Listeria monocytogenes
Jarmila Pazlarová Ústav biochemie a mikrobiologie FPBT, VŠCHT
Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 ze dne 15.11. 2005 o mikrobiologických kriteriích pro potraviny
• Platnost od 1.1.2006 • • • • • •
Salmonella sp. Listeria monocytogenes Enterobacter sakazakii Escherichia coli – indikátor fekálního znečistění Koagulázopozitivní stafylokoky Enterobacteriacae
Kriteria bezpečnosti potravin • Potraviny určené k přímé spotřebě pro kojence a potraviny určené k přímé spotřebě pro zvláštní léčebné účely • Nepřítomnost v 25 g EN/ISO 11290-1 • Potraviny určené k přímé spotřebě, které podporují růst L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely • 100 KTJ/g EN/ISO 11290-2 produkty uvedené na trh během doby údržnosti
Kriteria bezpečnosti potravin • Potraviny určené k přímé spotřebě, které nepodporují růst L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely • 100 KTJ/g
EN/ISO 11290-2
Historický úvod •
Murray v roce 1926: – Bacterium monocytogenes – krevní monocyty králíků – Patogen lidí a zvířat
•
Pirie v roce 1940: – Listeria monocytogenes – Joseph Lister
•
Od roku 1980 – foodborn pathogen
Potraviny určené k přímé spotřebě, které nepodporují růst L.monocytogenes výrobky s pH < 4,4 nebo aw < 0,92 výrobky s pH < 5,0
a
aw < 0,94
výrobky s dobou údržnosti pod 5 dní je-li to vědecky opodstatněné, i jiné výrobky
• Rod Listeria se člení do 6 druhů: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, a L. grayi. L. grayi a L. ivanovii mají dva poddruhy,které se obtížně rozlišují. • Současné taxonomické studie tohoto rodu jako patogeny uvádějí L. ivanovii a L. monocytogenes (myši, ovce a další zvířata). • Pouze L. monocytogenes je původce humánních listerios. • Listeriosy vyvolané infekcí L. ivanovii a nebo L. seeligeri, jsou u lidí vyjímečné.
Listeria monocytogenes Scanning EM showing Flagella
Základní údaje
- výskyt
Gram-pozitivní bakterie, pohyblivá pomocí bičíku. Některé studie udávají, že 1-10% lidí může být přenašečemi L. monocytogenes ve střevním traktu. • Celkem bylo nalezeno 37 kmenů u savců, jak u domácích, tak u divokých. U ptáků bylo nalezeno 17 druhů a pravděpodobně jsou druhy přenášené rybami a měkýši. • Byla izolovaná z půdy, siláže a dalších přírodních zdrojů. • L. monocytogenes je značně odolná, přežívá zhoubné účinky mrazu, vysušení a horka velice dobře na to, že se nejedná o sporotvorný druh. • Většina kmenů L. monocytogenes je patogenní.
Gramovo barvení
morfologie
Asociace s potravinami • L. monocytogenes bývá spojovaná s potravinami jako je syrové mléko, špatně pasterizované mléko, sýry (typy zrajících měkkých sýrů), zmrzlina, syrová zelenina, fermentované klobásy ze syrového masa, syrová a vařená drůbež, syrové maso (všech typů), a syrové a uzené ryby. • Schopnost růstu při teplotách kolem 3°C umožňuje množení v chlazených potravinách.
Odolnost listerií Listerie jsou bakterie s širokým rozmezím teplot, při kterých si zachovávají plně vitální funkce od 0 do 50 °C
Při teplotě 20 °C se v potravinách množí od aw 0,93 –0,95
Toleruje hodnoty pH v rozsahu 4,3 – 9,6 Přežívá v potravinách s koncentrací soli 10 % Bakterie mléčného kvašení a bakteriociny inhibují růst listerií
Infekční dávka • Infekční dávka L. monocytogenes není přesně určena. Zřejmě se mění v závislosti na kmenu a citlivosti nemocného. • Z případů vyvolaných syrovým nebo špatně pasterizovaným mlékem bylo odvozeno, že bezpečná dávka u citlivých osob je méně než 1,000 bakterií. • L. monocytogenes může pronikat gastrointestinálním epithelem. Jakmile bakterie vstoupí do monocytů, makrofágů, nebo polymorfonukleárních leukocytů, hostitele nastává její růst a následná septikémie. • Její intracelulární přítomnost v fagocytujících buňkách jí dovoluje přístup do mozku a transplacentální migraci do plodu u těhotných žen. • Pathogenese L. monocytogenes spočívá v její schopnosti přežívat a množit se ve fagocytárních buňkách hostitele.
Bakteriální virulence • Virulence – porovnatelný stupeň patogenity • A. LD50 – míra virulence, počet mikroorganismů nezbytných k usmrcení 50% pokusných zvířat nebo buněk v kultuře. • B. ID50 - míra virulence, počet mikroorganismů nezbytných k vyvolání infekce u 50% pokusných zvířat nebo buněk v kultuře. • C. LD50 bakterie A u králíka je 1000 organismů, zatímco pro bakterii B 5000 organismů. • Která bakterie je více virulentní?
Patogeneze protein
gen
poznámka
PrfA
prfA plcA hlyA actA inlA
regulační protein operonu
PIPLC LLO ActA IntA
fosfolipáza hemolyzin aktin internalin
Metody detekce • • • • •
Standardní normovaná metoda: (ČSN ISO 10560 a ČSN ISO 11290-1) - selektivní pomnožení (25g) v polovičním Fraserově bujonu, 225m, 30 °C, 24 h - sekundární pomnožení ve Fraseru s plným obsahem inhibičních složek 37 °C, 48 h - identifikace na dvou pevných selektivních médiích, inkubace 37°C, 48 h -výběr 5 charakteristických kolonií a vyočkování na chromogenní medium typu ALOA a TSAYE (Trypticase soja agar, extract yeast) inkubace 37 °C,24 h - další konfirmační testy : Gramovo barvení,CAMP test, API Listeria test,
Průkaz LM
Půda ALOA
Stanovení počtu LM
Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) test •
Provedení testu: kultury α-hemolytického Staphylococcus aureus a Rhodococcus equi se načárkují paralelně na misku s krevním agarem. Testované kultury pak se nanášejí v pravém úhlu ke kulturám S. aureus a R. Equi.
•
Po inkubaci při 35° C po 24-48 h, se na miskách hledá hemolýza. Hemolytická reakce L. monocytogenes a L. seeligeri je zesílená v zonách ovlivněných nárůstem S. aureus.
•
Ostatni druhy zůstávají nehemolytické. Reakce L. monocytogenes je častěji optimální za 24 h než po 48 h.
•
Je doporučeno použít kontrolní kmeny Listeria spp. na dalším agaru s ovčí krví. Misky s krevním agarem (beraní erythrocyty) by měly být co nejčerstvější.
Provedení CAMP testu •
CAMP test. Na krevní agar s propranými ovčími erytrocyty samostatnou čarou naočkujte testovací kultury S. aureus a R. equi, a to navzájem rovnoběžně v opačných polovinách misky. Je zapotřebí inokulovat tenkou čarou a rovnoměrně pomocí kličky vedené kolmo k misce. • Testované kmeny naočkujte podobně, každý samostatnou čarou a navzájem rovnoběžně, ve směru kolmém na očkovací čáry testovacích kultur tak, že se čar očkovaných testovacími kulturami nedotýkají, ale jsou od nich vzdálené asi 1-2 mm. Na jednu misku lze očkovat několik testovaných kmenů (nejčastěji 3 testované kmeny na jednu misku krevního agaru). Současně naočkujte kontrolní kultury L. monocytogenes, L. innocua a L. ivanovii. Takto naočkované misky krevního agaru inkubujte v termostatu s teplotou udržovanou na 37°C po dobu 18-24 hodin.
CAMP test
MALDI TOF - RESULTS
174 = 170
MALDI TOF - RESULTS
Trojúhelník onemocnění: kompatibilní interakce mezi patogenem a hostitelem končí nemocí při vhodných vnějších podmínkách. Nejsou-li všechny podmínky splněny, nemoc nepropukne
.
Oportunní patogen • Cílové populační skupiny pro listeriosu jsou: • Těhotné ženy/plod - perinatální a neonatální infekce; • Imunokompromisní pacienti po ošetření kortikosteroidy, protirakovinými léky, pacienti po transplantacích orgánů,nemocní AIDS; • Pacienti s rakovinou –zvláště s leukémií; • Méně často také - diabetici, astmatici, lidé s cirrhosou a ulcerativní kolitidou; • Senioři; • Zdraví lidé - podle některých zpráv i normální, zdraví lidé mohou být nakaženi. Při epidemii ve Švýcarsku, kdy vehikulem byl sýr ze syrového mléka onemocněli jinak zdraví lidé, jednalo se vysoké koncentrace L.monocytogenes.
onemocnění • Listeriosa je označení pro skupinu zdravotních poruch a potíží vyvolaných L. monocytogenes.
• Povaha onemocnění:Listeriosa je klinicky definovaná v případě, že organismus je izolován z krve, cerebrospinálního moku nebo z jiných za normálních podmínek sterilních míst (např. placenta, fetus).
Infekční cyklus 1 • Primární místo infekce je střevní epitel, kde bakterie napadá nefagocytující buňky pomocí mechanismu „zipování“. • Vstup je stimulován vazbou listeriového internalinu (Inl) do hostitelské buňky adhezními faktory jako Ecadherin nebo Met. • Tato vazba aktivuje některé Rho-GTPasy, které následně váže a stabilizuje Wiskott Aldrich Syndrome Protein (WASp). WASp tak může vázat komplex Arp2/3 a slouží jako bod nukleace aktinu. Následná polymerace aktinu rozpíná buněčnou membránu kolem bakterie, která je pohlcena. • Hlavním účinkem vazby internalinu je využití připojovacího mechanismu hostitele k internalizaci bakterie.
Infekční cyklus 2 • L. monocytogenes může také napadat fagocytující buňky (např. makrofágy) ale k invazi do nefagocytujících buněk stačí internaliny. • Po internalizaci musí bakterie opět uniknout z vakuoly/fagosomu dříve než dojde k fúzi s lysosomem. • Dva hlavní faktory virulence, které únik umožňují jsou listeriolysin O (LLO – kódovaný hly) a fosfolipasa-c B (plcB). Sekrece LLO a PlcB rozruší membránu vakuoly a dovolí bakterii proniknout do cytoplasmy, kde se může množit.
Průnik L. monocytogenes do hostitelské buňky •
Za adhezi L. monocytogenes k hostitelské buňce jsou zodpovědné povrchové proteiny Ami, bakteriální adhezin, který se váže na fibronektin sliznic a povrchový protein p104, internalin A a internalin B slouží k průniku do buňky indukcí fagocytózy, fosfolipázy, fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C a fosfatidylcholin-specifická fosfolipáza C, společně listeriolysin O, který tvoří póry v buněčné membráně vazbou na cholesterol v ní obsažený, naruší stěnu lysozomu a umožní buňce dostat se do cytoplasmy, kde se množí. Listeriolysin a fosfolipázy jsou zároveň cytolytickými toxiny, hemolyziny. • Baktérie produkuje také Zn2+dependentní proteázu, která působí jako exotoxin, povrchový protein LMaA je zřejmě zodpovědný za indukci pozdní hypersenzitivity a povrchový komplex Ei, izolovaný z buněčné stěny, je strukturou i účinky pozoruhodně podobný endotoxinům gramnegativních bakterií - L. monocytogenes je jediná grampozitivní bakterie, která je tvoří.
Virulence internalin Listeriolysin, lecitinasa
Aktinová vlákna
Faktory virulence jsou umístěny v lecithinasovém operonu a jejich transkripce ke regulována transkripčním aktivátorem PrfA.
Internalizace listerií savčí buňkou
Infekční cyklus 3 • Po průniku do cytoplasmy L. monocytogenes použije aktin hostitele podruhé. • ActA proteiny spojené se starým buněčným pólem bakterie (jako bacillus, L. monocytogenes tvoří septum ve středu buňky, a tak má vždy jeden nový pól a jeden starý ) jsou schopné vazby komplexu Arp2/3 a tak indukují nukleaci aktinu ve specifické oblasti povrchu bakterie. • Polymerace aktinu pohání bakterii cíleně k membráně hostitele. Takto vzniklý výčnělek může pak být internalizován sousední buňkou, za tvorby vakuoly s dvojitou membranou, ze které bakterie unikne použitím LLO a PlcB.
Listeria monocytogenes • • •
•
• •
L. monocytogenes tvoří biofilmy na nejrůznějších typech povrchů. Některé kmeny obsahují luxS gen, který je odpovědný za tvorbu biofilmu. luxS kóduje S-ribosylhomocysteinasu, která katalyzuje hydrolýzu Sribosylhomocysteinu na homocystein a 4,5-dihydroxy-2,3-pentadion (DPD), která je prekursorem autoinduktoru 2 (AI-2). AI-2 byl nalezen jako jeden z autoinduktorů regulujících bioluminiscenci u V.harveyi a dále byla AI-2 podobná aktivita detekována v supernatantu mnoha bakterií (G+ i G-). Orthology luxS byly identifikovány rovněž u mnoha bakterií(G+ i G-). AI-2 je „universální jazyk“ pro mezidruhovou komunikaci
Schéma tvorby biofilmu •
Provedení experimentu • Studium tvorby biofilmu Listeria monocytogenes : kultura rostla ná BHI 37 oC , 24h OD600 nm – 1,0, 100x naředěny čerstvým BHI, 0,5 ml aplikováno na 24 jamkovou polystyrenovou destičku. • Kultivace 1- 2 dny 37 oC staticky. Jamky 3x promyty 0,5 ml redest. vodou. Kvantitativní vyhodnocení: 0,1% krystal. violeť. Destička se 1h suší - 65 oC. Vyhodnocení: plate reader BioTec. • Množství biofilmu – průměr adsobance (OD595) extrahované violeti ze dvou nezávislých pokusů, každý po 3 paralelách.
Listeria monocytogenes - biofilm
Lineární mapa genomické DNA obklopující luxS L.monocytogenes
Známé a předpověděné ORF a jejich orientace. ORF lmo1285 a lmo 1285 kódují hypotetické proteiny podobné B.subtilis YneS a YneT. Lmo1291protein podobný B.subtilis acyltransferase (Yrhl protein.)
Mikroskopické analýzy prokázaly, že biofilm pokrývá lépe a více plochy z PVC, než z nerezové oceli. Na PVC vzniká biofilm již po 2 h kontaktu. Interakce mezi bakteriálními buňkami a anorganickým nosičem jsou závislé na hydrofobitě nebo hydrofilitě sledovaného povrchu. I když metod ke studiu je celá řada, použití mikrotitračních destiček je velmi výhodné a reprodukovatelně porovnatelné.
Kmen 39503 - vysoká tvorba biofilmu na nerezové plošce - A, na PVC - C. Kmen 35584 - nízká tvorba biofilmu na nerezové plošce - B, na PVC - D
Úsečka – 8,6 μm
Tvorba biofilmu u L.monocytogenes 0,08 0,07 0,06
A620
0,05 0,04
25°C
0,03
37°C
0,02 0,01 0 Lm52 Lm53 Lm54 Lm55 Lm 56 Lm57 Lm 58 Lm59 Lm 60 Lm169 Lm 170 Lm171
log CFU
Adherence to abiotic surfaces
5
4
Ent. faecalis.
3
E. coli St. aureus L.innocua
2
1
0 Glas Glass
Gummi rubber
Cleaning
Nirosta stainless steel
Glas Glass
Gummi rubber
Nirosta stainless steel
Cleaning+acidic desinfection
Rybí výrobky
Mléčné výrobky
Zelenina ostatní
Masné výrobky
Cukrářské výrobky
Lahůdkové saláty
Zelenina mražená
procento pozitivních
Výsledky studie MIKROMON 1999-2003 12
10
8
6
4
2
0
Pulsní gelová elektroforéza -PFGE • PFGE je elektroforetická metoda použitelná i k separaci dlouhých úseků DNA – při separaci se používá změny elektrického proudu během elektroforézy. • K provedení je nutná speciální aparatura, která je schopná střídat elektrické pole mezi dvěma páry elektrod orientovaných pravoúhle, případně třemi páry elektrod sestavených do šestiúhelníku. • Separace probíhá převážně na základě rozdílné velikosti molekul. Kratší molekuly putují gelem výrazně rychleji než molekuly velké.
Moderní metody identifikace Pulzní gelová elektroforéza (PFGE)
Jaký typ vyvolal epidemii? • Pulsotypy ze všech izolátů dodaných do Národní referenční laboratoře v Brně byly jednoho typu.
Comparison of serovar 4b distribution among large and small cheese making facilities % 30 25 20 15 10 5 0
small-scale
Statistically significant, p<0.05, Kolmogoroff Smirnoff, T-test
large-scale
Nálezy L. monocytogenes v potravinách v členských zemích EU (EFSA) Potravina
Pozitivní vzorky
Pozitivní vzorky
Výrobky z hovězího masa
2003 0-48 %
2004 0-11 %
Výrobky z vepřového masa
0-28 %
0-6 %
Výrobky z drůbežího masa
0-40 %
0-32 %
Výrobky z dalších druhů masa
0-29 %
0-22 %
Sýry
0-13 %
0-5 %
Syrové mléko
0-100 %
0.03 %
Další mléčné výrobky
0-0.6 %
-
0-29.6 %
0-13.2 %
0-33 %
0-1.3 %
Rybí výrobky Ovoce a zelenina
Rizikové skupiny sýrů Sýry s plísní uvnitř hmoty (Niva, Gorgonzola, Roquefort): pH 4.9, NaCl 4 % Sýry s plísní na povrchu – typ Camembert: pH 4.6-4.8, NaCl 3.5% Sýry zrající pod mazem (Romadur, Ol. tvarůžky): pH 5.2-5.4, NaCl do 5%
Děkuji za pozornost
