizmus által, in vitro körülmények között. További két elõnyös megvalósítás szerint a géncsalád emellett a következõ elõnyös tulajdonsággal rendelkezik: a fenti génekkel reagáló ellenanyagok a Plasmodium falciparum növekedését gátolják P. falciparum-mal fertõzött egerekben. A feltalálók azt is kimutatták, hogy szokatlanul magas fokú a szekvenciakonzerváció a 7 gén mindegyikében a különféle P. falciparum-izolátumokat tekintve. Ez már korábban kimutatásra került a GLURP esetében, és az R0 nem ismétlõdõ régió kiválasztásához vezetett, mint ami a leginkább konzervált a különbözõ izolátumok között, bár néhány aminosav helyettesítésre kerül. Ugyanez került kimutatásra az MSP1–3–1 esetében, melynek szekvenciáját 111 izolátum esetében kiemelkedõen konzerváltnak találták az MSP-3¹a, b, c és d peptideket lefedõ régióra nézve, azaz az önkéntesek immunizálására kiválasztott régióra nézve, ahol semmilyen aminosavhelyettesítést, azaz semmilyen aminosavváltozást nem találtak. Ezt újabban megerõsítették az MSP-3–1 C¹terminálisának többi részére és az MSP-3–2, MSP-3–3, MSP-3–4, MSP-3–7 és MSP3–8 teljes C¹terminális konzervatív régiójára nézve (9. és 10. ábra). A géncsalád ezen figyelemre méltó fokú szekvenciakonzerváltsága éles ellentétben áll a többi, újabban tanulmányozott vakcinajelölt viszonylag nagyfokú polimorfizmusával, és nyilvánvalóan fontos szempont, mely erõsíti ezen géncsalád potenciálját a vakcinafejlesztés szempontjából. A fentiek szerinti géncsaládok, melyek a SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 és 15 vagy Plasmodiumban található homológjaik közül kiválasztott legalább 3 génbõl állnak, szintén elõnyös géncsaládok. Egy másik, a jelen szabadalmi bejelentésben nyilvánosságra hozott megvalósítás valamely izolált Plasmodium falciparum gén, mely a SEQ ID No: 5, 7, 13 vagy 15 szekvenciájával rendelkezik, vagy valamely izolált gén, mely a SEQ ID No: 5, 7, 9, 11, 13 vagy 15 szerinti szekvenciával rendelkezõ Plasmodium falciparum gén homológja valamely Plasmodium törzsben.

1

HU 007 367 T2

Ezen gének, melyek nem leírt MSP-3-szerû gének, nagyon hasznosak lehetnek a témában jártas szakember kezében számos kutatási, diagnosztikus és védõoltással kapcsolatos alkalmazásban, az eddig és a továbbiakban leírt okokból. Közelebbrõl rekombináns MSP-3-szerû fehérjék termelésére lehet õket alkalmazni. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgyai a SEQ ID No: 6, 8, 10, 12, 14 és 16 szerinti rekombináns fehérjék, valamint bármely rekombináns fehérje, mely a SEQ ID No: 6, 8, 10, 12, 14 vagy 16 szerinti fehérjével homológ szekvenciával rendelkezik, valamely, a 3D7tõl különbözõ Plasmodium törzsben. Az MSP¹3 géncsalád tagjainak összehasonlító szekvenciaelemzése az epitópok szokatlanul magas fokú konzerváltságát mutatja a géncsalád tagjai között, különösen a biológiailag aktív ellenanyagokkal reagáló epitópok esetében, melyek a védettség szempontjából kritikusak. A szekvenciák összehasonlítását a 11. ábra mutatja be. A feltalálók 2 régiót azonosítottak, melyek a géncsalád tagjaiban nagyon hasonlóak, vagy akár teljesen azonosak, és az MSP-3¹b peptidbõl egy kritikus régiót, az MSP-3¹c és d peptidekbõl egy régiót (melyet az MSP-3¹c és MSP-3¹d peptidek is lefednek) érintenek. A kis különbségeket, melyek a különbözõ gének között igen nagy mértékben konzervált epitópokban megmutatkoznak, a 12. és 13. ábrák foglalják össze. Figyelemre méltó és nagyon jelentõségteljes, hogy a különbözõ géneket tekintve a legkonzerváltabb azon kettõ régió, melyek az ADCI-tesztben in vitro és a SCID egerekben passzív transzfer után (lásd fent) biológiailag aktív ellenanyagok célpontjai. A feltalálók azt is kimutatták, hogy immunológiai keresztreaktivitás áll fenn az MSP¹3 géncsalád különbözõ fehérjéi között, a géncsalád tagjai között fennálló szerkezeti homológia következményeképpen (5. példa). Immunológiai és vakcina-fejlesztési szinten a gyakorlati következmény az, hogy a géncsalád bármelyik tagjával történõ immunizálás ellenanyagokat fog indukálni ugyanarra és az összes többi géntermékre is. Ennek megfelelõen a jelen találmány tárgya egy nagyon különleges többgénes géncsalád-típus, ahol az epitóp-polimorfizmus helyett, ami általában a mai napig leírt többgénes géncsaládok tulajdonsága, a fõ jellemzõ az epitóp-konzerválás, ami deléció, vagy egy adott génben, egy másikban vagy a géncsalád összes tagjában történõ mutáció esetén az antigén-funkciót át tudja venni. Ráadásul az összes gén egy idõben expresszálódik egy adott parazitában. A jelen szabadalmi bejelentés tárgya továbbá egy fehérje, melyet a fent nyilvánosságra hozott gének közül kódol valamelyik. Egy elõnyös megvalósításban a fehérje rekombináns fehérje. Ennek megfelelõen a találmány tárgya továbbá egy antigénhatású polipeptid, mely egy legalább 10, elõnyösen legalább 15 egymást követõ aminosavat tartalmaz valamely, a jelen találmány tárgyát képezõ fehérjébõl. Természetesen az MSP-3–1 vagy MSP3–2 fragmenseire korlátozódó polipeptidek itt nem jönnek számításba.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

A jelen találmány szerint elõnyös polipeptidek az MSP3–3-ból származó olyan polipeptidek, melyek tartalmazzák legalább a SEQ ID NO: 27¹ben megadott MSP-3-c/d¹szerû motívumot. A találmány szerinti antigenikus polipeptid továbbá tartalmaz a SEQ ID No 17–24 szerinti szekvenciákból legalább egy motívumot, és tárgya a találmánynak. A jelen találmány tárgya továbbá egy antigenikus polipeptidkészítmény, mely tartalmaz egy fent definiált MSP3 c/d¹szerû motívumot és legalább egy másik MSP-3-b-szerû motívumot. A „polipeptidkészítmény” polipeptid összetevõket, azaz polipeptideket vagy polipeptidrészeket tartalmazó molekulákat, mint lipopolipeptideket, szilárd hordozóhoz kötött polipeptidekbõl álló konjugátumokat stb. tartalmazó készítményt jelent. A jelen találmány szerinti polipeptidkészítmények lehetnek oldatok, tabletták stb. A találmány szempontjából különösen fontos megvalósítás esetében az antigenikus polipeptidkészítményben található legalább egy másik MSP-3-c/d¹szerû motívum a SEQ ID NO 25, 26, 28, 29 és 30 valamelyike vagy ezek konzervatív variánsaiból van kiválasztva. A találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítmény esetében a legalább két különbözõ MSP-3c/d¹szerû motívumot hordozhatják különálló molekulák (azaz a készítmény tartalmazhat sokféle molekulát, melyek mindegyike csak egyetlen motívumot hordoz); más módon a készítmény minden egyes polipeptid alkotóeleme legalább két motívumot hordoz. A fentiek szerint leírt antigenikus készítmény, mely egyenként legalább két különbözõ MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaz, ily módon tárgya a jelen találmánynak. Ezen molekulák lehetnek komplex molekulák, melyekben legalább két motívum része különálló, egy közös hordozóhoz kapcsolt polipeptideknek; elõnyösen a polipeptidrész egyetlen polipeptid, mely a motívumokat tartalmazza. Fúziós fehérjéket lehet alkalmazni ilyen készítményekben, melyek számos, különbözõ MSP¹3 fehérjékbõl származó részeket tartalmaznak. Tekintettel az epitópok konzervált voltára, a feltalálók megvizsgálták, vajon a GLURP és MSP¹3 elleni citofil ellenanyagok részt vesznek¹e a klinikai malária elleni immunitás kifejlõdésében egy myanmari (ázsiai) népességben, amint azt Afrikában korábban találták, tehát eltérõ emberi és parazitagenetikai háttér mellett. Az alábbi 7. példában ismertetett eredmények megmutatják, hogy az MSP-3–1 és a GLURP konzervatív régiói elleni citofil IgG3 ellenanyagok szintje szignifikánsan korrelált a P. falciparum-malária elleni klinikai védettséggel. Ezzel szemben a GLURP elleni nem citofil IgG4 ellenanyagok szintje a maláriás rohamok számával párhuzamosan nõtt. A legfontosabb, hogy az MSP3–1- és GLURP-specifikus IgG3 ellenanyagok egymást kiegészítõ hatást mutattak a malária elleni védettség szempontjából. Az ezen antigének egyike ellen nem reagáló egyénekben a másik antigénnel szemben következetesen erõs válasz volt megfigyelhetõ és a védettséggel kapcsolatba hozható, ami arra utal, hogy mind az MSP3, mind a GLURP elleni ellenanyagok indukciója fontos lehet a védõ immunitás kifejlõdésében.

1

HU 007 367 T2

A találmány egy másik megvalósítása szerint az antigenikus polipeptidkészítmény még egy további antigenikus polipeptidmolekulát is tartalmaz, mely legalább 10 egymást követõ aminosavat tartalmaz a GLURP R0 régiójából. Amint azt fentebb említettük, a találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítmény tartalmazhat korlátozott számú molekulát, melyek mindegyike többféle epitópot hordoz, vagy sokféle molekulát, melyek mindegyike korlátozott számú epitópot hordoz. Egy különösen fontos megvalósítás esetében az antigenikus polipeptidkészítmény legalább 2, elõnyösen legalább 3, legfeljebb 9, a találmány szerinti gének által kódolt polipeptidet tartalmaz. Az utóbbi lehetõségnek megfelelõ antigenikus polipeptidkészítményre példa egy mixotóp, mely sokféle szintetikus peptidet tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–G–X9–X10– X11–X12 (SEQ ID No31), ahol: X1=I, Y vagy semmi; X2=L, F vagy semmi; X3=E, D, P vagy semmi; X4=R, D vagy semmi; X5=G, A, L vagy semmi; X6=W, G, S, I vagy E; X7=E, L vagy A; X8=F, I, G, L vagy S; X9=G, S vagy A; X10=V, A, L, I vagy S; X11=P, Y vagy L; X12=E, F vagy semmi. A „mixotóp” egy kombinatorikus peptidkönyvtár, melyet egyetlen szintézislépésben is elõ lehet állítani, amint azt Gras-Masse, Georges és munkatársai 1999ben leírták. Az MSP-3-b-bõl származó egy másik mixotóp, melyet találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítménybe lehet adagolni, egy peptidkeverék, mely sokféle szintetikus peptidet tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: X1–X2–X3–W–E–X4–G–G–G–X5–P (SEQ ID No 32), ahol: X1=I vagy Y: X2=L vagy F; X3=G vagy A; X4=F vagy I; és X5=V vagy A. Hasonlóképpen egy másik mixotóp, melyet a találmány szerinti antigenikus polipeptidkészítménybe lehet adagolni, egy peptidkeverék, mely sokféle szintetikus peptidet tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: L–X1–X2–X3–X4–X3–X5–X6–X7–D–XS–X9–X10– I–X11–X12–X13–X14–X15–X16 (SEQ ID No 33), ahol: X1=E, vagy S; X2=L, H, S vagy Q;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

X3=I, V vagy L; X4=K, N, Y vagy P; X5=T, S vagy P; X6=S vagy L; X7=K, W vagy S; X8=E, K, R vagy I; X9=E vagy N; X10=D, N vagy Q; X11=I, V, S, P vagy A; X12=K, D vagy N; X13=H vagy E; X14=N vagy S; X15=E vagy D; X16=D vagy Q. A fenti antigéntulajdonságú mixotópkészítmény lehet legalább 50, legalább 100, vagy legalább 500 különbözõ szekvenciájú peptid keveréke. A készítmény tartalmazhatja szintetikus peptidek egy kombinatorikus könyvtárát, mely minden egyes megfigyelt és potenciális helyettesítést tartalmazza. A találmány tárgya továbbá valamely antigenikus készítmény, mely a két fentebb leírt mixotóp keverékét tartalmazza. A fentebb leírt antigenikus polipeptidek vagy antigenikus polipeptidkészítmények bármelyikében lehetséges egy lipidmolekula kötése a polipeptidmolekulák legalább egy részéhez. Ilyen célra alkalmazható lipidmolekulára példa a C¹terminális palmitoil-lizilamid-maradék. Amint azt már említettük, a találmány szerinti antigenikus polipeptidben lévõ polipeptidek vagy polipeptid jellegû molekulák legalább egy része valamely szilárd hordozóhoz köthetõ, ily módon konjugátumokat képezve. Ebben a megvalósításban elõnyös szilárd hordozók a vírusrészecskék, nitrocellulóz vagy polisztirolgyöngyök, és biológiailag lebontható polimerek, mint a lipofoszfo-glikánok vagy a poli-L-tejsav. A jelen találmány egy másik megvalósításában egy immunogén készítmény olyan polipeptidet vagy polipeptidkészítményt tartalmaz immunogénként, mely a fent leírtaknak megfelel, és amelyet rekombinációval állítottak elõ. Amint azt az 5. példában kifejtjük, az itt leírt géncsalád egy figyelemre méltó jellemzõvel bír, nevezetesen a géncsalád különbözõ tagjai közötti epitópkonzerválással, ami a géncsalád különféle termékei közötti immunológiai keresztreaktivitáshoz vezet. Az MSP3–1 és fragmenseinek vakcinációs potenciálja, amit a 2. és 3. példa illusztrál, a fent említett epitópkonzerválással és keresztreaktivitással olyan figyelemre méltó tulajdonságok, melyek ezen géncsaládot és a belõle származó polipeptidkészítményeket különösen érdekes maláriaellenes vakcinajelöltté teszik. A jelen találmány egy másik fontos tárgya ennek megfelelõen valamely fent leírt polipeptid vagy polipeptidkészítmény alkalmazása malária elleni vakcina készítésére, valamint egy ilyen vakcina, mely immunogénként ilyen polipeptidet vagy polipeptidkészítményt tartalmaz, valamely alkalmas farmakológiai hordozóval együtt. A találmány szerinti immunogén készítmény és vakcina továbbá tartalmazhat legalább egy, a követke-

1

HU 007 367 T2

zõkbõl kiválasztott antigént: LSA¹1 (Guerin-Marchand, Druilhe és munkatársai 1987), LSA¹3 (Daubersies, Thomas és munkatársai 2000), LSA-5, SALSA (Bottius, BenMohamed és munkatársai 1996), STARP (Fidock, Bottius és munkatársai 1994), TRAP (Robson, Hall és munkatársai 1988), PfEXPI (Simmons, Woollett és munkatársai 1987), CS (Dame, Williams és munkatársai 1984), MSP1 (Miller, Roberts és munkatársai 1993), MSP2 (Thomas, Carr és munkatársai 1990), MSP4 (Marshall, Tieqiao és munkatársai 1998), MSP5 (Marshall, Tieqiao és munkatársai 1998), AMA¹1 (Peterson, Marshall és munkatársai 1989; Escalante, Grebert és munkatársai 2001), SERP (Knapp, Hundt és munkatársai 1989) és GLURP (lásd fent). A találmány egy különösen fontos megvalósítása szerint az immunogén készítmény vagy vakcina intradermális vagy intramuszkuláris injekcióként van formulázva. Ebben az esetben az immunogén készítmény vagy vakcina elõnyösen 1 és 100 mg közötti immunogént tartalmaz adagonként, elõnyösebben 2 és 50 mg között. Más módon az immunogén készítmény vagy vakcina orális beadásra lehet formulázva, amint azt BenMohamed, Beikaid és munkatársai 2002-ben leírták. A találmány szerinti immunogén készítmény vagy vakcina továbbá tartalmazhat SBAS2¹t és/vagy alumínium-sót és/vagy Montanide¹t adjuvánsként. A jelen találmány további tárgyai az itt tárgyalt antigének ellen termelt ellenanyagokkal és ellenanyagfragmensekkel kapcsolatosak. Amint az fent és az 5. példában leírásra kerül, az MSP¹5 géncsalád epitópkonzerváltsága egy adott antigén ellen nyert ellenanyagok keresztreaktivitásához vezet. Például valamely szintetikus vagy rekombináns ellenanyag, mely keresztreagál az MSP-3–3-mal, és amely in vitro körülmények között a Plasmodium falciparum vérben élõ stádiumainak gátlását vagy elpusztítását közvetíti a monocitadependens, ellenanyag-közvetített ADCI mechanizmusban, a találmány szempontjából különösen fontos ellenanyag. A találmány szerinti polipeptidek ellen termelt ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek keverékei szintén tárgyai a találmánynak. A találmány szerinti ellenanyagok vagy ellenanyagfragmensek egy másik keveréke valamely fent leírt polipeptidkészítmény ellen irányul. A találmány szerinti elõnyös ellenanyagok (vagy fragmensek) az emberi vagy humanizált ellenanyagok. Ilyen ellenanyagokat vagy ellenanyagfragmenseket például Lemna-ban, valamint kukoricában, dohányban, CHO sejtekben és hasonlókban lehet termelni. CHO sejtekben termelve például a WO 03/016354 által ismertetett eljárásokat lehet alkalmazni. A jelen találmány tárgya továbbá egy, a fentiekben leírt ellenanyagot vagy ellenanyag-keveréket vagy ezek fragmenseit tartalmazó készítmény alkalmazása malária elleni gyógyszer készítésére. Természetesen a malária passzív immunterápiájára szolgáló, ilyen ellenanyagot vagy ellenanyag-keveréket tartalmazó gyógyszer szintén a találmány tárgyát képezi. Az ilyen gyógyszer továbbá tartalmazhat a következõ listából

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

válogatott legalább egy antigén ellen irányuló ellenanyagokat: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. A malária megelõzésére, enyhítésére vagy kezelésére szolgáló eljárások, melyek a fentiekben leírt immunogén készítmény, vakcina, vagy ellenanyagot tartalmazó gyógyszer rászoruló betegeknek történõ beadását alkalmazzák, szintén tárgyai a találmánynak. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a malária in vitro diagnózisára P. falciparum-mal feltehetõen fertõzõdött egyénben, mely eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: az egyénbõl származó biológiai minta érintkezésbe hozása a találmány szerinti antigenikus polipeptiddel az antigenikus polipeptid és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ ellenanyagok közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetõvé tévõ körülmények között, és az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek detektálása. Ezen eljárásban az in vitro diagnózis ELISA módszerrel végezhetõ. Az eljárás további lépéseként lehetséges emellett a biológiai minta érintkezésbe hozása egy vagy több antigenikus peptiddel, mely a következõ listából választott valamely antigénbõl származik: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP3–1, MSP-3–2, MSP-3–5, MSP-3–6, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. Egy alternatív eljárás a malária in vitro diagnózisára P. falciparum-mal feltehetõen fertõzõdött egyénben a következõ lépéseket tartalmazza: az egyénbõl származó biológiai minta érintkezésbe hozása a találmány szerinti ellenanyagokkal, az ellenanyagok és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ antigének közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetõvé tévõ körülmények között, és az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek in vitro detektálása. A malária diagnózisára szolgáló kitek, melyek az MSP¹3 géncsaládnak a találmány szempontjából különösen fontos tulajdonságain alapulnak, szintén tárgyai a találmánynak. Példának okáért tartalmazhatnak legalább egy, a találmány szerinti peptidet vagy polipeptidet, akár szilárd hordozóhoz kötve. Egy ilyen kit továbbá tartalmazhat reagenseket, melyek lehetõvé teszik az antigenikus peptid vagy polipeptid és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ ellenanyagok közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását, és reagenseket, melyek lehetõvé teszik az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek detektálását. Egy másik, a malária diagnózisára szolgáló kit a találmány szerint a fent leírt ellenanyagokat tartalmazza, továbbá szükség szerint reagenseket, melyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és az MSP¹3 géncsalád fehérjéi közül a biológiai mintában jelen lévõk között antigén-ellenanyag komplexek kialakulását, és reagenseket, melyek lehetõvé teszik az esetlegesen képzõdött antigénellenanyag komplexek in vitro detektálását. A jelen találmány tárgya ugyancsak valamely rekombináns nukleotidszekvencia, mely a találmány szerinti antigenikus polipeptidet kódol. A találmány szem-

1

HU 007 367 T2

pontjából különösen fontos szekvenciák a találmány szerinti szekvenciák, melyek legalább két MSP-3-bszerû, és/vagy MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaznak, ahol ezen motívumok legalább egyike a SEQ ID No: 19–24 és 27–30 valamelyike, vagy ezek konzervatív variánsa. Egy példa erre egy rekombináns nukleotidszekvencia, mely számos MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmazó fúziós fehérjét kódol, ahol a motívumok közül legalább kettõ a SEQ ID No: 25–30 valamelyike, vagy ezek konzervatív variánsa. A találmány tárgya továbbá valamely rekombináns klónozó és/vagy expressziós vektor, mely a találmány szerinti valamely nukleotidszekvenciát tartalmazza, amint azt fentebb leírtuk, mely szekvencia például valamely promoter és valamely gazdasejt szempontjából homológ vagy heterológ szabályozóelemek ellenõrzése alatt áll, a gazdasejtben történõ expresszió céljából. A fenti bekezdésben leírt expressziós vektor elõnyösen alkalmazható a Plasmodium falciparum elleni genetikai immunizálásra szolgáló gyógyszer készítésére. A találmány tárgya továbbá valamely nukleinsavvakcina, mely a találmány szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. Valamely rekombináns gazdasejt, például baktérium, élesztõ, rovarsejt vagy emlõssejt, mely a fent leírtaknak megfelelõ expressziós vektorral transzformálva van, szintén tárgya a találmánynak. A jelen találmány számos vonatkozása és elõnye illusztrálva van a következõ ábrákkal és kísérleti adatokkal. Ábraaláírások 1. ábra: A 10. kromoszóma azonos régiójában található kilenc gén szervezõdése. A kilenc nyitott leolvasási keretet nem kódoló régiók választják el, és 5’–3’ irányban sorban elõször a GLURP-nek nevezett fehérjét kódolják, majd 1300 bázispár távolságra az MSP¹3 (újabb elnevezése MSP-3–1) következik, azután 7 másik gén, melyet MSP-3–2, MSP-3–3, MSP3–4, MSP-3–5, MSP-3–6, MSP-3–7, MSP-3–8 jelölés illet. 2. ábra: Az MSP-3–1-bõl származtatott különféle peptidek. A védettség az MSP¹3b, c és d peptidekkel reagáló ellenanyagokkal hozható összefüggésbe. 3., 4. és 5. ábra: In vivo tanulmányok. Specifikus ellenanyagok átvitele passzív transzferkísérletekben P. falciparum-mal fertõzött, emberi vörösvértestekkel transzfundált, immunkompromittált egerekbe. Az MSP 3¹b peptiddel, MSP-3¹d peptiddel és a GLURP¹R0 régióval reagáló ellenanyagok mind képesek in vivo, a passzív transzfer körülményei között, az immunkompromittált SCID egerekben elõidézett P. falciparum-parazitémia megszüntetésére. 6. ábra: In vivo tanulmányok. Megerõsítõ eredmények.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

Egy, az MSP-3¹b epitóp ellen irányuló emberi rekombináns ellenanyag, mely az MSP-3–2 rekombináns fehérjével keresztreagál, passzív transzferben képes a P. falciparum-fertõzött SCID egerekben a parazitémia megszüntetésére. 7. ábra: Emberi önkénteseknek egy, az MSP3¹b, c, d peptidek régióit lefedõ hosszú szintetikus peptiddel történt mûvi immunizálásával kiváltott ellenanyagok alkalmazásával nyert eredmények. Ugyanezt a hatást lehet megfigyelni mind in vitro körülmények közt, mind in vivo körülmények között, a P. falciparum-fertõzött SCID egér modellben. 8. ábra: A teljes afrikai IgG és az afrikai IgG koncentrációjára beállított, tisztított antiMSP-3¹b biológiai hatásának összehasonlítása. Az anti-MSP-3¹b ellenanyagok erõsebb és teljesebb hatása figyelhetõ meg, ami vakcinapotenciáljukat húzza alá. 9. ábra: Az MSP¹3 géncsalád nukleotidszekvenciáinak összeigazítása a ClustalW program segítségével. 10. ábra: Az MSP¹3 géncsalád peptidszekvenciáinak összeigazítása a ClustalW program segítségével. 11. ábra: Az MSP3 géncsalád génjei szekvenciáinak összehasonlítása. Az összehasonlítás felettébb szokatlan epitópkonzerválást mutat a géncsalád tagjai körében, a biológiailag aktív ellenanyagok által megcélzott epitópokra vonatkozóan, ami kritikus a védettség szempontjából. 12. ábra: MSP-3-b-szerû motívumok. 13. ábra: MSP-3-c-d-szerû motívumok. 14. ábra: A. Az lgG3 ellenanyagválaszok mintázata minden egyes antigén ellen 30 OoDobeli védett egyénben (az IgG3 specifikus válaszok arányainak átlagai és standard hibái). B. Az IgG3 ellenanyagválaszok mintázata 7 védett, alacsony IgG3 antiMSP3 választ mutató OoDo-beli lakosban (alacsony IgG3 határérték: az átlag 95%¹os konfidenciaintervallum-határértéke alatt, azaz anti-MSP3b IgG3 <2,30). C. Az IgG3 ellenanyagválaszok mintázata 15 védett, alacsony IgG3 anti¹RO választ mutató OoDo-beli egyénben (alacsony IgG3 határérték: az átlag 95%¹os konfidenciaintervallum-határértéke alatt, azaz anti-GLURP R0 <1,38). D. 1998ban magas lgG3 MSP3 választ mutató 7 védett egyén változásai 5 évi idõtartamban. E. 1998-ban magas IgG3 antiGLURP R0 választ mutató 7 védett egyén változásai 5 évi idõtartamban. 15. ábra: Az MSP¹3 géncsaládból származtatott különféle konstrukciókon affinitástisztított ellenanyagok ADCI-aktivitása. Az eredményeket SGI (specifikus növekedésgátlási index) átlagokként fejezzük ki a pozi-

1

HU 007 367 T2

tív kontrollhoz, egy afrikai immunglobulinkeverékhez (PIAG) viszonyítva. Ezt a keveréket thai gyermekekbe vitték át passzív transzferrel. Az affinitási tisztításhoz használt szekvenciák a C¹terminális régiónak felelnek meg, amely a leghomológabb rész a gének között és az egyetlen jól konzervált szakasz. A szekvenciákat a C¹terminális régió alatt vonal jelzi a 18. ábrán. Az eredmények azt mutatják, hogy a 6 gén minden egyes régiójára specifikus összes ellenanyag erõsen aktív az ADCI mechanizmusban annyira, mint az afrikai immunglobulinkeverék, melyrõl kimutatták, hogy hatékony a P. falciparum eliminálásában, fertõzött egyénekben, passzív transzferrel. 16. ábra: Az MSP¹3 géncsalád minden egyes tagjának C¹terminális régióján affinitástisztított ellenanyagok keresztreakciós mintázata az MSP¹3 géncsalád többi tagjával. A GLURP, 571 és a BSA negatív kontrollként szolgálnak. Az eredmények megmutatják, hogy a géncsalád egyik tagjának C¹terminális régióján affinitástisztított ellenanyagok keresztreagálnak, különbözõ mértékben, az MSP¹3 géncsalád többi tagjával. A legerõsebb keresztreakciós mintázatot az MSP3–4 adja, ami erõs pozitív reakciót ad az összes többi családtaggal; õt követi az MSP-3–8. Mindazonáltal ez a dot-blot mindössze az MSP¹3 géncsalád minden egyes tagjának keresztreagáló epitópjait mutatja. 17. ábra: Az MSP¹3 géncsalád minden egyes tagjának C¹terminális régióján affinitástisztított ellenanyagok keresztreakciós mintázata az MSP¹3 géncsalád MSP-3–1 és MSP-3–2 tagjaiból származó peptidekkel. A peptidek az MSP-3–1 és MSP3–2 a, b, c, d, és f peptidjei. A rekombináns MSP¹3 C¹terminális és a BSA rendre pozitív és negatív kontrollként szolgálnak. Az eredmények azt mutatják, hogy a géncsalád különbözõ tagjainak C¹terminális régióival reagáló ellenanyagok reagálnak, különbözõ mértékben, az MSP3–1 C¹terminálisának különbözõ régióival, különösen az MSP¹3b és c¹vel, és a legerõsebb választ az MSP3-f¹en kaptuk. A keresztreaktivitás az MSP-3–2- különféle peptidjeivel nem olyan erõs, mint az MSP-3–1gyel. Végezetül az MSP-3–1-CT-vel, a C¹terminális rekombinánssal kapott nagyon erõs keresztreaktivitás szintén egy, nem az egyedi peptidek bármelyike által meghatározott, hanem valószínûleg a hosszabb C¹terminális rekombináns által generált konformációs epitópra irányuló keresztreaktivitásra utal. Ebben az esetben bármely affinitástisztított ellenanyagnak a géncsalád bármely adott tagjával szemben mutatott keresztreaktivitásának mértéke a géncsalád különbözõ tagjai-

5

2

nak szerkezeti homológiáját és a keresztreagáló epitópok meglétét mutatja, beleértve a 3¹dimenziós konformáció által generált epitópokét. Ugyanez igaz az MSP3–2¹re. 18. ábra: Az MSP¹3 géncsalád különbözõ tagjainak sematikus megjelenítése. Az immunoassay-kben használt rekombináns antigének felépítésére alkalmazott C¹terminális régió alá van húzva.

10 Példák

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

1. példa: A P. falciparum vérben élõ stádiumának elpusztítása a géntermékek elleni ellenanyagok által, az ADCI mechanizmussal 2.A. Anyagok és módszerek: az ADCI teszt 2.A.1. Bevezetés Az ellenanyagfüggõ sejtgátlás [Antibody Dependent Cellular Inhibition (ADCI)] vizsgálata az ellenanyagok azon képességének megítélésére szolgál, hogy mennyire képesek gátolni a Plasmodium falciparum növekedését monociták jelenlétében, in vitro. Tanulmányok kimutatták, hogy ellenanyagok, melyek a P. falciparum vérben élõ stádiumai ellen védelmet nyújtanak emberben, passzív transzfer útján nem képesek a parazitát in vitro gátolni, hacsak nem tudnak együttmûködni a vér monocitáival. Azt is kimutatták, hogy az in vivo védelemre nem képes ellenanyagok nincsenek hatással a P. falciparum növekedésére az ADCI tesztben. Ennek megfelelõen az ADCI egy olyan in vitro teszt, melynek eredményei az antimalária-ellenanyagok emberben in vivo körülmények között megfigyelhetõ védõhatását tükrözik. A monocitákkal együttmûködni képes ellenanyagok nyilvánvalóan citofilek: az IgG1 és IgG3 izotípusok hatékonyak az ADCI-ben, míg az IgG2, IgG4 és IgM izotípusok nem hatékonyak. Ez összhangban van azokkal az eredményekkel, melyek szerint a védett egyének szérumában a citofil anti-P. falciparum ellenanyagok dominálnak, míg a nem védett egyénekben a parazita ellen termelt ellenanyagok nagyrészt nem citofilek. Az eredmények arra utalnak, hogy az ADCI feltehetõen a következõ eseménysorozatot foglalja magában, amikor a schizonták felhasadnak, egyes merozoita felszíni komponensek és a monocitákhoz az Fc fragmensükkel kötött citofil ellenanyagok kölcsönhatása oldott mediátorok felszabadulását váltja ki, amelyek a tenyészfolyadékba diffundálva az eritrocitán belül élõ paraziták osztódását gátolják. Az ADCI teszt fõbb lépései a következõk: (i). Szérum-IgG preparálása ioncserés kromatográfiával. (ii). Monociták izolálása egészséges véradóból. (iii). P. falciparum paraziták preparálása, szinkronizálás és schizontadúsítás. (iv). Parazitatenyésztés 96 óra hosszat, ellenanyagok és monociták jelenlétében. (v). A gátló hatás megítélése mikroszkópos megfigyeléssel és parazitaszámlálással.

1

HU 007 367 T2

2.A.2. Anyagok igG preparálása 1. Tris-puffer: 0,025 M Tris-HCl, 0,035 M NaCl, pH=8,8. 2. Foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS), pH=7,4. 3. GF-05-Trisacryl szûrõoszlop (IBF, Biothecnics, Villeneuve La Garenne, Franciaország). 4. DEAE-Trisacryl ioncserélõ kromatográfiás oszlop (IBF). 5. G25 gélszûrõ oszlop. 6. Amicon szûrõk és csövek fehérjekoncentráláshoz (molekulatömeg-határérték: 50 000 Da). 7. Sterile Millex szûrõk, 0,22 mm pórusátmérõ (Millipore Continental Water Systems, Bedford MA, USA). 8. Ultraibolya lámpával ellátott spektrofotométer. Monociták preparálása 1. Heparinos vér egészséges donortól, 20–40 ml térfogat. 2. Ficoll–Hypaque sûrûséggradiens (Pharmacia LKB Uppsala, Svédország). 3. Hank’s-oldat kiegészítve NaHCO3-mal, pH=7,0. 4. RPMI 1640 tenyészközeg kiegészítve 35 mM HEPES-sel és 23 mM NaHCO3-mal; ásványvízzel készítve; 4 °C¹on tartva. 5. Nem specifikus észteráz (NSE)-festéshez reagensek: fixálóoldat, nitrit, festék, puffer és szubsztrát 6. 96 mélyülettel ellátott steril mûanyag tálcák (TPP, Svájc). 7. Hûthetõ centrifuga. 8. CO2-inkubátor. 9. Inverz mikroszkóp. Parazitapreparálás 1. RPMI 1640 tenyészközeg (lásd fent). 2. 10% Albumax törzsoldat; 4 °C¹on tárolva legfeljebb 1 hónapig. 3. 5% szorbitol a paraziták szinkronizálásához. 4. Plasmagel a schizonták feldúsításához. 5. Reagensek kenetek fixálásához és festéséhez: metanol, eozin, metilénkék. 2.A.3. Módszerek IgG preparálása Az IgG¹t emberi szérumból vonjuk ki (lásd az 1. megjegyzést) a következõk szerint: 1. A szérumot 1:3 arányban hígítjuk a Tris-pufferrel. 2. A hígított szérumot az elõzõleg a Tris-pufferrel egyensúlyba hozott GF¹05 Trisacryl gélszûrõ oszlopon gélszûrjük. Ellenõrizzük, hogy a szérum:gél arány 1 térfogat hígítatlan szérum 4 térfogat GF¹05 gélre. 3. A fehérjét tartalmazó frakciókat összeöntjük. 4. Az összeöntött frakciókat az elõzõleg a Tris-pufferrel egyensúlyba hozott DEAE–Trisacryl ioncserés kromatográfiás oszlopra töltjük. Ellenõrizzük, hogy a szérum:gél arány 1 térfogat hígítatlan szérum 4 térfogat DEAE–Trisacryl gélre. 5. 1 ml térfogatú frakciókat gyûjtünk. 6. Minden egyes frakció optikai denzitását (OD) megmérjük 280 nm¹es szûrõvel.

2

7. Az IgG-koncentrációt a következõképpen számítjuk: IgG mg/ml=OD280 nm/1,4. 8. Az IgG-tartalmú frakciókat összeöntjük. 9. Az IgG-oldatot Amicon szûrõn koncentráljuk. Az Amicon szûrõt elõzõleg desztillált vízben áztatjuk 5 1 óra hosszat, majd speciális csövekhez illesztjük, melyekbe adagoljuk az IgG-oldatot. 10. A csöveket 876 g¹n 2 óra hosszat centrifugáljuk 4 °C¹on. Ez általában 25¹szörös koncentrálódást eredményez. 10 11. Végezetül gélszûrünk egy elõzõleg RPMI tenyészfolyadékkal egyensúlyba hozott G24 oszlopon. 12. Az RPMI-ben IgG¹t tartalmazó frakciókat gyûjtjük. 13. Minden egyes frakció optikai denzitását mérjük 280 nm¹es szûrõvel. 15 14. Az IgG-koncentrációt számítjuk. 15. Összeöntjük az IgG-tartalmú frakciókat. 16. Az IgG-frakciókat 0,22 mm pórusátmérõjû szûrõn átszûrve sterilizáljuk. 20 17. A steril IgG-oldatot 4 °C¹on legfeljebb 1 hónapig tároljuk (vagy Albumax¹ot adunk hosszabb tároláshoz – nem ajánlott eljárás).

25

30

35

40

45

50

55

60 11

Monocitapreparálás A monocitapreparálásra alkalmazott eljárás a Boyum (Scand J. Clin. Lab. Invest. 1968, 21, 77–89) által leírtakon alapul, és a következõ lépéseket foglalja magában: 1. A heparinos vért 3¹szorosan hígítjuk Hank’s-oldattal. 2. A hígított vér két térfogatnyi mennyiségét gondosan felülrétegezzük 1 térfogat Ficoll–Hypaque¹ra (centrifugacsövenként legfeljebb 20 ml hígított vér). 3. 560 g¹n 20 percig centrifugáljuk 20 °C¹on. 4. A Ficoll/plazma határfelületrõl a mononukleáris sejteket leszívjuk. 5. A mononukleáris sejtszuszpenziót 45 ml Hank’s-oldattal hígítjuk. 6. 1000 g¹n 15 percig centrifugáljuk 20 °C¹on. 7. A leülepedett sejteket gondosan felszuszpendáljuk 45 ml Hank’s-oldatban. 8. Ismét 1000 g¹n 15 percig centrifugáljuk 20 °C¹on. A mosási lépést még kétszer ismételjük. 9. Végezetül 180 g¹n 6 percig 20 °C¹on centrifugáljuk a vérlemezkék eltávolítására, melyek a felülúszóban maradnak. 10. A mononukleáris sejteket 2 ml RPMI-ban felvesszük. 11. A mononukleáris sejtek (azaz a limfociták és monociták) koncentrációját a sejtszuszpenzióban úgy számítjuk, hogy egy 20 ml¹es mintát RPMI-vel 3× hígítunk, és hematológiai sejtszámláló automatában (például Malassez típusúban) számláljuk. 12. A monociták számát nem specifikus észteráz(NSE) festési technikával határozzuk meg: (i). Az „A” jelû mikrokémcsõbe 40 ml mononukleáris sejtszuszpenziót és 40 ml 1 fixálóoldatot adunk. (ii). A „B” jelû mikrokémcsõben összekeverjük az NSE-festés reagenseit a következõ sorrendben:

1

HU 007 367 T2

60 ml nitrit, 60 ml festék, 180 ml puffer, és 30 ml szubsztrát. (iii). A „B” jelû mikrokémcsõben lévõ keveréket az „A” jelû mikrokémcsõben lévõ sejtekhez adjuk. (iv). A festett sejtekbõl 20 ml mintát veszünk és a monocita:limfocita arányt meghatározzuk az alapján, hogy a monociták barnára festõdtek, míg a limfociták festetlenek maradtak. Általában a monociták aránya 10–20% az összes mononukleáris sejten belül. 13. A sejtszuszpenziót 2×103 monocita/100 ml koncentrációra állítjuk RPMI-vel. 14. A sejtszuszpenziót 96 mélyülettel ellátott tálcára adagoljuk 100 ml/mélyület adagokban. 15. 37 °C¹on 90 percig inkubáljuk 5% CO2 alatt. Az inkubáció alatt a monociták a mûanyag felületére tapadnak. 16. A le nem tapadt sejteket eltávolítjuk, a monocitákat mélyületenként 200 ml RPMI hozzáadásával és gondos eltávolításával mossuk. 17. Ezt a mosási eljárást háromszor ismételjük, hogy az összes le nem tapadt sejtet eltávolítsuk. 18. Az így nyert sejtek legalább 95%¹a monocita lesz. Ellenõrizzük a sejtek kinézetét és az egyes mélyedésekben a sejteloszlás relatív homogenitását fordított fényutas mikroszkóppal (lásd a 2., 3. és 4. Megjegyzést). Parazitapreparálás A P. falciparum törzseket 0,5% Albumaxszal kiegészített RPMI 1640 tápfolyadékban tartjuk. A parazitákat szorbitolkezeléssel szinkronizájuk a következõk szerint: 1. A szorbitol törzsoldatot 5%¹ra hígítjuk ásványvízzel. 2. Az aszinkron parazitaszuszpenziót 1200 rpm¹en 10 percig 20 °C¹on centrifugáljuk. 3. Az üledéket felvesszük az 5% szorbitololdatban. Ez a schizontákkal fertõzött vörösvértestek líziséhez vezet a gyûrûs alakokra és fiatal trofozoitákra gyakorolt bármilyen hatás nélkül. Ha szükséges, a schizontákat plazmagélen flotációval lehet dúsítani a következõk szerint: 1. Az aszinkron parazitatenyészetet 250 g¹n 10 percig 20 °C¹on centrifugáljuk. 2. Az üledéket felvesszük a vörösvértestek 20%¹os koncentrációjáig 30% RPMI, 50% plazmagélben. 3. 37 °C¹on 30 percig inkubáljuk. A schizontával fertõzött vörösvértestek a felülúszóban maradnak, míg a fiatal trofozoitával fertõzött és nem fertõzött vörösvértestek leülepednek. 4. A felülúszót gondosan összegyûjtjük, centrifugálással 250 g¹n 10 percig 20 °C¹on. 5. A leülepedett sejtekbõl készítsünk kenetet, fessük meg, és határozzuk meg a parazitémia mértékét mikroszkópos számlálással. 6. Ezen eljárás használatával a szinkronizált schizontafertõzött vörösvértestek kinyerési aránya ~70% parazitémia. Az ADCI-teszthez szinkronizált korai schizonta parazitákat használunk. Általában a parazitémia 0,5–1,0% és a haematokrit 4%.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

2

Az ADCI-teszt 1. Az utolsó mosási lépés után minden egyes monocitatartalmú mélyülethez a következõket adjuk: (i). 40 ml RPMI 0,5% Albumaxszal kiegészítve (tenyészközeg). (ii). 10 ml vizsgálandó ellenanyagoldat. Általában az IgG-ket az eredeti, szérumbeli koncentrációjuk (~20 mg/ml hiperendémiás területekrõl származó felnõttekben, és ~12 mg/ml endémiás területekrõl származó gyermekekben és elsõ alkalommal fertõzõdött betegekben) 10%¹án alkalmazzuk (lásd az 5. megjegyzést). (iii). 50 ml parazitatenyészet, 0,5% parazitémia és 4% hematokrit mellett. 2. A kontrollmélyületek a következõket tartalmazzák: (i). Monociták (MN) és paraziták normál IgG-vel (N IgG), mely malária-elõtörténettel nem rendelkezõ donorból készült. (ii). Parazitatenyészet a vizsgálandó IgG-vel, de monociták nélkül. 3. A tenyészetet 37 °C¹on tartjuk 96 óráig felfordított befõttesüvegben (vagy alacsony O2, 5% CO2-inkubátorban). 4. 48 és 72 óra múlva adjunk 50 ml tenyészközeget minden egyes mélyületbe. 5. 96 óra után a felülúszókat eltávolítjuk, minden egyes mélyületbõl kenetet készítünk, festjük, és mikroszkóp alatt a parazitémiát meghatározzuk. A viszonylagos pontosság biztosítása érdekében legalább 50 000 vörösvértesben meg kell határozni a fertõzött sejtek arányát (lásd 6. és 7. megjegyzések). 6. A specifikus növekedésgátlási indexet [Growth Inhibitory Index (SGI)] számítjuk, figyelembe véve a monociták vagy az ellenanyag által önmagukban okozott esetleges gátlást: SGI=100×1 – százalékos parazitémia monocitákkal és ellenanyagokkal/százalékos parazitémia ellenanyagokkal/százalékos parazitémia monocitákkal és normál IgG-vel/százalékos parazitémia normál IgG-vel. 2.A.4. Megjegyzések 1. A vizsgálandó szérumokból az IgG kipreparálása elengedhetetlen, mivel frakcionálatlan szérum alkalmazásakor a parazitanövekedés nem ellenanyagfüggõ gátlása gyakran megfigyelhetõ, valószínûleg oxidált lipideknek tulajdoníthatóan. 2. Az ADCI-ben a monocita (MN)-mûködés számos tényezõtõl függ, így az RPMI 1640 elõkészítésére használt víztõl. A magas fokban tisztított víz, mint például a Millipore-víz, bár megfelelõ a paraziták tenyésztéséhez, a mûanyag mélyületekhez tapadt monociták számában rossz kitermelést eredményez. Másfelõl ásványi anyagokat nyomokban tartalmazó víz, például a kereskedelemben kapható Volvic víz, vagy üvegen desztillált víz, következetesen jó monocitamûködést eredményez. 3. Fokozott monocitaletapadást lehet elérni a tenyésztõedények fibronektines bevonásával, azaz a monocitadonor autológ plazmájával történõ bevo-

1

HU 007 367 T2

nással, majd azt követõ RPMI 1640¹es mosással, a mononukleáris sejtekkel történõ inkubálás elõtt. 4. Vírusfertõzött (például influenza) alanyokból származó monociták gyakran képesek nem IgG-függõ parazitanövekedés-gátlást indukálni. Ez a nem specifikus gátló hatás megakadályozhatja az IgGfüggõ hatás észlelését az ADCI-ban. Ennek okáért kerülendõk azon monocitadonorok, akik gyaníthatóan vírusos fertõzésen esnek át, vagy lázuk volt az elõzõ 8 napban. Az ADCI eredményei nem megbízhatóak, ha a monociták közvetlen hatása 50%¹os gátlásnál nagyobb. Heterológ szérumot, például fötális borjúsavót tartalmazó közegben történõ preparálása a monociták differenciálódását, makrofággá történõ progresszív transzformációjukat eredményezi, mellyel elvesztik ADCI-elõsegítõ hatásukat. 5. Ha szükséges, egér IgG¹t lehet emberi monocitákkal vizsgálni ADCI-ban. Az IgG2a izotípus képes az emberi monocitákon található Fcg-receptor II¹höz kötõdni, amelyrõl kimutatták, hogy az ADCI mechanizmusában szerepet játszik. 6. Az ADCI-teszt egy lehetséges variánsa a merozoita felszíni antigének elleni, védõhatású citofil ellenanyagok (hiperendemikus területrõl származó felnõttekbõl) és a nem védõhatású ellenanyagok (endémiás területekrõl származó gyermekekbõl és elsõ alkalommal fertõzõdött betegekbõl) közötti kompetitív hatás vizsgálatára alkalmas. Az utóbbiak ugyanazon antigéneket ismerik fel, de nem képesek a monocitaaktiválódás kiváltására, mert nem

5

10

15

20

25

30

2

kötõdnek az Fc gamma-receptorokhoz. Ennek megfelelõen a „kritikus” antigénekkel reagáló nem citofil IgG blokkolhatja a védõhatású ellenanyagok ADCI-hatását. Minden IgG-frakciót az eredeti, szérumbeli koncentrációja 10%¹án kell alkalmazni. 7. Az ADCI teszteljárás módosítható, és kétlépéses ADCI-ként is végre lehet hajtani, a monociták rövid idõtartamú aktivációjával az alábbiak szerint: (i). A monocitákat 12–18 óra hosszat inkubáljuk a vizsgálandó Ig¹vel és szinkronizált, érett schizontákkal fertõzött vörösvértestekkel, 5–10% parazitémia mellett. Az elsõ tenyészidõszak alatt a vörösvértestek széthasadása megtörténik, és a merozoiták kiszabadulnak. (ii). Minden egyes mélyületbõl a felülúszót összegyûjtjük, és 700 g¹n centrifugáljuk. (iii). A felülúszókat 96 lyukú tálcára osztjuk szét, 100 ml/mélyület térfogatban. (iv). Minden egyes mélyületbe 100 ml P. falciparum aszinkron tenyészetet teszünk, mely friss tápközeget tartalmaz, 0,5–1% parazitémia, 5% hematokrit mellett (ezen második tenyésztéshez alkalmazott vörösvértest-preparátum fehérvérsejtes szennyezését különös gonddal kell a minimumra csökkenteni). (v). A tenyésztés 36. órájában adjunk 1 mCi 3H-hipoxantint minden egyes mélyületbe. (vi). A tenyésztés 48. órája után gyûjtsük össze a sejteket, és mérjük meg a 3H-felvételt folyadékszcintillációs számlálóval.

2.B. Eredmények 1. táblázat ADCI körülmények

Ellenanyag

Térfogat

17/1/03

RPMI

10 ml

7,8

7,1

0%

0%

3D7

NIG dializált

5 ml

7,5

6,3

8%

4%

letapadás

PIAG (IFA 35,000) Ali

10 ml

11,8

5

53%

100%

–51%

Kezdeti parazita (%)

0,5% aszinkron AB+RBC-ben

anti-MSP3.1 CT (MSP3 Simon)

10 ml

11,8

5

53%

100%

–51%

Végsõ parazita (%)

7,8%

anti-MSP3.4 CT

10 ml

12,6

5,1

56%

104%

–62%

Az ADCI idõtartama

72 h

15 ml

9,4

5

42%

78%

–21%

ADCI 02/03 Parazitatörzs MN (monocita) preparálás

MN-gátlás % MN donor ADCI

9%

anti-MSP3.7 CT

fagyasztott cito 18/10/02 standard

1. tálca Minden ellenanyagot 1:200¹as IFA-titerre állítottunk be

anti-MSP3.1 CT (MSP3 old) anti-MSP3.2 CT (MSP6) anti-MSP3.8 CT

anti-MSP3.3 CT

13

MN (–)

MN (+)

SGI %

Adj SGII %

Direkt

10 ml

9,9

5

45%

83%

–27%

15 ml

11,4

10

4%

7%

–46%

10 ml

11

4,6

54%

101%

–41%

15 ml

11,3

4,6

55%

103%

–45%

10 ml

12,5

3,4

70%

131%

60%

15 ml

9,8

4,5

50%

93%

–26%

10 ml

4,4

60%

15 ml

12 8,2

7,7

–3%

112 –6%

–54% –5%

10 ml

9,1

4,1

51%

94%

–17%

15 ml

9,1

4,5

46%

85%

–17%

1

HU 007 367 T2

Az ellenanyagok elõállításához alkalmazott C¹terminális régiókat a 18. ábra jelzi, a minden egyes fehérje alatti vízszintes vonalaknak felelnek meg. E. coli-ban a PTCR¹His vektor alkalmazásával klónoztuk õket. 5 2. példa: In vivo vizsgálatok egérben, ellenanyagok passzív transzferével Az 1. példában bemutatott in vitro eredmények megerõsítésre kerültek passzív transzferkísérletekben, ahol specifikus ellenanyagokat vittünk P. falciparumfertõzött, emberi vörösvértestekkel átültetett, immunkompromittált egerekbe. A jelen példában alkalmazott anyagok és módszerek le vannak írva: (Brahimi, Perignon és munkatársai. 1993; Badell, Oeuvray és munkatársai 2000). Közelebbrõl az ellenanyagok kinyerésére alkalmazott eljárások le vannak írva Brahimi és munkatársai közleményében. Ezen modell kezelésének komplexitása miatt egyelõre nem lehetett az összes ellenanyagot vizsgálni, de az MSP-3¹b peptid, az MSP-3¹d peptid és a GLURP¹R0 régió elleni ellenanyagok mindre képesek in vivo, passzív transzfer körülményei között, az immunkompromittált SCID egerekben elõidézett P. falciparum parazitémia megszüntetésére (3., 4. és 5. ábra). Látható, hogy az anti-MSP-3¹b és anti-MSP-3¹d ellenanyagok parazitaellenes hatása kivételesen erõs, és viszont, az azonos ellenanyag-koncentrációra állított anti-GLURP ellenanyagok által indukált parazitaellenes hatás kevésbé hatékony: az anti-GLURP ellenanyagok esetében a paraziták eltûnéséhez szükséges idõtartam kétszer olyan hosszú, mint az anti-MSP¹3 ellenanyagok esetében. A fentebb leírt okokból a részletesen leírt 6 gén keresztreakciós hálózata azt jelenti, hogy a többi gén ellen termelt ellenanyagok valószínûleg ugyanolyan biológiai hatást mutatnak, ha P. falciparum-fertõzött egerekbe visszük át õket. Végezetül ezen in vivo hatás további megerõsítést nyert az MSP-3¹b epitóp elleni emberi rekombináns ellenanyag alkalmazásával (6. ábra), mely ellenanyag keresztreagál az MSP-3–2 rekombináns fehérjével, és passzív transzfer alkalmával megszünteti a parazitémiát a P. falciparumfertõzött SCID egerekben. Lényegében hasonló eredmények születtek emberi önkénteseknek az MSP-3¹b, c, d peptideket átfedõ, mind in vitro, mind in vivo, a P. falciparum-fertõzött SCID egér modellben ugyanezen hatást mutató hosszú szintetikus peptiddel történõ mesterséges immunizálásakor (7. ábra). 3. példa: Immunizációs kísérletek majmokon Az in vitro és in vivo körülmények között gyûjtött, védettségre vonatkozó adatok további független megerõsítést nyertek annak kimutatásával, hogy Freundféle teljes adjuvánssal adjuvált rekombináns MSP-3–1gyel immunizált Aotus majmok az ADCI mechanizmusban hatékony ellenanyagokat termeltek, és hogy a majmok, ha virulens, vérben élõ stádiumban lévõ P. falciparum-mal oltották be õket, képesek voltak a P. falciparum-parazitémiájuk korlátozására és megszüntetésére, míg a kontrollmajmok nem.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

4. példa: Teljes afrikai IgG-vel és tisztított antiMSP-3¹b ellenanyagokkal kapott biológiai hatások összehasonlítása A teljes afrikai IgG-vel és a teljes afrikai IgG koncentrációjára állított, tisztított anti-MSP-3¹b ellenanyagokkal kapott biológiai hatások összehasonlítása az anti-MSP-3¹b ellenanyagok erõsebb és teljesebb hatását mutatja, ami aláhúzza vakcinapotenciáljukat. A megelõzõ és jelen kutatások folyamán a feltalálók megfigyelték, hogy az MSP-3¹b peptid elleni, affinitástisztított ellenanyagok észlelhetõen gyorsabb és erõsebb hatást mutattak, mint a teljes afrikai IgG, melybõl kinyerésre kerültek. Ez a megfigyelés rendkívül érdekes, minthogy a P. falciparum mintegy 6000 különféle fehérjébõl épül fel, és az MSP-3¹b az egyik fehérje kis szakasza mindössze, így kiszámítható, hogy az antiMSP-3¹b ellenanyagok a parazitának való kitettség hatására keletkezõ ellenanyagok kevesebb mint 1/10 000¹ed részének felelnek meg. További kutatásokat folytattunk a teljes IgG-vel és az anti-MSP-3¹b ellenanyagokkal, melyeket a 8. ábra foglal össze. Figyelemre méltó, hogy ezen kísérletekben az anti-MSP-3¹b ellenanyagok mennyisége a teljes IgG-ben és a tisztított készítményben pontosan ugyanannyi volt. Ezen kísérletek, melyek 6 anti-MSP-3¹b ellenanyaggal kezelt egér és 6 teljes afrikai tisztított IgGvel kezelt egér átlag ± szórásának felelnek meg, világosan megerõsítették, hogy az anti-MSP-3¹b ellenanyagok hatása sokkal erõsebb, az anti-MSP-3¹b ellenanyagok hatása teljesebb, minthogy az egérben a parazitémia teljes megszûnéséhez vezetnek, míg az immun-IgG csökkenéshez vezet sterilitás nélkül, amint az ugyanezen készítmény esetében emberi önkéntesekbe történt injekciózásnál is megmutatkozott (és jelen esetben az afrikai felnõtt donoroknál, akik krónikus, alacsony szintû parazitémiát tartanak fenn). Ezen megfigyelés arra utal, hogy az afrikai immunIgG-ben olyan más ellenanyagok vannak jelen, melyek az anti-MSP¹3 ellenanyagok hatásával versengenek vagy azt gátolják. Ezen, különbözõ ellenanyagok közötti negatív kölcsönhatás például a Blackman és munkatársai által az anti-MSP¹1 ellenanyagokra vonatkozóan leírtakra emlékeztet. A negatív kölcsönhatás szintén összekapcsolható más merozoita felszíni antigénekre irányuló nem citofil ellenanyagok által okozott interferenciával, melyek indirekt módon hathatnak, például térbeli gátlás útján, az anti-MSP¹3 ellenanyagok számára gátolva az MSP¹3 antigének elérését. Mindenesetre ezen megfigyelés a vakcinafejlesztés számára is fontos következményekkel bír: felfogható annak jelzésének, hogy kiválasztott maláriaantigénekkel történõ immunizálás erõsebb védõhatású választ válthat ki, mint az összes maláriafehérjének, de legalábbis közülük számosnak való kitettségbõl eredõ védettség. Más szavakkal: a védõmechanizmusok célpontjaként azonosított molekulákkal történõ immunizálás erõsebb védelem kialakulásához vezethet, mint a természetes kitettség által kifejlesztett védettség, ami az aszexuális vérben élõ stádiumok elleni eddig legerõ-

1

HU 007 367 T2

sebb védettség emberi lényekben. Tehát rendkívül ígéretes a jövõbeni hatékony maláriavakcinák kifejlesztése szempontjából. 5 5. példa: Epitópkonzerválás az MSP¹3 géncsaládban A jelen példában alkalmazott anyagok és módszerek le vannak írva: (Brahimi, Perignon és munkatársai 1993; Badell, Oeuvray és munkatársai 2000). Közelebbrõl az ellenanyagok kinyerésére alkalmazott eljárások le van- 10 nak írva Brahimi és munkatársai közleményében.

2

A géncsalád tagjai közötti szerkezeti homológia következményeképpen a megfelelõ fehérjék közötti immunológiai keresztreaktivitás megléte megerõsítésre került: emberi ellenanyagokat affinitástisztítottunk minden egyes génterméken, és reagáltattuk az összes többivel. Az eredmények megmutatják, hogy az MSP¹3 géncsalád egyetlen fehérjéje ellen indukált ellenanyagok a többi antigénnel is reagálnak immunobloton (16. és 17. ábra), valamint ELISA-ban (az alábbi 2. táblázat).

2. táblázat A hét géntermék elleni ellenanyagok mind hatásosak a P. falciparum vérben élõ stádiumainak elpusztításában a monocitafüggõ ellenanyag-közvetített ADCI mechanizmusban in vitro körülmények között. Az eredmények megmutatják, hogy valamennyi ilyen régió elleni ellenanyag egyenlõ mértékben hatékony a P. falciparum eritrocitastádiumai növekedésgátlásában in vitro körülmények között. MSP3.1 CT MSP3.2 CT MSP3.3 CT MSP3.4 CT MSP3.7 CT MSP3.8 CT

571-His

BSA

Anti-MSP3.1 CT

100

6

33

4

35

23

3

4

Anti-MSP3.2 CT

54

100

22

4

39

37

4

4

Anti-MSP3.3 CT

117

45

100

5

100

47

5

5

Anti-MSP3.4 CT

216

44

130

100

147

103

10

10

Anti-MSP3.7 CT

32

4

3

3

100

5

4

4

Anti-MSP3.8 CT

73

23

26

8

53

100

6

5

Ezen, még mindig folyamatban lévõ kutatás megmutatta, hogy az egyik génterméken affinitástisztított ellenanyagok keresztreagálnak a többi gén termékeivel és viszont minden egyes génre, amit közvetett módon az ADCI-vel kapott eredmények is mutatnak (1. példa). Immunológiai és vakcinafejlesztési szinten a gyakorlati következmény az, hogy a géncsalád bármely tagjával végzett immunizálás ellenanyagokat fog indukálni ugyanazon és a többi géntermékkel szemben is. Ennek megfelelõen ez egy nagyon különleges típusú többgénes géncsalád, mely epitóppolimorfizmus helyett, ami általában a mai napig leírt többgénes géncsaládok jellemzõje, itt az epitópkonzerválás a fõ jellemzõ, ahol deléció, vagy bármely adott génben történõ mutáció esetén a géncsalád egy másik vagy összes többi tagja át tudja venni az antigénfunkciót. Ráadásul egy adott parazita az összes gént egyidejûleg expresszálja. Javaslatunk szerint ez nemcsak egy elõnyös vakcinacsaládot eredményez, hanem a parazita által annak túlélése érdekében kifejlõdött mechanizmust is jelent. A parazita csak akkor él túl, ha nem öli meg a gazdaszervezetet: az ADCI mechanizmus által a parazitémiát csökkenteni képes ellenanyagok indukálásával a parazita biztosítja az immunizálódott gazdaszervezet elegendõ mértékû védelmét, és ezáltal biztosítja saját túlélését. A géncsalád által biztosított epitópduplikáció biztosítja, hogy egynél több géntermék töltse be ezt a létfontosságú funkciót.

30

35

40

45

50

55

6. példa: Az MSP-3–2 peptidek ADCI eredményei Az MSP-3–2 a, b, c, d, e és f peptidekkel ADCI-ben kapott eredmények megegyeznek az MSP-3–1 ugyan- 60 15

ezen peptidjeivel kapottakkal, azaz az MSP-3–2 b, c, d és e peptidek elleni ellenanyagoknak van ADCI aktivitásuk, míg az MSP-3–2 a és f ellenieknek nincs. 7. példa: Az MSP3 és GLURP elleni válaszok egymást kiegészítõ hatása longitudinális klinikai és parazitológiai követéses vizsgálatban kimutatva 7.A. Anyagok és módszerek 7.A.1. Vizsgálati terület, népesség és klinikai felügyelet OoDo falu Myanmar egy újratelepült régiója trópusi klímával, melyet forró száraz, monszun és hideg száraz évszakok jellemeznek. Ezen területen a malária stabil és hiperendemikus, az évszaktól függõ változásokkal, a fertõzések többsége (98%) Plasmodium falciparum-nak tulajdonítható, a maradék 2%¹ért a Plasmodium vivax felelõs. A maláriás rohamot 4 együttesen fennálló kritériumnak megfelelõen definiáltuk: i)¹ korrigált hónalji hõmérséklet ³38,0 °C, ii)- más klinikai megbetegedés hiánya, iii)- aszexuális P. falciparum-formák jelenléte a keneteken, és iv)- klinikai és parazitológiai javulás chloroquine-kezelés után. Két lázrohamot két külön maláriaepizódnak definiáltunk, ha ³72 h választotta el õket. A követés elsõ 33 hónapjának eredményei újabban közlésre kerültek (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). Ugyanazon vizsgált népesség ismét követésre került egy újabb évre, 1998. december 31¹ig bezárólag, ugyanazon protokoll szerint. Vénás vérmintákat 1998 szeptembere folyamán vettünk, és az 1998. január 1. és december 31. között rögzített maláriás rohamokat elemeztük a klinikai védettséggel összefüggésben.

1

HU 007 367 T2

7.A.2. Vérminták és parazitológiai vizsgálat A maláriás fertõzõdés felügyelete ujjbegybõl vett vékony és vastag vérkenetek rendszeres havi vizsgálataiban valósult meg. Egy kenetet negatívnak minõsítettünk, ha a Giemsa-festett vastag kenetben 200 olajimmerziós látótérben nem volt parazita észlelhetõ. A lázas esetekben két ujjbegybõl vett kenetet értékeltünk a chloroquine-kezelés elõtt és után. Vénás mintákat vákuumos csövekbe vettünk, a szérumokat aszeptikusan szétosztottuk, és vizsgálatig –20 °C¹on tároltuk. A 292 lakosból álló kohorból 116 lakost választottunk ki, akinél a havi kenetek 60%-ából a parazitológiai adatok rendelkezésre álltak. 7.A.3. Antigének A három rekombináns GLURP antigén a P. falciparum F32 N¹terminális R0 nem ismétlõdõ régiójából (GLURP 27–500), az R1 központi ismétlõdõ régióból (GLURP 489–705), és az R2 C¹terminális ismétlõdõ régióból (GLURP 705–1178) származtak (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). Az MSP1C-terminális 19 kDa fragmense, az MSP1 19, a Wellcome törzsbõl (MSP1-W¹19) rekombináns GST-fúziós fehérjeként került termeltetésre Escherichia coli-ban, és Dr. A. Holder, UK szíves ajándéka volt. A GST-taget enzimes emésztéssel és azt követõ affinitási kromatográfiával távolítottuk el használat elõtt. Az MSP3b szintetikus peptid (184-AKEASSYDYILGWEFGGGVPEHKKEEN210, SEQ ID No:5) tartalmazta az MSP3b B¹sejt-epitópot, mely az ADCI-ben hatékony emberi ellenanyagokkal reagál (Oeuvray, Bouharoun-Tayoun és munkatársai 1994). 7.A.4. Ellenanyag-meghatározások A három P. falciparum-eredetû antigénnel reagáló ellenanyagok szintjét emzimkötött immunoszorbens vizsgálattal (ELISA) határoztuk meg, amint az korábban leírásra került (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). Röviden, mikrotitertálcákat (Maxisorb, Nunc, Dánia) vontunk be éjszaka 4 °C¹on a rekombináns fehérjékkel vagy szintetikus peptidekkel a következõ koncentrációkban: 0,5 mg/ml (R0 és R2), 1 mg/ml (R1 és MSP1) és 5 mg/ml (MSP3b). A GLURP antigének esetében 0,05 M Na2CO3, pH=9,6 az MSP1 és MSP3 esetében foszfátpufferolt sóoldat (PBS) pH=7,4 szolgált bevonópufferként. Másnap a tálcákat PBS–0,05% Tween 20 (PBST) keverékével mostuk és 2,5% PBS¹be kevert zsírmentes tejjel blokkoltuk 2 óra hosszat. Az 1,25 % (w/v) zsírmentes tejet tartalmazó PBST-ben hígított szérumokat párhuzamos mélyületekbe adtuk, és 1 óra hosszat szobahõmérsékleten tartottuk. Minden egyes antigénhez más szérumhígítást alkalmaztunk: 1:200 a GLURP-hez, 1:100 az MSP1hez és 1:20 az MSP3-hoz. Ezen hígításokat elõzetes elõkísérletek alapján határoztuk meg, melyek több mint 10¹szeres különbséget eredményeztek a kontroll- és vizsgálati minták között. A kötõdött ellenanyagot 1:3000¹re hígított peroxidázjelzett, kecskében termelt antihuman immunoglobulinnal (Caltag Laboratories) mutattuk ki. A színt pH=5 citrátpufferben oldott o¹feni-

5

10

15

20

25

30

2

lén-diaminnal (Sigma, St. Louis, Mo.) és H2O2-dal fejlesztettük ki 30 perc alatt. Az optikai denzitást (OD) 492 nm¹en egy tálcaleolvasóval (Titertek Multiskan MCC 1340) határoztuk meg. A tálcákat minden egyes inkubációs lépés között extenzíven mostuk PBST-vel. Minden ELISA vizsgálat 6 kontrollszérumot foglalt magába, melyeket 100, maláriának sosem kitett francia véradó közül választottunk ki véletlenszerûen. Az IgG 1–4 alosztályok meghatározásához egérbõl származó monoklonális antihumán alosztály-specifikus ellenanyagokat alkalmaztunk (NL16=IgG1 (Boehringer ® ), HP6002=IgG2 (Sigma ® ), Zg4=IgG3, és RJ4=IgG4 (Immunotech®)]. Ezeket rendre 1:2 000, 1:10 000, 1:10 000, és 1:1 000 arányban hígítottuk 1,25% (w/v) zsírmentes tejet tartalmazó PBST-ben, és 1 óra hosszat szobahõmérsékleten tartottuk. 1,25% (w/v) zsírmentes tejet tartalmazó PBST-ben 1:3000¹re hígított peroxidázjelzett, kecskében termelt antiegér immunoglobulint (Caltag Laboratories®) adtunk és 1 óra hosszat inkubáltuk. A kötõdött jelzett ellenanyagot a fent leírtak szerint mutattuk ki. Az egyes izotípusspecifikus monoklonális ellenanyagok (MAb) hígítását elõzõleg határoztuk meg, mint amelyek megkülönböztetik az emberi lg alosztályokat, azaz nem adnak keresztreakciót más alosztályokkal (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). A teljes IgG és alosztályonkénti ellenanyagszinteket az ellenanyagválasz arányaként fejezzük ki, ami a vizsgálati OD átlagának és az egyidejûleg futtatott 6 kontrollszérum átlag+3 szórás értékének hányadosa. Ezen arány ³1 esetén a mintát pozitívnak minõsítettük.

7.A.5. Statisztikai elemzés A Mann–Whitney U¹teszt és a Spearman rang-sor35 rend korrelációs koefficiens került alkalmazásra a p¹értékek számítására. Az 1998-ban észlelt maláriás roham kockázata és az arányként kifejezett ellenanyagszintek összefüggésének kimutatására a JMP® szoftvert alkalmaztuk, Poisson regressziós modell alkalma40 zásával, ahol a bemeneti faktorok, mint életkor, nem, a faluban eltöltött idõ és a transzmisszió voltak kontrollálva, vagy logisztikus regressziós elemzés alkalmazásával (a maláriás roham elõfordulásával és anélkül). 7.8. Eredmények 7.B.1. P. falciparum-fertõzések a vizsgált népességben A vizsgált népesség mind a 116 alanya OoDo faluból származott, mely Myanmarban, Délkelet-Ázsiában 50 van, ahol a malária hiperendemikus (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). A P. falciparum-parazitémia elõfordulása 1998-ban 40% körül ingadozott januártól júliusig, és 20% köré esett vissza augusztustól decemberig. A klinikai malária gyakorisága, melyet a vizsgált po55 pulációban havi átlagos rohamszámként számítottunk és százalékban fejezünk ki, az év folyamán jelentõsen változott, csúcsértékét júniusban mutatva. A fertõzõ átvitelek aránya nem került meghatározásra OoDo-ban, mindazonáltal Tun-Lin, W és munkatársai (Tun-Lin, 60 Thu és munkatársai 1995) 13,7 fertõzõ csípést hatá45

16

1

HU 007 367 T2

roztak meg fejenként és évenként egy másik faluban, mely OoDo falutól 15 km¹re fekszik keletre. Ez az adat jól egyezik a Beier, Killeen és munkatársai által 1999ben leírt módszer szerint becsült, fejenként és évenként 11 fertõzõ csípéssel. A fertõzõdések többsége (98%) P. falciparum-nak volt betudható (Soe, Khin Saw és munkatársai 2001). A folyamatos klinikai felügyelet 12 hónapos idõtartama alatt a 116 falusiból 86 (74%) szenvedett el legalább egy maláriás rohamot az Anyagok és módszerek fejezet kritériumai szerint, és ezen egyének maláriára fogékonynak számítanak. Ugyanezen 12 hónapos idõszak alatt a falusiak közül 30 (26%) nem szenvedett el klinikai maláriás epizódot, ezen egyéneket klinikailag védettnek minõsítettük.

tott összefüggést a nemmel egyik vizsgált antigén esetében sem.

5

10

3. táblázat Az életkor és az egyes alosztályokba tartozó ellenanyagok szintje közötti összefüggés a vizsgált antigének esetében. A p és r¹értékeket a Spearmanféle rangkorrelációs együttható alapján számítottuk. Antigének

IgG alosztályok

p

r

MSP1

IgG1

0,0002

0,344

IgG4

0,0009

0,309

IgG2

0,0090

0,242

IgG1

0,0220

0,213

IgG3

0,0040

0,268

IgG2

0,0040

0,268

IgG3

0,0008

0,313

IgG4

0,0140

0,231

MSP3

15 7.B.2. A P. falciparum-eredetû MSP3, GLURP és MSP1 antigének ellenanyagok általi felismerése Az 1998 szeptemberében gyûjtött 116 szérumból az MSP3b 184–210 peptid (MSP3b) és a GLURP 27–500 (R0), GLURP 489–705 (R1), GLURP 705–1179 (R2), és MSP1–19 kDa C¹terminális régiót reprezentáló négy rekombináns fehérje elleni IgG és IgG alosztályszintek meghatározása történt meg. Az R2 volt az IgG ellenanyagok által leggyakrabban felismert antigén (67,2%), ezt követték az R1, MSP3b és MSP1 (mind 62%), és az R0 (58,6%). A legmagasabb OD¹értékeket az R0 és R2 ellen kaptuk, míg az MSP3b alacsonyabb OD¹értékeket eredményezett. Mindhárom GLURP régió és az MSP1 elleni IgG-szintek szignifikánsan korrelláltak az életkorral (Spearman-féle rangsorrend korrelációs koefficiens, rendre r=0,51, 0,26, 0,41, és 0,43 az R0, R1, R2, és MSP1 esetében, p<0,05), míg az MSP elleni IgG-válasz az életkortól független volt (r=0,16, p=0,17). Ami az alosztályokat illeti, az MSP1 elleni IgG1 és IgG4, az MSP3 elleni IgG2, az R0 elleni IgG1 és IgG3, az R1 elleni IgG2 és IgG3, valamint az R2 elleni IgG4 mutatott szignifikáns életkorfüggést (3. táblázat). A pozitív ellenanyagválasznak sem a szintje, sem a gyakorisága nem muta-

2

GLURP antigének R0

R1

20 R2

7.B.3. Ellenanyagválaszok és klinikai védettség A három antigénre vonatkozóan meglepõ különbségek voltak észlelhetõk az IgG alosztály-válaszokat illetõen (4. táblázat). Például az MSP1 C¹terminális 19 kDa fragmense elleni válasz csaknem kizárólag IgG1 alosztályú ellenanyagokból áll, a mediánérték 8,6-szor maga30 sabb a védett, mint a fogékony csoportban. Ugyanakkor az MSB3b epitóp elleni válaszban az IgG3 ellenanyagok dominálnak, 6,5-szeres mediánértékkel a védett egyénekben a fogékony egyénekhez képest. Bár kevésbé kifejezett, de hasonló különbségek voltak megfi35 gyelhetõk a GLURP különbözõ régióival szembeni citofil IgG alosztályok esetében, ahol IgG1 ellenanyagok domináltak a nem ismétlõdõ R0 régióval szembeni, és IgG3 ellenanyagok fordultak elõ nagyobb mértékben az R2 ismétlõdõ régió elleni válaszokban. 25

4. táblázat A különbözõ IgG alosztályokhoz tartozó, MSP1, MSP3 és GLURP antigének elleni ellenanyagszintek mediánjai (és interkvartilis tartományai) a P. falciparum maláriás rohamok ellen védettnek, illetve fogékonynak minõsített OoDobeliekben 1 évi aktív, folyamatos követés alatt. Tekintettel az elvégzett statisztikai próbák számára, a Bonferroni-féle korrekciós faktor került alkalmazásra a szignifikanciaszintek meghatározásához, és csak a p<0,0025 értékeket tekintettük szignifikánsnak (*). A p-értékeket a nem parametrikus Mann–Whitney U¹teszt alapján számítottuk. A hányados a két csoport mediánjának aránya. A # jellel jelölt értékek kismértékben különböznek. Antigén

IgG alosztály

MSP1

IgG1

9,5 (0,8–25,03)

1,1 (0,5–8,22)

IgG2

0,9 (0,8–1,26)

0,9 (0,8–1,09)

>0,05

IgG3

0,9 (0,1–2,63)

0,4 (0,0–0,81)

>0,05

IgG4

1,2 (0,8–3,01)

1,0 (0,7–1,47)

0,01

MSP3

Védett csoport (n=30)

Fogékony csoport (n=86)

p-érték

0,003 #

Hányados

8,6

IgG1

1,4 (0,8–2,4)

0,7 (0,4–7,0)

<0,001*

IgG2

1,1 (0,9–1,57)

0,8 (0,7–1,0)

>0,05

IgG3

6,5 (2,5–14,03)

1,0 (0,6–1,49)

<0,001*

6,5

IgG4

1,3 (1,0–1,82)

1,0 (0,9–1,35)

<0,001*

1,3

17

2,0

1

HU 007 367 T2

2

4. táblázat (folytatás) Antigén

R0

R1

R2

IgG alosztály

Védett csoport (n=30)

Fogékony csoport (n=86)

p-érték

Hányados

2,2

IgG1

3,9 (2,4–7,62)

1,8 (1,0–3,15)

<0,001*

IgG2

0,9 (0,4–2,5)

0,8 (0,4–1,33)

>0,05

IgG3

1,3 (0,6–3,76)

0,9 (0,3–1,44)

IgG4

0,2 (0,2–2,05)

0,6 (0,2–1,07)

0,019 >0,05

IgG1

0,3 (0,1–0,9)

0,2 (0,1–0,4)

>0,05

IgG2

0,9 (0,4–1,64)

0,6 (0,4–0,91)

>0,05

IgG3

1,2 (0,4–2,64)

0,5 (0,2–0,91)

0,039

IgG4

0,2 (0,2–0,52)

0,7 (0,2–0,94)

0,021

IgG1

2,0 (0,9–5,4)

1,1 (0,3–3,11)

0,01

IgG2

2,0 (1,0–4,02)

0,9 (0,2–1,73)

<0,001*

2,2

IgG3

6,4 (1,7–12,01)

0,9 (0,3–2,83)

<0,001*

7,1

IgG4

1,0 (0,6–1,2)

0,6 (0,4–0,85)

0,003

Tekintettel a GLURP és MSP1 elleni ellenanyagtiterek növekedésére az életkor függvényében, újravizsgáltuk a falusiak klinikai státusa és a különféle ellenanyagok közötti összefüggéseket egy logisztikus-regressziós modellben, az életkort és az összes (logaritmi- 25 zált) ellenanyagválaszt magyarázó változónak véve. Ezen paraméterek ezen modell szerinti vizsgálatakor, különösen, ha az életkor kontrollált volt, az összes ellenanyagválasz közül a malária elleni védettség legerõsebb prediktorai az MSP3b és a GLURP¹R0 elleni 30 megnövekedett IgG3-szintek (F arány=67,5; p<0,0001 és F arány=23,1; p<0,0001). Más ellenanyagok nem mutattak szignifikáns összefüggést a védettséggel. Ezzel szemben az elemzés azt mutatta, hogy az R0 és R1 elleni IgG4 szintek (F arány=4,4; 35 p=0,038 és F arány=3,9; p=0,051) növekedtek a maláriás rohamok számával, azaz bizonyos mértékig prediktívek voltak a maláriával szembeni fogékonyságra nézve. 40 7.B.4. Az IgG3-válaszok antigénspecificitása a védett falusiakban A 14A. ábra mutatja a különbözõ vérben élõ stádiumok elleni IgG3 ellenanyagválaszok mintázatát OoDoban. A legtöbb antigénspecifikus ellenanyagválaszra 45 vonatkozóan az értéktartomány széles, ami arra utalhat, hogy a „responderek”¹en belül több csoport létezhet. A klinikai malária ellen védett falusiak közül nem mindenkinek a széruma mutatott magas IgG3-értékeket egyidejûleg az MSP3b és a GLURP¹R0 ellen. Egyes 50 egyének nem várt módon alacsony IgG3-reaktivitást mutattak ezen két antigén egyikére. Megkísérelve megérteni, milyen módon védettek ezen falusiak a maláriás rohamok ellen, két alcsoportot azonosítottunk, melyek jellemzõi: a) alacsony IgG3-válaszok az MSP3 ellen (a 55 30¹ból 7 esetben) vagy b) alacsony IgG3-válaszok az R0 ellen (a 30¹ból 15 esetben). A többi három antigén elleni IgG3 ellenanyagszinteket szintén mértük (14B. ábra). Az MSP3b ellen alacsony IgG3-választ (IgG3arány=1,26±0,22) mutató 7 védett egyénben (átlagélet- 60 18

kort 1 standard hiba=33,9±7,0 év) erõs IgG3-válaszokat találtunk az R0 (IgG3-arány=9,09±3,41) és R2 (IgG3arány=8,36±5,86) ellen. A többi 15 egyénbõl álló második alcsoportnál (24,7±4,3 életév), akik a GLURP¹R0 elleni alacsony IgG3-válasz (IgG3 arány=0,55±0,08) ellenére védettek voltak, a fordított helyzetet találtuk (14C. ábra): magas IgG3-ellenanyagválaszt észleltünk az MSP3b ellen (IgG3-arány=10,45±2,07) és kisebbeket a GLURP¹R2 ellen (IgG3-arány=4,43±0,80). Azoknál, akik csak egy antigénre adtak választ, a titerek jellemzõen magasabbak voltak, mint a mindkét antigénre reagálók között (4. táblázat). Az OoDo faluban eltöltött évek száma nem különbözött szignifikánsan az MSP3 ellen alacsony választ mutatók (20,43±4,70 év helybenlakási idõtartam) és az R0 ellen alacsony választ mutatók (18,7±10,6 év helybenlakási idõtartam) csoportjai között. Az 1998-ban védettnek minõsített 30 egyén közül 13¹tól korábban már vettünk vérmintát 1993-ban, és így össze tudtuk hasonlítani az anti-MSP3 és anti¹RO IgG1 és IgG3 ellenanyagok relatív szintjeit 5 év különbséggel. Amint azt a 14D. és 14E. ábrák mutatják, nagyobb változások nem voltak detektálhatók a két antigén elleni specifikus IgG1-szintekben. Ezzel szemben mind az MSP3, mind a GLURP elleni IgG3 ellenanyagszintek emelkedtek 1993 és 1998 között. Az 1998-ban emelkedett MSP3-elleni IgG3-szinteket mutató 7 egyén alcsoportja esetében (14D. ábra) a különbség 1,67szeres emelkedésnek felelt meg (p=0,11). Az 1998ban emelkedett R0 elleni IgG3-szinteket mutató 6 egyén alcsoportja esetében (14E. ábra) a különbség markánsabb, 3,93-szoros emelkedés (p=0,05). Az 1998-ban emelkedett MSP3 elleni IgG3-szinteket mutató 6 egyén 5 évvel korábban is már magas titerrel rendelkezett, ami arra utal, hogy egy fenntartott antiMSP3 IgG3-válasz miatt már 1993-ban is védettek voltak, amikor életkoruk 18,2±9,8 életév volt. Ezzel szemben a GLURP¹re vonatkozóan a 7 egyén, akik erõs anti¹R0 IgG3-választ mutattak 1998-ban, lényegesen alacsonyabb anti¹RO IgG3-válaszokat mutatott 5 évvel

1

HU 007 367 T2

korábban (p=0,0157), amikor életkoruk 23,7±6,9 életév volt. Tehát drasztikus változás volt az 1998-ban R0 elleni IgG3 révén védett 7 egyénben, és védettségük 5 évvel korábban feltehetõen MSP3 elleni IgG3-nak volt köszönhetõ. 7.C. Megbeszélés A jelen tanulmány az elsõ, mely összefüggést mutat ki Délkelet-Ázsiában egyes antigénspecifikus ellenanyagválaszok és a klinikai malária elleni védettség között. A GLURP és MSP3 elleni pozitív ellenanyagválaszok elõfordulása magas volt OoDo-ban, 58,6%-tól (R0) 67,2%¹ig (R2). Ezen megfigyelés összhangban van azzal az eredménnyel, mely szerint a GLURP¹n és MSP3¹n belüli B¹sejt-epitópok nagymértékben konzerváltak a P. falciparum laboratóriumi vonalai és az afrikai, valamint ázsiai terepizolátumok között (Huber, Felger és munkatársai 1997), (McColI és Anders 1997; de Stricker, Vuust és munkatársai 2000). Az MSP1W¹19 elleni ellenanyagok elõfordulása szintén magas volt, a Gambia és Sierra Leone területén (Egan, Morris és munkatársai 1996), valamint Ghanában (Dodoo, Theander és munkatársai 1999) találtaknál csaknem kétszer magasabb, ami arra utal, hogy a Wellcome törzszsel rokon törzs lehet gyakori OoDo-ban. A legmagasabb ELISA-titereket a rekombináns GLURP RO¹ és R2¹régiók és az MSP1 ellen találtuk. A GLURP¹R0, ¹R1, ¹R2 és MSP1 ELISA-titerek különbségei nagy valószínûséggel a szérumellenanyagok reaktivitásának különbségeit tükrözik. Ezzel szemben az MSP3-ELISA ennél alacsonyabb értékeket adott, bár ezen eltérés legalábbis részben az egyetlen vagy korlátozott számú epitópot tartalmazó rövid peptid alkalmazásának is betudható, szemben a GLURP és MSP1 esetében alkalmazott rekombináns fehérjékkel, melyek számos epitópot definiálnak (Theisen, Soe és munkatársai 2000). Az összes GLURP-régió és az MSP1 elleni IgGszintek összefüggést mutattak az életkorral (p<0,05), míg ezzel ellentétben az MSP3 elleni IgG-válasz nem az életkorral nem függött össze. Ami az IgG alosztályokat illeti, közülük számosnak az esetében találtunk összefüggést az életkorral; ezen változások tükrözhetik a maláriaparazitáknak kitettség idõtartamát vagy az immunrendszer fokozatos érését az idõ múlásával. Statisztikailag szignifikáns növekedést mutattak az R0 és MSP3 elleni IgG3 válaszok az OoDo-ban élõ védett egyének között a nem védettekhez viszonyítva. Ezen eredmények összhangban vannak Dodoo és munkatársai (Dodoo, Theisen és munkatársai 2000) adataival, akik azt találták, hogy az R0 és R2 elleni citofil ellenanyagválaszok a védettség erõs prediktorai a ghanai gyermekek körében, nemkülönben Oeuvray és munkatársai adataival, akik következetes korrelációt találtak a védettség és a GLURP¹R0 és R2 elleni emelkedett IgG3-szint között Dielmóban, Nyugat-Afrikában (Oeuvray, Theisen és munkatársai 2000). Hasonlóképpen az MSP3-specifikus IgG3 válaszokat korábban a klinikai malária elleni védettséggel összefüggésben lévõnek találták Dielmóban. Együttesen ezen eredmé-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

2

nyek arra utalnak, hogy ugyanazon kritikus epitópok elleni, ugyanazon alosztályú IgG-válaszok vesznek részt a P. falciparum-malária elleni védettség fokozatos kifejlõdésében a maláriaendemikus területeken élõ afrikai és ázsiai népességekben. Ráadásul a jelen kutatás szignifikáns negatív korrelációt talált az R0 és R1 elleni nem citofil ellenanyagok szintjei és a klinikai védettség között. Tehát egyfelõl pozitív összefüggés van a citofil IgG alosztályú válaszok és a védettség között, másfelõl negatív összefüggés van az ugyanazon epitópspecificitású nem citofil IgG alosztályú válaszok és a védettség között. Ezen epidemiológiai eredmény összhangban van azon in vitro megfigyeléssel, hogy nem citofil ellenanyagok képesek gátolni a merozoiták és az emberi monociták közötti, ugyanazon antigénnel szemben képzõdött citofil ellenanyagok által közvetített hídképzõdést, ily módon csökkentve azok parazitasokszorozódást gátló, ADCI mechanizmusú hatását (Bouharoun-Tayoun és Druilhe 1992). Míg az OoDo-beli védett lakosok többsége magas IgG3-válasszal rendelkezett mind az MSP3, mind a GLURP ellen, számos egyén tûnt szintén védettnek, akinek alacsony vagy majdnem semmilyen válasza nem volt ezen két antigén egyikére. A feltalálók az találták, hogy az összes, alacsony GLURP-RO-specifikus IgG3választ mutató egyén szignifikánsan emelkedett antiMSP3 IgG3 ellenanyagszinttel rendelkezett, és fordítva. Ezen megfigyelés arra utal, hogy a GLURP és MSP3 elleni ellenanyagok egymást kiegészítõ módon hathatnak az immunizálódott egyénekben a parazita szaporodásának gátlásában. Ez lényeges ezen ellenanyagok ADCI mechanizmusbeli szerepének megítélésében. Csak számos antigén egyidejû vizsgálata fedte fel ezt a kiegészítõ hatást. Ezen eredmény arra ösztönöz, hogy egyidejûleg számos antigén vizsgálatára kerüljön sor a kiegészítõ és lehetséges ellentétes hatások felderítése céljából, mely hatások következményekkel bírhatnak a kombinált vakcinák tervezése nézõpontjából. Következtetésképpen a jelen kutatás megmutatja, hogy (1) az MSP3 és GLURP antigénekben a kritikus epitópok azok, melyek a leginkább konzerváltak, védõhatású ellenanyagok célpontjai a világ földrajzilag távoli, endemikus területein. (2) Az MSP3 és GLURP¹R0 elleni IgG3 ellenanyagok a klinikai malária elleni védettség legerõsebb prediktorai egy afrikai és egy ázsiai helyzetben. (3) Ázsiában és Afrikában is a védett állapot eléréséhez kritikus antigének (nevezetesen az MSP3b és GLURP, melyek ADCI-ben aktív ellenanyagokat indukálnak) elleni citofil ellenanyagok termelése szükséges. (4) Ezen két antigén között, úgy tûnik, kiegészítõ hatás áll fenn. Az IgG3-válaszok hasonló hatással lehetnek a maláriás rohamok kivédésében, feltéve, hogy tartósan fennállnak az egyik antigénnel szemben, ha a válaszok a másikkal szemben alacsony szintûek vagy csaknem hiányoznak. (5) Az egy adott antigénen jelen lévõ különbözõ B¹sejt-epitópok elleni válaszok egymástól függetlenül fejlõdõnek tûnnek, és a felismerés szintje idõben változhat. Az ADCI mai napig azonosított két fõ célpontja elleni válaszok egymást kiegészítõ volta az elsõ ízben

1

HU 007 367 T2

szolgáltat racionális alapot ezen két antigén kombinálására egy hibrid vakcinakészítményben. Emellett preklinikai állatkísérletekben a hibrid vakcinával végzett immunogenitási kísérletek további támogatást nyújtanak ezen antigénkombináció számára, mivel javított immunogenicitást mutatnak mindkét molekula elleni jól kiegyensúlyozott, egyenletes válaszokkal. Hivatkozások Badell, E., C. Oeuvray, et al. (2000). „Human malaria in immunocompromised mice: an in vivo model to study defense mechanisms against Plasmodium falciparum.” J Exp Med 192(11): 1653–60. Beier, J. C., G. F. Killeen, et al. (1999). „Short report: entomologic inoculation rates and Plasmodium falciparum malaria prevalence in Africa.” Am J Trop Med Hyg 61(1): 109–13. BenMohamed, L., Y. Belkaid, et al. (2002). „Systemic immune responses induced by mucosal administration of lipopeptides without adjuvant”. Eur J Immunol 32(8): 2274–81. Bottius, E., L. BenMohamed, et al. (1996). „A novel Plasmodium falciparum sporozoite and liver stage antigen (SALSA) defines major B, T helper, and CTL epitopes”. J Immunol 156(8): 2874–84. Bouharoun-Tayoun, H. and P. Druilhe (1992). „Antibodies in falciparum malaria: what matters most, quantity or quality?” Mem Inst Oswaldo Cruz 87 Suppl 3: 229–34. Bouharoun-Tayoun, H., C. Oeuvray, et al. (1995). „Mechanisms underlying the monocyte-mediated antibody-dependent killing of Plasmodium falciparum asexual blood stages:” J Exp Med 182(2): 409–18. Brahimi, K., J. L. Perignon, et al. (1993). „Fast immunopurification of small amounts of specific antibodies on peptides bound to ELISA plates.” J Immunol Methods 162(1): 69–75. Dame, J. B., J. L. Williams, et al. (1984). „Structure of the gene encoding the immunodominant surface antigen on the sporozoite of the human malaria parasite Plasmodium falciparum.” Science 225(4662): 593–9. Daubersies, P., A. W. Thomas, et al. (2000). „Protection against Plasmodium falciparum malaria in chimpanzees by immunization with the conserved preerythrocytic Iiver-stage antigen 3.” Nat Med 6(11): 1258–63. de Stricker, K,, J. Vuust, et al. (2000). „Conservation and heterogeneity of the glutamate-rich protein (GLURP) among field isolates and laboratory lines of Plasmodium falciparum”. Mol Biochem Parasitol 111(1): 123–30. Dodoo, D., T. G. Theander, et al. (1999). „Levels of antibody to conserved parts of Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 in Ghanaian children are not associated with protection from clinical malaria”. Infect Immun 67(5): 2131–7. Dodoo, D., M. Theisen, et al. (2000). „Naturally acquired antibodies to the glutamate-rich protein are associated with protection against Plasmodium falciparum malaria.” J Infect Dis 181(3): 1202–5.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 20

2

Egan, A. F., J. Morris, et al. (1996). „Clinical immunity to Plasmodium falciparum malaria is associated with serum antibodies to the 19¹kDa C¹terminal fragment of the merozoite surface antigen, PfMSP¹1.” J Infect Dis 173(3): 765–9. Escalante, A. A., H. M. Grebert, et al. (2001). „Polymorphism in the gene encoding the apical membrane antigen¹1 (AMA¹1) of Plasmodium falciparum. X. Asembo Bay Cohort Project”. Mol Biochem Parasitol 113(2): 279–87. Fidock, D. A., E. Bottius, et al. (1994). „Cloning and characterization of a novel Plasmodium falciparum sporozoite surface antigen, STARP”. Mol Biochem Parasitol 64(2): 219–32. Gras-Masse, H., B. Georges, et al. (1999). „Convergent peptide libraries, or mixotopes, to elicit or to identify specific immune responses.” Curr Opin Immunol 11(2): 223–8. Guerih-Marchand, C., P. Druilhe, et al. (1987). „A liver-stage-specific antigen of Plasmodium falciparum characterized by gene cloning”. Nature 329(6135): 164–7. Huber, W., I. Felger, et al. (1997). „Limited sequence polymorphism in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3”. Mol Biochem Parasitol 87(2): 231–4. Khusmith, S. and P. Druilhe (1983). „Cooperation between antibodies and monocytes that inhibit in vitro proliferation of Plasmodium falciparum.” Infect Immun 41(1): 219–23. Knapp, B., E. Hundt, et al. (1989). „Molecular cloning, genomic structure and localization in a blood stage antigen of Plasmodium falciparum characterized by a serine stretch”. Mol Biochem Parasitol 32(1): 73–83. Lunel, F. and P. Druilhe (1989). „Effectorcells involved in nonspecific and antibody-dependent mechanisms directed against Plasmodium falciparum blood stages in vitro.” Infect Immun 57(7): 2043–9. Marshall, V. M., W. Tieqiao, et al. (1998). „Close linkage of three merozoite surface protein genes on chromosome 2 of Plasmodium falciparum.” Mol Biochem Parasitol 94(1): 13–25. McColl, D. J. and R. F. Anders (1997). „Conservation of structural motifs and antigenic diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein¹3 (MSP¹3)”. Mol Biochem Parasitol 90(1): 21–31. Miller, L. H., T. Roberts, et al. (1993). „Analysis of sequence diversity in the Plasmodium falciparum merozoite surface protein¹1 (MSP¹1)”. Mol Biochem Parasitol 59(1): 1–14. Oeuvray, C., H. Bouharoun-Tayoun, et al. (1994). „Merozoite surface protein¹3: a malaria protein inducing antibodies that promote Plasmodium falciparum killing by cooperation with blood monocytes”. Blood 84(5): 1594–602. Oeuvray, C., M. Theisen, et al. (2000). „Cytophilic immunoglobulin responses to Plasmodium falciparum glutamate-rich protein are correlated with protection against clinical malaria in Dielmo, Senegal”. Infect Immun 68(5): 2617–20.

1

HU 007 367 T2

Peterson, M. G., V. M. Marshall, et al. (1989). „Integral membrane protein located in the apical complex of Plasmodium falciparum”. Mol Cell Biol 9(7): 3151–4. Pleass, R. J. and J. M. Woof (2001). „Fc receptors and immunity to parasites”. Trends Parasitol 17(11): 545–51. Robson, K. J., J. R. Hall, et al. (1988). „A highly conserved amino-acid sequence in thrombospondin, properdin and in proteins from sporozoites and blood stages of a human malaria parasite”. Nature 335(6185): 79–82. Roussillon, C. (1999). „Correlates of Immune protection in malaria”. MIM African Malaria Conference, 14–19 March. Durban South Africa. Simmons, D., G. Woollett, et al. (1987). „A malaria protein exported into a new compartment within the host erythrocyte”. Embo J 6(2): 485–91. Soe, S., A. Khin Saw, et al. (2001). Tremunition against Plasmodium falciparum in a malaria hyperendemic village in Myanmar”. Trans R Soc Trop Med Hyg 95(1): 81–4. Theisen, M., D. Dodoo, et al. (2001). „Selection of glutamate-rich protein long synthetic peptides for vaccine development: antigenicity and relationship with clinical protection and immunogenicity”. Infect Immun 69(9): 5223–9. Theisen, M., S. Soe, et al. (2000). „Identification of a major B¹cell epitope of the Plasmodium falciparum glutamate-rich protein (GLURP), targeted by human

2

antibodies mediating parasite killing”. Vaccine 19(2–3): 204–12. Theisen, M, S. Soe, et al. (1998). „The glutamaterich protein (GLURP) of Plasmodium falciparum is a 5 target for antibody-dependent monocyte-mediated inhibition of parasite growth in vitro”. Infect Immun 66(1): 11–7. Thomas, A. W., D. A. Carr, et al. (1990). „Sequence comparison of allelic forms of the Plasmodium falcipa10 rum merozoite surface antigen MSA2”. Mol Biochem Parasitol 43(2): 211–20. Trucco, C., D. Fernandez-Reyes, et al. (2001). „The merozoite surface protein 6 gene codes for a 36 kDa protein associated with the Plasmodium falciparum 15 merozoite surface protein¹1 complex”. Mol Biochem Parasitol 112(1): 91–101. Tun-Lin, W,, M. M. Thu, et al. (1995). „Hyperendemic malaria in a forested, hilly Myanmar village”. J Am Mosq Control Assoc 11(4): 401–7. 20 A szekvencialistában található kötetlen szövegrészek fordítása: <223>¹as kódhoz tartozó kötetlen megjelölések kizárólag gének (illetve fehérjék) magyarra nem fordít25 ható megjelöléseit tartalmazzák, bizonyos helyeken a „like motif” kiegészítéssel, ami „¹szerû motívum”¹ot jelent, vagyis a megjelölt génben található, megjelölt szekvenciamotívumhoz hasonló szekvenciamotívumot.

Szekvencialista <110> INSTITUT PASTEUR <120> MSP-3-LIKE FAMILY OF GENES <130> B5767 – AD/LV/KN <140> EP 03292673.5 <141> 2003–10–24 <160> 33 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1065 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1).. (1065) <223> MSP 3. 1 <400> 1

atgaaaagtt ttataaatat tactctttca ttatttttgt tacatttata tatttatata aataatgttg ctagtaaaga aattgtaaaa aaatataatc ttaacttaag aaatgcaata ttgaataata attctcaaat agaaaatgaa gaaaatgtaa atactacaat tactggtaat 21

60 120 180

HU 007 367 T2

gattttagtg gcttccgaag gaagctgcta gaagcatgta gatgatgctg gaaaaagcaa gttttaaaag ggcgttccag gataaggaaa gaagaaacag agtgaagatg aaagaacaag cagaatttaa agcatcatga aaagatttag

gtggagaatt atgctgaaaa aagaagcagt cagctgcttc aaaaatcttc aaaatgctta caaaagaagc aacacaaaaa atatatctaa aagaagaaga aagaagaaga aaaaagaaca tttctaaaaa aaactttagc tagaagaatt

tttgtggcct agctgctaat aaatttaaag aaaggcaaag aaaagctgat tgaaaaggca ttctagttat agaagaaaat ggaaaatgat acttgaagaa agaagaagaa aagtaatgaa ccagaataat tggtttaatc atccaaatat

ggttatacgg gatgctgaaa gaatctgata aaagctgttg agtatttcta aaaaatgctt gattatattt atgttatcac gatgtattag aaaaatgaag gaagaaaagg aataatgatc aatgagaaaa aagggaaata tttaaaaatc

aagaattaaa atgcttcaaa aatcttatac aaactgcttt caaaaacaaa atcaaaaagc taggttggga atttatatgt atgagaagga aagaaacaga aagaagaaaa aaaaaaaaga acgtaaaaga atcaaataga attaa

agctaaaaaa agaggcagaa aaaagcaaaa aaaggcaaaa agaatatgct aaaccaagct atttggagga ttcttcaaag agaagaggca atcagaaata tgacaaaaaa tatggaagca agctgctgaa ttctacctta

<210> 2 <211> 354 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(354) <223> MSP 3.1 <400> 2

Met Lys Ser Phe Ile Asn Ile Thr Leu Ser Leu Phe Leu Leu His Leu 1 5 10 15 Tyr Ile Tyr Ile Asn Asn Val Ala Ser Lys Glu Ile Val Lys Lys Tyr 20 25 30 Asn Leu Asn Leu Arg Asn Ala Ile Leu Asn Asn Asn Ser Gln Ile Glu 35 40 45 Asn Glu Glu Asn Val Asn Thr Thr Ile Thr Gly Asn Asp Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Glu Phe Leu Trp Pro Gly Tyr Thr Glu Glu Leu Lys Ala Lys Lys 65 70 75 80 Ala Ser Glu Asp Ala Glu Lys Ala Ala Asn Asp Ala Glu Asn Ala Ser 85 90 95 Lys Glu Ala Glu Glu Ala Ala Lys Glu Ala Val Asn Leu Lys Glu Ser 100 105 110 Asp Lys Ser Tyr Thr Lys Ala Lys Glu Ala Cys Thr Ala Ala Ser Lys 115 120 125 Ala Lys Lys Ala Val Glu Thr Ala Leu Lys Ala Lys Asp Asp Ala Glu 130 135 140 Lys Ser Ser Lys Ala Asp Ser Ile Ser Thr Lys Thr Lys Glu Tyr Ala 145 150 155 160 Glu Lys Ala Lys Asn Ala Tyr Glu Lys Ala Lys Asn Ala Tyr Gln Lys 165 170 175 22

240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1065

HU 007 367 T2

Ala Asn Gln Ala Val Leu Lys Ala Lys Glu Ala Ser Ser Tyr Asp Tyr 180 185 190 Ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Val Pro Glu His Lys Lys Glu 195 200 205 Glu Asn Met Leu Ser His Leu Tyr Val Ser Ser Lys Asp Lys Glu Asn 210 215 220 Ile Ser Lys Glu Asn Asp Asp Val Leu Asp Glu Lys Glu Glu Glu Ala 225 230 235 240 Glu Glu Thr Glu Glu Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Glu Glu Glu Thr 245 250 255 Glu Ser Glu Ile Ser Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 260 265 270 Lys Glu Glu Glu Asn Asp Lys Lys Lys Glu Gln Glu Lys Glu Gln Ser 275 280 285 Asn Glu Asn Asn Asp Gln Lys Lys Asp Met Glu Ala Gln Asn Leu Ile 290 295 300 Ser Lys Asn Gln Asn Asn Asn Glu Lys Asn Val Lys Glu Ala Ala Glu 305 310 315 320 Ser Ile Met Lys Thr Leu Ala Gly Leu Ile Lys Gly Asn Asn Gln Ile 325 330 335 Asp Ser Thr Leu Lys Asp Leu Val Glu Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Lys 340 345 350 Asn His <210> 3 <211> 1116 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1116) <223> MSP 3.2 <400> 3

atgaataaga aataacttta atgtataata gaaaatagta gtagatgata tatgatatac cttcctataa aagggagcaa tctgaaacaa aatatacttg aagacagaat gatgagaatg gaagaaacag

tttataatat tcagaaatga acgataaaat ttcacgaatc taacatacaa aagcaacata aacaaagtgg atggtttaac ataaaaatcc gatgggaatt atttactaga aacaagtaat aaacagaaaa

tacttttctt acttataaac attaagtaaa tggacataag aaaaaaaaat tcaatttcct agaaaatcaa tggtgcaaca tacttctcat tggaggaggt acaaataaaa agaggaccct tttggaaaca

ttcattcttt gaaaaaaacc aatgaagtag attgatgggg gttgatgatt tctacatcag tatactgtta gaaaatatta agtaatagta gctcctcaaa attccatcat caagaagata gaagatgata 23

taaacttata ataatttaag atactaatat aagaagtttt cagaaattcc gaggaaataa catctatatc cacaagttgt ctacaacttc atggagctgc gggatagaaa ataaagatga ataatgaaga

tataaatgaa aaatggttca agaaagtaac aaaagctaat tttttctggt tgtaattcca aggtattcaa acaagcaaac tctgaataat agaagataaa taacatcccc agatgaagat gatagaagaa

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780

HU 007 367 T2

aatgaagaag aaggaagaag acaaatgaag ttaatttcta aaaacattgg gtacaagaaa

atgacataga aagaaaaaaa ttaaagagga ataagaataa ttggattatt tgatccatct

tgaagaaagt ggaagaaaaa acaaaaatat aaagaatgat taatgaaaaa atttagtaat

gtagaagaaa aaagaagaaa agttcaccaa gaaacaaaaa aatgagatag aattaa

aggaagaaga aaaaaccaga gtgatataaa agactgctga attctactat

ggaagaaaaa caatgaaatt tgcccaaaat aaatatagtt aaataattta

<210> 4 <211> 371 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(371) <223> MSP 3.2 <400> 4

Met Asn Lys Ile Tyr Asn Ile Thr Phe Leu Phe Ile Leu Leu Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Ile Asn Glu Asn Asn Phe Ile Arg Asn Glu Leu Ile Asn Glu Lys 20 25 30 Asn His Asn Leu Arg Asn Gly Ser Met Tyr Asn Asn Asp Lys Ile Leu 35 40 45 Ser Lys Asn Glu Val Asp Thr Asn Ile Glu Ser Asn Glu Asn Ser Ile 50 55 60 His Glu Ser Gly His Lys Ile Asp Gly Glu Glu Val Leu Lys Ala Asn 65 70 75 80 Val Asp Asp Ile Thr Tyr Lys Lys Lys Asn Val Asp Asp Ser Glu Ile 85 90 95 Pro Phe Ser Gly Tyr Asp Ile Gln Ala Thr Tyr Gln Phe Pro Ser Thr 100 105 110 Ser Gly Gly Asn Asn Val Ile Pro Leu Pro Ile Lys Gln Ser Gly Glu 115 120 125 Asn Gln Tyr Thr Val Thr Ser Ile Ser Gly Ile Gln Lys Gly Ala Asn 130 135 140 Gly Leu Thr Gly Ala Thr Glu Asn Ile Thr Gln Val Val Gln Ala Asn 145 150 155 160 Ser Glu Thr Asn Lys Asn Pro Thr Ser His Ser Asn Ser Thr Thr Thr 165 170 175 Ser Leu Asn Asn Asn Ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala Pro 180 185 190 Gln Asn Gly Ala Ala Glu Asp Lys Lys Thr Glu Tyr Leu Leu Glu Gln 195 200 205 Ile Lys Ile Pro Ser Trp Asp Arg Asn Asn Ile Pro Asp Glu Asn Glu 210 215 220 24

840 900 960 1020 1080 1116

HU 007 367 T2

Gln Val Ile Glu Asp Pro Gln Glu Asp Asn Lys Asp Glu Asp Glu Asp 225 230 235 240 Glu Glu Thr Glu Thr Glu Asn Leu Glu Thr Glu Asp Asp Asn Asn Glu 245 250 255 Glu Ile Glu Glu Asn Glu Glu Asp Asp Ile Asp Glu Glu Ser Val Glu 260 265 270 Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Glu Glu Glu Glu Lys Lys Glu 275 280 285 Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Pro Asp Asn Glu Ile Thr Asn Glu Val 290 295 300 Lys Glu Glu Gln Lys Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Ile Asn Ala Gln Asn 305 310 315 320 Leu Ile Ser Asn Lys Asn Lys Lys Asn Asp Glu Thr Lys Lys Thr Ala 325 330 335 Glu Asn Ile Val Lys Thr Leu Val Gly Leu Phe Asn Glu Lys Asn Glu 340 345 350 Ile Asp Ser Thr Ile Asn Asn Leu Val Gln Glu Met Ile His Leu Phe 355 360 365 Ser Asn Asn 370 <210> 5 <211> 1275 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1275) <223> MSP 3.3 <400> 5

atgaaaaaaa ttagtacaaa tcagaaaatg gatttttcag actggggttg cctaaagaga aacgaatctg atgcttggta aatcttaacg tttggtccta gttactcaaa ccgactaaaa gattcaaaaa gatgggatag aaacaaaaaa aaggaaaatg tacgaaaacg gaagaaatat

tcgtgaatat acgaaaatgt gaataaaaag cattttctta aaagtgtaaa ataaaattag atagtagttt ctgaaaagga acaattccaa ctgtggttca aaacaactaa acactaatac caaaatcaaa aatttagtgg atgttttaga aggatgttaa aaattataaa tagaagaaaa

aatattttat aaataaatct tctaaaggat tggtggttat agctattgat tactgaacca agaaaatgat aggttctcca atggtctgat tgatgttagt agatattggt atatgagaag tgaaaaagga tggtttatat atcagtaaat agatgaaaag gcaaccagaa taaaaatgat

atcttatatt aatctaagaa gaagatgaac cctatttatg ggggaaagtg ggagcagacc aaaaaaaaaa gatagtcatg tttcttaaaa gatacccttt agtactttac aaaaatgaaa agacctccta tttaatgaga ttaacatcgt gatgaagatg gacatattgg acagtagata 25

tatatatata aaggattatc atattaatat aaactacagg gtacttcaat aggtgtctat aagaaaacgt atagttctaa atatcgtaac cagatatatc ttgacttttt ataaaaatgt catattctcc aaaagtcgac gggataaaga atgaagaaga atgaggaaga caagtgattt

taaaagaaac tactaataat tataggagat aagtctagga ggattctaaa tggattggtc aaaaaaagaa ggaaaaatta gtttggtggt taaagatgaa tttaccatta atcaaatgta tattctggat tgaagaaaat ggatattgtt agaagaaaaa agtattagaa agaaaagaaa

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080

HU 007 367 T2

aatataccag gataatgata aatggaaaaa tttacatata

atttatcaaa cgataataat tattatagtt taatttataa gaactataag aatcagaaaa aactgcacaa acattaatca cagctctgat aagtttatta atgaattaga tgctaccata agaagattaa aacataggtt tatggaattt attaa

<210> 6 <211> 424 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(424) <223> MSP 3.3 <400> 6

Met Lys Lys Ile Val Asn Ile Ile Phe Tyr Ile Leu Tyr Leu Tyr Ile 1 5 10 15 Tyr Lys Arg Asn Leu Val Gln Asn Glu Asn Val Asn Lys Ser Asn Leu 20 25 30 Arg Lys Gly Leu Ser Thr Asn Asn Ser Glu Asn Gly Ile Lys Ser Leu 35 40 45 Lys Asp Glu Asp Glu His Ile Asn Ile Ile Gly Asp Asp Phe Ser Ala 50 55 60 Phe Ser Tyr Gly Gly Tyr Pro Ile Tyr Glu Thr Thr Gly Ser Leu Gly 65 70 75 80 Thr Gly Val Glu Ser Val Lys Ala Ile Asp Gly Glu Ser Gly Thr Ser 85 90 95 Met Asp Ser Lys Pro Lys Glu Asn Lys Ile Ser Thr Glu Pro Gly Ala 100 105 110 Asp Gln Val Ser Ile Gly Leu Val Asn Glu Ser Asp Ser Ser Leu Glu 115 120 125 Asn Asp Lys Lys Lys Lys Glu Asn Val Lys Lys Glu Met Leu Gly Thr 130 135 140 Glu Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ser His Asp Ser Ser Lys Glu Lys Leu 145 150 155 160 Asn Leu Asn Asp Asn Ser Lys Trp Ser Asp Phe Leu Lys Asn Ile Val 165 170 175 Thr Phe Gly Gly Phe Gly Pro Thr Val Val His Asp Val Ser Asp Thr 180 185 190 Leu Ser Asp Ile Ser Lys Asp Glu Val Thr Gln Lys Thr Thr Lys Asp 195 200 205 Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asp Phe Phe Leu Pro Leu Pro Thr Lys Asn 210 215 220

26

1140 1200 1260 1275

HU 007 367 T2

Thr Asn Thr Tyr Glu Lys Lys Asn Glu Asn Lys Asn Val Ser Asn Val 225 230 235 240 Asp Ser Lys Thr Lys Ser Asn Glu Lys Gly Arg Pro Pro Thr Tyr Ser 245 250 255 Pro Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Phe Ser Gly Gly Leu Tyr Phe Asn 260 265 270 Glu Lys Lys Ser Thr Glu Glu Asn Lys Gln Lys Asn Val Leu Glu Ser 275 280 285 Val Asn Leu Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp Ile Val Lys Glu Asn Glu 290 295 300 Asp Val Lys Asp Glu Lys Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Glu Asn Glu Ile Ile Lys Gln Pro Glu Asp Ile Leu Asp Glu Glu 325 330 335 Glu Val Leu Glu Glu Glu Ile Leu Glu Glu Asn Lys Asn Asp Thr Val 340 345 350 Asp Thr Ser Asp Leu Glu Lys Lys Asn Ile Pro Asp Leu Ser Asn Asp 355 360 365 Asn Asn Tyr Tyr Ser Leu Ile Tyr Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Asp Lys 370 375 380 Ser Glu Lys Thr Ala Gln Thr Leu Ile Thr Ala Leu Ile Ser Leu Leu 385 390 395 400 Asn Gly Lys Asn Glu Leu Asp Ala Thr Ile Arg Arg Leu Lys His Arg 405 410 415 Phe Met Glu Phe Phe Thr Tyr Asn 420 <210> 7 <211> 2094 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2094) <223> MSP 3.4 <400> 7

atgaagaaaa aaaaatatca ctaaataata tctaaaattg gttggacaag ttagaaggaa gatggtagtg cataataaat ccaaaaaatt

tatatagtat aatgcaatga gtttagattt aagaacatga atgtgcctat atagtattga cttttggtgg gtcctgatga ctactggtag

tttcttttct cctaataaat aacaaatgga aaataaatct tacatcggta cgatactaaa tggactccct aaatttttgt aaatggggat

ttatttattt tataatgatt ttaaataaca taccaaaata tattcttcta ggtcttagtg ttttctggtt aagggtatta tggattagtg 27

tgaatcttca cgaatctaag aagataacag aagataataa aaattataaa ttactaatag attctcctct aaaatgtctt tggctgttaa

tatatatata aaacggatta ttttattgat tatctctatc tgctaatgat tggatttgat acaaggaaat atcctgtcct agaaagttca

60 120 180 240 300 360 420 480 540

HU 007 367 T2

actacaaata aacaaggttt gctttaggag acagctataa gactatcaaa agtaatgaca gatgcattca aatatggaca agcgaatata aaccaggatg aagcattatg tttgaaaaag aaagaaatat tttaaagata ctaacaacca caacgaggga gttgatcaaa tacaacaata actgaagaaa ataaagcata gatgaagaag aatgaaacaa gaaaataagg gttgacgaag aatgttgctg gaaactattt

aaggtgttct ggcatcgaat aatcaaatgc aatatggatt ttactaaaaa aaattaaaaa tgtgtggata gaataccaca aaaataagtt attcacaact aagaatgggt aaaaaagtaa gttctgaatg acgttacact cttctttatc atataacaac ccaacagatt atttagagcg aatattctct atgaggatgt aattggaaaa atgatacgga aaaaagaact attcatatcg aatctatagt ttaagggttt

tgttcccccc caaagacgag tttaatgaaa ttcagatatg tataaatagg acgtgtagac taaagttcat atatcttaga tgaggatgta attagaaata taatagaagg atatgaagat tgattgtaaa tcttaaagca aacgtctatt atctcaagga agataatgta tggattgggt agaattaata gagagaagaa tgaaggagaa agatacggac cagtaatcaa aatactatca gaaaaaacta gacagaagat

agaagaacaa aaaaatttta cattataaag ggagatataa gcattagata tggtgggaag atcggaaata tggtttagag ataaaattat tcaaaaaagg agacctgaat actaaaagta tataaagatt gtaattgata aatagtgtta aattcacacc aactctgtaa tctggtgctc aaattaacat atagaagaac gaaacaaaag gatactgaag caacaaagtg gtaagttata tttagtttat atgacagatt

aattatgtct aagaagaatt aaaaaaatct taaagggaac aaatattacg ctaataaaag aaccatgtcc aatggggaac gtaatatcca ataaatgtaa ggaaaggcca taactgctga tggataatac acaaaaaaaa gggattctag gtgcaactgt cgcaaagagg ttcctggtac caaaggatga aacaagaaga aagaagatga atacggaaga aaaaaaaaag aggacaataa ttaatgataa tatttcaaaa

aagaaatatt tgttaaagtt gaatgccctt agacctaatt taatgaaaca tgcattctgg agaacatgat atatgtttgc acaatttaca agaagcatta atgtgataaa aaaatattta atttaaagaa tcaagattct taatctagat tgtgcaacaa aaataataac aaatattatt agaagatatt catcgaggaa tgaagaaaag tatagaagag tatttcaaaa tgaagtaaaa taataatttg ataa

<210> 3 <211> 697 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(697) <223> MSP 3.4 <400> 8

Met Lys Lys Ile Tyr Ser Ile Phe Phe Ser Leu Phe Ile Leu Asn Leu 1 5 10 15 His Ile Tyr Ile Lys Asn Ile Lys Cys Asn Asp Leu Ile Asn Tyr Asn 20 25 30 Asp Ser Asn Leu Arg Asn Gly Leu Leu Asn Asn Ser Leu Asp Leu Thr 35 40 45 Asn Gly Leu Asn Asn Lys Asp Asn Ser Phe Ile Asp Ser Lys Ile Glu 50 55 60 Glu His Glu Asn Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Asp Asn Asn Ile Ser Ile 65 70 75 80 Val Gly Gln Asp Val Pro Ile Thr Ser Val Tyr Ser Ser Lys Ile Ile 85 90 95 Asn Ala Asn Asp Leu Glu Gly Asn Ser Ile Asp Asp Thr Lys Gly Leu 100 105 110

28

600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2094

HU 007 367 T2

Ser Val Thr Asn Ser Gly Phe Asp Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Pro Phe Ser Gly Tyr Ser Pro Leu Gln Gly Asn His Asn Lys Cys 130 135 140 Pro Asp Glu Asn Phe Cys Lys Gly Ile Lys Asn Val Leu Ser Cys Pro 145 150 155 160 Pro Lys Asn Ser Thr Gly Arg Asn Gly Asp Trp Ile Ser Val Ala Val 165 170 175 Lys Glu Ser Ser Thr Thr Asn Lys Gly Val Leu Val Pro Pro Arg Arg 180 185 190 Thr Lys Leu Cys Leu Arg Asn Ile Asn Lys Val Trp His Arg Ile Lys 195 200 205 Asp Glu Lys Asn Phe Lys Glu Glu Phe Val Lys Val Ala Leu Gly Glu 210 215 220 Ser Asn Ala Leu Met Lys His Tyr Lys Glu Lys Asn Leu Asn Ala Leu 225 230 235 240 Thr Ala Ile Lys Tyr Gly Phe Ser Asp Met Gly Asp Ile Ile Lys Gly 245 250 255 Thr Asp Leu Ile Asp Tyr Gln Ile Thr Lys Asn Ile Asn Arg Ala Leu 260 265 270 Asp Lys Ile Leu Arg Asn Glu Thr Ser Asn Asp Lys Ile Lys Lys Arg 275 280 285 Val Asp Trp Trp Glu Ala Asn Lys Ser Ala Phe Trp Asp Ala Phe Met 290 295 300 Cys Gly Tyr Lys Val His Ile Gly Asn Lys Pro Cys Pro Glu His Asp 305 310 315 320 Asn Met Asp Arg Ile Pro Gln Tyr Leu Arg Trp Phe Arg Glu Trp Gly 325 330 335 Thr Tyr Val Cys Ser Glu Tyr Lys Asn Lys Phe Glu Asp Val Ile Lys 340 345 350 Leu Cys Asn Ile Gln Gln Phe Thr Asn Gln Asp Asp Ser Gln Leu Leu 355 360 365 Glu Ile Ser Lys Lys Asp Lys Cys Lys Glu Ala Leu Lys His Tyr Glu 370 375 380 Glu Trp Val Asn Arg Arg Arg Pro Glu Trp Lys Gly Gln Cys Asp Lys 385 390 395 400 Phe Glu Lys Glu Lys Ser Lys Tyr Glu Asp Thr Lys Ser Ile Thr Ala 405 410 415 Glu Lys Tyr Leu Lys Glu Ile Cys Ser Glu Cys Asp Cys Lys Tyr Lys 420 425 430

29

HU 007 367 T2

Asp Leu Asp Asn Thr Phe Lys Glu Phe Lys Asp Asn Val Thr Leu Leu 435 440 445 Lys Ala Val Ile Asp Asn Lys Lys Asn Gln Asp Ser Leu Thr Thr Thr 450 455 460 Ser Leu Ser Thr Ser Ile Asn Ser Val Arg Asp Ser Ser Asn Leu Asp 465 470 475 480 Gln Arg Gly Asn Ile Thr Thr Ser Gln Gly Asn Ser His Arg Ala Thr 485 490 495 Val Val Gln Gln Val Asp Gln Thr Asn Arg Leu Asp Asn Val Asn Ser 500 505 510 Val Thr Gln Arg Gly Asn Asn Asn Tyr Asn Asn Asn Leu Glu Arg Gly 515 520 525 Leu Gly Ser Gly Ala Leu Pro Gly Thr Asn Ile Ile Thr Glu Glu Lys 530 535 540 Tyr Ser Leu Glu Leu Ile Lys Leu Thr Ser Lys Asp Glu Glu Asp Ile 545 550 555 560 Ile lys His Asn Glu Asp Val Arg Glu Glu Ile Glu Glu Gln Gln Glu 565 570 575 Asp Ile Glu Glu Asp Glu Glu Glu Leu Glu Asn Glu Gly Glu Glu Thr 580 585 590 Lys Glu Glu Asp Asp Glu Glu Lys Asn Glu Thr Asn Asp Thr Glu Asp 595 600 605 Thr Asp Asp Thr Glu Asp Thr Glu Asp Ile Glu Glu Glu Asn Lys Glu 610 615 620 Lys Glu Leu Ser Asn Gln Gln Gln Ser Glu Lys Lys Ser Ile Ser Lys 625 630 635 640 Val Asp Glu Asp Ser Tyr Arg Ile Leu Ser Val Ser Tyr Lys Asp Asn 645 650 655 Asn Glu Val Lys Asn Val Ala Glu Ser Ile Val Lys Lys Leu Phe Ser 660 665 670 Leu Phe Asn Asp Asn Asn Asn Leu Glu Thr Ile Phe Lys Gly Leu Thr 675 680 685 Glu Asp Met Thr Asp Leu Phe Gln Lys 690 695 <210> 9 <211> 2139 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2139) <223> MSP 3.5

30

HU 007 367 T2

<400> 9

atgaaatata agtatatcat aatttaagaa gaaggaacat catacaacta tcaaatgaat gaaacaaata caacttgaag aatgaaaagg caatattttg aaaaatgrgt ggatcaagtg gaaaaattta ggaaatggac gatgcagaac gcagaacatt gaacattata cattataatg tataatgatg gatggaggta gaagataact ttaaattatc gaagaaacac actcatgaag aaccctactc ttttacaacc cacaattttt gaatcacaca catgaagaat cctactcatg tacaacccta aatttttaca tcacacaatt gactacgatt ttggtaaaaa ggtatagctg

tattaagtat gtgaaataga gctgttcttc atggtgaaaa acgaatcaaa caagtataac tatctaacga tacctaaaga aaaattttgc gatcttccta ttcagtctta tatttggatc taggatctaa aaaataaata attataatga ataatgatgg atgatggagg atggaggtat gagatataag taagtttaga accatttata atatgcatta acaattttta aatcacacaa atgaagaatc ctactcatga acaaccctac atttttacaa cacacaattt aagaatcaca ctcatgaaga accctactca tttacacccc acaattactt aagttaatga ggggtgttac

tagtcttttt ttacacccct taatcttgtt tttaaacgac tatatcaaat taaccagtca atcaagtgta tgcagtagaa aaatggagtg tgatatgaat ttttaatcaa catatttggt caatacaaat cgacaataat tggtagtata aagtataagt tatatgttta aagtttagat tttagatgaa cgaatcagat ttattgggat tacactttat taatactact tttttacaac acacaatttt agaatcacac tcatgaagaa ccctactcat ttacaaccct caatttttac atcacacaat tgaagaatca tactcatgat tgaaaatgat tttcatggaa tagttttttc

ttaattcttt agtaccaata ctttcttcaa agtgtatctt gtatcaaata aatttatcta ccaaatgaaa aatcacacag gaaacacatg atggacacag tccaaaggaa agcttattaa tcggattcta atatacttag agtttaggcg ttagatgaag ggtgaagaag gaagaagatg gatgagttaa gatttgagtg gatttctatc gaaccaaaca aatgaagaat cctactcatg tacaacccta aatttttaca tcacacaatt gaagaatcac actcatgaag aaccctactc ttttacaacc cacaattttt gaatttaatg aattataata tcagataatt ggatattaa

taaatttata ttactagcaa atatagattc tgacgaataa tatcaaatga gcgaaacaaa gcagtgtcaa aatccaaaga ttgatctagg aaggaggaat atagtggtac cccctataga atgtgaagaa atgaagaaga aagaagatga aagatgagtt atgagttaag tgttgagtga gtgatacaga accccgaaag atgaatataa atttttatga cacacaattt aagaatcaca ctcatgaaga accctactca tttacaaccc acaattttta aatcacacaa atgaagaatc ctactcatga acaaccctac ttcctttaaa ttcaaaatgt tattagttaa

taaatgtgct tttaaattct tactaaatta tattaatgat atcaaatata tatatctagc tgaggtacct tgttttattg atcccaagaa aaaaaagttc tgaaggtgat ttcattgtta cacttctatg tgctttgagt gttgagtgat gagtgatgca tgatgcagaa tgcagaacat aaattattat taaaacaaaa accaacttat tactactaat ttacaaccct caatttttac atcacacaat tgaagaatca tactcatgaa caaccctact tttttacacc acacaatttt agaatcacac tcatgaagaa ttataaccat taaagacaat tacctttaaa

<210> 10 <211> 712 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(712) <223> MSP 3.5 <400> 10

Met Lys Tyr Ile Leu Ser Ile Ser Leu Phe Leu Ile Leu Leu Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Lys Cys Ala Ser Ile Ser Cys Glu Ile Asp Tyr Thr Pro Ser Thr 20 25 30 Asn Ile Thr Ser Asn Leu Asn Ser Asn Leu Arg Ser Cys Ser Ser Asn 35 40 45

31

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2139

HU 007 367 T2

Leu Val Leu Ser Ser Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Glu Gly Thr Tyr 50 55 60 Gly Glu Asn Leu Asn Asp Ser Val Ser Leu Thr Asn Asn Ile Asn Asp 65 70 75 80 His Thr Thr Asn Glu Ser Asn Ile Ser Asn Val Ser Asn Ile Ser Asn 85 90 95 Glu Ser Asn Ile Ser Asn Glu Ser Ser Ile Thr Asn Gln Ser Asn Leu 100 105 110 Ser Ser Glu Thr Asn Ile Ser Ser Glu Thr Asn Ile Ser Asn Glu Ser 115 120 125 Ser Val Pro Asn Glu Ser Ser Val Asn Glu Val Pro Gln Leu Glu Val 130 135 140 Pro Lys Asp Ala Val Glu Asn His Thr Glu Ser Lys Asp Val Leu Leu 145 150 155 160 Asn Glu Lys Glu Asn Phe Ala Asn Gly Val Glu Thr His Val Asp Leu 165 170 175 Gly Ser Gln Glu Gln Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Asp Met Asn Met Asp 180 185 190 Thr Glu Gly Gly Ile Lys Lys Phe Lys Asn Val Phe Gln Ser Tyr Phe 195 200 205 Asn Gln Ser Lys Gly Asn Ser Gly Thr Glu Gly Asp Gly Ser Ser Val 210 215 220 Phe Gly Ser Ile Phe Gly Ser Leu Leu Thr Pro Ile Asp Ser Leu Leu 225 230 235 240 Glu Lys Phe Ile Gly Ser Asn Asn Thr Asn Ser Asp Ser Asn Val Lys 245 250 255 Asn Thr Ser Met Gly Asn Gly Gln Asn Lys Tyr Asp Asn Asn Ile Tyr 260 265 270 Leu Asp Glu Glu Asp Ala Leu Ser Asp Ala Glu His Tyr Asn Asp Gly 275 280 285 Ser Ile Ser Leu Gly Glu Glu Asp Glu Leu Ser Asp Ala Glu His Tyr 290 295 300 Asn Asp Gly Ser Ile Ser Leu Asp Glu Glu Asp Glu Leu Ser Asp Ala 305 310 315 320 Glu His Tyr Asn Asp Gly Gly Ile Cys Leu Gly Glu Glu Asp Glu Leu 325 330 335 Ser Asp Ala Glu His Tyr Asn Asp Gly Gly Ile Ser Leu Asp Glu Glu 340 345 350 Asp Val Leu Ser Asp Ala Glu His Tyr Asn Asp Gly Asp Ile Ser Leu 355 360 365

32

HU 007 367 T2

Asp Glu Asp Glu Leu Ser Asp Thr Glu Asn Tyr Tyr Asp Gly Gly Ile 370 375 380 Ser Leu Asp Glu Ser Asp Asp Leu Ser Asp Pro Glu Ser Lys Thr Lys 385 390 395 400 Glu Asp Asn Tyr His Leu Tyr Tyr Trp Asp Asp Phe Tyr His Glu Tyr 405 410 415 Lys Pro Thr Tyr Leu Asn Tyr His Met His Tyr Thr Leu Tyr Glu Pro 420 425 430 Asn Asn Phe Tyr Asp Thr Thr Asn Glu Glu Thr His Asn Phe Tyr Asn 435 440 445 Thr Thr Asn Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu 450 455 460 Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr 465 470 475 480 Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu 485 490 495 Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe 500 505 510 Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His 515 520 525 Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn 530 535 540 Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr 545 550 555 560 His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His 565 570 575 Asn Phe Tyr Thr Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro 580 585 590 Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser 595 600 605 His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn 610 615 620 Pro Thr His Glu Glu Ser His Asn Phe Tyr Asn Pro Thr His Glu Glu 625 630 635 640 Ser His Asn Phe Tyr Thr Pro Thr His Asp Glu Phe Asn Val Pro Leu 645 650 655 Asn Tyr Asn His Asp Tyr Asp Tyr Asn Tyr Phe Glu Asn Asp Asn Tyr 660 665 670 Asn Ile Gln Asn Val Lys Asp Asn Leu Val Lys Lys Val Asn Asp Phe 675 680 685

33

HU 007 367 T2

Met Glu Ser Asp Asn Leu Leu Val Asn Thr Phe Lys Gly Ile Ala Gly 690 695 700 Gly Val Thr Ser Phe Phe Gly Tyr 705 710 <210> 11 <211> 1701 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1701) <223> MSP 3.6 <400> 11

atgttgaata gccaatggaa aatttaagaa atagaaaatg ttatatgata aataaagaac gaagtaaaaa gaaataggtg gaattagttg aaagtagctg aaagtagatg gaattaattg gaattaattg gaattagttg gaattagttg gaagtaactg aaagtagatg gaattaattg aaagtagatg gaattagttg gaagtagttg gtagctgaag gtagctgaaa gtagatgaag ataattgaag caaggrgaaa tctagtgatt aaaaacgatt ttaagcactt

tttttaatat cactctctga atggatattt aaataaataa taaatgaaaa aaaaaaatga cagaatatgt aagaattaac aaaaagtaga aagaagtaga aagaagtaac aaaaagtaga aaaaagtaga aaaaagtagc aaaaagtaga aagaattaat aagaagttgc aaaaggtagc aacaagtagc aaaaagtaga aagaaggtga aagtagctga aagtagttga aagtagctga aagtagttga aagtaaacaa ttaaagaatc tagttaaaga tatatccata

aattttcttg aaatattgaa aaataatact tacaaattat tattttccct agaagtacca atctgaaaaa tgaaaaagta tgaagaagta tcaaaaagta tgaagaatta tgaagaagtt tgaagaagtt tgaagaatta tgaaaaagta tgaaaaagta tgaagaatta tgatgaatta tgaagaatta tgaacaagta aaaagtacct agaagtagct agaagaaggt aaaagtagtt agaagtagcc aaatgattta tcatgaggaa aaatttaaaa a

ttgtttttaa agtgctgaag tattttaatg aatgaagtaa gattattttt atgaaaatag aatgaggaag gatgaaaaag gctgaagaat gatgaagaag attgaaaaag gctgaagaat gctgaagaat gttgaaaaag gctgaagaag gatgaagaag attgaaaaag gttgaaaaag gttgaaaaag gttgaagaag gaagaagtag gaagaattag gaaaaagtac gaagaagaag gaagaagtag aatgatgcat ttatttaaag aagattacaa

<210> 12 <211> 566 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(566) <223> MSP 3.6

34

taaacatata agatagatgc aagaaaacaa cagaagaaac ttcttgatat aagtagtaaa tagaaaataa tacctgaaga tagttgaaaa taactgaaga tagatgaaga taattgaaaa taattgaaaa tagatgaaga tagatcaaaa taactgaaga tagatgaaga tagctgaaga tagatgaaca tagctgaaga ctgaagaagt ttgaaaaagt ctgaagaagt gtgaaaaagt ctgaaaaagt cttccgagga ttttcctgga acaatttaaa

tatatgtgaa tttaaaaacg taatttaaat taaagaagaa ctttactgaa tgatggagaa atcggaaact agtagctgaa agtagatgaa attaattgaa agttgctgaa ggtagctgat ggtagctgat agtagctgaa agtagatgaa attaattgaa agttgctgaa attagttgaa agtagctgaa agtagctgaa agctgaagaa agatgaagaa agttgaagaa acttgaagaa agttgaagaa aattaaggat gttaattaat tgaaatgcat

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1701

HU 007 367 T2

<400> 12

Met Leu Asn Ile Phe Asn Ile Ile Phe Leu Leu Phe Leu Ile Asn Ile 1 5 10 15 Tyr Ile Cys Glu Ala Asn Gly Thr Leu Ser Glu Asn Ile Glu Ser Ala 20 25 30 Glu Glu Ile Asp Ala Leu Lys Thr Asn Leu Arg Asn Gly Tyr Leu Asn 35 40 45 Asn Thr Tyr Phe Asn Glu Glu Asn Asn Asn Leu Asn Ile Glu Asn Glu 50 55 60 Ile Asn Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Val Thr Glu Glu Thr Lys Glu Glu 65 70 75 80 Leu Tyr Asp Ile Asn Glu Asn Ile Phe Pro Asp Tyr Phe Phe Leu Asp 85 90 95 Ile Phe Thr Glu Asn Lys Glu Gln Lys Asn Glu Glu Val Pro Met Lys 100 105 110 Ile Glu Val Val Asn Asp Gly Glu Glu Val Lys Thr Glu Tyr Val Ser 115 120 125 Glu Lys Asn Glu Glu Val Glu Asn Lys Ser Glu Thr Glu Ile Gly Glu 130 135 140 Glu Leu Thr Glu Lys Val Asp Glu Lys Val Pro Glu Glu Val Ala Glu 145 150 155 160 Glu Leu Val Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Glu Leu Val Glu 165 170 175 Lys Val Asp Glu Lys Val Ala Glu Glu Val Asp Gln Lys Val Asp Glu 180 185 190 Glu Val Thr Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Thr Glu 195 200 205 Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Glu 210 215 220 Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Ala Asp 225 230 235 240 Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Glu 245 250 255 Lys Val Ala Asp Glu Leu Val Glu Lys Val Ala Glu Glu Leu Val Glu 260 265 270 Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Glu Leu Val Glu Lys Val Asp Glu 275 280 285 Lys Val Ala Glu Glu Val Asp Gln Lys Val Asp Glu Glu Val Thr Glu 290 295 300

35

HU 007 367 T2

Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Thr Glu Glu Leu Ile Glu 305 310 315 320 Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Asp Glu 325 330 335 Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Glu Lys Val Ala Asp Glu Leu Val Glu 340 345 350 Lys Val Ala Glu Glu Leu Val Glu Lys Val Asp Glu Gln Val Ala Glu 355 360 365 Glu Leu Val Glu Lys Val Asp Glu Gln Val Ala Glu Glu Leu Val Glu 370 375 380 Lys Val Asp Glu Gln Val Val Glu Glu Val Ala Glu Glu Val Ala Glu 385 390 395 400 Glu Val Val Glu Glu Gly Glu Lys Val Pro Glu Glu Val Ala Glu Glu 405 410 415 Val Ala Glu Glu Val Ala Glu Glu Val Ala Glu Glu Val Ala Glu Glu 420 425 430 Leu Val Glu Lys Val Asp Glu Glu Val Ala Glu Lys Val Val Glu Glu 435 440 445 Glu Gly Glu Lys Val Pro Glu Glu Val Val Glu Glu Val Asp Glu Glu 450 455 460 Val Ala Glu Lys Val Val Glu Glu Glu Gly Glu Lys Val Leu Glu Glu 465 470 475 480 Val Ile Glu Glu Val Val Glu Glu Val Ala Glu Glu Val Ala Glu Lys 485 490 495 Val Val Glu Glu Gln Gly Glu Lys Val Asn Lys Asn Asp Leu Asn Asp 500 505 510 Ala Ser Ser Glu Glu Ile Lys Asp Ser Ser Asp Phe Lys Glu Ser His 515 520 525 Glu Glu Leu Phe Lys Val Phe Leu Glu Leu Ile Asn Lys Asn Asp Leu 530 535 540 Val Lys Glu Asn Leu Lys Lys Ile Thr Asn Asn Leu Asn Glu Met His 545 550 555 560 Leu Ser Thr Leu Tyr Pro 565 <210> 13 <211> 1218 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1218) <223> MSP 3.7

36

HU 007 367 T2

<400> 13

atgaataagt caaagcaatg tcttcaataa gaagcttcag gagaaaaata tcaaataaat actgggataa caaatagacg gttaatttat ccacctccta aaggtacctg aatagaaatg ggaggtggtg cacgtaaaaa cgcgaagttc acagaagata gatgaggata gaacaaataa tataaaaaaa ttacaaacaa tttttaaata

ttttgaatat ccacaagtaa ataataacaa aatatataga ataataattc ttcaatcaat aattaaatga atgaaaaatt taacaccatc gtgaacctaa aagatgcaaa aaaataatca ctccaacgta ttacctcgtg aagaaactga tggaagatga atgtaaattt aattagattc ctgaagaaaa ataaccaact actattga

tatattttac ggaaattcaa aaatatagaa aaaacaaaat attagataca tgaagacaat ttcacaaact gaagtatgga aagtcctact tgttgataca attatcaagt aaatacagat taaacccgag ggataaagaa agacactgac aaacgaaatt agaagatatt tacgcaagat aaaatcatta agatccttca

atttttctaa aaagatgaac aataaaaatg gacattttaa aatgtaacaa aatgtataca acatctgata gggtcgtttg caaaacgatg ccagatcctc tctcctagac ccatataacc aacaataaga gatataatta gaaactgaag gtggaagatc aataaaaata gacaaagctc gaagatcatg ctaaaagatt

tattaaattt aaaagaattt ataatattga atatgtataa aaaatactgt ataaaggtat attacaaaaa acacaatttt gatctacagg caacagcacc ctgaaggacc actattttgc acgataatat aagaaaatga atactgacga aattacaaga ctagaaatga aaaaattaat taaatctatt tagaaaatga

ctctttcttc aagaaatggt aactcaatat tgatgaaaaa aattgataat atttgtaggt tgaacgatat ttcaggtttt aagaaatgta cgcacctgta aagagcaaac atgggaaatt tttgctagaa agacacaaaa aactgaagaa aaatgaagat tatatttgaa ttctaatgaa atttaatttt gttaactttt

<210> 14 <211> 405 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(405) <223> MSP 3.7 <400> 14

Met Asn Lys Phe Leu Asn Ile Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Ile Leu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Phe Phe Gln Ser Asn Ala Thr Ser Lys Glu Ile Gln Lys Asp 20 25 30 Glu Gln Lys Asn Leu Arg Asn Gly Ser Ser Ile Asn Asn Asn Lys Asn 35 40 45 Ile Glu Asn Lys Asn Asp Asn Ile Glu Thr Gln Tyr Glu Ala Ser Glu 50 55 60 Tyr Ile Glu Lys Gln Asn Asp Ile Leu Asn Met Tyr Asn Asp Glu Lys 65 70 75 80 Glu Lys Asn Asn Asn Asn Ser Leu Asp Thr Asn Val Thr Lys Asn Thr 85 90 95 Val Ile Asp Asn Ser Asn Lys Phe Gln Ser Ile Glu Asp Asn Asn Val 100 105 110 Tyr Asn Lys Gly Ile Phe Val Gly Thr Gly Ile Lys Leu Asn Asp Ser 115 120 125

37

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1218

HU 007 367 T2

Gln Thr Thr Ser Asp Asn Tyr Lys Asn Glu Arg Tyr Gln Ile Asp Asp 130 135 140 Glu Lys Leu Lys Tyr Gly Gly Ser Phe Asp Thr Ile Phe Ser Gly Phe 145 150 155 160 Val Asn Leu Leu Thr Pro Ser Ser Pro Thr Gln Asn Asp Gly Ser Thr 165 170 175 Gly Arg Asn Val Pro Pro Pro Ser Glu Pro Asn Val Asp Thr Pro Asp 180 185 190 Pro Pro Thr Ala Pro Ala Pro Val Lys Val Pro Glu Asp Ala Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gly Pro Arg Ala Asn Asn Arg Asn Glu 210 215 220 Asn Asn Gln Asn Thr Asp Pro Tyr Asn His Tyr Phe Ala Trp Glu Ile 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ala Pro Thr Tyr Lys Pro Glu Asn Asn Lys Asn Asp Asn 245 250 255 Ile Leu Leu Glu His Val Lys Ile Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp Ile 260 265 270 Ile Lys Glu Asn Glu Asp Thr Lys Arg Glu Val Gln Glu Thr Glu Asp 275 280 285 Thr Asp Glu Thr Glu Asp Thr Asp Glu Thr Glu Glu Thr Glu Asp Met 290 295 300 Glu Asp Glu Asn Glu Ile Val Glu Asp Gln Leu Gln Glu Asn Glu Asp 305 310 315 320 Asp Glu Asp Asn Val Asn Leu Glu Asp Ile Asn Lys Asn Thr Arg Asn 325 330 335 Asp Ile Phe Glu Glu Gln Ile Lys Leu Asp Ser Thr Gln Asp Asp Lys 340 345 350 Ala Gln Lys Leu Ile Ser Asn Glu Tyr Lys Lys Thr Glu Glu Lys Lys 355 360 365 Ser Leu Glu Asp His Val Asn Leu Leu Phe Asn Phe Leu Gln Thr Asn 370 375 380 Asn Gln Leu Asp Pro Ser Leu Lys Asp Leu Glu Asn Glu Leu Thr Phe 385 390 395 400 Phe Leu Asn Asn Tyr 405 <210> 15 <211> 2289 <212> DNA <213> Plasmodium Falciparum

38

HU 007 367 T2

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(2289) <223> MSP 3.8 <400> 15

atgatatata aacatttatt attaatgatg aatatagaat tcggatatta gaagaaaaaa attagtatta ggtagtgaat aaatgtccta gtacatgaaa ggggttcttg cgtacgaaaa gaagctagaa agatatagtt acgtcaaaag gataaaccaa atgatgtgcg gatgatatac agcgaaaaaa gcgaatcctg gaagaatggt gacaaaatta tgtcctgaat ggaaaagctt gccttacctg caggaaaatc ggacaaacag gttggtaaca atagatcctt caacactcta tcggatattg attaatacag gaaaaaacag gaagsagcag aataaatcgc tttaataatt tataatgaac gaaggtaatg aaaaattaa

ttttatctat ctacatgttt atgaactaaa ataataaaaa tggatcaaga aaaatattaa ctggtaatga tagctggagg ctgaagagat gaaataattg ttcctccaag agaaaaagga aattaagaac ttgcagatat aaaccataac aagatgcaaa gatatcagag cacaattttt atatgaacac cattgactgt ataataaaag attatacaga gtaaatgtac tattagaaaa aaccaggtca aacctgttgt aaccgaataa tccaagaagt ctaagattga aggaagatgt aacagatagc atggggaaat aagaagatat atgaagaaac tagaagaaaa cagaaaaaga tagataaaaa gaagtgattc

tgtattttat tgttgtaaat ggggaaagca cttaaagcac agataaagga taaatcttta tagtaatagt tattcctcgt ttgtaaagac gttgggctca aagacaatct aggagatttt catacacaat tggaaatatt atatttagaa aaaatggtgg tgcgcagaaa aaggtggttc actaaaagct acatgaaaat gaaaactgaa tataaaaaca caaaaaaaat gctaaaaaaa aattacatta agaaacacct aggtgacaac aaaccaaggt cgaccgtttg aaaaaaggga taatgaaagc agaatatata agaagaagaa agtaaaagaa acaaatagat tgaaaaagct cgttcatact taccttgaat

atattttttt gaggggaacc tataataata aatgtaaact gataatgaaa gacgctgaat gataatagta tctatatata tttagtaatc agtgtaaaaa ttatgtttaa gaaaaattta aataacttag attagaggag aaagtactta acagaaaaca gataaccaat agagagtggg gtttgctttc gaaatgtgct tggactgaac ttatctcctt ttgcaagatg gaagaatcac cctgatcctt gttaccacag aataatgaaa agcgtgagcg gaattaagta tgtgctttag gaagatgtac acagaagaag acagaagaag atagaagaca aaaaatacag cgaaatttaa ttagtaaatt agtttatcaa

<210> 16 <211> 762 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(762) <223> MSP 3.8

39

tacatattga ctaatttaag ctatagatgc catctcatat attctcatga ccaattatgg atcagaatat ctattaacct ttccacaatg atttttcaag gaattacatt tttattcata aaaaagctca atgacatgat aaatttataa ggcatcatgt gtacaggtta gaacatatgt cgaaacagcc catcaacttt aatctattaa ctgaatattt tatttgaact ctgtgagtaa cattaaaaca ctgttattaa gagaaaatca aagaatcaca gtgggtcatc aattggtacc tggaagagat aaataaaaga aaacagaaga aaccagaaca ataccagtga tttctaaaaa caattattag aagatattac

tatatatgta aaataacata taataaccaa atctaaattt cataaaattt tattaatgaa ttttccagat tggttttaat tcgaaagaat tgataataag acaagatttt tgcatcatct tcaagctata ggatacacct tgaaaataat ttgggaagca tggtaacatt ctgtgaagaa aagaaccgaa aaaaaaatat atataacaat aatagaaaaa tacatttgat tagtgtgaat aacaacacaa tgaacatcaa tgaaagtaat ttctaaaact atctcttgaa tttatcttta agaagaagaa agatatagaa agaaacagaa agaaattaaa aaagaaagga ttataaaaat tttattagaa aaatttattt

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2289

HU 007 367 T2

<400> 16

Met Ile Tyr Ile Leu Ser Ile Val Phe Tyr Ile Phe Phe Leu His Ile 1 5 10 15 Asp Ile Tyr Val Asn Ile Tyr Ser Thr Cys Phe Val Val Asn Glu Gly 20 25 30 Asn Pro Asn Leu Arg Asn Asn Ile Ile Asn Asp Asp Glu Leu Lys Gly 35 40 45 Lys Ala Tyr Asn Asn Thr Ile Asp Ala Asn Asn Gln Asn Ile Glu Tyr 50 55 60 Asn Lys Asn Leu Lys His Asn Val Asn Ser Ser His Ile Ser Lys Phe 65 70 75 80 Ser Asp Ile Met Asp Gln Glu Asp Lys Gly Asp Asn Glu Asn Ser His 85 90 95 Asp Ile Lys Phe Glu Glu Lys Lys Asn Ile Asn Lys Ser Leu Asp Ala 100 105 110 Glu Ser Asn Tyr Gly Ile Asn Glu Ile Ser Ile Thr Gly Asn Asp Ser 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Asn Gln Asn Ile Phe Pro Asp Gly Ser Glu Leu 130 135 140 Ala Gly Gly Ile Pro Arg Ser Ile Tyr Thr Ile Asn Leu Gly Phe Asn 145 150 155 160 Lys Cys Pro Thr Glu Glu Ile Cys Lys Asp Phe Ser Asn Leu Pro Gln 165 170 175 Cys Arg Lys Asn Val His Glu Arg Asn Asn Trp Leu Gly Ser Ser Val 180 185 190 Lys Asn Phe Ser Ser Asp Asn Lys Gly Val Leu Val Pro Pro Arg Arg 195 200 205 Gln Ser Leu Cys Leu Arg Ile Thr Leu Gln Asp Phe Arg Thr Lys Lys 210 215 220 Lys Lys Glu Gly Asp Phe Glu Lys Phe Ile Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser 225 230 235 240 Glu Ala Arg Lys Leu Arg Thr Ile His Asn Asn Asn Leu Glu Lys Ala 245 250 255 His Gln Ala Ile Arg Tyr Ser Phe Ala Asp Ile Gly Asn Ile Ile Arg 260 265 270 Gly Asp Asp Met Met Asp Thr Pro Thr Ser Lys Glu Thr Ile Thr Tyr 275 280 285 Leu Glu Lys Val Leu Lys Ile Tyr Asn Glu Asn Asn Asp Lys Pro Lys 290 295 300

40

HU 007 367 T2

Asp Ala Lys Lys Trp Trp Thr Glu Asn Arg His His Val Trp Glu Ala 305 310 315 320 Met Met Cys Gly Tyr Gln Ser Ala Gln Lys Asp Asn Gln Cys Thr Gly 325 330 335 Tyr Gly Asn Ile Asp Asp Ile Pro Gln Phe Leu Arg Trp Phe Arg Glu 340 345 350 Trp Gly Thr Tyr Val Cys Glu Glu Ser Glu Lys Asn Met Asn Thr Leu 355 360 365 Lys Ala Val Cys Phe Pro Lys Gln Pro Arg Thr Glu Ala Asn Pro Ala 370 375 380 Leu Thr Val His Glu Asn Glu Met Cys Ser Ser Thr Leu Lys Lys Tyr 385 390 395 400 Glu Glu Trp Tyr Asn Lys Arg Lys Thr Glu Trp Thr Glu Gln Ser Ile 405 410 415 Lys Tyr Asn Asn Asp Lys Ile Asn Tyr Thr Asp Ile Lys Thr Leu Ser 420 425 430 Pro Ser Glu Tyr Leu Ile Glu Lys Cys Pro Glu Cys Lys Cys Thr Lys 435 440 445 Lys Asn Leu Gln Asp Val Phe Glu Leu Thr Phe Asp Gly Lys Ala Leu 450 455 460 Leu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Glu Ser Pro Val Ser Asn Ser Val Asn 465 470 475 480 Ala Leu Pro Glu Pro Gly Gln Ile Thr Leu Pro Asp Pro Ser Leu Lys 485 490 495 Gln Thr Thr Gln Gln Glu Asn Gln Pro Val Val Glu Thr Pro Val Thr 500 505 510 Thr Ala Val Ile Asn Glu His Gln Gly Gln Thr Glu Pro Asn Lys Gly 515 520 525 Asp Asn Asn Asn Glu Arg Glu Asn His Glu Ser Asn Val Gly Ser Ile 530 535 540 Gln Glu Val Asn Gln Gly Ser Val Ser Glu Glu Ser His Ser Lys Thr 545 550 555 560 Ile Asp Pro Ser Lys Ile Asp Asp Arg Leu Glu Leu Ser Ser Gly Ser 565 570 575 Ser Ser Leu Glu Gln His Ser Lys Glu Asp Val Lys Lys Gly Cys Ala 580 585 590 Leu Glu Leu Val Pro Leu Ser Leu Ser Asp Ile Glu Gln Ile Ala Asn 595 600 605 Glu Ser Glu Asp Val Leu Glu Glu Ile Glu Glu Glu Ile Asn Thr Asp 610 615 620

41

HU 007 367 T2

Gly Glu Ile Glu Tyr Ile Thr Glu Glu Glu Ile Lys Glu Asp Ile Glu 625 630 635 640 Glu Glu Thr Glu Glu Asp Ile Glu Glu Glu Thr Glu Glu Glu Thr Glu 645 650 655 Glu Glu Thr Glu Glu Glu Ala Asp Glu Glu Thr Val Lys Glu Ile Glu 660 665 670 Asp Lys Pro Glu Gln Glu Ile Lys Asn Lys Ser Leu Glu Glu Lys Gln 675 680 685 Ile Asp Lys Asn Thr Asp Thr Ser Glu Lys Lys Gly Phe Asn Asn Ser 690 695 700 Glu Lys Asp Glu Lys Ala Arg Asn Leu Ile Ser Lys Asn Tyr Lys Asn 705 710 715 720 Tyr Asn Glu Leu Asp Lys Asn Val His Thr Leu Val Asn Ser Ile Ile 725 730 735 Ser Leu Leu Glu Glu Gly Asn Gly Ser Asp Ser Thr Leu Asn Ser Leu 740 745 750 Ser Lys Asp Ile Thr Asn Leu Phe Lys Asn 755 760 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3–1 MSP3b-like motif <400> 17

Ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Val Pro 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3–2 MSP3b-like motif <400> 18

Ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 14

42

HU 007 367 T2

<212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> MSP 3¹3 MSP3b-like motif <400> 19

Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Phe Ser Gly Gly Leu Tyr Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3¹4 MSP3b-like motif <400> 20

Leu Glu Arg Gly Leu Gly Ser Gly Ala Leu Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3¹4 MSP3b-like motif <400> 21

Asp Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly Leu Pro 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3–7 MSP3b-like motif <400> 22

Tyr Phe Ala Trp Glu Ile Gly Gly Gly Ala Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 11 43

HU 007 367 T2

<212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3–8 MSP3b-like motif <400> 23

Arg Leu Glu Leu Ser Ser Gly Ser Ser Leu Glu 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MSP 3–8 MSP3b-like motif <400> 24

Pro Asp Gly Ser Glu Leu Ala Gly Gly Ile Pro 1 5 10 <210> 25 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> MSP3–1 MSP3c/d¹like motif <400> 25

Leu Ser His Leu Tyr Val Ser Ser Lys Asp Lys Glu Asn Ile Ser Lys 1 5 10 15 Glu Asn Asp Asp 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> MSP 3–2 MSP3c/d¹like motif

44

HU 007 367 T2

<400> 26

Leu Glu Gln Ile Lys Ile Pro Ser Trp Asp Arg Asn Asn Ile Pro Asp 1 5 10 15 Glu Asn Glu Gln 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> MSP 3¹3 HSP3c/d¹like motif <400> 27

Leu Glu Ser Val Asn Leu Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp Ile Val Lys 1 5 10 15 Glu Asn Glu Asp 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> MSP 3¹4 MSP3c/d¹like motif <400> 28

Leu Glu Leu Ile Lys Leu Thr Ser Lys Asp Glu Glu Asp Ile Ile Lys 1 5 10 15 His Asn Glu Asp 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> MSP 3–7 MSP3c/d¹like motif

45

HU 007 367 T2

<400> 29

Leu Glu His Val Lys Ile Thr Ser Trp Asp Lys Glu Asp Ile Ile Lys 1 5 10 15 Glu Asn Glu Asp 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Plasmodium Falciparum <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> MSP 3¹3 MSP3c/d¹like motif <400> 30

Leu Glu Leu Val Pro Leu Ser Leu Ser Asp Ile Glu Gln Ile Ala Asn 1 5 10 15 Glu Ser Glu Asp 20 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mixotope <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(1) <223> X=I, Y or none; <220> <221> DOMAIN <222> (2)..(2) <223> X=L, F or none; <220> <221> DOMAIN <222> (3)..(3) <223> X=E, D, P or none; <220> <221> DOMAIN <222> (4)..(4) <223> X=R, D or none; <220> <221> DOMAIN <222> (5)..(5) <223> X=G, A, L or none;

46

HU 007 367 T2

<220> <221> DOMAIN <222> (6)..(6) <223> X=W, G, S, I or E; <220> <221> DOMAIN <222> (7)..(7) <223> X=E, L or A; <220> <221> DOMAIN <222> (8)..(8) <223> X=F, I, G, L or S; <220> <221> DOMAIN <222> (9)..(9) <223> X=G, S or A; <220> <221> DOMAIN <222> (11)..(11) <223> X=G, S or A; <220> <221> DOMAIN <222> (12)..(12) <223> X=V, A, L, I or S; <220> <221> DOMAIN <222> (13)..(13) <223> X=P, Y or L; <220> <221> DOMAIN <222> (14)..(14) <223> X=E, F or none. <400> 31

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mixotope <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(1) <223> X=I or Y; <220> <221> DOMAIN 47

HU 007 367 T2

<222> (2)..(2) <223> X=L or F; <220> <221> DOMAIN <222> (3)..(3) <223> X=G or A; <220> <221> DOMAIN <222> (6)..(6) <223> X=F or I; and <220> <221> DOMAIN <222> (10)..(10) <223> X=V or A. <400> 32

Xaa Xaa Xaa Trp Glu Xaa Gly Gly Gly Xaa Pro 1 5 10 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mixotope <220> <221> DOMAIN <222> (2)..(2) <223> X=E, or S; <220> <221> DOMAIN <222> (3)..(3) <223> X=L, H, S or Q; <220> <221> DOMAIN <222> (4)..(4) <223> X=I, V or L; <220> <221> DOMAIN <222> (5)..(5) <223> X=K, N, Y or P; <220> <221> DOMAIN <222> (6)..(6) <223> X=I, V or L; <220> <221> DOMAIN <222> (7).. (7) <223> X=T, S or P; 48

HU 007 367 T2

<220> <221> DOMAIN <222> (8)..(8) <223> X=S or L; <220> <221> DOMAIN <222> (9)..(9) <223> X=K, W or S; <220> <221> DOMAIN <222> (11)..(11) <223> X=E, K, R or I; <220> <221> DOMAIN <222> (12)..(12) <223> X=E or N; <220> <221> DOMAIN <222> (13)..(13) <223> X=D, N or Q; <220> <221> DOMAIN <222> (15)..(15) <223> X=I, V, S, P or A; <220> <221> DOMAIN <222> (16)..(16) <223> X=K, D or N; <220> <221> DOMAIN <222> (17)..(17) <223> X=H or E; <220> <221> DOMAIN <222> (18)..(18) <223> X=N or S; <220> <221> DOMAIN <222> (19)..(19) <223> X=E or D; <220> <221> DOMAIN <222> (20)..(20) <223> X=D or Q.

49

1

HU 007 367 T2

2

<400> 33

Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. A SEQ ID NO:6 szerinti MSP3.3 fehérjébõl származó antigenikus polipeptid, mely legalább a SEQ ID NO:27 szerinti MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmazza. 2. A SEQ ID NO:6 szerinti MSP3.3 fehérjébõl származó antigenikus polipeptid, mely legalább egy, a SEQ ID NO:27 legalább egy aminosavjának konzervatív helyettesítésével nyert MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaz, mely motívumot a SEQ ID NO:27 szerinti MSP-3c/d¹szerû motívum ellen irányuló ellenanyag felismer, feltéve, hogy az antigenikus polipeptid nem a SEQ ID NO: 2 szerinti MSP-3–1 valamely fragmense és nem a SEQ ID NO: 4 szerinti MSP-3–2 valamely fragmense. 3. A 2. igénypont szerinti antigenikus polipeptid, mely legalább egy MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaz, mely legalább 90% azonosságot mutat a SEQ ID NO:27 szerinti motívummal. 4. Az 1–3. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptid, mely tartalmaz legalább egy, a SEQ ID No: 17–24 közül kiválasztott szekvenciával rendelkezõ MSP-3-b-szerû motívumot is. 5. Antigenikus polipeptidkészítmény, mely az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmaz, és legalább egy másik MSP-3c/d¹szerû motívumot is tartalmaz, mely a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: a) SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30; b) a SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 vagy SEQ ID NO:30 bármelyike szerinti szekvencia legalább egy aminosavjának konzervatív helyettesítésével nyert MSP-3-c/d¹szerû motívum, mely motívumot a SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:30 bármelyike szerinti MSP-3-c/d¹szerû motívum ellen irányuló ellenanyag felismer és c) valamely MSP-3-c/d¹szerû motívum, mely legalább 90% azonosságot mutat a SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 és SEQ ID NO:30 szerinti szekvenciák bármelyikével. 6. Az 5. igénypont szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, mely a SEQ ID NO:27 szerinti MSP-3c/d¹szerû motívumot tartalmaz, és legalább egy másik MSP-3-c/d¹szerû motívumot is tartalmaz, mely a következõkbõl álló csoportból van kiválasztva: SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 és SEQ ID NO:30. 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, ahol a legalább két különbözõ MSP3-c/d¹szerû motívumot különbözõ molekulák hordozzák.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 50

8. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, ahol a legalább két különbözõ MSP3-c/d¹szerû motívumot egyazon molekula hordozza. 9. Az 5–8. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, mely tartalmaz egy antigenikus polipeptidet is, mely a GLURP R0 régiójából legalább 10 egymást követõ aminosavat tartalmaz. 10. Az 5–7. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, mely egy mixotóp, amely szintetikus peptideket tartalmaz, melyek a következõ szekvenciát tartalmazzák: L–X1–X2–X3–X4–X3–X5–X6–X7–D–X8–X9–X10–I– X11–X12–X13–X14–X15–X16 (SEQ ID No 33), ahol: X1=E, vagy S; X2=L, H, S vagy Q; X3=l, V vagy L; X4=K, N, Y vagy P; X5=T, S vagy P; X6=S vagy L; X7=K, W vagy S: X8=E, K, R vagy I; X9=E vagy N; X10=D, N vagy Q; X11=I, V, S, P vagy A; X12=K, D vagy N; X13=H vagy E; X14=N vagy S; X15=E vagy D; és X16=D vagy Q. 11. A 10. igénypont szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, mely legalább 50, legalább 100, vagy legalább 500 különbözõ szekvenciájú peptid keveréke. 12. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptid, vagy az 5–11. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, ahol egy lipidmolekula van a polipeptidmolekulák legalább egy részéhez kötve. 13. A 12. igénypont szerinti antigenikus polipeptid vagy polipeptidkészítmény, ahol a lipidmolekula C¹terminális palmitoil-lizilamid-maradék. 14. Az 1–4. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptid, vagy az 5–13. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, ahol a polipeptidmolekulák legalább egy része hordozóhoz van kötve. 15. A 14. igénypont szerinti antigenikus polipeptid vagy polipeptidkészítmény, ahol a hordozó vírusrészecske, vagy nitrocellulóz vagy polisztirolgyöngy, vagy valamely biológiailag lebontható polimer.

1

HU 007 367 T2

16. A 15. igénypont szerinti antigenikus polipeptid vagy polipeptidkészítmény, ahol a biológiailag lebontható polimer lipo-foszfo-glikán vagy poli-L-tejsav. 17. Immunogén készítmény, mely immunogénként 1–4. és 12–16. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidet vagy 5–15. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítményt tartalmaz. 18. Malária elleni vakcina, mely immunogénként 1–4. és 12–16. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidet vagy 5–15. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítményt tartalmaz, valamely alkalmas gyógyászati hordozóval együtt. 19. A 17. igénypont szerinti immunogén készítmény vagy a 18. igénypont szerinti vakcina, mely tartalmaz legalább egy antigént is, amely a következõk közül van kiválasztva: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. 20. A 17–19. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény vagy vakcina, amely intradermális vagy intramuszkuláris injekcióként van formulázva. 21. A 20. igénypont szerinti immunogén készítmény vagy vakcina, mely 1 és 100 mg közötti immunogént tartalmaz injekciós dózisonként. 22. A 20. igénypont szerinti immunogén készítmény vagy vakcina, mely 2 és 50 mg közötti immunogént tartalmaz injekciós dózisonként. 23. A 17–22. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény vagy vakcina, mely adjuvánsként SBAS2¹t és/vagy aluminíumsót és/vagy Montanide¹t is tartalmaz. 24. Az 1–4. és 12–16. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptid, vagy az 5–15. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény alkalmazása malária elleni vakcinakészítmény elõállítására. 25. Szintetikus vagy rekombináns ellenanyag, mely 1–3. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptid MSP-3-c/d¹szerû motívuma ellen irányul. 26. Ellenanyagok keveréke, mely 5–16. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény ellen irányul. 27. A 25. igénypont szerinti ellenanyag, vagy a 26. igénypont szerinti ellenanyag-keverék, ahol az ellenanyagok emberi vagy humanizált ellenanyagok. 28. A 25–27. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag vagy ellenanyag-keverék alkalmazása malária elleni gyógyszer elõállítására. 29. Malária passzív immunterápiájára alkalmas gyógyszer, mely 25–27. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot vagy ellenanyag-keveréket tartalmaz. 30. A 29. igénypont szerinti gyógyszer, mely a következõk közül kiválasztott legalább egy antigén elleni ellenanyagokat is tartalmaz: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. 31. Eljárás malária in vitro diagnózisára P. falciparum-mal feltehetõen fertõzõdött egyénben, mely eljárás tartalmazza a következõ lépéseket: az egyénbõl származó biológiai minta érintkezésbe hozása 1–4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 51

2

igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptiddel az antigenikus polipeptid és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ ellenanyagok közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetõvé tévõ körülmények között, és az esetlegesen képzõdött antigénellenanyag komplexek in vitro detektálása. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, ahol az in vitro diagnózis ELISA teszttel van elvégezve. 33. A 31–32. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a biológiai minta érintkezésbe van hozva egy vagy több antigenikus peptiddel is, mely a következõk közül választott valamely antigénbõl származik: LSA-1, LSA-3, LSA-5, SALSA, STARP, TRAP, PfEXP1, CS, MSP-3–1, MSP-3–2, MSP-3–5, MSP-3–6, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, AMA-1, SERP és GLURP. 34. Malária in vitro diagnózisára alkalmas kit, mely 1–4. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidet tartalmaz. 35. A 34. igénypont szerinti kit, ahol az antigenikus peptid vagy polipeptid hordozóhoz van kötve. 36. A 34. vagy 35. igénypont szerinti kit, amely tartalmaz olyan reagenseket is, melyek lehetõvé teszik az antigenikus peptid vagy polipeptid és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ ellenanyagok közt antigénellenanyag komplexek kialakulását, továbbá olyan reagenseket, melyek lehetõvé teszik az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek in vitro detektálását. 37. Eljárás a malária in vitro diagnózisára P. falciparum-mal feltehetõen fertõzõdött egyénben, mely eljárás a következõ lépéseket foglalja magában: az egyénbõl származó biológiai minta érintkezésbe hozása a 25–27. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagokkal, az ellenanyagok és a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ, P. falciparum-specifikus antigének közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását lehetõvé tévõ körülmények között, és az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek in vitro detektálása. 38. A malária in vitro diagnózisára alkalmas kit, mely 25–27. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagokat tartalmaz. 39. A 38. igénypont szerinti kit, mely tartalmaz olyan reagenseket is, melyek lehetõvé teszik az ellenanyagok és az MSP¹3 géncsaládnak a biológiai mintában esetlegesen jelen lévõ fehérjéi közt antigén-ellenanyag komplexek kialakulását, továbbá olyan reagenseket is, melyek lehetõvé teszik az esetlegesen képzõdött antigén-ellenanyag komplexek in vitro detektálását. 40. Rekombináns nukleotidszekvencia, mely 1–4. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptidet kódol. 41. A 40. igénypont szerinti rekombináns nukleotidszekvencia, mely számos MSP-3-c/d¹szerû motívumot tartalmazó fúziós fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz, ahol a motívumok közül legalább kettõ a SEQ ID NO: 25–30 bármelyikébõl van kiválasztva. 42. Rekombináns klónozó- és/vagy expressziós vektor, mely 40–41. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns nukleotidszekvenciát tartalmaz.

1

HU 007 367 T2

43. A 42. igénypont szerinti rekombináns klónozóés/vagy expressziós vektor, ahol a nukleotidszekvencia gazdasejtben történõ expresszió céljából promoter és szabályozóelemek ellenõrzése alatt áll, mely promoter és szabályozóelemek a gazdasejt szempontjából homológok vagy heterológok. 44. A 43. igénypont szerinti expressziós vektor alkalmazása Plasmodium falciparum elleni genetikai immunizálásra alkalmas gyógyszer elõállítására. 45. DNS-vakcina, mely 40–41. igénypontok bármelyike szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz. 46. Rekombináns gazdasejt, mely a 42–43. igénypontok bármelyike szerinti vektorral van transzformálva.

2

47. A 46. igénypont szerinti gazdasejt, mely baktérium, élesztõ, rovarsejt vagy emlõssejt. 48. Az 1–4. és 12–16. igénypontok bármelyike szerinti antigenikus polipeptid, vagy az 5–15. igénypontok 5 bármelyike szerinti antigenikus polipeptidkészítmény, malária elleni vakcinakészítményként történõ alkalmazásra. 49. A 25–27. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot vagy ellenanyag-keveréket tartalmazó készít10 mény, malária elleni gyógyszerként történõ alkalmazásra. 50. A 42–43. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor, Plasmodium falciparum elleni genetikai immunizálásra alkalmas gyógyszerként történõ al15 kalmazásra.

52

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

53

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

54

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

55

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

56

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

57

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

58

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

59

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

60

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

61

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

62

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

63

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

64

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

65

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

66

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

67

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

68

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

69

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

70

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

71

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

72

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

73

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

74

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

75

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

76

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

77

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

78

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

79

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

80

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

81

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

82

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

83

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

84

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

85

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

86

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

87

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

88

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

89

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

90

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

91

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

92

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

93

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

94

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

95

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

96

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

97

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

98

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

99

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

100

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

101

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

102

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

103

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

104

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

105

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

106

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

107

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

108

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

109

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

110

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

111

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

112

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

113

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

114

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

115

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

116

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

117

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

118

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

119

HU 007 367 T2 Int. Cl.: C12N 15/30

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest