VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie
DIPLOMOVÁ PRÁCE Protilátky ke tkáňové transglutaminase ve screeningu celiakií
Vypracovala:
Jitka Hlavatá
Vedoucí diplomové práce: Konzultant: Studijní obor: Studijní zaměření:
MUDr. Petr Kocna, CSc. MUDr. Zdislava Vaníčková Obecná a aplikovaná biochemie Biomedicínské inženýrství
Prohlašuji, že jsem v předložené diplomové práci použila jen pramenů, které cituji a uvádím v seznamu použité literatury.
V Praze dne 9. května 2006
podpis
SOUHRN
Enzym tkáňová transglutaminasa hraje velmi důležitou roli v rozvoji celiakie, geneticky podmíněného autoimunitního onemocnění, které se projevuje chronickým zánětem tenkého střeva. Úkolem této práce bylo porovnat metodu ImmunoDot s rutinní metodou klinické laboratoře, a to při stanovení čtyř sérologických markerů celiakie, protilátek proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA a IgG a protilátek proti gliadinu ve třídě IgA a IgG. Stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase třídy IgA bylo doporučeno pro screening celiakie. Obě metody jsou založeny na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy. Bylo analyzováno celkem 96 vzorků, rozdělených do tří skupin, podle výsledků rutinního stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase IgA. Zjištěná diagnostická přesnost metody ImmunoDot vzhledem k rutinní metodě, která byla při výpočtu považována za referenční, byla nejvyšší právě u protilátek ke tkáňové transglutaminase třídy IgA. Diagnostická specificita stanovení byla 100% a senzitivita 78,4%. Metoda ImmunoDot může být použita pro screening celiakie v klinických laboratořích.
Interakce mezi tkáňovou transglutaminasou a fragmenty α-gliadinu byly zkoumány pomocí nekompetitivní enzymové imunoanalýzy. Na začátek byl zařazen krok, kdy proběhla preinkubace enzymu s fragmenty gliadinu. Bylo prokázáno, že fragmenty α-gliadinu blokují epitopy tkáňové transglutaminasy, na které se následně nemohou vázat protilátky. Zvýšení koncentrace fragmentů při preinkubaci má za následek snížení detekované hladiny protilátek proti atTG IgA v séru. Bohužel při identifikaci peptidových fragmentů pomocí hmotnostní spektrometrie se podařilo určit pouze tři fragmenty pocházející prokazatelně z α-gliadinu. Vzhledem k malému množství těchto fragmentů je nebylo možné použít pro další experimenty.
SUMMARY
Enzyme tissue transglutaminase has fundamental role in development of celiac disease, autoimmune disorder with genetic predisposition. It is characterized by chronic bowel inflammation. The aim of this work was to compare two different methods, classical method used in clinical laboratory with ImmunoDot. Both methods are based on noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay. All samples were evaluated in four celiac serological markers, antibodies against tissue transglutaminase class IgA and IgG and antibodies against gliadin class IgA and IgG. Tissue transglutaminase antibodies class IgA has been recommended for celiac screening. 96 pacient’s samples were evaluated. Samples were divided in three groups according to result of antibodies against tissue transglutaminase class IgA assay. Diagnostic accurancy of ImmunoDot in reference with classic method was highest for antibodies against tissue transglutaminase class IgA assay. Diagnostic specificity of this assay was 100% and diagnostic sensitivity was 78,4%. ImmunoDot method can be used in celiac screening in clinical laboratories.
Interactions between tissue transglutaminase and α-gliadin fragments were evaluated by noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay, when one step involving incubation of enzyme with α-gliadin fragments was added. It was found tissue transglutaminase epitopes are blocked by these fragments, so antibodies cannot bind there. Increasing concentration of fragments during preincubation cause decrease of detected amount of antibodies against tissue transglutaminase IgA in pacient’s serum. Unfortunately, within identification of α-gliadin fragments using mass spectrometry only three α-gliadin fragments were confirmed. According to low amont of these fragments future experiments with them were not possible.
Ráda bych poděkovala školiteli MUDr.Petru Kocnovi, CSc. a konzultantce MUDr. Zdislavě Vaníčkové z Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF UK a VFN za odborné vedení a pomoc při řešení úkolů této diplomové práce. Děkuji za vytvoření ideálního prostředí pro mou práci. Mé díky dále patří Mgr.Miloslavu Šandovi z Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR za možnost využití jeho laboratoře pro některá analytická stanovení v této práci.
Zvlášť bych pak chtěla poděkovat svým rodičům za všestrannou podporu během studia.
OBSAH 1.
ÚVOD
1
2.
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1 CELIAKIE 2.1.1 Gluten 2.1.2 Klinické projevy 2.1.2.1 Klasická forma 2.1.2.2 Tichá forma 2.1.2.3 Latentní forma 2.1.2.4 Potenciální forma 2.1.3 Incidence onemocnění 2.2 PATOGENEZE CELIAKIE 2.3 DIAGNOSTIKA CELIAKIE 2.3.1 Biopsie 2.3.2 Dechové testy 2.3.2.1 Dechové testy H2 2.3.2.2 Dechové testy 13C, 14C 2.3.3 Sérologické testy 2.3.3.1 Protilátky proti tkáňové transglutaminase 2.3.3.2 Protilátky proti gliadinu 2.3.3.3 Protilátky proti endomysiu 2.3.3.4 Protilátky proti retikulinu 2.4 TKÁŇOVÁ TRANSGLUTAMINASA 2.4.1 Enzymologie 2.4.2 Neenzymatická role tkáňové transglutaminasy při rozvoji celiakie 2.5 ALTERNATIVA K BEZLEPKOVÉ DIETĚ?
2 2 2 2 3 3 3 3 4 5 7 8 8 8 9 10 10 11 11 12 12 13 15 16
3.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 MATERIÁLOVÉ A PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ 3.1.1 Chemikálie 3.1.2 Přístroje a materiál 3.1.3 Složení roztoků 3.1.4 Pacienti 3.2 METODIKA MĚŘENÍ 3.2.1 ELISA (Dialab) 3.2.1.1 Modifikace metody, preinkubace s gliadinem a PTP 3.2.2 ImmunoDot (D-tek) 3.2.3 ELISA (D-tec) 3.2.4 Výpočet diagnostické senzitivity, specificity a Cohenova κ 3.2.5 Hmotnostní spektrometrie spojená s kapilární chromatografií 3.2.6 MALDI TOF hmotnostní spektrometrie
17 17 17 17 18 20 21 21 22 23 24 25 26 27
4.
VÝSLEDKY A DISKUSE 28 SROVNÁNÍ METOD ELISA A IMMUNODOT 28 4.1.1 Srovnání rutinní metody ELISA a metody ImmunoDot 28 4.1.1.1 Srovnání stanovení atTG IgA 28 4.1.1.2 Srovnání stanovení atTG IgG 29 4.1.1.3 Srovnání stanovení AGA IgA a IgG 30 4.1.2 Srovnání vizuálního vyhodnocení metody ImmunoDot a jejího qqq vyhodnocení počítačovým programem 33 4.1.3 Srovnání atTG IgA s vyhodnocením proužku ImmunoDot IgA jako celku 34 4.1.4 Srovnání metody ELISA a metody ImmunoDot při použití stejného qqq antigenu 35 4.1.5 Srovnání stanovení protilátek různými komerčními sety metodou ELISA 37 4.2 INTERAKCE MEZI TKÁŇOVOU TRANSGLUTAMINASOU qqqqqqqqqqq A GLIADINEM NEBO JEHO FRAGMENTY 39 4.2.1 Interakce mezi gliadinem a tkáňovou transglutaminasou 39 4.2.2 Interakce mezi PTP fragmenty α-gliadinu a tkáňovou transglutaminasou 39 4.2.3 Chromatografie PTP fragmentů 41 4.2.4 Určení molekulové hmotnosti pomocí MALDI-TOF 42 4.2.5 Sekvenace PTP fragmentů de novo následná identifikace pomocí qqq BLAST vyhledávání 43 4.1
5.
ZÁVĚR
45
6.
LITERATURA
47
7.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
50
8.
PŘÍLOHY 51 Tabulka XIV. Přehled všech hodnot použitých při srovnání metody ELISA a metody ImmunoDot 52
1.
ÚVOD
Tkáňová transglutaminasa má zásadní roli v patogenezi celiakie, autoimunitního onemocnění, které se projevuje chronickým zánětem tenkého střeva. Stanovení sérologických markerů je vyvíjeno jako první test. Pro screening je doporučováno stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA, které má nejlepší diagnostické vlastnosti, tedy senzitivitu a specificitu. Jediným jednoznačně průkazným vyšetřením je enterobiopsie tenkého střeva, toto vyšetření není operací a není nijak zvláště náročné.
V klinických laboratořích se pro toto stanovení používají komerční sady principiálně založené většinou na metodě ELISA. Na trhu je dostupné velké množství těchto sad, většinou v provedení na mikrotitračních destičkách. Cut off hodnota těchto testů je určena pouze empiricky, výrobce ji většinou uvádí s doporučením, aby si laboratoř stanovila své vlastní rozmezí normálních a patologických hodnot. Cílem práce je porovnání výsledků stanovení markerů celiakie, především tkáňové transglutaminasy, při použití různých komerčních setů, a to jak v provedení na mikrotitračních destičkách, tak i na papírových proužcích metodou zvanou ImmunoDot.
V odborné literatuře se v souvislosti se zvýšením diagnostické specificity a senzitivity objevil termín transglutaminasa aktivovaná gliadinem. Z tohoto důvodu bylo zkoumáno, jaký vliv má preinkubace enzymu s jednotlivými typy gliadinů nebo s fragmenty α-gliadinu, které vznikly následkem štěpení tohoto peptidu enzymy trávicího traktu, na stanovení protilátek proti tkáňové transglutaminase třídy IgA.
1
2.
2.1.
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
CELIAKIE
Celiakie, jinak také celiakální sprue nebo glutenová enteropatie, je geneticky podmíněné autoimunitní onemocnění, které se projevuje intolerancí k pšeničnému lepku (glutenu) resp. k dalším zásobním proteinům příbuzných obilovin, ječmene, žita a ovsa.1 Po požití potravin obsahujících lepek dochází k abnormální imunitní odpovědi, která se projevuje chronickým zánětem tenkého střeva.2 Celiakie je velmi významně asociována s lidskými leukocytárními antigeny (HLA).3 Vzhledem k permanentní intoleranci je v současné době jediným léčebným řešením dieta vylučující gliadin z potravy.4
2.2.1
Gluten
Gluten je směs proteinů nerozpustných ve vodě, kterou lze získat z pšeničné mouky. Skládá se z více než dvou stovek homologních gluteninů a gliadinů. Gliadiny jsou dále rozděleny na α-, β-, γ- a ω-gliadiny. Gluteniny se dělí na nízkomolekulární a vysokomolekulární.5 Za toxicitu jsou zodpovědné převážně gliadiny, proteiny obsahující velké množství glutaminu a prolinu (35 a 15% z celkového aminokyselinového složení).6,7 Rezistence vůči trávicím enzymům je dána obsahem prolinu.4
2.1.1.
Klinické projevy
Příznaky onemocnění celiakií bývají velmi nespecifické a z tohoto důvodu většina případů není stále ještě diagnostikována. Pomůckou při klasifikaci celiakie je tzv. teorie ledovce. (Schéma 1)8
2
2.1.2.1
Klasická forma
Klasická forma se prezentuje gastrointestinálními symptomy (bolesti v břišní dutině, zácpa, diarea, steatorea, zvracení) a následky poruchy vstřebávání živin neboli malabsorpce (ztráta hmotnosti, anemie, osteoporóza, avitaminózy, nervové poruchy a u dětí i poruchy tělesného a duševního vývoje). Lze ji potvrdit vyšetřením sérologických markerů a biopsií tenkého střeva.9
2.1.2.2
Tichá forma
Při tiché formě onemocnění pacient netrpí žádnými gastrointestinálními příznaky, ovšem výsledek sérologického screeningu je pozitivní a následná biopsie tenkého střeva diagnózu celiakie potvrdí.9
2.1.2.3
Latentní forma
Jedinci trpící latentní formou onemocnění nemají žádné klinické příznaky a obvykle bývají diagnostikováni pomocí sérologických markerů. Histologický rozbor tenkého střeva je normální, ovšem s velkou pravděpodobností dojde během života k patologickým změnám v tenkém střevě.9
2.1.2.4
Potenciální forma
Potenciální forma je charakteristická pouze genetickými predispozicemi, tedy přítomností HLA-DQ2 a HLA-DQ8 a zvýšenou přítomností intraepiteliálních lymfocytů exprimujících TCR typu γδ.10
Molekula HLA-DQ2, kódována alelami β1*0201 a α1*0501 se vyskytuje 95% pacientů, kdežto u zdravých jedinců pouze ve 20-30%.3 U většiny pacientů, u kterých bylo stanovení HLA-DQ2 negativní, byla zjištěna přítomnost HLA-DQ8.11
3
Schéma 1. Teorie ledovce.1, 8 Rozdělení jednotlivých forem celiakie na základě klinických projevů
2.1.3
Incidence onemocnění
Incidence celiakie má v poslední době vzrůstající tendenci, vzhledem k neustálému vývoji sérologických testů.9 Výsledky screeningu v normální populaci uvádí incidenci onemocnění mezi 1:100 a 1:133, což potvrzuje i studie u dětí do pěti let, která uvádí incidenci 1:104.12,13,14 Toto číslo vzrůstá u příbuzných nemocných celiakií až na 1:22.13
Zvýšený výskyt nemoci je u také u pacientů, kteří trpí i jinými nejen autoimunitními chorobami jako jsou např. diabetes mellitus, systémový lupus erythematodes, poruchy štítné žlázy, revmatoidní artritida a Downův syndrom.9
4
2.2.
PATOGENEZE (Obr. 1)
Ačkoli je celiakie považována za nejlépe prostudované autoimunitní onemocnění, patogeneze této nemoci je velmi složitá a některé kroky zůstávají stále neobjasněny.
Rozvoj onemocnění je jednoznačně podmíněn přítomností glutenu v potravě. Po jeho požití dojde k hydrolýze pšeničných proteinů trávicími enzymy – pepsinem, trypsinem, chymotrypsinem, elastasou, enteropeptidasami, karboxypeptidasami a enzymy kartáčového lemu enterocytů, čímž dojde k vzniku krátkých peptidů o délce maximálně několik desítek aminokyselin, které nejsou dále štěpitelné trávicími enzymy.6
Peptidy se potom transportují přes epitel tenkého střeva, do subepiteliální vrstvy, kde se nachází enzym tkáňová transglutaminasa. Mechanismus transportu není stále zcela objasněn a je vysoce pravděpodobné, že právě způsob, jakým jsou tyto krátké peptidy schopny prostoupit přes epiteliální vrstvu složenou z enterocytů, je jedním z klíčových kroků vzniku a rozvoje onemocnění.10 Bylo potvrzeno, že některé genetické modifikace proteinů myosinového typu mají za následek zvýšení permeability buněčných membrán. Například gen MYO9B kóduje protein myosin typu IX, který obsahuje doménu pro Rho-GTPasa aktivující protein. Tato GTPasová doména katalyzuje přeměnu aktivního Rho-GTP na neaktivní RhoGDP, čímž zasahuje do regulačních drah přestavby cytoskeletu a s tím spojených dějů a také mimo jiné ovlivňuje vlastnosti buněčných membrán.16 Zvýšená permeabilita může být také ovlivněna nadměrnou expresí zonulinu, proteinu, který reguluje mezibuněčný transport.17
Fragmenty gliadinu jsou poté vysoce pravděpodobně modifikovány tkáňovou transglutaminasou.5 Deaminované peptidy jsou zachyceny na buňkách prezentujících antigen (APC) navázáním na receptory HLA-DQ2 popř. HLA-DQ8 a tyto buňky je dále prezentují nezralým T buňkám. Ty je rozeznají jako antigen a díky vzájemné interakci dojde k diferenciaci T-buněk.18 Enteropatie je potom indukována uvolněním interferonu γ a dalších prozánětlivých cytokinů produkovaných efektorovými T buňkami.15 Rovněž dochází k uvolňování matrixových methaloproteinas, které mohou poškozovat sliznici tenkého střeva.10
5
Obr. 1. Průběh patogeneze. Gliadin v potravě je vystaven působení trávicích enzymů, včetně prolylendopeptidas, za vzniku dále neštěpitelných krátkých peptidů. Ty jsou poté transportovány do subepiteliální vrstvy a vystaveny působení tkáňové transglutaminasy (tTG), která specificky modifikuje některé glutaminové zbytky na glutamátové. Modifikované peptidy jsou pomocí APC (buňky prezentující antigen) prezentovány CD4+ T buňkám a dochází k interakci s HLA DQ2 nebo DQ8. Následkem toho dojde k rozvoji imunitní odpovědi, a to jak ke vzniku zánětlivé reakce, která poškozuje sliznici tenkého střeva, tak ke stimulaci B lymfocytů a produkci protilátek proti gliadinu a tkáňové transglutaminase.15
6
2.3.
DIAGNOSTIKA CELIAKIE
Gastrointestinální příznaky celiakie nejsou příliš specifické, navíc mnoho pacientů trpí jen některými nebo vůbec žádnými, tudíž její diagnóza není snadná. Tyto příznaky mohou trvat i několik let než je diagnostikována.19 K rozvoji onemocnění může dojít v jakémkoli věku, ale nejčastěji bývá celiakie diagnostikována během prvních dvou let života, tedy v době, kdy se gliadin stává složkou potravy, dále potom v pubertě a ve středním věku. Z hlediska pohlaví bývá diagnostikováno více žen než mužů, ale současné studie se přiklánějí k tomu, že incidence bude ekvivalentní.9 (Schéma 2, Tab. I)
Schéma 2. Postup při diagnóze celiakie20
7
Tab. I. Postup při diagnostikování celiakie21
Kritéria pro diagnostiku celiakie podle Evropské společnost pro pediatrickou gastroenterologii, hepatologii a výživu (ESPGHAN) 1. anamnéza a klinické projevy odpovídající celiakii 2. pozitivní sérologické markery celiakie 3. histologický průkaz změn sliznice tenkého střeva 4. klinická i sérologická odpověď na bezlepkovou dietu 5. vyloučena jiná onemocnění podobná celiakii
2.3.1.
Biopsie
Pro diagnózu celiakie je biopsie stále zásadní. Ovšem vzhledem k jeho invazivnímu charakteru se k tomuto vyšetření přistupuje až po stanovení sérologických markerů. Sliznice tenkého střeva při celiakii je charakteristická atrofií klků, zvýšeným množstvím intraepiteliálních lymfocytů a hyperplasií krypt.9, 22 (Obr. 2)
2.3.2.
Dechové testy
Diagnostika celiakie pomocí dechových testů je v současnosti se rozvíjející vyšetření. Jako jediné je neinvazivní.
2.3.2.1.
Dechové testy H2 Použití těchto testů se neomezuje jen na diagnostiku celiakie, ale lze ho také použít
k mnoha dalším speciálním měřením v gastroenterologii.
Princip testu spočívá v podání substrátu (sorbitol v případě celiakie) a následnému měření koncentrace H2 ve vydechovaném vzduchu.23 Způsob měření koncentrace může být pomocí plynové chromatografie, nebo pomocí elektrochemického článku.24
8
Obr. 2. Zdravá sliznice a sliznice při onemocnění celiakií a. Histologie normální sliznice, s klky (V) a kryptami (C). Lamina propria neboli subepiteliální vrstva (LP) se nachází mezi kryptami a uvnitř každého klku. Nachází se tam mnoho krevních i lymfatických vlásečnic, kde dochází k absorpci produktů trávení. b. Sliznice při onemocnění celiakií je charakteristická atrofií klků, hyperplasií krypt a zvýšenou infiltrací lymfocytů v epitelu a subepiteliální vrstvě.(převzato)22
Dechové testy 13C, 14C
2.3.2.2.
Princip těchto dechových testů spočívá v měření poměru izotopů
12
C a
13
C ve
vydechovaném CO2, který stoupá přímo úměrně s mírou hydrolýzy substrátu značeného izotopem
13
C. Při stanovení malabsorpce se jako substrát používá značená xylosa, laktosa
nebo kyselina palmitová.
9
V současné době se vzhledem k jeho nestabilitě již ustupuje od používání izotopu 14C, ale princip těchto testů je stejný. Způsobů detekce 13CO2 ve vydechovaném vzduchu je několik. Nejpřesnější je detekce hmotnostní spektrometrií (IRMS), pro kterou je nutné pouze malé množství vzorku. Více rozšířené, především z ekonomických důvodů, jsou detektory na principu infračervených spekter (NDIRS). Třetí princip detektoru spočívá v optogalvanickém měření vlastností laserového paprsku (LARA). Další používaný typ detektoru je založen na tzv. molekulární korelační spektroskopii (MCS).24, 25
2.3.3.
Sérologické testy
Sérologické testy jsou po lékařské diagnóze prvním stupněm v klinické diagnostice celiakie.9 Je známa celá řada sérologických markerů, které lze stanovit, nicméně jen některé jsou rutinně stanovovány v klinických laboratořích. Jedná se zejména o protilátky proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA, protilátky proti gliadinu IgA i IgG a protilátky proti endomysiu IgA.
K dispozici je celá řada komerčních sad, které dávají srovnatelné výsledky z hlediska pozitivity nebo negativity, ale chybějící standardizace testů bohužel neumožňuje získání srovnatelných hodnot.26
2.3.3.3.
Protilátky proti tkáňové transglutaminase (atTG)
Stanovují se protilátky ve třídě IgA a IgG. Protilátky proti tkáňové transglutaminase ve třídě IgA jsou doporučovány pro případný screening na celiakii, neboť mají nejlepší poměr senzitivity a specificity.27 Senzitivita IgA testů se pohybuje mezi 91 - 97% a specificita mezi 96 - 100%.28 Tyto testy dávají lepší údaje než stanovení protilátek proti endomysiu a protilátek proti gliadinu ve třídě IgA. Stanovení má i výpovědní hodnotu i jako míra dodržování bezlepkové diety.
10
Všeobecně bývá stanovení protilátek ve třídě IgG mnohem méně senzitivní, ale má velký význam pro diagnostiku celiakie u IgA deficientních pacientů. Právě u těchto pacientů mají tyto protilátky senzitivitu 98,7% a specificitu 98.6%.29
Rutinní laboratorní metody jsou založeny na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy (ELISA), většinou jsou k dispozici komerční sady pro analýzu na mikrotitračních destičkách, která umožňuje stanovení několika desítek pacientů najednou.26
2.3.3.2.
Protilátky proti gliadinu (AGA)
Vzhledem k chybějící standardizaci souprav pro stanovení protilátek proti gliadinu ve třídách IgA a IgG se i výsledky jednotlivých souprav značně liší. Některé soupravy používají surový gliadin, jiné purifikovaný gliadin, většinou frakci α, a proto vzhledem použití různých antigenů nelze očekávat shodné výsledky.30
Stanovují se protilátky ve třídách IgA a IgG. Senzitivita IgA se pohybuje v rozmezí 73-89%, a specificita 66-85%. IgG protilátky mají význam hlavně u nemocných s deficitem IgA, jejich senzitivita se pohybuje 78-92% a specificita 66-85%.28 Metody, které používají jako antigen purifikovaný α-gliadin vykazují vyšší specificitu. V současné době tato vyšetření ustupují stanovení atTG IgA a EMA, právě kvůli vyšší specificitě. Toto sérologické stanovení je prováděno metodou ELISA.31
2.3.3.1
Protilátky proti endomysiu (EMA)
Endomysium je pojivový protein hladkého svalstva, nacházející se mezi myofybrilami.
Pro
stanovení
protilátek
proti
endomysiu
se
používá
metoda
nepřímé
imunofluorescence, jako substrát se používá svalovina opičího jícnu nebo svalovina pupečníku.26, 31 Vyhodnocení fluorescence v mikroskopu vyžaduje dlouhodobé zkušenosti.24 Senzitivita se pohybuje mezi 83 - 95% a specificita dosahuje hodnot 94 – 100%.28 Ve většině
11
rutinních laboratoří se stanovují protilátky pouze ve třídě IgA, ale pro testování IgA deficientních pacientů lze použít i stanovení EMA IgG.29
2.3.3.4.
Protilátky proti retikulinu (ARA)
Retikulin je jedním z pojivových proteinů lymfatických tkání. Protilátky mohou být stanovovány ve třídách IgA a IgG a to metodou nepřímé fluorescence stejně jako u EMA.32 V současné době se toto stanovení již neprovádí.
2.4
TKÁŇOVÁ TRANSGLUTAMINASA
Transglutaminasy se nachází nejen ve tkáních, ale i v plazmě, a extracelulárních tekutinách. V současné době je známo několik lidských isoenzymů.33
Tkáňová
transglutaminasa
(isoenzym
transglutaminasa
II)
se
nachází
v extracelulárním prostoru, v cytoplazmě, ale i v jádře mnoha lidských buněk, včetně buněk cévní stěny, střevního epitelu a hladkého svalu. Katalyzuje posttranslační modifikace cytoplazmatických proteinů. Vzniklá kovalentní isopeptidová vazba je stabilní, rezistentní k proteolýze, čímž zvyšuje odolnost tkání k chemickým, enzymatickým a mechanickým poškozením. Úkolem tohoto enzymu jsou tedy posttranslační modifikace proteinů za účelem jejich stabilizace v různých fyziologických i patologických dějích.33, 34
Ačkoli ještě nebylo in vivo prokázáno, že tkáňová transglutaminasa má schopnost modifikovat gluten, existují argumenty, které toto tvrzení podporují. Bylo už mnohokrát ověřeno, že T lymfocyty získané z tkání pacientů reagovaly pouze nebo mnohem lépe na peptidy, které byly modifikovány tímto enzymem. Také aktivita tohoto enzymu ve tkáních pacientů s celiakií byla vyšší, přítomnost enzymu byla prokázána v epiteliální i subepiteliální vrstvě tenkého střeva.5
12
2.4.1.
Enzymologie
Tkáňová transglutaminasa (isoenzym transglutaminasa II) se v enzymovém katalogu nachází pod číslem EC 2.3.2.13, což ji řadí mezi transferasy přenášející aminoacylovou skupinu. Její systémový název je protein-glutamin:amin-γ-glutamyltransferasa. Tkáňová transglutaminasa je Ca2+ dependentní enzym, katalyzující následující reakce. protein-glutamin + amin → protein-N5-alkylglutamin + NH3 Tímto dochází ke vzniku intra- i intermolekulárních vazeb mezi postranními řetězci glutaminu (akceptor) a lysinu (donor).
protein-glutamin + H2O → protein-glutamát + NH3 Tato reakce probíhá s vyšší pravděpodobností při sníženém pH a při vysoké koncentraci glutaminů vzhledem ke koncentraci přítomných primárních aminů. (Obr. 3)22 Z hlediska kinetiky působí tento enzym ping-pongovým mechanismem. (Schéma 3)35
Schéma 3. Ping-pongový model reakce A + B ↔ P + Q35
13
Obr. 3. Reakce katalyzované tkáňovou transglutaminasou. Enzym katalyzuje vznik intramolekulární vazby mezi postranním řetězcem glutaminu a primárním aminem např. primárním řetězcem lysinu a deaminaci postranního řetězce glutaminu za vzniku protein-glutamátu. Poměr deaminace ke vzniku intramolekulární vazby je tím vyšší, čím nižší je pH a čím vyšší je poměr glutaminových postranních řetězců k polyaminům.22
V aktivním místě enzymu je naprosto zásadní cysteinový zbytek, který se přímo účastní reakce. Konkrétně lze reakční mechanismus rozepsat těmito rovnicemi.
14
V případě deaminace probíhá v druhém kroku reakce s H2O místo s primárním aminem.
Enzym má širokou specificitu pro primární aminy (lysin nebo polyaminy), na druhou stranu jen některé proteiny obsahující glutamin se mohou zúčastnit této reakce. Tato schopnost závisí na okolí příslušného postranního řetězce glutaminu, a to jak z hlediska aminokyselinové sekvence, tak z hlediska prostorového uspořádání.33 Klíčová je přítomnost prolinu ve vzdálenosti dvou aminokyselin směrem k C-terminálnímu konci nebo hydrofobní aminokyseliny jako např. fenylalanimu ve vzdálenosti tří aminokyselin směrem k Cterminálnímu konci.5
Vzhledem k množství gliadinů obsažených v pšenici, kde jich bylo nalezeno více než 200, literatura většinou nerozlišuje vztahy tkáňové transglutaminasy k jednotlivým gliadinům.2,36 V současnosti se výzkum zabývá identifikací epitopů, které je tento enzym schopen modifikovat a které následně stimulují T buňky.6
2.4.2.
Neenzymatická role tkáňové transglutaminasy při rozvoji celiakie
Během zánětu T- lymfocyty migrují z krve do tkání nejprve pomocí speciálních receptorů zajištující adhezi k endoteliu. Ovšem následný proces migrace T lymfocytů skrz endotelium (TEM) je méně jasný. Byly vyrobeny monoklonální protilátky mAb 6B9, které prokazatelně inhibují proces TEM, ale nijak neovlivňují proces adheze. Antigen byl nečekaně identifikován jako tkáňová transglutaminasa. Protilátka 6B9 selektivně inhibovala pouze CD8+ T lymfocyty, tedy tzv. cytotoxické T lymfocyty, jejichž počet mnohonásobně stoupá během zánětlivé reakce u celiakií.27 Rozdíly mezi reakcí zdravých tkání a tkáněmi nemocných celiakií s protilátkou 6B9 nebyly pozorovány. Prozatím nebyla prokázána žádná vazba mezi enzymatickou aktivitou tkáňové transglutaminasy a výskytem povrchového proteinu této
15
transglutaminasy, jak byla detekována pomocí mAb 6B9. V případě exprese tkáňové transglutaminasy na povrchu endoteliálních buněk tedy není enzymatická aktivita tohoto enzymu bezpodmínečně nutná pro jeho aktivitu biologickou.34
Tento směr výzkumu se snaží objasnit novou biologickou roli pro tkáňovou transglutaminasu, která se zdá být v regulaci transepiteliální migrace, která má význam nejen u celiakie, ale i u mnoha jiných onemocnění.34
2.5
ALTERNATIVA K BEZLEPKOVÉ DIETĚ?
Bezlepková dieta je v současné době jediná účinná metoda, jak předcházet chronickému zánětu tenkého střeva, čímž se zároveň snižuje i riziko rozvoje gastrointestinálního lymfomu nebo karcinomu.37 Bohužel, i tato dieta má své negativní stránky, jak ekonomické, tak i pacienti samotní jsou dietou omezováni, nehledě na to, že některé bezlepkové potraviny lze jen těžko označit za chutné. Jsou také pacienti, jejichž odpověď na bezlepkovou dietu není dostatečná nebo dostatečně rychlá.38
Jedním z možných řešení je vyvinout pšenici, která bude obsahovat méně či vůbec žádný gliadin, popřípadě takový, který nebude vyvolávat imunitní odpověď.5 Toxicita peptidu může být snížena bakteriálními endopeptidasami z Flavobacterium meningosepticum. Tato jejich aktivita byla prokázána in vitro a ex vivo a v současné době se zkoumá i možné použití enzymu in vivo jako doplněk bezlepkové diety. Tento enzym je dostatečně odolný, jak proti extrémnímu pH, tak i proti hydrolýze trávícími enzymy, což značně usnadňuje jeho případné použití u pacientů.27
Další možností je inhibice aktivity tkáňové transglutaminasy. Bohužel tento enzym má rozličné biologické funkce, jak bylo uvedeno kapitole 2.4.2., a i lokální inhibice tohoto enzymu by mohla mít závažné následky.38
16
3.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1
MATERIÁLOVÉ A PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ
3.1.1
Chemikálie
acetonitril (ACN) (Sigma-Aldrich) dihydrát citronanu trisodného (C6H5O7Na3.2H2O) (Lachema) dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného (Na2HPO4.H2O) (Lachema) dihydrogenfosforečnan draselný (KH2PO4) (Lachema) ethanol (Kulich Hradec Králové) hydroxid sodný (NaOH) (Lachema) chlorid vápenatý (CaCl2) (Sigma-Aldrich) kyselina chlorovodíková (HCl) (Lachema) kyselina synapová (Sigma-Aldrich) kyselina trifluoroctová (TFA) (Sigma-Aldrich) kyselina α-hydroxyskořicová (Sigma-Aldrich) monohydrát kyseliny citronové (C6H8O7.H2O) (Fluka) tetraboritan disodný (Na2B4O7.10H2O) (Lachema) TRIS (N-tris[hydroxymethyl]-methyl-2-aminoethansulfonová kyselina) (Lachema)
3.1.2
Přístroje a materiál
Přístroje:
Hybridní hmotnostní spektrometr Q-TOF Micro (Waters Micromass) spojený s 2D kapilární chromatografií 2D CapLC (Waters) MALDI TOF hmotnostní spektrometr, REFLEX IV, Bruker Daltonics Automatická promývačka pro mikrotitrační destičky, BIOTEC Instrument
17
pH metr Precisa pH 900 se skleněnou elektrodou Fotometr pro měření absorbance na mikrotitračních destičkách, SLT Labinstuments A-5082 Analytické váhy, Mettler H10T Multikanálová pipeta Program KIM pro vyhodnocení mikrotitračních destiček, verze 2.13
Materiál:
purifikovaný α-, β-, γ-, ω-gliadin, lyofilizát α-gliadin po štěpení pomocí pepsinu, trypsinu a směsí pankreatických enzymů (PTP), lyofilizát Oba vzorky byly vyrobeny v rámci předcházejícího projektu v laboratoři.39
3.1.3
Složení roztoků
Pufry:
C6H8O7-Na2HPO4 0,01M pH 3,4 5,7ml 0,2M Na2HPO4 14,3ml 0,1M C6H8O7 doplnit objem na 400 ml
C6H8O7-Na2HPO4 0,01M pH 4,2 8,3ml 0,2M Na2HPO4 11,7ml 0,1M C6H8O7 doplnit objem na 400 ml
Fosfátový pufr 0,01M pH 5,7 9,4ml 0,1M KH2PO4
18
0,6ml 0,1M Na2HPO4 doplnit objem na 100 ml
Fosfátový pufr 0,01M pH 6,2 8,3ml 0,1M KH2PO4 1,7ml 0,1M Na2HPO4 doplnit objem na 100 ml
Fosfátový pufr 0,01M pH 6,8 5,5ml 0,1M KH2PO4 4,5ml 0,1M Na2HPO4 doplnit objem na 100 ml
TRIS-HCl 0,01M pH 7,4 1,9ml 0,1M TRIS 8,1ml 0,1M HCl doplnit objem na 100 ml
TRIS-HCl 0,01M pH 8,2 6,9 ml 0,1M TRIS 4,1ml 0,1M HCl doplnit objem na 100 ml
TRIS-HCl 0,01M pH 9,0 9,0ml 0,1M TRIS 1,0ml 0,1M HCl doplnit objem na 100 ml
NaOH-Na2B4O7 0,01M pH 10,5 5,0ml 0,1M NaOH 5,0ml 0,05M Na2B4O7
19
doplnit objem na 100 ml
NaOH-Na2B4O7 0,01M pH 12,0 6,0ml 0,1M NaOH 4,0ml 0,05M Na2B4O7 doplnit objem na 100 ml
Roztoky:
α- gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M pH 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml β- gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M pH 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml γ- gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M pH 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml ω-gliadin rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M pH 7,4 5mg/ml, 0,1mg/ml
PTP rozpuštěný v TRIS-HCl pufru 0,01M pH 7,4 1mg/ml; 0,8mg/ml, 0,6mg/ml, 0,4mg/ml, 0,2mg/ml, 0,02mg/ml
3.1.4
Pacienti
Bylo vybráno 96 pacientů, jejichž séra byla rozdělena do tří kategorií dle aktivity protilátek proti tkáňové transglutaminase. Ta byla stanovena v rámci klinického stanovení na základě doporučení lékaře v Laboratoří gastroenterologie Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. První skupina obsahovala vzorky s hodnotami aktivity menšími než 10U/ml, tedy jednoznačně negativní vzorky, druhá jednoznačně pozitivní vzorky s aktivitou mezi 80 a 205U/ml a ve třetí skupině byly vzorky s hodnotou aktivity těsně nad hranicí cut off hodnoty, která je 10U/ml , tj. mezi 10 a 20U/ml. Stáří sér bylo v době měření maximálně dva roky od data odběru, byla skladována zmrazená na teplotu -20°C.
20
3.2
METODIKA MĚŘENÍ
3.2.1 Metoda ELISA (Dialab)
Pro rutinní stanovení markerů celiakie se používají komerční sady firmy Dialab. Všechny jsou založeny
na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy. Postup se
shoduje pro všechny stanovované antigeny, tj. atTG IgA, atTG IgG, AGA IgA a AGA IgG. Veškerá stanovení jsou prováděna v duplikátu, tudíž na jedné desce lze stanovit 40 pacientů.
Postup: 1. Všechny vzorky naředíme ředícím pufrem (10µl vzorku + 1000µl pufru) 2. Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetujeme 100µl kalibrátorů, kontrol a předředěných vzorků pacientů. 3. Inkubujeme 30 minut při laboratorní teplotě. 4. Promyjeme 3x300µl promývacího roztoku. 5. Přidáme do všech jamek 100µl konjugátu. 6. Inkubujeme 15 minut při laboratorní teplotě. 7. Promyjeme 3x300µl promývacího roztoku. 8. Přidáme do všech jamek 100µl substrátu. 9. Inkubujeme 15 minut ve tmě při laboratorní teplotě. 10. Ukončíme reakci přidáním 100µl Stop roztoku do každé jamky. 11. Necháme 5minut stát. 12. Do 30ti minut odečteme absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620nm.
Zpracování a vyhodnocení výsledků bylo provedeno programem KIM verze 2.13. Výrobcem doporučované cut off hodnoty se liší v jednotlivých setech (Tab. II).
21
Tab. II. Cut off hodnoty sad Dialab
Sada
Doporučená hodnota cut off (U/ml)
atTG IgA
10
atTG IgG
15
AGA IgA
12
AGA IgG
12
3.2.1.1 Modifikace metody, preinkubace s gliadinem a PTP
Pro zkoumání interakcí mezi tkáňovou transglutaminasou a proteiny, popř. peptidy byl na začátek do metody ELISA zařazen další krok. Byla zkoumána i možnost preinkubace proteinů spolu se sérem, ale ta neměla žádný efekt na výsledné hodnoty absorbance.
Preinkubace s α-, β-, γ-, ω-gliadinem : 1. Do jamky napipetujeme 100µl pufru TRIS-HCl 0,01M pH 7,4 a 10µl roztoku příslušného gliadinu (0; 0,1; 5,0mg/ml) a 5µl CaCl2 (0; 0,5;50mM) 2. Necháme inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě. 3. Promyjeme3x300ml promývacího pufru na automatické promývačce.
Preinkubace s PTP při měření závislosti absorbance na koncentraci proteinu: 1. Do jamky napipetujeme 100µl pufru TRIS-HCl 0,01M pH 7,4 a 10µl roztoku PTP příslušné koncentrace (0,02; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0mg/ml) 2. Necháme inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě. 3. Promyjeme3x300ml promývacího pufru na automatické promývačce.
Preinkubace s PTP při měření závislosti absorbance na pH: 1. Do jamky napipetujeme 100µl pufru 0,01M o příslušném pH (3,4; 4,2; 5,7; 6,2; 6,8; 7,4; 8,2; 9,0; 10,5; 12,0) a 10µl roztoku PTP o koncentraci 1mg/ml. 2. Necháme inkubovat 60 minut při laboratorní teplotě. 3. Promyjeme3x300ml promývacího pufru na automatické promývačce.
22
3.2.2
ImmunoDot (D-tec)
Metoda ImmunoDot je stejně jako rutinní metoda založena na principu nekompetitivní enzymové imunoanalýzy, v provedení na papírových proužcích. Konkrétně na těchto proužcích se stanovují dva antigeny, atTG a AGA vždy ve stejné třídě. Na každém proužku je také pozitivní a negativní kontrola. Najednou lze stanovit maximálně 16 vzorků.
Postup: 1.
Do každé jamky napipetujeme 2 ml promývacího roztoku.
2.
Proužky necháme 10 minut inkubovat za stálého kolébání.
3.
Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem.
4.
Do příslušné jamky přidáme 1,5 ml roztoku na ředění séra a 10µl séra.
5.
Necháme inkubovat 30 minut za stálého kolébání.
6.
Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem.
7.
Promyjeme 3x3minuty 1,5ml promývacího roztoku.
8.
Přidáme 1,5ml konjugátu do každé jamky.
9.
Necháme inkubovat 30 minut za stálého kolébání.
10.
Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem.
11.
Promyjeme 3x3minuty 1,5ml promývacího roztoku.
12.
Přidáme 1,5ml substrátu do každé jamky.
13.
Necháme inkubovat 10 minut za stálého kolébání.
14.
Obsah opatrně vylijeme, proužky přilnou na dno vaničky. Okraje osušíme filtračním papírem.
15.
Reakci zastavíme promytím po dobu 3 minut 1,5ml promývacího roztoku.
16.
Papírové proužky vyndáme z jamek a necháme oschnout.
Výsledné
stanovení
je
kvalitativní
při
vizuálním
vyhodnocení,
popřípadě
semikvantitativní při vyhodnocení počítačovým programem. Vizuálně vyhodnotíme, zda je
23
ploška reprezentující příslušný antigen více zbarvena, pak je vzorek označen za pozitivní, pokud je zbarvena méně nebo je stejné intenzity, vzorek je negativní.
Počítačový program při vyhodnocení přiřadí optické hustotě negativní kontroly hodnotu 0 a optické hustotě pozitivní kontrole hodnotu 100. Na základě těchto hodnot je potom určena konkrétní hodnota stanovovaných plošek. Nemělo by dojít k vyššímu probarvení plošek, které odpovídají množství protilátek, než kontrolních plošek, i když ve výjimečném případě může tato situace nastat a to při tzv. hook efektu. Klinické vyhodnocení testu je pozitivní, je-li hodnota vyšší než 0. (Obr.4) Konkrétní číselná hodnota má význam pouze při opakovaném stanovení jako marker průběhu onemocnění.
Obr. 4. Proužek na stanovení atTG IgG a AGA IgG
Další nespornou výhodou testů atTG IgA a AGA IgA je princip pozitivní kontroly. Pokud se totiž pozitivní kontrola neprobarví, je pravděpodobným důvodem deficience IgA protilátek pacienta. Principiálně je test založen na stanovení příslušné třídy protilátek, jako antigen jsou použity kozí rekombinantní protilátky pro γ-globulinům IgA.
3.2.3
ELISA (D-tec)
Pro srovnání byla některá stanovení provedena i jinou komerční sadou. Principiálně se jedná taktéž o metodu ELISA v provedení na mikrotitračních destičkách. Postup se shoduje pro oba stanovované antigeny, tj. atTG IgA a atTG IgG. Veškerá stanovení jsou prováděna v duplikátu.
24
Postup: 1.
Všechny vzorky naředíme ředícím pufrem (10µl vzorku + 500µl pufru)
2.
Do příslušných jamek mikrotitrační destičky napipetujeme 100ml kalibrátorů, kontrol a předředěných vzorků pacientů.
3.
Inkubujeme 30 minut při laboratorní teplotě.
4.
Promyjeme 3x200µl promývacího roztoku.
5.
Přidáme do všech jamek 100µl konjugátu.
6.
Inkubujeme 30 minut při laboratorní teplotě.
7.
Promyjeme 3x200µl promývacího roztoku.
8.
Přidáme do všech jamek 100µl substrátu.
9.
Inkubujeme 10 minut ve tmě při laboratorní teplotě.
10.
Ukončíme reakci přidáním 100µl Stop roztoku do každé jamky.
11.
Do 30ti minut odečteme absorbanci při vlnové délce 450nm. Referenční vlnová délka je 620nm.
Zpracování a vyhodnocení výsledků bylo provedeno programem KIM verze 2.13. Výrobcem doporučované cut off hodnoty se liší v jednotlivých setech (Tab. III).
Tab. III. Cut off hodnoty sad D-tek
Doporučená hodnota
Sada
3.2.4
cut off (U/ml)
atTG IgA
50
atTG IgG
25
Výpočet diagnostické senzitivity, specificity a Cohenova κ Tab. IV. Příklad výpočtu senzitivity a specificity
referenční metoda negativní pozitivní
testovaná metoda negativní pozitivní TN FP FN TP
25
Specificita (SP) = TN/(TN+FN) Senzitivita (SN) = TP/(TP+FP) Pomocná hodnota Q = (TP+FN)*(TP+FP)+(FN+TN)*(FP+TN) Cohenovo κ = [(TP+TN)-Q]/(1-Q)
Při úplném souhlasu testované metody s referenční je κ = 1, při úplném nesouhlasu je κ = 0.
3.2.5
Hmotnostní spektrometrie spojená s kapilární chromatografií
Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou.
Instrument: Hybridní hmotnostní spektrometr Q-TOF Micro (Waters Micromass) spojený s 2D kapilární chromatografií 2D CapLC (Waters)
1. použitý iontový zdroj: nanospray 2. první kolona Symetry300, C18, 5um OPTI-PAK 3. druhá kolona Atlantis dC18, 150 x 75um x 3um
M.F. : 1. 90% ACN + 10% (0,1% TFA) 2. 2% ACN + 98% (0,1% TFA)
Průtok na kolonu 4ul/min Průtok do zdroje 200nl/min Gradientový program 1Run 60minut Nástřik 1,5µl
26
Identifikace fragmentů: 1. analýza směsi tryptických štěpů v režimu MS (150-2000Da) 2. MS/MS fragmentace tryptických štěpů převážně z 2x nabitých iontů prekurzorů 3. de-novo sekvenování pomocí hmotnostního spektrometru 4. databazové vyhledávání BLAST search
3.2.6
MALDI TOF hmotnostní spektrometrie
Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou.
MALDI instrument: MALDI TOF hmotnostní spektrometr, REFLEX IV , Bruker Daltonics Použité matrice: α-kyselina hydroxyskořicová kyselina synapová
27
4.
4.1
VÝSLEDKY A DISKUSE
SROVNÁNÍ RUTINNÍ METODY ELISA A METODY IMMUNODOT
Skupiny pacientů byly vybrány s ohledem na požadované výsledky. Hlavním bodem bylo zjištění, zdali lze stanovení získané oběma metodami považovat za ekvivalentní, tedy jestli informace pro lékaře (pozitivní nebo negativní) bude stejná. Červeně jsou v grafech označeny příslušné cut off hodnoty. Tabulka, obsahující veškeré použité hodnoty, je v příloze. (Tab. XIV)
4.1.1
Srovnání rutinní metody ELISA (Dialab) a metody ImmunoDot
Srovnání bylo provedeno pro čtyři markery onemocnění, atTG IgA, atTG IgG, AGA IgA a AGA IgG.
4.1.1.1 Srovnání stanovení atTG IgA Graf 1. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro atTG IgA 100 90 80
ImmunoDot
70 60 > 10 U/ml 10 -20 U/ml 80 - 205 U/ml
50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
ELISA (U/ml)
28
200
250
Tab. V. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro atTG IgA
atTG IgA ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 32 0 pozitivní 14 50
Celkově se tyto metody shodly ve 85,4% případů. (Tab. V) Na výsledném grafu (Graf 1) jsou dobře patrné všechny tři vybrané skupiny pacientů. Obě jednoznačně klasifikovatelné skupiny, jak vysoce pozitivní tak i negativní, se shodují ve výsledcích ve 100%. V případě třetí skupiny, tedy pacientů jejichž hodnoty atTG IgA se pohybují těsně nad hranicí cut off (mezi 10 – 20 U/ml) , došlo mezi oběma metodami k výrazným rozdílům. Z počtu 32 pacientů v této skupině bylo jako pozitivní označeno 18 pacientů, tj. v 56,3% případů. U zbylých 14 pacientů, tj. ve 43,7% případů, došlo k rozporu. Podstatné je, že ve všech limitních případech se výsledky těchto testů shodují, neboť výsledky pacientů nemocných celiakií bývají většinou velmi vysoké.23 Diagnostická specificita metody ImmunoDot je vzhledem k rutinní metodě 100% a diagnostická senzitivita je 78,1%. Cohenovo κ je 0,70.
4.1.1.2 Srovnání stanovení atTG IgG
Při rutinním stanovení tohoto antigenu se celkově dosahuje mnohem nižších hodnot než u ostatních antigenů. Jak je patrné i z grafu (Graf 2), žádná z hodnot získaná rutinní metodou nebyla vyšší než 80U/ml. Naproti tomu při stanovení metodou ImmunoDot bylo 22 pacientů, kteří podle metody ELISA byly označeny negativně, určeno jako pozitivní. Opačná situace nastala pouze u jednoho pacienta. K shodě došlo celkem v 76% případů. (Tab. VI) Diagnostická specificita metody ImmunoDot je vzhledem k rutinní metodě 65,6% a diagnostická senzitivita je 96,9%. Cohenovo κ je 0,54.
29
Graf 2. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro atTG IgG 100 90 80
ImmunoDot
70 60 50 40 30 20 10 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
ELISA (U/ml)
Tab. VI. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro atTG IgG
atTG IgG ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 42 22 pozitivní 1 31
4.1.1.3 Srovnání stanovení AGA IgA a IgG
Srovnání výsledků těchto dvou metod je z analytického hlediska nelogické, neboť každá z metod používá pro stanovení jiný antigen, v případě metody ELISA se jedná o purifikovaný α- gliadin v případě metody ImmunoDot se jedná o surový gliadin, tedy směs α, β-, γ- a ω-gliadinů. Nicméně zde toto srovnání uvádím a to z toho důvodu, že v klinické laboratorní praxi nejsou tyto antigeny z hlediska diagnózy nijak rozlišovány.
30
Graf 3. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro AGA IgA 100 90 80
ImmunoDot
70 60 50 40 30 20 10 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
ELISA (U/ml)
K celkové shodě došlo v případě AGA IgA v 79,2% a v případě AGA IgG v 80,2% stanovení. (Tab. VII, Tab. VIII) Tato čísla ovšem, navzdory očekávání nejsou nijak výrazně nízká vzhledem k procentům shody u metod atTG IgA a atTG IgG, a tak je zřejmé, že analytická chyba způsobená jiným antigenem nebude mít zásadní vliv na shodu obou stanovení. (Graf 3, Graf 4)
Tab. VII. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro AGA IgA
AGA IgA ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 56 2 pozitivní 18 20
31
Graf 4. Korelační graf metod ELISA a ImmunoDot pro AGA IgG 100 90 80
ImmunoDot
70 60 50 40 30 20 10 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
ELISA (U/ml)
Tab. VIII. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ImmunoDot pro AGA IgG
AGA IgG ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 44 3 pozitivní 16 33
V případě rozporů se ve většině případů jednalo o vzorky určené metodou ImmunoDot jako negativní, kdežto rutinní laboratorní metoda je stanovila jako pozitivní. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky AGA IgA je vzhledem k rutinní metodě 96,6% a diagnostická senzitivita je 52,6%. Cohenovo κ je 0,53. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky AGA IgG je vzhledem k rutinní metodě 93,6% a diagnostická senzitivita je 67,3%. Cohenovo κ je 0,61. Tyto výsledky podporuje tvrzení, že metody s purifikovaným gliadinem mají vyšší senzitivitu než metody používající směs gliadinů.28
32
4.1.2
Srovnání vizuálního vyhodnocení metody ImmunoDot a jejího vyhodnocení počítačovým programem
Vyhodnocení papírových proužků metody ImmunoDot bylo provedeno jak vizuálně, kdy byly proužky vyhodnoceny pouze kvalitativně, tedy jako negativní nebo pozitivní na příslušné antigeny, a také pomocí počítačového programu, který přiřadí optické hustotě negativní kontroly hodnotu 0 a optické hustotě pozitivní kontroly hodnotu 100, a na základě takto získaných hodnot je potom přiřazena i hodnota stanovovaným protilátkám.
Celkem bylo vyhodnoceno 384 stanovení metodou ImmunoDot. Oba způsoby vyhodnocení se shodly v 91,5% případů. Naprostá většina rozporů se týkala situace, kdy byly protilátky vyhodnoceny vizuálně jako pozitivní a následné vyhodnocení počítačovým programem je označilo jako negativní (Obr. 5), opačný případ nastal pouze jeden. Semikvantitativní vyhodnocení má důležitou roli při monitorování průběhu nemoci, ale z analytického hlediska je vizuální vyhodnocení dostatečně spolehlivé. Lze se ho velmi rychle naučit, o čemž svědčí fakt, že po první polovině provedených stanovení došlo ke shodě mezi vizuálním a počítačovým vyhodnocením v 86,9% a v druhé polovině v 95,8% případů.
Obr. 5. Příklad rozporu mezi vizuálním vyhodnocením a vyhodnocením počítačovým programem
33
4.1.3 Srovnání atTG IgA s vyhodnocením proužku ImmunoDot IgA jako celku
Účelem tohoto srovnání je zjistit, jaké výsledky bychom získali, kdybychom nahradili stanovení atTG IgA rutinní ELISA metodou, které je doporučováno pro screening celiakie, výsledky získanými z proužků ImmunoDot IgA, které nám poskytují pouze semikvantitativní informaci, ale zato o dvou markerech, atTG IgA a AGA IgA.
U pacientů, jejichž výsledek byl podle rutinního stanovení atTG IgA negativní, stejně jako podle stanovení toho markeru metodou ImmunoDot, byl pouze u jednoho pacienta zjištěn metodou ImmunoDot pozitivní výsledek na AGA IgA. U pacientů s vysokou hodnotou atTG IgA, byly metodou ImmunoDot všichni pacienti označeny za pozitivní na atTG IgA a 50% z nich bylo současně pozitivní i na AGA IgA.
Dle předpokladů bylo nejzajímavější vyhodnocení skupiny pacientů, jejichž hodnoty byly těsně nad hranicí cut off hodnoty. Z 32 pacientů v této skupině bylo 14 pacientů pozitivních pouze na atTG IgA, 1 pacient pozitivní pouze na AGA IgA a 4, kteří byli pozitivní na oba markery. U žádného pacienta nebyl metodou ImmunoDot zjištěn deficit IgA protilátek.
Pokud posuzujeme výsledek stanovení metodou ImmunoDot jako pozitivní v případě, že je pozitivní alespoň jeden z markerů stanovovaným na proužku a tyto výsledky následně porovnáme s rutinní metodou, kterou považujeme za referenční, dostaneme hodnoty diagnostické specificity 96,9%, diagnostické senzitivity 79,7% a Cohenovo κ je 0,51.
Srovnáním těchto statistických hodnot s hodnotami získanými porovnáním rutinní metody s metodou ImmunoDot tgTG IgA došlo ke snížení diagnostické specificity ze 100% na 96,9% a ke zvýšení senzitivity ze 78,1% na 79,7%. Lze tedy konstatovat, že zahrnutí stanovení AGA IgA nepřineslo žádné výrazné zlepšení diagnostických vlastností.
34
4.1.4
Srovnání metody ELISA D-tek a metody ImmunoDot D-tek
Účelem tohoto stanovení bylo zjistit, jak dobře korelují hodnoty získané metodou ELISA a metodou ImmunoDot, pokud se v případě metody ELISA použije jiná komerční sada. Obě tyto metody pocházejí od stejného výrobce a pravděpodobně používají stejný antigen.
Toto srovnání vychází z vyhodnocení 40 pacientů, kteří byli vybráni z původní skupiny. Do výběru byli zahrnuti pacienti s vysokou hodnotou atTG IgA, a všichni pacienti, u kterých došlo k neshodě mezi stanovením rutinní metodou ELISA a metodou ImmunoDot.
Graf 5. Korelační graf metod ELISA D-tec a ImmunoDot pro atTG IgA 100 90 80
ImmunoDot
70 60 80 - 205 U/ml
50
10 - 20 U/ml < 10 U/ml
40 30 20 10 0 0
100
200
300
400
500
600
700
ELISA D-tec (U/ml)
Tab. IX. Vyhodnocení metod ELISA D-tek a ImmunoDot pro atTG IgA
atTG IgA ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 7 0 pozitivní 2 31
35
800
900
Graf 6. Korelační graf metod ELISA D-tec a ImmunoDot pro atTG IgG 100 90 80
ImmunoDot
70 60 50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
ELISA D-tec (U/ml)
Tab. X. Vyhodnocení metod ELISA D-tek a ImmunoDot pro atTG IgG
atTG IgG ImmunoDot ELISA negativní pozitivní negativní 4 2 pozitivní 1 31
Už na grafech (Graf 5, Graf 6) je jednoznačně vidět, že zde dochází k vyšší shodě než při srovnání metody ImmunoDot s rutinní metodou. Míra shody je vysoká pro stanovení protilátek obou tříd, pro IgA je 95% a pro IgG je 95,2%. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky atTG IgA je vzhledem k rutinní metodě 100% a diagnostická senzitivita je 93,9%. Cohenovo κ je 0,84. Diagnostická specificita metody ImmunoDot pro protilátky AGA IgG je vzhledem k rutinní metodě 93,6% a diagnostická senzitivita je 67,3%. Cohenovo κ je 0,61. Tyto výsledky odpovídají předpokladu, že je používám stejný antigen. (Tab. IX, Tab. X)
36
4.1.5 Srovnání stanovení protilátek různými komerčními sety metodou ELISA
Při vyhodnocení atTG IgA došlo ke shodě ve 100% (Tab. XI, Graf 7) a tudíž i diagnostická specificita metody ELISA (D-tek) je vzhledem k rutinní metodě 100% a diagnostická senzitivita je 100%. Cohenovo κ je 1. Nicméně se dá předpokládat, že tyto ideální výsledky jsou způsobeny výběrem vzorků a pokud by bylo možné srovnat celé spektrum vzorků, jistě by se objevily případy, jejichž stanovení by bylo rozdílné.
Graf 7. Korelační graf metod ELISA D-tec a ELISA Dialab pro atTG IgA 300,00
ELISA Dialab U/ml
250,00
200,00 80 - 205 U/ml < 10 U/ml
150,00
10 - 20 U/ml
100,00
50,00
0,00 0
100
200
300
400
500
600
700
ELISA D-tec (U/ml)
Tab. XI. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ELISA D-tek pro atTG IgA
ELISA D-tek ELISA Dialab negativní pozitivní negativní 7 0 pozitivní 0 33
37
800
900
Při srovnání hodnot atTG IgG (Tab. XII, Graf 8) byly zjištěny velice podobné výsledky jako v případě porovnání rutinně používané metody ELISA a metody ImmunoDot. V obou srovnáních se většina rozporů týkala případů, kdy rutinní metoda (Dialab) stanovila vzorek jako negativní a metoda firmy D-tek ho označila za pozitivní. Diagnostická specificita metody ELISA (D-tek) je vzhledem k rutinní metodě 20,8% a diagnostická senzitivita je 93,8%. Cohenovo κ je 0,12.
Graf 8. Korelační graf metod ELISA D-tec a ELISA Dialab pro atTG IgG 35,00
ELISA Dialab U/ml
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00 0
50
100
150
200
250
300
ELISA D-tec (U/ml)
Tab. XII. Vyhodnocení metod ELISA Dialab a ELISA D-tek pro atTG IgG
ELISA D-tek ELISA Dialab negativní pozitivní negativní 5 19 pozitivní 1 15
38
350
400
4.2
INTERAKCE MEZI TKÁŇOVOU TRANSGLUTAMINASOU A GLIADINEM NEBO JEHO FRAGMENTY
4.2.1
Interakce mezi gliadinem a tkáňovou transglutaminasou
Účelem této části práce bylo zjistit, zda inkubace tkáňové transglutaminasy s gliadinem, neboli enzymu se substrátem, bude mít nějaký vliv na výslednou hodnotu protilátek třídy IgA proti tomuto enzymu. Byly zjišťovány hodnoty absorbance pro všechny čtyři druhy gliadinu, a to ve dvou různých koncentracích příslušného gliadinu, ve dvou různých koncentrací CaCl2. Bylo použito sérum pacienta, který měl velmi vysokou hodnotu protilátek atTG IgA. Byla provedena stanovení absorbance pro všechny možné kombinace jednotlivých složek směsi. Bohužel i při opakování tohoto pokusu preinkubace s přídavkem gliadinu neprokázala žádný významný vliv na výsledné hodnoty.
4.2.2
Interakce mezi PTP fragmenty α-gliadinu a tkáňovou transglutaminasou
Při provedení stejného pokusu, tedy stanovení atTG IgA s PTP bylo překvapivě zjištěno, že interakce mezi tkáňovou transglutaminasu se snižují v závislosti na zvyšující se koncentraci PTP, navzdory očekávání, že by tomu mělo být naopak. (Graf 9) Tato závislost má exponenciální charakter. Je zřejmé, že tyto fragmenty blokují epitopy pro vazbu protilátek atTG IgA v séru pacienta.
Ještě předtím byla změřena závislost této interakce na pH použitém při inkubaci. (Graf 10) Bylo zjištěno, že v oblasti mezi pH 6,0 a pH 12,0 dochází k výraznému snížení naměřených protilátek. Výsledky odpovídají modelu chování tkáňové transglutaminasy při různých pH. Při pH kolem 7,3 dochází většinou ke vzniku intramolekulárních vazeb mezi fragmenty a tkáňovou transglutaminasou a mezi fragmenty samými, čímž dojde k zablokování epitopů a ke snížení stanovené hodnoty. Při snížení pH na hodnotu 4 ovšem dochází převážně k deaminaci přítomných fragmentů, tyto produkty byly následně odstraněny promytím a výsledná hodnota zůstane beze změny.23
39
Graf 9. Závislost interakce PTP a tkáňové transglutaminasy na koncentraci PTP 1,4 1,2 1
A
0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
200
400
600
800
1000
c (µg/ml)
Graf 10. Závislost interakce PTP a tkáňové transglutaminasy na pH 1,2
1
A
0,8
0,6
0,4
0,2
0 0
2
4
6
8
pH
40
10
12
14
4.2.3
Chromatografie PTP fragmentů
Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou.
Vzhledem k tomu, že měření bylo provedeno na jiné koloně a s rozdílným průběhem gradienty, nelze chromatogram srovnat s původním chromatogramem, který byl měřen v době přípravy vzorku. Nicméně nám potvrzuje přítomnost široké škály peptidových fragmentů ve vzorku PTP. (Graf. 11)
Graf 11. Chromatografie vzorku PTP v gradientu acetonitrilu (ACN)
41
4.2.4
Určení molekulové hmotnosti fragmentů pomocí MALDI-TOF
Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou.
Toto měření zjistilo velmi rozmanitou směs fragmentů a různých molekulových hmotnostech. (Graf 12, Graf 13)
Graf 12. MALDI spektrum 700 – 4000Da
42
Graf 13. MALDI spektrum 3000 – 7000Da
4.2.5
Sekvenace PTP fragmentů de novo následná identifikace pomocí BLAST vyhledávání
Měření bylo provedeno na Ústavu organické chemie a biochemie Akademie Věd ČR Mgr.Miloslavem Šandou.
Při sekvenaci byly mezi množstvím fragmentů nalezeny pouze tři, jež z vysokou pravděpodobností pochází z α-gliadinu (Tab. XIII). Identifikace proběhla pomocí BLAST vyhledávání. Bohužel, všechny tři fragmenty se ve vzorku nacházeli ve velmi malém množství, a proto je nebylo možné použít pro další stanovení.
43
Tab. XIII. Identifikované fragmenty a jejich molární hmotnosti
Identifikovaný fragment
Molekulová hmotnost (Da)
QPFPQPQLP40
1051
41
1081
QLQPFPQPQ
RPQQPYPQPQPQ42
1462
Výsledky tohoto stanovení jsou velmi překvapivé. Vzorek PTP, který obsahuje literárně popsané biologicky aktivní peptidy (Tab. XIII), pravděpodobně inhibuje protilátky proti tkáňové transglutaminase v testované ELISA soupravě. Ačkoli se dalo předpokládat, že ve vzorku se budou nacházet i fragmenty vzniklé vzájemným rozštěpením přítomných enzymů, z hlediska výtěžnosti by maximální možné množství fragmentů nepocházejících z gliadinu nemělo být vyšší než 20%. Bohužel je nejasné, z jakého důvodu bylo identifikováno tak malé množství fragmentů. Je možné, že vliv na to bude mít stáří vzorku (18 let), ale vzhledem k jeho způsobu skladování ve formě lyofilizátu a při teplotě 4ºC by tento vliv měl být minimální.
44
5.
ZÁVĚR
Bylo provedeno srovnání rutinní metody s nově dostupnou metodou ImmunoDot. Ačkoli vyhodnocení metodou ImmunoDot je pouze semikvantitativní, výsledky lze považovat za ekvivalentní. Na základě této práce je možné doporučit metody ImmunoDot ve třídě IgA pro screeningová vyšetření v klinických laboratořích.
Hodnoty získané počítačovým vyhodnocením lze použít k monitorování průběhu nemoci a reakce pacienta na bezlepkovou dietu. I když stanovení metodou ELISA nám dává konkrétní hodnotu, vzhledem k tomu, že se jedná o analýzu biologického materiálu, tato hodnota slouží stejně jako u semikvantitativního stanovení pouze ke sledování průběhu onemocnění. Pozitivní kontrola metody ImmunoDot navíc detekuje přítomnost protilátek třídy IgA, tudíž je schopná diagnostikovat deficienci IgA.
Při srovnání stanovení jednotlivých protilátek rutinní metodou a metodou ImmunoDot bylo dosaženo nejvyšší diagnostické specificity v případě atTG IgA, a to 100%. Tato ideální hodnota je zčásti jistě dána výběrem pacientů, nicméně stanovení má i druhou nejvyšší specificitu a tudíž nejlepší diagnostické vlastnosti. Srovnání atTG IgG má naopak nejnižší diagnostickou specificitu vzhledem k rutinní metodě, ale na základě jejích dlouhodobých výsledků existuje podezření, že rutinní metoda má velmi nízkou diagnostickou senzitivitu. Při srovnání stanovení protilátek AGA bylo s ohledem na použití dvou různých antigenům dosaženo překvapivě vysokých hodnot specificity.
Při vyhodnocení diagnostických vlastností proužku ImmunoDot IgA jako celku dostaneme v případě jeho srovnání s rutinním stanovením atTG IgA podobné hodnoty, jako kdybychom výsledky zjištěné metodou ImmunoDot AGA IgA do srovnání nezahrnuli. Stanovení AGA IgA neznamená proto žádný významný přínos, co se týče jeho diagnostických vlastností.
45
Z praktického hlediska je provedení na mikrotitračních destičkách vhodné pro větší laboratoře, neboť se dá stanovit až 40 vzorků najednou během dvou hodin. Stanovení nízkého počtu vzorků by bylo ekonomicky nevýhodné, vzhledem k nutnosti použití kalibračních roztoků a kontrol. Naproti tomu, metoda ImmunoDot má výhodu v případě nižšího počtu stanovení, neboť každý proužek má vlastní pozitivní i negativní kontrolu a stanovení vzorků lze provádět individuálně.
Při studiu nebyly interakce mezi tkáňovou transglutaminasou a gliadinem zjištěny, a to odpovídá biologickému modelu, že se tyto látky v organismu nesetkají. Oproti tomu byla prokázána interakce mezi enzymem a fragmenty PTP a bylo prokázáno, že PTP fragmenty blokují epitopy tkáňové transglutaminasy, na které se vážou protilátky. Zvýšení koncentrace PTP má za následek snížení množství protilátek proti atTG IgA v séru.
Bohužel při
identifikaci jednotlivých peptidových fragmentů se podařilo prokazatelně určit jen tři fragmenty, které pocházejí z α-gliadinu. Fragmenty se vyskytovaly ve velmi malém množství a tudíž je nelze pro další experimenty znovu použít. Pro další práci na tomto experimentu bude nutné především získat dostatečné množství PTP fragmentů a znát přesné složení vzorku.
46
6.
1.
LITERATURA
Kocna P. v knize: Kapitoly z klinické biochemie, 2.doplněné vydání (Schneiderka P. a kol.), Karolinum, Praha 2004.
2.
Ciccocioppo R., Di Sabatino A., Corazza GR.: Clin Exp Immunol. 140, 408 (2005).
3.
Bevan S., Popat S., Braegger CP., Busch A., O'Donoghue D., Falth-Magnusson K., Ferguson A., Godkin A., Hogberg L., Holmes G., Hosie KB., Howdle PD., Jenkins H., Jewell D., Johnston S., Kennedy NP., Kerr G., Kumar P., Logan RF., Love AH., Marsh M., Mulder CJ., Sjoberg K., Stenhammer L., Walker-Smith J., Marossy AM., Houlston RS.: J Med Genet. 36, 687 (1999).
4.
Shan L., Molberg O., Parrot I., Hausch F., Filiz F., Gray GM., Sollid LM., Khosla C. Science. 297, 2275 (2002).
5.
Koning F., Gilissen L., Wijmenga C.: Springer Semin Immun 27, 217 (2005).
6.
Shan L., Qiao S., Arentz-Hansen H., Molberg Q., Gray G., Sollid L., Khosla Ch.: J. Proteome Res. 4, 1732 (2005).
7.
Wieser H., Seilmeier W., Eggert M., Belitz HD.: Z Lebensm- Unters-Forsch 177, 457 (1983).
8.
Maki M., Collin P.: Lancet 349, 1755 (1997).
9.
Meize-Grochowski R.: Gastroenterol Nurs. 28, 394 (2005).
10.
Kagnoff MF.: Gastroenterology 128, S10 (2005).
11.
Mazzarella G., Maglio M., Paparo F., Nardone G., Stefanile R., Greco L., van de Wal Y., Kooy Y., Koning F., Auricchio S., Troncone R.: Gut. 52, 7(2003).
12.
McGough N., Cummings JH.: Proc Nutr Soc. 64, 434 (2005).
13.
Fasano A., Berti I., Gerarduzzi T., Not T., Colletti RB., Drago S., Elitsur Y., Green PH., Guandalini S., Hill ID., Pietzak M., Ventura A., Thorpe M., Kryszak D., Fornaroli F., Wasserman SS., Murray JA., Horvath K.: Arch Intern Med. 163, 286 (2003).
47
14.
Hoffenberg EJ., MacKenzie T., Barriga KJ., Eisenbarth GS., Bao F., Haas JE., Erlich H., Bugawan Tl. T., Sokol RJ., Taki I., Norris JM., Rewers M.: J Pediatr. 143, 308 (2003).
15.
Mowat AM.: Lancet. 361, 1290 (2003).
16.
Monsuur AJ., de Bakker PI., Alizadeh BZ., Zhernakova A., Bevova MR., Strengman E., Franke L., van't Slot R., van Belzen MJ., Lavrijsen IC., Diosdado B., Daly MJ., Mulder CJ., Mearin ML., Meijer JW., Meijer GA., van Oort E., Wapenaar MC., Koeleman BP., Wijmenga C.: Nat Genet. 37, 1341 (2005).
17.
Janatuinen EK., Kemppainen TA., Julkunen RJ., Kosma VM., Maki M., Heikkinen M., Uusitupa MI.: Gut. 50, 332 (2002).
18.
Hořejší V., Bartůňková J. v knize: Základy Imunologie, 2. vydání, Triton, Praha 2001.
19.
Green PHR., Stavropoulos SN., Panagi SG., Goldstein SL., Mcmahon DJ., Absan H., Neugut AI.: Am J Gastroenterol. 96, 126 (2001).
20.
Bai J., Zeballos E., Fried M., Corazza G.R., Schuppan D., Farthing M.J.G., Catassi C., Greco L., Cohen H., Krabshuis J.H. [online]: WGO-OMGE Practice Guideline Celiac Disease, 2005, Url: http://www.omge.org/globalguidelines/guide13/guideline13.htm.
21.
Walker-Smith JA., Guandalini S., Schmitz J., Shmerling DH., Visakorpi JH.: Arch. Dis. Child. 65, 909 (1990).
22.
Sollid LM.: Nat Rev Immunol. 2, 647 (2002).
23.
Corazza GR., Strocchi A., Rossi R., Sirola D., Gasbarrini G.: Gut. 29, 44 (1988).
24.
Kocna P. [online]: MiniEncyklopedie laboratorních metod v gastroenterologii, 2006, Url: http://www1.lf1.cuni.cz/~kocna/glab/glency1.htm.
25.
Parente F., Bianchi Porro G.: Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 803 (2001).
26.
Van Meensel B., Hiele M., Hoffman I., Vermeire S., Rutgeerts P., Geboes K., Bossuyt X.: Clin Chem. 50, 2125 (2004).
27.
Mohan K., Pinto D., Issekutz TB.: J Immunol. 171, 3179 (2003).
28.
Stern M.: J Pediatr Gastroenterol Nutr. 31, 513 (2000).
29.
Korponay-Szabo IR., Dahlbom I., Laurila K., Koskinen S., Woolley N., Partanen J., Kovacs JB., Maki M., Hansson T.: Gut. 52, 1567 (2003).
48
30.
Hill PG., Thompson SP., Holmes GK.: Clin Chem. 37, 647 (1991).
31.
Kocna P., Vanickova Z., Perusicova J., Dvorak M.: Clin Chem Lab Med. 40, 485 (2002).
32.
Janatuinen EK., Kemppainen TA., Julkunen RJ., Kosma VM., Maki M., Heikkinen M., Uusitupa MI.: Gut. 50, 332 (2002).
33.
Greenberg CS., Birckbichler PJ., Rice RH:. FASEB J. 5, 3071(1991).
34.
Maiuri L., Ciacci C., Ricciardelli I., Vacca L., Raia V., Rispo A., Griffin M., Issekutz T., Quaratino S., Londei M.: Gastroenterology 129, 1400 (2005).
35.
Kodíček M. v knize: Studijní materiály z enzymologie , 1. vydání, VŠCHT, Praha 2003.
36.
Shewry PR., Halford NG.: J Exp Bot. 53, 947 (2002).
37.
Corrao G., Corazza GR., Bagnardi V., Brusco G., Ciacci C., Cottone M., Sategna Guidetti C., Usai P., Cesari P., Pelli MA., Loperfido S., Volta U., Calabro A, Certo M.: Lancet. 358, 356 (2001).
38.
Dewar D., Pereira SP., Ciclitira PJ.: Int J Biochem Cell Biol. 36, 17 (2004).
39.
Kocna P., Fric P., Kocova-Holakova M., Slaby J., Kasafirek E., Hekkens WT.: J Chromatogr. 434, 429 (1988).
40.
Hausch F., Shan L., Santiago NA., Gray GM., Khosla C.: Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 283, G996 (2002).
41.
Martucci S., Fraser JS., Biagi F., Corazza GR., Ciclitira PJ., Ellis HJ.: Eur J Gastroenterol Hepatol. 15,1293(2003).
42.
Cornell HJ.: J Protein Chem. 17, 739 (1998).
49
7.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
ACN
acetonitril
AGA
protilátky proti gliadinu
APC
buňka prezentující antigen
ARA
protilátky proti retikulinu
ASCA
protilátky proti Saccharomyces cerevisiae
atTG
protilátky proti tkáňové transglutaminase
CD8+
receptor T buněk
ELISA
nekompetitivní enzymová imunoanalýza
EMA
protilátky proti endomysiu
ESPGHAN
European society for paediatrics gastroenterology, hepatology and nutrition
HLA
lidské leukocytární antigeny
HLA DQ2
lidské leukocytární antigen DQ2
HLA DQ8
lidské leukocytární antigen DQ8
IRMS
isotope ratio mass spectrometry
mAb 6B9
monoklonální protilátky 6B9
MCS
molekulární korelační spektroskopie
MS
hmotnostní spektrometrie
NDIRS
nondispersive isotope-selective infrared spectroscopy
PTP
směs fragmentů gliadinů po štěpení pepsinem, trypsinem, a pankreatinem
TCR
T-receptor
TEM
transepiteliální membrána
TFA
kyselina trifluoroctová
tTG
tkáňová transglutaminasa
50
8.
PŘÍLOHY
51
Tabulka XIV. Přehled všech hodnot použitých při srovnání metody ELISA a metody ImmunoDot 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 cut off
tTG IgA 0,09 0,11 0,50 0,52 0,54 0,56 0,57 0,59 0,59 0,61 0,65 0,66 0,68 0,72 0,72 0,72 0,80 0,82 0,84 0,92 0,95 0,95 0,98 1,00 1,01 1,04 1,05 1,05 1,05 1,09 1,26 1,33
tTG-A D-tek
10,00
50,00
0,00
7,08
4,85 5,67
3,83 3,67
5,28
d tTG IgA
d tTG IgA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
tTG IgG 0,37 14,60 0,77 0,77 3,61 2,50 7,12 4,40 5,40 2,76 4,60 1,32 7,12 3,35 1,90 2,98 8,45 0,77 27,50 1,08 8,45 2,30 3,81 2,07 2,50 5,14 2,74 7,95 0,49 4,21 1,57 2,53
tTG-G D-tek
-
>0
15,000
25,00
6,58
1,34
29,20 61,60
3,14 11,86
34,20
d tTG IgG
d tTG IgG
+ + + + + -
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11 64 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 77 0 0 0 0 0 0 0
G IgA 0,20 0,14 0,22 0,28 0,25 10,16 0,04 0,76 0,04 0,51 4,60 0,73 0,26 25,68 22,08 0,27 1,51 0,14 0,66 2,60 1,36 2,04 2,12 7,48 13,16 5,76 10,12 2,87 0,83 3,65 1,32 9,56
>0
12,0
52
d G IgA
d G IgA
+ + + -
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
G IgG 0,25 4,04 0,80 1,26 1,52 1,06 2,16 0,72 0,99 0,87 2,33 3,34 4,48 88,80 1,60 7,08 14,12 0,96 5,60 1,46 4,48 0,81 2,24 1,78 51,60 14,28 10,20 8,40 10,84 1,79 0,65 1,05
>0
12,0
d G IgG + + + + -
d G IgG EMA HIST 1 0 neg 2 0 neg 3 0 neg 4 0 neg 5 0 neg 6 0 neg 7 0 neg 8 0 neg 9 0 neg 10 0 neg 11 0 neg 12 0 neg 13 0 neg 14 100 neg 15 0 neg 16 0 neg 17 15 neg 18 0 neg 19 0 neg 20 0 neg 21 0 neg 22 0 neg 23 0 neg 24 0 neg 25 100 neg 26 0 neg 27 0 neg 28 0 neg 29 0 neg 30 0 neg 31 0 neg 32 0 neg >0
pokračování Tabulky XIV. 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 cut off
tTG IgA 12,10 12,50 12,60 12,60 12,70 12,70 13,00 13,10 13,40 13,40 14,00 14,00 14,30 14,60 14,60 14,70 14,70 15,00 15,90 16,00 16,20 16,40 16,70 16,70 17,00 17,10 17,40 17,50 17,50 17,60 17,70 17,80
tTG-A D-tek 299,00
10,00
50,00
511,00 197,00 666,00 465,00 471,00 314,00
346,00 270,00 180,00
259,00 215,00
380,00 276,00 350,00
d tTG IgA
d tTG IgA
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
28 30 22 14 15 6 6 14 15 0 0 0 17 0 32 18 31 0 0 22 5 0 0 0 0 0 0 5 10 0 0 16
tTG IgG 8,82 11,30 8,85 12,40 6,03 9,55 15,30 17,10 5,10 3,84 4,28 2,94 13,20 4,00 7,67 4,21 19,40 6,84 3,88 3,88 8,32 3,18 3,94 41,00 2,84 2,49 3,98 8,70 2,97 5,74 1,82 10,10
tTG-G D-tek 117,00
>0
15,000
25,00
81,20 90,20 25,60 52,80 86,80 16,10
11,42 128,60 86,00
29,20 53,60
53,00 234,00 77,60
d tTG IgG
d tTG IgG
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
76 0 33 62 0 0 100 80 6 0 0 36 18 100 0 96 52 0 0 31 73 0 14 100 0 0 0 14 0 100 0 59
G IgA 4,84 8,00 2,91 17,76 0,81 8,96 19,48 3,60 3,92 6,76 5,24 3,08 6,40 85,60 23,2 26,16 6,16 9,2 3,2 3,29 24,76 0,80 6,28 7,84 8,1 2,10 3,27 5,32 19,40 18,92 2,54 73,60
>0
12,0
53
d G IgA
d G IgA
+ + + + + + + + + +
0 0 0 0 29 15 0 0 0 0 0 0 0 62 0 46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 37
G IgG 17,72 3,03 3,43 35,68 15,52 7,80 46,00 11,64 6,96 8,88 8,44 18,36 1,85 63,60 11,28 10,32 1,97 1,58 1,90 11,16 27,08 19,40 9,52 95,20 1,82 1,68 21,76 6,88 15,56 90,80 21,28 48,00
>0
12,0
d G IgG
d G IgG
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0 0 0 53 0 0 100 0 17 15 0 84 0 63 0 19 0 0 0 0 100 0 0 100 0 0 59 0 0 69 0 15 >0
EMA HIST 33 neg 34 pozit 35 pozit 36 pozit 37 neg 38 neg 39 pozit N 40 neg 41 pozit 42 neg neg 43 44 neg 45 neg 46 pozit 47 neg 48 neg-g 49 neg 50 neg-p 51 neg 52 neg-x 53 pozit 54 neg 55 neg 56 neg 57 neg-g 58 neg 59 neg 60 neg 61 pozit 62 pozit 63 neg 64 pozit
pokračování Tabulky XIV. 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 cut off
tTG IgA 80,60 85,80 87,70 89,00 93,60 95,70 102,00 118,00 118,00 119,00 123,00 127,00 132,00 137,00 157,00 169,00 171,00 172,00 173,00 177,00 178,00 179,00 180,00 187,00 187,00 187,00 191,00 195,00 195,00 198,00 199,00 203,90
tTG-A D-tek 723,00
10,00
50,00
718,00
730,00 503,00 748,00 802,00
260,00 549,00 567,00 732,00 703,00 740,00 732,00 752,00 715,00 738,00 712,00 643,00
d tTG IgA
d tTG IgA
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
48 78 63 49 52 80 66 75 47 45 27 62 61 67 61 49 32 36 32 51 58 68 71 49 66 64 61 58 39 52 65 82
tTG IgG 11,70 61,60 16,50 4,23 21,90 58,20 18,60 38,70 14,10 11,60 45,60 19,10 31,20 33,70 35,70 24,80 14,80 50,80 19,00 16,20 32,00 28,50 25,00 30,70 32,60 40,40 29,50 32,30 19,40 27,70 35,80 69,80
tTG-G D-tek 252,00
>0
15,000
25,00
107,80
346,00 260,00 156,60 191,00
125,40 47,80 378,00 55,40 43,60 87,20 30,40 43,00 260,00 244,00 276,00 28,40
d tTG IgG
d tTG IgG
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
100 82 100 100 100 88 100 98 100 71 100 76 81 100 83 55 47 85 81 33 19 59 57 27 32 83 71 85 82 14 82 79
G IgA 12,68 22,84 8,80 36,64 89,60 12,84 13,76 29,72 104,80 111,60 36,16 115,32 11,80 80,40 7,52 15,32 10,08 161,00 137,68 13,40 102,40 16,28 31,96 142,60 13,60 15,44 136,40 141,84 108,40 5,16 116,80 11,12
>0
12,0
54
d G IgA
d G IgA
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
0 18 0 6 89 5 0 0 99 41 0 7 0 15 0 0 0 65 57 0 7 0 0 61 0 0 26 11 74 0 17 0
G IgG 18,00 21,40 5,28 34,04 27,88 23,28 58,00 16,20 136,40 66,80 142,88 52,00 46,00 100,00 105,32 50,00 42,80 152,04 86,40 30,52 22,64 70,40 88,40 30,20 28,00 20,60 66,80 116,32 40,00 32,20 127,56 154,40
>0
12,0
d G IgG
d G IgG
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
0 13 0 87 6 16 85 0 55 0 25 6 26 12 24 0 34 0 85 29 0 88 51 0 16 43 24 0 41 0 0 53 >0
EMA HIST pozit CSF 65 pozit 66 67 pozit 68 pozit 69 pozit pozit HLA 70 71 pozit pozit CSF 72 pozit 73 pozit CSF 74 75 pozit 76 pozit pozit CSF 77 78 pozit 79 pozit pozit 80 pozit CSF 81 82 pozit 83 pozit 84 pozit 85 pozit 86 pozit pozit CS-P 87 88 pozit pozit CSF 89 90 pozit 91 pozit pozit CSF 92 93 pozit pozit 94 pozit CSF 95 pozit CSF 96
