VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie DIPLOMOVÁ PRÁCE

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie

DIPLOMOVÁ PRÁCE Studium struktury mutantu T41I/T78I matrixového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru

Vypracoval:

Jan Prchal

Vedoucí diplomové práce: Konzultant: Studijní obor: Studijní zaměření:

Ing. Richard Hrabal, CSc. Ing. Jan Lipov, PhD. Obecná a aplikovaná biochemie Obecná biochemie

Prohlašuji, že jsem v předložené diplomové práci použil jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury.

V Praze dne 9. května 2007

podpis I

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatně s vyznačením všech použitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byl jsem seznámen s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů.

Praha, 2. 5. 2007 Jan Prchal

..................................................................................................

II

SOUHRN Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je prototypem D typu retrovirů. U retrovirů typu B a D se nezralá virová částice skládá v cytoplasmě, zatímco u retrovirů typu C (HIV) je Gag směřován na cytoplasmatickou membránu, kde probíhá skládání nezralé virové částice. Nterminální doména proteinu Gag - matrixový protein - hraje hlavní roli v určení tohoto rozdílu. Bylo popsáno několik mutantů, ovlivňujících různé fáze životního cyklu M-PMV. Naší snahou je charakterizovat vliv mutantních proteinů v M-PMV na molekulární úrovni studiem jejich struktury. Doposud jsou známy struktury divokého typu a mutantu R55F, který způsobuje změnu skládání nezralých virových částic z typu D na typ C. V této práci se zaměřujeme na určení třírozměrné struktury dvojitého mutantu T41I/T78I, který neovlivňuje skládání ani transport nezralých virových částic. Tyto částice však nejsou schopny pučet skrz cytoplasmatickou membránu a místo toho se na ní akumulují. Třírozměrnou strukturu mutantu matrixového proteinu jsme určili pomocí heteronukleární NMR spektroskopie.Srovnání struktury mutantu a struktury divokého typu ukazuje, že mutace pozměnila úhly mezi jednotlivými helixy proteinu, ale celková struktura zůstala nezměněna. Narozdíl od divokého typu jsou zmutované isoleuciny 41 a 78 orientovány do jádra proteinu, kde mohou interagovat se zbytkem kyseliny myristové, připojené na N-konec. Tyto výsledky podporují hypotézu, že změna fenotypu mutantu je způsobena zesílenou interakcí zbytku kyseliny myristové s jádrem proteinu, která brání vazbě nezralé virové částice na cytoplasmatickou membránu.

III

SUMMARY

The Mason-Pfizer Monkey Virus (M-PMV) is a prototype of D type retroviruses. In type B and D retroviral immature virus particles pre-assemble in cytoplasm, whereas in type C retroviruses (HIV) Gag is targeted to the plasma membrane, where the particle formation occurs. The N-terminal domain of Gag, the matrix protein (MA), plays a critical role in determining this morphogenic difference. Several single- or multi-point mutations of MA have been described that alter various stages of the M-PMV life cycle. Our goal is to characterize the influence of M-PMV mutant proteins on the molecular level by studying their structures. The three- dimensional structures of the wild-type and R55F mutant, a mutant which changes capsid assembly from D type to C type, are known so far. In this work we focus on the determination of the three-dimensional structure of the doublemutant T41I/T78I, which doesn`t affect assembly and transport of immature virus particles. However, these particles are unable to bud through the cytoplasmatic membrane and rather accumulate on it. We have determined the three-dimensional structure of the MA mutant using heteronuclear NMR spectroscopy. Comparison of the calculated structure and the structure of the wild-type proteins shows that the mutation altered angles between protein helices, but overall structure remained unchanged. In contrast to wild-type proteins, mutated isoleucines 41 and 78 are oriented inside the protein core where they may interact with a myristic acid which is linked to the N-terminus. This finding supports a hypothesis that the phenotypic change of the mutant is caused by enhanced interaction of the myristic acid with the protein core, which prevents association of immature viral particles with the cytoplasmatic membrane.

IV

Obsah 1.

Úvod.................................................................................................................................. 1

2.

Současný stav řešené problematiky .................................................................................. 2 2.1

2.1.1

Struktura virionu ........................................................................................................ 4

2.1.2

Hlavní strukturní proteiny ........................................................................................ 5

2.1.3

Životní cyklus retrovirů ............................................................................................ 6

2.2

HIV a M-PMV .......................................................................................................... 8

2.2.1

Virus HIV ................................................................................................................... 8

2.2.2

Virus M-PMV ............................................................................................................ 9

2.3

Matrixový protein ................................................................................................... 11

2.3.1

Významné modifikace matrixového proteinu...................................................... 12

2.3.2

Funkce MA proteinu ............................................................................................... 18

2.3.3

Struktura matrixového proteinu ............................................................................. 19

2.4

3.

Retroviry ................................................................................................................... 2

Významné mutace v MA proteinu.......................................................................... 22

2.4.1

Významné mutace v HIV-1 MA............................................................................ 23

2.4.2

Významné mutace v M-PMV MA ........................................................................ 25

Experimentální část......................................................................................................... 27 3.1

Materiál ................................................................................................................... 27

3.1.1

Chemikálie ................................................................................................................ 27

3.1.2

Roztoky ..................................................................................................................... 28

3.1.3

Buněčný materiál ..................................................................................................... 32

3.1.4

Použité plasmidové expresní vektory.................................................................... 32

3.1.5

Přístroje ..................................................................................................................... 32

3.2

Metody .................................................................................................................... 33

3.2.1

Příprava kompetentních buněk .............................................................................. 33

3.2.2

Transformace kompetentních buněk ..................................................................... 34

3.2.3

Produkce rekombinantního matrixového proteinu M-PMV v E. coli .............. 34

3.2.4

Desintegrace buněk E. coli obsahujících rekombinantní protein ...................... 35

3.2.5

Metaloafintiní chromatografie ............................................................................... 35 V

4.

3.2.6

Gelová permeační chromatografie ........................................................................ 36

3.2.7

Elektroforesa v polyakrylamidovém gelu obsahujícím SDS (SDS-PAGE) .... 36

3.2.8

Koncentrování roztoků proteinu ............................................................................ 36

3.2.9

Příprava vzorků pro NMR experimenty ............................................................... 37

3.2.10

NMR spektroskopie ................................................................................................. 37

3.2.11

Výpočet struktury .................................................................................................... 38

3.2.12

Interpretace a srovnání struktur ............................................................................. 39

3.2.13

Residuální dipolární interakční konstanty ............................................................ 39

Výsledky ......................................................................................................................... 40 4.1

Příprava rekombinantního proteinu ........................................................................ 40

4.2

Přiřazení chemických posunů atomů proteinu........................................................ 41

4.2.1 4.3

Výpočet struktury.................................................................................................... 45

4.3.1

Odhad sekundární struktury pomocí výpočtu indexu chemických posunů (CSI) ...... 45

4.3.2

Výpočet struktury .................................................................................................... 47

4.3.3

Zhodnocení kvality vypočtených struktur ............................................................ 51

4.4 5.

Porovnání chemických posunů atomů HN a N mutantu a divokého typu ....... 43

Porovnání struktur mutantu T41I/T78I a divokého typu MA proteinu .................. 56

Diskuze ........................................................................................................................... 59 5.1

Příprava rekombinantního proteinu ........................................................................ 59

5.2

Výpočet a zhodnocení struktury T41I/T78I mutantu.............................................. 60

5.3

Odhad pozice zbytku kyseliny myristové ............................................................... 61

6.

Závěr ............................................................................................................................... 63

7.

Literatura......................................................................................................................... 65

8.

Seznam použitých symbolů a zkratek............................................................................. 75

9.

Přílohy............................................................................................................................. 78

VI

1.

Úvod

HIV je dnes, vzhledem k pandemii AIDS podrobován intenzivnímu zkoumání. MasonPfizerův opičí virus je modelovým organismem nejen pro HIV, ale obecně pro výzkum retrovirů. Oproti HIV má výhodu, že je nepřenosný na člověka. V celém životním cyklu retrovirů hraje významnou roli matrixový protein. V matrixovém proteinu Mason-Pfizerova opičího viru bylo identifikováno několik bodových mutací, které ovlivňují různé fáze životního cyklu viru. Studium těchto mutantů metodami molekulární biologie nám umožňuje popsat účinek těchto mutací na molekulární úrovni. Doposud byla určena třírozměrná struktura divokého typu matrixového proteinu MasonPfizerova opičího viru a také struktura mutantu R55F, který způsobuje změnu morfogenického typu z D na C. V této práci se zabýváme určením struktury dvojitého mutantu T41I/T78I matrixového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru. Tato mutace brání viru pučet skrz cytoplasmatickou membránu ven z buňky. Použitím nukleární magnetické resonance se mi podařilo určit strukturu zmutovaného proteinu, kterou jsem porovnal se známou strukturou divokého typu matrixového proteinu.

1

2.

Současný stav řešené problematiky

2.1 Retroviry Retroviry tvoří skupinu virů s diploidním RNA genomem tvořeným dvěma identickými kopiemi RNA. Hlavním znakem retrovirů je, že během replikace jejich genomu je RNA přepsána do DNA pomocí virem kódované RNA dependentní DNA polymerasy (reversní transkriptasa, RT) a tato DNA je poté inkorporována do genomu hostitelské buňky pomocí dalšího virového enzymu, integrasy. Dalším charakteristickým znakem retrovirů je jejich maturace mimo hostitelskou buňku. Retroviry patří do čeledi Retroviridae. Do této čeledi patří DNA a RNA viry s reversní transkriptasou. Další členění je odvozeno od struktury genomu, morfogenese virionu a způsobu tvorby kapsidy. Z hlediska struktury genomu se retroviry dělí na jednoduché a komplexní. Genom komplexních retrovirů oproti jednoduchým obsahuje geny pro různé regulační proteiny, vznikající po alternativním sestřihu m-RNA, které ovlivňují průběh infekce. Z hlediska tvorby retrovirových kapsid jsou známy dvě základní skupiny retrovirů (Obr. 1). Do první spadají retroviry typů A, B a D a vyznačuje se tím, že se nezralá virová částice skládá uvnitř buňky. Nezralé částice typů B, D a intracytoplasmatického podtypu typu A se skládají

z bílkovinných

prekursorů

v cytoplasmě,

a

poté

jsou

transportovány

k cytoplasmatické membráně. Retroviry intracysternálního podtypu typu A skládají částice podobným mechanimem jako typ C s tím rozdílem, že virus pučí do endoplasmatického retikula. Mezi nejznámější zástupce patří MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus, typ B) a MPMV (Mason-Pfizer Monkey Virus, typ D). Druhou skupinu tvoří typ C. U tohoto typu se nezralá virová částice skládá na cytoplazmatické membráně a současně pučí ven z buňky. Do této skupiny patří několik lidských patogenů, například HIV (Human Imunodeficiency virus) a HTLV (Human T-cells Leukemia Virus)1.

2

Obr. 1. Elektronmikroskopické snímky dokumentující skládání virové částice různých retrovirů, převzato z knihy7. A) HIV-1 jako zástupce C-typu retrovirů. Skládání i pučení probíhá na membráně, poslední snímek v řadě je zralý virion B) MMTV jako zástupce D-typu retrovirů. Skládání proběhlo v cytoplasmě, poslední snímek zralý virion s typickým excentrickým core Retroviry se dnes člení do 7 rodů (Tab. I)2.

3

Tab. I Rozdělení retrovirů a typičtí zástupci Rod

Morfogenese

Avian Leukosis Virus

Alpharetrovirus C typ Betaretrovirus B/D typ

Rous Sarcoma Virus

jednoduché

Mouse Mammary Tumor Virus

retroviry

Mason-Pfizer Monkey Virus Murine Leukemia Virus

Gammaretrovisus C typ

Viper Retrovirus Bovine Leukemia Virus

Deltaretrovirus

Epsilonretrovirus

Typičtí zástupci

C typ

Human T-Lymphotic Virus 1

C typ

Walleye Dermal Sarcoma Virus

Lentivirus C typ

Human Imunodeficiency Virus 1

komplexní

Simian Imunodeficiency Virus

retroviry

Simian Foamy Virus

Spumavirus B/D typ

Feline Foamy Virus

2.1.1 Struktura virionu Struktura virové částice je v základních rysech společná všem retrovirům. Má sférický tvar o průměru 80-120 nm. Vnější obal je tvořen fosfolipidovou membránou, která pochází z hostitelské buňky. Do této membrány je zakotven transmembránový glykoprotein (TM) a na něj je nekovalentně vázán povrchový glykoprotein (SU), který je zodpovědný za vazbu na receptory hostitelské buňky. Organizace proteinů uvnitř virové membrány je odlišná u zralé a nezralé virové částice. Nezralá částice je tvořena polyproteinovými prekurzory Gag, Gag-Pro a Gag-Pro-Pol. Ty jsou ukotveny v membráně N-koncovou doménou Gag, tj. matrixovým proteinem (MA), který je kladně nabitý a na N-konci má navázán zbytek kyseliny myristové. Uvnitř nezralé částice jsou 2 molekuly genomové RNA nekovalentně vázané na molekuly Gag. Ve zralé virové částici jsou naproti tomu polyproteinové prekurzory již rozštěpeny na jednotlivé proteiny virovou proteasou3. Přímo pod membránou je vrstva tvořená MA vázaným k membráně stejným způsobem jako nerozštěpený Gag. MA se pravděpodobně vyskytuje ve formě trimeru4 a nekovalentně interaguje s TM5. Hlavní část virionu – jádro (core) je tvořeno kapsidovým proteinem (CA). Tvar jádra je jedním z kritérií klasifikace, např. u HIV je 4

kónický6, u M-PMV je válcový7. Uvnitř jádra je komplex genomové RNA se silně bazickým nukleokapsidovým proteinem (NC), dále reversní transkriptasa, integrasa (IN) a proteasa (PR). Dále se ve virionu vyskytují virové proteiny specifické pro jednotlivé retroviry, mRNA a některé buněčné proteiny (Obr. 2)8.

Obr. 2. Schéma nezralé (a) a zralé (b) virové částice. 1-povrchový glykoprotein, 2transmembránový glykoprotein, 3-dvojvrstva fosfolipidů, 4-polyproteinový prekurzor Gag, 5-prekurzor Gag-Pro-Pol, 6-genomová RNA, 7-matrixový protein, 8-core tvořené kapsidovým proteinem, 9-proteasa, 10-integrasa, 11-reversní transkriptasa. Převzato ze článku1

2.1.2 Hlavní strukturní proteiny retrovirů Polyproteinový prekurzor Gag je sám o sobě schopen vytvářet nezralé kapsidy, které pučí ven z buňky a podílí se na inkorporaci dalších virových komponent (RNA, TM). Po jeho rozštěpení vzniká několik maturních proteinů. Dosud není známa kompletní prostorová struktura Gag proteinu žádného retroviru, ale u mnoha z nich jsou známy jak struktury, tak funkce některých domén. Ve zralé virové částici jsou hlavními strukturními proteiny vznikajícími štěpením proteinu Gag, matrixový protein, kapsidový protein a nukleokapsidový protein. Matrixový protein je středem mého zájmu, a proto mu bude věnována vlastní kapitola (viz. kap. 2.3.). Kapsidový protein tvoří ve virionu hydrofobní schránku tzv. „core“, což je obal nukleoproteinového komplexu a dalších proteinů. Nukleokapsidový protein je vysoce basický protein, který tvoří součást ribonukleotidového komplexu. Ve zralém virionu je 5

pevně nekovalentně vázán na genomovou RNA. U většiny retrovirů se vyskytuje jedna nebo dvě Cys-His domény, které spolu se zinečnatými ionty tvoří tzv. domény zinkového prstu9.

2.1.3 Životní cyklus retrovirů

Obr. 3. Životní cyklus retrovirů. Převzato ze článku1

6

Životní cyklus viru (Obr. 3) lze rozdělit na dvě fáze: časnou a pozdní. Časná fáze zahrnuje procesy od vstupu viru do buňky až po integraci virové DNA do genomu hostitelské buňky. Prvním krokem je vazba povrchových glykoproteinů SU na příslušné receptory na povrchu hostitelské buňky (Obr. 3, krok 1) a následná fúze membrán (Obr.3, krok 2). Poté dojde k rozpadu core (krok 3) a vznikne komplex genomové RNA, reversní transkriptasy, integrasy, CA a MA, takzvaný preintegrační komplex (PIC) (krok 4), který je transportován do jádra10. Dalším krokem je reversní transkripce, kdy je virová RNA přepsána do lineární dvojřetězcové DNA. Původní genomová RNA je v průběhu reversní transkripce degradována RNasovou aktivitou RT11. Reversní transkripce probíhá většinou v cytoplasmě (u ALV až v jádře) v PIC. Reversní transkripce je ve srovnání s běžnou replikací značně nepřesná a je zdrojem mnoha mutací, což vede k problémům s rezistencí proti léčivům. Posledním krokem časné fáze je integrace virové DNA do genomu hostitelské buňky enzymem integrasou (krok 5). Poté virus přejde do latentní fáze a v ní zůstane, dokud není aktivován. Pozdní fáze začíná transkripcí provirové DNA buněčnou RNA polymerasou II (krok 6). Část vzniklé RNA je sestřižena (krok 7) a veškerá RNA je transportována do cytoplasmy (kroky 8 a 9). Zde je nesestřižená RNA inkorporována do vznikajících virionů nebo slouží jako templát pro syntézu polyproteinových prekursorů Gag, Pro a Pol (krok 10). Sestřižená RNA slouží jako m-RNA pro translaci genu env, případně genů pro regulační proteiny komplexních retrovirů. Gen env je translatován na drsném endoplasmatickém retikulu za vzniku proteinu Env (krok 11). Ten je poté transportován do Golgiho komplexu (kroky 13 a 15), kde probíhá jeho glykosilace a štěpení buněčnou proteasou na SU a TM, které jsou následně vystaveny na povrch buňky (krok 18). Vnitřní proteiny virové kapsidy jsou naproti tomu syntetizovány na volných ribosomech (krok 10)12. Nejčastěji vzniká jen protein Gag, ale s frekvencí 5-20 % dochází k posunu čtecího rámce a syntéze proteinu Gag-Pro nebo Gag-Pro-Pol. Tímto mechanismem je regulován poměr proteinů Gag, Pro a Pol. Další osud proteinu Gag závisí na morfogenickém typu. U virů typu C je Gag transportován k membráně, zde agreguje za vzniku nezralé virové částice a současně s tím pučí ven z buňky (krok 17). U typu B/D je Gag transportován do pericentriolární oblasti v cytoplasmě, zde se složí nezralá částice (krok 12) a ta je poté transportována k membráně, skrz kterou pučí (krok 16). Při tomto ději hraje klíčovou roli N-koncová doména proteinu Gag – matrixový protein. V případě viru M-PMV

7

bylo prokázáno, že záměna jedné aminokyseliny (R55F) v MA vede ke změně morfogenese z typu D na typ C13. Retroviry typu A s intracisternálním pučením se skládají na membráně Golgiho komplexu podobným způsobem jako typ C na cytoplasmatické membráně (krok 14). Pučením získávají retroviry svůj vnější obal – fosfolipidovou dvouvrstvu pocházející z cytoplasmatické membrány buňky. Posledním krokem životního cyklu retrovirů je proteolytické štěpení proteinu Gag a následná reorganizace produktů do podoby struktury zralého virionu. Toto štěpení probíhá záhy po opuštění hostitelské buňky a je nezbytné pro infektivitu virové částice.

2.2 HIV a M-PMV

2.2.1 Virus HIV Virus lidské imunodeficience (HIV) je horizontálně přenášený exogenní retrovirus patřící do rodu lentivirů. Poprvé byl izolován v roce 1983 ve Francii (tehdy byl nazván lymphadenopathy-associated virus - LAV). Jsou známy dva vzdálené subtypy: HIV-1 převažující ve většině oblastí světa a HIV-2, který se vyskytuje převážně v západní Africe. HIV-1 je více virulentní a snadněji přenosný než HIV-2. HIV je původcem AIDS (syndrom získaného selhání imunity). Toto onemocnění přenášené krví a sexuálním stykem způsobuje postupné selhání imunitního systému vedoucí k úmrtí na jiné infekce. Infekce HIV je dnes pandemická a podle odhadů WHO AIDS zabilo k 1.1.2006 více než 25 milionů lidí. Z tohoto důvodu je dnes HIV nejstudovanějším retrovirem. HIV napadá primárně CD4 positivní T-lymfocyty, protože povrchový glykoprotein (SU) interaguje s CD4 receptorem na T-lymfocytu. Většina kmenů HIV-1 je také schopna napadnout makrofágy pomocí vazby na CCR5 receptor. Virová infekce ničí napadené buňky třemi způsoby: přímým zničením v souvislosti s virovou infekcí, zvýšenou frekvencí apoptosy infikovaných buněk a zabitím infikovaných buněk CD8 cytotoxickým lymfocytem, který rozezná nakaženou buňku. Při velké ztrátě CD4+ T-buněk se vytrácí buněčná imunita a organismus je prakticky nechráněn proti jakékoliv infekci14. Symptomatickou léčbu ztěžuje vysoká 8

frekvence mutací během replikace viru a z toho plynoucí rychlá selekce resistentních mutantů. Virus HIV patří mezi komplexní retroviry, což znamená, že kromě genů gag, pro, pol a env obsahuje ještě geny pro další proteiny, které jsou translatovány ze sestřižených forem mRNA. Jsou to: Vif, který je nutný pro produkci infekčních částic v některých buněčných liniích, Vpr nezbytný pro replikaci viru a směrování provirové DNA do jádra, Tat,který se váže na specifickou strukturu u 5` konce RNA a zvyšuje produkci virové RNA, Nef způsobující odstranění CD4 z povrchu napadené buňky a tím bránící opětovné infekci, Rev, který se váže na specifické místo virové RNA a reguluje její sestřih a Vpu, integrální membránový protein, který způsobuje disociaci komplexů SU-TM-CD4 v endoplasmatickém retikulu1. Proteiny Tat, Nef a Vpr navíc způsobují apoptosu infikovaných buněk. Dále bylo zjištěno, že exprese samotného proteinu Nef v transgenních myších vede k podobným symptomům jako má onemocnění AIDS14.

2.2.2 Virus M-PMV Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je horizontálně přenášený exogenní retrovirus patřící do rodu betaretrovirů. Poprvé byl izolován v roce 1970 z prsního nádoru makaka červeného (macaca mulatta), přesto patří do skupiny neonkogenních retrovirů, neboť po infekci buňky nedochází k její transformaci. Infekce M-PMV u makaků způsobuje fatální imunodeficienci, dříve nazývanou SAIDS (Simian AIDS). Přesto není příbuzný s SIV (Simian Immunodeficiency Virus). Z hlediska složitosti řadíme M-PMV, na rozdíl od HIV, mezi jednoduché retroviry, neboť jeho genom neobsahuje geny regulující transkripci či translaci. Slouží jako prototyp B/D typu retrovirů, u kterých jsou tvorba nezralých částic, jejich intracelulární transport a pučení skrz cytoplasmatickou membránu časově i prostorově odděleným dějem. Díky tomu představuje M-PMV vhodný model pro studium skládání, pučení a maturace virionu. Další výhodou M-PMV jako modelového organismu je, že není přenosný na člověka. V budoucnu by se strukturní proteiny M-PMV také mohly použít jako nosiče DNA při genové terapii.

9

Proteiny M-PMV Na volných ribosomech jsou syntetizovány tři polyproteinové prekurzory Gag, Gag-Pro a Gag-Pro-Pol. Z nich se v pericentriolární oblasti hostitelské buňky skládá nezralá virová částice. Jednu částici tvoří 1500-2000 těchto molekul15. Po vypučení virionu z buňky dochází k proteolytickému štěpení prekurzorů na jednotlivé strukturní proteiny a enzymy. Protein Gag (Pr78) je štěpen na šest maturních proteinů (Obr. 4): MA (p10), fosfoprotein (PP, pp16/pp24), p12, CA (p27), NC (p14) a p416. Funkce MA, CA a NC již byly popsány (viz. kapitoly 2.3.a 2.1.2.). PP obsahuje doménu zodpovědnou za správné odpojení nově vznikajícího virionu od cytoplasmatické membrány17, p12 obsahuje doménu usnadňující skládání kapsidy18. Úloha proteinu p4 není dosud objasněna, pravděpodobně usnadňuje skládání nezralé kapsidy19. Z polyproteinu Gag-Pro kromě výše zmíněných proteinů vzniká dUTPasa (DU)20 a proteasa (PR)21. Z Gag-Pro-Pol vzniká navíc reversní transkriptasa a integrasa. Všechny tyto polyproteinové prekurzory jsou na N-konci myristoylovány22 a v oblasti PP fosforylovány16.

Obr. 4. Schéma Gag proteinu M-PMV. Převzato ze článku23. Prekurzor obalových glykoproteinů Env vzniká na drsném endoplasmatickém retikulu. Molekula je poté v Golgiho komplexu glykosylována na serinových a glutaminových zbytcích24. V průběhu transportu k membráně je štěpen buněčnou proteasou furinem na gp70 (SU) a gp22. Glykoprotein gp22 je v průběhu maturace štěpen virovou proteasou na gp20 (TM) a gp224.

10

2.3 Matrixový protein Matrixový protein tvoří N-koncovou doménu polyproteinového prekurzoru Gag. Během maturace virionu je odštěpen virovou proteasou a zůstává asociován s virovou membránou (MA pochází z Membrane Associated). MA je téměř u všech retrovirů na N-konci kotranslačně kovalentně modifikován připojením zbytku kyseliny myristové, která je zodpovědná za interakci Gag proteinu s buněčnou membránou a za interakci MA, s fosfolipidovým obalem virionu25. MA také hraje ústřední roli při transportu Gag na místo skládání kapsidy. U M-PMV bylo prokázáno, že mutace v MA způsobí změnu morfogenese z typu D na typ C13. Dále se podílí na inkorporaci komplexu SU-TM a pravděpodobně hraje roli ve směrování preintegračního komplexu do jádra infikované buňky. Doposud byla určena struktura nemyristoylovaných MA HIV-1, M-PMV, SIV, HTLV-II, BLV a RSV. Přestože sekvenční homologie mezi MA různých savčích retrovirů je nízká, jejich struktura je velmi podobná (viz. kapitola 2.3.3.). V primární struktuře MA byly nalezeny následující oblasti: M doména – série basických aminokyselin argininu a lysinu. Díky kladnému náboji jejich postranních řetězců interaguje MA s fosfolipidy a spolu se zbytkem kyseliny myristové zprostředkovávají vazbu na membránu. CTRS sekvence – signál pro cílení polyproteinu Gag do cytoplasmy (Cytoplasmatic Targeting-Retention Signal) se vyskytuje pouze u B/D typů retrovirů. Je zodpovědná za transport molekul Gag na specifické místo v cytoplasmě, kde probíhá skládání kapsidy. NLS – signál pro cílení do jádra (Nuclear Localization Signal) pravděpodobně hraje roli při cílení preintegračního komplexu do jádra infikované buňky.

11

2.3.1 Významné modifikace matrixového proteinu.

2.3.1.1 Myristoylace Myristoylace, tj. kotranslační připojení 14 uhlíkaté nasycené mastné kyseliny na Nterminální glycin je spolu s palmitoylací nejčastější modifikací proteinů mastnou kyselinou26, a to i přes to, že kyselina myristová tvoří méně než 1% mastných kyselin v buňce27. Je to důležitá modifikace mnoha eukaryotních a virových proteinů a také několika bakteriálních proteinů28. Způsobuje jejich směrování k membráně a napomáhá interakci proteinmembrána. Myristoylová kotva se také podílí na některých interakcích protein-protein, stabilizaci struktury modifikovaného proteinu a má i některé další role29. Analýzou několika eukaryotních genomů bylo zjištěno, že 0.5-0.8% proteinů může sloužit jako substrát pro Nmyristoyltransferasu (NMT). Nejčastěji se jedná o GTP-vazebné proteiny (např. některé podjednotky G-proteinů), serin/threonin kinasy, tyrosinové kinasy a Ca-vazebné proteiny s „EFhand“ motivem (např. rekoverin nebo aktivátory guanylát cyklasy)28. V eukaryotních buňkách je myristoylace katalyzována N-myristoyltransferasou (myristoylCoA:glycylpeptidN-myristoyltransferasa, E.C. 2.3.1.97) a většinou probíhá kotranslačně30, ale může proběhnout i na původně vnitřním glycinu, který se stal N-koncovým po proteolytickém štěpení. NMT rozeznává 17 aminokyselin dlouhou sekvenci začínající na N-konci sekvencí M-G-X-X-X-S/T31. Iniciační methionin je kotranslačně odstraněn pomocí methionyl aminopeptidasy (methionylpeptid methionylhydrolasa, E.C. 3.4.11.18)32 a NMT poté připojí amidickou vazbou myristoyl na N-terminální glycin.

2.3.1.1.1 Funkce myristoylace proteinů Vazba na membránu Zbytek kyseliny myristové často slouží jako hydrofobní kotva umožňující interakci s membránou. Tato vazba není tak pevná jako u delších mastných kyselin, díky tomu je však vratná a je regulována několika mechanismy (viz. kap. 2.3.1.1.2.). Protože myristoylace nestačí 12

k stabilnímu udržení proteinu na buněčné membráně, je potřeba, aby protein interagoval s membránovými fosfolipidy ještě jiným způsobem33. Tím může být buď vratná modifikace blízkého cysteinu zbytkem kyseliny palmitové nebo přítomnost shluku basických aminokyselin. U virových proteinů se jedná o druhý případ. Buď se jedná o sekvenci bazických aminokyselin blízko u sebe i v primární struktuře nebo jsou tyto aminokyseliny rozptýleny a k sobě se dostanou až po složení celého proteinu (např. u MA RSV a HTLV-I)34. Při vazbě na membránu se myristoyl zanoří přibližně deseti uhlíky do lipidové dvojvrstvy35. Bazické aminokyseliny poté interagují se záporně nabitými hlavicemi fosfolipidů na vnitřní straně buněčné membrány (hlavně fosfatidylserin a fosfatidylinositol). Ani hydrofobní, ale ani elektrostatické interakce nejsou samy o sobě dostatečně silné pro udržení proteinu na membráně. Jejich společný efekt je však pro stabilní interakci dostatečný. Někteří autoři ovšem uvádějí, že za určitých podmínek (hlavně iontová síla) je i nemyristoylovaný Gag protein schopen vazby na kyselé liposomy36. Cílení k membráně Z některých studií vyplývá, že myristoylace nejen způsobuje vazbu na membránu, ale také slouží jako signál pro směřování proteinu k membráně. Důkazem bylo přenesení Nterminální sekvence z Gag a její připojení na GFP (Green Fluorescence Protein), který se běžně nachází v cytoplasmě, což způsobilo jeho cílení na cytoplasmatickou membránu37. Na druhou stranu je známo několik myristoylovaných proteinů lokalizovaných volně v cytoplasmě28. U M-PMV je myristoylace nezbytná pro transport nezralé virové částice k cytoplasmatické membráně22. Strukturní role U mnoha proteinů je zbytek kyseliny myristové zanořen do hydrofobní kapsy proteinu, kde stabilizuje celkovou terciární strukturu38. Slouží tedy jako intramolekulární chaperon. U proteinu Nef (HIV) je prokázáno, že myristoylace je nezbytná pro oligomeraci a následnou interakci s aktinem39.

13

Autoregulace enzymatické aktivity Abelsonova kinasa (Abl) je tyrosinová proteinkinasa regulující buněčný cyklus. Její aktivita je regulována orientací myristátu na jejím N-konci. Pokud je myristoyl zanořený v hydrofobní kapse Abl, pak stabilizuje protein v neaktivní konformaci, kdy je aktivní místo blokováno a některé aminokyselinové zbytky důležité pro katalýzu jsou z něj odkloněny změněnou konformací molekuly40. Když byla připravena nemyristoylovaná forma Abl, vykazovala několikanásobně vyšší aktivitu než divoký typ41. Předpokládá se, že enzymatická aktivita Abl je regulována fosforylací tyrosinů. Fosforylace tyrosinových zbytků způsobí uvolnění zbytku kyseliny myristové z hydrofobní kapsy, což vede k rozvolnění celkové struktury a obnažení aktivního místa. Zároveň aktivní místo zaujme správnou konformaci40. Onemocnění zvané chronická myelogenní leukémie je způsobeno narušením tohoto mechanismu. Při chromosomální translokaci mezi 22. a 9. chromosomem je na místo části exonu, kódujícího N-konec Abl připojen gen pro BRC protein, což vede ke vzniku hybridního proteinu BRC-Abl. Tato mutace zabraňuje připojení zbytku kyseliny myristové a vede k velmi aktivní formě Abl, která způsobuje nekontrolované množení buněk40.

2.3.1.1.2 Regulace vazby myristoylovaných proteinů na membránu U některých proteinů je vazba na membránu regulována hydrolytickým odštěpením zbytku kyseliny myristové od proteinu42,43. Daleko častěji využívaným mechanismem je tzv. myristoylový přepínač (angl. myristoyl switch). Proteiny, které ho využívají se vyskytují ve dvou konformacích. V jedné z nich je myristoylový zbytek zanořen v hydrofobní kapse proteinu a ve druhé je vynořen ven z proteinu a může se účastnit interakce s membránou. Tento mechanismus je typický pro proteiny vratně se vážící na membránu. Myristoylový přepínač je mechanismem regulujícím přechod mezi stavem volným a vázeným. Přepínač je spouštěn několika způsoby: Prvním z nich je spuštění přepínače elektrostatickou interakcí. Příkladem proteinu s myristoylovým přepínačem řízeným elektrostatickou interakcí je Abelsonova kinasa nebo myristoylovaný substrát kinasy C (MARCKS - Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate). MARCKS je vázán na membránu synergickým působením zbytku kyseliny myristové zanořeného v membráně a bazické domény interagující se záporně nabitými fosfolipidy. Uv14

nitř této domény jsou také zbytky aminokyselin, které mohou být fosforylovány. Pokud k fosforylaci dojde, záporně nabité fosfáty značně zeslabí interakci s fosfolipidy a způsobí desorbci MARCKS od cytoplasmatické membrány44. Druhým mechanismem je spuštění přepínače vazbou ligandu. Modelovým proteinem pro tento typ myristoylového přepínače je recoverin. Jedná se o inhibitor rhodopsin kinasy, který se vyskytuje

v buňkách sítnice a váže vápenaté ionty. Ve stavu s nízkou koncentrací

Ca2+iontů je zbytek kyseliny myristové zanořen v hydrofobní kapse proteinu a recoverin je v cytoplasmě. Pokud se koncentrace Ca2+ zvýší, naváží se na recoverin dva ionty do vazebných míst typu „EF-hand“. Tato vazba vede ke změně konformace, která má za následek vynoření myristoylového zbytku z proteinu a vazbu recoverinu na membránu (Obr. 5.)45. A

B

Obr. 5. Myristoylový přepínač u recoverinu. Pokud je recoverin v prostředí s nízkou koncentrací Ca2+, zbytek kyseliny myristové (šedivý) je zanořen do hydrofobní kapsy v proteinu (A). Při zvýšení koncentrace Ca2+ iontů se dva z nich se naváží na recoverin, což vede ke změně konformace a uvolnění myristoylového zbytku do rozpouštědla (B). Může tak fungovat jako kotva pro udržení proteinu u cytoplasmatické membrány. Třetím možným mechanismem je proteolytické spuštění myristoylového přepínače. Tento typ je jedním z předpokládaných mechanismů u molekul proteinu Gag. Gag, tedy i MA, jsou vázány k membráně kombinací myristoylu a domény bazických aminokyselin. Gag je ovšem vázán k membráně silněji než MA vznikající jeho štěpením, přestože v oblasti MA nedojde ke změně primární struktury46. Předpokládá se, že za touto změnou stojí myristoylový přepínač. V molekule Gag je myristoyl exponován ven z molekuly a po proteolytickém štěpení Gagu na jednotlivé proteiny se opět zanoří do hydrofobní kapsy proteinu. Byl také 15

navržen mechanismus, kdy je myristoyl uvolněn z jádra molekuly Gag až po transportu k cytoplasmatické membráně, a tím brání interakci s vnitřními buněčnými membránami47. Posledním známým způsobem fungování myristoylového přepínače je jeho spuštění změnou entropie (entropic switch). U MA HIV-1 bylo zjištěno, že změna orientace myristoylu nevede k významné změně terciární struktury48. Spolu s tím bylo zjištěno, že pokud je MA v monomerní formě, tak je myristoylový zbytek skryt, zatímco pokud MA ztrimerisuje, je zbytek uvolněn. Tyto dvě formy jsou v rovnováze a spouštěčem myristoylového přepínače by mohla být oligomerace Gag proteinu během skládání nezralé virové částice nebo naopak rozpad kapsidy při vstupu do hostitelské buňky48.

2.3.1.1.3 Další funkce myristoylace matrixového proteinu Myristoylace je nezbytná pro transport proteinu Gag k cytoplasmatické membráně. U retrovirů typu C mutace bránící myristoylaci Gag zabraňuje tvorbě nezralých kapsid, neboť proteiny Gag nejsou transportovány do místa skládání a ani nejsou schopny interagovat s membránou49. U retrovirů typu B a D ke složení nezralé kapsidy dojde, neboť skládání probíhá v cytoplasmě. Tyto kapsidy jsou ovšem neschopny transportu k cytoplasmatické membráně a akumulují se v cytoplasmě22. Myristoylace je také nezbytná pro interakci Gag s cytoplasmatickou membránou a pučení viru ven z buňky. To je významné hlavně u retrovirů B/D typu, protože namísto postupného vychlipování membrány během stavby kapsidy jako u C typu musí být celá kapsida obalena lipidovou dvouvrstvou, což vyžaduje silnou interakci s membránou. U M-PMV byly připraveny mutanty se zvýšenou hydrofobicitou jádra MA proteinu, jejichž kapsidy se skládají a jsou transportovány k cytoplasmatické membráně, ale nejsou schopny skrz ni pučet a akumulují se na ní50,51. Ne zcela objasněn je vliv myristoylace na aktivaci virové proteasy. Bylo prokázáno, že mutace blokující transport a vazbu na membránu zároveň brání aktivaci proteasy49,52. U HIV-1 v některých buněčných liniích dochází k aktivaci proteasy i po odstranění myristoylačního signálu (ovšem nikoliv v přirozených hostitelských buňkách)53,54.

16

Pro časnou fázi životního cyklu je naopak nezbytné, aby vazba MA byla vratná a po vstupu virionu do buňky se z membrány uvolnil, protože MA je součástí preintegračního komplexu a je zodpovědný za cílení tohoto komplexu do jádra55. Z jediné známé struktury myristoylovaného MA (HIV-1) vyplývá, že myristoylace nemá podstatný vliv na terciární strukturu48.

2.3.1.2 Fosforylace Matrixový protein zajišťuje v průběhu životního cyklu dvě protichůdné funkce. V pozdní fázi je zodpovědný za transport polyproteinu Gag, jehož je součástí k cytoplasmatické membráně. Naproti tomu v časné fázi cyklu, bezprostředně po infekci je součástí preintegračního komplexu a zodpovídá za jeho cílení do jádra. Mnoho autorů předpokládá, že fosforylace slouží jako přepínač mezi těmito dvěma funkcemi, ale názory na to nejsou jednotné. Někteří autoři dokonce předpokládají, že fosforylace MA reguluje vazbu na membránu podobně jako v případě MARCKS56. K fosforylaci dochází na serinových a threoninových zbytcích aminokyselin proteinkinasami asociovanými s membránou. U mnoha retrovirů má MA primární strukturu zakončenu zbytkem aminokyseliny tyrosinu57. Ve zralém virionu je zhruba 1% těchto tyrosinů fosforylováno. Podle některých autorů je tato fosforylace nezbytná pro vazbu MA do preintegračního komplexu a brání jeho vazbě na buněčné membrány58. Existují ovšem autoři, kteří důležitost fosforylace Tyr131 popírají59. Poněkud jasnější je situace u serinových zbytků. V MA HIV-1 bylo nalezeno 5 serinů v pozicích 6, 9, 67, 72, 77 a 111, které mohou být fosforylovány. Serin 6 je součástí myristoylačního signálu a jeho mutace tedy brání skládání kapsid. Mutace serinů 9, 67, 72 a 77 vedly ke vzniku neinfekčních virových částic. Všechny tyto seriny jsou na povrchu proteinu v oblasti, kterou se MA dotýká membrány. Jejich fosforylace zřejmě zabraňuje jejich interakci s membránou a umožňuje tak asociaci s integrasou již ve virionu60. Není také příliš jasné, jakou roli hraje fosforylace u jiných retrovirů. RSV má signál pro cílení do jádra v integrase a mutace zabraňující fosforylaci MA nemá na infektivitu viru vliv61. Gag M-PMV je sice také fosforylován, ovšem cílem fosforylace je pp16/pp2416.

17

2.3.2 Funkce MA proteinu

2.3.2.1 Cílení molekul Gag a jejich vazba na cytoplasmatickou membránu U retrovirů typu C probíhá skládání na cytoplasmatické membráně současně s pučením. Pro transport Gag k cytoplasmatické membráně je nezbytné, aby byl Gag na svém N-konci myristoylován. Pokud bylo mutací v MA doméně Gag zabráněno myristoylaci, nedocházelo ke vzniku nezralých virových částic, protože protein Gag nebyl transportován k membráně a ani s ní neinteragoval49. U retrovirů typu B/D myristoylace nemá vliv na skládání, ale zodpovídá za transport nezralé kapsidy k cytoplasmatické membráně22. MA proteiny těchto virů obsahují sekvenci zodpovědnou za transport Gag proteinů do periplasmatického prostoru, kde probíhá skládání. Jedná se o CTRS (Cytoplasmatic Targetig/Retention Signal) sekvenci, u M-PMV je v oblasti Pro43-Gly60. Bodová mutace argininu v pozici 55 na fenylalanin nebo tryptofan způsobí změnu morfogenetického typu z D na C13. Bylo zjištěno, že prostřednictvím CTRS sekvence MA a potažmo Gag interaguje s proteinem Tctex-1, který je součástí buněčného motoru dyneinu. Mutace v 55 aminokyselině vede k zanoření části CTRS sekvence do nitra proteinu a tak blokuje interakci s Tctex-123. U retrovirů typu B a D je možné sledovat sledovat skládání nezralé kapsidy a vazbu Gag k cytoplasmatické membráně odděleně, neboť jsou časově i prostorově oddělené. U M-PMV jsou známy mutanty, ve kterých záměna hydrofilní aminokyseliny za hydrofobní brání vazbě nezralé virové částice na membránu13,51.

2.3.2.2 Inkorporace Env Během pučení získává virus kromě fosfolipidové membrány také své povrchové glykoproteiny SU a TN. Interakce MA s cytoplasmatickou membránou naznačuje, že by MA mohl také interagovat s cytoplasmatickou doménou TM. Tato doména je typicky 20-40 aminokyselin dlouhá, ovšem u lentivirů dosahuje délky 150 aminokyselin. 18

Některé mutace v MA jak u HIV-1 tak u M-PMV vedou ke ztrátě schopnosti inkorporace obalových glykoproteinů12,62,63.

2.3.2.3 Cílení preintegračního komplexu Lentiviry jsou schopny, na rozdíl od onkogenních retrovirů, infikovat i pomalu proliferující nebo nedělící se buňky. V takovýchto buňkách musí být preintegrační komplex (PIC) aktivně transportován do jádra pomocí MA, který je spolu s RT a IN součástí PIC64. Nejlépe je důležitost MA pro transport PIC do jádra prozkoumána na HIV-1. V něm byly lokalizovány dvě oblasti, které slouží jako signál pro cílení do jádra65,66. U jiných retrovirů je nukleární lokalizační signál umístěn v integrase (RSV)67 nebo chybí zcela a tyto retroviry jsou schopny napadat jen dělící se buňky (M-PMV nebo MLV).

2.3.3 Struktura matrixového proteinu HIV

RSV

HTLV

SIV

MMLV

M-PMV

Obr. 6. Srovnání známých struktur retrovirových matrixových proteinů. N-konec znázorněn červeně. Do dnešní doby byla vyřešena struktura matrixových proteinů sedmi retrovirů (Obr. 6). Pomocí nukleární magnetické resonance (NMR) byly určeny struktury MA proteinů HIV-168, 19

BLV69, HTLV-II70 a M-PMV4. Struktury MA proteinů RSV71, MoMLV (Moloney Murine Leukemia Virus)72, SIV73 a HIV-174 byly určeny pomocí rentgenové krystalografie. Přestože primární struktura matrixových proteinů nevykazuje vysokou homologii sekundární a terciální struktury jednotlivých proteinů si jsou vzájemně podobné. Skládají se ze čtyř nebo pěti α-helixů propojených smyčkami nebo oblastmi extendované struktury. U MA s pěti helixy (HIV-1 a SIV) poloha prvních čtyř helixů velmi dobře odpovídá poloze helixů čtyřhelixových MA proteinů. Navíc u všech MA je většina bazických aminokyselinových zbytků na jedné straně molekuly, což umožňuje interakci s fosfolipidovou membránou75. Samozřejmě lze mezi jednotlivými MA proteiny nalézt i odlišnosti. Jak již bylo zmíněno MA protein SIV a HIV-1 má na svém C-konci další α-helix. V těchto dvou proteinech se jako v jediných nachází krátký region v konformaci β-skládaný list. N-terminální helix má v různých proteinech odlišnou pozici oproti zbytku molekuly. Na druhou stranu kromě HIV-148 nejsou známy struktury myristoylovaných MA a je možné, že myristoylace má jistý vliv na zafixování pozice 1. helixu.

2.3.3.1 Struktura HIV a M-PMV MA

Obr. 7. Struktura nemyristoylovaného matrixového proteinu HIV-1. N-konec znázorněn červeně

20

Matrixový protein HIV-1 obsahuje 132 aminokyselinových zbytků. Sekundární struktura je tvořena pěti α-helixy, smíšeným třířetězcovým β-motivem skládaného listu a krátkým úsekem 310 helixu, které jsou navzájem propojené smyčkami. Helixy I, II, III a V jsou poskládány okolo dlouhého centrálního helixu IV a vytváří tak globulární protein z jedné strany uzavřený β-listem. V oblasti β-listu se nachází oblast bazických aminokyselin orientovaných ven z proteinu, které se účastní interakce s cytoplasmatickou membránou. Struktura HIV-1 (Obr. 7) byla zkoumána jak pomocí NMR68 tak pomocí rentgenové krystalografie74. U HIV-1 byla jako u jediného retroviru určena struktura myristoylovaného MA proteinu (Obr. 8). Vliv myristoylace na celkovou strukturu není velký, nedošlo ke změně postavení hlavních strukurních prvků, významnější strukturní změny jsou patrny jen poblíž N-konce. Myristoyl není zcela zanořen do proteinu jako u rekoverinu, ale zhruba ze 40% je přístupný rozpouštědlu. Na základě struktury myristoylovaného MA byl také navržen jeden z typů myristoylového přepínače48 (viz. kap. 2.3.1.1.2).

Obr. 8. Srovnání struktur myristoylovaného (červený) a nemyristoylovaného (modrý) HIV matrixového proteinu.

21

Obr. 9. Struktura matrixového proteinu M-PMV. N-konec je znázorněn červeně, C-konec je znázorněn modře. Červeně jsou zvýrazněny threoniny 41 a 78. Matrixový protein M-PMV (Obr. 9) je o něco ktratší než HIV-1 MA. Je tvořen 100 aminokyselinami. Jeho sekundární struktura se skládá ze čtyř α-helixů propojených krátkými smyčkami uspořádaných podobně jako první čtyři helixy HIV-1 MA. V M-PMV MA se nachází dvě oblasti bazických aminokyselin. První je analogická N-terminálním bazickým doménám MA ostatních retrovirů. Druhá oblast se nachází na druhé straně proteinu a nemá obdobu u jiných MA, její funkce není známa. Struktura byla určena pomocí NMR4,23. Kromě struktury divokého typu (wt) byla určena struktura mutantu, který má arginin na posici 55 nahrazen fenylalaninem. Sruktura mutantu se od divokého typu liší změnou úhlu, který spolu svírají helixy II a III, a tím dochází k reorientaci celé C-koncové domény23. Tato mutace způsobuje změnu morfogenetického typu z D na C (viz. kapitola 2.4)13.

2.4 Významné mutace v MA proteinu Vzhledem k malé homologii v primárních strukturách matrixových proteinů jednotlivých retrovirů, není mnoho bodových mutací, které by měly stejný efekt u všech retrovirů. Příkladem mutace, která ovlivňuje všechny retroviry stejným způsobem, je poškození myristoylačního signálu například záměnou glycinu na pozici 2 za alanin (G2A). Mutace znemožní transport proteinů Gag k cytoplasmatické membráně49 (viz. kapitola 2.3.1.1). 22

2.4.1 Významné mutace v HIV-1 MA Matrixový protein viru HIV-1 byl podroben celé řadě mutačních studií. V následující tabulce jsou shrnuty výsledky nejdůležitějších z nich. Tab. III shrnutí fenotypů významných mutantů HIV-1 MA Mutace

Stabilita Gag

proteinu Schopnost

skládat Schopnost

virovou částici

virovou

uvolnit Infektivita vzniklých částici

z částic

buňky wt

+

+

+

+

L8A

+

-

-

-

S9A

+

+

+

-

L13E

+

+

-

-

W16A

+

++

+

-

K18I

+

+

-

-

R20G

+

+

-

-

L21S/K

+

++

+

-

R22A

+

+

-

-

L31E

+

+

-

-

K32L

+

+

-

-

W36A

+

++

+

-

R39E/R43E

+

I

-

-

A45I

+

+

+

-

L50A/L51A

-

-

-

-

G56E

-

-

-

-

C57D/S

+

-

-

-

I60E

+

-

-

-

23

Mutace

Stabilita

proteinu Schopnost

Gag

skládat Schopnost

virovou částici

virovou

uvolnit Infektivita vzniklých částici

z částic

buňky S67A

+

+

+

-

T70E/E74K

-

-

-

-

S72A

+

+

+

-

S77A

+

+

+

-

L85R

+

I

-

-

Y86G

+

I

-

-

C87D

+

I

-

-

V88E

+

I

-

-

H89G

+

I

-

-

(I-skládá se na vnitřních membránách)

Mutace v oblasti aminokyselin 85-89 vedou ke ztrátě infektivity a k pučení virionů do vakuol Golgiho aparátu76. Stejný efekt má také dvojitá mutace R39E/R43E77. Je známo mnoho mutací, které brání skládání nezralé virové částice. Některé způsobují nestabilitu celého Gag proteinu (L50A/L51A, G56E, T70E/E74K). Jiné pravděpodobně brání vazbě Gag na membránu (L8A, C57S, I60E)77. Velmi zajímavé jsou mutanty W16A, W36A a L21K. Ty způsobují naopak silnější vazbu Gag na membránu a tím rychlejší pučení než v případě divokého typu. Zároveň vykazují také nižší infektivitu. Tyto mutace jsou také schopny potlačit účinek některých mutací znemožňujících vazbu Gag na cytoplasmatickou membránu (například L8A)47. Společným rysem těchto mutací je, že nahrazují zbytky hydrofobních aminokyselin hydrofilnějšími. Změna fenotypu je tedy pravděpodobně způsobena snížením hyrofobicity jádra proteinu, která usnadňuje uvolnění myristoylového zbytku pro integraci s membránou. Tím by se kompenzoval vliv mutací, které naopak interakci s membránou brání a lze tím také vysvětlit snížení infektivity, neboť myristoyl se nezanoří zpět do proteinu a neuvolní MA z membrány, aby se mohl stát součástí PIC.

24

Mutace L13E, K18I, R20G, R22A, L31E a K32L znemožňují inkorporaci molekul Env do virionu, ovšem nebrání inkorporaci molekul Env z jiných retrovirů s krátkými cytoplasmatickými doménami63,77. Mutace serinů 9, 67, 72 a 77 brání jejich fosforylaci a vedou ke ztrátě infektivity60 (viz. kapitola 2.3.1.2.). Mutace narušující myristoylaci nejsou v tabulce uvedeny (viz. kapitola 2.3.1.1.)

2.4.2 Významné mutace v M-PMV MA Marixový protein M-PMV byl také podroben mnoha mutačním studiím50. Tab. IV shrnutí fenotypů mutantů M-PMV MA Mutace

Stabilita Gag

proteinu Schopnost

skládat Schopnost

virovou částici

virovou

uvolnit Infektivita vzniklých částici

z částic

buňky bez mutace

+++

+++

+++

+++

P43L

+

+

-

P72S

+

+

-

P43L/S81F

+

+

-

R55F

+++

M

+++

A18V

+++

+++

-

A79V

+++

+++

+

-

T69I

+++

+++

+++

+

T41I/T78I

+++

+++

++

+

-

(M-nezralá virová částice se skládá na membráně)

Mutace v prolinových zbytcích 43 a 72 ukazuje na jejich důležitost pro sbalování Gag proteinu, protože jejich záměna vede k snížení účinnosti skládání a snížení stability celého Gag. Mutanty A18V, A79V a T69I jsou defektní v transportu virové částice. Tyto mutace neovlivňují skládání virové částice, ovšem znemožňují nebo alespoň výrazně zpomalují její transport 25

k cytoplasmatické membráně. Tím se ve svém účinku velmi podobají mutantům zabraňujícím myristoylaci. Mutant R55F je unikátní tím, že neovlivňuje infektivitu, ale mění místo skládání nezralé virové částice. Částice se neskládá v cytoplasmě, ale na cytoplasmatické membráně podobně jako je tomu u retrovirů typu C13. Arginin 55 je součástí CTRS sekvence, která je zodpovědná za interakci s proteinem Tctex-1 což je lehký řetězec retrográdního buněčného motoru dyneinu. Mutace způsobí ukrytí části této sekvence pod povrch, čímž omezí interakci MA s Tctex-123. Dvojitý mutant T41I/T78I je defektní v interakci s cytoplasmatickou membránou. Nezralé kapsidy se skládají v periplasmatické oblasti a jsou transportovány k cytoplasmatické membráně stejně jako u wt. U membrány se ale viriony akumulují a jsou jen minimálně uvolňovány ven z buňky (Obr. 10). Pokud se ovšem provede mutace jen v threoninu 41, k zablokování pučení nedojde, ale mutace v threoninu 78 má menší účinek než mutace T41I/T78I13. Tato změna se vysvětluje tím, že hydrofobní isoleuciny se zanoří do jádra proteinu, čímž zvýší jeho hydrofobicitu a znemožní uvolnění zbytku kyseliny myristové pro interakci s membránou. Tuto hypotézu potvrzují také mutanty Y11F, Y28F a Y67Y , připravené za tímto účelem, a které se chovají stejně jako mutant T41I/T78I. Druhým možným vysvětlením změny fenotypu je, že mutace způsobí konformační změnu proteinu, která zabrání interakci s membránou51.

Obr. 10. Elektronmikroskopický snímek nezralých virových částic M-PMV, nesoucích mutaci T41I/T78I. Částice se akumulují na cytoplasmatické membráně a nepučí skrz ni. Převzato z článku50 26

3.

Experimentální část

3.1 Materiál

3.1.1 Chemikálie Bio-Rad: bis-akrylamid, molekulové standardy pro SDS PAGE Biotika Slovenská Ľupča: ampicilin Fluka: lysozym Oxoid: technický agar Penta: ethanol, glycerol Qiagen: Ni–NTA agarosa Roche: COMPLETE směs inhibitorů, DNasa I, RNasa A Sigma: akrylamid, Coomassie Briliant Blue R-250, Coomassie Briliant Blue G, deuterium oxid, dimethylsulfoxid (DMSO), dithiothreitol (DTT), dodecylsulfát sodný (SDS), glycin, imidazol, isopropyl-D-thiogalaktopyranosid (IPTG), kvasničný autolysát – Serva, SRN, N, N, N´, N´ tetramethylethylendiamin (TEMED), peroxodisíran amonný (APS), thiamin, tricin, Tris base Spectra Stable Isotopes: D-glukosa nespecificky obohacená

13

C, chlorid amonný nespeci-

ficky obohacený 15N, L-isoleucin nespecificky obohacený 13C a 15N Všechny ostatní běžné chemikálie byly od firem Sigma a Lachema Peptidový inhibitor M-PMV proteasy PYVPstAMT pocházel z ÚOCHB, AV ČR Plasmid pEMAPPHis vytvořený na základě komerčního plasmidu pET-22b pochází od Dr. Lipova, UBM, VŠCHT Praha

27

3.1.2 Roztoky LB médium (Luria-Bertani médium), 1 litr 10 g trypton 10 g NaCl 5 g kvasničný autolyzát 200 µl 5M NaOH LB agar 1 l LB médium 18 g agar technický M9 minimální médium, 1litr 1 ml 1M MgSO4 1 ml 0,1M CaCl2 1 ml 1M thiaminu 10 ml 20% glukosy (w/w) 10 ml 50% NH4Cl (w/w) 100 ml roztoku 10 x M9 soli Roztok 10 x M9 soli, 1 litr 75 g Na2HPO4.2H2O 30 g KH2PO4 5 g NaCl pH 7,4 Fosfátový lyzovací pufr: 50 mM fosfátový pufr 300 mM NaCl 10 mM imidazol pH 8 28

Roztoky pro tricin - SDS PAGE Vzorkový pufr: 100 mM Tris base 200 mM dithiothreitol 8 % SDS (w/v) 24 % glycerol (w/v) 0,02 % Coomassie Blue G-250 (w/v) pH 6,8 Anodový pufr: 200 mM Tris base pH 8,9 Katodový pufr: 100 mM Tris base 100 mM tricin 0,1 % SDS (w/v) pH neupravováno Pufr pro přípravu gelu: 3 M Tris base 0,3 % SDS (w/v) pH 8,45 Roztok akrylamidu: 29 g akrylamidu 1g bis-akrylamidu 100 ml vody

29

Roztok Coomassie Blue (barvení gelů po SDS PAGE) 0,25 g Coomassie Briliant Blue R-250 45 ml CH3OH 10 ml CH3COOH 45 ml H2O Roztok byl zfiltrován. Odbarvovací roztok 250 ml CH3OH 100 ml CH3COOH Objem byl doplněn do 1 litru destilovanou vodou. Sušící roztok 400 ml CH3OH 100 ml CH3COOH 30 ml glycerolu Objem byl doplněn destilovanou vodou do 1 litru. Roztoky pro barvení stříbrem (barvení gelů po SDS PAGE): Roztok I 5,7 ml CH3COOH 32 ml CH3OH 0,5 ml 37% HCHO Objem doplněn do 0,5 l destilovanou vodou. Roztok II 250 ml CH3OH 250 ml H2O Roztok III 1 g Na2S2O3.5H2O Objem doplněn do 0,5 l destilovanou vodou.

30

Roztok IV 1 g AgNO3 0,38 ml 37% HCHO Objem doplněn do 0,5 l destilovanou vodou. Roztok V 30 g Na2CO3 2 mg Na2S2O3.5H2O 0,25 ml 37% HCHO Objem doplněn do 0,5 l destilovanou vodou. Roztok VI 32 ml CH3OH 5,7 ml CH3COOH Objem doplněn do 0,5 l destilovanou vodou. Pufr pro M-PMV proteasu: 100 mM fosfátový pufr 900 mM NaCl pH 6,25 Pufr pro gelovou permeační chromatografii 50 mM fosfátový pufr 100 mM NaCl 0,01 % merkaptoethanol 0,05 % azid sodný pH 6,5

31

Vzorkový pufr pro NMR spektroskopii 100 mM fosfátový pufr 200 mM NaCl 5 mM dithiotreitol 10% deuterium oxid 0.05% azid sodný Complete inhibitory proteas pH 6 Polymerační směs pro 4,5% akrylamidový gel 53,2 µl zásobního roztoku akrylamidu (22% akrylamid, 0,96% bis-akrylamid) 204 µl vody 2,6 µl 10% peroxodisíranu amonného 0,26µl TEMED

3.1.3 Buněčný materiál produkce rekombinantních proteinů – E. coli BL21(DE3) - mikrobiologická sbírka Ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT v Praze, Invitrogen, USA

3.1.4 Použité plasmidové expresní vektory pEMAPPHis (T41I/T78I) Plasmid na bázi komerčního vektoru pET22b s vloženým genem pro MA s mutací T41I/T78I, částí genu pro PP tak, že výsledný protein je ve fúzi s histidinovou kotvou na Ckonci.

3.1.5 Přístroje analytické váhy - Sartorius, SRN aparatura pro elektroforetickou separaci proteinů - MiniProtean III, Bio-Rad, USA inkubační blok - Thermolyne17600, USA 32

laminární box - Clean air Woerden, Nizozemí nízkotlaký chromatograf - Biologic LP, Biorad, USA odstředivka - Beckman J2-MC, USA odstředivka - Eppendorf 5415 C, SRN odstředivka - Hettich EBA 12 R, SRN orbitální inkubátor - Gallenkamp, USA pH metr - inoLab pH Level1, WTW, SRN předvážky – AND, Japonsko sonikátor – Microson, UL, USA spektrofotometr - Unicam Helios α, UK spektrometr pro NMR - Avance DRX500, Brüker, USA třepačka gelů - KS 125, IKA Labortechnik, SRN vortex - IKA Labortechnik, SRN

3.2 Metody

3.2.1 Příprava kompetentních buněk Kompetentní buňky, tedy buňky schopné přijmout plasmidovou DNA, byly připraveny metodou dle Cohena s použitím chloridu vápenatého78. Buňky Escherichia coli kmene BL21 (DE3) byly rozetřeny ze zásobní kultury na pevné LB médium a kultivovány při 37 °C přes noc. Jedna isolovaná kolonie byla použita pro přípravu 5 ml inokula. Inokulum bylo připraveno kultivací při 37 °C v orbitálním inkubátoru při otáčkách 250 rpm přes noc. Část inokula byla převedena do 200 ml LB media a buňky byly kultivovány při teplotě 37 °C, 250 rpm do doby, kdy optická denzita (OD), měřená při vlnové délce 590 nm, dosáhla hodnoty 0,4. Po aseptickém převedení do předchlazených sterilních zkumavek byly buňky odděleny od živného média centrifugací (1500 × g, 10 min, 4 °C, nízký stupeň brždění). Všechny následující operace byly prováděny pokud možno v chladové místnosti nebo alespoň na ledu. Peleta buněk byla resuspendována v 50 ml vychlazeného sterilního 100mM roztoku CaCl2. Suspenze byla ihned centrifugována (1500 × g, 10 min, 4 °C, nízký 33

stupeň brždění) a supernatant byl opět odstraněn. Peleta byla resuspendována v 2,7 ml vychlazeného roztoku CaCl2 a inkubována na ledu 4 – 6 hodin. Poté bylo přidáno 2,3 ml sterilního vychlazeného 50% roztoku glycerolu. Suspenze byla pipetována po 100 či 150 µl do sterilních vychlazených mikrozkumavek na ledu. Takto připravené zkumavky byly poté rychle zmraženy ponořením do tekutého dusíku či ethanolu o teplotě -80 °C. Buňky byly skladovány v hlubokomrazícím boxu při teplotě - 80 °C.

3.2.2 Transformace kompetentních buněk Mikrozkumavka se zmraženou buněčnou suspenzí byla přesunuta z mrazícího boxu na led a zde ponechána rozmrznout. Poté k ní bylo přidáno potřebné množství DNA (obvykle 1,5 µl). Suspenze byla poté ponechána 30 minut na ledu. Následoval tepelný šok ponořením mikrozkumavky na 2 minuty do vodní lázně o teplotě 42°C. Poté bylo k suspenzi přidáno 800 µl LB média a byla inkubována 1h při 37°C. Takto získaná suspenze byla poté rozetřena na Petriho misky s LB agarem obsahujícím ampicilín o koncentraci 100 mg/l a inkubována přes noc při 37°C.

3.2.3 Produkce rekombinantního matrixového proteinu M-PMV v E. coli Transformované kolonie E. coli byly resuspendovány v LB médiu s ampicilínem o koncentraci 100 mg/l tak, aby optická densita měřená při 590 nm byla přibližně 0,1. Buněčná suspenze byla poté inkubována v orbitálním inkubátoru do OD590 ~ 0,5. Poté byl do média přidán induktor exprese IPTG do výsledné koncentrace 0,4 mM. Po čtyřech hodinách byly buňky odděleny od zbytku média centrifugací (11800 g, 10 minut, 4°C). Peleta byla resuspendována ve fosfátovém lysovacím pufru a poté zamražena.

34

3.2.3.1 Produkce izotopově obohaceného trixového proteinu M-PMV v E. coli

rekombinantního

ma-

Pro měření proteinu pomocí NMR spektroskopie je nutné připravit protein uniformě obohacený o izotopy

13

Ca

15

N. Tato příprava se od předešlé odlišuje pouze růstovým médiem,

ostatní podmínky zůstaly stejné. Bylo použito M9 minimální médium, ve kterém byl NH4Cl nahrazen 15NH4Cl a glukosa byla nahrazena uniformně 13C obohacenou glukosou.

3.2.4 Desintegrace buněk E. coli obsahujících rekombinantní protein Zamražená buněčná suspenze byla pomocí horké vody rozmražena a byl k ní přidán komerční inhibitor proteas. Poté bylo přidáno 30 mg lysozymu a směs byla inkubována za stálého míchání 30 minut při pokojové teplotě. Následovala sonikace 3x 1,5 min při výkonu 20W na ledu. Poté byl přidán deoxycholát do výsledné koncentrace 0,1%, směs byla poté inkubována 30 min při pokojové teplotě za stálého míchání. Poté byla přidána DNasa I do koncentrace 1 mg/ml a RNasa do koncentrace 2 mg/ml a směs byla zamíchána a inkubována při 37°C 30 min. Následovala druhá sonikace. Nerozpustné zbytky buněk byly poté odděleny centrifugací (15 000 g, 15 min, 4°C). Pro ověření účinnosti desintegrace byla peleta resuspendována ve fosfátovém lysovacím pufru a spolu se supernatantem nanesen na SDS PAGE.

3.2.5 Metaloafintiní chromatografie Matrixový protein byl produkován jako fůzní polyprotein MAPPHis, přičemž PP je Nterminální část fosfoproteinu a His je histidinová kotva. Takto bylo vytvořeno mezi MA a histidinovou kotvou štěpné místo pro M-PMV proteasu, umožňující odštěpení samotného MA od histidinové kotvy. Po desintegraci buněk byly k supernatantu přidány 4 ml suspenze Ni-NTA agarosy a směs byla inkubována za stálého míchání 1 hodinu při 4°C. Poté byla agarosa promyta 20 ml fosfátového lysovacího pufru a 20 ml pufru pro M-PMV proteasu. Agarosa byla resuspendována ve 4 ml proteasového pufru a 1 ml roztoku rekombinantní M-PMV proteasy (0,4 35

mg/ml). Štěpění probíhalo 1 hodinu při pokojové teplotě za stálého míchání. Poté byl supernatant oddělen od agarosy a agarosa byla promyta 5 ml pufru pro gelovou chromatografii. V této fázi je možné orientačně zjistit koncentraci proteinu měřením absorbance při 280 nm s využitím vypočteného extinkčního koeficientu79.

3.2.6 Gelová permeační chromatografie Pro gelovou permeační chromatografii byla použita kolona HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) s dělícím rozsahem 1-100 kDa o objemu 320 ml. Chromatografie byla provedena na přístroji BioLogic (Bio-Rad), při konstantním průtoku mobilní fáze (pufr pro gelovou chromatografii) 1,3 ml/min. Frakce byly jímány po 4 ml. Průběh chromatografie byl zaznamenáván UV detektorem v podobě elučních pásů.

3.2.7 Elektroforesa v polyakrylamidovém gelu obsahujícím SDS (SDS-PAGE) Analýza proteinů byla prováděna pomocí SDS elektroforesy v polyakrylamidovém gelu v tris-tricinovém uspořádání. Separace probíhala 40 minut při napětí 40 V a poté 50 minut při napětí 150 V. Gely byly poté nejčastěji obarveny v roztoku Comassie blue (30 minut) a poté odbarveny v odbarvovacím roztoku do dostatečného odbarvení pozadí. Pro vyšší citlivost bylo použito barvení stříbrem.

3.2.8 Koncentrování roztoků proteinu Roztoky proteinů byly koncentrovány centrifugační ultrafiltrací pomocí filtračních kyvet Centricon (Amicon, Millipore, USA) s vylučovacím limitem 3 kDa při 6 800 g, 15 °C do požadované koncentrace minimálně 1 mmol/l. Přibližná koncentrace byla stanovena měřením absorbance při 280 nm. Během koncentrování byl protein převeden do pufru pro NMR měření.

36

3.2.9 Příprava vzorků pro NMR experimenty Určení chemických posunů vodíků na aromatických kruzích aminokyselin fenylalaninů, tryptofanů a tyrosinů ztěžuje to, že mají podobné chemické posuny jako vodíky amidických skupin. Pro určení jejich chemických posunů je proto potřeba připravit vzorek v němž jsou amidické vodíky vyměněny za deuterium. Za tímto účelem byl vzorek dvakrát lyofilizován a rozpuštěn v 99,9% těžké vodě. Mezi lyofilizacemi byl protein ponechán 3 dny při 4°C. Pro přesné měření orientace isoleucinů byl připraven vzorek, v němž byly izotopově obohaceny 13C/15N pouze isoleuciny. Příprava vzorku se odlišovala pouze přídavkem 40 mg takto obohaceného isoleucinu na litr minimálního média. Pro měření residuálních dipolárních interakcí bylo nutné protein měřit v anizotropním prostředí. Tím byl stlačený 4,5% polyakrylamidový gel. Polymerační směs zpolymerovala v polymerační komůrce. Gel byl přes noc promyt v deionizované vodě a poté vysušen cca na 10% původního objemu. Poté k němu bylo přidáno 250 µl vzorku proteinu a přes noc se nechal nasáknout. Poté byl gel příčně stlačen a umístěn do NMR kyvety pro měření.

3.2.10 NMR spektroskopie NMR spektra byla snímána na spektrometru Avance DRX 500 firmy Bruker při 25°C. Pro měření 1H spektra byla použita pracovní frekvence 500,132 MHz a pro 15N spektrum 50,684 MHz. Spektra byla zpracována pomocí programu NMRPipe80 a analyzována pomocí programu Sparky81. Pro základní zhodnocení správného sbalení proteinu bylo u každého vzorku obohaceného 15N měřeno 1H-15N HSQC spektrum, protože změna struktury se v něm projeví posunem signálů ve spektru. Prvním krokem pro určení struktury proteinu je přiřazení chemických posunů jednotlivých atomů proteinu. Přiřazení chemických posunů 1H, 15N a 13C páteře proteinu bylo provedeno na základě souboru experimentů: HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH a HB(CB)HA(CA)(CO)NH82. Pro přiřazení chemických posunů atomů postranních řetězců aminokyselin byla změřena spektra H(C)CH-TOCSY a (H)CCH-COSY. Vzdálenostní omezení pro výpočet struktury byla získána z editovaného (13C a 15N) 3D NOESY spektra. Pro přiřazení chemických posunů aromatických vodíků aminokyselin Phe, Tyr 37

a Trp bylo změřeno 13C-NOESY spektrum. Typické nastavení pro sběr dat pro experimenty s trojitou resonancí bylo: 1H spektrální šířka 7000 Hz, velikost dat 1024 komplexních bodů; 15

N spektrální šířka 1500 Hz, velikost dat 92 komplexních bodů; 13C (oblast CB + CA) spek-

trální šířka 8100 Hz, velikost dat 64 komplexních bodů. V doménách

13

C a

15

N byla pro

zvětšení velikosti dat použita lineární predikce.

3.2.11 Výpočet struktury Na základě znalosti chemických posunů atomů páteře proteinu lze předpovědět oblasti s pravidelnou sekundární strukturou. Polohu α-helixů a β-skládaných listů je možné odhadnout z chemických posunů atomů Hα, Cα, Cβ a C‘ a pomocí tzv. indexu chemických posunů (Chemical shift index CSI). Výpočet CSI je založen na porovnání chemického posunu těchto atomů v proteinu s tabelovanými chemickými posuny pro strukturu náhodného klubka. Pokud má aminokyselina v proteinu vyšší chemický posun, než horní mez v referenčním intervalu pak pravděpodobně leži v β-skládaném listu. Pokud má naopak chemický posun nižší, pak pravděpodobně leží v α-helixu. Výpočet byl proveden pomocí programu CSI83. Na základě znalosti přibližné pozice α-helixů byly pro výpočet struktury v těchto oblastech aplikovány omezení vodíkovými vazbami pro snazší konvergenci výpočtu. Na podobném principu je založen odhad omezení páteřních dihedrálních úhlů. Chemické posuny atomů 1Hα, 13Cα, 13Cβ a 13C‘jsou porovnány s databází chemických posunů atomů páteře proteinů se známou strukturou a z tohoto porovnání jsou vypočteny rozmezí povolených dihedrálních úhlů φ a ψ. Pro tento odhad byl použit program TALOS84. Základem pro výpočet struktury byla omezení meziprotonových vzdáleností vycházející z NOESY spekter. NOE interakce vznikají mezi dvojicemi vodíkových atomů vzdálených od sebe méně než 5,5 Ǻ, bez ohledu na jejich vzdálenost v primární struktuře. Intenzita signálu NOE je úměrná inverzní šesté mocnině vzdálenosti mezi interagujícími atomy. Z jednotlivých NOE interakcí se vytvoří síť strukturních omezení, ze kterých je možno vypočítat strukturu proteinu. Pro přiřazení jednotlivých „kross-píků“ v NOESY spektru, kalibraci strukturních omezení a výpočet předběžné struktury byl použit softwarový balík Aria (verze 2.0 alpha)85. Vzdálenostní omezení, omezení dihedrálních úhlů, vodíkové vazby a 38

residuální dipolární kaplingy byly poté použity jako vstup do programu NIH-XPLOR86. Tento program byl použit pro konečné přiřazení strukturních omezení a výpočet finálního souboru

struktur.

3.2.12 Interpretace a srovnání struktur Vizualizace vypočtených struktur a jejich vzájemné porovnání bylo prováděno pomocí programu VMD87 a programu PyMOL88. Blízkost struktur byla hodnocena výpočtem faktoru RMSD (Root Mean Square Deviation – střední kvadratická odchylka) mezi atomy páteře

∑ [xi − yi ] N

proteinu. RMSD je definována jako

2

i =1

N

kde N je počet srovnávaných atomů a xi a yi jsou pozice i-tého atomu ve struktuře x a y a udává se v Ǻngströmech. Pro výpočet úhlů, které mezi sebou svírají jednotlivé helixy byl použit program MOLMOL89. Pro analýzu získaných struktur byl použit program PROCHECK90.

3.2.13 Residuální dipolární interakční konstanty Residuální interakční konstanty (RDC z angl. residual dipolar coupling) je možné měřit v prostředí, kde jsou molekuly částečně uspořádané vůči magnetickému poli. Jejich velikost závisí na orientaci vazby vůči vnějšímu magnetickému poli a tím i vůči zbytku molekuly. Uspořádání molekul proteinu bylo docíleno umístěním vzorku do polyakrylamidového gelu, který byl poté příčně stlačen, čímž došlo k částečnému uspořádání molekul matrixového proteinu v prostoru. RDC lze použít k zpřesnění celkové struktury, obzvláště pro upřesnění vzájemné orientace nezávislých domén, mezi kterými často není dostatek signálů NOE, protože poskytují informaci o úhlových orientacích vazeb. Spektra byla měřena pomocí pulsní sekvence H-N HSQC IPAP91. Získané RDC byly analyzovány v programu Igor 6.0 a v tomto programu byly i vypočteny RDC z již vypočtených struktur.

39

4.

Výsledky

4.1 Příprava rekombinantního proteinu Pro přípravu rekombinantního proteinu byl použit postup použitý pro přípravu divokého typu a mutantu R55F MA, také vektor pro expresi proteinu je prakticky totožný. Exprese v buňkách E. coli probíhala velmi dobře, protein tvořil velkou část všech buněčných proteinů a pro přípravu vzorku postačovalo použít 0,5 l média. Z tohoto množství bylo možné připravit dva NMR vzorky. Purifikace pomocí metaloafinitní chromatografie poskytovala již dostatečně čistý protein pro NMR, ovšem z důvodu precipitace během zahušťování na koncentraci potřebnou pro měření byl zařazen ještě další purifikační krok, a to gelová permeační chromatografie. Průběh purifikace je dokumentován na gelu z PAGE (Obr. 11). kDa 200 116,3 97,4 66,2

1

2

3

4

5

6

7

45

31 21,5 14,4 6,5

Obr. 11 Průběh přípravy rekombinantního matrixového proteinu. Gel po tris-tricinové SDS PAGE, barveno koloidním stříbrem. Dráha 1 Buňky před indukcí IPTG Dráha 2 Buňky 4 h po indukci Dráha 3 Nerozpustná peleta po lýzi

40

Dráha 4 Supernatant po lýzi Dráha 5 Proteiny nezachycené na Ni-NTA agarose Dráha 6 Matrixový protein po metaloafinitní chromatografii Dráha 7 Matrixový protein po gelové permeační chromatografii Poté byly frakce obsahující MA zahuštěny do finální koncentrace alespoň 1 mmol/l. Přibližná koncentrace MA byla určována měřením absorbance při 280 nm v nezahuštěných frakcích po gelové chromatografii. Během zahušťování občas docházelo k částečné precipitaci proteinu, ovšem v porovnání s divokým typem i mutantem R55F MA byl mutant T41I/T78I stabilnější a precipitoval méně. Z 0,5 l média bylo průměrně získáno 22 mg purifikovaného rekombinantního proteinu. Správná konformace proteinu a jeho dostatečná koncentrace byla u každého

15

N-značeného proteinu ověřována změřením 1H-15N HSQC spektra a porovnáním

chemických posunů jednotlivých signálů s dříve naměřenými spektry. U všech čerstvě připravených vzorků MA proteinů byly pozorovány ve spektru další signály, které však během několika dnů vymizely.

4.2 Přiřazení chemických posunů atomů proteinu Přiřazování resonancí probíhalo ve dvou fázích. V první fázi byly naměřeny experimenty pro sekvenční přiřazení chemických posunů atomů páteře proteinů, tj. N, HN, Cα, Hα, Cβ a Hβ. Ve druhé fázi byly potom naměřeny experimenty, které umožňovaly na základě znalosti chemických posunů atomů páteře přiřadit chemické posuny atomů postranních řetězců jednotlivých aminokyselin. Pro přiřazení chemických posunů atomů páteře proteinu byla použit soubor experimentů HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH a HBHA(CBCA)(CO)NH. Pro sekvenční přiřazení je nejprve nutné identifikovat počáteční aminokyselinu pomocí unikátního chemického posunu např. glycin, alanin, serin nebo threonin. Problém při tomto způsobu přiřazování představují proliny, neboť všechny tyto experimenty, jak je patrné z jejich názvu, vyžadují HN skupinu, a protože prolin HN neobsahuje, dojde k přerušení sekvenčního přiřazování a je tedy nutné identifikovat počáteční aminokyselinu v každém úseku odděle41

ném prolinem. V případě mutantu T41I/T78I byla situace usnadněna znalostí chemických posunů atomů N a HN divokého typu MA. V oblastech, kde nedochází k překryvu jednotlivých signálů, bylo možno předpokládat, že signál se stejným chemickým posunem patří stejné aminokyselině. Tímto způsobem se podařilo identifikovat cca 30% signálů amidických skupin, což významně usnadnilo přiřazení celé páteře proteinu. Celkem se podařilo přiřadit 94,7% chemických posunů HN atomů, 92,5% chemických posunů N atomů, 100% chemických posunů Cα atomů a 96,8% chemických posunů Cβ atomů. Všechny chemické posuny jsou uvedeny v příloze. Pro přiřazení chemických posunů atomů vodíku a uhlíku postranních řetězců nearomatických aminokyselin byly použity experimenty (H)CCH-COSY a H(C)CH-TOCSY. Pro využití těchto experimentů je nutné znát chemické posuny Cα a Hα nebo Cβ a Hβ atomů. Chemické posuny některých atomů postranních řetězců aminokyselin byly též určeny pomocí experimentů NOESY, kde jsou interakce mezi atomy ze stejné aminokyseliny často velmi silné. Pro výpočet struktury jsou významné hlavně chemické posuny atomů postranních řetězců hydrofobních aminokyselin, které jsou obvykle zanořeny do proteinu a poskytují informace o interakcích mezi vzdálenými částmi molekuly. Z těchto aminokyselin bylo 75% signálů vodíkových a uhlíkových atomů přiřazeno zcela a zbytek alespoň částečně. Přiřazení chemických posunů postranních řetězců aromatických aminokyselin je většinou komplikováno malou disperzí chemických posunů jak ve vodíkovém, tak i uhlíkovém spektru. Proto se využívá napojení signálů aromatických atomů na poměrně dobře oddělené a již přiřazené signály Cβ. Nevýhodou těchto experimentů je ovšem velmi nízká citlivost a tudíž nutnost pracovat se vzorky o velmi vysoké koncentraci (3-5 mM) nebo mít k dispozici výkonější NMR spektrometr vybavený kryosondou. Vzhledem k tomu, že takový přístroj nebyl k dispozici, byly chemické posuny aromatických vodíků určovány pouze z NOESY spekter. Pro rozlišení aromatických a amidických vodíků byl připraven protein, v němž byly amidické vodíky nahrazeny deuteriem. Dvě lyofilisace s následným rozpuštěním v D2O byly dostačující a pouze I86 HN nebyl zcela vyměněn (viz. Obr. 12). 13C editované NOESY spektrum, naměřené v D2O, bylo využito pouze jako referenční spektrum pro rozhodnutí, zda daný signál odpovídá amidickému nebo aromatickému vodíku z důvodů jeho nižší kvality.

42

A

B

Obr. 12 Srovnání HN-HSQC T41I/T78I mutantu MA v H2O (A) a D2O (B). Úbytek signálů je způsoben náhradou vodíku deuteriem.

4.2.1 Porovnání chemických posunů atomů HN a N mutantu a divokého typu Chemické posuny atomů HN a N jsou velmi výhodné pro sledování strukturních změn pro jejich velkou disperzi (malé překryvy signálů) a nezávislost na typu aminokyselinového zbytku. Změna chemického okolí se projeví změnou chemického posunu atomu. Protože chemický posun amidických dusíků je zhruba pětkrát vyšší než chemický posun amidických vodíků, byl pro výpočet rozdílu chemických posunů mezi T41I/T78I a divokým typem MA 2

⎛ ω 15N ⎞ ⎟⎟ + ω 1H použit vzorec: ∆ = ⎜⎜ 5 ⎝ ⎠

(

)

2

.

Na obrázku 13 je srovnání 1H–15N HSQC spekter obou proteinů a na obrázku 14 vyhodnocení rozdílů v jejich chemických posunech.

43

Obr. 13 Porovnání H-N HSQC spekter mutantu T41I/T78I (červeně) a divokého typu (zeleně) MA.

44

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0 2

12

22

32

42

52

62

72

82

92

Obr. 14 Histogram rozdílů chemických posunů amidických atomů mezi divokým typem a mutantem T41I/T78I. Pozice mutovaných aminokyselin jsou znázorněny červeně. Z histogramu rozdílů chemických posunů vyplývá, že k největším změnám chemického posunu došlo v okolí mutací a v oblastech aminokyselin 26-34, 63-79 a 83-86.

4.3 Výpočet struktury

4.3.1 Odhad sekundární struktury pomocí výpočtu indexu chemických posunů (CSI) Po přiřazení chemických posunů bylo možno pomocí výpočtu CSI odhadnout sekundární strukturu proteinu. V diagramu na obrázku 16 je vynesen tzv. „konsensuální“ index chemických posunů, vycházející z chemických posunů atomů N, HN, Hα a Hβ. Oblasti αhelixu odpovídá index -1, oblasti extendované struktury (β-skládaného listu) odpovídá index +1 a index 0 přísluší oblastem s neuspořádanou strukturou. Pro srovnání je na obrázku 15 index chemického posunu wt MA.

45

1

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-1

Obr. 16 Histogram indexu chemických posunů mutantu T41I/T78I M-PMV MA

1

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

-1

Obr. 15 Histogram indexů chemických posunů divokého typu M-PMV MA. Výpočtem indexu chemických posunů se podařilo identifikovat 4 α-helixy v oblastech aminokyselin 7-21, 28-40, 55-70 a 79-89. Oproti CSI divokého typu MA se CSI mutantu odlišuje zkrácením II., III. a IV. helixu o aminokyseliny 41, 54, 78 a 90. U mutovaného proteinu také není náznak β-skládaného listu na začátku III. helixu. Pro následující výpočet struktury byla v takto identifikovaných oblasti helixů aplikována omezení vodíkovými vazbami.

46

4.3.2 Výpočet struktury Základem výpočtů struktury byla vzdálenostní omezení získaná z experimentů

15

N- a

13

C-

editované NOESY spolu s omezeními dihedrálních úhlů φ a ψ, získaných z programu TALOS a vodíkovými vazbami, udržujícími oblasti α-helixů získanými z CSI. Pro základní přiřazení NOE interakcí a výpočet počátečního souboru struktur byl použit program Aria 2.0. V tomto programu bylo provedeno celkem 12 cyklů výpočtů, mezi kterými bylo manuálně upravováno jak přířazení NOE interakcí, tak přiřazení resonancí, eventuálně jejich korekce. Pro finální stádia výpočtu byl využit program NIH-XPLOR. V tomto programu bylo provedeno 31 cyklů výpočtů struktury a přiřazení dalších signálů NOE. Finální výpočet struktury byl proveden celkem se 1442 NOE interakcemi, poskytujícími stejný počet vzdálenostních omezení. Aby bylo možné získat detailnější informaci o eventuálních strukturních změnách v okolí obou mutací, byl připraven vzorek, ve kterém byly selektivně značeny uhlíkem isoleuciny. Toho jsme docílili přidáním uniformně

13

13

C pouze

C/15N-značeného L-isoleucinu do

minimálního média. Značení bylo dostatečně specifické a nedocházelo k biotransformaci isoleucinu na jiné aminokyseliny (Obr. 16), což vedlo k značnému zjednodušení a zpřehlednění

13

C-NOESY spektra, ve kterém byly viditelné pouze NOE interakce vycházející

z isoleucinů (Obr. 17). Tímto způsobem bylo získáno dalších 89 vzdálenostních omezení.

47

A

B

Obr. 16 Porovnání H-C HSQC spekter uniformně

13

C značeného T41I/T78I mutantu (A) a

T41I/T78I mutantu se selektivně 13C značeným pouze isoleucinem (B).

48

B

A

Obr. 17 Porovnání

13

C-NOESY spekter uniformně

13

C značeného T41I/T78I mutantu MA

(A) a T41I/T78I mutantu MA se selektivně 13C značeným pouze isoleucinem (B). Finální běh výpočtu byl proveden se všemi získanými experimentálními omezeními, tj. s 1442 vzdálenostními omezeními, 39 vodíkovými vazbami, 69 omezeními dihedrálních úhlů a 43 RDC. Celkem bylo vypočteno 100 struktur, z nichž byl vybrán soubor 18, které nejlépe odpovídaly jak z hlediska energetických parametrů, tak měly minimální problémy s experimentálními parametry (NOE interakce….). Superpozice těchto struktur je na obrázku 18. Podle předpokladů se vypočtená struktura (Obr. 19) skládá ze čtyř α-helixů v oblastech aminokyselin 5-22, 28-44, 53-70 a 79-91, které jsou navzájem propojeny smyčkami. Ve většině struktur se vyskytuje, na rozdíl od divokého typu, krátká α-helikální otáčka mezi aminokyselinami 72-74.

49

Obr. 18 Superposice 18 nejlepších struktur přes zarovnaných dobře definované oblasti. Barevně jsou zvýrazněné jednotlivé helixy (první modře, druhý azurově, třetí oranžově a čtvrtý červeně) a volná smyčka mezi II a III helixem (zeleně). Při superpozici 18 nejlepších struktur přes sebe je patrné, že oblasti α-helixů se mezi jednotlivými strukturami neliší, naopak největší variabilitu vykazují (kromě volných konců) ve smyčce mezi helixy II a III, která je součástí CTRS sekvence.

50

Obr. 19 Průměrná struktura dvojitého mutantu T41I/T78I matrixového proteinu M-PMV, Nkonec je znázorněn modře, C-konec je červený.

4.3.3 Zhodnocení kvality vypočtených struktur Struktury proteinů získané pomocí NMR lze zhodnotit podle počtu experimentálních parametrů použitých při výpočtu, počet těchto parametrů, které jsou ve struktuře porušené a podle odchylek od ideální struktury. Tyto parametry jsou shrnuty v tabulce V. Počet vzdálenostních omezení odpovídá proteinu této velikosti. Počet porušených parametrů, stejně jako odchylek od idealizované geometrie je velmi malý, podobně jako u struktur divokého typu. Dalším způsobem posouzení struktury je Ramachandranův diagram (Obr. 20). V tomto diagramu jsou vůči sobě vyneseny dihedrální úhly φ a ψ a jsou zde vyznačeny nejvýhodnější oblasti. V Ramachandranově diagramu spočteném pro jednu ze struktur je většina dvojic dihedrálních úhlů v oblasti odpovídající α-helixu a žádná dvojice není v nedovolené oblasti ani ve „velkoryse“ povolené oblasti (s výjimkou glycinů a prolinů). Statistické rozdělení dihedrálních úhlů v jednotlivých strukturách je v tabulce V. 51

Tab V. Statistické údaje získané z programů X-PLOR NIH a Procheck charakterizující 18 nejlepších vypočtených struktur Omezení vzdáleností a dihedrálních úhlů Vzdálenostní omezení Celkový počet NOE

1442

Intra-residuální

596

Inter-residuální, z toho: sekvenční (|i-j| = 1)

494

na střední vzdálenost (|i-j| ≤ 5)

275

na dlouhou vzdálenost (|i-j| > 5)

77

Počet omezení dihedrálních úhlů Φ

69

Ψ

69

Statistika struktury Počet porušených parametrů

průměr

sm. odchylka

Vzdálenostní omezení

4,6

2,8

RDC

8,5

5,6

Délka vazby (Ǻ)

0,0019

0,00096

Vazebné úhly (°)

0,41

0,04

Dihedrální úhly (°)

1,02

0,27

Odchylka od planarity

0,426

0,077

Nejvýhodnější oblast (%)

90,4

2,1

Dodatečná povolená oblast (%)

7,1

2,2

“Velkoryse” povolená oblast (%)

1,8

1,3

Nepovolená oblast (%)

0,68

0,68

Odchylky od idealizované geometrie

Statistiky z Ramachandranova diagramu

Průměrná RMSD (Å)* Přes všechny těžké atomy

0.7312

Přes těžké atomy páteře

1,3606

* RMSD byly vypočteny jako průměr odchylek pozic příslušných atomů všech 18 struktur a průměrné struktury pro dobře definované oblasti (aminokyseliny 7-41 a 53-91).

52

Obr. 20 Ramachandranův diagram pro jednu z vypočtených struktur.

53

4.3.3.1 Validace struktury pomocí residuálních dipolárních interakčních konstant Residuální dipolární interakční konstanty (RDC) podávají informaci o orientaci vektoru vazby vůči směru externího magnetického pole a poskytují tak prostorovou informaci zcela nezávislou na NOE interakcích. Tento experimentální parametr není pozorovatelný v kapalné fázi za běžných podmínek, neboť v isotropním prostředí je jeho střední hodnota rovna nule díky rychlým fluktuacím molekul. Je proto nutné provádět měření v anisotropním prostředí tak, aby došlo k částečné orientaci molekuly vzhledem ke směru externího magnetického pole. Na rozdíl od NOE nejsou závislé na svém okolí a mohou být proto využity především pro určení úhlů, které mezi sebou svírají jednotlivé domény proteinu (např. i helixy), ale lze je také použít ke zpřesnění výpočtu struktur jako další experimentální omezení nebo jako prostředek k ověření správnosti vypočtené struktury. Nejčastěji jsou měřeny 1H-15N RDC na 15

N obohaceném vzorku.

V případě MA proteinů bylo možné naměřit RDC pouze v polyakrylamidovém gelu, nejprve o koncentraci 5,5% polyakrylamidu. Tato koncentrace se však ukázala jako příliš vysoká, neboť došlo ke zrychlení spin-spinové relaxace, což v konečném důsledku vedlo k rozšíření signálů a ztrátě rozlišení jednotlivých resonancí. Takto se podařilo odečíst pouze 25 interakcí. Proto byl připraven nový vzorek, který byl umístěn do 4,5% ního polyakrylamidového gelu. Zde již byly signály užší a intenzivnější a podařilo se odečíst 43 hodnot. Získané RDC byly použity pro výpočet struktury, ale jejich použití strukturu nezměnilo, což svědčí o jejich velmi dobré shodě s již vypočtenými strukturami.

54

Obr. 21 Srovnání změřených (červeně) a vypočtených (modře) reziduálních kaplingů v závislosti na poloze aminokyseliny v sekvenci. Vypočtené reziduální kaplingy byly získány pomocí programu Igor Pro 6.0 ze souboru struktur vypočtených bez dipolárních kaplingů Ověření správnosti struktury T41I/T78I mutantu bylo provedeno porovnáním

experi-

mentálně získaných RDC a RDC vypočtených na základě určené struktury. Jak je vidět z obrázku 21, teoreticky vypočtené RDC se až na výjimky velmi dobře shodují s experimentálními hodnotami pro rigidní oblasti. Z grafu byla odstraněna oblast aminokyselin 42-56, protože je flexibilní a tudíž experimentální RDC neodpovídají vypočteným hodnotám. Graf obsahuje více experimentálních hodnot, než bylo ve skutečnosti naměřeno, shoda experimentálních dat se strukturami je natolik dobrá, že chybějící RDC pro rigidní oblasti bylo možné bez problémů dopočítat. Na obrázku 22 je též vidět perfektní shoda experimentálních a vypočtených RDC.

55

Obr. 22 Srovnání změřených reziduálních kaplingů a vypočtených z jedné struktury.

4.4 Porovnání struktur mutantu T41I/T78I a divokého typu MA proteinu Stejně jako struktura divokého typu i struktura mutantu je tvořena čtyřmi α-helixy propojenými smyčkami. Mutace nezpůsobila významnou změnu celkové struktury (Obr. 23), avšak způsobila změnu úhlu, který svírá IV. helix s II. a v menší míře i III. helix s II Odlišný úhel také svírá I. helix se zbytkem molekuly (Tab. VI).

56

T41I/T78I

Divoký typ

Obr. 23 Srovnání struktury mutantu T41I/T78I (zelený) a divokého typu (azurový) matrixového proteinu M-PMV ve stejné orientaci jako na obr 18. Tab. VI Interhelikální úhly v divokém typu a T41I/T78I mutantu MA divoký typ

směr. odch.

T41I/T78I

směr. odch.

I. – II. helix

123,1

2,5

104.2

4,7

II. – III. helix

103,1

2,9

98,7

2,4

III. – IV. helix

169,0

2,2

167,0

3,4

Poměrně významné změny nastaly v místech mutací. Isoleuciny 41 a 78 jsou na rozdíl od threoninů 41 a 78 u divokého typu orientované dovnitř molekuly (Obr. 24). Postranní řetězec isoleucinu 41 směřuje do hydrofobní kapsy tvořené aminokyselinami F37, V38, F45, V59 a F63 a zvyšuje tak její hydrofobicitu. Také došlo k prodloužení II. helixu o jednu otáčku až k 44. aminokyselině (oproti divokému typu, u kterého II. helix končí 41. aminokyselinou). Isoleucin 78 je orientován směrem ke druhému helixu, konkrétně k aminokyselině F34 a jejímu okolí. Výchylka 78. aminokyseliny je větší než u 41 a I78 není součástí IV. helixu jako v případě T78 ve struktuře wt MA. 57

I41 A - T41I/T78I

I78

T41 B -divoký typ

T78

Obr. 24 Porovnání pozice mutovaných aminokyselin mezi mutantem T41I/T78I (A) a divokým typem (B) MA. Aminokyselina 41 je znázorněna zeleně, aminokyselina 78 je znázorněna oranžově. Na tomto obrázku je také dobře patrné prodloužení II. helixu o jednu otáčku. 58

5.

Diskuze

5.1 Příprava rekombinantního proteinu Příprava matrixového proteinu pro měření NMR spekter byla optimalizována pro přípravu divokého typu MA23. V případě mutantu T41I/T78I nebylo nutné protokol upravovat, naopak protein byl i přes to, že mutací byly do molekuly zavedeny dvě hydrofobní aminokyseliny, lépe rozpustný a NMR vzorek bylo možné zahustit na vyšší koncentraci než v případě divokého typu. Vysvětlením může být, že isoleucin 41 přispívá ke stabilizaci hydrofobního jádra proteinu , do kterého je zanořen (Obr. 25), a brání tak ostatním hydrofobním aminokyselinám v orientaci jejich postranních řetězců na povrch proteinu.

Obr. 25 Hydrofobní kapsa, do které je zanořen isoleucin 41 tvořená aminokyselinami F37, V38, F45, V59 a F63.

59

Co způsobuje vznik dalších signálů bezprostředně po přípravě, není zatím objasněno. Předpokládáme, že tyto signály mohou být způsobeny molekulami proteinu, u kterého neproběhla plně renaturace, a která byla dokončena během stání proteinu při laboratorní teplotě po několika dnech.

5.2 Výpočet a zhodnocení struktury T41I/T78I mutantu Z porovnání chemických posunů divokého typu MA a mutantního MA vyplývá, že oblasti největších změn jsou lokalizované okolo mutací, neboť zde došlo k výměně aminokyseliny a chemické posuny atomů sousedních aminokyselin jsou ovlivněny jinými atomy. K velkým změnám chemického posunu došlo na konci druhého helixu (aminokyseliny 39-45), kde se nachází jedna z mutací a také zde došlo k prodloužení II. helixu o jednu otáčku, a v oblasti okolo aminokyseliny 32, k níž je orientován postranní řetězec isoleucinu 78. Další oblastí, kde došlo k větší změně chemických posunů, je spojka mezi III. a IV. helixem. V této oblasti je oproti struktuře divokého typu patrná helikální otáčka v oblasti 71.-74. aminokyseliny, která se ve struktuře divokého typu nevyskytuje. Poslední oblastí větších změn chemických posunů amidických atomů je IV. helix, který má oproti divokému typu jinou orientaci vůči druhému helixu. Mutace výrazně nezměnily pozice a orientace helixů oproti divokému typu. Došlo pouze ke změnám v délce helixů v okolí mutací (ve struktuře divokho typu jsou obě mutované aminokyseliny posledními aminokyselinami na okrajích příslušných helixů). Mutace T41I vedla k prodloužení helixu II o jednu otáčku. Pravděpodobnou příčinou je hydrofobní interakce mezi isoleucinem 41 a fenylalaninem 45, která tuto otáčku stabilizuje. Naopak isoleucin 78 není součástí helixu IV, neboť je značně vychýlen směrem k helixu II. Ze superpozice vypočtených struktur je patrné, že nejflexibilnější oblastí je kromě N a C konce smyčka mezi helixem II a III, což koresponduje se strukturami divokého typu i mutantu R55F MA. Nejrigidnější částí strukturního motivu jsou naopak oblasti všech α-helixů. RDC se podařilo naměřit až po přiřazení signálů NOE, a nebyly proto použity pro výpočet struktury. Byly však využity pro zhodnocení správnosti vypočtené struktury, neboť RDC jsou nezávislé na NOE interakcích a velmi citlivě reagují na jakoukoliv změnu orientace struk-

60

turních prvků proteinu. Z minimálních odchylek mezi změřenými a teoreticky vypočtenými RDC vyplývá, že vypočtená struktura velmi dobře odpovídá skutečnosti.

5.3 Odhad pozice zbytku kyseliny myristové Zatím se nám dosud nepodařilo připravit vzorek myristoylovaného matrixového proteinu, který by byl vhodný pro měření NMR. Z publikovaných údajů o struktuře myristoylovaného MA HIV-1 však vyplývá, že prakticky nedochází ke změně struktury MA oproti nemyristoylovanému proteinu48, a tak je možné se pokusit o návrh pozice zbytku kyseliny myristové v MA proteinech M-PMV. V programu Pymol88 byl k N-konci struktury mutantu T41I/T78I MA připojen zbytek kyseliny myristové a změnou dihedrálních úhlů ve volné smyčce na Nkonci byl orientován tak, aby jeho pozice zhruba odpovídala pozici zbytku kyseliny myristové v myristoylovaném MA HIV-1 a zároveň aby nekolidoval s postranními řetězci aminokyselin v jádře proteinu. Ve struktuře nemyristoylovaného proteinu je patrná mezera mezi helixem IIa IV, do které by mohl být orientován zbytek kyseliny myristové. Okolí této mezery je tvořeno hydrofobními aminokyselinami a končí u isoleucinu 78 (Obr. 28). Za předpokladu, že M-PMV MA myristoylací významně nezmění celkovou strukturu proteinu stejně jako u HIV MA, je toto jediná orientace myristoylu, kdy je možné jej zanořit do jádra proteinu. Toto řešení podporuje pracovní hypotézu o zvýšené hydrofobicitě jádra proteinu a znemožnění uvolnění zbytku kyseliny myristové pro interakci s plasmatickou membránou51. Isoleucin 78 je blízko konce zbytku kyseliny myristové. U divokého typu se v této oblasti nacházejí spíše hydrofilní aminokyseliny, zatímco v mutantu je zde vysoce hydrofobní isoleucin, který může zesilovat hydrofobní interakci kyseliny myristové s jádrem proteinu. Isoleucin 41 je na opačném konci molekuly než je předpokládaná pozice zbytku kyseliny myristové (Obr. 26 A), což je v souladu s tím, že mutace T41I sama o sobě nezabrání viru v pučení. Skutečnost, že mutace T41I/T78I má silnější efekt než jen mutace T78I, je pravděpodobně způsobena tím, že isoleucin 41 stabilizuje celkovou strukturu proteinu a tím udržuje hydrofobní oblast, do které je myristoyl zakotven, pohromadě.

61

A

B

Obr. 26 Struktura mutantu T41I/T78I M-PMV MA s připojeným myristoylem se znázorněným povrchem proteinu. Povrch je barven podle typu aminokyseliny (hydrofobní šedé, bazické modré, kyselé červené, hydrofilní zelené) Myristoyl je obarven žlutě, isoleucin fialově. 62

6.

Závěr •

Podařilo se připravit vzorek uniformě

13

C a

15

N-značeného mutantu T41I/T78I M-

PMV MA v dostatečné koncentraci pro měření NMR exprimentů. •

Pomocí experimentů s trojnásobnou resonancí byly přiřazeny chemické posuny atomů páteře proteinu a poté i atomů postranních řetězců.

•

Pro přiřazení chemických posunů aromatických vodíků byl připraven vzorek v němž byly amidické vodíky nahrazeny deuteriem.

•

Z porovnání chemických posunů amidických atomů mutantu a divokého typu vyplynulo, že největší změny jsou v okolí mutací a také v oblastech, kde došlo k lokálním změnám struktury.

•

Z chemických posunů byl vypočten index chemických posunů CSI, pomocí něhož byly odhanuty pozice helixů. Porovnáním se strukturou divokého typu bylo zjištěno, že jsou shodné.

•

Pro určení struktury proteinu byla změřena

15

N a

13

C editovaná NOESY spektra a

získaná vzdálenostní omezení byla využita pro výpočet struktury. •

Pro přesné určení signálů NOE ze zmutovaných aminokyselin byl připraven protein, ve kterém byly selektivně 13C značeny pouze isoleuciny.

•

Byl vypočten soubor 100 struktur, ze kterých bylo vybráno 18, které nejlépe splňovaly experimentální omezení.

•

Validací struktur bylo zjištěno, že mají jen velmi malé odchylky od ideální geometrie a malý rozptyl mezi sebou.

•

Správnost vypočtených struktur byla dále ověřena změřením zbytkových bipolárních interakčních konstant RDC, které byly porovnány s vypočtenými. Z tohoto srovnání vyplývá, že vypočtená struktura je správná.

•

Mutace nezpůsobila významnou změnu celkové struktury oproti divokému typu. MA Došlo pouze ke změně úhlů, které mezi sebou svírají jednotlivé helixy. Zmutované isoleuciny jsou orientovány směrem do jádra proteinu. Helix II je oproti divokému

63

typu prodloužený o jednu otáčku. Ve smyčce mezi helixem III a IV je jedna helikální otáčka, která nebyla zjištěna ve struktuře divokého typu. •

Orientace postranních řetězců isoleucinů 41 a 78 podporuje hypotézu, že změna fenotypu mutantu je způsobena zvýšenou hydrofobicitou jádra proteinu. Odhad možné pozice zbytku kyseliny myristové bylo potvrzeno, že s myristoylem by mohl přímo interagovat pouze isoleucin 78. Isoleucin 41 je od místa, kde se pravděpodobně myristoyl nachází poměrně vzdálen, což souhlasí s předchozím pozorováním, že mutant T41I sám o sobě změnu fenotypu nezpůsobuje.

64

7.

Literatura 1. Strnad P, Haubová Š. & Ruml,T. Genom retrovirů a fyziologická funkce jeho produktů Chem. Listy 97, (2003). 2. Fauquet,C.M., Mayo,M.A., Maniloff,J., Desselberger,U. & Ball,L.A. Virus Taxonomy, VIIIth Report of the ICTV. 1258. 2004. Elsevier/Academic Press.

3. Vogt,V.M. Proteolytic processing and particle maturation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 214, 95-131 (1996). 4. Conte,M.R., Klikova,M., Hunter,E., Ruml,T. & Matthews,S. The three-dimensional solution structure of the matrix protein from the type D retrovirus, the Mason-Pfizer monkey virus, and implications for the morphology of retroviral assembly. EMBO J. 16, 5819-5826 (1997). 5. Song,C., Dubay,S.R. & Hunter,E. A tyrosine motif in the cytoplasmic domain of mason-pfizer monkey virus is essential for the incorporation of glycoprotein into virions. J. Virol. 77, 5192-5200 (2003). 6. Briggs,J.A., Wilk,T., Welker,R., Krausslich,H.G. & Fuller,S.D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003). 7. Coffin,J., Hughes,S. & Varmus,H. Retroviruses. 1997. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

8. Ott,D.E. Potential roles of cellular proteins in HIV-1. Rev. Med. Virol. 12, 359-374 (2002). 9. Summers,M.F. et al. Nucleocapsid zinc fingers detected in retroviruses: EXAFS studies of intact viruses and the solution-state structure of the nucleocapsid protein from HIV-1. Protein Sci. 1, 563-574 (1992). 65

10. Enquist L.W., Krug R.M., Racaniello V.R., Skalka A.M. & Flint S.J. Principles of Virology. 1-1-2001. The American Society for Microbiology.

11. Gotte,M., Li,X. & Wainberg,M.A. HIV-1 Reverse Transcription: A Brief Overview Focused on Structure-Function Relationships among Molecules Involved in Initiation of the Reaction. Archives of Biochemistry and Biophysics 365, 199-210 (1999). 12. Rhee,S.S. & Hunter,E. Structural role of the matrix protein of type D retroviruses in gag polyprotein stability and capsid assembly. J. Virol. 64, 4383-4389 (1990). 13. Rhee,S.S. & Hunter,E. A single amino acid substitution within the matrix protein of a type D retrovirus converts its morphogenesis to that of a type C retrovirus. Cell 63, 77-86 (1990). 14. Green,W.C. & Peterlin,M.B. Molecular Insights Into HIV Biology. HIV InSite . 2005.

15. Parker,S.D., Wall,J.S. & Hunter,E. Analysis of Mason-Pfizer monkey virus Gag particles by scanning transmission electron microscopy. J. Virol. 75, 9543-9548 (2001). 16. Bradac,J. & Hunter,E. Polypeptides of Mason-Pfizer monkey virus. I. Synthesis and processing of the gag-gene products. Virology 138, 260-275 (1984). 17. Yasuda,J. & Hunter,E. A proline-rich motif (PPPY) in the Gag polyprotein of MasonPfizer monkey virus plays a maturation-independent role in virion release. J. Virol. 72, 4095-4103 (1998). 18. Sommerfelt,M.A., Rhee,S.S. & Hunter,E. Importance of p12 protein in Mason-Pfizer monkey virus assembly and infectivity. J. Virol. 66, 7005-7011 (1992). 19. Hong,S. et al. Type D retrovirus Gag polyprotein interacts with the cytosolic chaperonin TRiC. J. Virol. 75, 2526-2534 (2001).

66

20. Barabas,O. et al. dUTPase and nucleocapsid polypeptides of the Mason-Pfizer monkey virus form a fusion protein in the virion with homotrimeric organization and low catalytic efficiency. J. Biol. Chem. 278, 38803-38812 (2003). 21. Zabransky,A. et al. Three active forms of aspartic proteinase from Mason-Pfizer monkey virus. Virology 245, 250-256 (1998). 22. Rhee,S.S. & Hunter,E. Myristylation is required for intracellular transport but not for assembly of D-type retrovirus capsids. J. Virol. 61, 1045-1053 (1987). 23. Lipov,J. Disertační práce. 2006.

24. Bradac,J. & Hunter,E. Polypeptides of Mason-Pfizer monkey virus. II. Synthesis and processing of the env gene products. Virology 150, 491-502 (1986). 25. Krausslich,H.G. & Welker,R. Intracellular transport of retroviral capsid components. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 214, 25-63 (1996). 26. Resh,M.D. Fatty acylation of proteins: new insights into membrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins. Biochim. Biophys. Acta 1451, 1-16 (1999). 27. Khandwala,A.S. & Kasper,C.B. The fatty acid composition of individual phospholipids from rat liver nuclear membrane and nuclei. J. Biol. Chem. 246, 6242-6246 (1971). 28. Maurer-Stroh,S. et al. MYRbase: analysis of genome-wide glycine myristoylation enlarges the functional spectrum of eukaryotic myristoylated proteins. Genome Biol. 5, R21 (2004). 29. Maurer-Stroh,S. & Eisenhaber,F. Myristoylation of viral and bacterial proteins. Trends Microbiol. 12, 178-185 (2004). 30. Wilcox,C., Hu,J.S. & Olson,E.N. Acylation of proteins with myristic acid occurs cotranslationally. Science 238, 1275-1278 (1987). 67

31. Maurer-Stroh,S., Eisenhaber,B. & Eisenhaber,F. N-terminal N-myristoylation of proteins: prediction of substrate proteins from amino acid sequence. J. Mol. Biol. 317, 541-557 (2002). 32. Hirel,P.H., Schmitter,M.J., Dessen,P., Fayat,G. & Blanquet,S. Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 8247-8251 (1989). 33. Peitzsch,R.M. & McLaughlin,S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry 32, 1043610443 (1993). 34. Zhou,W., Parent,L.J., Wills,J.W. & Resh,M.D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J. Virol. 68, 2556-2569 (1994). 35. Murray,D. et al. Electrostatics and the membrane association of Src: theory and experiment. Biochemistry 37, 2145-2159 (1998). 36. Ehrlich,L.S., Fong,S., Scarlata,S., Zybarth,G. & Carter,C. Partitioning of HIV-1 Gag and Gag-related proteins to membranes. Biochemistry 35, 3933-3943 (1996). 37. Zhou,W. & Resh,M.D. Differential membrane binding of the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein. J. Virol. 70, 8540-8548 (1996). 38. Zheng,J. et al. Crystal structures of the myristylated catalytic subunit of cAMPdependent protein kinase reveal open and closed conformations. Protein Sci. 2, 15591573 (1993). 39. Fackler,O.T. et al. Association of human immunodeficiency virus Nef protein with actin is myristoylation dependent and influences its subcellular localization. Eur. J. Biochem. 247, 843-851 (1997).

68

40. Nagar,B. et al. Structural Basis for the Autoinhibition of c-Abl Tyrosine Kinase. Cell 112, 859-871 (2003). 41. Hantschel,O. et al. A myristoyl/phosphotyrosine switch regulates c-Abl. Cell 112, 845-857 (2003). 42. da Silva,A.M. & Klein,C. A rapid posttranslational myristylation of a 68-kD protein in D. discoideum. J. Cell Biol. 111, 401-407 (1990). 43. Manenti,S., Sorokine,O., Van Dorsselaer,A. & Taniguchi,H. Demyristoylation of myristoylated alanine-rich C kinase substrate. Biochem. Soc. Trans. 23, 561-564 (1995). 44. McLaughlin,S. & Aderem,A. The myristoyl-electrostatic switch: a modulator of reversible protein-membrane interactions. Trends Biochem. Sci. 20, 272-276 (1995). 45. Ames,J.B. et al. Molecular mechanics of calcium-myristoyl switches. Nature 389, 198-202 (1997). 46. Spearman,P., Horton,R., Ratner,L. & Kuli-Zade,I. Membrane binding of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein in vivo supports a conformational myristyl switch mechanism. J. Virol. 71, 6582-6592 (1997). 47. Paillart,J.C. & Gottlinger,H.G. Opposing effects of human immunodeficiency virus type 1 matrix mutations support a myristyl switch model of gag membrane targeting. J. Virol. 73, 2604-2612 (1999). 48. Tang,C. et al. Entropic switch regulates myristate exposure in the HIV-1 matrix protein. PNAS 101, 517-522 (2004). 49. Bryant,M. & Ratner,L. Myristoylation-dependent replication and assembly of human immunodeficiency virus 1. PNAS 87, 523-527 (1990).

69

50. Rhee,S.S. & Hunter,E. Amino acid substitutions within the matrix protein of type D retroviruses affect assembly, transport and membrane association of a capsid. EMBO J. 10, 535-546 (1991). 51. Stansell,E., Tytler,E., Walter,M.R. & Hunter,E. An early stage of Mason-Pfizer monkey virus budding is regulated by the hydrophobicity of the Gag matrix domain core. J. Virol. 78, 5023-5031 (2004). 52. Rein,A., McClure,M.R., Rice,N.R., Luftig,R.B. & Schultz,A.M. Myristylation site in Pr65gag is essential for virus particle formation by Moloney murine leukemia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83, 7246-7250 (1986). 53. Gottlinger,H.G., Sodroski,J.G. & Haseltine,W.A. Role of capsid precursor processing and myristoylation in morphogenesis and infectivity of human immunodeficiency virus type 1. PNAS 86, 5781-5785 (1989). 54. Yuan,X., Yu,X., Lee,T.H. & Essex,M. Mutations in the N-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein block intracellular transport of the Gag precursor. J. Virol. 67, 6387-6394 (1993). 55. Dupont,S. et al. A novel nuclear export activity in HIV-1 matrix protein required for viral replication. Nature 402, 681-685 (1999). 56. Bukrinskaya,A.G. et al. Phosphorylation-dependent human immunodeficiency virus type 1 infection and nuclear targeting of viral DNA. PNAS 93, 367-371 (1996). 57. Camaur,D., Gallay,P., Swingler,S. & Trono,D. Human immunodeficiency virus matrix tyrosine phosphorylation: characterization of the kinase and its substrate requirements. J. Virol. 71, 6834-6841 (1997). 58. Gallay,P., Swingler,S., Aiken,C. & Trono,D. HIV-1 infection of nondividing cells: Cterminal tyrosine phosphorylation of the viral matrix protein is a key regulator. Cell 80, 379-388 (1995).

70

59. Freed,E.O., Englund,G., Maldarelli,F. & Martin,M.A. Phosphorylation of residue 131 of HIV-1 matrix is not required for macrophage infection. Cell 88, 171-173 (1997). 60. Kaushik,R. & Ratner,L. Role of human immunodeficiency virus type 1 matrix phosphorylation in an early postentry step of virus replication. J. Virol. 78, 2319-2326 (2004). 61. Nelle,T.D., Verderame,M.F., Leis,J. & Wills,J.W. The major site of phosphorylation within the Rous sarcoma virus MA protein is not required for replication. J. Virol. 72, 1103-1107 (1998). 62. Freed,E.O. & Martin,M.A. Virion incorporation of envelope glycoproteins with long but not short cytoplasmic tails is blocked by specific, single amino acid substitutions in the human immunodeficiency virus type 1 matrix. J. Virol. 69, 1984-1989 (1995). 63. Freed,E.O. & Martin,M.A. Domains of the human immunodeficiency virus type 1 matrix and gp41 cytoplasmic tail required for envelope incorporation into virions. J. Virol. 70, 341-351 (1996). 64. Bukrinsky,M.I. et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. PNAS 89, 6580-6584 (1992). 65. Bukrinsky,M.I. et al. A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells. Nature 365, 666-669 (1993). 66. Haffar,O.K. et al. Two nuclear localization signals in the HIV-1 matrix protein regulate nuclear import of the HIV-1 pre-integration complex. J. Mol. Biol. 299, 359-368 (2000). 67. Hatziioannou,T. & Goff,S.P. Infection of nondividing cells by Rous sarcoma virus. J. Virol. 75, 9526-9531 (2001). 68. Massiah,M.A. et al. Three-dimensional structure of the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein. J. Mol. Biol. 244, 198-223 (1994).

71

69. Matthews,S., Mikhailov,M., Burny,A. & Roy,P. The solution structure of the bovine leukaemia virus matrix protein and similarity with lentiviral matrix proteins. EMBO J. 15, 3267-3274 (1996). 70. Christensen,A.M., Massiah,M.A., Turner,B.G., Sundquist,W.I. & Summers,M.F. Three-dimensional structure of the HTLV-II matrix protein and comparative analysis of matrix proteins from the different classes of pathogenic human retroviruses. J. Mol. Biol. 264, 1117-1131 (1996). 71. McDommell,J.M. et al. Solution structure and dynamics of the bioactive retroviral M domain from Rous sarcoma virus. J. Mol. Biol. 279, 921-928 (1998). 72. Riffel,N. et al. Atomic resolution structure of Moloney murine leukemia virus matrix protein and its relationship to other retroviral matrix proteins. Structure. (Camb. ) 10, 1627-1636 (2002). 73. Rao,Z. et al. Crystal structure of SIV matrix antigen and implications for virus assembly. Nature 378, 743-747 (1995). 74. Hill,C.P., Worthylake,D., Bancroft,D.P., Christensen,A.M. & Sundquist,W.I. Crystal structures of the trimeric human immunodeficiency virus type 1 matrix protein: implications for membrane association and assembly. PNAS 93, 3099-3104 (1996). 75. Conte,M.R. & Matthews,S. Retroviral matrix proteins: a structural perspective. Virology 246, 191-198 (1998). 76. Freed,E.O., Orenstein,J.M., Buckler-White,A.J. & Martin,M.A. Single amino acid changes in the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein block virus particle production. J. Virol. 68, 5311-5320 (1994). 77. Cannon,P.M. et al. Structure-function studies of the human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, p17. J. Virol. 71, 3474-3483 (1997). 78. Sambrook,J. & Russell,R. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (2001).

72

79. Gasteiger,E. et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. Walker, J. M ed. The Proteomics Protocols Handbook , 571-607. 2005. Humana Press.

80. Delaglio,F., Grzesiek,S., Vuister,G.W. & Zhu,G. NMRPipe: a multidimensional spectra processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-293 (1995). 81. Goddard,T.D. & Kneller,D.G. Sparky 3. 2006. University of California, San Francisco. Ref Type: Computer Program 82. Sattler,M. & Schleucher,J. Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing field gradients. Prog. NMR Spectrosc. 34, 93-158 (1999). 83. Wishart,D.S. & Sykes,B.D. The 13C chemical shift index. A simple method for the identifikation of protein secondary structure using 13C chemical shift data. J. Biomol. NMR 4, 171-180 (1994). 84. Cormilescu,G., Delaglio,F. & Bax,A. Protein backbone angle restraints from searching a database for chemical shift and sequence homology. J. Biomol. NMR 13, 289302 (1999). 85. Rieping,W. et al. ARIA2: automated NOE assignment and data integration in NMR structure calculation. Bioinformatics (2006). 86. Schwieters,C.D., Kuszewski,J.J., Tjandra,N. & Clore,G.M. The Xplor-NIH NMR Molecular Structure Determination Package. J. Magn. Res. 160, 66-74 (2003). 87. Humphrey,W., Dalke,A. & Schulten,K. VMD - Visual Molecular Dynamics . J. Molec. Graphics 14, 33-38 (1996). 88. DeLano,W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. 2002.

73

89. Koradi,R., Billeter,M., Yasuda,J. & Wüthrich,K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Molec. Graphics 14, 51-55 (1996). 90. Laskowski,R.A., MacArthur,M.W., Moss,D.S. & Thornton,J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 283-291 (1993). 91. Cordier,F., Dingley,A.J. & Grzesiek,S. A doublet-separated sensitivity-enhanced HSQC for the determination of scalar and dipolar one-bound J-couplings. Journal of Biomolecular NMR 13, 175-180 (1999).

74

8.

Seznam použitých symbolů a zkratek

Abl

Abelsonova kinasa

AIDS

syndrom získaného selhání imunity, z angl. Acquired Immunodeficiency Syndrome

ASV

z angl. Avian Sarkoma Virus

BLV

obdoba HIV-1 u skotu (z angl. Bovine Leukemia Virus), lentivirus

CA

kapsidový protein

COSY

NMR experiment, z angl. COrrelation SpectroscopY

CSI

index chemických posunů, z angl. Chemical Shift Index

CTRS

oblast v matrixovém proteinu, která je zodpovědná za cílení strukturních polyproteinů k místu skládání u B/D typů retrovirů (z angl. Cytoplasmic Targeting Retention Signal)

DU

dUTPasa

Gag, Pro a Pol, Env

retrovirové polyproteiny, obsahující strukturní (Gag) proteiny, proteasu (Pro), reversní transkriptasu a integrasu (Pol) či obalové glykoproteiny (Env)

GFP

zeleně fluoreskující protein, používaný jako značka proteinů pro určení jejich lokalizace v živých buňkách (z angl. Green Fluorescent Protein)

HBV

virus lidské hepatitidy typu B

HIV

virus lidské imunodeficience, z angl. Human Immunodeficiency Virus

HSQC

NMR experiment, z angl. Heteronuclear Single Quantum Corelation

HTLV

virus lidské leukémie (z angl. Human T-cell Leukemia Virus), lentivirus

75

IN

integrasa

IPAP

způsob měření NMR experimentu, z angl. InPhase AntiPhase

IPTG

isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid

LAV

původní název viru HIV z angl. lymphadenopathy-associated virus

M doména

basická

oblast

v matrixovém

proteinu

která

interaguje

s fosfolipidy v cytoplasmatické memmbáně (z angl. Membrane domain) MA

matrixový protein

MARCKS

z angl. Myristoylated Alanine-rich C Kinase Substrate

MLV

z angl. Murine Leukemia Virus, jednoduchý onkogenní retrovirus

MMTV

virus myšího prsního karcinomu (z angl. Mouse Mammary Tumor Virus), jednoduchý onkogenní retrovirus

Mo-MLV

z angl. Moloney-Murine Leukemia Virus, jednoduchý onkogenní retrovirus

M-PMV

z angl. Mason-Pfizer Monkey Virus

NC

nukleokapsidový protein

Nef, Rev, Tat, Vif, Vpu, pomocné proteiny lentivirů Vpr NLS

oblast v MA proteinu, zodpovědná za cílení do jádra, z angl. Nuclear Localisation Signal

NMR

nukleární magnetická resonance

NMT

N-myristoyltransferasa

NOE

Nukleární Overhauserův Efekt

NOESY

Vícerozměrný NMR experiment využívající NOE, z angl. Nuclear Overhauser Efect SpectrocopY

PIC

preintegrační komplex

PP

fosfoprotein

PPT

polypurinový trakt

PR

proteasa 76

R55F

mutant matrixového proteinu, vzniklý záměnou argininu v pozici 55 za fenylalanin

RDC

residuální dipolární interakční konstanta, z angl. Residual Dipolar Coupling

RMSD

střední kvadratická odchylka, z angl. Root Mean Square Deviation

RSV

virus způsobující sarkomy u kuřat, (z angl. Rous Sarcoma Virus), jednoduchý onkogenní retrovirus

RT

reversní transkriptasa

SAIDS

obdoba AIDS u opic z angl. Simian AIDS

SDS-PAGE

polyakrylamidová elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS

SIV

obdoba HIV-1 u opic (z angl. Simian Imunodeficiency Virus), lentivirus

SU

povrchový glykoprotein (z angl. surface glycoprotein), též gp70

T41I/T78I

dvojitý mutant matrixového proteinu vzniklý záměnou threoninů 41 a 78 za isoleuciny

Tctex-1

z angl. t-complex testis expressed 1

TEMED

N,N,N’,N’-tetramethylendiamin

TM

transmembránový glykoprotein (z angl.transmembrane glycoprotein), též gp22

TOCSY

TOtal Correlated SpectroscopY

77

9.

Příloha

Tabulka chemických posunů atomů dvojitého mutantu T41I/T78I matrixového proteinu M-PMV.

78

79

80