VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie
DIPLOMOVÁ PRÁCE Gliadinové sekvence v patogenezi a diagnostice celiakie
Vypracovala:
Kateřina Topinková
Vedoucí diplomové práce:
MUDr. Kocna Petr, CSc
Konzultant:
MUDr. Vaníčková Zdislava
Studijní obor:
Obecná a aplikovaná biochemie
V Praze dne 11. května 2009
................................................... Kateřina Topinková
Tato diplomová práce byla vypracována na Ústavu biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze v období leden 2008 – duben 2009
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s vyznačením všech použitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů.
V Praze dne 11. května 2009
................................................... Kateřina Topinková
SOUHRN Celiakie, také zvaná gluten-senzitivní enteropatie, je velmi rozšířená autoimunitní nemoc iniciovaná pšeničným zásobním proteinem gliadinem a jeho geneticky příbuznými proteiny žita a ječmene. Sérologické testy jsou prvním vyžadovaným testem při podezření na celiakii. Stanovují se protilátky proti gliadinu (AGA, AGG), tkáňové transglutaminase (atTG) a endomysiu (EMA). Protilátky proti gliadinu jsou v diagnostice celiakie stanovovány i navzdory jejich nízké citlivosti a specificitě. Při stanovování se využívá komerčních ELISA setů, využívajících jako antigen purifikovaný α-gliadin. Nedávné studie poukazují na povzbudivé výsledky ELISA setů detekujících protilátky proti deaminovaným gliadinovým peptidům (DGP). Stanovují se protilátky ve třídách IgA a IgG a tyto sety by měly vykazovat vyšší specificitu a citlivost než používaný purifikovaný α-gliadin. Cílem této diplomové práce bylo zhodnotit ELISA sety dvou firem, využívající jako antigen deaminované gliadinové peptidy. Výsledky těchto dvou firem byly porovnávány s výsledky třetí firmy Dialab, využívající jako antigen purifikovaný α-gliadin. Testovací skupina byla tvořena 120 séry získaných od pacientů s provedenou enterobiopsií, 79 sér bylo pozitivních na celiakii, 35 negativních (s normální střevní sliznicí) a 6 sér bylo získáno od pacientů v remisi. Testovala se přítomnost protilátek proti gliadinu ve třídě IgA a IgG od firmy Quanta Lite Gliadin IgA II a IgG II (iDGPA/G; Inova Diagnostics) a dále gliadinové protilátky Anti-gliadin ELISA IgA a IgG (eDGPA/G; Euroimmun). Výsledné hodnoty byly porovnávány s výsledky protilátek získanými rutinně používanou firmou Dialab (dAGA/G). Všechny metody jsou založené na nepřímé ELISA metodě. Výsledky metod využívajících deaminovaných gliadinových peptidů jsou následující (v %): citlivost, specificita a přesnost iDGPA (89,9; 97,1; 92,1), iDGPG (84,8; 100; 89,5), eDGPA (72,2; 68,6; 71,1), eDGPG (73,4; 68,6; 71,9). Přesnost dosahuje vyšších hodnot, jsouli protilátky IgA a IgG posuzovány současně iDGPA nebo iDGPG (96,5 %), eDGPA nebo eDGPG (78,1 %). Rutinně používané sety firmy Dialab dosahovaly těchto hodnot (v %)t: AGA (84,8; 100; 89,5), AGG (88,6; 100; 92,1), EMA (83,5; 100; 88,6) a atTG (89,9; 100; 93). Běžně používané antigliadinové protilátky (Dialab) vykazují přesnost 95,6 %, zatímco Inova vykazuje přesnost 96,5 %. Deaminované gliadinové peptidy tedy mohou v diagnostice celiakie zvyšovat citlivost a přesnost.
SUMMARY Celiac disease, also known as gluten-sensitive enteropathy, is a prevalent autoimmune disorder that is triggered by the ingestion of wheat gluten and realated proteins of rye and barley in genetically susceptible individuals. Serological tests are the first-line investigation required to make a diagnosis of celiac disease. Serological markers used are anti-gliadin antibodies (AGA, AGG), anti-tissue transglutaminase (atTG) and anti-endomysial antibodies (EMA). Anti-gliadin antibodies are used despite of their initial usefulness, these antibodies have lost diagnostic importance due to their poor specificity and sensitivity as celiac disease markers. Antibodies to purified alpha-gliadin are evaluated by commercial ELISA kits. Recent studies report encouranging results with the use of ELISAs to detect antibodies binding synthetic deamidated gliadin-related peptides (DGPs). Both isotypes (IgA and IgG) of the peptide antibodies have been shown to be highly sensitive and specific for active celiac disease. The aim of this thesis was to evaluate two different commercial ELISA kits that are using deamidated gliadin peptides as antigen. Antibodies to purified alpha-gliadin are evaluated by routinely company Dialab. On the group of 120 serum samples obtained from patients with small bowel biopsy performed (79 florid CD, 35 with normal histology, 6 CD in remission) we tested presence of anti-gliadin antibodies in IgA and IgG classes by Quanta Lite Gliadin IgA II and IgG II (iDGPA/G; Inova Diagnostics) and Anti-gliadin ELISA IgA and IgG (eDGPA/G; Euroimmun) compared to routinely used methods (AGA/G; Dialab). All compared methods are based on ELISA principle while Inova and Euroimmun kits use DGP and Dialab kit uses purified alpha-gliadin as antigen. Every methods are based on indirect ELISA. New methods using deamidated gliadin peptides display following sensitivities, specificities and accuracies (in %): iDGPA (89,9; 97,1; 92,1), iDGPG (84,8; 100; 89,5), eDGPA (72,2; 68,6; 71,1), eDGPG (73,4; 68,6; 71,9). Accuracy increases if IgA and IgG antibodies are evaluated together - iDGPAorG (96,5 %), eDGPAorG (78,1 %). Routinely used methods constantly show sensitivities, specificities and accuracies (in %): AGA (84,8; 100; 89,5), AGG (88,6; 100; 92,1), EMA (83,5; 100; 88,6) and atTG (89,9; 100; 93). Accuracy of AGA/G combination is 94.7%. Routinely used AGA/G Dialab has accuracy 95.6 %. Inova method (iDGPA/G) reaches the best accuracy 96.5 %. Deamidated gliadin peptides could increase sensitivities and accuracies of celiac disease serology screening.
PODĚKOVÁNÍ
Ráda bych poděkovala svému vedoucímu diplomové práce, MUDr. Petru Kocnovi, CSc., z Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN za odbornou pomoc při zpracování mé práce. Dále děkuji své konzultantce MUDr. Zdislavě Vaníčkové taktéž z Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN za velmi laskavé vedení během pokusu a během psaní mé diplomové práce. Děkuji rovněž všem dalším spolupracovníkům z gastroenterologické laboratoře. V neposlední řadě bych také ráda poděkovala prof. Ing. Miloslavu Suchánkovi, CSc. za pomoc při statistickém zpracování výsledků.
OBSAH 1.
ÚVOD
1
2.
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
2
2.1
CELIAKIE
2
2.1.1
Gliadin
2
2.1.2
Celiakie
3
2.1.3
Prevalence onemocnění
4
2.2
KLINICKÉ PROJEVY CELIAKIE
4
2.2.1
Klasická forma
5
2.2.2
Tichá forma
6
2.2.3
Latentní forma
6
2.2.4
Potencionální forma
6
2.2.5
Kožní forma
6
2.3 2.3.1
DIAGNOSTIKA CELIAKIE Sérologické testy
2.3.1.1
Antigliadinové protilátky – AGA (Anti-gliadin antibody)
2.3.1.2
Protilátky ke tkáňové transglutaminase – atTG (Anti-tissue transluglutaminase)
2.3.1.3 2.3.2
Protilátky k endomysiu – EMA (Endomysial antibody) Biopsie
7 8 8 8 8 9
2.3.2.1
Enterobiopsie
9
2.3.2.2
Endoskopie
9
2.4
PATOGENEZE ONEMOCNĚNÍ
11
2.5
ALTERNATIVA BEZLEPKOVÉ DIETY
13
2.6
DEAMINOVANÉ GLIADINOVÉ PEPTIDY
13
2.7
ELISA
14
2.7.1 3. 3.1
Nekompetitivní ELISA s imobilizovaným antigenem EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST MATERIÁLOVÉ A PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ
15 16 16
3.1.1
Chemikálie
16
3.1.2
Pacientská séra
18
3.1.3 3.2 3.2.1
Přístrojové vybavení METODIKA MĚŘENÍ Metoda ELISA (Dialab)
19 19 19
3.2.1.1
Princip metody (Dialab)
19
3.2.1.2
Pracovní postup
20
3.2.1.3
Zpracování výsledků
20
3.2.2
Metoda ELISA (INOVA Diagnostics, Itc.)
21
3.2.2.1
Princip metody (Inova)
21
3.2.2.2
Pracovní postup
21
3.2.2.3
Zpracování výsledků
22
3.2.3
Metoda ELISA (EUROIMMUN)
23
3.2.3.1
Princip metody (Euroimmun)
23
3.2.3.2
Pracovní postup
23
3.2.3.3
Zpracování výsledků
24
3.2.4 4.
Statistické zpracování výsledků VÝSLEDKY
25 26
4.1
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY DIALAB
26
4.2
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY INOVA
28
4.3
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY EUROIMMUN
30
4.4
POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ VŠECH TŘÍ FIREM
32
4.4.1 4.5
Korelační grafy
33
POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ ANTIGLIADNINOVÝCH PROTILÁTEK S DALŠÍMI DIAGNOSTICKY VYŠETŘOVANÝMI PROTILÁTKAMI
36
5.
DISKUSE
40
6.
ŽÁVĚR
41
7.
LITERATURA
42
8.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
47
9.
PŘÍLOHY
48
1.
ÚVOD Sérologické stanovení protilátek třídy IgA a IgG ke gliadinu je prvním diagnostickým
testem při podezření na onemocnění celiakií. Celiakie je onemocnění charakterizované trvalou nesnášenlivostí lepku. Klinickým projevem celiakie jsou léze na střevní sliznici doprovázející částečnou nebo úplnou atrofii klků. Důsledným dodržováním bezlepkové diety dochází k ústupu těchto změn a k normalizaci střevní sliznice. Sérologicky se dále také stanovují protilátky třídy IgA ke tkáňové transglutaminase a endomysiu. Rozhodujícím stanovením v diagnostice celiakie je histologické vyšetření bioptického vzorku sliznice tenkého střeva. Stanovení protilátek třídy IgA a IgG ke gliadinu slouží také k dlouhodobému monitorování pacientů dodržujících bezlepkovou dietu. V klinických laboratořích se tyto protilátky detekují pomocí komerčních ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) setů v provedení mikrotitračních destiček. V laboratoři ÚKBLD VFN a 1. LF UK v Praze (Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky, Všeobecné fakultní nemocnice 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze) se ke stanovení těchto protilátek využívá ELISA setů firmy Dialab používajících jako antigen purifikovaný α-gliadin. Nejnovější metody doporučují detekci protilátek proti synteticky připraveným gliadinspecifickým nonapeptidům resp. deamidovaným peptidům gliadinu. Tato skutečnost vedla k nápadu vyzkoušet, jaké výsledky by tyto peptidy vykazovaly v porovnání s rutinně používanými sety firmy Dialab. Deaminované peptidy jako antigen vázaný v setech ELISA metody, používají firmy Inova a Euroimmun. Cílem práce je zhodnotit a porovnat výsledky získané s použitím výše zmíněných setů na sérech pacientů, u kterých byla provedena enterobiopsie.
1
2.
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
2.1
CELIAKIE
2.1.1 Gliadin Gliadiny a gluteniny se řadí mezi zásobní proteiny prolaminy. Prolaminy jsou zásobními proteiny cereálií, nerozpustné ve vodě a roztocích solí, ale rozpustné ve 40-70% ethanolu (Bukrhard, 2006). Jsou uložené v obalové vrstvě obilky – endospermu, bohaté na aminokyseliny: asparagin, glutamin, arginin nebo prolin. Naopak velice chudé jsou na esenciální aminokyseliny lysin, tryptofan a methionin (Abrol a spol., 1971). Prolaminy pšenice (gliadiny), žita (sekaliny) a ječmene (hordeiny) jsou považovány za toxické ve vztahu k celiakii, zatímco prolaminy kukuřice (zeiny) a rýže (oryziny) jsou považovány za netoxické a názory na toxicitu prolaminů ovsa (aveniny) se různí (Bukrhard, 2006). Gliadiny jsou děleny do čtyř frakcí nazývaných alfa-, beta-, gama- a omega-gliadiny po rozdělení elektroforézou prováděnou v nízkém pH (Woychick a spol., 1961). Na přiloženém obrázku je prezentován α-gliadin (Obr. 1).
Obr.1 Aminokyselinové složení α-gliadinu (Kasarda, internetový zdroj)
2
Geny regulující gliadinové peptidy jsou kódovány jako jeden komplexní lokus vyskytující se na krátkých ramínkách 1 a 6 chromosomu (Payne a spol., 1981). Frakce alfagliadinů je kódována na 6 chromosomu (Kasarda, 1980). Aminokyselinové sekvence gliadinů mají určitá místa (epitopy) schopná vyvolat imunitní odpověď a tedy i tvorbu protilátek (Salentijn a kol., 2009) (Obr. 2).
Obr. 2 Alfa – Gliadinové epitopy pro celiakii (Salentijn a kol., 2009) Na obrázku je znázorněna aminokyselinová sekvence α-gliadinu s místy (epitopy) pro celiakii. Sekvence p31-49 (PGQQQPFPPQQPYPQPQPF) spouští vrozenou imunitní odpoveď, HLA-DQ2+ molekuly a T-lymfocyty vážou epitopy Glia-α9 (I) (PFPQPQLPY), Glia-α9 (III) (PYPQPQLPY), Glia-α2 (PQPQLPYPQ) a Glia-α20 (FRPQQPYPQ). Sekvence Glia-α (QGSFQPSQQN) váže HLADQ8+ a také T-lymfocyty.
2.1.2 Celiakie Celiakie, jinak také zvaná celiakální sprue nebo glutenová enteropatie je autoimunitní onemocnění s geneticky podmíněnou vazbou (HLA-DQ2/DQ8) (HLA- lidské leukocytární antigeny) a specifickou odpovědí na spouštěcí faktor peptidy pšeničného gliadinu (lepku) resp. zásobní proteiny (prolaminy) příbuzných obilovin, ječmene, žita a ovsa (Schneiderka P. a spol., 2004). Podstata autoimunitních chorob spočívá ve vzniku imunitní reakce (ať už zprostředkované humorální nebo buněčnou imunitou), při které dochází k napadení struktur vlastního těla a k jejich poškození. Spouštěcím faktorem je agens, proti kterému je namířena imunitní reakce a jehož antigenní struktura se podobá orgánu či tkáni, která je potom vlastními protilátkami či buněčnou imunitou poškozena.
3
V případě celiakie je takovým spouštěčem pšeničný peptid gliadin, resp. jeho součást α-gliadin (přesněji sekvence aminokyselin, kterou musí peptid vzniklý štěpením obsahovat, aby byl schopen tuto imunitní reakci vyvolat). Alfa-gliadin je v žaludku, duodenu a tenkém střevě enzymaticky štěpen na menší peptidy, které se potom vážou v submukóze buněk tenkého střeva na povrchové glykoproteiny HLA-DQ2 a HLA-DQ8 pozitivních imunokompetentních buněk. Tím tedy gliadiny spouštějí ve sliznici tenkého střeva imunitní odpověď, a to jak buněčnou (aktivace cytotoxických T lymfocytů), tak humorální (dochází ke vzniku protilátek proti tkáňové transglutaminase a gliadinu pomocí B lymfocytů). Na základě této reakce dochází k poškození buněk sliznice tenkého střeva (enterocytů) a k typickému histologickému obrazu poškozené sliznice, který se může objevit v široké škále od minimálního postižení sliznice (změny na úrovni kartáčového lemu enterocytů) až k totální atrofii klků, hypertrofii Lieberkühnových krypt a infiltraci submukózy lymfocyty. Všechny tyto změny mohou v různém časovém úseku při dodržování bezlepkové diety regredovat (v závislosti na stupni poškození). O vrozené genetické podstatě svědčí to, že se celiakie vyskytuje prakticky výlučně u jedinců s HLA-antigeny DQ2 nebo DQ8. I to, že bývá častěji sdružena s dalšími autoimunitními
onemocněními
a
její
četnost
je
vyšší
u
příbuzných
pacientů
postižených celiakií (Kohout, 2006).
2.1.3 Prevalence onemocnění Prevalence (udává poměr nemocných jedinců k celkovému počtu jedinců ve sledované populaci) se v České republice odhaduje na 1:200–250, to znamená, že touto chorobou trpí okolo 40–50 tisíc osob, ze kterých je sledována v současné době pouze asi desetina (Kohout, 2007).
2.2
KLINICKÉ PROJEVY CELIAKIE Klinické příznaky onemocnění jsou různé, a proto je u hodně pacientů nemoc
diagnostikována velmi pozdě. Klasifikace celiakie je schematicky vyjádřena tzv. teorií ledovce (Schéma 1).
4
Schéma 1. Teorie ledovce
2.2.1 Klasická forma Celiakie se může projevovat klasickými klinickými příznaky, které se liší v dětství a v dospělosti. V dětství se u dětí po přidání obilných kaší do stravy objeví objemné mastné průjmy a dítě přestane prospívat (růst a přibývat na váze), může mít nafouklé bříško. V
dospělosti
jsou
typickými
příznaky
objemné
mastné
stolice,
hubnutí,
proteinoenergetická malnutrice a bolesti břicha. Tak se však v dospělosti projevuje celiakie jen u malého počtu pacientů, častěji jsou přítomny atypické příznaky, například zácpa, kombinovaná kostní nemoc (osteoporóza a osteomalacie) s možností zlomenin dlouhých kostí či obratlů, anémie, občasné pobolívání břicha, izolované zvýšení transaminas, únavový syndrom, plešatost – alopecie, neplodnost, aftózní stomatitida, epilepsie i deprese a další. Celiakie se však může projevit až příznaky komplikací, například perforací střeva při maligním lymfomu, zlomeninou kostí při osteoporóze, nebo tzv. selháním střeva, kdy tenké střevo není schopné absorbovat žádné živiny, dochází k profúzním průjmům a je nutná úplná parenterální výživa. Rozlišujeme několik forem celiakie, přičemž klinicky diagnostikována je většinou forma symptomatická – s typicky vyjádřenými příznaky.
5
Pacient se symptomatickou formou celiakie má typické či atypické příznaky, pozitivní nález na sliznici tenkého střeva a pozitivní sérologické markery. Stejně se chová forma oligosymptomatická, kdy příznaky jsou málo vyjádřeny či atypické, nález na sliznici tenkého střeva je typický a jsou pozitivní sérologické ukazatele (Kohout, 2006). 2.2.2 Tichá forma Pacienti mající tichou formu celiakie netrpí žádnými gastrointestinálními příznaky, ale mají pozitivní sérologické testy a atrofovanou střevní sliznici prokazatelnou biopsií (Gasbarrini, 2008). 2.2.3 Latentní forma U latentní formy vykazují pacienti pozitivní sérologické testy, ale na bioptickém vzorku nejsou potvrzené změny na střevní sliznici (Gasbarrini, 2008). 2.2.4 Potencionální forma Potencionální forma celiakie zahrnuje formy s negativními klinickými příznaky, negativním histologickým vyšetřením i negativními sérologickými markery. Pacienti však mají genetickou predispozici tohoto onemocnění, tedy ve svých enterocytech mají navázané HLA-antigeny DQ2 nebo DQ8 a také mohou mít zvýšený počet gama/delta lymfocytů v submukóze sliznice (Kohout, 2006). 2.2.5 Kožní forma Duhringova herpetiformní dermatitida je samostatná jednotka, jde o kožní manifestaci celiakie, která se projevuje puchýřky v typických místech (nad extenzory, napínači v kožních rýhách, na vlasaté části hlavy), které nereagují na běžné masti, ale reagují na sulfony – Dapson (Kohout, 2006). Na sliznici střeva jsou jen minimálně znatelné změny, nebo je postižení střevní sliznice mozaikovité (Marsh, 2000). Stejně jako u celiakie je pozitivní reakce na bezlepkovou dietu, která umožní snížit či úplně vysadit léčbu sulfony (Kohout, 2006).
6
2.3
DIAGNOSTIKA CELIAKIE Přesná diagnostika celiakie je dosažena následujícími současnými diagnostickými
směrnicemi a má na paměti, že intestinální biopsie zůstává stále jediným obecně přijatelným zlatým standardem diagnostiky. Stanovení je založené na doporučení odbornou společností ESPGAN (European Society for Paediatric Gastroenterology and Nutrition = Evropská společnost pro dětskou gastroenterologii a výživu), dále NASPGHAN (North American Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition = Severoamerická společnost pro dětskou gastroenterologii, hematologii a výživu) (Briani a kol, 2008). Sérologicky se stanovují protilátky třídy IgA a IgG proti gliadinu, protilátky třídy IgA ke tkáňové transglutaminase a endomysiu. Pokud jsou výsledky testů pozitivní, je doporučena enterobiopsie. Ta se provádí ještě u neléčeného pacienta, aby se ukázalo, zda je sliznice porušena či nikoliv. Diagnostika se řídí kroky naznačenými ve Schématu 2.
Schéma 2. Jednotlivé kroky v diagnostice celiakie (AGA-protilátky proti k gliadinu, EMA-endomysiální protiláky, tTG-tkáńová transglutaminasa)
7
2.3.1 Sérologické testy 2.3.1.1 Antigliadinové protilátky – AGA (Anti-gliadin antibodies) Detekce protilátek třídy IgA a IgG proti gliadinu (AGA) jsou nejčastěji a nejdéle používanými sérologickými markery. ELISA metody detekce AGA jsou běžně dostupné a z uvedených markerů celiakie jsou AGA nejlevnější. Měření AGA je dobré pro dlouhodobé sledování aktuálního stavu pacienta dodržujícího bezlepkovou dietu. Ukazuje se, že IgG AGA dosahují lepší citlivosti, ale zároveň menší specificity v porovnání s IgA AGA (Pietzak, 2005). 2.3.1.2
Protilátky ke tkáňové transglutaminase – atTG (Anti-tissue transluglutaminase) Protilátky třídy IgA ke tkáňové citlivosti (tTG), jsou pro diagnostiku velmi přínosné,
protože poskytují dostatečnou citlivost a specificitu za rozumnou cenu. Pozitivní test na protilátky IgA tTG vede k odebrání histologického vzorku tenkého střeva. Pokud je test negativní, ale symptomy napovídají, že se jedná o celiakii, bývá doporučen test na IgG tTG. Je to z toho důvodu toho, že asi 3 procenta pacientů celiaků mají IgA deficienci (Presutti a kol., 2007). Stanovení protilátek ke tkáňové transglutaminase (atTG) má velmi vysokou diagnostickou efektivitu (senzitivita 87-97 % a specificita 88-98 %) (Kocna Gastrolab, internetový odkaz) 2.3.1.3
Protilátky k endomysiu – EMA (Endomysial antibodies) Endomysium je pojivový protein hladkého svalstva nacházející se mezi myofibrilami. Pro
stanovení
protilátek
proti
endomysiu
se
používá
metoda
nepřímé
imunofluorescence, jako substrát se používá například svalovina opičího jícnu (Palacios a spol., 2000). Průkaz EMA protilátek by měl být proveden v několika ředěních vzorku séra od 1:5 (pro základní screening) až 1:40 (průkaz onemocnění). Vzhledem k finanční náročnosti testu je většinou prováděno hodnocení pouze v jediném ředění, nejčastěji 1:20. Vyhodnocení fluorescence v mikroskopu není zrovna jednoduché a vyžaduje dlouhodobé zkušenosti. Endomysiální protilátky jsou rovněž velmi spolehlivým markerem celiakie (citlivost 83-95 % a specificita 94-99 %) (gastrolab).
8
2.3.2 Biopsie Biopsie malého vzorku tenkého střeva se provádí dvěma metodami. A to častější enterobiopsií nebo méně častou hloubkovou duodenoskopií (Pietzak, 2005). 2.3.2.1 Enterobiopsie Navzdory příchodu klinicky přesných sérologických testů, je stále enterobiopsie důležitým vyšetřením vedoucím k vyvrácení nebo potvrzení celiakie. Může být také prováděna u rizikových pacientů, kteří mají sice sérologické testy negativní, ale lékař má velké podezření na toto onemocnění. Enterobiopsie se provádí i u pacientů trpících kožní formou Duhringovou herpetiformní dermatitidou. Změny na střevní sliznici se mohou velice lišit: počínaje od částečné po totální atrofii klků. Mohou se také objevovat rozptýlená ložiska atrofovaných klků po celé délce tenkého střeva. Ukazatelem bývá i vysoká koncentrace epiteliálních lymfocytů (Pressuti a kol., 2007). Enterobiopsie se provádí za úplného vědomí, pouze u dětí se podávají sedativa. Ústy se vpraví do těla bioptická kapsle, která je připevněna na vodič. Posouvá se skrze jícen a žaludek až do duodena (dvanáctník), což je první oddíl tenkého střeva. Na rozdíl od endoskopie, bioptická kapsle se může zavést až do jejuna (lačník), kde je atrofie klků pravděpodobnější a pro diagnostiku přesnější (Pietzak, 2005). Poloha kapsle v trávící trubici se kontroluje pomocí rentgenových snímků břišní dutiny. Když je kapsle na správném místě v jejunu, působením podtlaku se kapsle otevře a odřízne se bioptický vzorek sliznice. Po vytáhnutí kapsle ven se zkontroluje, zda byl vzorek odebrán, a pokud ano, zašle se k histologickému vyšetření. Vzorek vyhodnocuje patolog (Green, Moshe, 2006). 2.3.2.2 Endoskopie Za částečného znecitlivení lékař vede dlouhou úzkou trubici, zvanou endoskop, skrze pacientova ústa, jícen a žaludek až do duodena. Endoskop má kameru, takže vyšetřující lékař přímo vidí, v které části trávícího systému se právě nachází. Endoskop se dostane nejdále na konec duodena. Oproti enterobiopsii může endoskopie vykazovat falešně negativní výsledky, protože se zánět může vyskytovat zatím jen v jejunu. Bioptický vzorek za pomoci mikroskopu vyhodnotí patolog (Lapid N., 2008). Na přiloženém obrázku je patrný rozdíl mezi normální a atrofovanou sliznicí tenkého střeva (Obr. 3)
9
Obr. 3 Ukázka zdravé (A) a atrofované střevní sliznice (B) (Elliot D., internetový odkaz)
Patologické změny objevující se na střevní sliznici se dělí podle „Marshovy klasifikace” (Obr. 4): Stupeň 0: normální sliznice Stupeň 1: zvyšující se počet submukózních lymfocytů Stupeň 2: proliferace lymfocytů do Lieberkühnových krypt Stupeň 3: částečná nebo úplná atrofie klků Stupeň 4: zploštění povrchu střevní sliznice (Marsh M.N., 1992)
Obr. 4 Marshova klasifikace míry poškození střevní sliznice (Wikipedie, internetový odkaz) Stupeň 0 (normální nepoškozená sliznice), Stupeň 1 (zvyšující se počet submukózních lymfocytů), Stupeň 2 (proliferace lymfocytů do Lieberkühnových krypt, Stupeň 3 (částečná nebo úplná atrofie klků), Stupeň 4 (zploštění střevní sliznice)
10
2.4
PATOGENEZE ONEMOCNĚNÍ Po požití pšenice (nebo jiných příbuzných obilovin) dojde k hydrolýze pšeničných
proteinů
trávicími
enzymy
–
pepsinem,
trypsinem,
chymotrypsinem,
elastasou,
enteropeptidasami, karboxypeptidasami a enzymy kartáčového lemu enterocytu. Tím dojde ke vzniku krátkých peptidů o délce maximálně několik desítek aminokyselin, které nejsou dále štěpitelné trávicími enzymy. Peptidové řetězce o 33 aminokyselinách jsou potom transportovány přes epitel tenkého střeva do subepiteliální vrstvy, zvané též lamina propria (van Heel, West, 2006). Propustnost střevního epitelu závisí na regulaci intracelulárních těsných spojení (tight junctions). Je to druh mezibuněčného spojení, tvořeného síťovinou proteinů. Tato spojení umožňují jen velmi malý průnik látek do subepiteliálního prostoru. Existují zejména mezi buňkami málo propustných epitelů, též zvaných zonula occludens (Carchon a kol., 1979). Nyní je jasné, že tato spojení jsou dynamická struktura, účastnící se vývojových, fyziologických a patologických procesů epiteliálních buněk. In vitro studie svědčí o tom, že cytokiny TNF-α (tumor-necrosis factor) a IFN-γ (interferon) mohou způsobit dysfunkci střevního epitelu v průběhu střevního zánětu. Objevením zonulinu, molekuly, která vratně reguluje propustnost těsných spojení, se osvětlil mechanismus střeva jako bariéry chránící buňky. Zonulin je protein zapojující se ve funkci tight junctions. Další funkcí zonulinu je chránit povrch střeva před kolonizací patogenními mikroorganismy. Při rozvoji celiakie jsou těsná spojení otevřená sekundárním regulačním mechanismem zonulinu. Regulace zonulinu jako cesty vrozené imunity je přímo indukovaná antigenem gliadinem (Fasano, SheaDonohue, 2005). Tkáňová transglutaminasa v subepiteliální vrstvě lamina propria deaminuje gliadin a vytváří z něj negativně nabité deaminované gliadinové peptidy. Proteiny DQ2 a DQ8, vázané na povrchu antigen-prezentujících buněk (APC), přednostně vážou tyto negativně nabité peptidy. Tato vazba je geneticky podmíněná, proto u zdravého jedince se gliadin nemá kam navázat, a tak není pro tělo škodlivý. Následně Th (pomocné) lymfocyty se po této interakci aktivují a produkují cytokiny, hlavně interferon gama (IFN-γ). Odpovědí na tuto zánětlivou reakci je další produkce cytokinů a jiných chemických látek vedoucí k poškození klků. Zároveň plasmatické buňky poškozené tkáně, indukované B lymfocyty, začínají produkovat autoimunní protilátky proti gliadinu a tkáňové transglutaminase (Treem, 2004; Alaedini, Green, 2005; Sollid, Lie, 2005).
11
Působením nahromaděných cytokinů, Tk lymfocytů zabíječů a dalších chemických látek, dochází k poškození enterocytů a nastartování apoptózy u těchto buněk. Celý proces patogeneze je schematicky a přehledně znázorněn na obrázku (Obr. 5).
Obr. 5 Funkce výjimečné propustnosti střeva v patogenezi celiakie Gliadinové fragmenty jsou obsaženy ve střevním lumen (1), kde indukují zonulin-dependetní receptor (2). Uvolněním zonulinu se otevřou těsná spojení a gliadin prostoupí skrze tuto bariéru do subepiteliální vrstvy (3). Po následné deaminaci tkáňovou transglutaminasou (4) se gliadinové peptidy vážou na HLA receptory přítomné na povrchu antigen prezentujících buněk (5) nebo gliadin přímo atakuje antigen prezentující buňky (6) a receptor na povrchu začne uvolňovat cytokiny (7). T-lymfocyty interagují skrze gliadinové peptidy s antigenpresentujícími buňkami (8), což má za následek imunitní odpověď jak humorální zprostředkovanou aktivací Blymfocytů (9) tak buněčnou spuštěnou aktivací T-lymfocytů (10). Tato souhra adaptivní a vrozené imunity zodpovídá za autoimunitní proces vedoucí k poškození epiteliálních buněk tenkého střeva (11). EMA-antiendomysiální protilátky, AGA-anti-gliadinové protilátky, APC, antigen-presentující buňka, atTG-protilátky ke tkáňové transglutaminase, B-B lymfocyty, P-plasmatická buňka, T-T lymfocyty, Tk-lymfocyty
T zabíječi, tTG-tkáňová transglutaminasa (Fasano, Shea-Donohue, 2005).
12
2.5
ALTERNATIVA BEZLEPKOVÉ DIETY Léčba celiakie jako taková neexistuje. Jedinou možností pro celiaky, jak předcházet
potížím, je dodržování přísné bezlepkové diety. Tím se zároveň u těchto lidí snižuje riziko rozvoje gastrointestinálního lymfomu nebo karcinomu. Bohužel, tato dieta je ekonomicky značně náročná a pro pacienty velmi omezující. Lepek je totiž velmi běžnou ingrediencí vyskytující se v běžné stravě. Nehledě na to, že některé bezlepkové potraviny nechutnají dobře (Sollid, Khosla, 2005). V současnosti probíhá studie, poukazující na terapeutickou možnost orálně podávat (PEP) prolyl endopeptidasy z rodiny enzymů s unikátní schopností rozštěpit 33aminokyselinové
gliadinové
peptidy
v místech
aminokyseliny
prolinu
odolávající
proteolytickému štěpení. Tímto štěpením vzniknou kratší peptidy, které nejsou imunogenní a tedy jsou pro celiaky neškodné. Výhoda těchto enzymů spočívá v tom, že účinek enzymů může být omezen délkou řetězce substrátu (gliadinu) a dále fakt, že reagují v poměrně neutrálním pH prostředí tenkého střeva (Bethun a kol., 2006). Další studií je objevení AT-1001 oktapeptidového inhibitoru paracelulární propustnosti, jehož struktura je odvozená od zonula ocludens toxinu. Tento toxin je proteinem sekretovaným bakterií Vibrio cholerae. Oktapepdtid AT-1001 se váže na receptor zonula occludens toxinu a tím zamezí otevření tight juction. Blokace intestinální propustnosti skrze těsná spojení snižuje patogenezi onemocnění, protože enterocyty nepropustí tolik gliadinu do lamina propria (Paterson a kol., 2007).
2.6
DEAMINOVANÉ GLIADINOVÉ PEPTIDY Gliadinové peptidy hrají klíčovou roli v patogenezi celiakie, nicméně v diagnostice
jsou často nahrazovány více citlivou a specifickou metodou zjišťování protilátek proti tkáňové transglutaminase. Objevila se nová studie průkazu protilátek proti synteticky deaminovaným gliadinovým peptidům, vykazující lepší citlivost a specificitu oproti protilátkám proti αgliadinu. Tkáňová transglutaminasa specificky deaminuje místa, kde se vyskytuje aminokyselina glutamin přeměnou na glutamát. Tyto negativně nabité peptidy se přednostně váží na HLA receptory druhé třídy a také na receptory T-lymfocytů, čímž navozují autoimunitu. Dále se také podílejí na aktivaci B-lymfocytů, tedy na produkci protilátek. Takže
13
se ukazují být lepší pro diagnostiku jejich protilátek než α-gliadin. Na základě tohoto zjištění INOVA Diagnostics navrhla synteticky připravené deaminované gliadinové peptidy o složení méně než 30 aminokyselinách, používajících se v ELISA testech (Liu a kol., 2007). Aminokyselinové složení peptidů použité u ELISA setů firmy INOVA Diagnostics je patentované a firma tyto sekvence nesdílí (Prince, 2006). V poslední době byly popsány specifické protilátky proti syntetickým peptidům, které jsou odvozeny od částečně deaminovaných gamma gliadinů. Tyto sekvence jsou nazývány jako GAF(3X) (gliadin analogous fusion peptides) a vykazují velmi vysokou přesnost v diagnostice celiakie. GAF(3X) se skládá ze tří opakujících se peptidových sekvencí PLQPEQPFP a PEQLPQFEE (Obr. 6). Připravená DNA kódující GAF byla vektorem vnesena (plazmid) do genomu bakterie E. coli. ELISA sety používající tyto sekvence jsou od firmy EUROIMMUN (Prause a kol., 2008).
Obr. 6 GAF(3X) peptid (Prause a kol., 2008)
2.7
ELISA ELISA z anglického názvu Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay je jednou z
nejpoužívanějších imunochemických metod sloužících k detekci protilátek. Existuje početná řada variant uspořádání ELISA. Varianty je vhodné dělit na základě dvou hlavních kritérií. Za prvé jestli imunochemická interakce v rámci metody je kompetitivní či nikoliv. Za druhé podle imunoreaktantu zakotveného na pevnou fázi.
14
Kompetitivní ELISA využívá skutečnosti, že snižováním koncentrace imunoreaktantů se zvyšuje (zlepšuje) citlivost metody. Při nekompetitivní ELISE se pracuje s přebytkem imunoreaktantů, aby bylo zachyceno co nejvíce analytu a dosaženo co nejvyššího signálu při měření enzymové aktivity (Fukal, Holubová; 2007). 2.7.1 Nekompetitivní ELISA s imobilizovaným antigenem Pro tuto variantu ELISY existují dvě metody: přímá a nepřímá. Přímá metoda se používá například k detekci proteinů po elektroforetické dělením tzv. imunoblotingem. Nepřímá metoda je hojně používaná ke stanovení protilátek (Fukal, Holubová; 2007). U této nepřímé metody je na dno mikrotitrační destičky navázán antigen. Nejdříve se tento antigen inkubuje s primární protilátkou (např. obsaženou v séru) a její nadbytek se vymyje. Sekundární protilátka značená enzymem neboli konjugát se váže na primární protilátku a nadbytek se opět vymyje (Obr. 7). Podmínkou spolehlivosti je, že sekundární protilátka se neváže na primární protilátku a nelne na stěny jamek mikrotitrační destičky. Nakonec se přidá chromogenní substrát, který způsobí barevnou změnu spektrofotometricky měřitelnou. Intenzita barvy odpovídá koncentraci protilátky (ELISA Technology, internetový zdroj).
Obr. 7 Vazba nepřímé ELISA metody (ELISA Technology, internetový zdroj) Antigen je vázaný na dno mikrotitrační destičky, přidá se sérum obsahující primární protilátku, která se naváže na antigen. Přidaný konjugát (sekundární protilátka) se váže na primární protilátku. Přidáním chromogenního substrátu se posléze detekuje signál.
15
3.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1
MATERIÁLOVÉ A PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ
3.1.1 Chemikálie K pokusu byly použity tyto komerční ELISA sety: ELISA sety firmy INOVA Diagnostics, Inc: - QUANTA LiteTM Gliadin IgA II 704525 (Tab. I) Tab I. Obsah ELISA setu od firmy Inova protilátky proti gliadinu IgA Inova IgA Složky
Barva
Složení
-
12x8
růžový
1x1,2 ml
růžový
1x1,2 ml
5. Negativní kontrola: (neobsahuje IgA, lidské), připraveno k použití
růžový
1x1,2 ml
6. Konjugát: peroxidasa značená anti-human IgA (kozí)
modrý
1x12 ml
7. Pufr pro ředění vzorků, připraven k použití
růžový
1x50 ml
8. Promývací roztok, 40x koncentrovaný
červený
1x25 ml
bezbarvý
1x12 ml
bezbarvý
1x12 ml
-
1 blok
Barva
Složení
-
12x8
růžový
1x1,2 ml
(20Units)
růžový
1x1,2 ml
5. Negativní kontrola: (neobsahuje IgG, lidské), připraveno k použití
růžový
1x1,2 ml
1. Mikrotitrační destičky, potažené antigenem 2. Kalibrátor 1: High-Vysoká koncentrace (IgA, lidské), připraven k použití 3. Kalibrátor 2: Low-Nízká koncentrace (IgA, lidské), připraven k použití (20Units)
9. Substrát - TMB (Tetramethylbenzidin)/H2O2 (peroxid vodíku), připraven k použití 10. Stopovací roztok: 0,344 M kyselina sírová, připraven k použití 11. Příbalový leták - informace
- QUANTA LiteTM Gliadin IgG II 704520 (Tab. II) Tab II. Obsah ELISA setu od firmy Inova protilátky proti gliadinu IgG Inova IgG Složky 1. Mikrotitrační destičky, potažené antigenem 2. Kalibrátor 1: High-Vysoká koncentrace (IgG, lidské), připraven k použití 3. Kalibrátor 2: Low-Nízká koncentrace (IgG, lidské), připraven k použití
16
6. Konjugát: peroxidasa značená anti-human IgG (kozí)
modrý
1x12 ml
7. Pufr pro ředění vzorků, připraven k použití
růžový
1x50 ml
8. Promývací roztok, 40x koncentrovaný
červený
1x25 ml
použití
bezbarvý
1x12 ml
10. Stopovací roztok: 0,344 M kyselina sírová, připraven k použití
bezbarvý
1x12 ml
-
1 blok
Barva
Složení
-
12x8
9. Substrát - TMB (Tetramethylbenzidin)/H2O2 (peroxid vodíku), připraven k
11. Příbalový leták - informace
ELISA sety firmy EUROIMMUN: Anti-Gliadin ELISA (IgA) EV 3011-9601 A (Tab. III) Tab III. Obsah ELISA setu od firmy Euroimmun protilátky proti gliadinu IgA Euroimun IgA Složky 1. Mikrotitrační destičky, potažené antigenem - gliadin purifikovaný z pšenice
tmavě 2. Kalibrátor 1: 200 RU/ml (IgA, lidské), připraven k použití
červený
1x2,0 ml
3. Kalibrátor 2: 25 RU/ml (IgA, lidské), připraven k použití
červený
1x2,0 ml
světle 4. Kalibrátor 3: 2 RU/ml (IgA, lidské), připraven k použití
červený
1x2,0 ml
5. Positivní kontrola: (IgA, lidské), připraveno k použití
modrý
1x2,0 ml
6. Negativní kontrola: (neobsahuje IgA, lidské), připraveno k použití
zelený
1x2,0 ml
7. Konjugát: peroxidasa značená anti-human IgA (králičí)
zelený
1x12 ml
světle modrý
1x100 ml
bezbarvý
1x100 ml
použití
bezbarvý
1x12 ml
11. Stopovací roztok: 0,5 M kyselina sírová, připraven k použití
bezbarvý
1x12 ml
-
1 blok
8. Pufr pro ředění vzorků, připraven k použití 9. Promývací roztok, 10x koncentrovaný 10. Substrát - TMB (Tetramethylbenzidin)/H2O2 (peroxid vodíku), připraven k
12. Příbalový leták - informace
Anti-Gliadin ELISA (IgG) EV 3011-9601 G (Tab. IV)
17
Tab IV. Obsah ELISA setu od firmy Euroimmun protilátky proti gliadinu IgG Euroimmun IgG Složky 1. Mikrotitrační destičky, potažené antigenem - gliadin purifikovaný z pšenice
Barva
Složení
-
12x8
tmavě 2. Kalibrátor 1: 200 RU/ml (IgG, lidské), připraven k použití
červený
1x2,0 ml
3. Kalibrátor 2: 25 RU/ml (IgG, lidské), připraven k použití
červený
1x2,0 ml
světle 4. Kalibrátor 3: 2 RU/ml (IgG, lidské), připraven k použití
červený
1x2,0 ml
5. Positivní kontrola: (IgG, lidské), připraveno k použití
modrý
1x2,0 ml
6. Negativní kontrola: (neobsahuje IgG, lidské), připraveno k použití
zelený
1x2,0 ml
7. Konjugát: peroxidasa značená anti-human IgG (králičí)
zelený
1x12 ml
světle 8. Pufr pro ředění vzorků, připraven k použití
modrý
1x100 ml
bezbarvý
1x100 ml
použití
bezbarvý
1x12 ml
11. Stopovací roztok: 0,5 M kyselina sírová, připraven k použití
bezbarvý
1x12 ml
-
1 blok
9. Promývací roztok, 10x koncentrovaný 10. Substrát - TMB (Tetramethylbenzidin)/H2O2 (peroxid vodíku), připraven k
12. Příbalový leták - informace
3.1.2 Pacientská séra Bylo
náhodně
vybráno
120
zmražených
pacientských
sér
ze
zásoby
gastroenterologické laboratoře ÚKBLD VFN v Praze. Séra byla již předem stanovena v rámci klinické diagnostiky na základě doporučení lékaře. Stáří sér bylo v době měření maximálně deset let od data poslední analýzy, séra byla skladována zmražená na teplotu -20°C. Pro analýzu byla séra náhodně rozdělena do tří skupin, aby mohla být podrobena měření. Známé byly výsledky mražených sér pro stanovované antigeny: atTG IgA, AGA IgA, AGA IgG a EMA. Všichni pacienti byli také v minulosti podrobeni histologickému vyšetření biopsie tenkého střeva, takže podle výsledků histologie bylo potvrzeno, zda pacient má či nemá onemocnění celiakii. V pracovní skupině bylo 35 negativních sér, 79 pozitivních sér a šest sér od pacientů, kteří byli v remisi (mají celiakii, ale dodržují bezlepkovou dietu). Testovací skupina obsahovala 89 ženských a 31 mužských sér. Lidem v době diagnózy bylo od 19 let do 75 let, průměrný věk je 40 let. Testovaná séra byla odebíraná dospělým lidem, nejednalo se o dětská séra.
18
3.1.3 Přístrojové vybavení K provedení pokusu byly použity tyto přístroje (Tab. V): Tab. V Přístrojové vybavení
Název přístroje
Firma
Automatická promývačka na mikrotitrační
BIOTEC Instrument
destičky Fotometr pro měření absorbance na
SLT Labinstuments A-5082
mikrotitračních destičkách Program KIM pro vyhodnocení mikrotitračních destiček, verze 2.13 Multikanálová pipeta
3.2
METODIKA MĚŘENÍ Všechny testované vzorky byly vyšetřeny následujícími metodami.
3.2.1 Metoda ELISA (Dialab) Pro rutinní stanovení markerů celiakie se v laboratoři ÚKBLD VFN a 1. LF UK v Praze používají komerční ELISA sety firmy Dialab. Všechny jsou založeny na principu nekompetitivní nepřímé enzymové imunoanalýzy. Všechny vybrané vzorky pacientských sér pro analýzu byly podrobeny této ELISA metodě a byly známy jejich výsledky. Pracovní postup se shoduje pro tyto stanovované antigeny, tj. AGA IgA a AGA IgG. Veškerá stanovení byla prováděna v dubletech, na jedné desce lze stanovit 40 pacientů. 3.2.1.1 Princip metody (Dialab) Princip metody spočívá v následujícím postupu. Na dnech jamek mikrotitračních destiček je vázán α-gliadin izolovaný z pšenice. Na něj se navážou protilátky přítomné ve vzorcích a kalibrátorech. Po inkubaci se vymyjí nereaktivní součásti séra. Dále je do jamek přidán konjugát, který naváže již zakotvené protilátky. Přebytek je po inkubaci vymyt. Dále se přidává substrát, který během inkubace vytvoří barevnou změnu. Barevná změna je přímo
19
úměrná koncentraci protilátek ve vzorku. Přidáním stopovacího roztoku se reakce ukončí. Optická hustota se měří při 450 nm s použitím 620 nm filtru jako referenční vlnové délky. 3.2.1.2 Pracovní postup 1. Všechny vzorky naředit ředícím pufrem (10 µl vzorku + 1000 µl pufru). Před pipetováním zvortexovat. 2. Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetovat 100 µl kalibrátoru, kontrol a předředěných vzorků pacientů. 3. Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Promyje se 3x300 µl promývacího roztoku, provádělo se na automatické promývačce. 5. Přidat do všech jamek 100 µl konjugátu. 6. Inkubovat 15 minut při laboratorní teplotě. 7. Promýt 3x300 µl promývacím roztokem, provádělo se na automatické promývačce. 8. Přidat do všech jamek 100 µl substrátu. 9. Inkubovat 15 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 10. Ukončit reakci přidáním 100 µl Stop roztoku do každé jamky. 11. Nechat 5 minut stát. 12. Do 30 minut odečíst absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620nm. 3.2.1.3 Zpracování výsledků Zpracování a vyhodnocení výsledku bylo provedeno programem KIM verze 2.13. Všechny výsledné hodnoty této metody jsme už před analýzou znali. Popis metody uvádím pro porovnání s metodami dalších dvou firem. Výrobcem doporučované cut off hodnoty jsou uvedeny v (Tab. VI). Tab. VI. Cut off hodnoty sady Dialab Sada
Negativní (Abr.j.)
Pozitivní (Abr.j.)
iIgA
≤30
>30
iIgG
≤30
>30
Abr.j. - arbitrární jednotky
20
3.2.2 Metoda ELISA (INOVA Diagnostics, Itc.) Inova Diagnostics, Itc., uvedla na trh ELISA metody používající jako antigen deaminované gliadinové peptidy. Veškerá stanovení byla prováděna v dubletech (po dvojcích), na jedné desce bylo stanoveno 43 pacientů. 3.2.2.1
Princip metody (Inova)
Na dnech jamek mikrotitračních destiček je vázán deaminovaný gliadinový peptid patentovaný firmou Inova. Tento peptid neobsahuje žádné aminokyslinové sekvence obsažené v gliadinu, ale musí být prostorově podobný. Na něj se navážou protilátky přítomné ve vzorcích a kalibrátorech. Po inkubaci se vymyjí neaktivní součásti séra. Dále je do jamek přidán konjugát (enzym značený protilátkami IgA nebo IgG), který naváže již zakotvené protilátky. Přebytek je po inkubaci vymyt. Dále se přidává substrát, který během inkubace vytvoří barevnou změnu. Barevná změna je přímo úměrná koncentraci protilátek ve vzorku. Přidáním stopovacího roztoku se reakce ukončí. Optická hustota se měří při 450 nm s použitím 620 nm jako referenční vlnové délky. 3.2.2.2 Pracovní postup 1. Všechny vzorky naředit ředícím pufrem (5 µl vzorku + 500 µl pufru). Před pipetováním zvortexovat. 2. Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetovat 100 µl kalibrátoru, kontrol a předředěných vzorků pacientů. 3. Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Promyje se 3x300 µl promývacího roztoku, provádělo se na automatické promývačce. 5. Přidat do všech jamek 100 µl konjugátu. 6. Inkubovat 30 minut při laboratorní teplotě. 7. Promýt 3x300 µl promývacím roztokem, provádělo se na automatické promývačce. 8. Přidat do všech jamek 100 µl substrátu. 9. Inkubovat 30 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 10. Ukončit reakci přidáním 100 µl Stop roztoku do každé jamky. 11. Nechat 5 minut stát. 12. Do 60 minut odečíst absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620 nm.
21
3.2.2.3 Zpracování výsledků Zpracování a vyhodnocení výsledku bylo provedeno programem KIM verze 2.13. Výrobcem doporučované cut off hodnoty jsou znázorněny (Tab. VII). Výrobce má nastavené hodnoty cut off tak, že v rozmezí 20-30 U je mírná pozitivita a u hodnot nad 30 U je vysoká pozitivita. Hodnotila jsem pozitivitu už jako nízkou (tzn. pokud byla koncentrace vyšší jak 20 Units bylo sérum označováno za pozitivní). Tab. VII. Cut off hodnoty sady Inova Sada
Negativní (U)
Slabě pozitivní (U)
Silně pozitivní (U)
iIgA
<20
20-30
>30
iIgG
<20
20-30
>30
U units - jednotky
Vzorky byly pipetovány vždy v dubletech (po dvojcích) po 43 sérech podle tohoto modelu (Tab. VIII): Tab. VIII Model pipetování mikrotitračních destiček (Inova). INOVA 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
ŘP
ŘP
p5
p5
p13
p13
p21
p21
p29
p29
p37
p37
B
NK
NK
p6
p6
p14
p14
p22
p22
p30
p30
p38
p38
C
LC
LC
p7
p7
p15
p15
p23
p23
p31
p31
p39
p39
D
HC
HC
p8
p8
p16
p16
p24
p24
p32
p32
p40
p40
E
p1
p1
p9
p9
p17
p17
p25
p25
p33
p33
p41
p41
F
p2
p2
p10
p10
p18
p18
p26
p26
p34
p34
p42
p42
G
p3
p3
p11
p11
p19
p19
p27
p27
p35
p35
p43
p43
H
p4
p4
p12
p12
p20
p20
p28
p28
p36
p36
LC
LC
ŘP-pufr na ředění vzorků, NK-negativní kontrola, LC-nízká koncentrace antigenu, HC-vysoká koncentrace antigenu, p1-43 pacientská séra
Výsledné absorbance získané měřením se přepočetly podle vzorce uvedeného výrobcem, a tím jsem získala výsledné koncentrace: koncentrace vzorku=
průměry absorbancí vzorku průměry absorbancí nízké pozitivity
22
x Nízká pozitivita (20 Units)
3.2.3 Metoda ELISA (EUROIMMUN) ELISA sety firmy Euroimmun používá jako antigen GAF-3X (deaminované peptidyfúzní analogy gliadinu). Veškerá stanovení byla prováděna v dubletech, na jedné desce bylo stanoveno 43 pacientů. 3.2.3.1 Princip metody (Euroimmun) Na dnech jamek mikrotitračních destiček je vázán deaminovaný gliadinový peptid GAF-3X. Na něj se navážou protilátky přítomné ve vzorcích a kalibrátorech. Po inkubaci se vymyjí neaktivní součásti séra. Dále je do jamek přidán konjugát (enzym značený protilátkami IgA nebo IgG), který naváže již zakotvené protilátky. Přebytek je po inkubaci vymyt. Dále se přidává substrát, který během inkubace vytvoří barevnou změnu. Barevná změna je přímo úměrná koncentraci protilátek ve vzorku. Přidáním stopovacího roztoku se reakce ukončí. Optická hustota se měří při 450 nm s použitím 620 nm jako referenční vlnové délky. 3.2.3.2 Pracovní postup 1. Všechny vzorky naředit ředícím pufrem (5 µl vzorku + 1000 µl pufru). Před pipetováním zvortexovat. 2. Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetovat 100 µl kalibrátoru, kontrol a předředěných vzorků pacientů. 3. Inkubuje se 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Promyje se 3x300 µl promývacího roztoku, provádělo se na automatické promývačce. 5. Přidat do všech jamek 100 µl konjugátu. 6. Inkubovat 30 minut při laboratorní teplotě. 7. Promýt 3x300 µl promývacím roztokem, provádělo se na automatické promývačce. 8. Přidat do všech jamek 100 µl substrátu. 9. Inkubovat 15 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 10. Ukončit reakci přidáním 100 µl Stop roztoku do každé jamky. 11. Nechat 5 minut stát. 12. Do 30 minut odečíst absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620nm.
23
3.2.3.3
Zpracování výsledků Zpracování a vyhodnocení výsledků bylo provedeno programem KIM verze 2.13.
Výrobcem doporučované cut off hodnoty jsou uvedeny (Tab. IX). Výrobce má nastavené hodnoty cut off tak, že v rozmezí 25-50 RU/ml je mírná pozitivita a u hodnot nad 50 RU/ml je vysoká pozitivita. Hodnotili jsme pozitivitu už jako nízkou (tzn. pokud byla koncentrace vyšší jak 25 RU/ml, už bylo sérum označeno za pozitivní).
Tab. IX. Cut off hodnoty sady Euroimmun Sada
Negativní (RU/ml)
Slabě pozitivní (RU/ml)
Silně pozitivní (RU/ml)
iIgA
<25
20-50
>50
iIgG
<25
20-50
>50
RU relative units – relativní jednotky
Vzorky byly pipetovány vždy v dubletech po 43 sérech podle tohoto modelu (Tab X): Tab. X Model pipetování mikrotitračních destiček (Euroimmun). EUROIMMUN 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
STD 1
STD 1
p1
p1
p9
p9
p17
p17
p25
p25
p33
p33
B
STD 2
STD 2
p2
p2
p10
p10
p18
p18
p26
p26
p34
p34
C
STD 3
STD 3
p3
p3
p11
p11
p19
p19
p27
p27
p35
p35
D
NK
NK
p4
p4
p12
p12
p20
p20
p28
p28
p36
p36
E
PK
PK
p5
p5
p13
p13
p21
p21
p29
p29
p37
p37
F
p41
p41
p6
p6
p14
p14
p22
p22
p30
p30
p38
p38
G
p42
p42
p7
p7
p15
p15
p23
p23
p31
p31
p39
p39
H
p43
p43
p8
p8
p16
p16
p24
p24
p32
p32
p40
p40
STD 1-kalibrátor 1 (200 U/ml), STD 2-kalibrátor 2 (25 U/ml), STD 3-kalibrátor 3 (2 U/ml), NK-negativní kontrola, PK- pozitivní kontrola, p1-43 pacientská séra
Výsledné hodnoty koncentrací vzorků v jednotkách (U/ml) byly získány z kalibrační křivky, zpracované výsledky byly přímo prezentovány programem KIM verze 2.13.
24
3.2.4 Statistické zpracování výsledků Všechny výsledné hodnoty koncentrací byly statisticky zpracovány v programu Microsoft Excel. Podle nastavených cut off hodnot uvedených u všech tří firem, byla posouzena negativita či pozitivita vzorků. Na základě tohoto posouzení jsem vytvořila kontingenční tabulky. V tabulkách se porovnávaly výsledky pozitivity či negativity ELISA testů se známými histologickými výsledky vzorků (histologie byla hlavním kritériem, v posouzení jestli je daný vzorek séra pozitivní, nebo negativní). Z takto získaných výsledků jsem statisticky hodnotila citlivost (sensitivity), specifitu (specificity) a přesnost (accuracy) výsledných hodnot koncentrací podle následujících vzorců:
citlivost =
TP TP + FN
specifita =
TN TN + FP
presnost =
TP + TN TP + FP + FN + TN
Použité označení viz (Tab. XI). Tab. XI Použité označení
TP
True positive – Správně pozitivní
TN
True negative – Správně negativní
FP
False positive – Falešně pozitivní
FN
False negative – Falešně negativní
Výsledné koncentrace všech naměřených analytů byly podrobeny korespondenční analýze. Korespondenční analýza byla provedena v programu XLSTAT, což je rozšířená verze Microsoft Excelu. Korespondenční analýza (CA) je aplikovaná metoda hlavních komponent pro kategorizovaná (nenumerická) data. Multivariační verze CA se nazývá MCA (multivariační korespondenční analýza). MCA zpracovává frekvenční kontingenční tabulku finálních dat (program xlstat, 2008).
25
4.
VÝSLEDKY Na ELISA destičkách obou firem (Inova a Euroimmun) byla změřena celá testovací
skupina (120 sér). Všechny výsledky jsou přehledně shrnuty v příloze (Tab. XII). Z důvodu hodnocení patogeneze onemocnění byly vyňaty výsledky vzorků remisní skupiny (6 sér), které jsou v (Tab XII) označeny jako CSR. Statistickému vyhodnocení bylo podrobeno 114 vzorků. Dosažené výsledky z experimentů podle metodiky všech tří firem byly porovnány s výslednými hodnotami histologického vyšetření bioptických vzorků. 4.1
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY DIALAB Hodnoty protilátek IgA a IgG od firmy Dialab byly známy již z předešlých stanovení
před zmražením sér. Výsledné hodnoty byly posouzeny podle toho, jestli je sérum pozitivní, nebo negativní. Cut off hodnota pro obě protilátky IgA i IgG je 30 Abr.j. Na následujícím grafu je zobrazeno, jak protilátky spolu navzájem korelují.
Korelační graf protilátek IgA a IgG od firmy Dialab 420
Protilátky IgG [Abr.j.]
360 300 240
Cut off
180 120 60 0 0
60
120
180
240
300
360
420
480
540
Protilátky IgA [Abr.j.]
Pomocí Excelové funkce CORREL jsem vypočítala korelační koeficient pro hodnocení vztahu protilátek IgA a IgG (0,58). Protilátky spolu dobře korelují.
26
Dále bylo spočítáno: specifita (specificity), citlivost (sensitivity) a přesnost (accuracy) této metody ve třídě IgA. Výsledky jsou patrné níže (Tab. XIII). Tab. XIII Statistické vyhodnocení protilátek IgA v porovnání s histologií (Dialab) Dialab IgA Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 67
FP = 0
Negativní test
FN = 12 79
Přesnost
89,5 %
67
Citlivost
84,8 %
TN = 35
47
Specificita
100 %
35
114
Dále jsou prezentovány podobné výsledky ve třídě protilátek IgG od firmy Dialab (Tab. XIV). Tab. XIV Statistické vyhodnocení protilátek IgG v porovnání s histologií (Dialab) Dialab IgG Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 70
FP = 0
Negativní test
FN = 9 79
Přesnost
92,1 %
70
Citlivost
88,6 %
TN = 35
44
Specificita
100 %
35
114
Jako další výsledky uvádím porovnání protilátek IgA a IgG navzájem od firmy Dialab, kde musí být alespoň jeden vzorek pozitivní (Tab. XV). Tab. XV Statistické vyhodnocení protilátek IgA a IgG současně v porovnání s histologií (Dialab) Dialab IgA/IgG Celiakie ANO
Celiakie NE
Poizitivní test
TP = 74
FP = 0
Negativní test
FN = 5 79
Přesnost
95,6 %
74
Citlivost
93,7 %
TN = 35
40
Specificita
100 %
35
114
Z této tabulky je patrné, že výsledné hodnoty citlivosti, specificity a přesnosti jsou vysoké a také se velmi podobají Inově.
27
4.2
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY INOVA Opět byly posuzovány výsledné hodnoty koncentrací protilátek podle toho, jestli je
sérum pozitivní, nebo negativní. Cut off hodnota pro obě protilátky IgA i IgG byla zvolena na přísnější zóně 20 U. V příloze (Tab. XI) jsou shrnuté výsledky obou protilátek, a i přesto, že jsme cut off hodnotu zvolili přísně na 20 U, v (Tab. XI) jsou pro ilustraci uvedené i slabě pozitivní hodnoty. Na grafu je ukázáno, jak protilátky navzájem korelují.
Korelační graf protilátky IgA a IgG od firmy Inova 220 200
Protilátky IgG [U]
180 160 140 120
Cut off
100 80 60 40 20 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Protilátky IgA [U]
Pomocí Excelové funkce CORREL byl vypočítán korelační koeficient pro hodnocení vztahu protilátek IgA a IgG (0,69). Dále se také posuzovala specificita (specificity), citlivost (sensitivity) a přesnost (accuracy) této metody ve třídě IgA. Výsledky jsou patrné níže (Tab. XVI).
28
Tab. XVI Statistické vyhodnocení protilátek IgA v porovnání s histologií (Inova) Inova IgA Celiakie
Celiakie
ANO
NE
Pozitivní test
92,1 %
TP = 71
FP = 1
72
Citlivost
89,9 %
FN = 8
TN = 34
42
Specificita
97,1 %
Negativní test
Přesnost
79
35
114
Dále jsou prezentovány podobné výsledky ve třídě protilátek IgG od firmy Inova (Tab. XVI). Tab. XVII Statistické vyhodnocení protilátek IgG v porovnání s histologií (Inova) Inova IgG Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 67
FP = 0
Negativní test
FN = 12 79
Přesnost
89,5 %
67
Citlivost
84,8 %
TN = 35
47
Specificita
100 %
35
114
Jako další výsledky uvádím porovnání protilátek IgA a IgG navzájem od firmy Inova, kde musí být alespoň jeden vzorek pozitivní (Tab. XVIII). Tab. XVIII Statistické vyhodnocení protilátek IgA a IgG současně v porovnání s histologií (Inova) Inova IgA/IgG Celiakie ANO
Celiakie NE
Poizitivní test
TP = 76
FP = 1
Negativní test
FN = 3 79
Přesnost
96,5 %
77
Citlivost
96,2 %
TN = 34
37
Specificita
97,1 %
35
114
Z této tabulky je patrné, že výsledné hodnoty citlivosti, specificity a přesnosti jsou hodně vysoké a velmi podobné hodnotám dosažených u firmy Dialab. 29
4.3
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY EUROIMMUN Výsledné hodnoty protilátek byly posouzeny podle toho, jestli je sérum pozitivní, nebo
negativní. Cut off hodnota pro obě protilátky IgA i IgG byla zvolena 25 RU/ml. V příloze (Tab. XII) jsou shrnuté výsledky obou protilátek, a i přesto, že cut off hodnota byla zvolena přísně na 25 RU/ml, v (Tab. XII) jsou pro ilustraci uvedeny i slabě pozitivní hodnoty. Na grafu je ukázáno, jak protilátky IgA a IgG poměrně dobře navzájem korelují.
Korelační graf protilátek IgA a IgG od firmy Euroimmun 450
Protilátky IgG [U/ml]
400 350 300 250
Cut off
200 150 100 50 0 0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
Protilátky IgA [U/ml]
Pomocí Excelové funkce CORREL byl vypočítán korelační koeficient pro hodnocení vztahu protilátek IgA a IgG (0,55). Dále byla také posuzována specifita (specificity), citlivost (sensitivity) a přesnost (accuracy) této metody ve třídě IgA. Výsledky jsou patrné níže (Tab. XIX).
30
Tab. XIX Statistické vyhodnocení protilátek IgA v porovnání s histologií (Euroimmun) Euroimmun IgA Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 57
FP = 11
Negativní test
FN = 22 79
Přesnost
71,1 %
68
Citlivost
72,2 %
TN = 24
46
Specificita
68,6 %
35
114
Dále jsou prezentovány podobné výsledky ve třídě protilátek IgG od firmy Euroimmun (Tab. XXI). Tab. XXI Statistické vyhodnocení protilátek IgG v porovnání s histologií (Euroimmun) Euroimmun IgG Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 58
FP = 11
Negativní test
FN = 21 79
Přesnost
71,9 %
69
Citlivost
73,4 %
TN = 24
45
Specificita
68,6 %
35
114
Jako další výsledky uvádím porovnání protilátek IgA a IgG navzájem od firmy Euroimmun, kde musí být alespoň jeden vzorek pozitivní (Tab. XXI). Tab. XXI Statistické vyhodnocení protilátek IgA a IgG současně v porovnání s histologií (Euroimmun) Euroimmun IgA/IgG Celiakie ANO
Celiakie NE
Poizitivní test
TP = 66
FP = 12
Negativní test
FN = 13 79
Přesnost
78,1 %
78
Citlivost
83,5 %
TN = 23
36
Specificita
65,7 %
35
114
Z této tabulky je patrné, že v porovnání s Dialabem a Inovou jsou výsledné hodnoty ctlivosti, specificity a přesnosti podstatně nižší.
31
4.2
VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FIRMY INOVA Pro celkové porovnání výsledných hodnot citlivosti, specificity a přesnosti uvádím
přehlednou tabulku (Tab. XXII). Tab. XXII Porovnání statistických výsledků všech tří firem Přesnost
Citlivost
Specifiita
dIgA (Dialab IgA)
89,5 %
84,8 %
100 %
iIgA (Inova IgA)
92,1 %
89,9 %
97,1 %
eIgA (Euroimmun IgA)
71,1 %
72,2 %
68,6 %
dIgG (Dialab IgG)
92,1 %
88,6 %
100 %
iIgG (Inova IgG)
89,5 %
84,8 %
100 %
eIgG (Euroimmun IgG)
71,9 %
73,4 %
68,6 %
dIgA/IgG (Dialab IgA/IgG)
95,6 %
93,7 %
100 %
iIgA/IgG (Inova IgA/IgG)
96,5 %
96,2 %
97,1 %
eIgA/IgG (Euroimmun IgA/IgG)
78,1 %
83,5 %
65,7 %
Z tabulky je patrné, že nejlepší výsledky vykazují firmy Inova a Dialab, zatímco Eurimmun vykazuje o něco horší výsledky. Inova dosahuje nejlepších výsledků přesnosti u společného hodnocení protilátek IgA a IgG (96,5 %), i když oproti Dialabu jen nepatrně (95,6 %). Euroimmun vykazuje přesnost jen 78,1 %.
32
4.4.1
Korelační grafy Dále bylo zajímavé zjistit, zda spolu protilátky stejné třídy, ale dvou různých firem,
vzájemně korelují. Na následujícím grafu je znázorněno porovnání protilátek třídy IgA od firem Dialab (osa x) a Euroimmun (osa y). Excelevskou funkcí CORREL byl vypočítán korelační koeficient (0,23) který naznačuje, že protilátky spolu moc dobře nekorelují. Korelační graf protilátek třídy IgA Dialab/Euroimmun 350 325 300 275
Protilátky e IgA
250 225 200
Cut off
175 150 125 100 75 50 25 0 0
30
60
90
120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540
Protilátky d IgA
Další graf vyobrazuje korelaci protilátek IgA od firem Dialab (osa x) a Inova (osa y). Již na grafu je dobře vidět, že protilátky spolu významně korelují. Potvrzuje to i vypočítaný korelační koeficient (0,73). Korelační graf protiláte k třídy IgA Dialab/Inova 200 180
Protilátky i IgA [U]
160 140 120
Cut off
100 80 60 40 20 0 0
30
60
90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540
Protilátky d IgA [Abr.j.]
33
Také jsme vzájemnou korelaci hodnotili u protilátek IgA firem Inova (osa x) a Euroimmun (osa y). Protilátky spolu moc dobře nekorelují, vypočítaný korelační koeficient je roven 0,24. Korelační graf protilátek třídy IgA Inova/Euroimmun 225 200
Protilátky e IgA[U/ml]
175 150 125
Cut off
100 75 50 25 0 0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
Protilátky i IgA [U]
Korelační grafy jsou znázorněny i pro protilátky IgG, na kterých se opět potvrdilo, že firmy Dialab a Euroimmun spolu moc dobře nekorelují. Korelační koeficient v porovnání s protilátkami IgA (0,23), je u protilátek IgG je nepatrně větší (0,28), ale přesto stále nízký. Korelační graf protilátek třídy IgG Dialab/Euroimmun 450
Protilátky e IgG [U/ml]
400 350 300 250
Cut off
200 150 100 50 0 0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
Protilátky d IgG [Abr.j.]
34
300
330
360
390
420
Dobrá korelace protilátek IgG u firem Dialab a Inova se potvrdila v následujícím grafu. Hodnota korelačního koeficientu je o trochu nižší, ale přesto významná (0,67). Korelační graf protilátek třídy IgG Dialab/Inova 220 200
Protilátky i IgG [U]
180 160 140 120
Cut off
100 80 60 40 20 0 0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
Protilátky d IgG [Abr.j]
Z posledního grafu, je patrné, že protilátky IgG od firem Inova a Euroimmun spolu příliš dobře nekorelují, ale korelační koeficient je o trochu vyšší (0,36) oproti protilátkám IgA (0,24) Korelační graf protilátek třídy IgG Inova/Euroimmun 450
Protilátky e IgG [U/ml]
400 350 300 250
Cut off
200 150 100 50 0 0
20
40
60
80
100
120
Protilátky i IgG [U]
35
140
160
180
200
220
4.5
POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ ANTIGLIADNINOVÝCH PROTILÁTEK S DALŠÍMI
DIAGNOSTICKY VYŠETŘOVANÝMI PROTILÁTKAMI V diagnostice celiakie se kromě protilátek ke gliadinu měří i protilátky ke tkáňové transglutminase a endomysiální protilátky (EMA). Výsledné hodnoty protilátek ke tkáňové transglutaminase a EMA protilátky byly známy již před zmražením sér. V tabulkách
(Tab.
XXIII,
XXIV)
uvádím
výsledné
hodnoty,
vypočtené
z kontingenčních tabulek, protilátek ke tkáňové transglutaminase a EMA. Tyto protilátky vykazují 100 % specificity a vykazují i velmi dobrou citlivost a přesnost v diagnostice onemocnění celiakie. Tab. XXIII Statistické vyhodnocení protilátek IgA tTG v porovnání s histologií Dialab IgA tTG Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 71
FP = 0
Negativní test
FN = 8 79
Přesnost
93 %
71
Citlivost
89,9 %
TN = 35
43
Specificita
100 %
35
114
Tab. XXIV Statistické vyhodnocení protilátek EMA v porovnání s histologií BioSystems EMA Celiakie ANO
Celiakie NE
Pozitivní test
TP = 66
FP = 0
Negativní test
FN = 13 79
Přesnost
88,6 %
66
Citlivost
83,5 %
TN = 35
48
Specificita
100 %
35
114
36
Pro lepší interpretaci je zde ještě uvedena (Tab. XXV), která představuje porovnání výsledných hodnot specificity, citlivosti a přesnosti všech naměřených hodnot. Tab. XXV Porovnání statistických výsledků naměřených veličin Přesnost
Citlivost
Specifiita
dIgA (Dialab IgA)
89,5 %
84,8 %
100 %
iIgA (Inova IgA)
92,1 %
89,9 %
97,1 %
eIgA (Euroimmun IgA)
71,1 %
72,2 %
68,6 %
dIgG (Dialab IgG)
92,1 %
88,6 %
100 %
iIgG (Inova IgG)
89,5 %
84,8 %
100 %
eIgG (Euroimmun IgG)
71,9 %
73,4 %
68,6 %
EMA
88,6 %
83,5 %
100 %
tTG IgA
93 %
89,9 %
100 %
dIgA/IgG (Dialab IgA/IgG)
95,6 %
93,7 %
100 %
iIgA/IgG (Inova IgA/IgG)
96,5 %
96,2 %
97,1 %
eIgA/IgG (Euroimmun IgA/IgG)
78,1 %
83,5 %
65,7 %
Z tabulky (Tab. XXV) je patrné, že nejlepších výsledků dosahují protilátky ke tkáňové transglutaminase. Pokud se ovšem porovnají výsledné hodnoty tkáňové transglutaminasy s hodnotami současně hodnocených protilátek IgA a IgG k deaminovaným peptidům, nejlepší výsledky pak vykazuje firma Inova. Nejvyšší hodnoty jsou v tabulce znázorněny červeně. Výsledky všech osmi naměřených parametrů (posouzení pozitivity nebo negativity protilátek IgA a IgG od firem Dialab, Inova, Euroimmun, protilátky proti tkáňové transglutaminase a endomysiální protilátky) byly podrobeny korespondenční analýze. Zjistilo se, že všechny testované protilátky spolu navzájem korelují (96,25 %). Na následujícím grafu korespondenční analýzy je patrné, že popis souboru pacientů příslušnými parametry je velmi dobrý. Parametry jsou shlukovány do dvou hlavních shluků, které tvoří pozitivní (poz) a negativní (neg) testy. Mírně se odlišují pouze tři parametry. Jedná se o slabě pozitivní vzorky (wpoz). Korespondenční analýza tedy potvrdila, že není rozdílu mezi jednotlivými testovacími soupravami.
37
Symmetric variable plot (axes F1 and F2: 96,25 %) 1 iIgA-wpoz iIgG-poz eIgA-poz eIgG-poz dIgG-poz EMA-poz atTG-poz
eIgG-neg eIgA-neg iIgG-neg dIgA-neg
0
F2 (2,36 %)
iIgA-poz dIgA-poz
EMA-neg atTG-neg iIgA-neg dIgG-neg
-1
eIgA-wpoz
-2
-3 iIgG-wpoz eIgG-wpoz -4 -6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
F1 (93,90 %) Variables
Dále byla data podrobena shlukovací analýze. Data jsou řazena v (Tab. XXVI). Shlukovací analýza potvrdila výsledky vícerozměrné korespondenční analýzy, není rozdílu mezi jednotlivými testy pro negativní a pozitivní vzorky. Tab. XXVI Shlukovací analýza Class
1
2
3
4
Objects
8
8
2
2
dIgA-neg
dIgA-poz
eIgA-wpoz
eIgG-wpoz
dIgG-neg
dIgG-poz
iIgA-wpoz
iIgG-wpoz
eIgA-neg
eIgA-poz
eIgG-neg
eIgG-poz
iIgA-neg
iIgA-poz
iIgG-neg
iIgG-poz
atTG-neg
atTG-poz
EMA-neg
EMA-poz
38
39 iIgA-wpoz
eIgA-wpoz
EMA-poz
atTG-poz
dIgA-poz
iIgA-poz
iIgG-poz
dIgG-poz
eIgG-poz
eIgA-poz
eIgG-neg
eIgA-neg
iIgA-neg
dIgG-neg
EMA-neg
atTG-neg
iIgG-neg
dIgA-neg
iIgG-wpoz
eIgG-wpoz
Dissimilarity
Na následujícím grafu je znázorněn dendrogram graficky potvrzující výsledky
shlukovací analýzy, tj. rozdělení parametrů do čtyř skupin.
Dendrogram
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
5.
DISKUSE Deaminované gliadinové peptidy firmy Inova dosahují lepších výsledků než používaný
α-gliadin firmy Dialab. Tento pokus je v souladu s výsledky Volta a kol. (2007), který uvádí, že v jejich pokusu (který byl proveden v souladu s naším pokusem) výsledné hodnoty citlivosti a přesnosti deaminovaných gliadinových peptidů (Inova Diagnostics) jsou vyšší v porovnání s purifikovaným α-gliadinem (α-gliadin IgA a IgG; Eurospital, Trieste, Italy). Autoři použili také séra od dospělých pacientů (průměrný věk pacientů v době diagnosy byl 35 let). V této studii autoři hodnotí používání deaminovaných peptidů gliadinu jako dobrý pomocný test v diagnostice celiakie. Skupina amerických vědců z Minnesoty uvádí opět podobné výsledky obdobného pokusu. Ve svém pokusu porovnávali ELISA sety používající deaminované peptidy (Inova Diagnostics) s antigliadinovými protilátkami (Scimedx). Analýzu prováděli opět se séry získanými od dospělých pacientů. Ve svých výsledcích uvádějí, že protilátky proti deaminovaným gliadinovým peptidům jsou lepším diagnostickým testem celiakie než užívané antigliadinové protilátky. I přesto histologické vyšetření bioptického vzorku střevní sliznice stále zůstává zlatým standardem diagnostiky celiakie (Rashtak a kol., 2008). Firma Euroimmun provedla studii, ve které porovnávala deaminované gliadinové peptidy (GAF-3X) s antigliadinovými protilátkami v obou třídách IgA i IgG. Výsledné hodnoty (GAF-3X) dosahovaly 95,2 % specificity IgA a 97,2 % specificity IgG (Euroimmun, internetový odkaz). Takových výsledků v naší práci nebylo dosaženo.
40
6.
ZÁVĚR Je možné konstatovat, že deaminované gliadinové peptidy mohou zvyšovat citlivost a
přesnost sérologického vyšetření celiakie (Vaníčková a kol., 2008). Firma Inova používá deaminované gliadinové peptidy, které vykazují lepší výsledky sérologického stanovení celiakie než purifikovaný α-gliadin používaný firmou Dialab. Firma Euroimmun vynalezla deaminované gliadinové peptidy (GAF-3X), které v tomto pokusu vykazují horší výsledky v porovnání s Inovou a Dialabem.
41
7.
LITERATURA
Abrol Y.P., Uprety D.C., Ahuja V.P., Naik M.S., (1971), Soil fertility levels and protein quality in wheat grains, Australian Journal Agriculture Reseach, 22: 197-202 Alaedini A., Green P.H., (2005), Narrative review: celiac disease: understanding a complex autoimmune disorder, Annals of Internal Medicine, 142: 289–298 Bethune M.T., Strop P., Tang Y., Sollid L.M., Khosla Ch., (2006), Heterologous Expression, Purification, Refolding and Structural-Funnctional Characterization of EP-B2, a SelfActivating Barley Cysteine Endoprotease, Chemistry & Biology, 13: 637-647 Briani Ch., Samaroo D., Alaedini A., (2008), Celiac disease: From gluten to autoimmunity, Autoimmunity Reviews, 7: 644-650 Burkhard M., (2006), Imunochemické vlastnosti protaminů a jejich analytické využití, souhrn disertační práce Carchon H., Serrus M. , Eggermont E., (1979), Digestion of Gliadin Peptides by Intestinal Mucosa from Control or Coeliac Children, Digestion, 19: 1-5 ELISA Technology http://www.genwaybio.com/gw_file.php (21 .4 . 2009) Elliot D., http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Students/spring2006/Mohr/Villi%20Atrop hy.jpg (22. 3. 2009) Euroimmun, http://www.euroimmunus.com/fileadmin/template/images/pdf/GAF_3X_UK.pdf (28.4.2009)
42
Fasano A., Shea-Donohue T., (2005), Mechanisms of Disease: the role of intestinal barrier function in the pathogenesis of gastrointestinal autoimmune diseases, Nature Clinical Practise Gastroenterology & Hepatology, 2: 416-422 Fukal L., Holubová B., (2007), Imunochemie a imunoanalýza, 61-62 Gasbarrini G., Malandrio N., Giorgio V., Fundaró C., Cammarota G., Merra G., Toccatina D., Gasbarrini A., Caristo E., (2008), Celiac desease: what´s new about it?, Epub 26(2): 121-127 Green P.H., Moshe R., (2006) Capsule Endoscopy in Celiac Disease: Diagnosis and Management, Gastrointestinal Endoscopy Clinics, 16: 307-316 van Heel D.A., West J., (2006) Recent advances in coeliac disease, Gut, 55: 1037-1046 Kasarda D.D, Grains in relation to Celiac Disease http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/topics/celiac.html (23. 4. 2009) Kasarda D.D., (1980), Structure and properties of alpha-gliadins, Annual Technologic Agriculture, 29: 151-173 Kocna P., Gastrolab – Miniencyklopedie laboratorních metod v gastroeneterologii, http://www1.lf1.cuni.cz/~kocna/glab/glency1.htm (18. 3. 2009) Kohout P., (2007), Celiakie v ambulantní praxi, Medicína Pro Praxi, 6: 250–252 Kohout P., (2006), Diagnostika a léčba celiakie, Interní Medicína, 7;8: 324–326 Lapid N., (2008), A Celiac Disease Diagnosis Requiers Blood Test And Biopsy, Medical Review Board Liu E., Li M., Emery L., Taki I., Barriga K., Tiberti C., Eisenbarth G.S., Rewers M.J., Hoffenberg E.J., (2007), Antibodies to Deaminated Gliadin Peptides and Transglutaminase in
43
Early Childhood Celiac Disease, Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 45: 293-300 Marsh M. N., (2000), Celiac Disease Methods and Protocols, 1. Marsh M.N., (1992), Gluten, major histocompatibility complex, and the small intestine. A molecular and immunobiologic approach to the spectrum of gluten sensitivity (celiac sprue), Gastroenterology, 102: 330-354 Palacios S.M., Riveso M.A., SanchezValverde V.F., Feijoo B.E, Ramos A.M., Olivera O.J., García M.S., (2000), Transglutaminase antibody: usefulness in the diagnosis of celiac disease, Analys Espaňoles Pediatra, 53: 542-546 Paterson B.M., Lammers K.M., Arrieta M.C., Fasano A., Meddings J.B., (2007), The safety, tolerance, pharmacokinetic and pharmacodynamic effect of single doses of AT-1001 in coeliac disease subjects: a proof of concept study, Alimentary Pharmacology & Therapeutics, 26: 757-766 Payne P.I., Holt L.M. and Law C.N., (1981), Structural and genetic studies on the highmolecular-weight subunits of wheat glutenins, Part I. Allelic variation in subunits amongst varieties of wheat (Triticum aestivum), Theoretical Applied Genetics, 60: 229-236 Pietzak M.M., (2005) Follow-up of Patiens With Celiac Disease: Achieving Compliance With Treatment, Gastroenterology, 128:135-141 Prause C., Probst C., Daehnrich C., Schlumberger W., Stoecker W., Richter T., Hauer A.C., SternM., Uhlig H., Laas M., Zimmer K.P., Mothes T., (2008), Antibodies against deamidated gliadin peptides as highly valid biomarkers of childhood celiac disease, poster Presutti R.J., Cangemi J.R., Cassidy H.D., Hill D.A., (2007), Celiac disease, American Family Physician, 76: 1795-1802
44
Presutti R.J., Cangemi J.R., Cassidy H.D., Hill D.A., (2007), Celiac disease, American Family Physician, 76: 1809-1810 Program XLSTAT, Addinsoft 2008, www.xlstat.com Prince H.E., (2006), Evaluation of the INOVA Diagnostic Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulin G (IgG) and IgA to Deaminated Gliadin Peptides, Clinical and Vaccine Immunology, 13: 150-151 Rashtak S., Ettore M.W., Homburger H.H., Murray J.A., (2008), Comperative usefulness of deamidated gliadin antibodies in the diagnosis of celiac disease., Clinical Gastroenterology and Hepatology, 6: 426-432 Salentijn E.M.J., Goryunova S.V., Bas N., van der Meer I.M., van der Broeck H.V., Bastien T., Gilissen L.J., Smudlers M.J., (2009), Tetraploid and hexaploid wheat varieties reveal large differences in expression of alpha- gliadins from homoeologous Gli-2 loci, BMC Genomics, 10: 48 Schneiderka P. a kol., (2004), Kapitoly z klinické biochemie, 2.doplněné a přepracované vydání, Karolinum, Praha (http://ukb.lf1.cuni.cz/vyuka/textbook.php) 5. 3. 2009 Sollid L.M., Khosla Ch., (2005), Future therapeutic options for celiac disease, Nature Clinical Practise Gastroenterology & Hepatology, 2: 140-147 Sollid L.M., Lie B.A., (2005), Celiac disease genetics: current concepts and practical applications, Clinical Gastroenterology and Hepatology, 3: 843–851 Treem W.R., (2004), Emerging concepts in celiac disease, Current Opinion Pediatrics, 16: 552–559 Vaníčková Z., Kocna P., Topinková K., Dvořák M., (2008), Deamidated gliadin peptides in coeliac disease diagnostics, Gut, 57; suppl. II, A228-P0615
45
Volta U., Granito A., Fiorini E., Parisi C., Piscaglia M., Pappas G., Muratori P., Bianchi F.B., (2007), Usefulness of Antibodies to Deamidated Gliadin Peptides in Celiac Disease Diagnosis and Follow-up, Digestive Diseases and Sciences, 53: 1582-1588 Wikipedie, http://en.wikipedia.org/wiki/File:CoeliacDisease.png (14. 4. 2009) Woychick J.H., Boundy J. A. and Dimler R. J., (1961), Starch gel electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea, Archives of Biochemistry Biophysics 94: 477-482
46
8.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
Abr.j.
arbitrární jednotky
AGA
protilátky proti gliadinu
APC
buňka prezentující antigen
atTG
protilátky proti tkáňové transglutaminase
CA
korespondenční analýza
CD8+
receptor T buněk
DGP
deaminované gliadinované peptidy
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
EMA
protilátky proti endomysiu
ESPGHAN
European society for paediatrics gastroenterology, hepatology and nutrition
GAF-3X
gliadin analogous fusion peptide
HLA
lidské leukocytární antigeny
HLA DQ2
lidské leukocytární antigen DQ2
HLA DQ8
lidské leukocytární antigen DQ8
IFN
interferon
IgA
protilátka-imunoglobulin třídy A
IgG
protilátka-imunoglobulin třídy G
MCA
multivariační korespondenční analýza
NASPGHAN North American Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition PEP
propyl endopeptidasy
RU
relative units
TCR
T-receptor
TMB
Tetramethylbenzidin
TNF
tumor necrosis factor
tTG
tkáňová transglutaminasa
U
units
47
9.
PŘÍLOHY
Tabulka (Tab. XII) Vysvětlivky: DGP
deaminované gliadinové peptidy
VZ
vzorek séra
Poh
pohlaví pacienta, od kterého byl odebrán vzorek
Věk
věk pacienta v době diagnosy
Datum dg
datum provedení diagnosy
Histol.
histologické posouzení patogeneze onemocnění
EMA
endomysiální protilátky (BioSystems)
atTG
protilátky proti tkáňové transglutaminase (Dialab) [U/ml]
dIgA
protilátky proti gliadinu třídy IgA (Dialab) [U/ml]
dIgG
protilátky proti gliadinu třídy IgG (Dialab) [U/ml]
dIgA/IgG
porovnání protilátek proti gliadinu IgA a IgG navzájem (Dialab) [U/ml]
eIgA
protilátky proti DGP třídy IgA (Euroimmun) [RU/ml]
eIgG
protilátky proti DGP třídy IgG (Euroimmun) [RU/ml]
eIgA/IgG
porovnání protilátek proti DGP IgA a IgG navzájem (Euroimmun)[RU/ml]
iIgA
protilátky proti DGP třídy IgA (Inova) [U]
iIgG
protilátky proti DGP třídy IgG (Inova) [U]
iIgA/IgG
porovnání protilátek proti DGP IgA a IgG navzájem (Inova) [U]
w+
weak positive – slabě pozitivní
+
pozitivní
-
negativní
CSF
celiakální sprue fluoridní-pozitivní na celiakii
CSR
celiakální sprue remise-celiakie v remisi
N
negativní na celiakii
48
Tab. XII Celkové výsledky analýzy VZ Poh. Věk 1 m 19 2 m 51 3 f 46 4 m 46 5 f 45 6 f 26 7 f 52 8 f 49 9 f 25 10 f 28 11 f 52 12 f 55 13 m 32 14 f 47 15 f 53 16 f 27 17 f 44 18 f 53 19 m 61 20 f 44 21 f 44 22 f 48 23 f 48 24 f 26 25 m 23 26 m 24 27 m 49 28 m 24 29 f 61 30 m 34 31 m 72 32 f 25 33 f 56 34 f 19 35 f 23 36 f 24 37 f 28 38 f 35 39 m 25 40 m 23 Cut off
Datum Dg. Histol. CSF 24.2.1998 CSF 30.6.1998 CSF 31.7.1998 CSF 24.9.1998 CSF 24.9.1998 CSF 6.10.1998 CSF 6.10.1998 22.10.1998 CSF 17.11.1998 CSF 25.11.1998 CSF CSF 2.12.1998 N 20.1.1999 CSR 21.5.1999 CSF 8.6.1999 N 11.6.1999 N 30.6.1999 CSF 15.9.1999 CSF 17.9.1999 CSF 20.9.1999 CSF 29.9.1999 22.10.1999 CSF CSF 8.11.1999 CSF 8.11.1999 CSF 18.2.2000 CSF 25.2.2000 CSF 25.2.2000 N 6.3.2000 CSF 18.4.2000 CSF 18.4.2000 N 9.5.2000 CSR 26.5.2000 N 19.1.2001 CSF 19.1.2001 N 31.1.2001 N 9.2.2001 N 26.2.2001 N 26.2.2001 N 28.3.2001 N 23.4.2001 N 21.6.2001
EMA + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
atTG 30,1 36,1 111,8 41,9 330,0 150,0 52,1 1,6 28,3 134,1 35,6 0,5 15,0 190,0 2,3 0,0 204,7 67,7 58,4 241,7 73,2 75,8 94,5 42,5 262,0 161,0 2,0 95,5 265,0 4,2 10,9 0,0 17,0 0,0 1,4 3,1 0,0 2,3 0,0 4,4 10
atTG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
dIgA 43,1 249,4 121,8 62,9 502,1 197,4 170,8 22,9 118,7 305,4 143,6 16,6 62,2 222,5 15,7 1,9 198,8 97,6 13,3 151,1 95,2 68,6 76,4 31,0 72,0 34,0 23,0 31,0 300,0 6,9 75,0 20,0 31,0 6,9 6,8 5,0 12,0 9,9 7,0 8,3 30
dIgG 106,3 120,9 127,0 87,3 165,6 101,6 120,1 110,9 38,5 125,9 113,4 21,6 103,0 119,7 20,5 27,5 105,7 102,8 24,1 111,5 87,7 57,0 57,1 44,0 85,0 100,0 23,0 94,0 85,0 30,0 27,0 7,5 65,0 17,0 30,0 22,0 11,0 8,3 16,0 24,0 30
dIgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
eIgA 59,7 132 337 53,1 334 0 8,96 81,2 337 324 256 1,51 63,3 51,1 1,13 0 16,9 274 4,9 154 336 91,7 0 63,9 21,4 332 10,5 45 54,4 0 123 6,62 89 0 0,797 0 3,33 61,8 198 1,13 25-50
49
eIgA + + + + + + + + + + + + + + + + + w+ + + + + + -
eIgG 239 0 122 112 396 142 275 272 55,5 342 213 0 59 266 0 13,7 216 253 4,01 222 81,4 0 0,374 47,7 56,9 89,1 0 227 124 0 13,8 0 44,9 0 21,2 0 16,9 79 378 0 25-50
eIgG + + + + + + + + + + + + + + + + w+ + + + + w+ + + -
E IgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
iIgA 73,0 22,2 137,1 30,0 161,1 161,9 29,9 5,5 159,8 189,0 189,9 17,6 12,4 161,0 11,7 5,4 162,8 29,4 15,9 164,9 51,8 155,9 86,8 54,7 133,0 25,3 17,8 13,2 16,1 12,5 18,7 6,5 33,4 5,4 4,1 3,8 5,9 4,6 14,0 10,0 20-30
iIgA + w+ + w+ + + w+ + + + + + w+ + + + + + + w+ + -
iIgG 112,0 6,8 67,8 32,5 213,1 78,9 146,2 4,1 35,3 113,8 43,8 7,5 6,0 139,3 4,2 8,2 113,3 53,9 18,7 118,0 46,4 5,3 7,7 30,6 35,5 50,1 2,4 122,4 68,3 6,2 8,0 2,6 53,2 2,3 2,1 2,3 2,4 2,4 3,9 3,8 20-30
iIgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
I IgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
VZ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Tab. XII Celkové výsledky analýzy VZ Poh. Věk 41 m 56 42 f 25 43 f 34 44 m 53 45 f 44 46 m 20 47 f 21 48 f 23 49 f 56 50 f 43 51 f 38 52 f 32 53 f 31 54 f 73 55 f 50 56 f 30 57 f 36 58 m 25 59 m 36 60 f 68 61 f 26 62 f 59 63 m 63 64 f 39 65 f 75 66 f 44 67 m 67 68 f 21 69 m 41 70 m 41 71 f 36 72 f 41 73 f 27 74 f 42 75 m 26 76 f 33 77 f 47 78 f 62 79 f 24 80 f 56 Cut off
Datum Dg. Histol. CSF 21.6.2001 N 28.6.2001 N 25.9.2001 N 25.9.2001 N 25.9.2001 N 4.10.2001 10.10.2001 CSF N 17.10.2001 CSF 1.11.2001 N 13.12.2001 27.12.2001 CSF CSF 7.3.2002 N 7.3.2002 CSF 7.3.2002 N 16.4.2002 N 16.4.2002 CSF 16.4.2002 N 16.4.2002 N 24.4.2002 N 27.5.2002 CSR 14.6.2002 CSF 14.6.2002 CSF 26.8.2002 23.9.2002 CSF N 23.9.2002 N 1.10.2002 N 1.10.2002 CSR 1.10.2002 N 11.10.2002 N 29.11.2002 N 31.12.2002 N 10.2.2003 N 10.4.2003 N 11.4.2003 CSF 11.4.2003 CSF 2.5.2003 CSF 13.2.2004 CSF 23.2.2004 CSF 23.2.2004 CSF 27.2.2004
EMA + + + + + + + + + + + + + + + +
atTG 53,6 0,0 0,0 7,0 0,0 6,8 164,8 0,0 156,0 2,4 196,0 227,0 3,9 233,0 1,3 1,4 268,0 1,8 3,0 1,6 15,2 155,0 180,0 320,1 1,4 3,0 1,5 21,7 6,0 5,8 2,0 9,7 1,7 0,0 48,2 296,7 311,6 299,4 172,0 32,9 10
atTG + + + + + + + + + + + + + + + + + +
dIgA 22,0 18,0 6,6 8,5 5,9 11,0 110,0 10,0 190,0 14,0 54,0 38,5 5,1 238,0 2,5 7,0 288,0 3,4 28,6 1,4 14,4 125,0 349,9 354,5 5,5 17,2 4,3 86,9 9,8 10,7 6,5 25,7 14,0 1,5 23,8 54,0 365,3 386,1 43,5 67,00 30
dIgG 14,0 6,0 12,0 6,0 24,0 22,0 68,0 16,0 120,0 16,0 100,0 79,7 17,4 220,0 1,6 4,0 123,0 3,8 11,3 1,3 110,0 87,8 90,6 314,1 1,7 9,2 2,0 41,8 17,7 19,2 1,6 8,6 23,7 0,0 15,0 27,4 70,6 121,0 38,6 47,00 30
dIgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + +
eIgA 57,9 6,14 84,3 162 0 0 122 68,7 0 8,01 328 321 65,7 0 21 320 129 29 0 0 23,9 325 13,7 55,7 280 317 0 324 5,83 0 1,08 0 19,9 335 22,4 15,1 264 304 0 44 25-50
50
eIgA + + + + + + + + + + w+ + + + + + + + + w+
eIgG 194 1,2 207 203 0 0 216 224 0 69,3 210 225 116 0 0 116 86 27,2 1,96 0 76,6 278 0 64,2 174 248 0 128 19,1 3,86 0 0 18,5 0 70,2 38,4 66,9 154 0 15,3 25-50
eIgG + + + + + + + + + + + w+ + + + + + + + w+ + + -
E IgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
iIgA 40,1 6,1 5,7 11,6 7,5 8,6 127,9 4,4 184,3 36,0 74,8 13,0 5,4 185,9 2,9 2,6 85,8 5,1 5,9 4,4 83,1 183,9 189,5 189,6 8,5 10,4 12,8 185,8 8,1 4,9 8,6 8,0 12,8 4,7 44,2 135,9 153,7 187,6 167,1 46,8 20-30
iIgA + + + + + + + + + + + + + + + + + +
iIgG 25,3 2,6 2,8 4,1 2,5 3,5 17,5 2,5 55,9 3,3 39,1 8,6 2,5 88,1 2,0 1,8 46,5 2,1 2,1 2,0 45,9 80,9 72,9 127,8 2,5 2,5 3,2 146,1 2,4 2,5 2,1 2,7 16,5 2,3 42,4 26,7 115,2 145,5 139,6 9,6 20-30
iIgG w+ + + + + + + + + + + w+ + + + -
I IgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + +
VZ 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
Tab. XII Celkové výsledky analýzy VZ Poh. 81 f 82 f 83 f 84 f 85 m 86 f 87 f 88 f 89 f 90 f 91 m 92 f 93 m 94 f 95 f 96 f 97 f 98 f 99 f 100 f 101 f 102 f 103 m 104 f 105 m 106 f 107 f 108 f 109 f 110 m 111 f 112 f 113 m 114 f 115 f 116 f 117 f 118 f 119 m 120 f Cut off
Věk 23 26 45 48 27 28 24 29 39 25 46 56 46 52 25 61 44 32 21 21 33 26 40 31 55 25 20 51 36 56 34 74 52 49 41 52 24 50 23 50
Datum Dg. Histol. CSF 29.3.2004 CSF 2.4.2004 CSF 2.4.2004 CSF 26.4.2004 CSF 26.4.2004 CSF 12.5.2004 CSF 2.6.2004 CSF 24.6.2004 CSF 25.6.2004 CSF 1.7.2004 CSF 20.7.2004 CSF 24.9.2004 CSF 24.9.2004 18.10.2004 CSF 25.10.2004 CSF 25.10.2004 CSF 29.12.2004 CSF CSF 28.1.2005 CSF 10.2.2005 CSF 7.4.2005 CSF 28.4.2005 CSF 6.6.2005 CSF 15.7.2005 CSR 15.7.2005 CSF 23.9.2005 CSF 27.9.2005 CSF 27.9.2005 CSF 3.11.2005 CSF 2.12.2005 CSF 12.1.2006 CSF 12.1.2006 CSF 2.2.2006 CSF 2.2.2006 CSF 22.2.2006 CSF 10.3.2006 CSF 19.5.2006 CSR 7.9.2006 CSF 14.9.2006 CSF 4.1.2007 14.10.2002 CSF
EMA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
atTG 1,4 257,4 272,7 181,0 75,0 77,9 190,0 254,2 211,1 92,6 65,9 58,8 4,8 218,3 43,2 6,8 66,2 36,1 228,4 222,0 132,0 0,6 222,7 19,2 169,0 32,2 203,9 119,0 235,8 34,3 178,0 7,1 38,4 212,5 214,1 3,8 83,5 201,0 55,9 4,7 10
atTG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
dIgA 34,70 310,20 296,30 282,70 74,60 20,50 350,00 250,00 44,40 13,20 302,10 168,00 60,00 296,40 36,30 48,40 238,00 124,00 366,30 278,90 29,50 31,40 263,70 12,70 38,30 76,30 27,80 279,00 275,26 25,90 32,70 68,00 30,60 255,64 105,00 17,20 24,90 273,10 14,40 15,6 30
dIgG dIgA/IgG 11,00 + 286,80 + 162,00 + 143,00 + 270,76 + 34,30 + 363,00 + 250,00 + 29,20 + 76,20 + 233,00 + 55,50 + 239,00 + 159,00 + 166,00 + 53,80 + 62,50 + 290,90 + 255,00 + 325,00 + 115,00 + 74,00 + 92,30 + 69,00 + 125,00 + 238,00 + 386,00 + 167,00 + 311,90 + 182,00 + 134,00 + 342,90 + 13,90 + 254,44 + 362,33 + 23,80 303,18 + 245,00 + 14,40 113,0 + 30
eIgA 64,3 35,5 276 0 318 323 270 245 60 80 39,5 7,53 65 43 268 29,2 230 135 266 4,47 28,1 62,6 234 238 0 265 261 56,5 2,52 44,5 17,2 21,6 16,7 225 0 30,9 250 0 27 308 25-50
51
eIgA + + + + + + + + + w+ + w+ + w+ + + + w+ + + + + + + w+ + w+ + w+ +
eIgG 42,5 58,1 136 0 11 397 71,5 118 31,5 97 122 0 163 67,9 297 40,3 90,4 191 413 8,64 0 68,7 89 182 1,2 446 283 17,6 0 128 91,6 239 3,49 145 0 0 272 278 14,8 119 25-50
eIgG w+ + + + + + w+ + + + + + w+ + + + + + + + + + + + + + + +
E IgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
iIgA 6,5 192,5 188,8 190,2 56,8 152,6 190,0 153,7 153,4 47,0 68,7 103,5 27,3 129,0 62,3 13,1 155,7 155,3 153,0 123,7 109,8 6,2 145,8 25,7 64,9 88,8 72,0 157,2 119,8 45,5 106,0 165,2 122,4 158,0 76,2 23,4 106,2 159,4 26,8 24,4 20-30
iIgA + + + + + + + + + + + w+ + + + + + + + + w+ + + + + + + + + + + + w+ + + w+ w+
iIgG 27,9 78,2 150,2 154,7 68,2 88,3 163,6 143,1 22,6 32,3 27,5 41,9 87,2 86,3 91,5 26,9 15,9 130,7 63,9 140,6 94,5 41,8 27,8 9,9 33,8 26,1 79,9 107,3 81,5 31,1 49,2 127,9 9,8 51,6 90,7 4,6 145,2 151,9 14,6 67,7 20-30
iIgG w+ + + + + + + + w+ + w+ + + + + w+ + + + + + w+ + w+ + + + + + + + + + + +
I IgA/IgG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
VZ 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
