(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

!HU000004256T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 004 256

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07K 14/47

(21) Magyar ügyszám: E 03 729533 (22) A bejelentés napja: 2003. 01. 17. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030729533 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1483290 A2 2003. 07. 24. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1483290 B1 2008. 08. 13.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 350208 P 2002. 01. 17.

(73) Jogosult: Takeda Pharmaceutical Company Limited, Osaka-shi, Osaka 541-0045 (JP)

US

(72) Feltalálók: Kawabe, Takumi, Numazu-city, Shizuoka 410-0011 (JP); KOBAYASHI, Hidetaka, Shizuoka 410-9070 (JP) (54)

(2006.01) A61K 38/04 (2006.01) C07K 7/06 (2006.01) C07K 5/062 (2006.01) C07K 7/08 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03059942 PCT/IB 03/000425

(74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest

Antiproliferatív aktivitású és/vagy nukleinsavat károsító ágenseket vagy kezeléseket erõsítõ peptidek és peptidmimetikumok

(57) Kivonat

HU 004 256 T2

A találmány tárgyát olyan vegyületek – például peptidek és peptidmimetikumok – képezik, amelyek – jóindulatú vagy rosszindulatú tumorsejtekkel kapcsolatos – sejtproliferációs rendellenességek kezelésére alkalmasak. Noha a találmány nem korlátozódik semmilyen konkrét mechanizmusra, a találmány szerinti ve-

gyületek, úgy tûnik, legalább részben gátolják a G2¹es sejtciklus-ellenõrzõ pontot. Így tehát a találmány szerinti vegyületek önmagukban, vagy nukleinsavat (például DNS¹t) közvetlenül vagy közvetetten károsító kezelésekkel kombinálva, sejtproliferáció-ellenes hatásúak.

A leírás terjedelme 42 oldal (ezen belül 9 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 004 256 T2

A találmány tárgyát olyan vegyületek – például peptidek és peptidmimetikumok – képezik, amelyek önmagukban, és nukleinsavat (például DNS¹t) közvetlenül vagy közvetetten károsító kezelésekkel kombinálva, sejtproliferáció-ellenes hatásúak. Ennélfogva, a találmány szerinti vegyületek sejtproliferáció gátlására és ennek folytán sejtproliferációs rendellenességek – például rákos megbetegedések – kezelésére alkalmasak. A találmány szerinti vegyületek különösen alkalmasak metasztázisos és nem metasztázisos, tömör vagy „folyékony” tumorok kezelésére. A sejtciklus „S” fázisból (DNS-replikáció), „M” fázisból (mitózis), és az „S”, illetve „M” fázisok közötti két „rés” (gap) fázisból („G1” és „G2” fázisok) áll. A sejtciklus ellenõrzési pontjai – például a DNS integritás helyzetének, a DNS replikációjának, a sejt méretének és a körülvevõ környezet monitorozásával – biztosítják a folyamat pontos elõrehaladását [Maller, Curr. Opin. Cell Biol., 3, 26 (1991)]. Többsejtes szervezeteknél a genom integritásának fenntartása különösen fontos, és a genom állapotát több ellenõrzési pont követi nyomon. Ezek közé tartozik a DNS replikációját megelõzõ „G1”, és a mitózis elõtti „G2” ellenõrzési pont. Az „S” fázisba való lépés elõtt döntõ jelentõségû, hogy a DNS¹t ért károsodások kijavításra kerüljenek, mivel ha az egyszer már károsodott DNS replikálódása esetén gyakran jönnek létre mutációk [Hartwell, Cell, 71, 543 (1992)]. A folyamat elõrehaladása során, a már létezõ DNS-károsodás „G1” és „G2” ellenõrzési pontokon történõ kijavításának elmaradása apoptózis és/vagy szerencsétlenség indukálását eredményezi. A legtöbb rákos sejt a „G1” ellenõrzési pont fehérjéit – például p53, Rb, MDM-2, p16INK4 és p19ARF – érintõ elváltozásokat hordoz [Levine, Cell, 88, 323 (1997)]. Másfelõl, a mutációk okozhatják a „G1” ellenõrzési pont sztringenciáját csökkentõ onkogén termék – például Ras, MDM–2 és ciklin D – túlzott mértékû expresszióját és/vagy túlzott mértékû aktiválását. E mutációk mellett, a növekedési faktorok túlexpressziója okozhat túlzott mértékû növekedési faktor, minek hatására növekedési faktor szignál megnõ és ez csökkentheti a „G1” ellenõrzési pont sztringenciáját. A funkcióvesztési és funkciónyerési (loss and gam-of-function) mutációkkal együtt, a növekedési faktor receptorainak vagy az utána következõ („downstream”) jelátalakító molekulák folyamatos aktiválása a „G1” ellenõrzési pont elnyomásával („overriding”) sejttranszformációt okozhat. A „G1” ellenõrzési pont megszûnésére vezethetõ vissza a magasabb mutációs ráta és a ráksejtekben megfigyelt sok mutáció. Ennek eredményeként, a túlzott DNS-károsodás elleni túlélést illetõen a legtöbb ráksejt a „G2” ellenõrzési ponttól függ [O’Connor és Fan, Prog. Cell Cycle Res., 2, 165 (1996)]. Úgy tartják, hogy a DNS¹t ért károsodás után, az élesztõtõl az emberig egy konzervált mechanizmus lépteti a sejtciklust a „G2” nyugalmi szakaszba. Károsodott DNS jelenlétében, a Cdc2/Ciklin B kináz inaktív, mivel azt a Cdc2 kináz 14¹es és 15¹ös treoninján lévõ foszforiláció gátolja vagy a Ciklin B fehérje szintje alacsony. A mitózis kezdetekor, a Cdc25 kettõs foszfatáz

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 2

2

eltávolítja ezeket a gátló foszfátokat és így aktiválja a Cdc2/Ciklin B kinázt. A Cdc2/Ciklin B aktiválásával indul el az M¹fázis. Osztódó élesztõben, Chk1 fehérjekinázra van szükség ahhoz, hogy károsodott DNS esetében a sejtciklus nyugalmi állapotba kerüljön. A Chk1 kináz számos rad géntermék után lép mûködése és mûködését a DNSkárosodás esetén bekövetkezõ foszforiláció szabályozza. A bimbózó élesztõben lévõ Rad53 és az osztódó élesztõ Cd1 kinázairól ismert, hogy nem replikálódott DNS-rõl jeleket vezetnek át. Úgy tûnik, hogy a Chk1 és Cds1 között valamiféle redundancia létezik, mivel a Chk1 és Cds1 együttes eltávolítása a károsodott DNS által indukált „G2” nyugalmi fázis megszakadását eredményezi. Érdekes, hogy a Chk1 és a Cds1 egyaránt foszforilálja a Cdc25¹öt és elõsegíti a Rad24 kötõdését a Cdc25-höz, melynek következtében a Cdc25 a citoszolba kerül és a Cdc2/Ciklin B nem aktiválódik. Ennélfogva, a Cdc25 e kinázok közös célpontjának tûnik, ami arra utal, hogy e molekula nélkülözhetetlen faktor a „G2” ellenõrzési pontban. Suganuma és munkatársai [Suganuma és mtsai. Cancer Research 59, 5887–5891 (1999)] mutatták ki a Cdc25 jelentõségét oly módon, hogy emberi Cdc25¹öt a HIV1-TAT egy részével fuzionálva megszüntették a „G2” ellenõrzési pontot. Ehhez hasonlóan, a WO 01/21771 sz. nemzetközi közzétételi irat módot ír le a „G2” sejtciklus Chk1 és/vagy Chk2 kinázok gátlásával történõ megszakítására, bemutatva ezzel a Cdc25 és Chk1 kinázok „G2” ellenõrzõ pontban betöltött jelentõségét. Emberekben, mind a hChk1 (az osztódó élesztõ Chk1 kinázának emberi homológja) és mind a Chk2/HuCds1 (a bimbózó élesztõ Rad53 és az osztódó élesztõ Cds1 fehérjéjének emberi homológja) foszforilálja a Cdc25C¹t a 216¹os szerinen (ami a DNS-károsodás esetén egy kritikus szabályozóhely). E foszforiláció kötõhelyet képez a 14¹3¹3s kisméretû savas fehérjék (az osztódó élesztõ Rad24 és Rad25 fehérjéinek emberi homológjai) részére. E foszforiláció regulációs szerepét egyértelmûen jelzi az a tény, hogy a Cdc25C¹n a 216¹os szerin alaninra cserélése emberi sejtekben megszakította a sejtciklus „G2” nyugalmi szakaszát. Azonban, a „G2” ellenõrzési pont mechanizmusa még nem teljesen ismert. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást. A találmány szerinti megoldással összhangban, a találmány tárgyát olyan peptidek és peptidmimetikumok képezik, amelyeknek a szabadalmi igénypontokban meghatározottak szerint egy vagy több, sejtproliferációt gátló, apoptózist vagy katasztrófát serkentõ, vagy nem kívánt (például valamilyen sejtproliferációs elváltozással jellemezhetõ) sejtproliferációt vagy sejttúlélést kezelõ hatásuk van. A találmány egyik megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ („contiguous”) peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 1. azonosító számon megadott szekvencia) vagy P6, P5, P4, P3, P2,

1

HU 004 256 T2

P1 (a SEQ ID NO. 2. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, Nal(2), (Phe2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például Tyr vagy Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidin csoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P2 jelentése Cha, Nal(2), (Phe2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például Tyr vagy Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidin csoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P3, P4, P5 jelent bármilyen aminosavat (például P4 jelentése Trp), vagy ahol P3, P4, P5 közül egy vagy több egyszerû szénlánc (például 11¹amino-undekánsav, 10¹amino-dekánsav, 9¹amino-nánsav, 8¹amino-kaprilsav, 7¹amino-heptánsav, 6¹amino-kapronsav, vagy egy vagy több hasonló, telítetlen szénkötést tartalmazó szerkezet) úgy, hogy a P2 és P6 közötti távolság nagyjából akkora, mint abban az esetben, amikor a P3, P4, P5 mindegyike aminosav; és P6 jelentése Bpa, Phe4NO2, bármilyen aminosav és Tyr (például SerTyr), bármilyen aminosav és Phe (például Ser-Phe), bármilyen aminosav, vagy semmi. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 3. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 4. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 5. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 6. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 7. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 8. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 9. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 10. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 11. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2. P1 (a SEQ ID NO. 12. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 13. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 14. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (a SEQ ID NO. 15. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11; P12 (a SEQ ID NO. 16. azonosító szá-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 3

2

mon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr vagy 1¹Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, vagy kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P2 jelentése Cha, Nal(2), (Phe2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), vagy oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például Tyr vagy Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzofurán, benzotiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P3, P4, P5 jelent bármilyen aminosavat (például P4 jelentése Trp), vagy ahol P3, P4, P5 közül egy vagy több egyszerû szénlánc (például 11¹amino-undekánsav, 10¹amino-dekánsav, 9¹amino-nánsav, 8¹amino-kaprilsav, 7¹amino-heptánsav, 6¹amino-kapronsav, vagy egy vagy több hasonló, telítetlen szénkötést tartalmazó szerkezet) úgy, hogy a P2 és P6 közötti távolság nagyjából akkora, mint abban az esetben, amikor a P3, P4, P5 mindegyike aminosav; és P6 jelentése Bpa, Phe4NO2, bármilyen aminosav és Tyr (például Ser-Tyr), bármilyen aminosav és Phe (például Ser-Phe), és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három bázikus aminosav, míg a többi bármilyen aminosav vagy hiányzik. A találmány egy további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 17. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 18. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 19. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 20. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, Nal(2), (Phe2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav, vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, vagy kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P2 jelentése Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5¹F), (Phe-4CF3), vagy oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például Tyr vagy Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidin csoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P3, P4, P5 jelent bármilyen aminosavat (például P4 jelentése Trp), vagy ahol P3, P4, P5 kö-

1

HU 004 256 T2

zül egy vagy több egyszerû szénlánc (például aminoundekánsav vagy 8¹amino-kaprilsav) úgy, hogy a P2 és P6 közötti távolság nagyjából akkora, mint abban az esetben, amikor a P3, P4, P5 mindegyike aminosav; és P6 jelentése Bpa, Phe4NO2, bármilyen aminosav és Tyr (például Ser-Tyr), bármilyen aminosav és Phe (például Ser-Phe), vagy bármilyen aminosav és semmi; és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három bázikus aminosav, míg a többi bármilyen aminosav vagy hiányzik. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 21. azonosító számon megadott szekvencia) vagy P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 22. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, vagy Phe; P2 is Cha, Nal(2), (Phe2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, vagy Phe; P3 is Ser, Arg, Cys, Pro, vagy Asn; P4 jelentése Trp; P5 is Ser, Arg, vagy Asn; vagy P3, P4, P5 jelentése egyetlen amino-undekánsav vagy 8¹amino-kaprilsav; és P6 jelentése Bpa, Phe4NO2, (Ser-Tyr), vagy (Ser-Phe). A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 23. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 24. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 25. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 26. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 27. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 28. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 29. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 30. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 31. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 32. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (a SEQ ID NO. 33. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 34. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, vagy Phe; P2 jelentése Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3), Bpa, Phe4NO2, Tyr, vagy Phe; P3 jelentése Ser, Arg, Cys, Pro, vagy Asn; P4 jelentése Trp; P5 jelentése Ser, Arg, vagy Asn; vagy P3, P4, P5 egyetlen amino-undekánsav vagy egyetlen 8¹amino-kaprilsav; P6 jelentése

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 4

2

Bpa, Phe4NO2, (d¹Ser-d-Tyr), vagy (d¹Ser-d-Phe); és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három Arg vagy Lys, míg a maradék bármilyen aminosav vagy akár hiányozhat is. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 35. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 36. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 37. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 38. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, vagy Nal(2); P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F), (Phe-4CF3); P3 jelentése Ser, P4 jelentése Trp; P5 jelentése Ser vagy Asn; P6 jelentése Bpa, Phe4NO2, (Ser-Tyr), vagy (Ser-Phe); és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három Arg, míg a maradék bármilyen aminosav vagy akár hiányozhat is. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 39. azonosító számon megadott szekvencia) vagy P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 40. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, vagy Nal(2); P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe3,4,5¹F) vagy (Phe-4CF3); P3 jelentése Ser, P4 jelentése Trp; P5 jelentése Ser, és P6 jelentése Bpa, vagy (Ser-Tyr). A találmány egy további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 41. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 42. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 43. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 44. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 45. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 46. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 47. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 48. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1 P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 49. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 50. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 51. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 52. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P7, P8, P9,

1

HU 004 256 T2

P6, P11, P12 (a SEQ ID NO. 53. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 54. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha, vagy Nal(2); P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F), (Phe-3,4,5¹F) vagy (Phe-4CF3); P3 bármilyen aminosavat (például Ser, vagy Pro) jelent; P4 jelentése d¹ vagy 1¹Trp; bármilyen aminosavat (például Ser, vagy Pro) jelent; P6 jelentése Bpa vagy (Ser-Tyr); P7 jelentése Arg; P8 jelentése Arg; P9 jelentése Arg; P10 jelentése Gln vagy Arg; P11 jelentése Arg; és P12 jelentése d¹ vagy 1¹Arg. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 55. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 56. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 57. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 58. azonosító számon megadott szekvencia). P1 jelentése Cha vagy Nal(2); P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F); P3 jelentése Ser; P4 jelentése Trp; P5 jelentése Ser; P6 jelentése Bpa vagy (Ser-Tyr); P7 jelentése Arg; P8 jelentése Arg; P9 jelentése Arg; P10 jelentése Gln vagy Arg; P11 jelentése Arg; és P12 jelentése Arg. A találmány elõnyös szempontja szerint, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 99. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa)(d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 100. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 59. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (4¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 60. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 67. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 68. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 71. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Cha) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 72. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 73. azonosító számon megadott szekvencia). A találmány további szempontjai szerint, peptid- és peptidmimetikum-szekvenciák tartalmaznak egy vagy

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

2

több 1¹es típusú vagy d¹típusú aminosavat; 1¹es típusú aminosavval szubsztituált d¹típusú aminosavat, vagy d¹típusú aminosavval szubsztituált 1¹es típusú aminosavat. A peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciák az alábbi aktivitások közül magukban foglalnak egyet vagy többet: Sejtproliferáció gátlása; egy adott sejt sejtciklusának „G2” ellenõrzési pontjának megszüntetése; sejtapoptózis serkentése; sejtkatasztrófa serkentése. A peptid- és peptidmimetikum-szekvenciák tartalmaznak körülbelül 6 aminosavtól körülbelül 12 aminosav hosszúságú, körülbelül 10 aminosavtól körülbelül 20 aminosav hosszúságú, körülbelül 18 aminosavtól körülbelül 25 aminosav hosszúságú körülbelül 25 aminosavtól körülbelül 100 aminosav hosszúságú, körülbelül 25 aminosavtól körülbelül 200 aminosav hosszúságú, vagy körülbelül 50 aminosavtól körülbelül 300 aminosav hosszúságú szekvenciát. Továbbá, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti peptid- és peptidmimetikum-szekvenciákat magukban foglaló készítmények A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott készítmény peptidmimetikum-szekvencia szerinti peptidet és nukleinsavat károsító ágenst tartalmaz. A találmány egy másik megvalósítási módjában, egy adott készítmény peptidmimetikum-szekvencia szerinti peptidet és proliferációt gátló ágenst tartalmaz. A találmány egy további megvalósítási módjában, egy adott készítmény gyógyászatilag elfogadható kötõanyagot és peptidmimetikumszekvencia szerinti peptidet, és – adott esetben – és nukleinsavat károsító ágenst vagy proliferációt gátló ágenst tartalmaz. Ezenfelül, a találmány tárgyát a találmány szerinti peptid- és peptidmimetikum-szekvenciákat – adott esetben – nukleinsavat károsító kezeléssel (például nukleinsavat károsító ágens), vagy proliferációt gátló ágenssel kombinálva tartalmazó készletek is képezik. A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott készlet peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát, és a találmány szerinti eljárás gyakorlatba vételében alkalmazandó utasításokat tartalmaz. A találmány elõnyös szempontja szerint, az utasítások a sejtproliferáció gátlására vonatkoznak. A találmány tárgyát a találmány szerinti peptid- és peptidmimetikum-szekvenciák alkalmazására szolgáló eljárások is képezik, ahol a sejtek emberi eredetû embrionális sejttõl különbözõ sejtek. A találmány egyik megvalósítása szerint, egy adott in vitro eljárásban sejtet érintkeztetünk a sejt proliferációjának gátlására elegendõ mennyiségû peptiddel vagy peptidmimetikummal. A találmány egy másik megvalósítási módjában, egy adott in vitro eljárásban sejtet érintkeztetünk nukleinsavat károsító ágenssel vagy sejtet teszünk ki nukleinsavat károsító kezelésnek. A találmány tárgya egy adott sejt, nukleinsavat károsító ágenssel vagy kezeléssel szembeni érzékenységének fokozására szolgáló in vitro eljárás. A találmány egyik megvalósítása szerint, egy adott in vitro eljárásban sejtet érintkeztetünk a sejt, nukleinsavat károsító ágenssel vagy kezeléssel szembeni érzékenységének

1

HU 004 256 T2

fokozására elegendõ mennyiségû peptiddel vagy peptidmimetikummal. Továbbá, a találmány tárgyát egy adott sejtre irányuló nukleinsav-károsítás fokozására szolgáló in vitro eljárások is képezik. A találmány egyik megvalósítása szerint, egy adott in vitro eljárásban sejtet érintkeztetünk a sejt nukleinsav-károsodásának fokozására elegendõ mennyiségû peptiddel vagy peptidmimetikummal. A találmány különféle szempontjai szerint, a találmány szerinti eljárásban a sejt tenyésztett sejt. A találmány további szempontjai szerint, az in vitro eljárásban sejtet érintkeztetünk nukleinsavat károsító ágenssel vagy sejtet teszünk ki nukleinsavat károsító kezelésnek. A találmány tárgya továbbá, a találmány szerinti peptid vagy peptidmimetikum egy adott mennyiségének alkalmazása sejtproliferációs rendellenesség kezelésre. A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott alkalmazás során a sejtproliferációs rendellenesség kezelésére hatékony mennyiségû peptidet vagy peptidmimetikumot alkalmazunk. A találmány elõnyös szempontjaiban, a sejtproliferációs rendellenesség jóindulatú vagy rosszindulatú, szilárd vagy „folyékony” tumor (például metasztázisos vagy nem metasztázisos szarkóma vagy karcinóma, vagy a vérképzést érintõ rák, mint például mielóma, limfóma vagy leukémia). A találmány további elõnyös szempontjaiban, a sejtproliferációs elváltozást tartalmazó sejtek legalább egy része a vérben, mellben, tüdõben, pajzsmirigyben, fejben vagy nyakban, agyban, nyirokcsomóban, gyomor-bél rendszerben, orrgaratban, ivari és húgyvezetékben, húgyhólyagban, vesében, hasnyálmirigyben, májban, csontban, izomban vagy bõrben található. A találmány szerinti alkalmazásba bármilyen módon történõ beadás is beletartozik. A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban, peptidet vagy peptidmimetikumot lokálisan, regionálisan vagy szisztémásan adjuk be. A találmány szerinti alkalmazásba az adott alany állapotának javulását eredményezõ kezelések is beletartoznak. A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban, a javulásba beletartozik egy vagy több csökkent sejtproliferáció, lecsökkent sejtszámok, megnövekedett sejtproliferáció gátlása, sejtszámokban bekövetkezõ növekedés gátlása, fokozott apoptózis, vagy lecsökkent túlélés, a sejtproliferációs rendellenességet tartalmazó sejtek legalább egy részében. A találmány szerinti alkalmazások közé tartozik továbbá az alany kezelése nukleinsavat károsító ágenssel, nukleinsavat károsító kezelés, az alany kezelése proliferációellenes ágenssel, vagy proliferációellenes kezelés. A találmány elõnyös szempontjaiban, az ágensbe vagy kezelésbe beletartozik egy adott hatóanyag [például kemoterápiás hatóanyag, mint például 5¹fluoro-uracil (5–FU), rebeccamicin, adriamicin (ADR), bleomicin (Bleo), pepleomicin, ciszplatin származék, mint például ciszplatin (CDDP) vagy oxaliplatin, vagy kamptotecin (CPT)], besugárzás (például besugárzás UV¹vel, IR¹rel, vagy alfa¹, béta- vagy gamma besugárzás), radioizotóp (például I131, I125, 90Y, l77Lu, 213Bi, vagy 211At), környezeti sokk (például hipertermia).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 6

2

Az alábbiakban ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat. 1. ábra: Bleomicinnel kezelt Jurkat-sejtekkel szemben alkalmazott vegyületek dózishatás görbéi. Az X tengely a dózist, az Y tengely a G2/M sejtek kezelés utáni %¹os arányát jelenti. 2. ábra: Kolhicinnel kezelt Jurkat-sejtekkel szemben alkalmazott vegyületek dózis-hatás görbéi. Az X¹tengely a dózist, az Y¹tengely a G2/M sejtek kezelés utáni %¹os arányát jelenti. 3A. és 3B. ábra: Különbözõ dózisú (A) bleomicinnel (Bleo) vagy (B) adriamicinnel (ADR) kezelt, emberi hasnyálmirigyrákból származó MIAPaCa2 sejtvonal. A begyûjtött sejteket DNS¹re nézve festettük és áramlás-citometriával analizáltuk. A „G1” stádium elõtti sejtek %¹os populációját elpusztult sejtekként tüntettük fel. 4A–4C. ábrák: A (1¹Gly)(1¹Arg)(1¹Lys)(1¹Lys) (1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Gln) (1¹Arg) (1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (1¹Arg)(1¹Ser)(1¹Pro)(1¹Ser)(1¹Tyr)(1¹Tyr) (a SEQ ID NO. 78. azonosító számon megadott szekvencia) „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ vegyület szerkezethatás összefüggését vázlatosan bemutató diagram, (A): 1¹Cha¹t érintõ aminosavszubsztitúciók „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitása bleomicinnel kezelt Jurkat-sejtekben, sorrendben feltüntetve, [1¹Cha=1-Nal(2)]>[1¹Ala(3¹Bzt)= 1-Nal(1)=1-Trp=1-Dph]>[1¹Ala(tBu)= Cys(tBu)=Leu]; (B): 1¹Cha¹t érintõ aminosavszubsztitúciók „M” fázis ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitása és/vagy nem specifikus toxicitása kolhicinnel kezelt Jurkat-sejtekben, sorrendben [Ala(3¹Bzt)=1-Nal(1)=1-Dph]>[1¹Cha=1Nal(2)]; (C): 1¹Phe-2,3,4,5,6-F¹et érintõ aminosavszubsztitúciók „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitása sorrendben feltüntetve, 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F)=1(Phe-3,4,5¹F)=1-(Phe-4CF3)]>[1¹(Phe3Br,4Cl,5Br)=1-(Phe-4Cl)=1-Tyr]. 5. ábra: Különféle, argininben gazdag szekvenciák „G2”¹t megszüntetõ aktivitása. A jelzett peptideket bleomicinnel együtt vagy anélkül adtuk Jurkat-sejtekhez. A G2/M sejtek %¹os arányát az Y tengelyen tüntettük fel. Az X tengelyen az alábbiak vannak feltüntetve: 1, Bleomicin önmagában; 2, 0,2 mg/ml; 3, 0,39 mg/ml; 4, 0,78 mg/ml; 5, 1,56 mg/ml; 6, 3,125 mg/ml; 7, 6,25 mg/ml; 8, 12,5 mg/ml; 9, 25 mg/ml; és 10, 50 mg/ml. A peptidszekvenciák az alábbiak: rrrqrrkkr, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)

1

HU 004 256 T2

(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Lys) (d¹Lys)(d¹Arg) (a SEQ ID NO. 79. azonosító számon megadott szekvencia); CBP501, (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia); no TAT, (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 81. azonosító számon megadott szekvencia); rqrr, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 82. azonosító számon megadott szekvencia); rrqrr, (d¹Bpa)(d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg)(d¹Arg) (a SEQ ID NO. 83. azonosító számon megadott szekvencia); rrrq, (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (a SEQ ID NO. 84. azonosító számon megadott szekvencia); és rrrqr, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 85. azonosító számon megadott szekvencia). 6. ábra: Különféle, (d¹Bpa)¹t nem tartalmazó peptidek „G2”¹t megszüntetõ aktivitása. A jelzett peptideket bleomicinnel együtt vagy anélkül adtuk Jurkat-sejtekhez. A G2/M sejtek %¹os arányát az Y tengelyen tüntettük fel. Az X tengelyen az alábbiak vannak feltüntetve: 1, Bleomicin önmagában; 2, 0,2 mg/ml; 3, 0,39 mg/ml; 4, 0,78 mg/ml; 5, 1,56 mg/ml; 6, 3,125 mg/ml; 7, 6,25 mg/ml; 8, 12,5 mg/ml; 9, 25 mg/ml; és 10, 50 mg/ml. A peptidszekvenciák az alábbiak: CBP0, (d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 86. azonosító számon megadott szekvencia); CBP451, ( d ¹ T y r ) ( d ¹ S e r ) ( d ¹ P r o ) (1¹Trp)(1¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 87. azonosító számon megadott szekvencia); CBP452, (d¹Tyr)(d¹Ser)(1¹Pro)(1¹Trp)(1¹Ser)(d¹Ph e-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 88. azonosító számon megadott szekvencia); és CBP501, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg)(d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia). 7. ábra: Különféle, argininben gazdag és lizinben gazdag peptidszekvenciák „G2”¹t meg-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 7

2

szüntetõ aktivitása. A jelzett peptideket Jurkat-sejtekhez adtuk (a fentiekben megadottak szerint), és kiszámítottuk a G2/M sejtek %¹os arányát (Y tengely). A peptidszekvenciák az alábbiak: CBP603, (d¹Bpa)(d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser)(dPhe 4NO2)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 89. azonosító számon megadott szekvencia); CBP607, (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 90. azonosító számon megadott szekvencia); CBP608, (d¹Bpa)(d¹Ser) (d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 91. azonosító számon megadott szekvencia); és CBP609, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Lys) (d¹Lys) (d¹Lys) (d¹Lys) (d¹Lys) (d¹Lys) (a SEQ ID NO. 92. azonosító számon megadott szekvencia). 8. ábra: A szekvencia argininben gazdag részének helye változtatható. A jelzett peptideket Jurkat-sejtekhez adtuk (a fentiekben megadottak szerint), és kiszámítottuk a G2/M sejtek %¹os arányát (Y tengely). A peptidszekvenciák az alábbiak: CBP501, (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) ( d ¹ P h e - 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ¹ F ) (d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia); CBP510, (d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Cha)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Ser)(d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Bpa) a SEQ ID NO. 93. azonosító számon megadott szekvencia); CBP511, (d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Bpa)(d¹Ser) (d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 94. azonosító számon megadott szekvencia); és CBP512, (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Cha)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Ser) (d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Bpa) (a SEQ ID NO. 95. azonosító számon megadott szekvencia). 9. ábra: A vizsgált szubsztituált peptidszekvenciák közül néhány szekvencia szerkezete. „G2”¹t megszüntetõ aktivitás a halvány árnyalással jelölt szubsztitúciók esetén növekedett (*), az „M” fázis ellenõrzési pontját megszüntetõ aktivitás és/vagy nemspecifikus aktivitás növekedett a sötéttel árnyalt szubsztitúcióknál (**), a többi szubsztitúció esetén az aktivitás körülbelül ugyanaz maradt. 10. ábra: A tumornövekedés (emberi hasnyálmirigy-karcinóma) gátlása scid egerekben

1

HU 004 256 T2

CBP501- és ciszplatinkezelés után. A „0” nap (Day 0) a kezelés kezdetét jelzi. Az egyes kezelési csoportok esetében, a tumorok átlagmérete és a standard eltérés az Y tengelyen, a kezelés kezdete után eltelt napok száma pedig az X tengelyen van feltüntetve. 11. ábra: Kinázgátló szekvenciarégiót és HIV-TAT transzdukciós szekvencián alapuló szekvenciarégiót tartalmazó peptidek „G2”¹t megszüntetõ aktivitása (lásd fent). A G2/M sejtek %¹os arányát az Y tengelyen tüntettük fel. Az X tengelyen az alábbiak vannak feltüntetve: 1, Bleomicin önmagában; 2, 0,2 mg/ml; 3, 0,39 mg/ml; 4, 0,78 mg/ml; 5, 1,56 mg/ml; 6, 3,125 mg/ml; 7, 6,25 mg/ml; 8, 12,5 mg/ml; 9, 25 mg/ml; és 10, 50 mg/ml. A peptidszekvenciák az alábbiak: CBP501, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2 , 3 , 4 , 5 , 6 ¹ F ) ( d ¹ C h a ) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia); CBP700, (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 96. azonosító számon megadott szekvencia); CBP701, (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 97. azonosító számon megadott szekvencia); CBP702, (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 98. azonosító számon megadott szekvencia); CBP703, (d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 99. azonosító számon megadott szekvencia). Peptidek „G2”¹t megszüntetõ aktivitásának összehasonlítása az „M”¹et megszüntetõ aktivitásukkal és/vagy nemspecifikus toxicitásukkal, ahol a „G2” megszüntetésére irányuló analízisben bleomicint, az „M” megszüntetésére irányulóban és/vagy a nemspecifikus toxicitásnál pedig kolhicint alkalmaztunk. A jelzett peptideket bleomicinnel vagy kolhicinnel együtt vagy anélkül adtuk Jurkat-sejtekhez. A G2/M sejtek %¹os arányát az Y tengelyen tüntettük fel. Az X tengelyen az alábbiak vannak feltüntetve: 1, Bleomicin vagy kolhicin önmagában; 2, 0,2 m/ml; 3, 0,39 m/ml; 4, 0,78 mg/ml; 5, 1,56 mg/ml; 6, 3,125 mg/ml; 1, 6,25 mg/ml; 8, 12,5 mg/ml; 9, 25 mg/ml; és 10, 50 mg/ml. A peptidszekvencia az alábbi: CBP501, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia). Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti megoldást.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 8

2

A találmány tárgyát sejtproliferációt gátló peptideket és peptidmimetikumokat tartalmazó vegyületek képezik. Ennélfogva, a találmány szerinti vegyületek alkalmasak sejtproliferációs rendellenességek vagy – például jóindulatú vagy rosszindulatú tumorsejtek – nemkívánatos vagy nem felesleges sejtproliferációval jellemzett fiziológiai állapotok kezelésre. Úgy tûnik, hogy a találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok sejtproliferációt gátló képessége, legalábbis részben, a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontjának megszüntetésére vezethetõ vissza. Mivel a sejtek, nukleinsavat ért károsodásra válaszként indukálhatók a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontjába való belépésre (ezzel a sejt számára lehetõvé válik, hogy még a DNS-replikáció elõtt kijavítsa a károsodást és létrejöjjön a sejtosztódás), a találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok a „G2” ellenõrzési pont gátlásával nukleinsavkárosító ágensekre és nukleinsavat károsító kezelési protokolokra érzékenyítik a sejteket. Elegendõ nukleinsavkárosodást felhalmozó sejtek, a megbontott „G2” ellenõrzési pont miatt nem lesznek képesek teljesen kijavítani a károsodott nukleinsavat. Az ilyen sejtek csökkent proliferációt mutatnak (például a túléléshez szükséges, kijavítatlan génmutáció miatt) és végül apoptózison mennek át. Normális „G1”¹el rendelkezõ sejtek kevésbé fogékonyak a károsodott nukleinsavak felhalmozására, mivel nukleinsavkijavítás a „G1” szakasz alatt is folyik. így, a normális sejtek a találmány szerinti vegyületek hatásaira kevésbé fogékonyak. Azonban, az olyan sejtek, amelyek sejtciklusában a „G1” ellenõrzési pont hibás vagy károsodott, sokkal valószínûbb, hogy felhalmoznak károsodott nukleinsavat, mivel a „G1” ellenõrzési pont hibás vagy károsodott, ezáltal kevésbé valószínû, hogy a sejtek képesek lesznek teljesen kijavítania károsodott nukleinsavat. így, hibás vagy károsodott „G1”¹et hordozó sejtek a „G2” ellenõrzési pontot megbontó, találmány szerinti peptidek vagy peptidmimetikumok valamelyikével történõ kezelése esetén még kevésbé valószínû, hogy a sejtek képesek lesznek teljesen kijavítania károsodott nukleinsavat. Ezért, a hibás vagy károsodott „G1”¹et hordozó sejtek különösen érzékenyek a találmány szerinti peptidekre vagy peptidmimetikumokra. így, peptideket vagy peptidmimetikumokat tartalmazó, találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók sejtproliferáció általános gátlására vagy megakadályozására, és különösen a hibás vagy károsodott „G1” ellenõrzési pontot hordozó sejtek proliferációját gátolják. A hibás vagy károsodott „G1” ellenõrzési pontot hordozó sejtek közé, minden korlátozás nélkül, gyorsan proliferálódó sejtek tartoznak. A sejtproliferációs rendellenességekre és fiziológiai állapotokra a gyorsan szaporodó sejtek, nem kívánt mértékben szaporodó sejtek vagy az olyan sejtek jellemzõk, amelyek ahelyett, hogy apoptózison mennének át, sejtciklusukban a „G1” ellenõrzési pont gyakran hibás vagy károsodott. Ennélfogva, úgy tûnik, hogy a találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok proliferációt gátló vagy apoptózist serkentõ képessége, legalábbis részben, a

1

HU 004 256 T2

sejtciklus „G2” ellenõrzési pontjának károsítására vezethetõ vissza. Hibás vagy károsodott „G1” ellenõrzési pont miatt gyorsan vagy nemkívánatos mértékben proliferálódó sejtek különösen vonzó célpontok. Peptideket vagy peptidmimetikumokat tartalmazó, találmány szerinti vegyületek önmagukban, további, nukleinsavat károsító vagy proliferáció elleni aktivitású kezelés nélkül is elnyomhatják a sejtproliferációt, mivel a „G2” ellenõrzési pont károsítása feltehetõen a nukleinsav-károsodás felszaporodásához vezet a sejtek osztódása során. Eszerint, abnormálisan vagy nem kívánt mértékben proliferálódó vagy túlélõ sejtek kezelhetõk önmagában a találmány szerinti vegyülettel, vagy nukleinsav-károsító kezeléssel (például kémiai ágenssel vagy kezelési protokollal) kombinálva a sejtek proliferációjának gátlása vagy megakadályozása, illetve sejtapoptózis/katasztrófa serkentése céljából. A gyorsan proliferálódó sejtekre (függetlenül attól, hogy azok normálisak¹e vagy sem, például ráksejtek) irányuló hagyományos sejtproliferációs ágensektõl eltérõen, a találmány szerinti vegyületek elõnyben részesítik az olyan sejteket, amelyekben a sejtciklus „G1” ellenõrzési pontja hibás vagy károsodott. például a ciszplatintól eltérõen, a CBP501 nem hat a HUVEC sejtek szaporodására (lásd Például 3. táblázat). A CBP501 nincs hatással a sejtciklus „M” nyugalmi szakaszára és/vagy a kolhicin indukálta nemspecifikus toxicitásra (lásd például 12. ábra). Ennek következtében, kicsi annak a valószínûsége, hogy a találmány szerinti vegyületek a sejtproliferáció elleni kezelésben hagyományos ágensek alkalmazásával járó nem kívánt mellékhatásokat (például csontvelõ-szuppresszió, hányinger, étvágyvesztés, hasmenés, hajhullás) produkálnák. Emellett, mivel a ráksejtek többségében a sejtciklus „G1” ellenõrzési pontja hibás vagy károsodott, a rákos sejtek fokozott érzékenységet fognak mutatni a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontját megszüntetõ, találmány szerinti vegyületekkel szemben. Az, hogy a normális sejtek kevésbé érzékenyek azt is jelenti, hogy a találmány szerinti, peptideket és peptidmimetikumokat tartalmazó vegyületek nagyobb mennyiségben alkalmazhatók. A találmány szerinti megoldásban, a találmány tárgyát a szabadalmi igénypontokban meghatározott, sejtproliferációt gátló aktivitású és/vagy a sejtciklus „G2” ellenõrzõ pontját megszüntetõ, peptideket és peptidmimetikumokat tartalmazó vegyületek képezik. A peptidek vagy peptidmimetikumok egy adott sejt proliferációját gátló vagy egy adott sejt apoptózisát serkentõ szekvenciákat tartalmaznak. A peptidek vagy peptidmimetikumok tartalmaznak olyan szekvenciákat is, amelyek módosítják a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontját. A találmány egyik megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 1. azonosító számon megadott szekvencia) vagy P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 2. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 9

2

4CF3), oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr, d¹ vagy 1¹Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P2 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr, d¹ vagy 1¹Phe), vagy bármely, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, vagy kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P3, P4, P5 bármilyen aminosavat jelent, vagy a P3, P4, P5 közül egy vagy több egyszerû szénlánc úgy, hogy a P2 és P6 közötti távolság nagyjából akkora, mint abban az esetben, amikor a P3, P4, P5 mindegyike aminosav (d¹ vagy 1¹Trp egy példa a P4¹re); P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, bármilyen aminosav és d¹ vagy 1¹Tyr (például d¹Ser-d-Tyr), bármilyen aminosav és d¹ vagy 1¹Phe (például d¹Ser-d-Phe), bármilyen aminosav, vagy semmi. A találmány különféle szempontjai szerint, az egyszerû szénláncú aminosav d¹ vagy 1–11-amino-undekánsav, d¹ vagy 1–10-amino-dekánsav, d¹ vagy 1¹9amino-nonánsav, d¹ vagy 1–8-amino-kaprilsav, d¹ vagy 1¹7-amino-heptánsav, d¹ vagy 1–6-amino-kapronsav, illetve egy vagy több telítetlen szénkötést tartalmazó hasonló szerkezet. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:3); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 4. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 5. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 6. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 7. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 8. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 9. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 10. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 11. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 12. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 13. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 14. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (a SEQ ID NO. 15. azo-

1

HU 004 256 T2

nosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 16. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr, d¹ vagy 1¹Phe), vagy bármilyen, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidin csoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, vagy kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P2 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal (2), d¹ vagy 1¹(Phe2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe4CF3), vagy oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr, d¹ vagy 1¹Phe), vagy bármilyen, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P3, P4, P5 bármilyen aminosavat jelent, vagy a P3, P4, P5 közül egy vagy több egyszerû szénlánc úgy, hogy a P2 és P6 közötti távolság nagyjából akkora, mint abban az esetben, amikor a P3, P4, P5 mindegyike aminosav (d¹ vagy 1¹Trp egy példa a P4¹re); P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, bármilyen aminosav és d¹ vagy 1¹Tyr (például d¹Ser-d-Tyr), bármilyen aminosav és d¹ vagy 1¹Phe (például d¹Ser-d-Phe), és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három bármilyen, bázikus aminosav, míg a maradék bármilyen aminosav vagy hiányzik. A találmány különféle szempontjai szerint, az egyszerû szénláncú aminosav d¹ vagy 1–11-amino-undekánsav, d¹ vagy 1–10-amino-dekánsav, d¹ vagy 1¹9-amino-nonánsav, d¹ vagy 1–8-amino-kaprilsav, d¹ vagy 1¹7-amino-heptánsav, d¹ vagy 1–6-amino-kapronsav, illetve egy vagy több telítetlen szénkötést tartalmazó hasonló szerkezet. A találmány egy további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 17. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 18. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 19. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 20. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr, d¹ vagy 1¹Phe), vagy bármilyen, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 10

2

tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, vagy kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P2 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal (2), d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3), oldalláncok tekintetében hasonló méretû területet elfoglaló aminosav (például d¹ vagy 1¹Tyr, d¹ vagy 1¹Phe), vagy bármilyen, oldalláncán egy vagy két aromás, piperidin, pirazin, primidin, piperazin, morfolin vagy pirimidincsoportot, vagy egy indol, pentalén, indén, naftalén, benzo-furán, benzo-tiofén, kinolin, indolin, kromán, kinoxalin, vagy kinazolincsoportot tartalmazó aminosav; P3, P4, P5 bármilyen aminosavat jelent, vagy a P3, P4, P5 közül egy vagy több egyszerû szénlánc úgy, hogy a P2 és P6 közötti távolság nagyjából akkora, mint abban az esetben, amikor a P3, P4, P5 mindegyike aminosav (d¹ vagy 1¹Trp egy példa a P4¹re); P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, bármilyen aminosav és d¹ vagy 1¹Tyr (például d¹Ser-d-Tyr), bármilyen aminosav és d¹ vagy 1¹Phe (például d¹Ser-d-Phe), bármilyen aminosav, vagy semmi; és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három bármilyen, bázikus aminosav, míg a maradék bármilyen aminosav vagy hiányzik. A találmány különféle szempontjaiban, az egyszerû szénláncú aminosav d¹ vagy 1¹amino-undekánsav, illetve d¹ vagy 1¹8-amino-kaprilsav. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 21. azonosító számon megadott szekvencia) or P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 22. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, d¹ vagy 1¹Tyr, illetve d¹ vagy 1¹Phe; P2 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, d¹ vagy 1¹Tyr, vagy d¹ vagy 1¹Phe; P3 jelentése d¹ vagy 1¹szerin, d¹ vagy 1¹arginin, d¹ vagy 1¹cisztein, d¹ vagy 1¹prolin, illetve d¹ vagy 1¹aszparagin; P4 jelentése d¹ vagy 1¹triptofán; és P5 jelentése d¹ vagy 1¹szerin, d¹ vagy 1¹arginin, vagy d¹ or 1¹aszparagin; vagy P3, P4, egyetlen d¹ vagy 1¹amino-undekánsav, illetve egyetlen d¹ vagy 1¹8-amino-kaprilsav; P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, (d¹Ser-d-Tyr), vagy (d¹Ser-d-Phe). A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 23. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 24. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 25. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 26. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO.

1

HU 004 256 T2

27. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 28. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 29. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 30. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 31. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 32. azonosító számon megadott szekvencia); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (a SEQ ID NO. 33. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 34. azonosító számon megadott szekvencia), ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, d¹ vagy 1¹Tyr, illetve d¹ vagy 1¹Phe; P2 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, d¹ vagy 1¹Nal(2), d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3), d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, d¹ vagy 1¹Tyr, illetve d¹ vagy 1¹Phe; P3 jelentése d¹ vagy 1¹szerin, d¹ vagy 1¹arginin, d¹ vagy 1¹cisztein, d¹ vagy 1¹prolin, illetve d¹ vagy 1¹aszparagin; P4 jelentése d¹ vagy 1¹triptofán; P5 jelentése d¹ vagy 1¹szerin, d¹ vagy 1¹arginin, illetve d¹ vagy 1¹aszparagin; vagy P3, P4, P5 egyetlen d¹ vagy 1¹amino-undekánsav, illetve egyetlen d¹ vagy 1¹8-amino-kaprilsav; P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, (d¹Ser-d-Tyr), vagy (d¹Ser-d-Phe); és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három jelentése d¹ vagy 1¹Arg, illetve d¹ vagy 1¹Lys, míg a maradék bármilyen aminosav vagy hiányzik. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 35. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 36. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (a SEQ ID NO. 37. azonosító számon megadott szekvencia); vagy P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 38. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, illetve d¹ vagy 1¹Nal(2); P2 jelentése d¹ vagy 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹ vagy 1¹(Phe-4CF3); és a P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három jelentése d¹ vagy 1¹Arg, míg a maradék bármilyen aminosav vagy hiányzik; P3 jelentése d¹ vagy 1¹serine; P4 jelentése d¹ vagy 1¹tryptophan; P5 jelentése d¹ vagy 1¹serine, illetve d¹ vagy 1¹aszparagin; P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, d¹ vagy 1¹Phe4NO2, (d¹ vagy 1¹Ser¹d¹, illetve 1¹Tyr), vagy (d¹ vagy 1¹Ser¹d¹, illetve 1¹Phe). A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (a SEQ ID NO. 39. azonosító számon megadott szekvencia)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 11

2

vagy P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 40. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése d¹ vagy 1¹Cha, illetve d¹ vagy 1¹Nal(2); P2 jelentése (d¹ vagy 1¹Phe-2,3,4,5,6¹F), (d¹ vagy 1¹Phe-3,4,5¹F) vagy (d¹ vagy 1¹Phe-4CF3); P3 jelentése d¹ vagy 1¹Ser; P4 jelentése d¹ vagy 1¹Trp; P5 jelentése d¹ vagy 1¹Ser; P6 jelentése d¹ vagy 1¹Bpa, illetve (d¹ vagy 1¹Ser¹d¹, illetve 1¹Tyr). A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 42. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a SEQ ID NO. 45. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a SEQ ID NO. 46. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 48. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 50. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P4 jelentése Trp; P7 jelentése Arg; P8 jelentése Arg; P9 jelentése Arg; P10 jelentése Gln vagy Arg; P11 jelentése Arg; P12 jelentése d¹ vagy 1¹Arg; P6 jelentése Bpa. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 56. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P3 jelentése Ser; P4 jelentése Trp; P5 jelentése Ser; P7 jelentése Arg; P8 jelentése Arg; P9 jelentése Arg; P10 jelentése Gln vagy Arg; P11 jelentése Arg; P12 jelentése Arg; P6 jelentése Bpa. A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha)(d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln)(d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln)(d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 100. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 59. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 60. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 67. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Bpa) (d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 68. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 71. azonosító számon megadott szekven-

1

HU 004 256 T2

cia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 73. azonosító számon megadott szekvencia). A találmány egy még további megvalósítási módjában, a részletes leírásban is megadott, összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia tartalmazza az alábbi szerkezetet: (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Tcp)(d¹Ser)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg)(d¹Arg) (a SEQ ID NO. 77. azonosító számon megadott szekvencia). Adott esetben, a találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok tartalmaznak poli-Lys és/vagy Arg szekvenciát a membránon történõ áthaladás támogatására. Mivel más aminosavszekvenciák (például HIVtat, felszíni receptorok/fehérjék ligandumai stb.) képesek áthaladni a membránon és más molekulák pedig alkalmazhatók a „G2”¹t megszüntetõ peptidek és peptidmimetikumok sejtbe történõ bejutásának elõsegítésére (például liposzómák, micellák és más lipidmolekulák, vírus- és más vektorok, elektroporáció stb.), a poliLys és/vagy Arg szekvenciák bevétele választható lehetõség. Eszerint, a találmány egy további megvalósítási módjában, a peptidek és peptidmimetikumok nem tartalmaznak a sejtbe történõ belépést támogató poliLys és/vagy Arg szekvenciát. Például a találmány egyik elõnyös megvalósítási módjában, a sejtmembránon való áthaladást támogató poli-Lys és/vagy Arg szekvenciák nélküli minimális szekvenciák közé tartozik a P6, P5, P4, P3, P2, P1, például d¹Bpa, d¹Ser, d¹Trp, d¹Ser, d¹Phe-2,3,4,5,6¹F, d¹Cha (a SEQ ID NO. 101. azonosító számon megadott szekvencia.) További ilyen, a sejtmembránon való áthaladást támogató poliLys és/vagy Arg szekvenciák nélküli minimális szekvenciák közé tartozik, például a d¹Bpa, d¹Cys, d¹Trp, d¹Ser, d¹Phe-2,3,4,5,6F, d¹Cha, d¹Cys (a SEQ ID NO. 103. azonosító számon megadott szekvencia); és a d¹Tyr, d¹Cys, d¹Pro, d¹Trp, d¹Ser, d¹Phe-2,3,4,5,6F, d¹Cha, d¹Cys (a SEQ ID NO. 104. azonosító számon megadott szekvencia); ahol adott esetben a Cys aminosav ciklizálva van. Ahogy már ismertettük, a találmány szerinti vegyületeknek sejtproliferáció elleni aktivitásuk vagy egyedül a „G2”¹t megszüntetõ aktivitásuk van. Sejtproliferációellenes aktivitás fokozható az ilyen, találmány szerinti vegyületek és közvetlenül vagy közvetetten nukleinsavkárosodást okozó kezelések kombinálásával. Sejtproliferáció-ellenes aktivitás fokozható továbbá az ilyen, találmány szerinti vegyületek és sejtproliferációt gátló kezelések kombinálásával, függetlenül attól, hogy a kezelés nukleinsavat károsít¹e vagy sem. Ennélfogva, a találmány tárgyát a találmány szerinti vegyületet (például peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát) és nukleinsavat károsító ágenst tartalmazó készítmények, és a találmány szerinti vegyületet (például peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát) és proliferációt gátló ágenst tartalmazó készítmények képezik. A leírás szerinti értelemben, a „módosítja a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontját”, „megbontja a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontját”, „károsítja a sejtciklus „G2” el-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 12

2

lenõrzési pontját” kifejezések és ezek nyelvtani változatai a kérdéses sejt sejtciklusának „G2” ellenõrzési pontjában történõ leállásának gátlását jelentik. A „G2” ellenõrzési pont megszüntetésével károsodott sejtciklusú sejtnél lecsökken az az idõ, amit a sejt a „G2” ellenõrzési pontban eltölt. Ez a csökkenés a „G2” ellenõrzési pont hiányától a „G2” ellenõrzési pontban eltöltött percek, órák, napok, hetek vagy, megfelelõ körülmények között, ennél hosszabb idõtartam csökkenéséig terjedhet. Így, a találmány szerinti vegyülettel érintkeztetett sejt „G2” ellenõrzési pontja idõtartamát tekintve rövidebb, mint amilyen normális esetben, a vegyület hiányában a kérdéses sejt esetében lenne. például a „G2” ellenõrzési pont idõtartamának csökkenése jelentheti azt, hogy amennyiben egy adott sejt, amely a „G2” pontban egy bizonyos idõt – például 4 órát – eltölt, a találmány szerinti vegyülettel érintkeztetve a „G2” pontban 4 óránál kevesebb például 3,5, 3, 2,5, 2, 1 vagy ennél kevesebb órát – tölt el. A leírás szerinti értelemben, az „apoptózis” kifejezés programozott sejthalált, és azzal kapcsolatosan a sejt fiziológiájában bekövetkezett változásokat, például nukleinsavfragmentáció, kaszpáz-aktiválás stb. jelent a technikában elfogadottak szerint. A „katasztrófa” kifejezés a mitózis folyamatában fellépõ hiba eredményeként bekövetkezett sejthalált jelent. Katasztrófa esetén, az apoptózisra jellemzõknél (például kaszpázok aktiválása, kromoszómakondenzáció stb.) kevesebb jellegzetesség figyelhetõ meg. A leírás szerinti értelemben, a „peptid”, „polipeptid” és „fehérje” kifejezéseket egymással felcserélhetõen alkalmazzuk, és két vagy több, amidkötéssel vagy egyenértékû, nem amid kötéssel egymáshoz kovalensen kapcsolt aminosavat jelent. A találmány szerinti peptid bármilyen hosszú lehet. például a peptid állhat körülbelül 5 és körülbelül 100 közötti vagy annál több aminosavból, például lehet 5–12, 12–15, 15–18, 18–25, 25–50, 50–75, 75–100, vagy annál több aminosav hosszúságú. A találmány szerinti peptidek tartalmaznak 1¹ vagy d¹izomereket, és 1¹ és d¹izomerek kombinációit. A peptidek tartalmazhatnak jellemzõen a fehérjék poszt-transzlációs feldolgozásával kapcsolatos módosításokat, például ciklizálást (például diszulfid- vagy amidkötés), foszforilálást, glikozilálást, karboxilálást, ubiquitinálást, mirisztilezést, vagy lipidálást. A találmány tárgyát képezõ peptidek tartalmaznak továbbá olyan vegyületeket is, amelyek aminosavak szerkezeti és funkcionális analógjai, például szintetikus vagy nem természetes aminosavakat vagy aminosavanalógokat tartalmazó peptidmimetikumok, ha a mimetikumnak van egy vagy több funkciója vagy aktivitása. Ennélfogva, a találmány szerinti vegyületek tartalmaznak „mimetikum” és „peptidmimetikum” formákat. A leírás szerinti értelemben, a „mimetikum” és „peptidmimetikum” kifejezések a találmány szerinti peptidekével lényegében azonos szerkezeti és/vagy funkcionális jellemzõkkel rendelkezõ, szintetikus kémiai vegyületet jelent. A mimetikum állhat teljes egészében szintetikus, nem természetes aminosavanalógokból, vagy lehet egy vagy több természetes peptidbõl szár-

1

HU 004 256 T2

mazó aminosavat és egy vagy több nem természetes aminosavanalógot tartalmazó kimérikus molekula. A mimetikum tartalmazhat bármennyi természetes konzervatív aminosavszubsztitúciót, amennyiben az ilyen szubsztitúciók nem rontják el a mimetikum aktivitását. Akárcsak a találmány szerinti, konzervatív változatú polipeptidek esetében, rutin tesztelést lehet alkalmazni annak meghatározására, hogy a kérdéses mimetikumnak meg van¹e a szükséges aktivitása, például hogy van¹e kimutatható aktivitása a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontjának megszüntetését illetõen. Ezért egy, valamilyen alanynak való beadás vagy sejttel történõ érintkeztetés esetén a sejtciklus „G2” ellenõrzési pontját kimutathatóan felbomlasztó mimetikumnak „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitása lehet. Peptidmimetikum-készítmények bármilyen kombinációban tartalmazhatnak nem természetes, jellemzõen három szerkezeti csoportból származó szerkezeti összetevõket: a) aminosavakat összekapcsoló, természetes amidkötéstõl („peptidkötés”) eltérõ csoportok; b) természetesen elõforduló aminosavak helyett lévõ nem természetes aminosavak (residues); vagy c) másodlagos szerkezeti jellemzõket utánzó aminosavak (residues), azaz másodlagos szerkezetet – például b¹kanyar¹, g¹kanyar¹, b¹lemez¹, a¹hélix konformációt, és hasonlókat – indukáló vagy stabilizáló utánzó aminosavak (residues). Például egy adott polipeptid akkor nevezhetõ mimetikumnak, ha egy vagy több aminosava az amidkötéstõl eltérõ kémiai módon van összekapcsolva. Peptidmimetikumot alkotó egyedi aminosavak összekapcsolhatók amidkötésekkel, nem természetesés nem amid kémiai kötésekkel, más kémiai kötésekkel vagy kapcsolási eljárással, így például glutáraldehiddel, N¹szukcininimid-észterekkel, bifunkcionális maleimidekkel, N,N’-diciklohexil-karbodiimiddel (DCC) vagy N,N’-diizopropil-karbodiimiddel (DIC). Az amidkötésre nézve alternatív kapcsolócsoportok közé tartozik, például a ketometilén [például –C(=O)–CH2– a –C(=O)–NH– csoporthoz], amino-metilén (CH2–NH), etilén, olefin (CH=CH), éter (CH2–O), tioéter (CH2–S), tetrazol (CN4–), tiazol, retroamid, tioamid, vagy észter [ld. például Spatola, „Peptide and Backbone Modifications,” Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, 7. köt., 267–357, Marcel Decker, NY (1983)]. Az említettek szerint, egy adott peptid akkor tekinthetõ mimetikumnak, ha természetes körülmények között elõforduló aminosav helyett egy vagy több nem természetes aminosavat tartalmaz. Nem természetes aminosavak a technikában ismertek. Természetes aminosavak mimetikumaként alkalmazható nem természetes aminosavak közé, például elõnyösen, aromás aminosavak mimetikumai tartoznak. Így például D¹ vagy L¹naftil-alanin; D¹ vagy L¹fenil-glicin; D¹ vagy L¹2 tienilalanin; D¹ vagy L-1, -2, 3¹, vagy 4¹ pirenil-alanin; D¹ vagy L¹3 tienil-alanin; D¹ vagy L¹(2¹piridinil)-alanin; D¹ vagy L¹(3¹piridinil)-alanin; D¹ vagy L¹(2¹pirazinil)-alanin; D¹ vagy L¹(4¹izopropil)-fenil-glicin; D¹(trifluoro-metil)-fenil-glicin; D¹(trifluoro-metil)-fenil-alanin; D¹p-fluoro-fenilalanin; D¹ vagy L¹p-bifenil-fenil-alanin; K¹ vagy L¹p-me-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 13

2

toxi-bifenil-fenil-alanin; D¹ vagy L¹2-indol-(alkil)-alaninek; és D¹ vagy L¹alkilaininek, ahol az alkil lehet szubsztituált vagy nem szubsztituált metil, etil, propil, hexil, butil, pentil, izopropil, izobutil, sec-izotil, izopentil, vagy nem savas aminosav. Egy adott természetes aminosav aromás gyûrûi helyett alkalmazható nem természetes aminosavból származó aromás gyûrûk közé tartozik, például a tiazolil, tiofenil, pirazolil, benzimidazolil, naftil, furanil, pirrolil, és piridil aromás gyûrûk. Savas aminosavak mimetikumai elõállíthatók nemkarboxil-aminosavak szubsztitúcióival a negatív töltés fenntartása mellett; (foszfono)alanin; és szulfatált treonin. Karboxil-oldalcsoportok (például aszpartil- vagy glutamilcsoportok) is módosíthatók szelektíven (R’–N–C–N–R’) karbodiimidekkel – így, például 1¹ciklohexil-3-(2¹morfolinil-(4¹etil)-karbodiimid vagy 1¹etil-3(4¹azonia-4,4-dimetol-pentil)-karbodiimid – végzett reakcióval. Ammóniumionokkal végzett reakcióval az aszpartil- vagy glutamilcsoportok is átalakíthatók aszparaginil- vagy glutaminilcsoportokká. Bázikus aminosavak mimetikumai elõállíthatók szubsztitúcióval, például lizin és arginin addíciójával, ornitin, citrullin aminosavakkal, vagy (guanidino)-ecetsavval, vagy (guanidino)-alkil-ecetsavval, ahol az alkil lehet szubsztituált vagy nem szubsztituált metil, etil, propil, hexil, butil, pentil, izopropil, izobutil, sec-izotil, izopentil, vagy nem savas aminosav. Nitrilszármazék (például a COOH helyett CN¹csoportot tartalmazó származék) aszparaginra vagy glutaminra szubsztituálható. Aszparaginil- és glutaminilcsoportokból deaminálással a megfelelõ aszpartil- vagy glutaminilcsoportok állíthatók elõ. Argininmimetikumok elõállíthatók arginil egy vagy több reagenssel, így például fenilglioxál, 2,3-butándion, 1,2-ciklohexándion vagy ninhidrin, adott esetben, lúgos körülmények között végzett reagáltatásával. Tirozin aminosav mimetikumai elõállíthatók tirozil aromás diazóniumvegyületekkel vagy tetranitrometánnal történõ reagáltatásával. N¹acetil-imidazol O¹acetilezet tirozilek, tetranitrometán pedig 3¹nitroszármazékok elõállítására alkalmazható. Lizinmimetikumok elõállíthatók (és aminoterminális aminosavak megváltoztathatók) lizinil szukcinilsavanhidriddel vagy más karboxilsavanhidridekkel történõ reagáltatásával. Lizin- és más a¹amino-csoportot tartalmazó aminosavmimetikumok elõállíthatók imidoészterekkel, például metil-pikolinimidát, piridoxál-foszfát, piridoxál, klór-borohidrát, trinitro-benzol-szulfonsav, O¹metil-izokarbamid, 2,3-pentándion, végzett reakcióval és glioxiláttal végzett reakcióban transzamidázzal történõ katalízis mellett. Metioninmimetikumok elõállíthatók metionin-szulfoxiddal végzett reakcióval. Prolinmimetikumok közé tartozik, például a pipekolsav, tiazolidin-karboxilsav, 3¹ vagy 4¹hidroxi-prolin, dehidroprolin, 3¹ vagy 4¹metilprolin, és a 3,3-dimetil-prolin. Hisztidinmimetikumok elõállíthatók a hiszitdilcsoport dietil-prokarbonáttal vagy para-bróm-fenacil-bromiddal végzett reakciójával. További mimetikumok közé tartoznak, például prolin vagy lizin hidroxilálásával; szerû- vagy treonilcsoportok

1

HU 004 256 T2

hidroxilcsoportjainak foszforilálásával; lizin, arginin és hisztidin a¹amino-csoportjának metilálásával; az N¹terminális amin acetilálásával; a fõlánc amidcsoportjainak metilálásával vagy N¹metil aminosavakkal végzett szubsztitúciójával; vagy C¹terminális karboxilcsoportok amidálásával elõállított mimetikumok. Egy vagy több aminosav helyettesíthetõ az ellentétes kiralitású aminosavval (vagy peptidmimetikum-csoporttal). Eszerint, bármilyen, természetes körülmények között L¹konfigurációjú aminosav (amelyet a kémiai entitás szerkezetétõl függõen, „R’’ vagy „S” változatnak is neveznek) helyettesíthetõ azonos, de ellentétes kiralitású aminosavval vagy mimetikummal (amelyet D¹aminosavnak neveznek, de emellett, „R” vagy „S” formának is hívhatnak). A találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok közé tartoznak továbbá az itt meghatározott szekvenciák módosított formái is, amennyiben a módosított forma legalábbis részben megtartja a nem módosított vagy referenciapeptid vagy ¹peptidmimetikum funkcióját. Például módosított peptid vagy peptidmimetikum legalább részben megtartja a sejtproliferációt gátló vagy „G2”¹t megszüntetõ aktivitását, de a módosított peptid vagy peptidmimetikum sejtproliferációt gátló vagy „G2”¹t megszüntetõ aktivitása lehet fokozott vagy lecsökkent a referenciapeptid vagy ¹peptidmimetikum aktivitásához képest. Módosított peptideknek és peptidmimetikumoknak lehet egy vagy több, a más csoporttal szubsztituált, a szekvenciához adott vagy a szekvenciából törölt aminosava. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány szerinti peptid vagy peptidmimetikum egy vagy több (például 1–3, 3–5, 5–10 vagy ennél több) szubsztitúcióval, addícióval vagy delécióval rendelkezik. A találmány egyik szempontja szerint, a szubsztitúció olyan aminosavval vagy mimetikummal történik, amelynek oldallánca a referencia aminosavval vagy mimetikummal (a szubsztituálni kívánt aminosav vagy mimetikum) hasonló teret foglal el. A találmány egy további szempontja szerint, a szubsztitúció nem emberi eredetû, de az emberi aminosavhoz szerkezetileg hasonló aminosavval történik. A találmány egy elõnyös szempontja szerint, a szubsztitúció konzervatív aminosavszubsztitúció. A leírás szerinti értelemben, a „hasonló tér” kifejezés olyan kémiai csoportot („moiety”) jelent, amely a referencia csoportéhoz hasonló méretû, háromdimenziós teret foglal el. Jellemzõ, hogy a hasonló méretû teret elfoglaló csoport méretét tekintve hasonló a referenicacsoporthoz. „Oldallánc tekintetében hasonló teret elfoglaló” aminosavnak vagy mimetikumnak olyan oldallánca van, amely a referencia-aminosavhoz vagy mimetikumhoz hasonló méretû, háromdimenziós teret foglal el. A d¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹mhoz hasonló méretû, háromdimenziós teret foglal el. A d¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), 1¹(Phe-2,3,4,5,6¹F), d¹(Phe3,4,5¹F), 1¹(Phe-3,4,5¹F), d¹(Phe-4CF3) vagy 1¹(Phe4CF3)¹ra specifikus példák a (1 vagy d¹Phe2R1,3R2,4R3,SR4,6R5) aminosavak, amelyekben az R1, R2, R3, R4, R5 lehet klorid, bromid, fluorid, jodid,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

hidrogén, hidrogén-oxid vagy hiányozhat. Kis molekulák, például fluorid esetén (amelynek mérete körülbelül 1 Ångstrom) a hasonló tér a csoport hiánya lehet. A „konzervatív szubsztitúció” kifejezés egy aminosav biológiailag, kémiailag vagy szerkezetileg hasonló aminosavval való helyettesítését jelenti. Biológiailag hasonló kifejezés azt jelenti, hogy a szubsztitúció az adott biológiai aktivitással, például sejtproliferáció-ellenes vagy „G2”¹t megszüntetõ aktivitással kompatibilis. Szerkezetileg hasonló kifejezés azt jelenti, hogy az aminosavaknak hasonló hosszúságú oldalláncai vannak (például alanin, glicin és szerin), vagy hasonló méretûek. Kémiai hasonlóság azt jelenti, hogy az aminosavak ugyanazon töltésûek, vagy egyaránt hidrofilek vagy hidrofóbok. Elõnyös példák közé tartoznak az alábbiak: egyetlen hidrofób aminosav, például izoleucin, valin, leucin vagy metionin szubsztitúciója egy másikkal, vagy egyetlen poláros aminosav egy másikra való cseréje, mint például az arginin szubsztitúciója lizinre, a glutaminsavé aszparaginsavra, vagy a glutaminé aszparaginra, a szeriné pedig treoninra, és hasonlók. Ennélfogva, a találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok közé tartoznak az 1. táblázatban megadott peptid- és peptidmimetikum-szekvenciákkal nem azonos szekvenciájú peptidek és peptidmimetikumok. A találmány oltalmi körébe tartoznak az 1. táblázatban megadott szekvenciával 50%-ban, 60%-ban, 70%-ban, 75%-ban, 80%-ban, 85%-ban, 90%-ban, 95%, vagy annál nagyobb arányban azonos peptidek és peptidmimetikumok. A találmány szerinti vegyület – így a peptidek és peptidmimetikumok – a technikában ismert bármely eljárással elõállíthatók és izolálhatók. Peptidek szintetizálhatók, teljes egészükben vagy részben, a technikában ismert kémiai eljárásokkal [ld. például Caruthers, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215–223 (1980); Horn, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225–232 (1980); és Banga, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Lancaster, PA (1995)]. Peptidszintézis végezhetõ különféle szilárd fázisú eljárások [ld., például Roberge, Science 269, 202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol, 289, 3–13 (1997)] és – például az ABI 431A peptidszintetizáló (Perkin Elmer), a gyártó útmutatásai szerint végzett – automatizált szintézis alkalmazásával. Egyedi szintetikus aminosavak és mimetikumokat tartalmazó polipeptidek szintetizálhatók a technikában ismert különféle eljárásokkal és módszerekkel [ld., például Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman és mtsai., John Wiley & Sons, Inc., NY]. Peptidek és peptidmimetikumok kombinatorikus eljárások alkalmazásával is szintetizálhatók. Peptid- és peptidmimetikumkönyvtárak elõállítására szolgáló eljárások jól ismertek, és ilyenek közé tartozik, például a többtûs, teafilter és split-couple-mix eljárások [ld. például al¹Obeidi, Mol. Biotechnol. 9, 205–223 (1998); Hruby, Curr. Opin. Them. Biol. 1, 114–119 (1997); Ostergaard, Mol. Divers. 3, 17–27 (1997); és Ostresh, Methods Enzymol. 267, 220–234 (1996)]. Módosított peptidek továbbá ké-

1

HU 004 256 T2

miai módosítási eljárásokkal is elõállíthatók [ld., például Belousov, Nucleic Acids Res. 25, 3440–3444 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19, 373–380 (1995); és Blommers, Biochemistry 33, 7886–7896 (1994)]. Immunogénebb peptid elõállítása, rekombináns úton szintetizált peptid könnyebb izolálhatósága vagy antitestek, illetve antitestet expresszáló B¹sejtek azonosítása és izolálása céljából, a peptidek szintetizálhatók és expresszálhatók egy vagy több további doménnel kapcsolásával képzett fúziós fehérjeként. Kimutatást és tisztítást elõsegítõ domének közé tartoznak, például fémkelát-képzõ peptidek, mint például immobilizált fémeken történõ tisztítást lehetõvé tevõ polihisztidinszakaszok és hisztidin-triptofán modulok; Immobilizált immunglobulinon való tisztítást lehetõvé tevõ protein¹A domének, és a FLAGS kiterjesztéses/affinitástisztítási rendszerben (Immunex Corp, Seattle WA) hasznosított domén. A tisztításhoz szükséges domén és a peptid közé beépített lehasítható linkerszekvencia, például Xa faktor vagy enterokináz (Invitrogen, San Diego CA), alkalmazható a peptidtisztítás elõsegítésére. például egy adott expressziós vektor tartalmazhat hat hisztidin aminosavhoz, majd az azokhoz kapcsolt tioredoxin vagy enterokináz hasítóhelyhez kapcsolt, peptidet kódoló szekvenciát [ld. például Williams, Biochemistry 34:1787–1797 (1995); Dobeli, Protein Expr. Purif. 12, 404–14 (1998)]. A hisztidin aminosavak elõsegítik a fúziós fehérje kimutatását és tisztítását, míg az enterokináz hasítóhely lehetõvé teszi a peptid elkülönítését a fúziós fehérje maradék részétõl. Fúziós fehérjéket kódoló vektorokkal és fúziós fehérjék alkalmazásával kapcsolatos eljárások a technikában ismertek [ld., például Kroll, DNA Cell. Biol., 12, 441–53 (1993)]. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti peptideket kódoló nukleinsavak. Elõnyös, ha a nukleinsavak körülbelül 8–12, 12–15, 15–18, 15–20, 18–25, 20–25, 25–35, 25–50, vagy 50–100, vagy annál több aminosav hosszúságú, találmány szerinti peptidszekvenciákat kódolnak. A „nukleinsav” és „polinukleotid” kifejezéseket egymással felcserélhetõen alkalmazzuk, és bármilyen formájú nukleinsavat, ideértve a dezoxiribonukleinsavat (DNS) és ribonukleinsavat (RNS), jelentenek. A nukleinsav lehet kettõs szálú, egyesszálú, illetve triplex, lineáris vagy cirkuláris. Nukleinsavak közé tartozik genomi DNS, cDNS, és antiszensz. RNS nukleinsav lehet átszabott (spliced) vagy nem átszabott mRNS, rRNS, tRNS, vagy antiszensz (például RNSi). A találmány szerinti nukleinsavak közé tartoznak természetes körülmények között elõforduló, szintetikus nukleinsavak, és nukleotidanalógok és ¹származékok. Ilyen megváltoztatott vagy módosított polinukleotidok közé tartoznak, például nukleázok elleni rezisztenciát biztosító analógok. A nukleinsavak hosszúsága a példaként felhozott peptidszekvenciáknál rövidebb is lehet. például a peptidszekvencia bármilyen alszekvenciája kódolhat proliferáció ellenes vagy „G2”¹t megszüntetõ aktivitású peptidet. Nukleinsavak elõállíthatók a különféle jól ismert standard klónozó és kémiai szintetikus eljárások bár-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

melyikének alkalmazásával, és irányított mutagenezissel vagy a szakember számára ismert más rekombináns eljárások alkalmazásával szándékosan módosíthatók. A nukleotidok tisztasága meghatározható szekvenálással, gélelektroforézissel és hasonlókkal. Nukleinsavak beilleszthetõk olyan nukleinsavkonstrukciókba, amelyekben a nukleinsav expresszióját „expressziós szabályozóelem” befolyásolja vagy szabályozza. Az ilyen kombinációt nevezik „expressziós kazettának”. Az „expressziós szabályozóelem” kifejezés egy vagy több olyan szekvenciaelemet jelent, amely az ahhoz mûködõképesen kapcsolt nukleinsavszekvencia expresszióját szabályozza vagy befolyásolja. Nukleinsavszekvenciához mûködõképesen kapcsolt expressziós szabályozóelem a nukleinsavszekvencia transzkripcióját és – alkalmas esetben – annak transzlációját szabályozza. A „mûködõképesen kapcsolt” kifejezés olyan funkcionális melléhelyezést (juxtaposition) jelent, ahol az ekként leírt komponensek olyan kapcsolatban állnak, amely lehetõvé teszi, hogy azok az elõre eltervezett módon mûködjenek. Jellemzõ expressziós szabályozóelemek a gén 5’¹ vagy 3’¹végére vannak elhelyezve, de akár intronok is lehetnek. Promoterek általában a kódolószekvencia 5’¹végén vannak elhelyezve. A „promoter” kifejezés a transzkripció irányításához elégséges, minimális szekvenciaelemet jelent. Expressziót szabályozó elemek közé tartoznak promoterek, enhancerek, transzkripció-terminátorok, génlecsendesítõk (gene silencers), fehérjét kódoló gén elõtt lévõ startkodon (például ATG). Expressziós szabályozóelemek aktiválják a konstitutív transzkripciót, indukálható transzkripciót (azaz az aktiváláshoz külsõ jelre van szükség), vagy elnyomják a transzkripciót (azaz, egy adott jel a transzkripciót aktiváló jel eltávolításával kikapcsolja a transzkripciót). Az expressziós kazetták tartalmazhatnak olyan, indukálható szabályozóelemeket, amelyek elegendõk ahhoz, hogy a génexpresszió specifikus sejt- vagy szövettípusokban szabályozható legyen (azaz, szövetspecifikus szabályozóelemek). A találmány szerinti nukleinsavak beilleszthetõk plazmidba egy adott gazdasejtben való felszaporítás és azt követõ genetikai manipuláció céljából. A plazmid olyan nukleinsav, amely egy adott gazdasejtben stabilan szaporítható; adott esetben tartalmaz expressziós szabályozóelemeket a peptidkódoló nukleinsavnak a gazdasejtben való expressziójának meghajtására. A leírás szerinti értelemben, a „vektor” kifejezés a plazmid kifejezéssel azonos értékû, és tartalmazhat expressziós szabályozóelemet egy adott gazdasejtben történõ expresszióhoz. Plazmidok és vektorok általában legalább egy, gazdasejtben való felszaporításhoz szükséges replikációs origót és promotert tartalmaznak. Ennélfogva, a plazmidok és vektorok alkalmazhatók peptidet kódoló nukleinsavak genetikai manipulálására, peptidek elõállítására, és a peptidet gazdasejtben vagy például egész szervezetben történõ expresszálására. Ennélfogva, peptidek expresszálhatók bakteriális rendszerekben konstitutív promoterek, például T7, vagy

1

HU 004 256 T2

indukálható promoterek, például bakteriofág 1 pL promotere, piac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibrid promoterek) alkalmazásával; élesztõben, konstitutív promoterek, például ADH vagy LEU2, illetve indukálható promoterek, mint például GAL, alkalmazásával [ld., például Ausubel és mtsai., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience (1988); Grant és mtsai., Methods in Enzymology, 153, 516 (1987), Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152, 673, Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y. (1987); és, Strathern és mtsai., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor-Press (1982); Rothstein, DNA Cloning, A Practical Approach, D. M. Glover, IRL Press, Wash., D. C. (1986)]; rovarsejt-rendszerben konstitutív vagy indukálható promoterrel, például ekdizon, alkalmazásával; és emlõseredetû sejtrendszerekben, konstitutív promoterek, például SV40, RSV, vagy az emlõssejt genomjából származó indukálható promoterek, például metallotionein IIA promoter, hõsokk promoter, vagy emlõsvírusból származó promoterek, például adenovírus-eredetû késõi promoter vagy az indukálható, egér emlõtumorvírus hosszú terminális ismétlõ szakaszának alkalmazásával. Peptidexpressziós-rendszerek közé tartoznak még in vivo alkalmazásra tervezett vektorok közé tartoznak adenovírusvektorok (US 5.700.470 sz. és US 5.731.172 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) adenoasszociált vektorok (US 5.604.090 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat), herpes simplex vírusvektorok (US 5.501.979 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) és retrovírus-vektorok (US 5.624.820 sz., US 5.693.508 sz. és US 5.674.703 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok, WO92/05266 sz. és WO92/14829 sz. nemzetközi közzétételi iratok). Borjú-papillómavírust (BPV) is alkalmaztak már génterápiára (US 5.719.054 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Ilyen génterápiás vektorok közé tartoznak CMV¹n alapuló vektorok (US 5.561.063 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Továbbá, a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti peptideket kódoló, gazdasejtekbe illesztet nukleinsavak. A gazdasejt prokarióta sejt, eukarióta sejt, például élesztõsejt vagy emlõseredetû (például emberbõl, fõemlõsbõl stb. származó) sejt. A leírás szerinti értelemben, a „gazdasejt” kifejezés olyan sejt, amelyben a beillesztett nukleinsav felszaporítható, átírható vagy a nukleinsav által kódolt polipeptid expresszálható. A kifejezés a kérdéses gazdasejt mindenféle leszármazottját is magában foglalja. Gazdasejtek közé tartoznak, minden korlátozás nélkül, mikroorganizmusok, például baktérium vagy élesztõ, és növényi, rovar¹, illetve emlõssejtek. Például a találmány tárgyát képezik rekombináns bakteriofágból származó nukleinsavval transzformált baktériumok; plazmideredetû nukleinsavat vagy kozmidból származó nukleinsavat tartalmazó expressziós vektorok; rekombináns élesztõeredetû expressziós vektorokkal transzformált élesztõ; rekombináns víruseredetû (például karfiol-mozaikvírus, CaMV, dohány-mozaikvírus,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

2

TMV) expressziós vektorokkal, vagy rekombináns plazmideredetû expressziós vektorokkal (például Ti¹plazmid) fertõzött növényi sejtrendszerek; rekombináns víruseredetû (például bakulovírus) expressziós vektorokkal fertõzött rovarsejtrendszerek; vagy rekombináns víruseredetû (például retrovírusok, adenovírus, vakcinavírus) vektorokkal fertõzött állati sejtrendszerek, vagy stabil expresszáláshoz genetikailag megváltoztatott, transzformált állati sejtrendszerek. Az expressziós vektor tartalmazhat még egy adott szelektív nyomás elleni rezisztenciát vagy azonosítható markert (például b¹galaktozidáz) biztosító, szelektálható markert kódoló nukleinsavat, miáltal a vektort tartalmazó sejtek azonosíthatók, szaporíthatók és azok expanziója érhetõ el. Esetleg, a kérdéses szelektálható marker lehet egy második vektoron, amelyet a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó elsõ vektort hordozó gazdasejtbe kotranszfektálunk. Számtalan szelekciós rendszer alkalmazható, ideértve – minden korlátozás nélkül – a timidinkináz génjét [Wigler és mtsai., Cell 11, 223 (1977)], hipoxantin-guanin foszforiboziltranszferáz génjét [Szybalska és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026 (1962)] és az adenin foszforiboziltranszferáz génjeit [Lowy és mtsai., Cell 22, 817 (1980)] hordozó herpes simplex vírus alkalmazható tk¹, hgprt- vagy aprt-sejtekben (megfelelõen). Metabolit elleni rezisztencia alkalmazható a metotrexát elleni rezisztenciát biztosító dhfr¹re való szelekció alapjául [O’Hare és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1527 (1981)]; a mikofenolsav elleni rezisztenciát biztosító gpt génre [Mulligan és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072 (1981)]; az aminoglikozidáz G–418 elleni rezisztenciát biztosító neomicin génre [Colberre-Garapin és mtsai., J. Mol. Biol. 150, 1 (1981)]; és a higromicin elleni rezisztenciát biztosító higromicin génre irányuló szelekció alapjául [Santerre és mtsai., Gene 30,147 (1984)]. További szelektálható gének közé tartozik a sejteknek az indol helyett a triptofán hasznosítását lehetõvé tevõ trpB, a sejteknek a hisztidin helyett a hisztinol hasznosítását lehetõvé tevõ hisD [Hartman és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8047 (1988)], az ornitin-dekarboxilázt gátló 2¹(difluoro-metil)-DL-ornitin (DFMO) ellen rezisztenciát biztosító ODC (ornitin-dekarboxiláz) [McConlogue, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory (1987)]. A leírás szerinti értelemben, a „nukleinsavat károsító kezelés” és „nukleinsavat károsító ágens” kifejezések nukleinsavat (például DNS, cDNS, genomi DNS, mRNS, tRNS vagy rRNS) közvetlenül vagy közvetetten károsító bármilyen kezelési rendet jelent. Ilyen ágensekre specifikus példák közé tartoznak alkilálóágensek, nitrozoureák, antimetabolitikumok, növényi alkaloidok, növényi kivonatok és radioizotópok. Ágensekre specifikus példák közé tartoznak nukleinsavat károsító drogok, például. 5¹fluoro-uracil (5¹FU), capecitabin. S¹I (Tegafur, 5¹kloro-2,4-dihidroxi-pyridin és oxonsav), 5¹etinil-uracil, arabinozil citozin (ara¹C), 5¹aza-citidin (5–AC), 2’,2’-difluoro-2’-deoxicitidin (dFdC), purin antimetabolitikumok (merkaptopurin,

1

HU 004 256 T2

aza-tiopurin, tioguanin), gemcitabin hidroklorid (Gemzar), pentosztatin, allopurinol, 2¹fluoro-arabinozil-adenine (2F-ara¹A), hidroxi-karbamid, kénmustár (biszkloro-etil-szulfid), mekloretamin, melfalán, klorambucil, ciklofoszfamid, ifoszfamid, tiotepa, AZQ, mitomicin C, dianhidrogalaktitol, dibromoducitol, alkilszulfonáte (busul-fan), nitrozoureák (BCNU, CCNU, 4¹metil CCNU vagy ACNU), prokarbazin, dekarbazin, rebeccamicin, antraciklinek, például doxo-rubicin (adriamicin; ADR), daunorubibcin (Cerubicine), idarubicin (Idamicin) és epirubicin (Ellence), antraciklinanalógok, például mitoxantron, aktinimicin D, nem interkaláló topoizomerázgátlók, például epipodofillotoxinok (etopozid=VP16, tenipozid=VM¹26), podofillotoxin, bleomicin (Bleo), pepleomicin, nukleinsavval adduktumot képzõ vegyületek, így platinumszármazékok [például ciszplatin (CDDP), a ciszplatin transz-analógja, karboplatin, iproplatin, tetraplatin és oxaliplatin], kamfotecin, topotecan, irinotecan (CPT–11), és SN–38. Nukleinsavak károsító kezelésekre specifikus példák közé tartozik a besugárzás [például ultraibolya (UV), infravörös (IR), vagy alfa¹, béta- vagy gamma-besugárzás] és a környezeti sokk (például hipertermia). A leírás szerinti értelemben, a „proliferációellenes kezelés” és „proliferáció elleni ágens” kifejezések egy adott sejt, vírus, baktérium vagy más egysejtû vagy soksejtû szervezet proliferációját közvetlenül vagy közvetetten gátló bármilyen kezelési rendet jelent, függetlenül attól, hogy a kérdéses kezelés vagy ágens nukleinsavat károsít¹e vagy sem. Proliferációellenes ágensekre elõnyös példák a sejtproliferációt, vagy vírusproliferációt vagy ¹replikációt gátló tumorellenes és vírusellenes hatóanyagok. Specifikus példák közé tartozik, többek között, a ciklofoszfamid, aza-tioprin, ciklosporin A, prednizolon, melfalán, klorambucil, mekloretamin, buszulfan, metotrexát, 6¹merkaptopurin, tioguanin, citozin arabinozid, taxol, vinblasztin, vinkrisztin, doxorubicin, aktinomicin D, mitramicin, karmusztin, lomusztin, szemusztin, streptozotocin, hidroxi-karbamid, ciszplatin, mitotán, prokarbazin, dakarbazin és dibromomannitol; nukleinsavreplikációban hibákat okozó vagy nukleinsavreplikációt gátló, proliferációellenes ágensek, például nukleozid- és nukleotidanalógok (például AZT vagy 5¹AZC). A találmány szerinti peptidek és peptidmimetikumok fokozhatják a mikrotubulusokat stabilizáló vagy destabilizáló ágensek, például a vinca alkaloidák (vinblasztin=VLB, vinkrisytin=VCR, vinorelbin=VRLB, vinflunin=VFL) és a taxánok (paklitaxel és docetaxel=taxotare), sejtproliferáció-ellenes aktivitását. Ennélfogva, ilyen ágensek is részét képezhetik a találmány szerinti készítménynek és alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokban. A találmány szerinti vegyületekkel kezelhetõ sejtek közé tartozik bármely sejt, amelynek proliferációját kívánatos in vitro, ex vivo vagy in vivo gátolni vagy megakadályozni. Elõnyös célsejtek „G1” ellenõrzési pontjának ideje a normális sejtcikluséhoz képest rövidebb vagy a sejtciklus „G1” ellenõrzési pontja károsodott mégpedig oly módon, hogy a sejt a „G1” ellenõrzési

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 17

2

pontból a nukleinsav teljes kijavításának befejezéséhez szüksége idõ letelte elõtt kilép. Ennélfogva, a szóba jöhetõ, lehetséges sejtek („sejtjelöltek”) közé tartoznak gyorsan proliferálódó – normális vagy abnormális – sejtek. Specifikus példák közé tartoznak jóindulatú vagy tumoros, metasztázisos vagy nem metasztázisos sejtek. További lehetséges sejtek azonosíthatók az adott sejtek proliferációja arányának mérésével vagy azon idõtartam meghatározásával, amit a sejtek a „G1” fázisban eltöltenek. Lehetséges sejtek azonosíthatók egy adott tesztsejt találmány szerinti vegyülettel önmagában, vagy nukleinsavat károsító kezeléssel kombináltan történõ érintkeztetésével, és annak meghatározásával, hogy az érintkeztetett sejt csökkent proliferációt, illetve fokozott sejthalált vagy apoptózist/akatasztrófát mutat¹e. Ennélfogva, a találmány szerinti vegyületek alkalmasak sejtproliferáció in vitro, ex vivo vagy in vivo gátlására. Mint ilyen, abnormális vagy nemkívánatos vagy felesleges sejtproliferációval vagy sejttúléléssel, illetve abnormális vagy hibás sejtdifferenciálódással jellemzett elváltozástól vagy fiziológiai állapottól szenvedõ vagy annak kitett alanyok kezelhetõk a találmány szerinti vegyülettel önmagában, vagy közvetlenül vagy közvetetten nukleinsavkárosodást okozó kezeléssel vagy proliferáció elleni kezeléssel kombinálva. Eszerint, a találmány szerinti megoldással összhangban, a találmány tárgyát sejtproliferációt gátló in vitro eljárások, egy adott sejt nukleinsavat károsító ágenssel vagy ¹kezeléssel szembeni érzékenységét fokozó in vitro eljárások, és egy adott sejtben in vitro, ex vivo vagy in vivo nukleinsavkárosodást fokozó eljárások képezik. A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott in vitro eljárás során a kérdéses sejtet (például tenyésztett sejt vagy egy adott alanyban jelen lévõ sejt) a sejt proliferációjának gátlására elegendõ mennyiségû, találmány szerinti vegyülettel érintkeztetjük. A találmány egyik másik megvalósítása szerint, egy adott in vitro eljárásban a sejtet a sejt, nukleinsavat károsító ágenssel vagy kezeléssel szembeni érzékenységének fokozására elegendõ mennyiségû peptiddel vagy peptidmimetikummal érintkeztetjük. A találmány egyik még további megvalósításában, egy adott in vitro eljárásban sejtet érintkeztetünk a sejt nukleinsavkárosodásának fokozására elegendõ mennyiségû peptiddel vagy peptidmimetikummal. A találmány különféle szempontjai szerint, az in vitro eljárásban a sejtet nukleinsavat károsító ágenssel érintkeztetjük vagy a sejtet nukleinsavat károsító kezelésnek tesszük ki. Továbbá, a találmány tárgya egy adott mennyiségû peptid vagy peptidmimetikum sejtproliferációs rendellenesség vagy sejtdifferenciációs rendellenesség alkalmazása egy adott alanyban, ahol a sejtproliferációs rendellenesség vagy sejtdifferenciációs rendellenesség kifejezésbe tartoznak nem kívánt vagy felesleges sejtproliferációval vagy sejttúléléssel járó állapotok, hibás vagy abnormális apoptózis jellemezte állapotok, hibás vagy abnormális sejttúléléssel járó állapotok, és hibás vagy abnormális sejtdifferenciálódásos állapotok. A találmány egyik megvalósítási módjában, egy adott

1

HU 004 256 T2

alkalmazás során a sejtproliferációs rendellenesség kezelésére hatékony mennyiségû, találmány szerinti peptidet vagy peptidmimetikumot alkalmazunk. A találmány egyik szempontja szerint, a mennyiség elegendõ az alany állapotának javítására. A találmány elõnyös szempontjai szerint, a javulás kifejezés tartalmazza azt, hogy a célba vett sejtek (például abnormálisan proliferáló sejtek) legalább egy részénél a sejtproliferáció lecsökken, csökken a sejtek száma, a sejtek számának növekedése gátlódik, nõ az apoptózis, vagy csökken a túlélés. A találmány egy még további szempontja szerint, a találmány szerinti vegyülettel kezelni kívánt alany a kezelés elõtt, azzal egy idõben, vagy az után sejtproliferációt gátló kezelésben részesült. A találmány további elõnyös szempontjaiban, a sejtproliferációs elváltozásos sejtek legalább egy része a vérben, mellben, tüdõben, pajzsmirigyben, fejben vagy nyakban, agyban, nyirokban, gyomor-bél rendszerben, orrgaratban, ivari és húgyvezetékben, vesében, hasnyálmirigyben, májban, csontban, izomban vagy bõrben található. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a kérdéses alkalmazásban „szilárd” tumor kezelésére szolgáló vegyületmennyiséget alkalmazunk. A találmány egy másik megvalósítási módjában, a kérdéses alkalmazásban „folyékony” tumor kezelésére szolgáló vegyületmennyiséget alkalmazunk. A találmány különféle megvalósítási módjaiban, a találmány szerinti vegyületet egy másik tumorellenes terápiát megelõzõen, azzal egy idõben, vagy az után adjuk be a tumoros betegnek. A leírás szerinti értelemben, a „proliferációs rendellenesség” és „proliferációs állapot” kifejezések jelentenek bármilyen patológiás vagy nem patológiás fiziológiás állapotot, amelyet abnormális vagy nem kívánt (például sejt¹, vírus¹, baktérium¹, gomba- stb.) proliferáció jellemez. A „sejtproliferációs rendellenesség” és „sejtproliferációs állapot” kifejezések bármilyen, abnormális vagy nem kívánt sejtproliferációval jellemzett patológiás vagy nem patológiás fiziológiás állapotot jelentenek, és e kifejezésekbe beletartoznak (például a hibás apoptózis miatti) nem kívánt vagy felesleges sejtproliferációs vagy sejttúléléssel járó állapotok, nem kívánt vagy felesleges apoptózisos állapotok, és nem kívánt vagy felesleges sejttúlélés jellemezte állapotok. A „differenciációs rendellenesség” kifejezés bármilyen, abnormális vagy hibás differenciálódással járó patológiás vagy nem patológiás fiziológiai állapotot jelent. A kezelni kívánt proliferációs- vagy differenciációs rendellenességek közé tartoznak abnormális vagy nem kívánt sejtszámokkal, ¹sejtszaporodással vagy ¹sejttúléléssel járó jóindulatú és neoplasztikus betegségek és nem patológiás állapotok. Ilyen rendellenességek vagy állapotok képezhetnek betegségi stádiumot és idetartozik mindenféle típusú rákos szaporodás vagy onkogén folyamat, metasztázisos szövet vagy rosszindulatúan transzformálódott sejt, szövet, vagy szerv, vagy lehet nem patológiás, azaz a normálistól való, de betegséggel jellemzõen nem társuló eltérés. A találmány szerint kezelhetõ nem patológiás állapotra specifikus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 18

2

példa a szöveteknek a hegesedést eredményezõ sebgyógyulás során fellépõ visszanövése (re-growth). A proliferációs vagy differenciációs elváltozást tartalmazó sejtek sejttömegbe aggregálódhatnak vagy lehetnek diszpergáltak. A „szilárd tumor” kifejezés jellemzõen összeállt és tömeget képzõ neopláziákat vagy metasztázisokat jelent. A „folyékony tumor” a vérképzõ rendszer neopláziáira – például limfómák, mielómák és leukémiák – vagy természetüket tekintve diffúz (mivel jellemzõen nem képeznek szilárd tömeget) neopláziákra utal. Leukémiákat tekintve, elõnyös példák közé tartozik akut és krónikus limfoblaszt¹, mieloblaszt- és többszörös mielóma. Ilyen rendellenességek közé tartoznak jóformán bármilyen sejt- vagy szövettípust befolyásolni képes neopláziák vagy rákos megbetegedések, például karcinóma, szarkóma, melanóma, metasztázisos rendellenességek vagy vérképzési neopláziás rendellenességek. Metasztázisos tumor képzõdhet többféle elsõdleges tumortípusból, ideértve – minden korlátozás nélkül – a mell¹, tüdõ¹, pajzsmirigy¹, fej- és nyak¹, agy¹, nyirok¹, gyomor- és bélrendszeri (száj, nyelõcsõ, gyomor, vékonybél, vastagbél, végbél), húgy-ivarvezeték (uterus, ovárium, cervix, hólyag, here, pénisz, prosztata), vese¹, hasnyálmirigy¹, máj¹, csont¹, izom¹, bõr- stb. tumorból. A karcinóma kifejezés epitéliális- vagy endokrin szövet rosszindulatú voltára utal, és idetartoznak a légzõrendszer karcinómái, gyomor és bélrendszer karcinómái, húgy és ivarrendszer karcinómái, herekarcinómák, mellkarcinómák, prosztatakarcinómák, endokrin rendszer karcinómái, és melanómák. Karcinómák közé tartoznak például a cervixbõl, tüdõbõl, prosztatából, mellbõl, fejbõl és nyakból, vastagbélbõl, májból és petefészekbõl kialakuló karcinómák. A kifejezésbe tartoznak még a karcinoszarkómák is, például karcinómás és szarkómás szövetekbõl összetevõdõ rosszindulatú tumorok. Adenokarcinómák közé tartozik egy adott mirigyes szövet karcinómája, vagy amely mirigyes szövetben a tumor mirigyszerû szerkezetet képez. A „szarkóma” kifejezés mesenchimális sejtbõl származó rosszindulatú tumorra utal. példaként említhetõ szarkómák közé tartozik, például limfoszarkóma, liposzarkóma, oszteoszarkóma, és fibroszarkóma. A leírás szerinti értelemben, a „vérképzõ szervet érintõ proliferációs rendellenesség” kifejezés olyan betegséget jelent, amelyben vérképzõ szervbõl – például mieloid, limfoid vagy eritroid vonalból, vagy azok prekurzos sejtjeibõl – származó hiperpláziás/neopláziás sejtek vesznek részt. Jellemzõ, hogy a betegségek gyengén differenciálódott akut leukémiákból, például eritroblaszt-leukémia és akut megakarioblaszt-leukémia, ered. Mielod rendellenességek közé tartozik – minden korlátozás nélkül – például az akut promieloid leukémia (APML), akut mielogén leukémia (AML) és krónikus mielogén leukémia (CML); limfoidrendszer rosszindulatú tumorai közé tartozik – minden korlátozás nélkül – az akut limfoblaszt-leukémia (ALL), amely magában foglalja a B¹sejtvonalas ALL¹t és a T¹sejtvonalas ALL¹t, krónikus limfocita-leukémiát (CLL), prolimfocita-

1

HU 004 256 T2

leukémiát (PLL), hajassejtes leukémiát (HLL) és a Waldenstrom-féle makroglobulémiát (WM). További rosszindulatú limfómák közé tartozik – minden korlátozás nélkül – a nem Hodgkin-féle limfóma és annak változatai, periferiális T¹sejt-limfómák, felnõttkori T¹sejt-leukémia/limfóma (ATL), a bõr T¹sejt-limfómája (CTCL), nagy granuláris limfocitás leukémia (LGF), Hodgkin-féle betegség és Reed–Stemberg-féle betegség. A találmány szerinti vegyületekkel kombinálva alkalmazandó kezelések közé tartozik bármilyen, a leírtak vagy technikában ismertek szerint végzett proliferációellenes, nukleinsavat károsító vagy tumorellenes kezelés. például sejtproliferáció-ellenes vagy tumorellenes kezelés tartalmazhat sugárkezelést vagy sebészi eltávolítást, adott esetben, gyógyszeres kezeléssel kombinálva. A kezelés tartalmazhatja valamilyen kémiai ágens, mint például radioizotóp, hatóanyag, mint például egy másik kemoterápiás ágens, vagy, a génterápiás anyag – mint például valamilyen antionkogén (például Rb, DCC, p53 stb.), domináns negatív onkogén vagy valamelyik onkogén elleni antiszensz – beadását. A vegyületek beadhatók más kezelésiprotokolok elõtt, azokkal egy idõben, vagy azok után. például a találmány szerinti vegyület a sejtproliferáció ellen irányuló terápiára (például sugárterápia, kemoterápia, génterápia, sebészi eltávolítás stb.) kiválasztott alanynak beadható a sejtproliferáció ellen irányuló terápia megkezdése elõtt. Eszerint, a találmány tárgyát megelõzõ kezelés is képezi. Az „alany” kifejezés jelent állatokat, jellemzõen emlõsállatokat, mint például fõemlõsöket (embereket, emberszabású majmokat, gibbonokat, csimpánzokat, orangutánokat, makákókat), háziállatokat (kutyákat és macskákat), gazdasági állatokat (lovakat, tehenet, kecskéket, juhot, sertéseket) és kísérleti állatokat (egeret, patkányt, nyulat, tengerimalacot). Alanyok közé tartoznak állati betegségmodellek (például tumoros egerek). Kezelésre megfelelõ alanyok közé tartoznak valamilyen proliferációs vagy differenciációs rendellenességen vagy (például tumorellenes kezelésen) jelenleg részt vevõk vagy arra kijelöltek. További kijelölt alanyok közé tartoznak, például sejtproliferációs rendellenesség kialakulása kockázatának kitett alanyok. Ennélfogva, a találmány szerinti alkalmazás alkalmas olyan alany kezelésére, aki/amely ugyan ki van téve a sejtproliferációs rendellenesség kialakulása kockázatának, de még nem mutatkoztak nála a rendellenesség nyilvánvaló tünetei. Kockázatnak kitett alanyok azonosíthatók egy adott sejtproliferációs rendellenességre való genetikai fogékonyság vagy családi kórtörténet alapján. például aktivált onkogént vagy valamelyik tumorszuppresszor gént érintõ mutációt vagy deléciót hordozó alanyok szóba jöhetõ, lehetséges alanyok („candidate subjects”). Ennélfogva, kockázatnak kitett alanyok azonosíthatók a genetikai lézió meglétére irányuló rutin, genetikai szûréssel, vagy az alany családi kórtörténetében való nyomozás révén annak megalapozására, hogy a kérdéses alanyok a rendellenesség kockázatának ki vannak¹e téve. Kockázatnak kitett alanyra elõnyös példa olyan valaki lenne, akinek családi kórtörté-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

2

nete vagy más genetikai jellemzõje olyan rákos megbetegedésre való hajlamot jelez, amelyben a neoplasztikus vagy hatóanyag-rezisztens neoplasztikus sejtek CD40¹et expresszálnak. Genetikai betegségre különösen elõnyös példa a retinoblasztóma, amelyet az Rb tumorszuppresszor génben lévõ hiányosság okoz. A beadandó mennyiség jellemzõen „hatékony mennyiség” vagy „elegendõ mennyiség”, amely mennyiség a kívánt hatás kiváltására elegendõ. Ennélfogva, hatékony mennyiségek közé tartozik az alábbiak közül egy vagy több: sejtproliferáció csökkentése, sejtszámok csökkentése, fokozott proliferáció gátlása, megnövekedett sejtszámok gátlása, apoptózis fokozása, vagy túléléscsökkentés, a proliferáló sejteket tartalmazó sejtek legalább egy részében (például a célba vett sejtek közül legalább néhánynál). Ennélfogva, például ahol sejtproliferáció gátlása kívánatos, a hatékony mennyiség az a mennyiség, amely kimutathatóan csökkenti a sejtproliferációt vagy a proliferáló sejtek számát, vagy fokozza a sejtek apoptózisát vagy csökkenti a sejtek túlélését. Ezért, a mennyiség elegendõ lehet a célsejtek számának csökkentésére, a célsejtek számának stabilizálására vagy a célsejtek száma emelkedésének gátlására. Például ahol a rendellenesség szilárd tumort tartalmaz, a tumor méretének csökkentése, a tumor méretének stabilizálása, vagy a tumor további növekedésének megakadályozása, legalább a tumor egy részénél (például a tumortömeget alkotó sejtek 5–15%-ának, 15–20%-ának vagy annál több sejt szaporodásának gátlása) kielégítõ klinikai végpont. Ahol a rendellenesség folyékony tumort alkot, kielégítõ végpontnak számít a tumorsejtek számának csökkentése, tumorsejtek számának stabilizálása vagy tumorsejtek számában bekövetkezõ további növekedés gátlása, legalább a tumorsejtek alpopulációjának egy részénél (például a sejtek 5–15%-ának, 15–20%-ának vagy annál több sejt szaporodásának gátlása). Emellett, a hatékonynak tekintett mennyiségek képesek megakadályozni vagy gátolni az állapot vagy rendellenesség progresszióját. Például progressziójuk során bizonyos tumorok fokozatosan agresszívvé válnak, ideértve a metasztázisos formákká való fejlõdést is. Eszerint, hatékonynak tekintett mennyiségek a tumorok fokozott agresszívvá vagy metasztázisossá válásának csökkentését vagy megakadályozását eredményeznék. Ennek megfelelõen, a rendellenesség vagy állapot rosszabbodásának gátlása vagy megakadályozása, azaz az állapot stabilizálása, egy további kielégítõ klinikai végpontnak számít. Folyékony tumort tartalmazó biológiai minta (például vér vagy szövetminta) vizsgálatával megállapítható, hogy a tumorsejtek tömegét vagy ¹számát sikerült¹e lecsökkenteni, vagy hogy megtörtént¹e a tumorsejt proliferációjának gátlása. Szilárd tumor esetében, invaziv és nem invaziv leképezési eljárásokkal meg lehet gyõzõdni a tumorméret csökkenésérõl vagy a tumor méretében bekövetkezõ növekedés gátlásáról. Receptorpozitív tumor receptorszámának csökkenése alkalmazható tumorsejt-proliferáció csökkenésének vagy gátlásának becslésére. Hormontermelõ tumor, például mell¹,

1

HU 004 256 T2

here¹, vagy petefészekrákok, hormonmennyiségei alkalmazhatók a tumor proliferációjára vonatkozó csökkenés vagy gátlás becslésére. Hatékony mennyiségek objektíve vagy szubjektíve is képesek redukálni vagy csökkenteni a rendellenességgel vagy állapottal társult szimptómák súlyosságát vagy gyakoriságát. Például a találmány szerinti vegyület fájdalmat, hányingert vagy más kényelmetlenséget csökkentõ, vagy étvágygerjesztõ, vagy szubjektív jóérzetet kiváltó mennyisége kielégítõ klinikai végpont. Hatékony mennyiségek közé tartozik a mennyiség (például dózis) vagy egy másik protokol szerinti kezelés gyakoriságának csökkentése, amely szintén kielégítõ klinikai végpontnak számít. például a találmány szerinti vegyülettel kezelt rákos beteg esetében a ráksejtek proliferációjának gátlásához kevesebb nukleinsavkárosító ágensre lehet szükség. Ebben a példában, hatékony mennyiség kifejezésbe beletartozik az a mennyiség, amely a találmány szerinti vegyülettel végzett kezelés nélküli dozírozási gyakorisághoz vagy mennyiséghez képest csökkenti a dózisok beadásának gyakoriságát vagy az alanynak beadott nukleinsavkárosító ágens mennyiségét. Az alany állapotában vagy terápiás hatékonyságban bekövetkezõ, a találmány szerinti alkalmazás miatti javulás lehet viszonylag rövid idõtartamú, például a javulás tarthat néhány órán, napokon vagy heteken át, vagy hosszabb idõtartam, például hónapok vagy évek, is lehet. Nem szükséges, hogy egy adott hatékony mennyiség teljesen megszüntesse az állapot vagy rendellenesség bármilyen vagy minden szimptómáját. Eszerint, egy adott hatékony mennyiségre vonatkozó kielégítõ klinikai végpontot akkor sikerül elérni, amikor a már említett kritériumok vagy a technikában a rendellenesség stádiuma, illetve az állapot meghatározásához megfelelõ, más ismert kritériumok szerint az alany állapotában, rövid vagy hosszú ideig, szubjektív vagy objektív javulás állt be. A találmány szerinti megoldásban leírtak vagy technikában ismertek szerint, egy vagy több jótékony hatást biztosító hatású mennyiségre úgy hivatkozunk, mint az alany állapotának „javulását” kiváltó vagy az alany számára biztosított „terápiás elõny” biztosító mennyiségre. A találmány szerinti vegyület hatékony mennyiségét állatkísérleteken vagy – adott esetben – embereken végzett klinikai vizsgálatokkal lehet meghatározni. A szakember ismeri egy adott alany kezeléséhez szükséges dozírozást és idõzítést feltehetõen befolyásoló, különféle faktorokat, amilyenek például az alany általános egészségi állapota, kora vagy neme, a rendellenesség vagy állapot súlyossága vagy stádiuma, korábbi kezelések, a nem kívánt mellékhatásokkal szembeni érzékenység, a kívánt klinikai kimenet és más rendellenességek vagy állapotok megléte. Ilyen faktorok befolyásolhatják a kellõ dozírozást és idõzítést a kérdéses terápiás elõny biztosításához szükséges mennyiség eléréséhez. A beadási rendnél a farmakokinetikát – azaz, a gyógyászati készítmény abszorpciós rátáját, biológiai elérhetõségét, metabolizmusát, és ürülését (clearance) [ld. például Egleton, Peptides 18, 1431–1439 (1997);

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 20

2

és Langer, Science 249, 1527–1533 (1990)] – is figyelembe kell venni. Ezenfelül, a dozírozást és kezelési protokolt feltehetõen specifikusan az alanyhoz kell igazítani vagy a farmakológiai adatok alapján módosítani kell. Ennélfogva, a találmány szerinti vegyületeket önmagukban vagy gyógyászati készítményként be lehet adni szisztémásan (például egy adott szervre vagy szövetre irányozva, például a máj sejtproliferációs elváltozásának kezelésére a vena portalisba injektálva), helyileg (például közvetlenül a tumortömegbe), a kívánt hatást elérõ bármilyen protokoll vagy út szerint. A vegyületek és gyógyászati készítmények beadhatók napi egyetlen vagy többszörös dózisban (például alacsony dózis esetében), vagy megszakításokkal (például magasabb dózisnál minden másnap, hetente egyszer stb.). A vegyületek és gyógyászati készítmények beadhatók inhalációval (például intratracheálisan), orálisan, intravénásan, intraartériásan, intravaszkulárisan, intrathecalisan, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, szubkután, a testüregbe (intracavity), transzdermálisan (például topikálisan), nyálkahártyán át (például száj, hólyag, vagina, uterus, végbél vagy orr nyálkahártyáján át), többszörös beadásai, késleltetett felszabadulással (például idõben gradiensen változó perfúzióval), vagy egyetlen bolusként. Hatóanyagok beadására szolgáló, implantálható eszközök, ideértve a mikrogyártással készült eszközöket, jól ismertek és szintén alkalmazhatók a találmány szerinti vegyületek egy adott alanynak történõ beadására. Az intravénás (IV) beadásra szánt vegyületek mennyisége több órán át (jellemzõen 1, 3, vagy 6 órán át) körülbelül 0,01 mg/órától–1,0 mg/óra tartományba esik (idõszakos ciklusokkal, egy vagy több héten át megismételhetõ). Lényegesen magasabb dózisok (például akár 10 mg/ml¹ig felsõ tartományig) alkalmazhatók, elsõsorban akkor, ha a hatóanyag beadása nem a véráramba, hanem egy elkülönített helyre történik, mint például testüregbe vagy egy szerv lumenébe, például az agy-gerinc folyadékba [cerebrospinal fluid (CSF)]. Ezért, a találmány tárgyát továbbá gyógyászati készítmények is képezik. Ilyen gyógyászati készítmények alkalmasak egy adott alanynak in vivo vagy ex vivo beadásra, és arra, hogy egy adott alanyt a találmány szerinti vegyületekkel kezeljük, például. A leírás szerinti értelemben, a „gyógyászatilag elfogadható” és „élettanilag elfogadható” kifejezésbe tartoznak a gyógyászati beadással kompatibilis oldószerek (vizes vagy nem vizes), oldatok, emulziók, diszperziós közegek, bevonatok, izotónikus és abszorpciót elõsegítõ vagy késleltetõ ágensek. Ennélfogva, a „gyógyászatilag elfogadható” és „élettanilag elfogadható” kifejezés, egy adott alanyban gyógyászati célú alkalmazásra megfelelõ készítményt jelent. A gyógyászati készítmények és formulációk tartalmaznak egy adott mennyiséget a találmány szerinti vegyületbõl, például egy adott peptid vagy peptidmimetikum hatékony mennyiségét, ugyanezt kódoló nukleinsavat, vektort, vagy a találmány szerinti sejtet, és gyógyászatilag vagy élettanilag elfogadható hordozót.

1

HU 004 256 T2

Gyógyászati készítmények kiszerelhetõk úgy, hogy egy adott, szisztemikus vagy helyi, beadási móddal kompatibilisek legyenek. Így, gyógyászati készítmények tartalmaznak a különféle beadási módokra alkalmas hordozókat, hígítószereket, vagy kötõanyagokat. Formulációk lehetnek, illetve enterális (orális) beadás végezhetõ az alábbiak révén: tabletta (bevonatos vagy bevonat nélküli), kapszula (kemény vagy lágy), mikrogömb, emulzió, por, szemcse, kristály, szuszpenzió, szirup vagy elixír. Szilárd formulációk elkészítésére, hagyományos, nem toxikus, szilárd hordozók – így, például gyógyászati tisztaságú mannitol, laktóz, keményítõ, magnézium-sztearát, nátrium-szacharinát, talkum, cellulóz, glükóz, szukróz, magnézium-karbonát – alkalmazhatók. Kiegészítõ aktív vegyületek (például tartósítószerek, antibakteriális, antivirális és gombaellenes ágensek) is beépíthetõk a készítményekbe. Enterális beadáshoz folyékony formuláció is alkalmazható. A hordozó választható a különféle olajok közül, ideértve a nyersolajat, állati, növényi vagy szintetikus olajokat, például mogyoróolaj, szójaolaj, ásványi olaj, szezámolaj. Alkalmas gyógyászati kötõanyagok közé tartozik, például a keményítõ, cellulóz, glükóz, laktóz, szacharóz, zselatin, maláta, rizs, liszt, kréta, szilikagél, magnézium-sztearát, nátrium-sztearát, glicerin-monosztearát, nátrium-klorid, sovány tejpor, glicerin, propilénglikol, víz, etanol. Enterális, parenterális, vagy nyálkahártyán át történõ bevitelre szolgáló gyógyászati készítmények tartalmaznak, például vizet, sóoldatot, foszfáttal pufferelt sóoldatot, Hank-féle oldatot, Ringer-oldatot, dextróz/sóoldatot, és glükózoldatokat. A fiziológiás állapotokhoz való közeledés céljából a formulációk tartalmazhatnak kiegészítõ anyagokat, így például pufferképzõ ágenseket, rendes feszültségi állapotot beállító ágenseket, nedvesítõszereket, detergenseket és hasonlókat. Adalék anyagok közé tartozhatnak még további aktív összetevõk, mint például baktericid ágensek, vagy stabilizálok. Például az oldat tartalmazhat nátrium-acetátot, nátrium-laktátot, nátriumkloridot, kálium-kloridot, kalcium-kloridot, szorbitán-monolaurátot vagy trietanol-amin-oleátot. További parenterális formulációk és eljárások le vannak írva az irodalomban [Bai, J. Neuroimmunol. 80, 65–75 (1997); Warren, J. Neurol. Sci. 152, 31–38 (1997); és Tonegawa, J. Exp. Med. 186, 507–515 (1997)]. A parenterális készítmény bezárható ampullákba, eldobható fecskendõkbe, üvegbõl vagy mûanyagból készült, többszörös dózist tartalmazó fiolákba. Intradermális vagy szubkután beadásra szolgáló gyógyászati készítmények tartalmazhatnak steril diluenst, például vizet, sóoldatot, fixált olajokat („fixed oils”), polietilénglikolokat, glicerint, propilénglikolt vagy más szintetikus oldószereket; antibakteriális ágenst, például benzil-alkoholt vagy metil-parabéneket; antioxidánsokat, például aszkorbinsavat, glutationt vagy nátrium-biszulfitot; kelátképzõ ágenseket, például etiléndiamin-tetraecetsavat; puffereket, például acetátokat, citrátokat vagy foszfátokat, és a rendes feszültségi állapotot beállító ágenseket, mint például nátrium-kloridot vagy dextrózt.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

Injektálásra szolgáló gyógyászati készítmények közé tartoznak vizes oldatok (vízoldékony készítmények esetén) vagy diszperziók, és steril injektálható oldatok vagy diszperziók alkalmankénti elkészítésére szolgáló steril porok. Intravénás beadáshoz, az alkalmas hordozók közé tartozik a fiziológiás sóoldat, bakteriosztatikus víz, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) vagy foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS). A hordozó lehet, például az alábbiakat tartalmazó oldat vagy diszperziós közeg: víz, etanol, poliol (például glicerin, propilénglikol, és folyékony polietilénglikol, és hasonlók), és azok alkalmas keverékei. Folyékonyság fenntartható, például valamilyen bevonat, például lektin, vagy diszperziók esetében a szükséges szemcseméret fenntartásának alkalmazásával vagy felületaktív anyagok alkalmazásával. Antibakteriális és gombaellenes ágensek közé tartoznak, például parabének, klór-butanol, fenol, aszkorbinsav és timerozál. A rendes feszültségi állapotot beállító ágensek, például cukrok, polialkoholok, így például mannitol, szorbitol, nátrium-klorid is jelen lehetnek a készítményben. Az eredményül kapott oldatok csomagolhatók az adott formában való alkalmazásra, vagy az oldatokat liofilizálni is lehet, majd késõbb, a beadás elõtt lehet a liofilizált készítményt steril oldattal kombinálni. Gyógyászatilag elfogadható hordozók tartalmazhatnak abszorpciót vagy kiürülését stabilizáló, fokozó vagy késleltetõ vegyületet. Ilyen vegyületek közé tartoznak, például szénhidrátok, mint például glükóz, szukróz, vagy dextránok; alacsony molekulasúlyú fehérjék; a peptidek kiürülését vagy hidrolízisét csökkentõ készítmények; illetve kötõanyagok vagy más stabilizálok és/vagy pufferek. Abszorpciót késleltetõ ágensek közé tartozik, például az alumínium-monosztearát és a zselatin. Detergenst, így liposzómális hordozókat, is lehet alkalmazni a gyógyászati készítmény abszorpciójának stabilizálására, fokozására vagy csökkentésére. A megemésztés elleni védelemhez, a vegyület valamilyen készítménnyel komplexbe vihetõ abból a célból, hogy az a savas és enzimatikus hidrolízissel szemben rezisztenssé váljon, vagy a vegyület megfelelõen rezisztens hordozóban- mint például liposzómában – komplexbe vihetõ. A vegyületek megemésztés elleni védelmének módjai a technikában ismertek [ld. például Fix, Pharm. Res. 13, 1760–1764 (1996); Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48119–135 (1996); és a terápiás ágensek szájon át történõ bevitelére szolgáló lipidkészítményeket ismertetõ U.S. 5.391.377 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat]. Nyálkahártyán vagy bõrön át történõ beadáshoz, az áthatolni kívánt gátnak megfelelõ áthatolószereket alkalmazunk a készítményben. Ilyen áthatolószerek a technikában általában ismertek, és idetartoznak, például a nyálkahártyán át történõ beadáshoz alkalmazott detergensek, epesók, és fuzidinsav („fusidic acid”) származékok. Nyálkahártyán át történõ beadás történhet orrsprayk vagy kúpok révén [ld., például Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13, 85–184 (1996)]. Ahogyan a technikában általánosan ismert, a transzdermális beadáshoz, az aktív vegyület kiszerelhetõ ke-

1

HU 004 256 T2

nõcsök, gyógykenõcs, gélek, vagy krémek formájában. Tapaszok alkalmazásával is létrehozható transzdermális beviteli rendszer. Inhalációval történõ beadás esetén, a gyógyászati készítmények beadhatók aeroszol vagy köd formájában. Aeroszolos beadáshoz a készítmény adagolható finoman elválasztott formában, valamilyen felületaktív anyaggal és hajtógázzal együtt. A találmány egy másik megoldási módjában, a készítmény légzõszerv szöveteibe történõ adagolására szolgáló eszköz az, amiben a készítmény porlasztásra kerül. A technikában ismert, más beviteli rendszerek közé tartoznak száraz por aeroszolok, folyékony beviteli rendszerek, és légfúvókás porítók és meghajtó rendszerek [ld., például: Patton, Biotechniques 16, 141–143 (1998); Dura Pharmaceuticals, San Diego, CA; Aradigm, Hayward, CA; Aerogen, Santa Clara, CA; and Inhale Therapeutic Systems, San Carlos, CA]. Biológiailag lebontható, biokompatibilis polimerekpéldául etilénvinil-acetát, polianhidridek, poliglikolsav, kollagén, poliortoészterek, és tejsav polimer – is alkalmazhatók. A szakember ismeri az ilyen készítmények elõállítására szolgáló eljárásokat. Az anyagok kereskedelmi forgalomban beszerezhetõk az Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. cégektõl. Gyógyászatilag elfogadható hordozóként liposzómaszuszpenzió (így, antitestek vagy víruseredetû burokfehérjék alkalmazásával készített, sejtekre vagy szövetekre irányított liposzómák) is alkalmazható. Ilyeneket a technikában ismert eljárásokkal [ld. például U.S. 4.235.871; 4.501.728; 4.522.811; 4.837.028; 6.110.490; 6.096.716; 5.283.185; és 5.279.833. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok; Akimaru, Cytokines Mol. Ther. 1, 197–210 (1995); Alving, Immunol. Rev. 145, 5–31 (1995); és Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980)] lehet elõállítani. Biológiailag lebontható mikrogömbök vagy kapszulák, illetve más, kisméretû molekulák, így például peptidek, késleltetett felszabadítását lehetõvé tevõ, biológiailag lebontható polimerkonfigurációk a technikában ismertek [ld. például Putney, Nat. Biotechnol. 16, 153–157 (1998)]. A találmány szerinti vegyületek micellákba is beépíthetõk [ld. például Suntres, J. Pharm. Pharmacol. 46, 23–28 (1994); Woodle, Pharm. Res. 9, 260–265 (1992)]. Az egyes vagy kettõs lipidréteg felszínéhez peptidek is csatlakoztathatók. Például peptidek csatlakoztathatók hidrazid-PEG-(disztearoil-foszfatidil) etanol-amint tartalmazó liposzómákhoz [ld. például Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6, 705–708 (1995)]. Esetleg, a lipidmembránok bármilyen formája, például sík lipidmembrán vagy egy érintetlen sejt – például vörösvértest – sejtmembránja is alkalmazható. Liposzómális és lipidtartalmú készítmények bevihetõk bármilyen módon, így például intravénásan, transzdermálisan [ld. például Vutla, J. Pharm. Sci. 85, 5–8 (1996)], nyálkahártyán át, vagy szájon át történõ beadással. Gyógyászatilag elfogadható készítmények tartalmazhatnak körülbelül 1–99,99% aktív összetevõt (például peptidet vagy peptidmimetikumot). A gyógyászati készítmény hagyományos, jól ismert sterilizálási eljárásokkal sterilizálhatók vagy sterilre szûrhetõk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 22

2

További gyógyászati formulációk és beviteli rendszerek ismertek a technikában és alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokban és készítményekben [ld. például Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); The Merck Index, 12th ed., kiad.: Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ (1996); Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, kiad.: Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); és Poznansky és mtsai., Drug Delivery Systems, szerk.: R. L. Juliano, 253–315, kiad.: Oxford, N. Y. (1980)]. A gyógyászati készítmények a beadás megkönnyítése és a dózisok egységességének biztosítása végett egységnyi dózisformába csomagolhatók. A leírás szerinti értelemben, az „egységnyi dózisforma” kifejezés a kezelendõ alanynak történõ beadásra szolgáló, fizikailag elkülönült, egységes dózisokat jelent, ahol minden egység egy kívánatos hatást létrehozó, elõre meghatározott mennyiségû, gyógyászati hordozóval vagy kötõanyaggal kombinált vegyületet tartalmaz. Továbbá, a találmány tárgyát a találmány szerinti vegyületeket és azok gyógyászati formulációit – adott esetben, alkalmas csomagolóanyagba csomagoltan – tartalmazó készletek képezik. Egy adott készlet, jellemzõen, olyan címkét vagy csomagolási mellékletet tartalmaz, amelyben szerepel az összetevõk leírása vagy a készlet összetevõinek in vitro, in vivo, vagy ex vivo alkalmazási utasításai. Egy adott készlet ilyen összetevõk készletét például a találmány szerinti vegyületekbõl kettõt vagy többet, vagy a találmány szerinti vegyületet nukleinsavat károsító ágenssel vagy proliferációellenes ágenssel kombinálva – tartalmazza. A „csomagolóanyag” kifejezés a készlet összetevõit befogadó fizikai szerkezetet jelenti. A csomagolóanyag fenntarthatja az összetevõk sterilitását, és a csomagolóanyagot az ilyen célokra általánosan alkalmazott anyagból (például papír, hullámosított szálból, üvegbõl, mûanyagból, fóliából, ampullákból stb.) készülhetnek. A címke vagy csomagolási melléklet tartalmazhat írott utasításokat. Ennélfogva, a találmány szerinti bármelyik eljárásban, a találmány szerinti készletek tartalmazhatnak továbbá a készlet alkalmazásával kapcsolatos címkéket vagy utasításokat. Az utasítások tartalmazhatják az itt leírt találmány bármely eljárásának – így, kezelés, kimutatás, monitorozó vagy diagnosztikai eljárások – gyakorlatba vételére szolgáló utasításokat. Így, például egy adott készlet egy csomagban vagy adagolóban tartalmazhatja a találmány szerinti vegyületet a vegyület találmány szerinti kezelési eljárásban való beadására vonatkozó utasításokkal együtt. Az utasítások továbbá tartalmazhatnak egy adott klinikai végpontra vagy az esetleg elõforduló bármilyen káros tünetre vonatkozó utalásokat, vagy a szabályozó hatóságok, mint például a Gyógyszer- és Élelmiszerügyi Bizottság által, emberi alanyokon való alkalmazásra elõírt további információkat. Az utasítások lehetnek „nyomtatott anyagon”, például a készleten belülre vagy arra rögzített papíron vagy kartonon, vagy a készletre vagy csomagolóanyagra, vagy a készlet valamelyik összetevõjét tartalmazó fiolára

1

HU 004 256 T2

vagy csõre rögzített címkén. Az utasítások jelen lehetnek, továbbá, számítógéppel olvasható hordozón, mint például diszken (floppi diszk vagy merevlemez), optikai CD¹n, mint például CD¹n vagy DVD-ROM/RAM¹on, mágnesszalagon, elektromos tárolóközegen, mint például RAM¹on vagy ROM¹on, IC¹csúcson és ezek hibridjein, mint például mágneses/optikai közegen. A találmány szerinti készletek tartalmazhatnak továbbá pufferképzõ ágenst, illetve tartósító- vagy stabilizálóágenst a gyógyászati készítményben. A készlet minden összetevõjét egyedi tárolóedénybe lehet elhelyezni és az összes különféle tárolóedényt egyetlen csomagba lehet csomagolni. A találmány szerinti készleteket hidegben való tárolásra lehet tervezni. A leírásban az alábbi rövidítéseket alkalmaztuk: Cha jelentése: ciklohexil-alanin Phe-2,3,4,5,6¹F jelentése: Fluoridok a fenil-alanin fenilcsoportjának 2, 3, 4, 5, 6. pozícióin F jelentése: Fluorid Bpa jelentése: Benzoil-fenil-alanin Nal(2) jelentése: 2¹Naftil-alanil Ala(3¹Bzt) jelentése: (3¹Benzotienil)-Alanin Nal(1) jelentése: 1¹Naftil-alanil Dph jelentése: Difenil-Alanin Ala(tBu) jelentése: t¹Butil-alanil Cys(tBu) jelentése: t¹Butil-cisztein Phe-3,4,5¹F jelentése: Fluoridok a fenil-alanin fenilcsoportjának 3, 4, 5. pozícióin Phe-4CF3 jelentése: CF3 a fenil-alanin fenilcsoportjának 4. pozícióján Phe-3Br,4Cl,5Br jelentése: A fenil-alanin feniljének 3. pozícióján bromid, a 4. pozíción klorid és az 5. pozíción pedig bromid. Phe-4Cl jelentése: Klorid a fenil-alanin feniljének 4. pozícióján P1, P2, P3, P4, P5, P6 stb., és (P1, P2, P3, P4, P5, P6 stb.); és P7, P8, P9, P10, P11, P12 stb., és (P7, P8, P9, P10, P11, P12 stb.) jelentése: rendre a P1, P2, P3, P4, P5, P6 stb.; és P7, P8, P9, P10, P11, P12, összefüggõ szekvenciák. Hacsak másként nincs meghatározva, a leírásban alkalmazott minden mûszaki és tudományos kifejezésnek a találmánynak megfelelõ technikában képzett szakember által elfogadott jelentése van. Bár a talál-

2

mány gyakorlatba vételében vagy tesztelésében alkalmazottakhoz hasonló vagy azokkal egyenértékû eljárások és anyagok is alkalmazhatók, az alkalmas eljárásokat és anyagokat a leírás ismerteti. A leírás szerinti értelemben, amennyiben külön 5 nem kötjük ki az ellenkezõjét, az „egy”, „és”, „az” kifejezések, és a létezés bármilyen kifejezése, amennyiben nyelvtanilag egyes számú formában áll, magában foglalja, mint jelentést, a többes számú formát is. így, pél10 dául egy adott „vegyületre” való utalás magában foglalja a vegyületek sokaságát, és egy adott „csoportra” vagy „aminosavra” való hivatkozásba beleértendõ az egy vagy több csoportra vagy aminosavra való hivatkozás. 15 Példák

20

25

30

35

40

1. példa Ez a példa az anyagokat és számos eljárást ismertet. Ez a példa írja le, továbbá, az analizált peptidek/peptidmimetikumok szekvenciáit. Kémiai anyagok és reagensek. A bleomicin a Wako Pure Chemical Co. (Osaka, Japán) cégtõl származott, és desztillált vízben 10 mg/ml koncentrációjú oldat készült belõle. A propidium-jodid (P1) és adriamicin a Sigma (St. Louis, MO) cégtõl származott. Sejttenyészet. Emberi T¹sejt-leukémiából származó Jurkat-sejtvonalat 10% újszülött borjúeredetû szérummal (IBL: Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japán) kiegészített RPMI 1640 (Sigma) tápoldatban tenyésztettünk (37 °C/5% CO2). Emberi hasnyálmirigyrákból származó MIAPaCa2 sejtvonalat 10% újszülött borjúeredetû szérummal kiegészített DMEM tápoldatban tenyésztettünk (37 °C/5% CO2). Sejtciklus-analízis. A bleomicinnel vagy adriamicinnel kezelt sejtek sejtciklusának helyzetét áramlási citometriával analizáltuk [Kawabe, Nature 385, 454–458 (1997)]. Röviden: kétmillió felszuszpendált sejtet 200 ml Krishan-féle oldatban (0,1% nátrium-citrát, 50 mg/ml P1, 20 mg/ml RNáz A és 0,5% NP–40) 1 órán át 4 °C¹on inkubáltunk, majd a CEL-LQuest™ (Beckton Dickinson) program alkalmazásával végzett FACScan™ (Beckton Dickinson, Mountain View, CA) áramlási citometriával analizáltunk.

1. táblázat Példaként ismertetett peptidek/peptidmimetikumok szekvenciái és vonatkozó kódnevei (1¹Tyr)(1¹Gly)(1¹Arg)(1¹Lys)(1¹Lys)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Gln)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe2,3,4,5,6¹F)(1¹Arg)(1¹Ser)(1¹Pro)(1¹Ser)(1¹Tyr)(1¹Tyr) (SEQ ID NO. 105.)

CBP413

(1¹Tyr)(1¹Gly)(1¹Arg)(1¹Lys)(1¹Lys)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Gln)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe2,3,4,5,6¹F)(1¹Arg)(1¹Ser)(1¹Pro)(1¹Ser)(1¹Tyr) (SEQ ID 106.)

CBP420

(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(1¹Arg)(1¹Ser)(1¹Pro)(1¹Ser)(1¹Tyr)(1¹Tyr) (SEQ ID NO. 107.)

CBP430

(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Gln)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe2,3,4,5,6¹F)(1¹Arg)(1¹Ser)(1¹Pro)(1¹Ser)(1¹Tyr)(1¹Tyr) (SEQ ID NO. 108.)

CBP431

(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Gln)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Ser)(d¹Trp)(1¹Pro)(1¹Ser)(1¹Tyr) (SEQ ID 109.)

CBP432

23

HU 004 256 T2

1. táblázat (folytatás) (1¹Tyr)(1¹Gly)(1¹Arg)(1¹Lys)(1¹Lys)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Gln)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Arg)(1¹Cha)(1¹Phe2,3,4,5,6¹F)(1¹iminoundekánsav)(1¹Tyr)(1¹Tyr) (SEQ ID 110.)

CBP440

(d¹Tyr)(d¹Tyr)(d¹Ser)(1¹Gly)(d¹Ser)(d¹Arg)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Arg)(1¹Gly)(d¹Tyr) (SEQ ID 111.)

CBP450

(d¹Tyr)(d¹Ser)(d¹Pro)(1¹Trp)(1¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 87.)

CBP451

(d¹Tyr)(d¹Ser)(1¹Pro)(1¹Trp)(1¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 88.)

CBP452

(d¹Tyr)(d¹Ser)(d¹Pro)(1¹Trp)(1¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Pro)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 112.)

CBP454

(d¹Tyr)(d¹Ser)(1¹Pro)(1¹Trp)(1¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(1¹Pro)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 113.)

CBP455

(1¹Tyr)(1¹Tyr)(1¹amino-undekánsav)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Arg)(1¹Gly)(d¹Tyr) (SEQ ID 114.)

CBP460

(1¹Tyr)(1¹amino-undekánsav(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Arg)(1¹Gly)(d¹Tyr) (SEQ ID 115.)

CBP461

(1¹Tyr)(1¹amino-undekánsav)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID NO. 116.)

CBP462

(1¹amino-undekánsav)(d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Arg)(1¹Gly)(d¹Tyr) (SEQ ID 117.)

CBP463

(1¹amino-undekánsav)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID 118.)

CBP464

(1¹amino-undekánsav)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID NO. 119.)

CBP465

(1¹8-amino-kaprilsav)(d¹Cha)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 120.)

CBP466

(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID NO. 121.)

CBP470

(d¹Cha)(d¹Phe-2,3,5,6¹F)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID NO. 122.)

CBP471

(d¹Tyr)(d¹Ser)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 123.)

CBP481

(d¹Tyr)(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 124.)

CBP500

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 80.)

CBP501

(d¹Bpa)(1¹8-amino-kaprilsav)(d¹Cha)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 125.)

CBP502

(d¹Bpa)(1¹8-amino-kaprilsav)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 126.)

CBP503

(d¹Asp)(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 127.)

CBP504

(d¹Bpa)(d¹Asp)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 128.)

CBP505

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Asp)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 129.)

CBP506

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Cha)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Bpa) (SEQ ID 93.)

CBP510

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID NO. 94.)

CBP511

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Cha)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Bpa) (SEQ ID 95.)

CBP512

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Bpa)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg)(SEQ ID NO. 130.)

CBP601

(d¹Bpa)(1¹8-amino-kaprilsav)(d¹Bpa)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 131.)

CBP602

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe4NO2)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 89.)

CBP603

24

1

HU 004 256 T2

2

1. táblázat (folytatás) (d¹Bpa)(d¹Pro)(d¹Trp)(d¹Pro)(d¹Phe4NO2)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID NO. 132.)

CBP604

(d¹Bpa)(d¹Pro)(d¹Trp)(d¹Pro)(d¹Phe4NO2)(d¹NaI2)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID NO. 133.)

CBP605

(d¹Phe4NO2)(d¹Pro)(d¹Trp)(d¹Pro)(d¹Phe4NO2)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 134.)

CBP606

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 90.)

CBP607

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg) (SEQ ID 91.)

CBP608

(d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Lys)(d¹Lys) (SEQ ID 92.)

CBP609

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID 96.)

CBP700

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa)(d¹Arg)(d¹Trp)(d¹Arg)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID 97.)

CBP701

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa)(d¹Arg)(d¹Trp)(d¹Arg)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID NO. 98.)

CBP702

(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (SEQ ID NO. 99.)

CBP703

(d¹Bpa)(d¹Cys)(d¹Trp)(d¹Arg)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Cys) (SEQ ID NO. 135.)

CBP524

(d¹Tyr)(d¹Cys)(d¹Pro)(d¹Trp)(d¹Arg)(d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha)(d¹Cys) (SEQ ID 136.)

CBP721

2. példa E példában írjuk le a különféle peptidek „G2”¹t megszüntetõ aktivását jelzõ adatokat, és a különféle szekvenciapermutációk – így, a szekvenciahosszúság csökkenése – aktivitásra gyakorolt hatását. A „G2” ellenõrzési pont megszüntetés áramlási citometriás analízise emberi leukémiából származó Jurkat-sejtvonalon történt. Röviden, különféle dózisú peptiddel/peptidmimetikummal és 40 mg/ml bleomicinnel tenyésztett sejteket kezeltünk 24 órán át. A sejtek DNS-tartalmát propidium-jodiddal festettük és áramlási citometriával analizáltuk. Ezen eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze. Az egyes peptidek/peptidmimetikumokra vonatkozó, bleomicinnel kezelt Jurkatsejtekre felvett dózis-hatás görbék az 1., 5., 6., 7., 8., 11. és 12. ábrán találhatók (az „Y” tengelyen tüntettük

fel a 24 órás kezelés után a „G2/M” fázisban lévõ Jur25 kat-sejtek %¹os arányát). A vegyületek okozta „M” fázisú ellenõrzési pont megszûnésének áramlási citometriás analízise emberi T¹sejt leukémiából származó, kolhicinnel (5 mg/ml vagy 0,5 mg/ml) és különféle dózisú peptiddel/peptid30 mimetikummal 24 órán át kezelt Jurkat-sejteken történt. A sejtek DNS-tartalmát festettük és áramlási citometriával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. Ezeken eredmények is a 2. táblázatban vannak összefoglalva. 35 Az egyes peptidek/peptidmimetikumokra vonatkozó, kolhicinnel kezelt Jurkat-sejtekre felvett dózis-hatás görbék a 2. és 14. ábrán találhatók (az „Y” tengelyen tüntettük fel a 24 órás kezelés után a „G2/M” fázisban lévõ Jurkat-sejtek %¹os arányát).

2. táblázat A vegyületek „G2” ellenõrzési pontot megszüntetését vagy mellékhatást indukáló dózisai Kódnév

„G2”¹t megszüntetõ dózis (mM)

A mellékhatás jelentkezése az önmagában alkalmazott vegyületnél (mM)

A mellékhatás jelentkezése kolhicinnel együtt alkalmazott vegyületnél (mM)

CBP441

>50

>50

>50

CBP462

>50

>50

>50

CBP464

>50

>50

>50

CBP470

>50

>50

>50

CBP430

>50

50

>50

CBP481

>50

>6,25

>12,5

CBP431

>50

>3,125

>50

CBP420

>50

>1,56

>50

CBP440

>12,5

>1,56

CBP413

>25

>1,56

CBP450

>6,25

>0,78

25

>3,125 >25 >6,25

1

HU 004 256 T2

2

2. táblázat (folytatás) Kódnév

A mellékhatás jelentkezése az önmagában alkalmazott vegyületnél (mM)

„G2”¹t megszüntetõ dózis (mM)

A mellékhatás jelentkezése kolhicinnel együtt alkalmazott vegyületnél (mM)

CBP460

>3,125

>0,39

>3,125

CBP461

>6,25

>0,39

>6,25

CBP463

>6,25

>0,39

>6,25

CBP500

>50

>0,39

>12,5

CBP501

>50

>0,39

>25

„A mellékhatás jelentkezése az önmagában alkalmazott vegyületnél” felirat jelzi azt a peptid/peptidmimetikum-dózist, amely a Jurkat-sejt ciklusában zavart [azaz, „G1” fázis alatti sejtek (elpusztult sejtek) jelentõs mennyiségének elõfordulása vagy a szokásosnál nagymértékben változó DNS-tartalmú sejtek] okozott. például a „G1” sejtek rendszerint éles csúcsként jelennek meg a FACS-analízisben, azonban amikor kezelés után a sejtciklus zavart szenved, a csúcs szélesebbé és laposabbá válik, ami a nem megfelelõ sejtprogressziót vagy a sejthalál kezdetét jelzi. A „G2¹t megszüntetõ dózis” jelzi a 24 órás kezelés után a kimutatható „G2”¹t megszüntetõ aktivitást adó, 40 mg/ml bleomicinnel együtt alkalmazott peptid/peptidmimetikumdózist. „A mellékhatás jelentkezése kolhicinnel együtt alkalmazott vegyületnél” felirat jelzi azt a peptid/peptidmimetikum-dózist, amely 5 mg/ml kolhicinnel együtt adagolva a 24 órás kezelés után a Jurkat-sejt ciklusában zavart okozott. A ciszplatinnal kombinált CBP501 „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását vizsgáltuk különféle sejtvonalakon. Röviden, ciszp-

latint (3 mg/ml) és CBP501¹et (0,4, 2 és 10 mM) adtunk 15 egyidejûleg a sejttenyészethez, amelyet 3 órán át 37 °C¹on, 5%¹os CO2 atmoszférában inkubáltunk. A tápoldatot eltávolítottuk, friss, a fenti vegyületeket nem tartalmazó tápoldatot adtunk a sejtekhez és további 45 órán át inkubáltuk. A lebegõ sejtekkel együtt 20 a sejteket tripszin-EDTA-oldat alkalmazásával begyûjtöttük, Krishan-féle-oldattal inkubáltuk, és a fentiekben leírtak szerint áramlási citometriával analizáltuk a DNS-tartalomra nézve. Az eredmények a 3. táblázatban vannak összefoglalva. A HUVEC-tõl eltekintve, ár25 nyékolt kiemeléssel jeleztük azokat a sejtvonalakat, amelyeknél a „G2” populációban jelentõs veszteség és fokozott „G1” populáció volt jelen, ami a „G2” ellenõrzési pont megszûnésére és a ciszplatinnal szembeni, CBP501 általi érzékenyítésre utal. Az a megfigyelés, 30 miszerint a HUVEC-sejtek – amelyeknél a „G1” ellenõrzési pont normális – még maximum 50 mM CBP501nél sem lettek érzékenyek azt jelzi, hogy a CBP501 inkább a „G2” ellenõrzési pontra specifikus és nemspecifikus.

3. táblázat „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ dózisú CBP501 különféle sejtvonalak ellen CBP501

Eredet

Ciszplatin

HUVEC

Vena umbiliculis endotéliuma

>50 <2

HT–29

Vastagbél

MIAPaCa2

Hasnyálmirigy

SK-OV-3

Petefészek, hMLH1

50

HCT116

Vastagbél, hMLH1

<2

Panc1

Hasnyálmirigy

>10

0,4<<2

MK45

Gyomor

>10

SW620

Vastagbél

>10

NCl-H226

Tüdõ, SCC

0,4

SW900

Tüdõ, SCC

>10

NCl-H520

Tüdõ, SCC

>10

DU–145

Prosztata, MLH1

MCF–7

Emlõmirigy

Különbözõ dózisoknál tanulmányoztuk a különféle vegyületek „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását bleomicinnel (Bleo) vagy adriamicinnel (ADR) ke-

0,4 >10

zelt, emberi hasnyálmirigyrákból származó MIAPaCa2 sejtvonalon. Röviden, sejteket inkubáltunk a ve60 gyületekkel és bleomicinnel (10 mg/ml) vagy adriami26

1

HU 004 256 T2

cinnel (1 mg/ml) 3 órán át. A tápoldatot kicseréltük és további 21 órán át inkubáltuk. Begyûjtött sejteket propidium-jodiddal DNS¹re festettük és áramlási citometriával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. A 3. ábrán a „G1” elõtti stádiumban lévõ sejtek %¹os arányát elpusztult sejtekként adtuk meg. Az eredmények jelzik, hogy a CBP501 dózistól függõen érzékenyítette a MIAPaCa2-sejteket mind a bleomicinnel, és mind pedig az adriamicinnel szemben. A 4A. és 4C. ábra foglalja össze az egymástól egy aminosav tekintetében különbözõ peptidek párjainak „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását. E peptidek „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását bleomicinnel kezelt Jurkat-sejtek alkalmazásával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. A 4B. ábra az egymástól egy aminosav tekintetében különbözõ peptidek párjainak az „M” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását és/vagy nemspecifikus toxicitásának analízisét foglalja össze. E peptidek az „M” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását és/vagy nem specifikus toxicitását kolhicinnel kezelt Jurkat-sejtek alkalmazásával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. Különféle dózisú, argininben gazdag szekvenciák „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását bleomicinnel kezelt sejteken vizsgáltuk. Röviden, a tápoldathoz 0,2 mg/ml, 0,39 mg/ml, 0,78 mg/ml, 1,56 mg/ml, 3,125 ng/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml vagy 50 mg/ml peptidet és 40 mg/ml bleomicint adtunk. A sejteket 24 órával késõbb begyûjtöttük, Krishan-féle oldattal festettük és áramlási citometriával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. A G2/M sejtek százalékos arányát (Y tengely) a peptiddózisok arányában (X tengely) ábrázoltuk az 5. ábrán. Az adatok jelzik, hogy a kiindulási, bázikus aminosavban gazdag szekvencia „(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln)(d¹Arg)(d¹Arg) (a SEQ ID NO. 17. azonosító számon megadott szekvencia)” a legjobb szekvencia a kevesebb vagy több aminosavat tartalmazó szekvenciákkal összehasonlítva. Különféle dózisú, (D¹Bpa)¹t nem tartalmazó peptidek „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását bleomicinnel kezelt sejteken vizsgáltuk. Röviden, a tápoldathoz 0,2 mg/ml, 0,39 mg/ml, 0,78 mg/ml, 1,56 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml vagy 50 mg/ml peptidet és 40 mg/ml bleomicint adtunk. Ezután a sejteket begyûjtöttük és áramlási citometriával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. A G2/M sejtek százalékos arányát (Y tengely) a peptiddózisok arányában (X tengely) ábrázoltuk a 6. ábrán. Ez az eredmény jelzi, hogy a (Tyr)(Ser)(Pro)(Trp)(Ser) (Phe-2,3,4,5,6¹F)(Cha) szekvencia (a SEQ ID NO. 138. azonosító számon megadott szekvencia) a (Bpa)(Ser)(Trp) (Ser)(Phe2,3,4,5,6¹F)(Cha) szekvenciáéval (a SEQ ID NO. 139. azonosító számon megadott szekvencia) összevethetõ, „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitást mutat. Különféle dózisú, argininben gazdag és lizinben szekvenciák „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását bleomicinnel kezelt sejteken vizsgáltuk. Röviden, a megadott dózisú (X tengely) peptideket 40 mg/ml bleomicinnel együtt Jurkat-sejtek tápoldatához adtuk. Ezután a sejteket begyûjtöttük és áramlási citometriával analizál-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 27

2

tuk a fentiekben leírtak szerint. A G2/M sejtek százalékos arányát (Y tengely) a peptiddózisok függvényében ábrázoltuk (7. ábra). Az eredmények jelzik, hogy a kiindulási, aminosavban gazdag szekvenciát tekintve az argininben gazdag szekvenciák aktivitása feltehetõen jobb, mint lizinszekvenciáké, és hogy a szekvencia mûködéséhez a Gln nem elengedhetetlenül szükséges. Argininben gazdag régiót különféle helyeken tartalmazó szekvenciák „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását vizsgáltuk. Röviden, a megadott dózisú (X tengely) peptideket 40 mg/ml bleomicinnel együtt Jurkat-sejtek tápoldatához adtuk. Ezután a sejteket begyûjtöttük és áramlási citometriával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. A G2/M sejtek százalékos arányát (Y tengely) a peptiddózisok függvényében ábrázoltuk (8. ábra). Az adatok jelzik, hogy a peptidek „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitása az argininben gazdag régió helyének cseréjével jelentõs mértékben nem változott meg. Ráadásul, a CBP511¹el ellentétben a CBP501 vízben oldható volt. Ez a különbség bizonyos gyógyszerbeviteli-rendszerek esetén elõnyös lehet, mivel bizonyos rendszerek a vízben oldhatatlan vegyületeket részesítik elõnyben. A 9. ábra foglalja össze a különféle, egymástól csak egy aminosav tekintetében különbözõ peptidek párjaival végzett analízis eredményeit. E peptidek „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását bleomicinnel kezelt Jurkat-sejtek alkalmazásával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. Az egyes aminosavak mérete, töltése és hidrofobicitása határozza meg, hogy a szekvencia milyen hatékonyan illeszkedik a célmolekulába. A peptid vagy peptidmimetikum oldallánca szabadon mozoghat, így még egy vagy két elõnytelen oldalláncú peptid vagy peptidmimetikum is be tud illeszkedni a célmolekula zsebébe vagy vájatába (groove). Az összefoglalás szerint, az egyes oldalláncok esetében van elõnyös méret, ami jelzi a célmolekula kötõrégió (zseb vagy vajat) egyes oldalláncokra vonatkozó méretét. Például gyûrûszerkezetekhez, mint például benzol, idol és ciklohexán, kapcsolódó oldalláncok határozzák meg a „G2”¹t megszüntetõ vagy „M”¹et megszüntetõ aktivitás erõsségét és/vagy a nemspecifikus toxicitást; ld. 9. és 4. ábra, ahol az öttagúnál nagyobb szerkezetek hatást gyakorolnak a „G2”¹t megszüntetõ aktivitásra (a P1 és P2) mérsékelt mérete fokozza a „G2”¹t megszüntetõ aktivitást, míg a túl nagy szerkezet (P1, P5 és P6) fokozza az „M”¹et megszüntetõ aktivitást és/vagy a nem specifikus toxicitást. A gyûrûszerkezet nélküli oldalláncok közömbösnek tûnnek. Eszerint, a jobb aktivitás eléréséhez, a P1¹nél, P2¹nél, P4¹nél és P6¹nál a megfelelõen méretezett gyûrûszerkezet mellett arra is szükség van, hogy a P3¹nál és P5¹nél ne legyen gyûrûszerkezet vagy hattagúnál kisebb gyûrûszerkezet legyen. A P1, P2 és P6 esetében, a megfelelõ gyûrû 1–6 tagú gyûrûtõl a két, 5 vagy 6 tagú gyûrû fúziójával kialakult gyûrûig terjed. A P4¹nél egy megfelelõen méretezett gyûrû két, egyenként 5 vagy 6 tagú gyûrû fúziójával létrejött gyûrû. így, P1¹nek a Cha vagy Nal(2) tûnik a legjobbnak,

1

HU 004 256 T2

míg P2¹nek a Phe-2,3,4,5,6¹F, Phe-3,4,5F vagy PheCF3. Ezek az oldallánc-méretek jelzik, hogy a célmolekulában vagy két zseb vagy egyetlen nagyobb zseb van ott, ahol e régió kölcsönhatásba lép. P3 és P5 esetében, egy kisebb oldallánc, mint például Ser vagy Pro, a megfelelõ és egy nagyobb oldallánc, mint például Arg, is elfogadható, ami jelzi, hogy a célmolekula e régiójában nincs zseb, így az oldalláncok csak elhelyezkednek a célcsoporttal szemben. Azonban, lehetséges, hogy egy adott gyûrûszerkezet lehetõvé teheti, hogy a peptid vagy peptidmimetikum egy másik molekulával (azaz, nem a célmolekulával) lépjen kölcsönhatásba, amely viszont fokozza a mellékhatást. A P6¹nál, a Bpa vagy Ser-Tyr jobbnak tûnik, mint a Tyr önmagában vagy egy annál kisebb oldallánc, ami egy mélyebb, a célban vízszintesen elhelyezkedõ vájatra utal. A P4 aminosavainak mérete alapján, a célban a P4¹re létezik még egy felületi és szélesebb zseb is. Az alábbi peptideket analizáltuk Jurkat-sejtek és bleomicin, a fentiekben leírtak szerinti alkalmazásával. A peptidszekvenciák az alábbiak: CBP501, (d¹Bpa)(d¹Ser)(d¹Trp)(d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia); CBP700, (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a (SEQ ID NO. 96. azonosító számon megadott szekvencia); CBP701, (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 97. azonosító számon megadott szekvencia); CBP702, (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg)(d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 98. azonosító számon megadott szekvencia); és CBP703, (d¹Arg) (d¹Arg)(d¹Arg)(d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F)(d¹Cha) (a SEQ ID NO. 99. azonosító számon megadott szekvencia). Az eredmények arra utalnak, hogy a CBP700, 701, 702, 703 – amelyek ugyan rövidebbek, mint a többi példáként említett peptid – a jelentõs „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitású más peptidekkel összevethetõ mértékben megõrzik „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitásukat (11. ábra). Összehasonlítottuk a CBS01 „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitását és nemspecifikus toxicitását („M” ellenõrzési pont megszüntetését). Röviden, Jurkat-sejteket kezeltünk 40 mg/ml bleomicinnel (a „G2” ellenõrzési pontot megszüntetõ aktivitáshoz) vagy 0,5 mg/ml kolhicinnel (a nemspecifikus toxicitáshoz). Az egyes sejtek DNS-tartalmát áramlási citometriával analizáltuk a fentiekben leírtak szerint. Az adatok jelzik, hogy CBP501 a „G2” ellenõrzési pontot dózistól függõen szüntette meg, míg a nemspecifikus toxicitás akár 50 mM koncentrációjú peptid esetében is hiányzott (az „M” fázisban nyugvó sejtek változatlan aránya szerint) (12. ábra). 3. példa E példa írja le a peptid/peptidmimetikum kinázgátló aktivitását és a különféle peptidek szérumban való stabilitásának analízisét.

2

Mivel két kináz, a Chk1 és Chk2, fontos szerepet tölt be a „G2” ellnõrzési pont mûködésében, mindkét enzimre kinázgátló analízist végeztünk. In vitro kinázgátló analízist a Promega gyártmányú „PepTag(R) 5 Non-Radioactive Protein Kinase Assays” készlettel végeztünk a gyártó által megadott protokol szerint, azzal a különbséggel, hogy PKC helyett tisztított CHK2 kinázt alkalmaztunk. Tisztított PKC¹t az Upstate Biotechnology, Inc.¹tõl szereztünk be. Ezen eredményeket a 10 4A. táblázat mutatja be. 4A. táblázat A vegyületek kinázgátlásának analízise 15

IC50 (mM)

PKA

CHK2

CBP450

>400

10

CBP440

180

8

In vitro kinázgátlási analízist a CycLex, Co. Ltd. 20 (Nagano, Japán) végezte. Röviden, hisztidin toldalékkal ellátott, bakulovírusból származó, rekombináns, emberi teljes hosszúságú Chk1¹et vagy GST-vel fuzionált, E. coli eredetû, rekombináns, emberi teljes hosszúságú Chk2¹t alkalmaztunk kinázként. E. coliból 25 származó, rekombináns GST-Cdc25C (167–267. aminosavak) alkalmaztunk szubsztrátumként. Reakciókörülmények: 20 mM Hepes-KOH (pH=7,5), 1 mM DTT, 80 mg/ml BSA, 10 mM MgCl2 és 50 mM ATP; 30 °C, 60 perc. A GST-Cdc25C 216. szerinjének foszforilálá30 sát foszforilált Cdc25C elleni S216 antitesttel végzett, enzimmel kapcsolt immunvizsgálattal mutattuk ki. Ezeket az eredményeket a 4B. táblázat mutatja be.

35

4B. táblázat A peptidek kinázgátlásának analízise CHK1

40

CHK2

CBP500

5,6

8

CBP501

7,9

18,6

CBP505

63,4

>100

CBP506

37,6

67

CBP603

15,5

18,1

Az adatok jelzik, hogy a „G2”¹t megszüntetõ dózisnál magasabb dózis esetében mind a Chk1 és mind pedig a Chk2 kináz gátlása tapasztalható (a „G2” megszüntetésének CBP500, 501, 505, 506, 603 esetében számított IC50-értéke alacsonyabb, mint a VM). Ezek 50 az eredmények felvetik, hogy e peptideknek a Chk1/2 molekulák gátlása mellett más hatásmechanizmusuk is van. Esetleg, a peptidek feltehetõen annyira felgyülemlenek a sejtekben, hogy azok koncentrációja magasabb lesz a sejten belül, mint a környezõ tápol55 datban. Szérumanalízist analízist végeztünk a peptidek stabilitásának meghatározására egéreredetû és emberi szérumban. Röviden, peptideket (10 mM vagy 2,5 mM) inkubáltunk frissen készített emberi szérummal 60 37 °C¹on 1 órán át. CBP501 (10 mM) inkubáltunk fris45

28

1

HU 004 256 T2

sen készített egéreredetû szérummal 37 °C¹on 1 órán át. Jurkat-sejteket kezeltünk a peptideket és bleomicint (40 mg/ml) tartalmazó vagy azok nélküli szérummal és 24 órán át inkubáltuk. A G2¹fázisú sejtek populációját áramlási citometriával határoztuk meg a fentiekben leírtak szerint. A szérummal kezelt peptidek maradék, „G2” ellenõrzési pont megszüntetési aktivitását a kezelt szérum G2 sejtjeinek százalékos arányának a tápoldattal kezelt peptidek, bleomicin és Jurkat-sejtek alkalmazásával elõállított standard görbével való összehasonlításával határoztuk meg (5A. táblázat). A maradék CBP501 mennyiségét etanollal végzett fehérjeeltávolítás után, HPC-vel határoztuk meg. Az adatok jelzik, hogy a d¹típusú aminosavakat tartalmazó CBP501 és CBP603 stabilabb a szérumban, mint az 1¹es típusú aminosavakat tartalmazó peptid, mint amilyen a CBP413. 5A. táblázat Emberi szérummal végzett kezelés analízise

mezeltük ki. Az eredmények jelzik, hogy a peptid önmagában nem zavarja meg a normális sejtek szaporodását és a peptid nem erõsíti a ciszplatin és oxiplatin citotoxikus aktivitását a sejt ellen. Ennélfogva, úgy tû5 nik, hogy nukleinsavat károsító kezelésnek kitett normális sejtek ellen a peptidek nem mutatnak jelentõs mértékû, „G2”¹t megszüntetõ aktivitást, azonban a túlságos mértékben proliferálódó sejteket (például ráksejtek) a nukleinsavat károsító kezelésre érzékennyé 10 tesznek. Az eredmények jelzik, hogy a peptid, nukleinsavat károsító kezelésre érzékenyítõ hatása a proliferálódó sejtekre specifikus, és nem a normális sejtekre, 15

Az eredeti <4%¹a

CBP501

Az eredeti >50%¹a

CBP603

Az eredeti >50%¹a

5B. táblázat Egéreredetû szérummal végzett kezelés analízise

20

>90%

4. példa Ez a példa írja le a CBP501 tenyésztett sejtekre gyakorolt sejtproliferáció ellenes aktivitását. E példa a peptidek/peptidmimetikumok in vivo aktivitását bemutató adatokat is leírja. A vegyületek sejtproliferáció elleni aktivitásának bemutatása céljából, emberi hasnyálmirigyrákból származó MIAPaCa2-sejtek tenyészetét csak CBP501¹el (10 mM), ciszplatinnal (1,3 vagy 9 mg/ml) és oxaliplatinnal (1,3 vagy 9 mg/ml), vagy ezek kombinációjával kezeltük. Röviden, a sejteket 6 lyukú lemezre lemezeltük ki 300 sejt/lyuk koncentrációban, 12 órán át inkubáltuk és a vegyületekkel 3 órán át kezeltük. A tápoldatot kicseréltük és további 10 napon át inkubáltuk. Sejtek rögzítettünk 70% metanollal, 0,1%¹os kristálylilával festettük és tettük láthatóvá. A telepképzési analízisben kapott eredmények jelezték, hogy a CBP501 egyaránt fokozta a ciszplatin és az oxiplatin MIAPaCa2-sejtekre gyakorolt citotoxikus aktivitását. Hasonló vizsgálatokat végeztünk normális emberi köldökzsinórból származó endotél sejtek (HUVEC) alkalmazásával. Mivel normális sejtek nem alkotnak telepeket, ezeket a sejteket a lyukanként 300 sejt koncentráció helyett 3000 sejt/lyuk koncentrációban le-

24 h

48 h

72 h

16,mM

3 mM

46 mM

CBP501

6,mM

10 mM

13 mM

CBP501 10 mM ciszplatinnal

0,6 mM

1 mM

6 mM

Ciszplatin

25

30

A peptidmaradék aktivitása 1 órás, emberi szérummal végzett kezelés után

CBP501

6. táblázat MIAPaCa2-sejtek szaporodása gátlásának analízise alamarkék alkalmazásával IC50

A peptidmaradék aktivitása 1 órás, emberi szérummal végzett kezelés után

CBP413

2

35

40

45

50

55

60 29

Alamarkékkel analízist végeztünk a ciszplatinnal együtt vagy anélkül alkalmazott CBP501 szaporodásgátló aktivitásának vizsgálata céljából. Röviden, MIAPaCa2-sejteket 1, 3, 10, 30, 100 mM ciszplatinnak vagy 10 mM ciszplatinnal vagy anélkül alkalmazott 0,22, 0,67, 2, 6, és 18 pM CBP501-nek tettünk ki (3 h, 96 lyukú lemez, 2500 sejt/lyuk, kétszeres ismétlés). A tápoldatot lecseréltük és további 24, 48 vagy 72 órán át inkubáltuk. Inkubálás után, az egyes lyukakhoz 20¹20 ml 96%¹os almarkék reagenst adtunk. További 6 órás inkubálás után a sejtek életképességét fluoreszcenciaintenzitás kimutatásával határoztuk meg. Fluoreszcenciaintenzitást Spectrafluor Plus lemezleolvasó alkalmazásával mértünk (530 nm excitáció, 590 nm emisszió). Kiszámítottuk az IC50-értékeket (6. táblázat). E vizsgálat jelzi, hogy a CBP501 önmagában, a moláris dózisban alkalmazott ciszplatinnal jobban gátolja a sejtszaporodást. A CBP501 sokkal alacsonyabb dózisban nyomja el a sejtszaporodást, ha 10 mM ciszplatinnal (körülbelül egyenlõ a ciszplatin rák kezelésében alkalmazott dózisával) együtt alkalmazzuk. Továbbá, a CBP501 szaporodást szuppresszáló aktivitása ciszplatinénál a hosszabb ideig tart; a 72 óránál számított IC50 érték sokkal jobb, amikor ciszplatin helyett CBP501¹et alkalmazunk. A CBP501 in vivo féléletidejét úgy állapítottuk meg, hogy egértõl vett szérumban a CBP501 (40 mg/kg) intraperitoneális injekcióként történt beadása után 1, 3 és 6 órával meghatároztuk a CBP501 mennyiségét. A maradvány intakt CBP501 mennyiségét, injektált egérbõl vett szérum etanollal végzett fehérjementesítése után, HPLC-vel határoztuk meg (7. táblázat).

1

HU 004 256 T2

7. táblázat A CBP501 in vivo fél-életideje 40 mg/kg intraperitoneális injekció utáni féléletidõ

CBP501

5

3h

A peptidekkel szembeni tolerancia meghatározására, 10 egérbõl álló csoportokat intravénásan (egyszeri injekció; 5, 8 vagy 10 mg/kg) vagy intraperitoneálisan injektáltunk CBP501¹el (egyszeri injekció; 50, 80 vagy 100 mg/kg). Egy héttel késõbb megállapítottuk az életben maradt injektált egerek számát (8. táblázat). 8. táblázat Maximális tolerált dózis egérben (egyetlen injekció) MTD (iv)

MTD (ip)

CBP413

14 mg/kg

146,7 mg/kg

CBP501

10 mg/kg

98,8 mg/kg

A vegyületek in vivo hatékonyságának meghatározása céljából SCID egerekbe emberi hasnyálmirigyrákeredetû MIAPaCa2-sejteket implantáltunk szubkután. A kezelést akkor kezdtük meg, amikor az elsõdleges (primer) tumor mérete elérte a 0,1 cm3¹es (0. nap) vagy annál nagyobb, például 7 vagy 8 mm átmérõjû, méretet. Önmagában vagy kombinációban CDDP¹t (3 mg/kg) és CBP 501¹et (10 vagy 40 mg/kg) adtunk be intraperitoneálisan. A tumorok méretét tapintókörzõvel hetente háromszor mértünk, és a térfogatokat az alábbi képlettel számítottuk ki: Tömeg (mg)=[szélesség (mm) 2×hosszúság (mm)]/2. Az egyes kezelések során mért tumorméretek (n=4) átlagát a kezelés kezdetétõl eltelt napok függvényében ábrázoltuk (10. ábra). Az eredmények jelzik, hogy önmagában a CBP501kezelés elnyomta az emberi hasnyálmirigyrákból származó sejtek in vivo szaporodását. Az eredmények jelzik továbbá azt is, hogy a CBP501 fokozta a ciszplatin tumorellenes aktivitását.

10

15

20

25

30

35

40

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 45 1. Összefüggõ peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 2. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 4. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a (SEQ ID NO. 7. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a (SEQ ID NO. 8. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 10. azonosító számon megadott szekvencia);

50

55

60 30

2

P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 12. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P1 jelentése Cha; ahol P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F), Bpa, vagy Phe4NO2; ahol P3 jelentése bármilyen aminosav; ahol P4 jelentése Trp; ahol P5 jelentése bármilyen aminosav; ahol P6 jelentése Bpa, vagy Phe4NO2; és ahol P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három bázikus aminosav, míg a többi bármilyen aminosav vagy hiányzik. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 18. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F). 3. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol P2 jelentése (Phe-2,3,4,5,6¹F) vagy Phe4NO2. 4. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol P2 jelentése (Phe2,3,4,5,6¹F). 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol P3 vagy P5 jelentése Ser. 6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol P6 jelentése Bpa. 7. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol P2 jelentése Phe4NO2. 8. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 22. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P3 jelentése Ser, Arg, Cys, Pro, vagy Asn; és ahol P5 jelentése Ser, Arg, vagy Asn. 9. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a (SEQ ID NO. 25. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a (SEQ ID NO. 26. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 28. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 30. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P3 jelentése Ser, Arg, Cys, Pro, vagy Asn; ahol P5 jelentése Ser, Arg, vagy Asn; és ahol P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három Arg vagy Lys, míg a többi bármilyen aminosav vagy hiányzik.

1

HU 004 256 T2

10. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 36. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P3 jelentése Ser; ahol P5 jelentése Ser vagy Asn; ahol P7, P8, P9, P10, P11, P12 közül legalább három Arg, míg a többi bármilyen aminosav vagy hiányzik. 11. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 40. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P3 jelentése Ser; és ahol P5 jelentése Ser. 12. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a SEQ ID NO. 42. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (a (SEQ ID NO. 45. azonosító számon megadott szekvencia); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (a (SEQ ID NO. 46. azonosító számon megadott szekvencia); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 48. azonosító számon megadott szekvencia); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 50. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P4 jelentése d¹ vagy I¹Trp; ahol P6 jelentése Bpa; ahol P7 jelentése Arg; ahol P8 jelentése Arg; ahol P9 jelentése Arg; ahol P10 jelentése Gln vagy Arg; ahol P11 jelentése Arg; és ahol P12 jelentése d¹ vagy I¹Arg. 13. Az 1., 3. vagy 12. igénypont szerinti peptidvagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol P3 vagy P5 jelentése Ser vagy Pro. 14. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (a (SEQ ID NO. 56. azonosító számon megadott szekvencia); ahol P3 jelentése Ser; ahol P5 jelentése Ser; ahol P6 jelentése Bpa; ahol P7 jelentése Arg; ahol P8 jelentése Arg; ahol P9 jelentése Arg; ahol P10 jelentése Gln vagy Arg; ahol P11 jelentése Arg; és ahol P12 jelentése Arg.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 31

2

15. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 80. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a (SEQ ID NO. 100. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 59. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a (SEQ ID NO. 60. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a (SEQ ID NO. 67. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 68. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 71. azonosító számon megadott szekvencia); (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Bpa) (d¹Arg) (d¹Trp) (d¹Arg) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 73. azonosító számon megadott szekvencia). 16. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe-2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Arg) (d¹Gln) (d¹Arg) (d¹Arg) (a SEQ ID NO. 77. azonosító számon megadott szekvencia). 17. Az 1. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, amely tartalmazza az alábbi szerkezetet: (d¹Bpa) (d¹Ser) (d¹Trp) (d¹Ser) (d¹Phe2,3,4,5,6¹F) (d¹Cha) (a SEQ ID NO. 101. azonosító számon megadott szekvencia). 18. Az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol (a) egy vagy több aminosav 1 típusú; vagy (b) egy vagy több aminosav d típusú. 19. A 15. vagy 16. igénypont szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol valamelyik d¹aminosav 1¹aminosavval van szubsztituálva. 20. Az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol (a) a szekvencia sejtproliferációt gátol; (b) a szekvencia módosítja egy adott sejt sejtciklusának „G2” ellenõrzési pontját. 21. Az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvencia, ahol a szekven-

1

HU 004 256 T2

cia hossza 6–12, 10–20, 18–25, 25–100, 25–200, vagy 50–300 aminosav. 22. Készítmény, amely az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát, valamint nukleinsavat károsító ágenst vagy proliferációellenes ágenst tartalmaz. 23. Gyógyászati készítmény, amely az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát tartalmaz. 24. Gyógyászati készítmény, amely az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát és nukleinsavat károsító ágenst vagy proliferáció ellenes ágenst tartalmaz. 25. Készlet, amely az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid- vagy peptidmimetikum-szekvenciát és alkalmazási utasításokat tartalmaz. 26. A 25. igénypont szerinti készlet, ahol az alkalmazási utasítások nukleinsavat károsító kezeléssel kombinált sejtproliferáció-gátlásra vonatkozó utasításokat tartalmaznak. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti készlet, amely nukleinsavat károsító ágenst vagy proliferáció elleni ágenst is tartalmaz. 28. In vitro eljárás sejtproliferáció gátlására, amelyben sejtet érintkeztetünk az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptidnek vagy peptidmimetikumnak a sejt proliferációjának gátlására elegendõ mennyiségével, ahol a sejt emberi eredetû embrionális sejttõl különbözõ sejt. 29. In vitro eljárás sejt nukleinsavat károsító ágenssel vagy kezeléssel szembeni érzékenységének fokozására, amelyben a sejtet érintkeztetjük az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptidnek vagy peptidmimetikumnak a sejt nukleinsavat károsító ágenssel vagy ilyen kezeléssel szembeni érzékenységének fokozására elegendõ mennyiségével, ahol a sejt emberi eredetû embrionális sejttõl különbözõ sejt. 30. In vitro eljárás sejt nukleinsavait érõ károsodás fokozására, amelyben a sejtet érintkeztetjük az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptidnek vagy peptidmimetikumnak a sejt nukleinsavait érõ károsodás fokozására elegendõ mennyiségével, ahol a sejt emberi eredetû embrionális sejttõl különbözõ sejt. 31. A 28–30. igénypontok bármelyike szerinti in vitro eljárás, amelyben továbbá a sejtet nukleinsav-károsító ágenssel érintkeztetjük vagy a sejtet nukleinsavat károsító kezelésnek tesszük ki. 32. A 28–31. igénypontok bármelyike szerinti in vitro eljárás, amelyben a sejt tenyésztett sejt. 33. Az 1–17. igénypontok bármelyike szerinti peptid vagy peptidmimetikum sejtproliferációs rendellenesség kezelésére hatékony mennyiségének alkalmazása a sejtproliferációs rendellenesség kezelésére szolgáló gyógyászati készítmény elõállítására. 34. A 33. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a sejtproliferációs rendellenesség a vérben, mellben, tü-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

32

2

dõben, pajzsmirigyben, fejben vagy nyakban, agyban, nyirokban, gyomor-bél rendszerben, orrgaratban, ivari és húgyvezetékben, húgyhólyagban, vesében, hasnyálmirigyben, májban, csontban, izomban vagy bõrben található. 35. A 33. vagy 34. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény beadása lokálisan, regionálisan vagy szisztémásan történik. 36. A 33–35. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a sejtproliferációs rendellenesség magában foglalja a jóindulatú vagy rosszindulatú, szilárd vagy folyékony tumort. 37. A 36. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tumor áttétes vagy nem áttétes. 38. A 36. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a szilárd tumorok közé tartozik a szarkóma vagy a karcinóma. 39. A 36. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a folyékony tumorok közé tartozik a vérképzõ rendszert érintõ (hematopoietikus) rák. 40. A 39. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a hematopoietikus rák kifejezésbe tartozik a mielóma, a limfóma vagy a leukémia. 41. A 36–40. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a kezelés az alanyok állapotának javulását eredményezi. 42. A 41. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a javulás kifejezés csökkent sejtproliferációt, csökkent sejtszámot, fokozott sejtproliferáció gátlását, sejtszámok növekedésének gátlását, fokozott apoptózist, vagy csökkent túlélést tartalmaz a sejtproliferációs rendellenességet hordozó sejtek legalább egy részénél. 43. A 39–42. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyászati készítmény nukleinsavat károsító ágenst, nukleinsavat károsító kezelést, vagy proliferáció elleni ágenst is tartalmaz. 44. A 43. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az ágens kifejezés magában foglal hatóanyagot vagy radioizotópot, vagy a nukleinsavat károsító kezelés magában foglal besugárzást vagy környezeti sokkot. 45. A 44. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a hatóanyag kemoterápiás hatóanyagot tartalmaz. 46. A 45. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a hatóanyag 5¹fluoro-uracilt (5¹FU), rebeccamicint, adriamicint (ADR), bleomicint (Bleo), pepleomicint, ciszplatinszármazékot, vagy kamptotecint (CPT) tartalmaz. 47. A 46. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a ciszplatinszármazék kifejezés ciszplatint (CDDP) vagy oxaliplatint tartalmaz. 48. A 44. igénypont szerinti alkalmazás, ahol (a) a radioizotóp kifejezés magában foglalja a következõket I131, I125, 90Y, 177Lu, 213Bi, vagy 21At; (b) a besugárzás kifejezés magában foglalja a következõket: UV¹besugárzás, IR¹besugárzás, vagy alfa¹, béta- vagy gamma-besugárzás; vagy (c) a környezeti sokk kifejezés magában foglalja a hipertermiát.

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

33

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

34

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

35

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

36

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

37

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

38

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

39

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

40

HU 004 256 T2 Int. Cl.: C07K 14/47

41

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest