VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie
DIPLOMOVÁ PRÁCE VÝZNAM EXPRESE TRANSKRIPČNÍHO FAKTORU HIF-1α U BUNĚČNÝCH LINIÍ ODVOZENÝCH OD NEUROBLASTOMU
Vypracovala:
Bc. Helena Maříková
Vedoucí diplomové práce: Školitel:
Prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.
Studijní program: Studijní obor:
Klinická bioanalytika Laboratorní metody a příprava léčivých přípravků
Rok:
2011
Tato diplomová práce byla vypracována na Ústavu biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze a v Laboratoři průtokové cytometrie a molekulární biologie na Klinice dětské hematologie a onkologie, UK 2. LF a FN Motol v období září 2009 – květen 2011.
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s vyznačením všech použitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů. Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v knihovně Ústavu biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze.
V Praze dne 9. května 2011
SOUHRN Hypoxie je charakteristickým znakem mikroprostředí solidních nádorů. Adaptace nádorových buněk na hypoxické podmínky má řadu významných biologických dopadů, podílí se na agresivnějším chovaní nádorů, jejich dediferenciaci a je jednou z příčin snížení apoptózy indukované cytostatiky a zvýšení genetické nestability nádorových buněk. Hlavním faktorem, který adaptaci na hypoxické prostředí ovlivňuje, je hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF). Je tvořen dvěma podjednotkami, konstitutivně exprimovanou HIF-1β/ARNT a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. Obě podjednotky patří do (bHLH)-PAS rodiny proteinů. Doména bHLH je nezbytná pro vazbu transkripčních faktorů na DNA a doména PAS pro heterodimerizaci podjednotek α a β. Za snížené tenze kyslíku je HIF-1α podjednotka stabilizována, heterodimerizuje s HIF-1β/ARNT a tento dimer je následně translokován do jádra. Stabilizovaný heterodimer transaktivuje geny, které zprostředkovávají adaptivní odpověď nádorových buněk na hypoxii. Mezi geny regulované HIF-1α patří například vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGF), erythropoetin (EPO) a glukosový transporter 1 (Glut1). Pochopení regulačních mechanismů HIF-1α může mít dopad na léčbu zhoubných nádorů. V této práci jsme se zaměřili na sledování dynamiky exprese HIF-1α v průběhu kultivace buněčných linií neuroblastomu v hypoxii (1 % O2) a v normoxii (21 % O2). Pro sledování jeho vlivu na chemorezistenci buněčné linie SK-N-AS odvozené od lidského neuroblastomu jsme se pokoušeli o zavedení metody silencingu genu HIF-1α a inhibici jeho aktivity nízkomolekulárními inhibitory chetominem, YC-1 a LW6. Zjistili jsme nejvhodnější koncentrace inhibitorů vzhledem k míře jejich inhibiční aktivity HIF-1α a cytotoxicitě, která ovlivňuje výsledky experimentů a při pokusu o zavedení do terapie by mohla negativně ovlivnit i nenádorové buňky. Prokázali jsme, že inhibicí HIF-1α je možné potlačit chemorezistenci hypoxických nádorových buněk k fázově nespecifickému cytostatiku cisplatině. Prokázali jsme i normoxickou expresi HIF-1α u buněčné linie SK-N-AS. Pro zjištění její příčiny bude však nutné provést další experimenty, které budou zaměřeny na subcelulární lokalizaci proteinu HIF-1α a DNA analýzu této buněčné linie, díky níž bude možné zjistit mutace v genu VHL.
SUMMARY Hypoxia is the hallmark of solid tumour microenvironment. Adaptation of tumour cells to hypoxic conditions has several important biological effects and contributes to the aggressive attitude of tumours and their dedifferentiation. Hypoxia is also one of the reasons for reduced apoptosis in chemotherapy-treated cancerous cells and increases their genetic instability. The main factor that is necessary for adaptation to hypoxic environment is the hypoxia-induced transcription factor (HIF). It consists of two subunits, constitutively expressed HIF-1β/ARNT and hypoxia-induced HIF-1α with its homologues HIF-2α and HIF-3α. Both subunits belong to (bHLH)-PAS protein family. The bHLH domain is essential for binding of transcription factors to DNA and the PAS domain provides the heterodimerization of α- and β-subunits. HIF-1α subunit is stabilized at a reduced oxygen tension, forms the heterodimer with HIF-1β/ARNT, which is then translocated into the nucleus. Stabilized heterodimer transactivates genes that mediate the adaptive response of tumour cells to hypoxia. Such genes, as vascular endothelial growth factor (VEGF), erythropoietin (EPO), and glucose transporter 1 (Glut1), are regulated by HIF-1α. Understanding of the regulatory mechanisms of HIF-1α may have an impact on the treatment of malignant tumours. In this study, we focused on exploring the dynamics of HIF1α expression in human neuroblastoma cell line SK-N-AS in hypoxia (1% O2) and normoxia (21% O2). We tried to use gene silencing of HIF-1α and inhibition of HIF-1α transcription activity by small molecule inhibitors chetomin, YC-1 and LW6, for observation of its impact on chemoresistance of these cells. We found the best concentrations of these inhibitors with respect to their inhibitory activity of HIF-1α and cytotoxicity, which influences results of experiments and in an attempt to introduce these inihbitors to chemotherapy it could adversely affect the non-neoplastic cells. We have shown that inhibition of HIF-1α can suppress the chemoresistance of hypoxic tumour cells to cisplatin, the cell-cycle nonspecific antineoplastic agent. We demonstrated that HIF-1α is also expressed in normoxic conditions in SK-N-AS cells. To determine its cause, however, we will need to focus our future experiments on the subcellular localization of HIF-1α protein and DNA analysis of this cell line, which could adjust mutations in the VHL gene.
Na tomto místě bych ráda mnohokrát poděkovala celé své rodině a všem, kteří mě během studia podporovali, pomáhali mi a v nejedné chvíli mi projevili velkou dávku trpělivosti. Moc děkuji prof. MUDr. Tomáši Eckschlagerovi, CSc. a prof. Ing. Tomáši Rumlovi, CSc. za odborné vedení a za umožnění práce na Klinice dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a FN Motol. Můj velký dík za odborné vedení při zpracování tématu patří také MVDr. Janu Hrabětovi, Ph.D. Jemu i RNDr. Jitce Poljakové, Ph.D., Ing. Janě Hřebačkové, Ph.D., MUC. Šimonu Ciprovi a Bc. Tomáši Grohovi děkuji také za vytvoření příjemné pracovní atmosféry a za ochotu vždy pomoci s jakýmkoliv problémem, za cenné rady a odborné připomínky k mé práci. Tato práce vznikla za podpory výzkumných záměrů MŠMT MSM0021620813 a grantu GAČR č. P301/10/0356.
OBSAH 1
Úvod...................................................................................................................................... 1
2
Současný stav řešené problematiky ...................................................................................... 2
3
2.1
Hypoxie .......................................................................................................................... 2
2.2
Hypoxií indukované transkripční faktory (HIF) ............................................................ 3
2.2.1
Struktura transkripčního komplexu HIF ................................................................. 3
2.2.2
Regulace transkripce a translace HIF-1α ................................................................ 4
2.2.3
Regulace stability HIF-1α ....................................................................................... 6
2.2.4
Vazba na DNA cílových genů a alternativní subcelulární lokalizace HIF-1α ...... 13
2.2.5
Regulace transkripční aktivity HIF-1α ................................................................. 14
2.2.6
Biologická funkce HIF-1α .................................................................................... 16
2.2.7
HIF-2α ................................................................................................................... 19
2.2.8
HIF-3α ................................................................................................................... 21
2.2.9
Klinické využití dosavadních znalostí o transkripčních faktorech HIF ................ 21
Experimentální část ............................................................................................................. 23 3.1
Použité chemikálie, reagencie a protilátky ................................................................... 23
3.2
Použité detekční kity .................................................................................................... 24
3.3
Přístrojové vybavení, pomůcky a software .................................................................. 24
3.4
Buněčné linie a kultivace buněk................................................................................... 25
3.4.1
Rozmrazování buněčných linií ............................................................................. 25
3.4.2
Kultivace buněk .................................................................................................... 26
3.4.3
Pasážování buněk .................................................................................................. 26
3.4.4
Sklízení buněk....................................................................................................... 27
3.5
Inhibice HIF-1α ............................................................................................................ 27
3.5.1
Transfekce buněk pomocí siRNA ......................................................................... 27
3.5.2
Kontrola transfekce pomocí fluorescenčně značené nesilencující siRNA ........... 28
3.5.3
Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů .................................................. 28
3.6
Izolace RNA s TRIzol Reagent .................................................................................... 29
3.6.1 3.7
Kontrola čistoty RNA pomocí agarosové elektroforesy ....................................... 29
Izolace proteinů ............................................................................................................ 30
3.7.1
Určení koncentrace proteinů ................................................................................. 31
3.8 Stanovení buněčného cyklu a proliferace buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie ............................................................................................................................... 31 3.9
Stanovení apoptózy a viability buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie ......... 31
I
3.10
Stanovení aktivity kaspázy-3 .................................................................................... 32
3.11
Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) .................... 32
3.11.1
SDS-PAGE ........................................................................................................... 33
3.11.2
Přenos na membránu ............................................................................................. 34
3.11.3
Blokování nespecifických interakcí ...................................................................... 35
3.11.4
Inkubace s protilátkami ......................................................................................... 36
3.11.5
Detekce ................................................................................................................. 36
3.12
4
PCR........................................................................................................................... 37
3.12.1
Reversní transkripce.............................................................................................. 37
3.12.2
Kvantitativní polymerasová řetězová reakce v reálném čase ............................... 37
Výsledky a diskuse ............................................................................................................. 39 4.1
Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) ........................ 39
4.2
Exprese HIF-1α v normoxii ......................................................................................... 41
4.3 Ověření hypoxií indukované chemorezistence buněk SK-N-AS pomocí stanovení aktivity kaspázy-3 a vazby Anexinu V ................................................................................... 41 4.4
Inhibice HIF-1α ............................................................................................................ 42
4.4.1
Utlumení exprese HIF-1α pomocí siRNA ............................................................ 43
4.4.2
Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů .................................................. 45
4.4.3
Vliv inhibice HIF-1α na hypoxií indukovanou chemorezistenci .......................... 52
5
Závěr ................................................................................................................................... 54
6
Literatura ............................................................................................................................. 56
7
Seznam použitých zkratek .................................................................................................. 68
II
1
ÚVOD Neuroblastom (NBL) je nejčastější extrakraniální nádor dětského věku odvozený z
nediferencovaných buněk neurálni lišty, které osidlují paravertebrální sympatická ganglia, dřeň nadledviny a paraganglia. Je pro něj charakteristická značná biologická variabilita. Nádory nízkého rizika často samovolně regredují, případně spontánně či při léčbě diferencují1. Vysoce maligní forma s amplifikací genu MYCN se vyznačuje mimořádně agresivním průběhem s neovlivnitelnou progresí a časným metastazováním2. V NBL, stejně jako prakticky ve všech ostatních solidních nádorech, jsou v důsledku neadekvátní angiogeneze přítomny hypoxické oblasti. Nádorové buňky jsou schopny se na hypoxické podmínky adaptovat, což má dopad na jeho biologické chování3. Hypoxie se podílí na agresivnějším chovaní nádorů, jejich dediferenciaci a je jednou z příčin snížení apoptózy indukované cytostatiky a zvýšení genetické nestability nádorových buněk v důsledku zvýšené frekvence mutací4. Hlavním faktorem, který adaptaci na hypoxické prostředí ovlivňuje, je hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF). Je tvořen dvěma podjednotkami, konstitutivně exprimovanou HIF-1β/ARNT a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. Za snížené tenze kyslíku je HIF-1α stabilizován a tvoří heterodimer s HIF-1β. Ten je následně translokován do jádra, kde aktivuje transkripci více než 100 genů, které zprostředkovávají adaptivní odpověď nádorových buněk na hypoxii. Mezi geny regulované HIF-1α patří například vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGF), erythropoetin (EPO) a glukosový transporter 1 (Glut1)5. Pochopení regulačních mechanismů HIF-1α může mít významný dopad na léčbu zhoubných nádorů a cévních chorob. Pro sledování jeho vlivu na chemorezistenci buněčné linie SK-N-AS odvozené od NBL jsme zavedli metodu silencingu genu HIF-1α a inihbici jeho aktivity nízkomolekulárními inhibitory chetominem, YC-1 a LW6.
1
2 2.1
SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY Hypoxie Parciální tlak kyslíku (pO2) v lidském těle je variabilní v závislosti na typu orgánu a je
podstatně nižší než 21 % O2 (~160 mm Hg) ve vzduchu, který dýcháme. V plicním parenchymu a krevním oběhu, v dobře vaskularizovaných orgánech, jako jsou ledviny, játra a srdce, se hladina kyslíku pohybuje v rozmezí 4–14 % O2. V mozku se vyskytují oblasti, kde je pouze 0,5 % O2, ale i oblasti se 7 % O2, v oku se hladina O2 pohybuje v rozmezí 1–5 % a v kostní dřeni 0–4 %. Téměř anoxické jsou chrupavky a rohovka6. Hypoxie je definována jako stav sníženého pO2 pod kritickou hodnotu (pO2<30 mm Hg, 0–3 % O2) a může být způsobena sníženým přísunem kyslíku, například ve vyšších nadmořských výškách, nebo lokální ischemií způsobenou přerušením přítoku krve do dané oblasti, například při infarktu myokardu nebo mozkové mrtvici. Nekontrolovaná buněčná proliferace solidních nádorů spolu s neadekvátním cévním zásobením nádorové tkáně vyvolává vznik rozsáhlých hypoxických oblastí. Defektní vaskularizace vede navíc ke sníženému přísunu živin, které se spolu s nedostatkem O2 podílí na snížení produkce ATP nutného pro buněčnou proliferaci6. Transkripční odpověď na hypoxii je primárně zprostředkovávána dvěma hypoxií indukovanými faktory – HIF-1α a HIF-2α. Ty aktivují transkripci mnoha různých genů nezbytných pro adaptaci buněk na hypoxii. Odpověď na hypoxii na buněčné úrovni zahrnuje přepnutí aerobního metabolismu na anaerobní glykolýzu a expresi stresových proteinů regulujících buněčnou smrt nebo přežití. Další adaptace na hypoxii pro zvýšení přísunu kyslíku probíhá na tkáňové úrovni, zahrnuje erythropoesu a angiogenezi7,8. Adaptace buněk na hypoxii nádorového mikroprostředí má významné biologické důsledky. Hypoxie indukuje u nádorových buněk zvýšenou rezistenci k chemo- a radioterapii a zvyšuje jejich invazivitu a metastazování. Vyšší produkce kyslíkových radikálů a snížená exprese DNA reparativních enzymů se podílí na genetické nestabilitě nádorových buněk. V konečném důsledku je hypoxie a s ní spojené genetické, biochemické a biologické změny významnou příčinou vyšší agresivity nádorových onemocnění a snížení odpovědi na protinádorovou léčbu9. Role hypoxie nádorů bude detailněji popsána v kap. 2.2.6.1 Hypoxie a chemorezistence. Hypoxie hraje důležitou roli i v patofyziologii plicních a hematologických onemocnění, onemocnění ledvin (akutní poškození ledvin, chronická ledvinná nedostatečnost a diabetická
2
nefropatie), hojení ran, zánětu a infekci. Buňky se však dostávají do stavu hypoxie i v rámci fyziologických podmínek. V průběhu rychlé buněčné proliferace v časné fázi embryogeneze stimuluje fyziologická hypoxie výstavbu hematopoetického a oběhového systému9. 2.2
Hypoxií indukované transkripční faktory (HIF) Fylogeneticky vysoce konzervovaný transkripční komplex HIF (hypoxií indukovaný
faktor) byl objeven v roce 1991 jako transkripční aktivátor erythropoetinu (EPO), až posléze bylo zjištěno, že se účastní celkové odpovědi buněk na hypoxii a že je nejvýznamnějším proteinem buněčné adaptace na hypoxické podmínky10. HIF je heterodimer složený z HIF-α podjednotky, jejíž exprese je regulována převážně proteasomální degradací, a konstitutivně exprimované HIF-β podjednotky. Dosud byly popsány tři isoformy podjednotky HIF-α (HIF-1α, HIF-2α a HIF-3α), přičemž nejlépe charakterizovány byly HIF-1α a HIF-2α11. Základní vlastnosti HIF-β podjednotky a jednotlivých HIF-α podjednotek budou popsány níže. Protože předmětem mé práce byl protein HIF-1α, bude v následujícím textu pojednáváno především o něm. 2.2.1
Struktura transkripčního komplexu HIF
Transkripční faktor HIF je složen z podjednotky HIF-α a HIF-β. Nejlépe popsaná podjednotka HIF-1α je tvořena 826 aminokyselinami, gen pro HIF-1α se nachází na lidském chromosomu 14 (14q21-q24)12. HIF-β podjednotka je kódována genem ARNT, který se nachází na lidském chromosomu 1 (1q21)13. Tento gen kóduje dvě isoformy (774 AMK a 789 AMK) arylhydrokarbonového receptoru (AhR), který je známý jako arylhydrokarbonový jaderný translokátor (ARNT; AhR nuclear translocator)5,14–16. Isoforma ARNT, která je tvořena 789 AMK, může dimerizovat s HIF-α podjednotkami v buňkách vystavených hypoxii, čímž vznikne transkripční komplex HIF. Mimo to je protein ARNT schopen dimerizovat i s dalšími proteiny z bHLH (basic-helix-loop-helix) rodiny, případně i homodimerizovat16. Všechny HIF proteiny, HIF-α a ARNT (HIF-β), patří do bHLH rodiny transkripčních faktorů, která obsahuje základní strukturní motiv helix-loop-helix. Ten je lokalizován na Nkonci proteinu a zprostředkovává dimerizaci α a β podjednotek. HIF proteiny navíc na rozdíl od ostatních proteinů rodiny bHLH obsahují i druhou doménu, která je důležitá pro heterodimerizaci – PAS (Per-ARNT-Sim) doménu. Ta se nachází v centrální části proteinu a původně byla identifikována u proteinů Per, ARNT a Sim. Společně tedy bHLH a
3
PAS domény proteinů HIF-α a ARNT umožňují dimerizaci obou podjednotek, která je nezbytná pro vazbu celého transkripčního komplexu na DNA7,16. (Obr. 1)
Obr. 1 Schematické znázornění domén HIF proteinů (adaptováno podle Déry et al.9 a Hu et al.17). HIF proteiny patří do rodiny bHLH (basic-helix-loop-helix) proteinů, obsahují tedy bHLH doménu, která se spolu s PAS B doménou (Per-ARNT-Sim B domain) podílí na heterodimerizaci α a β podjednotky a vazbě na cílovou DNA. HIF-α podjednotky obsahují ODD doménu (oxygen dependent degradation domain), která je zodpovědná za regulaci jejich stability v závislosti na přítomnosti molekulárního kyslíku. TAD (transaktivační domény) regulují transkripční aktivitu celého transkripčního komplexu, pravděpodobně však na ni mají vliv pouze TAD α podjednotek 9. Znázorněny jsou i NLS (nuclear localization signals) a NES (nuclear export signal).
Podjednotky HIF-α obsahují navíc dvě transaktivační domény (TADs, transactivation domains), které jsou zodpovědné za regulaci transkripce HIF cílových genů. N-koncová TAD (N-TAD) se u HIF-1α nachází mezi aminokyselinami 531–575, to znamená v tzv. oblasti ODD (oxygen-dependent degradation domain; res. 401–603), která je zodpovědná za regulaci stability HIF-1α (její funkce bude popsána v kap. 2.2.3.1 Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku). C-koncová TAD (C-TAD) se nachází na samém konci proteinu HIF-1α mezi aminokyselinami 786–82618. (Obr. 1) Tyto domény se podílí na regulaci vazby HIF komplexu na cílovou DNA pomocí koaktivátorů, jako je p300/CBP (viz kap. 2.2.5 Regulace transkripční aktivity HIF-1α). ARNT obsahuje také transaktivační doménu, ale zdá se, že ta nemá vliv na transkripční aktivitu komplexu. I když jsou α a β podjednotky strukturně podobné proteiny, hlavní funkční komponentou celého komplexu je podjednotka HIF-α. Svědčí o tom její vysoce kontrolovaná exprese v buňkách, která je ovlivňována mírou přítomnosti kyslíku9 (viz níže). 2.2.2
Regulace transkripce a translace HIF-1α
Hladina exprese tohoto klíčového faktoru buněčné odpovědi na hypoxii je úzce kontrolována pomocí hladin jeho syntézy a degradace. Transkripce genu kódujícího HIF-1α probíhá konstitutivně, a to převážně díky transkripčnímu faktoru Sp1. V oblasti promotoru
4
genu HIF-1α se ale nachází i další specifická místa rozpoznávaná transkripčními faktory AP1, AP-2, NF-1 a NF-κB9. Hladina transkripce HIF-1α bývá v normoxii a hypoxii téměř stejná, ale byla pozorována i zvýšená akumulace HIF-1α mRNA v hypoxii19,20. Na rozdíl od většiny proteinů probíhá translace HIF-1α v hypoxii dál. Předpokládá se, že za selektivní HIF-1α translaci jsou zodpovědné tzv. IRES (internal ribosome entry site) elementy, které se nachází na 5´-netranslatované oblasti (5´-UTR, 5´-untranslated region) HIF-1α genu. IRES jsou zodpovědné za alternativní způsob iniciace translace, který není závislý na 5´cap (7-methylguanosinová čepička). Studie ukázaly možnost vazby PTB (polypyrimidine tract-binding protein) na IRES, díky níž je aktivována translace HIF-1α v hypoxii21,22. Ta je dále zvýšena, pokud je přítomen i HuR, který patří do rodiny RNAvazebných proteinů Hu/ELAV. Přesný mechanismus translace HIF-1α v hypoxii však dosud není zcela jasný23,24. Exprese a transkripční aktivita HIF-1α se zvyšuje především v hypoxii (viz níže), někdy je však HIF-1α aktivován i v normoxii. Hlavním regulačním mechanismem stability HIF-1α v hypoxii je utlumení jeho normoxické degradace (viz kap. 2.2.3.1 Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku). U normoxické aktivace HIF-1α nemusí být jeho degradace utlumena, proto nejspíš spočívá normoxická indukce HIF-1α převážně ve zvýšení míry jeho translace9. Další z možných příčin stabilizace HIF-1α v normoxii je v některých nádorech se vyskytující defekt genu VHL, který kóduje von Hippel-Lindau tumor supresorový protein (pVHL). Ten se, pokud není mutovaný, podílí na degradaci HIF-1α v normoxii25 (viz kap. 2.2.3.1 Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku). Na rozdíl od hypoxie se zdá, že normoxická aktivace HIF-1α je tkáňově specifická. Zvýšení míry translace HIF-1α umožňují různé onkoproteiny, virové proteiny26, růstové faktory, cytokiny a vazoaktivní hormony27–29 převážně prostřednictvím aktivace signální dráhy PI3K-Akt (fosfatidylinositol-3-kinasa-Akt)30. Tato dráha aktivuje množství signálních kaskád, které vedou k rozličným buněčným pochodům, řídí především růst buněk a syntézu proteinů, buněčnou proliferaci a přežití31. Její aktivace je typická téměř pro všechny typy nádorů. Kromě zvýšení translace HIF-1α může být však dráha PI3K-Akt zapojena i do regulace jeho degradace pomocí proteinů OS-9, SSAT2 a RACK1 (viz kap. 2.2.3.3 a 2.2.3.4). V některých případech je do indukce aktivity HIF-1α zapojena ještě dráha mTOR (mTOR – mammalian target of rapamycin; dráha PI3K-Akt-mTOR) a dráha p42/p44 MAPK (mitogeny aktivované
5
protein kinasy, p42/p44 MAPK; původně zvané ERK2 a ERK1, extracellular signal regulated kinase)29,32. Aktivace těchto signálních drah vyvolává fosforylaci translačního represoru eIF4E-BP a ribosomální kinasy p70S6, která reguluje translaci mRNA a zvyšuje translaci HIF-1α. Tím se i za normoxických podmínek zvýší transkripční aktivita HIF-1 komplexu a aktivují HIF-1 cílové geny28,33,34. (Obr. 2)
Obr. 2 Regulace translace HIF-1α pomocí signálních drah PI3K-Akt-(mTOR) a MAPK (adaptováno podle Koh et al.24). Za jistých normoxických podmínek je aktivována fosfatidylinositol-3-kinasa (PI3K), která je nezbytná pro působení drah PI3K-Akt, PI3K-Akt-mTOR a MAPK. Do aktivace translace HIF-1α může a nemusí být zapojen komplex proteinů mTORC1 složený z proteinů mTOR, Raptor, GβL, PRAS40 a DEPTOR. Ten je aktivován pomocí Akt kinasy a je schopen dále aktivovat p70S6 ribosomální kinasu (p70S6K). Tu aktivuje i samotná kinasa Akt, která je aktivována účinkem PI3K přes fosfatidylinositol trifosfát (PIP3). Nezávisle na PI3K může být Akt kinasa aktivována i pomocí komplexu proteinů mTORC2, který je složený z proteinů mTOR, Rictor, GβL a mSIN1. Mitogeny aktivované protein kinasy p42/p44 (MAPK) mohou být také aktivovány pomocí PI3K a fosforylují jak p70S6K, tak p90S6K. Obě tyto ribosomální kinasy fosforylují ribosomální S6 protein, který indukuje syntézu proteinu na ribosomu.
2.2.3
Regulace stability HIF-1α
Přestože i v normoxii dochází k transkripci a translaci HIF-1α, není v těchto podmínkách stabilní. Ve všech lidských tkáních byla detekována mRNA HIF-1α i ARNT (HIF-β)35. Na rozdíl od podjednotky ARNT, která je exprimována konstitutivně a je stabilní i za normoxických podmínek, je však stabilita HIF-α podjednotek velmi často závislá především na posttranslačních modifikacích probíhajících za přítomnosti molekulárního kyslíku. K expresi HIF-α podjednotek na úrovni proteinu tedy dochází hlavně za hypoxických podmínek, kdy je aktivace těchto proteinů nezbytná pro adaptaci buněk na hypoxii. Bylo však popsáno i množství drah regulujících stabilitu HIF-1α nezávisle na přítomnosti kyslíku.
6
2.2.3.1
Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku
Za aerobních podmínek je HIF-1α obvykle velmi nestabilní a prakticky nedetekovatelný, poločas jeho degradace je menší než 5 min9. V roce 2001 byl definován základní mechanismus degradace HIF-1α závislý na přítomnosti kyslíku v buňce31. Podjednotky HIF-α jsou za přítomnosti molekulárního kyslíku hydroxylovány na klíčových prolinech (u HIF-1α Pro402 a Pro564; u HIF-2α Pro405 a Pro531), které se nacházejí v tzv. ODD doméně (oxygen-dependent degradation domain) HIF-1α (res. 401–60336,37). (Obr. 1) Specifickou hydroxylaci Pro402 a Pro564 zajišťují enzymy prolyl-4-hydroxylasy (PHDs, prolyl hydroxylase domain-containing proteins), jinak zvané EGLN (egg laying nine). Jedná se o homology produktu genu Egl-9 (egg laying abnormal-9 gene), který byl původně identifikován u Caenorhabditis elegans a Drosophila melanogaster. Byly identifikovány tři isoenzymy, které jsou schopny této specifické hydroxylace – PHD1, PHD2 a PHD338–40, přičemž na hydroxylaci prolinů HIF-1α se pravděpodobně nejvíc podílí PHD2, zatímco na hydroxylaci prolinů HIF-2α se více podílí PHD3. Reakce vyžaduje přítomnost molekulárního kyslíku a 2-oxoglutarátu jako substrátů a kyseliny askorbové a Fe2+ jakožto kofaktorů PHDs34, 41, 42
. Hydroxylovaný HIF-1α je díky ODD doméně rozpoznán von Hippel-Lindau tumor
supresorovým proteinem (pVHL). β doména pVHL je vysoce hydrofobní, ale obsahuje dva hydrofilní aminokyselinové zbytky (His-115 a Ser-111), které za nepřítomnosti HIF-1α, nebo pokud není HIF-1α hydroxylován, interagují s molekulami vody. Při hydroxylaci HIF-1α jsou molekuly vody vyměněny za vazbu s ním, hydroxylované proliny tvoří s His-115 a Ser-111 dva vodíkové můstky43, 44. (Obr. 3)
7
Obr. 3 Struktura pVHL komplexu a vazba HIF-1α43. Schematické znázornění N-segmentu HIF-1α (res. 560–575) s vyznačeným hydroxyprolinem 564, který tvoří vazbu s β doménou pVHL. Znázorněny jsou i proteiny elongin C a elongin B, které interagují i s dalšími komponentami E3 ubikvitin ligasového komplexu.
Mutace β domény pVHL je zodpovědná za poměrně často se vyskytující Von-Hippel Lindauovu chorobu (VHL). VHL je autosomálně dominantně dědičné onemocnění, které je charakterizované typickou manifestací různých patologických změn, z nichž nejčastější jsou hemangioblastomy centrální nervové soustavy, renální cysty a nádory25. Tato mutace se může vyskytovat i v nádorech, převážně karcinomech ledviny, které vznikly i mimo rámec VHL choroby45. α doména pVHL obsahuje F-box motiv, který zprostředkovává interakci s proteinem zvaným elongin C. Ten je součástí komplexu proteinů (elongin B, elongin C, Cul2, Rbx1 (Ring-Box 1) a E2 (ubiquitin-conjugating enzyme)), který spolu s proteinem E1 (ubiquitin-activating enzyme) vykazuje aktivitu E3 ubiquitin ligasy. (Obr. 3) Vazba pVHL tedy zprostředkovává ubikvitinylaci HIF-1α, a tím jej označuje pro 26S-proteasomální degradaci9,46–48. (Obr. 4)
8
Obr. 4 Regulace stability HIF-1α v hypoxii a normoxii (adaptováno podle Yee Koh et al.24). V hypoxii nedochází k pVHL-dependentní proteasomální degradaci HIF-1α. Naopak dochází ke stabilizaci HIF-1α a jeho transportu do jádra, kde tvoří transkripční komplex s ARNT/HIF-1β podjednotkou. Za přítomnosti transkripčních koaktivátorů (nejsou vyznačeny ve schématu) může dojít k transaktivaci HIF-1α cílových genů a adaptaci buňky na hypoxické podmínky.
Kromě hydroxylace prolinů hraje důležitou roli při degradaci HIF-1α v normoxii i acetylace Lys532, který se také nachází v ODD doméně HIF-1α. Tuto acetylaci zprostředkovává acetyltransferasa ARD1 přenosem acetylu z acetyl-CoA. Díky tomu se zesílí interakce mezi HIF-1α a pVHL9,49,50. V hypoxii ke specifické hydroxylaci Pro402 a Pro564 nedochází, acetylace Lys532 je také snížena a podjednotka HIF-1α nemůže být rozpoznána pVHL, je tudíž stabilizována a akumulována. Kromě toho, že hydroxylace prolinů vyžaduje molekulární kyslík, je v hypoxii inhibována aktivita PHDs i kvůli nedostatku kofaktoru 2-oxoglutarátu, který vzniká v citrátovém cyklu. K inaktivaci PHD v hypoxii pravděpodobně přispívá i zvýšení mitochondriální produkce reaktivních forem kyslíku (ROS, reactive oxygen species)50. Ty přeměňují Fe2+ na Fe3+, který je jako kofaktor pro PHDs nepoužitelný51–53. PHDs mohou být regulovány i dalšími faktory, jako je například Siah2 (Seven in absentia homologs 2) E3 ubiquitin ligasa, která je aktivní v hypoxii a podílí se na degradaci PHDs. Zajímavé je, že exprese PHD2 a PHD3 je ale recipročně faktorem HIF-1α v hypoxii zvyšována, což reguluje stabilitu HIF-1α negativní zpětnou vazbou34,54.
9
2.2.3.2
Modifikace aktivity pVHL závislá na přítomnosti kyslíku
Deubikvitinilace Deubikvitinylace je důležitým regulačním prvkem stabilizace HIF-1α. Doposud byl identifikován jediný HIF-1α-deubikvitinylační enzym interagující s pVHL – VDU2 (pVHLinteracting deubiquitinating enzyme 2), jinak zvaný USP20 (Ubiquitin Specific Protease 20). VDU2 váže a deubikvitinyluje HIF-1α, čímž jej chrání před proteasomální degradací. β doména proteinu pVHL, která bývá mutovaná u VHL nemoci, obsahuje vazebná místa pro HIF-1α i pro VDU2. VDU2 sám může být tedy také ubikvitinylován a degradován pVHL E3 ligasovým komplexem. Vzhledem k tomu, že je pVHL schopen ubikvitynylovat oba tyto proteiny, hladina HIF-1α v buňkách nádoru je pravděpodobně určena rovnováhou mezi pVHL zprostředkovanou ubikvitinylací a VDU2 zprostředkovanou deubikvitinylací. Jak je ovlivňována tato rovnováha a jaký je přesně vzájemný vtah mezi pVHL, VDU2 a HIF-1α v nádorových buňkách, zatím není zcela jasné. Stejně tak není dosud jasné, zda hraje VDU2 roli i při regulaci hladiny HIF-1α nezávisle na pVHL a dostupnosti kyslíku, tedy zda je VDU2 schopen regulovat hladiny HIF-1α i za některých fyziologických podmínek55–57. SUMOylace Několik studií ukázalo, že hypoxie indukuje expresi SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier-1), díky čemuž může docházet ke zvýšení hladiny SUMOylace HIF-1α. Dříve se předpokládalo, že SUMOylace HIF-1α stabilizuje56, nicméně dle novějších poznatků se zdá, že SUMOylace HIF-1α může vést i k jeho pVHL-dependentní degradaci57. Stabilizace HIF-1α za přispění SUMOylace byla pozorována v hypoxii v nekrotických zónách gliomů. Tam je exprimován protein RSUME (RWD-containing SUMOylation enhancer), který je schopen interagovat s HIF-1α, a tím zvyšovat jeho SUMOylaci. To má v těchto případech za následek zvýšení hladiny HIF-1α a jeho transaktivaci58. Hypoxií indukovaná HIF-1α SUMOylace může ale způsobit i vazbu pVHL E3 ligasového komplexu na HIF-1α, aniž by byly hydroxylovány Pro402 a Pro564. To má za následek degradaci HIF-1α. SENP1 (SUMO1/sentrin specific peptidase 1) jaderná SUMO proteasa je schopna v hypoxii dekonjugovat SUMOylovaný HIF-1α, čímž mu umožňuje uniknout pVHL-zprostředkované degradaci. Tomu odpovídá vyřazení SENP1, který snižuje expresi HIF-1α pomocí pVHL degradačního mechanismu. Bylo také zjištěno, že SENP1-/-
10
embrya vykazují závažnou fetální anémii v důsledku nedostatečné produkce erythropoetinu. To poukazuje na důležitou roli SENP1 v regulaci HIF-1α za fyziologických hypoxických podmínek57. Mechanismus SUMOylace HIF-1α během hypoxie je však vzhledem ke kontroverzním výsledkům dosavadních studií stále nejasný. 2.2.3.3
Modifikace aktivity pVHL nezávislá na přítomnosti kyslíku
Dle nových poznatků existuje také mechanismus degradace HIF-1α, který není závislý na množství dostupného kyslíku. pVHL samotný má složitý regulační mechanismus, který řídí jeho stabilitu a afinitu k HIF-1α. Jedním z jeho regulátorů je E2-EPF (endemic pemphigus foliaceus) UCP (ubiquitin carrier protein)59. Ten je schopen specificky ubikvitinylovat pVHL, což vede k jeho proteasomální degradaci. Zvýšená exprese UCP vede proto k akumulaci HIF1α i v normoxii, ke zrychlenému růstu a metastazování nádoru. Naopak při vyřazení UCP se zvyšuje hladina pVHL, inhibuje HIF-1α a zastavuje růst nádoru. Úroveň exprese UCP navíc ve zkoumaných buněčných liniích, primárních a metastatických nádorech koreluje se sníženou expresí pVHL a zvýšenou expresí HIF-1α60. UCP je zvýšeně exprimován v různých typech nádorů u lidí a právě jeho zvýšená exprese může být jedním z vysvětlení zvýšené hladiny HIF-1α, která je pozorována v normoxických oblastech těchto nádorů61. Na negativní regulaci stability HIF-1α nezávisle na přítomnosti kyslíku se podílí i protein OS-9 (osteosarkom-9). Ten tvoří ternární komplex s HIF-1α a PHD2 nebo PHD3, čímž umožňuje efektivní hydroxylaci Pro402 a Pro564 HIF-1α. Jeho zvýšená exprese tedy podporuje pVHL-dependentní degradaci HIF-1α v normoxii i v hypoxii. Paradoxně je však OS-9 exprimován v osteosarkomech, které i nadále exprimují HIF-1α. Jeho význam v regulaci HIF-1α v nádorových buňkách tedy zůstává nejasný62, 63. Další regulátor, jehož funkce není závislá na množství molekulárního kyslíku v buňce, je SSAT2 (spermidin/spermin-N1-acetyltransferasa 2). Ten se současně váže na pVHL a elongin C, čímž stabilizuje jejich interakci a umožňuje HIF-1α ubikvitinilaci. Zvýšená exprese SSAT2 snižuje hladiny HIF-1α, zatímco jeho vyřazení hladiny HIF-1α v normoxii i v hypoxii zvyšuje64. 2.2.3.4
Regulace stability HIF-1α nezávislá na přítomnosti kyslíku a pVHL
Kromě pVHL existují v buňkách další regulační mechanismy hladiny HIF-1α, které se zdají být méně závislé na množství kyslíku v buňce a naopak více na specifických podmínkách, např. na přítomnosti růstových faktorů.
11
Ubikvitinylace a proteasomální degradace zprostředkovaná RACK1 nebo Hdm2 Stabilita HIF-1α proteinu je nezávisle na dostupnosti molekulárního kyslíku regulována dvěma proteiny, které soutěží o interakci s ním. Jedná se o molekulární chaperon Hsp90 (Heat shock protein 90kDa), jehož funkce je zde tumorsupresorová, a receptor aktivované proteinkinasy C (RACK1). Inhibice Hsp90 umožňuje vazbu RACK1 na HIF-1α, čímž dochází k degradaci podjednotky HIF-1α . RACK1 homodimerizuje a váže se na elongin C a další komponenty E3 ligasového komplexu, což vede k HIF-1α ubikvitinylaci a degradaci. Tato cesta degradace je velmi podobná pVHL-dependentní degradaci. Vazba RACK1-HIF-1α je navíc závislá na přítomnosti SSAT1, který stabilizuje jejich interakci. Na rozdíl od něj dříve popsaný SSAT2 napomáhá vázat právě pVHL24. Hdm2 (Human double minute 2; lidský analog Mdm2, Mouse double minute 2) je další z možných komponent E3 ubiquitin ligasy, která je schopna indukovat proteasomální degradaci proteinů, na rozdíl od pVHL nezávisle na přítomnosti kyslíku. Hdm2 je jedním z cílových genů tumorsupresorového proteinu p53 a negativní zpětnou vazbou se v normoxii podílí na snižování jeho hladiny. V buňkách vystavených stresovým podmínkám, mezi něž patří i těžká nebo dlouhodobá hypoxie, dochází ke stabilizaci a akumulaci p53. Hladina Hdm2 se v hypoxických oblastech nádorů nemění, ale velmi často je jeho vazba s p53 znemožněna. Bylo prokázáno, že v některých případech se HIF-1α také podílí na stabilizaci p53. Zdá se, že vazbou na něj a Hdm2 znemožňuje HIF-1α degradaci p5365. Namísto p53 pak Hdm2 pravděpodobně degraduje HIF-1α. Zvýšená exprese p53 v těchto studiích totiž korelovala se snížením transkripční aktivity HIF-1α právě kvůli jeho proteasomální degradaci zprostředkované Hdm266, 67. Naopak mutace p53, které jsou přítomny téměř u poloviny všech typů nádorů, mají za následek zvýšení hladiny proteinu HIF-1α a jeho transkripční aktivity66. Bylo tedy prokázáno, že p53 je schopen za silně hypoxických až anoxických podmínek s HIF-1α přímo nebo nepřímo prostřednictvím Hdm2 interagovat65. Problematika vztahu mezi HIF-1α a p53 je však velmi komplikovaná a leckdy se zdá kontroverzní. V jiné studii měla naopak zvýšená exprese Hdm2 za následek zvýšení hladiny a transkripční aktivity HIF-1α v buňkách. Tyto výsledky poukázaly na možnou funkci Hdm2 v regulaci HIF-1α, která není závislá na interakci s p53 a naopak přispívá k adaptaci nádorových buněk na hypoxii68. Přesný mechanismus regulace HIF-1α pomocí Hdm2 zůstává také nejasný.
12
Ubikvitinylace a proteasomální degradace zprostředkovaná GSK-3β nebo FOXO4 Glykogen synthasa kinasa 3β (GSK-3β) je klíčovým regulátorem mnoha signálních drah, které ovlivňují metabolismus glykogenu, transkripci, translaci, cytoskeletální regulaci, intracelulární vezikulární transport, progresi buněčného cyklu a apoptózu69. Zprostředkovává také fosforylaci HIF-1α, která vede k následné hydroxylaci prolinů a tím označení HIF-1α pro proteasomální degradaci nezávislou na pVHL70. Byla zjištěna i interakce GSK-3β s p53, která může regulovat intracelulární lokalizaci p53, usnadnit transkripci p53-cílových genů nebo indukovat apoptózu buněk pomocí p53, v níž může svou roli plnit i již zmíněný Hdm271. S expresí transkripčního faktoru FOXO4 (forkhead box O4) souvisí snížení adaptivní buněčné odpovědi na hypoxii. Byla detekována snížená exprese vaskulárního endotheliálního faktoru (VEGF), glukosového transportéru 1 (Glut1) a erythropoetinu (EPO). Tyto proteiny jsou v hypoxii exprimovány právě díky transkripční aktivitě HIF-1α. FOXO4 snižuje i přímo hladinu proteinu HIF-1α, a to v případech, kdy byly inhibovány PHDs zodpovědné za specifickou hydroxylaci prolinů HIF-1α, která je nezbytná pro pVHL-dependentní ubikvitinylaci a následnou proteasomální degradaci HIF-1α. To je důkazem toho, že podobně jako GSK-3β je i protein FOXO4 zodpovědný za degradaci HIF-1α nezávisle na pVHL72. GSK-3β i FOXO4 jsou negativně regulovány signální dráhou PI3K-Akt, která, převážně za normoxických podmínek, zvyšuje translaci HIF-1α (viz kap. 2.2.2 Regulace syntézy HIF-1α). Zdá se, že dlouhodobá hypoxie dráhu PI3K-Akt inhibuje, a tím zvyšuje aktivity GSK-3β a FOXO4, což má za následek snížení hladiny a aktivity HIF-1α73. 2.2.4
Vazba na DNA cílových genů a alternativní subcelulární lokalizace HIF-1α
Jakožto transkripční faktor je HIF-1α translokován do jádra, kde vytváří funkční transkripční komplex se stabilní podjednotkou ARNT7,10. Vzniklý heterodimer se váže do tzv. HRE (hypoxia responsive element) oblasti cílového genu, ta obsahuje konzervovanou sekvenci 5'-(A/G)CGTG-3', kterou transkripční komplex HIF-1 rozeznává a váže se na ni (HIF-vazebné místo). Tato sekvence se může nacházet v oblasti promotoru, intronu a/nebo enhanceru cílového genu (možná přítomnost i druhého HIF-vazebného místa). HREs obsahují mimo to i další specifické DNA sekvence nezbytné pro správnou transkripci. Díky vazbě HIF-1 je transaktivován cílový gen, zvýšena jeho exprese a dochází k adaptaci na hypoxii7,9,16,30,74.
13
Byly popsány i případy, kdy byl stabilizovaný protein HIF-1α přítomen v různých buňkách, ale nebyl transkripčně aktivní. Zdá se, že indukované transkripční faktory mohou být přemisťovány z cytoplasmy do jádra a naopak. V cytoplasmě mohou být pravděpodobně navázány na specializované struktury, nebo lokalizovány ve specializovaných vezikulách, které znemožňují jejich proteasomální degradaci a transport do jádra75. To vysvětluje například stálou normoxickou expresi HIF-1α v neurogenních zónách mozku a v neurálních kmenových/progenitorových buňkách76,77. Subcelulární lokalizace HIF-1α může být pravděpodobně důležitá i pro jeho proteasomální degradaci, která se zdá být tkáňově specifická. Například v buňkách hepatocelulárního karcinomu (HepG2 buňky) je HIF-1α degradován především v cytoplasmě, zatímco v buňkách ependymu mozku myší je HIF-1α degradován jak v cytoplasmě, tak v jádře78. Různé regulační mechanismy HIF-1α se tedy mohou projevit různě v závislosti na jejich subcelulární lokalizaci24. 2.2.5 2.2.5.1
Regulace transkripční aktivity HIF-1α Koaktivátory
Jakmile je heterodimer HIF-1 (komplex HIF-1α-ARNT) navázán do HRE cílového genu, je nutná další aktivace transkripce genu transkripčními koaktivátory, se kterými HIF-1 navázaný na cílovou DNA tvoří iniciační komplex. Vazbu koaktivátorů zprostředkovávají TADs (transaktivační domény HIF-1α). (Obr. 1) Ačkoli ARNT podjednotka obsahuje také TAD, zdá se, že pro transkripční aktivitu komplexu HIF-1 není důležitá79. N-koncová TAD (N-TAD) i C-koncová TAD (C-TAD) HIF-1α jsou vysoce konzervované u jednotlivých živočišných druhů, mezi sebou však vykazují jen asi 20% homologii, což svědčí pro jejich rozdílné transkripční cíle. N-TAD i C-TAD využívají vazbu koaktivátorů, jako jsou p300 a jemu velmi podobný CBP (CREB-binding protein), dále SRC-1 (steroid receptor coactivator 1) a TIF-2 (transcriptional intermediary factor 2)80–84. Koaktivátory zvyšují pravděpodobnost iniciace transkripce cílových genů prostřednictvím stabilizace vazby transkripčního faktoru na DNA. p300/CBP koaktivátor má navíc aktivitu histon acetyltransferasy, která je nezbytná pro modifikaci histonů a rozvolnění DNA před zahájením samotné transkripce. Transkripční aktivita HIF-1 může být dále zesílena dalšími transkripčními faktory, jako je Smad3 a STAT3. Ty jsou schopny stabilizovat komplex HIF-p300/CBP85,86. Transkripční aktivitu
14
komplexu HIF-1 zvyšuje i fosforylace koaktivátoru p300/CBP signální dráhou p42/p44 MAPK87. Na regulaci vazby koaktivátorů se může podílet i přítomnost standardního proteinu p53. Jeho vysoká exprese vede k degradaci HIF-1α, naopak jeho nízká exprese tlumí transkripční aktivitu HIF-1 kompeticí o transkripční koaktivátor p300 (viz kap. 2.2.5.1 Koaktivátory)67,88. 2.2.5.2
FIH-1
HIF-1α podstupuje kromě hydroxylace prolinů i další posttranslační modifikace, které mají vliv spíš na jeho transkripční aktivitu než na jeho stabilitu. Tzv. faktor inhibující HIF-1 (FIH-1) hydroxyluje specificky Asn803 v C-TAD HIF-1α89,90, což ze sterických důvodů brání interakci HIF-1α s CH1 doménou p300/CBP koaktivátorů91,92. Tato hydroxylace je opět závislá na přítomnosti molekulárního kyslíku, stejně jako PHDs vyžaduje i 2-oxoglutarát jako kofaktor a vede k potenciálnímu snížení transkripční aktivity HIF-1α v normoxii9,93. Studie však prokázaly, že KM FIH-1 pro molekulární kyslík je téměř třikrát nižší než KM PHDs. To znamená, že v počátečních fázích hypoxie je HIF-1α stabilizován díky inhibici PHDs, ale jeho transkripční aktivita je nižší z důvodu stále probíhající hydroxylace Asn803 pomocí FIH1, který má k HIF-1α mnohem vyšší afinitu než PHDs. Maximální aktivace HIF-1α vyžaduje proto další snížení parciálního tlaku kyslíku, které již inaktivuje i FIH-1, a tím umožňuje vazbu transkripčních koaktivátorů89, 94, 95. FIH-1-specifická hydroxylace asparaginu může být ovlivněna aktivací dráhy p42/p44 MAPK, která fosforyluje Thr796 HIF-1α, což hydroxylaci asparaginu pomocí FIH-1brání. Tím je HIF-1 aktivován a zvyšuje transkripční odpověď buněk na hypoxii96. Na rozdíl od C-TAD domény HIF-1α není aktivita N-TAD domény na regulaci pomocí FIH závislá. HIF-1α má proto bifunkční transkripční aktivitu, která, v závislosti na aktivitě FIH, a tedy na hladině snížení pO2, umožňuje rozdílnou aktivaci genů, která je kontrolována N-TAD nebo C-TAD97. To potvrzuje i studie s HeLa buňkami, ze které vyplývá, že hladina proteinu HIF-1α a vazba komplexu HIF-1 na DNA se při poklesu buněčného pO2 zvyšuje exponenciálně. Maximální hladina HIF-1α byla detekována při 0,5 % kyslíku a polovina maxima při 1,5–2 % kyslíku16. Všeobecně je zvýšená exprese HIF-1α typická pro silně hypoxické, perinekrotické oblasti nádoru98.
15
2.2.6
Biologická funkce HIF-1α
HIF-1α zprostředkovává buněčnou odpověď na hypoxii nádorových buněk aktivací transkripce více než stovky genů (Obr. 6) nezbytných pro přežití buněk a jejich adaptaci na hypoxické podmínky8.
Obr. 6 Příklady genů, které jsou aktivované transkripčním faktorem HIF-1α (adaptováno podle Semenza 200330).
Mezi transkripční cíle HIF-1α patří geny podílející se na anaerobní glykolýze, která je za hypoxických podmínek nutná pro získání ATP. Posun od aerobního k anaerobnímu metabolismu, tzv. Warburgův efekt, je pro solidní nádory typický dokonce i za normoxických podmínek. Pro jeho dosažení je nutná aktivace glykolytických enzymů aldolasy A (ALDA, fruktosa-2,6-bisfosfatasa), enolasy 1 (ENO1), fosfofruktokinasy L (PFKL, 6-fosfofrukto-2kinasa), fosfoglycerátkinasy 1 (PGK1), laktátdehydrogenasy A (LDHA) a glukosových transportérů Glut1 a Glut399–102. Při anaerobní glykolýze se zvyšuje produkce laktátu a CO2, což vede k potenciálně toxické buněčné acidóze. Pro vyrovnání pH je aktivována exprese monokarboxylového transportéru 4 (MCT4), který zprostředkovává transport laktátu ven z buňky, a membránově vázané karbonáthydrolyasy IX (CA9), která katalyzuje přeměnu extracelulárního CO2 na slabou zásadu, hydrokarbonátový iont (HCO3¯)2. HIF-1α aktivuje expresi několika pro-angiogenních růstových faktorů, jako je vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGF), destičkový růstový faktor B (PDGF-B, platelet-derived growth factor B), placentární růstový faktor (PGF, placental growth factor),
16
angiopoetin 1 (Ang1) a angiopoetin 2 (Ang2). Díky vzniku nových cév se obnoví dodávání kyslíku a živin nádorovým buňkám, proto je zvýšení angiogeneze klíčovým dějem, který umožňuje přežití a růst nádoru (tzv. angiogenní switch)24,103,104. Kromě toho aktivuje HIF-1α transkripci genů podílejících se na erythropoese (EPO, erythropoetin)105 a zvýšení průtoku krve v nově vznikajících cévách pomocí syntézy vazoaktivních molekul CO a NO, které slouží jako intracelulární signální molekuly (HO1, hem oxygenase I a iNOS, induced nitric oxide synthase)106,107. Růstové faktory, jako je IGF-2 (insulin-like growth factor-2 ) a EGF (epidermal growth factor) jsou oba jak aktivátory, tak cílové geny HIF-1α. Jejich indukce přispívá k proliferaci, růstu a přežití
buněk. Exprese proteinů, jako je MMP2 (matrix
metalloproteinase 2), CATHD (cathepsin D), UPAR (urokinase plasminogen activator receptor) a KRT (keratin 14/18/19), může být modifikována pomocí HIF-1α a zapojena do migrace endotheliálních či metastatických buněk108. Aktivace HIF-1α má za následek expresi antiapoptotických, ale i proapoptotických proteinů. Například proapoptotický protein BNIP-3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3) je pozitivně regulován pomocí HIF-1α a může být naopak v některých typech buněk potlačen pomocí HIF-2α109. Proapoptotický transkripční faktor p53 může být pravděpodobně také exprimován pomocí aktivace HIF-1α, v těchto případech vede k apoptóze, která je p53-HIF-1α-dependentní, jejich vzájemný vztah je ale velmi komplikovaný a stále nejasný94. Zda tedy dojde v hypoxických oblastech nádoru k apoptóze nebo naopak přežití buněk závisí pravděpodobně na tom, zda převáží proapoptotická nebo antiapoptotická role hypoxií indukovaného HIF-1α. Protože k hypoxii dochází i v časné fázi embryogeneze, byly studie HIF-1α zaměřeny i na tuto oblast. Vyřazení HIF-1α v myších embryích vyvolalo kardiovaskulární malformace, nedostatečný neurální vývoj a prenatální úmrtí plodu50,110. Mimo to byla zjištěna i důležitá role HIF-1α při hojení ran, obnově tkání a procesu zánětu108,111. 2.2.6.1
Hypoxie a chemorezistence
Vysoká exprese HIF-1α je u různých typů nádorů spojována se zvýšenou úmrtností pacientů. Přežívání a proliferace nádorových buněk v hypoxii svědčí pro důležitou antiapoptickou roli HIF-1α. Zvýšená exprese HIF-1α byla navíc objevena u mnoha nádorů, které mají defektní p53 nebo jiné tumorsupresorové proteiny a které ztratily schopnost opravy
17
chyb párování bazí v DNA. To vysvětluje rezistenci mnoha solidních nádorů na ozařování a chemoterapii, jejich zvýšenou invazivnost, metastázování a celkově agresivnější fenotyp, který vede ke zvýšené mortalitě. Výsledný efekt zvýšené exprese HIF-1α však záleží na typu nádoru a na přítomnosti nebo absenci genetických změn, které ovlivňují rovnováhu mezi proapoptickými a antiapoptickými faktory112. Kyslík v tkáních může difundovat do vzdálenosti 100-200 µm od nejbližší kapiláry. Vzhledem k této omezené distribuci kyslíku a živin mimo cévní řečiště se hypoxické oblasti vyskytují již v nádorech o velikosti 2 mm3, které jsou v tzv. prevaskulární fázi113,114. Buňky, které nejsou schopny adaptace na nedostatek kyslíku a živin, podléhají apoptóze nebo nekróze, proto jsou často přítomny rozsáhlé nekrotické oblasti obvykle v centrální části nádorů115. Pro nádory je typická odlišná vaskularizace, krevní cévy nádorů jsou obvykle dilatované a stočené a oproti normálním tkáním mají větvený charakter, pro který je příznačná přítomnost nadbytečných smyček a arteriovenózních aneurysmat90. (Obr. 7)
Obr. 7 Schematické znázornění mikroprostředí nádoru v závislosti na vzdálenosti od cévy (1a) a vaskulární systém normálních tkání (2a) a nádorových tkání (2b)116.
Cévy tumorů postrádají hierarchické uspořádání cévního řečiště do arteriol, kapilár a drobných žil. Ve stěnách cév nádorů jsou časté fenestrace, nespojité, nebo dokonce chybějící bazální membrány a menší množství pericytů. Na rozdíl od normálních cév může chybět i perivaskulární hladká svalovina a nádorové buňky mohou být včleněny i do cévních stěn30,115,117. Všechny tyto abnormality cév a jejich komprese způsobená nadměrnou proliferací nádorových buněk, vedou k deorganizaci a chaotickému průtoku krve nádorem. Výsledkem toho je snížený přísun živin i kyslíku, snížená clearance produktů metabolismu a senzitivita nádorů k lékům, protože i ty jsou transportovány krví30,118. Pokud jsou chemoterapií usmrceny nádorové buňky, které jsou v blízkosti krevních cév, může se zlepšit
18
přísun živin buňkám, které byly do té doby vystavené hypoxii a tak může dojít k následné regeneraci nádoru110,119. Vliv na rezistenci hypoxických oblastí nádorů vůči chemoterapii může mít kromě neadekvátní vaskularizace tumoru i mechanismus působení léku. Řada cytostatik indukuje tvorbu volných radikálů, které poškozují DNA nádorových buněk. Například doxorubicin je redukován na semichinonový radikál. Ten reaguje s kyslíkem za vzniku superoxidu, který je cytotoxický. Tento mechanismus usmrcení nádorových buněk se však nemůže uplatnit v hypoxické oblasti94. Pro mnoho chemoterapeutik je také typické, že efektivně působí především na proliferující buňky. Pro hypoxické oblasti nádorů je však typická zástava buněčného cyklu v G0 fázi, k rychlé proliferaci dochází v oblastech lépe zásobovaných kyslíkem. Čím dál od krevních cév se tedy buňky nachází, tím pomaleji proliferují, a tím vyšší je jejich rezistence k chemoterapii120. Kromě toho aktivuje HIF-1α expresi genu MDR1 (multidrug resistanece 1), který kóduje ATP-dependentní P-glykoprotein MDR1. Ten chrání buňku před cizorodými látkami, např. chemoterapeutiky, které transportuje ven z buňky. MDR1 tak zprostředkovává mnohočetnou chemorezistenci, která je hlavním problémem léčby mnoha typů nádorů30,121. Cytotoxicitu protinádorových léků ovlivňuje i pH. Extracelulární pH hypoxických nádorů je kvůli vysoké hladině laktátu nízké. Kyselé mikroprostředí nádorů může inhibovat aktivní transport některých slabě zásaditých léků do buňky. Intracelulární pH nádorových buněk je neutrální až zásadité63,94. 2.2.7
HIF-2α
Protein HIF-2α, známý také jako EPAS1 (Endothelial PAS domain-containing protein 1), byl nezávisle objeven několika výzkumnými týmy při hledání nových proteinů rodiny bHLH-PAS, které by byly podobné HIF-1α. Oba tyto transkripční faktory jsou vysoce homologní, jejich bHLH domény jsou z 85 % identické a rozpoznávají stejný DNA motiv (HREs), na který se vážou17. Oba proteiny mají velmi podobnou strukturu (Obr. 8), mechanismus jejich stabilizace v hypoxii i způsob jejich transkripční aktivace je také v některých krocích téměř stejný, nicméně některé regulační mechanismy HIF-1α a HIF-2α se liší a jsou i nadále zkoumány98.
19
Obr. 8 Schematicky znázorněná strukturní podobnost domén HIF-1α a HIF-2α (adaptováno podle Hu et al.17). Procenta značí podobnost jednotlivých domén. Vyznačena jsou i specifická místa podléhající hydroxylaci, která mají vliv na stabilitu a transkripční aktivitu HIF-α podjednotek.
Jedním z příkladů rozdílné regulace HIF-1α a HIF-2α je jejich odlišná aktivace v hypoxii. HIF-1α je plně aktivován v silně hypoxických podmínkách (1 % kyslíku) jako akutní odpověď na hypoxii a jeho hladina postupně při dlouhotrvající hypoxii klesá. Naproti tomu hladina HIF-2α po delší době v hypoxii stoupá a umožňuje i následnou transkripci genů, jako je VEGF. Ten je tedy primárním transkripčním cílem pro HIF-1α v akutní fázi hypoxie a při dlouhotrvající hypoxii naopak primárním transkripčním cílem pro HIF-2α122. Zdá se proto, že oba tyto transkripční faktory jsou schopny aktivovat transkripci většiny genů, které zprostředkovávají buněčnou odpověď na hypoxii, oba toho však dosahují za rozdílných podmínek. Pro příklad je možné uvést jako další společné transkripční cíle geny kódující proteiny EPO, Glut1122–124, CA9125 a ADM (adrenomedullin), který zvyšuje toleranci buněk na oxidativní stres, hypoxii a podílí se i na angiogenezi. Z experimentů vyplývá, že HIF-2α je stabilizován v normálních i nádorových buňkách již za vyššího pO2, než je tomu u HIF-1α122–124. HIF-2α je totiž relativně odolný vůči inhibici pomocí FIH-1 za normoxických podmínek95,126. Byla sice také prokázána FIH-1-specifická hydroxylace asparaginu HIF-2α (různé zdroje uvádějí různá místa – Asn85189,90,127, 847 nebo 84822), FIH-1 ale nemá k HIF-2α takovou afinitu jako k HIF-1α126,127. To tedy vysvětluje, proč je HIF-2α transkripčně aktivní i za téměř fyziologického pO2, jak je tomu například ve vaskulárních endotheliálních buňkách122,123,128,129. HIF-2α pozitivní jsou i nádorové buňky neuroblastomů v oblastech, které jsou v okolí cév nebo přímo v kontaktu s nimi, a stromální buňky obklopující nádor. Zvýšená exprese HIF-2α je také v buňkách hemangioblastomů, které jsou velmi bohaté na cévy122. Nález aktivity HIF-2α za téměř normoxických podmínek vysvětluje fakt, že proteasomální degradace HIF-2α je tkáňově specifická124. Normoxickou transkripční aktivitu
20
HIF-2α může zlepšit jeho interakce s proteinem NEMO (NF-κB essential modulator), který je znám také jako IKK-γ (inhibitor of nuclear factor κB kinase subunit γ) a usnadňuje vazbu koaktivátorů p300/CBP na HIF-2α. Interakce mezi HIF-1α a NEMO zjištěna nebyla130. Mezi proteiny, které jsou přednostně exprimovány pomocí HIF-2α, patří receptor pro angiopoetin-1 (Tie-2/Tek) a VEGF receptor-2 (KDR) podílející se na angiogenezi, LOXL2 (lysyl oxidase like-2), homolog lysyloxidasy, který se podílí na invazivnosti a metastázování nádoru, a CITED2 (CBP/p300-interacting transactivator 2), který je možným negativním regulátorem HIF-1α131. Specifickým cílovým genem HIF-2α je Oct-4, který kóduje transkripční faktor nezbytný pro pluripotenci kmenových buněk. Jeho aktivace v nádorových buňkách je zodpovědná za dediferenciaci buněk, což bylo prokázáno u neuroblastomů a rakoviny prsu a pravděpodobně je tomu tak i u jiných nádorů132–134. Na ztrátě schopnosti diferenciace buněk se zároveň podílí i aktivace signální dráhy Notch135–138. Všeobecně tedy HIF-2α transkripční cíle zahrnují geny podílející se na erythropoese, angiogenezi, metastazování, proliferaci a dediferenciaci buněk. HIF-2α se stejně jako HIF-1α podílí jak na fyziologických, tak na patologických dějích, jeho exprese v normoxii je však častější než u HIF-1α a pravděpodobně se více než HIF-1α podílí na embryogenezi. Jeho exprese je tkáňově specifická3,7. 2.2.8
HIF-3α
Regulace a funkce HIF-3α dosud není zcela jasná, je nejméně prozkoumaným proteinem rodiny HIF proteinů. Byl detekován v brzlíku, ledvinách, Purkyňových buňkách mozečku a epitelu rohovky. Zdá se, že může také dimerizovat s ARNT, vázat se na HREs cílových genů a tak aktivovat jejich transkripci139. Nicméně může podstoupit i alternativní sestřih, který dává vznik tzv. proteinu inhibujícímu PAS doménu (IPAS). IPAS neobsahuje transaktivační domény (TADs), je také indukován hypoxií a je schopen soutěžit s HIF-1α o vazbu s ARNT, čímž působí jako dominantně negativní inhibitor HIF-1α140. 2.2.9
Klinické využití dosavadních znalostí o transkripčních faktorech HIF
Aktivace HIF hraje ústřední roli v hypoxických, a za některých okolností i normoxických oblastech mnoha typů nádorů. V hypoxii se podílí na indukci rezistence nádorů vůči radiační léčbě a cytostatikům. Pomocí selektivní inhibice těchto transkripčních faktorů můžeme lépe porozumět jejich úloze v indukci rezistence a inhibici programované buněčné
21
smrti, což může mít významný dopad na léčbu nádorových onemocnění. Léky zaměřující se na inhibici aktivity HIF-1α nebo na signální dráhy ovlivňující stabilizaci HIF-1α představují novou skupinu látek, které by mohly pomoci k potlačení chemorezistence nádorů a být tak důležitou součástí kombinované protinádorové terapie9,30,94. Zvýšená exprese HIF-1α a HIF-2α může být u některých typů nádorů využívána jako marker pokročilého stadia nebo špatné prognózy. Stanovení hladiny exprese HIF-2α je již za tímto účelem využíváno u nemalobuněčného karcinomu plic141, rakoviny prsu142,143, močového měchýře144,145, kolorektálního karcinomu146 a neuroblastomu122. Vzhledem ke složité regulaci indukce a aktivace HIF-1α, ke komplikovanému vzájemnému vztahu mezi HIF-1α a proapoptotickými proteiny jako je p53, Bcl-2, NOXA a BNIP3, protoonkogeny, jako je cMyc a dalšími faktory však nemůže sloužit HIF-1α jako univerzální marker agresivního fenotypu všech typů nádorů. Některé studie, zaměřené například na nádory vaječníků, ukázaly, že aktivace HIF-1α může korelovat i s apoptózou nádorových buněk spojenou s expresí standardního proteinu p53. U buněk s mutantním p53 k apoptóze nedocházelo a zvýšená exprese HIF-1α odpovídala zvýšené úmrtnosti pacientů147. U karcinomu jícnu byla zjištěna vyšší úmrtnost pacientů při zvýšené expresi HIF-1α a Bcl2148, u nemalobuněčného karcinomu plic korelovala naopak exprese HIF-1α s apoptózou nádorových buněk149. Dalším možným využitím komplexních znalostí o HIF proteinech je léčba kardiovaskulárních chorob způsobených nedostatečnou perfuzí (infarkt myokardu, cévní mozková příhoda a onemocnění periferních cév). V tomto případě by aktivace HIF mohla sloužit k obnovení angiogeneze a vaskularizace poškozených tkání150,151.
22
3
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
3.1
Použité chemikálie, reagencie a protilátky
40% Akrylamid/Bis roztok (Bio-Rad, USA)
BLOCK-iT™ Fluorescent Oligo (Invitrogen, USA)
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk (Bio-Rad, USA)
deoxycholát sodný (Sigma Aldrich, USA)
DMSO (Amresco, USA)
Fetal Bovine Serum (PAA Laboratories Inc., USA)
Foma LP-D – regenerátor vývojky (FOMA BOHEMIA spol. s.r.o., ČR)
Foma LP-DS – startér vývojky (FOMA BOHEMIA spol. s.r.o., ČR)
Fomafix + Fomafix H – ustalovač (FOMA BOHEMIA spol. s.r.o., ČR)
Glutamin (PAA Laboratories Inc., USA)
HIF-1 Inhibitor: sc-221724 (Santa Cruz Biotechnology, USA)
HIF1A ON-TARGETplus siRNA (Dharmacon, USA)
Chetomin (Sigma Aldrich, USA)
IGEPAL® CA-630 (Sigma Aldrich, USA)
inhibitor proteas Complete™ Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche, USA)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium without L-glutamine (IMDM; Lonza, Švýcarsko)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium with L-glutamine (IMDM; Lonza, Švýcarsko)
transfekční činidlo Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA)
mix primerů a sond SLC2A1 (GENERI BIOTECH, s.r.o., ČR)
mix primerů a sond B2M (GENERI BIOTECH, s.r.o., ČR)
mix primerů a sond VEGFA (GENERI BIOTECH, s.r.o., ČR)
ON-TARGETplus siCONTROL Non-targeting Pool (Dharmacon, USA)
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium (Invitrogen, USA)
PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Fermentas, USA)
PBS (Invitrogen, USA)
PCR vkládací pufr (Top-Bio s.r.o., ČR)
Platidam 50 (PLIVA - Lachema a.s., ČR)
primární protilátka HIF-1α (3C144): sc-71247 (Santa Cruz Biotechnology, USA)
23
sekundární protilátka goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 (Santa Cruz Biotechnology, USA)
CO2 (Linde Gas, ČR)
směs plynů v lahvi O2 1%, CO2 5%, N2 94% (Linde Gas, ČR)
TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, USA)
TRIzol® Reagent (Invitrogen, USA)
Trypsin 0,25% (PAA Laboratories Inc., USA)
YC-1 (AG Scientific, Inc., USA)
Ostatní použité chemikálie (kyseliny, hydroxidy, soli a organická rozpouštědla) byly v čistotě p. a. nebo vyšší. 3.2
Použité detekční kity
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision, USA)
Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit (BioVision, USA)
DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA)
DNA Prep kit (Beckman Coulter, Inc., USA)
Immun-Star™ HRP Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, USA)
3.3
Přístrojové vybavení, pomůcky a software
Aura PCR box (BIO-Cabinets, Australia)
BD CellQuest Pro Software (BD Biosciences, USA)
průtokový cytometr BD FACSCalibur (BD Biosciences, USA)
blotovací aparatura pro elektrotransfer (Bio-Rad, USA)
CAWO ABS X-ray cassette (CAWO, Německo)
centrifuga UNIVERSAL 320 (Hettich, Německo)
Centrifuge 5415 R (Eppendorf, Německo)
Direct-Q® 3 Water Purification system (Millipore, USA)
filmy na vyvolání Western blotu (FOMA BOHEMIA spol. s r.o., ČR)
Gel Doc™ 2000 (Bio-Rad, USA)
GyroTwister S1000 (Labnet, USA)
hypoxická komůrka (Billups-Rothenberg Inc., USA)
24
laminární box 1 (Clean Air Technology Inc., USA)
laminární box 2 (Jouan, France)
laboratorní CO2 inkubátor 1 (Jouan, France)
laboratorní CO2 inkubátor 2 (Shel Lab, USA)
IX51® INVERTED MICROSCOPE (Olympus, USA)
MS Excel (Microsoft, USA)
pH metr Cyber Scan510 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA)
Quantity One® 1-D analysis software (Bio-Rad, USA)
REST-MCS beta software (Gene Quantification, Německo)
SoftMax® Pro Software (Molecular Devices, USA)
Spectrofotometer Biomate 3 UV – Vis (Thermo Scientific, USA)
systém pro detekování proteinů SNAP i.d. (Millipore, USA)
Techne Dri-block® DB-2A heater (Bibby Scientific Limited, UK)
termocyklér ABI 7300 cycler (Applied Biosystems, USA)
termocyklér Perkin Elmer GeneAmp 9600 (Certified GeneTool, Inc., USA)
VersaMax™ Microplate Reader (Molecular Devices, USA)
VERTICAL ELECTROPHORESIS UNIT Z33,956-3 (Sigma – Aldrich, USA)
vyvolávací automat (FOMA BOHEMIA spol. s r.o., ČR)
zdroj napětí (Bio-Rad, USA)
3.4
Buněčné linie a kultivace buněk Pro studium významu transkripčního faktoru HIF-1α byla použita buněčná linie SK-N-
AS odvozená od lidského neuroblastomu S-typu (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK). Práce s buněčnými kulturami byly prováděny za sterilních podmínek v laminárním boxu. 3.4.1
Rozmrazování buněčných linií
10% IMDM (kompletní kultivační médium) IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Lonza) 10% FBS (Fetal Bovine Serum, PAA Laboratories Inc.) (1% glutamin v případě IMDM without L-glutamine, PAA Laboratories Inc.) Médium bylo skladováno při 4 °C.
25
Buňky jsou dlouhodobě uchovávány zmražené v 1 ml kompletního kultivačního media s 10 % DMSO (dimethylsulfoxid) v kryozkumavkách uložených v tekutém dusíku při teplotě -196 °C. Buňky byly rozmrazovány v původních kryozkumavkách ve vodní lázni (37 °C, 1 min) a následně přeneseny do uzavíratelné centrifugační zkumavky (15 ml) s 1 ml kompletního kultivačního média. Byly centrifugovány při 1250 x g (centrifuga UNIVERSAL 320, Hettich), 2 min při pokojové teplotě. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant. Buňky v peletě byly jemně resuspendovány s částí média, přeneseny do kultivační lahve (25 cm 2) s 10 ml 10% IMDM a pěstovány při 37 °C v normoxii. 3.4.2
Kultivace buněk
Buněčná linie SK-N-AS byla kultivována v IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) s přídavkem 10 % fetálního bovinního séra (FBS, fetal bovine serum) a 1 % Lglutaminu, dále v textu uváděno jako 10% IMDM. Kultivace probíhala v inkubátoru při 37 °C v normoxii (O2 21 %, CO2 5%, vlhkost 80 %) a v hypoxii (O2 1 %, CO2 5 %, N2 94 %) v kultivačních lahvích nebo na kultivačních miskách (21 cm2 a 55 cm2) či v šesti jamkové kultivační desce (9,5 cm2). Počáteční množství buněk určené pro následné experimenty se pohybovalo v rozmezí 12 500–45 500 buněk/cm2 v závislosti na celkové době a podmínkách kultivace a na kultivační ploše. Buněčnou smrt jsme indukovali přidáním cisplatiny (Platidam 50, PLIVA - Lachema a.s.) v koncentraci 5 µg/ml do kompletního kultivačního média a kultivovali podle uspořádání pokusu 8–72 hod v normoxii a v hypoxii. 3.4.3
Pasážování buněk
Pasážování buněk probíhalo jednou až dvakrát týdně. Všechny chemikálie byly před pasážováním temperovány na 37 °C. Inverzní mikroskopií byl zkontrolován nárůst buněk a optimálně při 70% pokrytí kultivační plochy byla prováděna pasáž. Původní kultivační médium bylo odstraněno, dno kultivační lahve s adherovanými buňkami bylo opláchnuto PBS pro usnadnění trypsinace. Následně byly buňky trypsinovány (0,25% trypsin, 2–4 min, 37 °C) a poté resuspendovány v menším množství 10% IMDM. Část buněk byla odstraněna, případně použita pro kultivaci na kultivačních miskách. Ke zbylému množství buněk bylo přidáno čerstvé 10% IMDM (10–15 ml pro kultivační plochu 25 cm2, 25–35 ml pro kultivační plochu 75 cm2) a buňky byly dále pěstovány při 37 °C v normoxii.
26
3.4.4
Sklízení buněk
3.4.4.1
Sklízení buněk pro stanovení apoptózy a viability
Médium s mrtvými a uvolněnými buňkami bylo přeneseno do centrifugační zkumavky, kultivační plocha misky s živými buňkami byla opláchnuta 1 ml PBS a poté byly buňky v inkubátoru trypsinovány (0,5–1 ml 0,25% trypsinu, 2 min). Po trypsinaci byla k buňkám přidána část předem odebraného média s mrtvými buňkami a všechny buňky byly resuspendovány a následně s médiem přeneseny do centrifugační zkumavky. Centrifugace probíhala 2 min při 1250 x g při pokojové teplotě (centrifuga UNIVERSAL 320, Hettich). Supernatant byl odstraněn a buňky v peletě byly resuspendovány v 1 ml PBS, následně centrifugovány za stejných podmínek. Supernatant byl opět odstraněn a buňky v peletě byly analyzovány vybranou metodou. 3.4.4.2
Sklízení buněk pro izolaci proteinů nebo RNA
Buňky byly seškrábány buněčnou škrabkou z kultivační plochy misky a spolu s médiem pipetou přeneseny do centrifugační zkumavky, ve které byly centrifugovány 2 min při 2500 x g při pokojové teplotě (centrifuga UNIVERSAL 320, Hettich). Buňky byly promyty PBS, centrifugace probíhala při 2500 x g. Promytí PBS bylo ještě jednou zopakováno a zbylá peleta s buňkami byla skladována v -80 °C v mikrozkumavce, nebo resuspendována v 1 ml TRIzol Reagent pro následnou izolaci RNA a skladována v -80 °C. 3.5
Inhibice HIF-1α Pro utlumení exprese HIF-1α byla použita siRNA cílená proti HIF-1α (HIF1A ON-
TARGETplus siRNA, Dharmacon) a specifické inhibitory HIF-1α (chetomin, YC-1 a LW6). Pro kontrolu transfekce byla použita i nesilencující siRNA (ON-TARGETplus siCONTROL Non-targeting Pool, Dharmacon) a fluorescenčně značená nesilencující siRNA (BLOCK-iT™ Fluorescent Oligo, Invitrogen). 3.5.1
Transfekce buněk pomocí siRNA
IMDM bez FBS IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Lonza)
(1% glutamin v případě IMDM without L-glutamine) Médium bylo skladováno při 4 °C.
27
Transfekce byla většinou prováděna na miskách s kultivační plochou 21 cm2, množství použitých látek bude proto uváděno pro tuto plochu. Pokud byly buňky určené pro transfekci kultivovány na miskách s kultivační plochou 55 cm2 nebo v šesti jamkových deskách s kultivační plochou jamky 9,5 cm2, byla příslušná množství upravena adekvátně velikosti kultivační plochy. První den byly buňky přeneseny na kultivační misky v počtu 45 500 buněk/cm2. Druhý den, kdy byly buňky z 90 % konfluentní, jim bylo vyměněno 10% IMDM za IMDM bez FBS (5,6 ml média). K 560 µl média Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium (dále jen Opti-MEM médium) bylo přidáno 28 µl 20µM siRNA (5 min inkubace, pokojová teplota). K druhým 560 µl média Opti-MEM bylo přidáno 11 µl Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen; dále jen LF) a 5 min inkubováno při pokojové teplotě. Ze směsí LF a siRNA s médiem Opti-MEM byla spojením obou složek vytvořena transfekční směs, která byla inkubována 20 min při pokojové teplotě. Následně byla transfekční směs aplikována buňkám do média. Transfekce probíhala po dobu 4 hod, poté bylo do média přidáno 10% FBS. Buňky byly následně kultivovány v normoxii a v hypoxii po dobu požadovanou pro daný experiment. 3.5.2
Kontrola transfekce pomocí fluorescenčně značené nesilencující siRNA
Pro ověření účinnosti transfekce byly buňky transfekovány siRNA konjugovanou s FITC (fluorescein isothiokyanát; BLOCK-iT™ Fluorescent Oligo, Invitrogen). Transfekce probíhala stejným způsobem, jako je uvedeno v protokolu 3.5.1, pomocí Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen). Buňky byly následně kultivovány 24 hod v normoxii a poté bylo fluorescenční mikroskopií ověřeno, zda FITC-značená siRNA pronikla do jader buněk a došlo k transfekci. 3.5.3
Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů
Kromě siRNA byly pro utlumení aktivity HIF-1α použity chemické inhibitory chetomin (Sigma-Aldrich), YC-1 (Sigma-Aldrich) a LW6 (Santa Cruz Biotechnology). Všechny inhibitory byly rozpuštěny v DMSO a skladovány v -20 °C. 24 hodin před přidáním inhibitoru byly buňky nasazeny na kultivační misky. Druhý den byly do média přidány jednotlivé inhibitory HIF-1α. Inhibitory byly používány v koncentracích uvedených v Tab. I. Buňky byly následně kultivovány v normoxii a v hypoxii po dobu požadovanou pro daný experiment.
28
Tab. 1 Používané koncentrace inhibitorů HIF-1α.
zásobní koncentrace (skladování v -20 °C v DMSO) chetomin 1 mM YC-1 15 mM LW6 20 mM
3.6
výsledné koncentrace v médiu 0,1µM, 0,5µM a 1,0µM 10µM, 50µM a 100µM 10µM, 50µM a 100µM
Izolace RNA s TRIzol Reagent Buňky určené pro izolaci RNA uchovávané v -80 °C v 1 ml TRIzol Reagent byly
rozmraženy a inkubovány 4 hod při pokojové teplotě. Poté bylo k 1 ml TRIzol Reagent přidáno 200 µl chloroformu, vzorek byl 15 s vortexován a poté 5 min inkubován při pokojové teplotě. Poté byl centrifugován při 4 °C po dobu 15 min při 16 100 x g (Centrifuge 5415 R, Eppendorf). Po centrifugaci byla odebrána horní vodná fáze s RNA do nových mikrozkumavek. Bylo k ní přidáno 500 µl isopropanolu a opatrným překlápěním mikrozkumavky byla RNA precipitována z roztoku. Vzorek byl 10 min inkubován při pokojové teplotě a poté byl centrifugován při 4 °C po dobu 10 min při 16 100 x g. Supernatant byl opatrně odstraněn, k peletě s RNA byl přidán 1 ml 70% EtOH a RNA v něm byla lehce protřepána. Následně byla centrifugována při 4 °C po dobu 5 min při 16 100 x g. Supernatant
byl
odstraněn,
peletka
byla
zlehka
vysušena
ponecháním
otevřené
mikrozkumavky na vzduchu. Poté byla 10 min rozpouštěna ve 40 µl PCR-H2O ve vodní lázni (55-60 °C). 5 µl vzorku bylo odebráno pro spektrofotometrické určení koncentrace RNA a 5 µl pro elektroforetickou kontrolu čistoty RNA. Koncentrace byla měřena jako absorbance vzorku při vlnové délce 260 nm, čistota RNA byla stanovena jako poměr absorbancí vzorku při vlnových délkách 260 nm a 280 nm, který by se měl pohybovat v intervalu 1,8–2,2. Izolovaná RNA byla uchovávána v -80 °C. 3.6.1
Kontrola čistoty RNA pomocí agarosové elektroforesy
TBE pufr 10x 890mM Tris 890mM kyselina boritá 20mM EDTA (pH 8,0) Skladování při 4 °C.
29
TBE pufr Naředěný TBE pufr 10x v poměru 1:10 redestilovanou, sterilní vodou. Připravován čerstvý.
1% agarosový gel agarosa
2g
TBE pufr 1x
20 ml
Čistota
RNA
izolované
byla
kontrolována
pomocí
horizontální
agarosové
elektroforesy. Připravený 1% agarosový gel byl přelit do sestavené aparatury pro horizontální elektroforesu, byla do něj ponořena šablona pro vznik jamek pro nanesení vzorků. Po zatuhnutí byl gel přenesen do vany pro elektroforesu a převrstven TBE pufrem. Do jamek bylo naneseno 5 µl vzorku s 2 µl PCR vkládacího pufru (Top-Bio s.r.o.). Elektroforesa probíhala ze začátku při napětí 75 V, po chvíli bylo napětí zvýšeno na 100 V a dál probíhala elektroforesa při konstantním napětí po dobu 30 min. Gel byl poté vyjmut z aparatury a barven v roztoku připraveném přidáním 10 μl 1% ethidium bromidu do 200 ml ddH2O. Po 10–15 min působení tohoto interkalačního činidla byl vizualizován UV světlem v ethidium bromidu pomocí přístroje Gel Doc™ 2000 (Bio-Rad) a softwaru Quantity One®. 3.7
Izolace proteinů RIPA pufr IGEPAL CA-630
0,5 ml
deoxycholát sodný
0,25 g
SDS
0,05 g
PBS
49,5 ml
Skladování při 4 °C. Peleta buněk určených pro analýzu proteinů pomocí metody Western blot byla na ledu rozmražena a resuspendována v dvojnásobku jejího objemu v roztoku RIPA, ke kterému byl přidán v poměru 1:25 Complete™ Protease Inhibitor Cocktail. Buněčná suspenze byla inkubována 30–60 min na ledu, poté centrifugována při 4˚C po dobu 20 min při 16 100 X G. Supernatant obsahující proteiny byl přenesen do nové mikrozkumavky a takto mohl být skladován v -80 °C.
30
3.7.1
Určení koncentrace proteinů
Koncentrace proteinů byla stanovena kolorimetricky kitem DC Protein Assay Kit (Bio-Rad) v mikrotitračních destičkách. Všechna stanovení vzorků byla prováděna v tripletu. Jako standard byla použita koncentrační řada BSA (bovinní sérový albumin). Vzorek byl ředěn 8x ddH2O, k 5 μl naředěného vzorku bylo přidáno 25 μl roztoku A´ a 200 μl roztoku B. Vzorky byly po přidání těchto roztoků inkubovány 15 min a poté byla měřena jejich absorbance při 750 nm na spektrofotometru VersaMax™ Microplate Reader (Molecular Devices). Výsledná koncentrace proteinů byla získána pomocí softwaru SoftMax® Pro Software (Molecular Devices). 3.8
Stanovení buněčného cyklu a proliferace buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie Množství a míra kondenzace DNA v buňkách se mění v závislosti na fázi buněčného
cyklu. Pro měření množství DNA v buňkách je využívána vazba propidium jodidu (PI), fluorescenčního barviva interkalačně se vážícího na DNA, po předchozí permeabilizaci buněk detergentem. Využívali jsme kitu DNA Prep kit (Beckman Coulter, Inc.), barvení bylo prováděno podle návodu výrobce, měření probíhalo na cytometru BD FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences) a zastoupení jednotlivých fází buněčného cyklu (G0/G1, S a G2/M) jsme zjišťovali za využití softwaru BD CellQuest Pro Software (BD Biosciences). 3.9
Stanovení apoptózy a viability buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie Viabilita buněk byla stanovena pomocí kitu Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit
(BioVision). Principem stanovení je vazba Annexinu V konjugovaného s FITC (fluorescein isothiokyanát) na fosfatidylserin, čímž jsou označeny časně apoptotické buňky. Pro stanovení množství mrtvých buněk (nekrotických a pozdně apoptotických) je využíván průnik PI do buněk a jeho vazby na DNA. Viabilita je stanovena jako množství živých buněk, které nejsou značeny Annexinem V-FITC ani PI. Získaná peleta buněk byla resuspendována v 500 µl 1X Binding Buffer z kitu. K této suspenzi pak bylo přidáno 5 µl Annexinu V-FITC a 5 µl PI (koncentrace PI 50 µg/ml). Vzorek byl poté minimálně 5 min inkubován při pokojové teplotě. Vazba Annexinu V-FITC na buňky a průnik PI byly analyzovány na cytometru BD FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences).
31
3.10 Stanovení aktivity kaspázy-3 Kaspáza 3 paří do podrodiny CED-3 kaspáz a je kritickým enzymem apoptózy. Zvýšení její aktivity je možné považovat za průkaz apoptózy. Měření aktivity kaspázy 3 jsme použili pro zjištění citlivosti buněčné linie SK-N-AS na cisplatinu v normoxii a v hypoxii. Aktivita kaspázy 3 byla měřena pomocí Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit (BioVision) po 48hodinové kultivaci buněk s cisplatinou . Metoda je založena na hydrolýze značeného substrátu acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroaniline (AcDEVD-pNA) kaspázou 3 a následné spektrofotometrické detekci odštěpeného chromoforu pnitroanilinu (pNA). pNA je kvantifikován použitím spektrofotometru při vlnové délce 400 nm nebo 405 nm. Při měření aktivity bylo postupováno podle protokolu výrobce kitu. 5 x 106 buněk bylo zpracováno podle protokolu výrobce. Všechny chemikálie a byly vychlazeny na teplotu 4 °C. Získaná peleta buněk byla resuspendována v 50–100 µl (dle velikosti pelety) vychlazeného lyzovacího pufru (Cell Lysis Buffer) a inkubována 10 min na ledu. Poté byla centrifugována při 10 000 x g, 1 min, 4 °C. Supernatant s cytosolickým extraktem byl přenesen do nové mikrozkumavky a analyzován nebo uskladněn při -80 °C a vyšetřen později. Pro stanovení aktivity kaspázy 3 bylo použito 150 µg proteinů rozředěných v 50 µl vychlazeného lyzovacího pufru z kitu. Koncentrace proteinů byla stanovena pomocí kitu DC Protein Assay Kit (Bio-Rad) viz výše. K takto připravenému vzorku bylo přidáno 50 µl 2X Reaction Buffer s 10mM DTT. a 5 µl 4mM DEVD-pNA substrátu (výsledná koncentrace substrátu byla 200µM) a vzorek byl inkubován 1–2 hod při 37 °C. Aktivita kaspázy 3 byla měřena
spektrofotometricky
(VersaMax™ Microplate
Reader,
Molecular
Devices)
v mikrotitračních destičkách při 400 nm. Všechna Stanovení byla provedena v tripletu, získané hodnoty byly vyhodnoceny pomocí MS Excel (Microsoft). 3.11 Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) Metoda Western blot (WB) se skládá z několika kroků. Proteiny jsou nejprve rozděleny podle své molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE (elektroforesa v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného). Následně jsou přeneseny na nitrocelulosovou membránu a detekovány specifickou protilátkou.
32
3.11.1 SDS-PAGE
1M Tris-HCl pH 6,8 Tris base
60,57 g
Doplněno do 500 ml redestilovanou, sterilní vodou (ddH2O). pH upraveno pomocí HCl. Skladování při 4 °C.
1,5M Tris-HCl pH 8,8 Tris base
90,8 g
Doplněno do 500 ml ddH2O. pH upraveno pomocí HCl. Skladování při 4 °C.
APS 10% vodný roztok
SDS 10% vodný roztok
Separační gel (~ 11%) 1,5M Tris pH 8,8
2,5 ml
40% Akrylamid/Bis roztok
2,5 ml
10% SDS
100 μl
TEMED
10 μl
Doplněno ddH2O do 10 ml, promícháno. 10% APS
100 μl
APS přidáváno vždy těsně před nalitím gelu, promícháno.
Zaostřovací gel (~ 6%) 1M Tris pH 6,8
1,25 ml
40% Akrylamid/Bis roztok
750 μl
10% SDS
50 μl
TEMED
10 μl
Doplněno ddH2O do 10 ml, promícháno. 10% APS
100 μl
33
Vzorkový pufr Laemmli 6X 375mM Tris-HCl pH 6,8 9% SDS 50% glycerol 9% merkaptoethanol 0,03% bromfenolová modř
Elektrodový pufr 5X Tris base
7,55 g
Glycin
47 g
SDS
2,5 g
Doplněno do 450 ml ddH2O. pH 8,8 (neupravováno).
Elektrodový pufr 1X Running buffer 5x
50 ml
Doplněno do 250 ml redestilovanou vodou. Připravený separační gel byl nalit mezi skla a po zatuhnutí přelit zaostřovacím gelem, do nějž byla vložena šablona pro jamky určených k nanesení vzorků. Poté byl přenesen do aparatury pro vertikální elektroforesu. Do aparatury byl přidán elektrodový pufr 1X, šablona pro vznik jamek byla vyjmuta a do jamek bylo po povaření naneseno 5 μl vzorku s 1 μl vzorkovacího pufru Laemmli 6X. Do první jamky byly nanášeny 4 μl proteinového standardu (PageRuler™
Prestained
Protein
Ladder,
Fermentas).
Vzorky
byly
připravovány
v požadované koncentraci ředěním ddH2O. Elektroforesa probíhala při konstantním proudu 0,25mA/cm2 po dobu 80 min. 3.11.2 Přenos na membránu
Transferový pufr 5X Tris base
30,5 g
Glycin
145 g
Doplněno do 2000 ml redestilovanou vodou. Skladován při 4 °C.
34
Transferový pufr 1X Transferový pufr 5x 200 ml Doplněno do 900 ml redestilovanou vodou. Doplněno do 1000 ml methanolem. Připravován vždy čerstvý. Po skončení SDS-PAGE byl proveden elektroforetický transfer rozdělených proteinů
z gelu na nitrocelulosovou membránu. Přenos probíhal v blotovací aparatuře v transferovém pufru 1X při 4 °C, konstantním proudu 350 mA po dobu 80 min. 3.11.3 Blokování nespecifických interakcí
Ponceau S 2% Ponceau S
2g
Kyselina trichloroctová
30 g
Kyselina sulfosalicylová
30 g
Doplněno do 100 ml ddH2O. Skladování při 4 °C.
PBS/Tween PBS 1x
400 ml
20% Tween
1 ml
Skladován při 4 °C.
5% mléko v PBS/Tween Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk (Bio-Rad)
5g
Doplněno do 100 ml PBS/Tween. Pro ověření úspěšnosti přenosu byly po převedení na nitrocelulosovou membránu proteiny reverzibilně detekovány pomocí diazobarviva Poceau S, které se dá snadno odstranit promytím membrány v PBS 1x. Poté proběhlo blokování membrány v 5% mléce v PBS/Tween, aby se omezily nespecifické interakce mezi proteiny a primární protilátkou. Blokování trvalo 1 hod za mírného míchání na přístroji GyroTwister S1000 (Labnet) při pokojové teplotě.
35
3.11.4 Inkubace s protilátkami
0,1% mléko PUFR C
4 ml
5 % odtučněné mléko
80 µl
Po zablokování nespecifických interakcí byla membrána inkubována s primární protilátkou (Santa Cruz Biotechnology) ředěnou v poměru 1:500 v 5% mléce v PBS/Tween přes noc ve 4 °C, nebo ředěnou v poměru 1:250 v 5% mléce v PBS/Tween po dobu 2–3 hod při pokojové teplotě. Po skončení inkubace s primární protilátkou byla membrána 3x promyta 20 ml roztoku PBS/Tween pomocí vakuového systému Snap i.d. (Millipore; Obr. 9). Poté byla přidána sekundární protilátka (goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) ředěná v poměru 1:2000 v 0,1% mléce. Po 10 min inkubace při pokojové teplotě byla protilátka vakuově odsáta a membrána byla opět 3x promyta 20 ml roztoku PBS/Tween.
Obr. 9 Snap i.d. Systém pro vakuové promývání a inkubaci s protilátkami (Millipore, USA).
3.11.5 Detekce
Vizualizace signálu sekundární protilátky, která umožňuje detekci proteinu HIF-1α o molekulové hmotnosti 120 kDA, byla provedena pomocí kitu Immun-Star™ HRP Chemiluminescent Kit (Bio-Rad). Sekundární protilátka (goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) byla konjugována s enzymem HRP (křenová peroxidasa, horseradish peroxidase), který v přítomnosti peroxidu vodíku katalyzuje oxidaci substrátu luminolu za vzniku chemiluminiscence. Immun-Star™ HRP Chemiluminescent Kit obsahuje roztok luminolu se zesilovačem signálu a pufr s peroxidem. Roztok luminolu byl smíchán s pufrem
36
v poměru 1:1 (dále uváděno jako substrát) a aplikován na membránu (2 ml na membránu o velikosti 7 cm x 5 cm). Membrána byla se substrátem inkubována 3–4 min, poté byl přebytek substrátu odstraněn a membrána vložena do kazety na film (CAWO ABS X-ray cassette, CAWO). Ve fotokomoře byl pak do kazety vložen film, na nějž byl exponován chemiluminiscenční signál. 3.12 PCR Pro ověření transkripční aktivity HIF-1α bylo provedeno kvantitativní Real Time PCR (qRT-PCR) pro HIF-1α cílové geny VEGFA a SLC2A1, které kódují proteiny VEFG-A a Glut1. Jako referenční gen byl zvolen B2M (β-2 microglobulin), který je exprimovaný konstitutivně, nezávisle na aktivitě HIF-1α. Pro qRT-PCR je nejprve nutné získat cDNA z izolované mRNA. 3.12.1 Reversní transkripce
Pro reverzní transkripci mRNA do cDNA byly použity vzorky RNA získané z buněk SK-N-AS (viz kap. 3.6 Izolace RNA s TRIzol Reagent). Pro vzorky byl připraven Master Mix 1, jeho přehled je v Tab. II. Master Mix 1 byl rozdělen na alikvoty a přidán k 2 µg izolované RNA rozředěné v PCR-H2O. Směs o celkovém objemu 25 μl byla inkubována 10 min při 25 °C, 50 min při 37 °C, 5 min při 95 °C a 1 min při 4 °C. Tab. II Master Mix 1. Uvedená množství jsou pro 1 vzorek.
10x RT Buffer 5mM MgCl2 dNTP mix Random hexamers RNAse ihibitor RT RNA (2 µg) + H2O
2,5 µl 5,5 µl 5 µl 1,25 µl 0,5 µl 1,5 µl 8,75 µl
3.12.2 Kvantitativní polymerasová řetězová reakce v reálném čase
Pro kvantitativní polymerasovou řetězovou reakci v reálném čase (qRT-PCR) byla jako templát použita cDNA získaná reversní transkripcí. 2 μl cDNA byly přidány k Master Mixu 2, jeho složení je uvedeno v Tab. III.
37
Tab. III Master Mix 2. Uvedená množství jsou pro 1 vzorek.
TaqMan gene expression MM 10x proba + primery H2O cDNA
12,5 µl 2,5 µl 8 µl 2 µl
Exprese každého genu byla analyzována v tripletu. Byly použity komerční primery a sondy HIF-1α cílových genů od firmy GENERI BIOTECH, s.r.o. VEGFA a SLC2A1, jako referenční byl zvolen gen B2M. Reakce probíhala v přístroji ABI 7300 cycler (Applied Biosystems, USA). Reakce probíhala za následujících podmínek: 95 °C 15 min (iniciace polymerázy a úvodní denaturace DNA) a 40 cyklů 95 °C 10 s (denaturace DNA) a 60 °C 40 s (připojení primerů, a syntéza DNA). Výsledné
hodnoty
získané
z termocykléru
byly
zpracovány
a
statisticky
vyhodnoceny programem Relative Expression Software Tool (REST). Pro výpočet statistické významnosti používá REST Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test, všechny uváděné výsledky byly vyhodnoceny jako statisticky významné (p ≤ 0,05)152.
38
4
VÝSLEDKY A DISKUSE Sledovali jsme význam transkripčního faktoru HIF-1α na hypoxií navozenou
chemorezistenci u buněčné linie lidského neuroblastomu. Již dříve byla prokázána souvislost mezi vysokou expresí HIF-1α u různých typů nádorových buněk a špatnou prognózou onemocnění143, 153–155. Je známo, že hypoxie navozuje chemorezistenci na chemoterapii i radioterapii, ale podíl exprese HIF-1α na těchto hypoxií indukovaných jevech není přesně znám. Pro ověření významu HIF-1α na hypoxií indukovanou chemorezistenci jsme použili buněčnou linii neuroblastomu SK-N-AS. Buňky byly kultivovány v normoxii a v hypoxii (1 % kyslíku). Expresi HIF-1α jsme prokazovali pomocí metody Western blot, buněčnou smrt jsme detekovali Anexinem V a PI na průtokovém cytometru nebo jako zvýšení aktivity kaspázy 3. Pro snížení exprese nebo transkripční aktivity HIF-1α jsme použili „silencing“ pomocí siRNA a nízkomolekulární inhibitory LW6, YC-1 a chetomin. Zjistili jsme, že hypoxie snižuje citlivost buněk SK-N-AS k cisplatině a že je možné tuto hypoxií navozenou rezistenci zvrátit snížením exprese HIF-1α . 4.1
Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) Pomocí metody Western blot byla sledována dynamika exprese proteinu HIF-1α
v různých kultivačních podmínkách. Buněčná linie SK-N-AS byla kultivována v normoxii a hypoxii (1 % kyslíku). Při optimalizaci Western blotingu jsme zjistili, že nejlepších výsledků bylo dosaženo, pokud bylo použito méně než 30 µg proteinu/jamku a inkubace s primární protilátkou probíhala přes noc při 4 °C.
Obr. 10 Dynamika hypoxické exprese HIF-1α. Buňky byly sbírány po 2, 4, 8, 16, 48, 72, 96 a 120hodinové kultivaci v hypoxii (H). Jako kontrola byly použity buňky kultivované 2 hod v normoxii (N 2). Bylo použito 15 µg proteinu/jamku a krátká doba expozice.
Na Obr. 10 je patrná zvýšená exprese HIF-1α v hypoxii.
Nejvyšší expresi
transkripčního faktoru HIF-1α jsme pozorovali po 8–16hodinové kultivaci v hypoxii. V delších časových intervalech (72 hod) je patrné snížení exprese a následně opět její zvýšení. Krátkodobý vzestup HIF-1α po expozici hypoxii potvrzují i údaje o experimentech na jiných buněčných liniích. Ke zvýšení exprese proteinu HIF-1α dochází zejména v akutní fázi
39
hypoxie, následně jeho exprese klesá122. Na opětovném zvýšení hladiny HIF-1α v buňkách v kultivačních časech 96 a 120 hod se může podílet řada faktorů. Bylo popsáno zvýšení exprese HIF-1α v souvislosti se snížením pH, které lze očekávat při delší kultivaci buněk v hypoxii v důsledku produkce laktátu. IMDM médium obsahuje fenolovou červeň, která indikuje přechodovou oblast mezi pH 6,8–8,4156. V dlouhodobých kultivacích, zvláště v hypoxických podmínkách, odpovídala žlutá barva média silnému snížení pH. Změnu pH media jsme ověřili pomocí pH metru (Graf 1). Protože ideální pH pro růst buněk se pohybuje v rozmezí 7,3–7,6, snížení pH pod hodnotu 7 se může podílet na opětovném zvýšení exprese HIF-1α při dlouhodobých kultivacích v hypoxii. Kromě hromadění laktátu v médiu však mohou mít vliv na opětovné zvýšení exprese i jiné metabolity produkované kultivovanými buňkami. Zda se na změně exprese HIF-1α podílí pH media a/nebo metabolity látkové přeměny nebo látky uvolňované buňkami do media je nutné ověřit dalšími experimenty. V dalších experimentech budeme sledovat vliv pH media v časných fázích kultivace a vliv frakcí kondicionovaného media z různých fází kultivace na expresi HIF-1α. 8
7,5
pH
Počet buněk/cm2
7
13 000 26 000
6,5 24 hod
48 hod
72 hod
96 hod
120 hod
Graf 1 Závislost pH média na době kultivace a počtu buněk na kultivační ploše. Počet buněk/cm2 udává množství buněk nasazených na kultivační misky.
Vzhledem k nízkému signálu HIF-1α po normoxické kultivaci (Obr. 10, N 2) byl Western blot déle exponován takže byla patrná i exprese HIF-1α v normoxii. (Obr. 11)
Obr. 11 Dynamika hypoxické exprese HIF-1α. Buňky byly sbírány po 2, 4, 8, 16, 48, 72, 96 a 120hodinové kultivaci v hypoxii (H). Jako kontrola byly použity buňky kultivované 2 hod v normoxii (N 2). Bylo použito 15 µg proteinu/jamku a dlouhá doba expozice vzhledem k nízké expresi v normoxii.
40
4.2
Exprese HIF-1α v normoxii Expresi HIF-1α v normoxii jsme rovněž sledovali pomocí metody Western blot
(Obr. 12), kde byla porovnána exprese HIF-1α po 6, 12, 24 a 48 hodinách kultivace v normoxii a v hypoxii. Z výsledků (Obr. 11 a 12) je patrné, že exprese HIF-1α v normoxii není konstantní. Hladina proteinu HIF-1α v buňkách SK-N-AS po 2, 24 a 48hodinové kultivaci v normoxii je nižší než jeho hladina ve stejných časech v hypoxii.
Obr. 12 Normoxická a hypoxická exprese HIF-1α. Buňky sbírané po 6, 12 a 48hodinové kultivaci v normoxii (N) a v hypoxii (H). Bylo použito 20 µg proteinu/jamku.
Normoxická exprese HIF-1α již byla popsána v neurogenních zónách mozku a neurálních/progenitorových buňkách76, 77. Je možné, že transkripční aktivita HIF-1α je zde ovlivněna jeho subcelulární lokalizací. Transkripční faktor HIF-1α může být pravděpodobně navázán na specializované struktury v cytoplasmě, nebo lokalizován ve specializovaných vezikulách, které znemožňují jeho transport do jádra75. Kromě subcelulární lokalizace HIF-1α však může mít vliv na jeho normoxickou expresi i mutace v genu VHL u buněk SK-N-AS25. Pro ověření je třeba provést DNA analýzu této buněčné linie. 4.3
Ověření hypoxií indukované chemorezistence buněk SK-N-AS pomocí stanovení aktivity kaspázy-3 a vazby Anexinu V Zvýšená exprese HIF-1α je spojována s agresivním fenotypem a chemorezistencí
nádorů112. Pro ověření hypoxické chemorezistence buněčné linie SK-N-AS byly tyto buňky inkubovány 48 hod v normoxii a hypoxii s cytostatikem cisplatinou (5 µg/ml média). Poté u nich byla stanovena apoptóza měřením aktivity kaspázy 3 pomocí soupravy Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit (BioVision) a viabilita a časná apoptóza měřením vazby Annexinu-V pomocí průtokové cytometrie.
41
Aktivita kaspázy 3 (A)
400 300 Normoxie
200
Hypoxie 100 0 K
CDDP
Graf 2 Aktivita kaspázy 3 v buňkách kultivovaných s cisplatinou (CDDP) v normoxii a hypoxii. Aktivita kaspázy 3 je vyjádřena jako absorbance vzorku měřená při 400 nm. K – kontrolní buňky bez cisplatiny, CDDP – cisplatina.
V Grafu 2 je patrná nižší aktivita kaspázy 3 u buněk kultivovaných s cisplatinou v hypoxii než u buněk kultivovaných s cisplatinou v normoxii. Aktivita kaspázy 3 je úměrná apoptóze těchto buněk. Časně apoptotické buňky (%)
Živé buňky (%)
100 80 60 40 20 0 K normoxie
CDDP hypoxie
15 10 5 0 K normoxie
CDDP hypoxie
Graf 3 Viabilita a časná apoptóza buněk kultivovaných s cisplatinou (CDDP) v normoxii a hypoxii.
Vazbou Annexinu-V byla také potvrzena chemorezistence buněčné linie SK-N-AS na cisplatinu. V normoxii je patrné výrazně vyšší zastoupení časně apoptotických buněk než v hypoxii, s tím korelují hladiny viability buněk v normoxii a hypoxii. (Graf 3) 4.4
Inhibice HIF-1α Pokusili jsme inhibovat HIF-1α pomocí dvou různých metod, potlačením exprese
mRNA HIF-1α pomocí siRNA a malými chemickými inhibitory proteinu HIF-1α.
42
4.4.1
Utlumení exprese HIF-1α pomocí siRNA
4.4.1.1
Kontrola transfekce pomocí fluorescenčně značené nesilencující siRNA
Pro zjištění účinnosti transfekce buněk pomocí Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen) byly buňky nejprve transfekovány siRNA konjugovanou s FITC (BLOCK-iT™ Fluorescent Oligo, Invitrogen). Na Obr. 13 je vidět, že transfekce proběhla úspěšně.
Obr. 13 Buňky SK-N-AS 24 hod po transfekci siRNA konjugovanou s FITC (zvětšení 200x).
4.4.1.2
Ověření utlumení exprese HIF-1α metodou Western blot
Pro utlumení exprese HIF-1α byla použita HIF1A ON-TARGETplus siRNA (Dharmacon) cílená proti HIF-1α mRNA. Jako kontrolní byly použity netransfekované buňky kultivované za jinak stejných podmínek. Pro ověření účinnosti transfekce byly buňky sbírány 24 a 48 hod po transfekci. 48hodinové kultivace jsou důležité především pro následné sledování chemorezistence buněk, k jejímuž nástupu dochází u buněk kultivovaných in vitro většinou až se zpožděním vzhledem k maximu exprese HIF-1α. Utlumení exprese HIF-1α v transfekovaných buňkách bylo ověřeno pomocí stanovení hladiny HIF-1α Western blotem v transfekovaných a kontrolních buňkách, kde jasně vidíme nižší množství v transfekovaných buňkách kultivovaných v normoxii i v hypoxii, zvláště po 48 hodinách. (Obr. 14)
Obr. 14 Porovnání exprese proteinu HIF-1α v transfekovaných (t) a kontrolních buňkách. Buňky byly transfekovány (t) a následně kultivovány 24 a 48 hod v normoxii (N) a hypoxii (H). Jako kontrolní byly použity netransfekované buňky kultivované za jinak stejných podmínek.
43
4.4.1.3
Sledování exprese mRNA HIF-1α cílových genů po transfekci
Po transfekci buněk siRNA cílené proti HIF-1α (HIF1A ON-TARGETplus siRNA, Dharmacon) byla sledována i jeho transkripční aktivita. Bylo provedeno kvantitativní Real Time PCR (qRT-PCR) pro HIF-1α cílové geny VEGFA a SLC2A1, které kódují proteiny VEGF-A a Glut1. Jako referenční gen byl zvolen B2M, který kóduje β2 mikroglobulin a není cílovým genem HIF-1α. Jako kontrolní byly použity netransfekované buňky kultivované za jinak stejných podmínek a zároveň i buňky transfekované kontrolní, nesilencující siRNA (ON-TARGETplus siCONTROL Non-targeting Pool, Dharmacon). Z výsledků (Graf 4 a Graf 5) je patrné výrazné snížení exprese genů VEGFA a SLC2A1 24 a 48 hod po transfekci buněk siRNA cílené proti HIF-1α mRNA.
Relativní exprese
2,5 1,5 Glut 1
0,5
VEGF
-0,5 -1,5 N-K2
N-H1 siRNA
H-K2
H-H1 siRNA
Graf 4 Exprese HIF-1α cílových genů VEGFA (VEGF) a SLC2A1 (Glut 1) 24 hod po transfekci. Hodnoty jsou vztažené ke kontrolním buňkám kultivovaným 24 hod v normoxii. N – normoxie, H – hypoxie, K2 – kontrolní buňky transfekované nesilencující siRNA (ON-TARGETplus siCONTROL Non-targeting Pool, Dharmacon), H1 siRNA – buňky transfekované siRNA cílenou proti HIF-1α (HIF1A ON-TARGETplus siRNA, Dharmacon). Z kontrolních, netransfekovaných buněk kultivovaných v hypoxii se nepodařilo izolovat dostatečné množství RNA pro qRT-PCR. Oproti K2 však došlo i v hypoxii k výraznému snížení exprese HIF-1α (H-H1 siRNA) po transfekci buněk siRNA cílené proti HIF1α.
44
Relativní exprese
2,5 1,5 Glut 1 0,5
VEGF
-0,5 -1,5 N-K2
N-H1 siRNA
H-K1
H-K2
H-H1 siRNA
Graf 5 Exprese HIF-1α cílových genů VEGFA (VEGF) a SLC2A1 (Glut 1) 48 hod po transfekci. Hodnoty jsou vztažené ke kontrolním buňkám kultivovaným 48 hod v normoxii. N – normoxie, H – hypoxie, K1 – kontrolní, netransfekované buňky, K2 – kontrolní buňky transfekované nesilencující siRNA (ON-TARGETplus siCONTROL Nontargeting Pool, Dharmacon), H1 siRNA – buňky transfekované siRNA cílenou proti HIF-1α (HIF1A ON-TARGETplus siRNA, Dharmacon). V hypoxii i normoxii je patrné snížení exprese HIF-1α po transfekci buněk siRNA cílené proti HIF-1α.
4.4.2
Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů
Kromě silencingu HIF-1α jsme testovali jeho inhibici pomocí malých molekul, které inhibují různými mechanismy transkripční aktivitu HIF-1α. Byly vybrány 3 molekuly, chetomin, YC-1 a LW6, které byly již dříve popsány jako inhibitory HIF-1α157–160.
Obr. 15 Strukturní vzorec chetominu160.
Chetomin, epidithiodioxopiperazin (Obr. 15) je přirozený metabolit produkovaný několika druhy rodu Chaetomium161. Bylo prokázáno, že chetomin není nespecifickým inhibitorem vazby transkripčních koaktivátorů, protože například na aktivitu transkripčních koaktivátorů SRC-1, SREBP2 nebo RAR nemá žádný vliv. Chetomin rozrušuje strukturu CH1 domény transkripčních koaktivátorů p300/CBP, čímž zabraňuje jejich interakci s HIF-1α a HIF-2α a tím i jejich transkripční aktivitě, která přítomnost koaktivátorů vyžaduje. Transkripční koaktivátory SRC-1, SREBP2 a RAR pravděpodobně interagují s transkripčními faktory prostřednictvím jiné domény41, 157.
45
Obr. 16 Strukturní vzorec inhibitoru LW6163.
Inhibitor
LW6,
3-[2-(4-adamantan-1-yl-phenoxy)-acetylamino]-4-methylbenzoát
(Obr. 16), je nízkomolekulární látka, která inhibuje transkripční aktivitu HIF-1α nezávisle na ovlivnění exprese ARNT (HIF-1b). U buněk karcinomu tlustého střeva HCT116162 a buněk hepatocelulárního karcinomu Hep3B159 LW6 snižuje hladinu proteinu HIF-1α zvýšením exprese pVHL a následné proteasomální degradace HIF-1α, přičemž neovlivňuje aktivitu PHDs.
Obr. 17 Strukturní vzorec inhibitoru YC-1163.
Poslední zvolený inhibitor, YC-1, 3-(5´-hydroxymethyl-2´-furyl)-1-benzylindazol, inhibuje transkripční aktivitu HIF-1α pomocí inaktivace transaktivační domény (C-TAD) HIF-1α. YC-1 stimuluje i v hypoxických podmínkách vazbu FIH na C-TAD, pravděpodobně však nezávisle na hydroxylaci Asn803164. FIH také brání interakci HIF-1α i HIF-2α s CH1 doménou p300/CBP koaktivátorů, čímž snižuje transkripční aktivitu α podjednotek HIF proteinů91, 92, YC-1 však zároveň snižuje i samotnou expresi proteinu HIF-1α164. 4.4.2.1
Sledování exprese mRNA HIF-1α cílových genů po jeho selektivní inhibici
Účinnost inhibitorů HIF-1α byla sledována pomocí qRT-PCR HIF-1α cílových genů VEGFA a SLC2A1. Pro stanovení nejúčinnější koncentrace inhibitoru jsme nejprve vybrali na základě literárních údajů tři různé koncentrace každého z nich. Na expresi HIF-1α cílového genu VEGFA (Grafy 6 a7) bylo ověřeno, že všechny vybrané a použité molekuly inhibují
46
transkripční aktivitu HIF-1α v hypoxii (Graf 7) s výjimkou LW6. Ten ovlivňuje stabilitu HIF1α a k jeho efektu je nezbytný intaktní VHL protein162.
Relativní exprese
1
0,5 VEGF Glut-1
0
-0,5
-1 L10
L50
L100
Y10
Y50
Y100
Ch 0,1
Ch 0,5
Ch 1,0
Graf 6 Exprese HIF-1α cílových genů VEGFA (VEGF) a SLC2A1 (Glut 1) v normoxii, 48 hod po inhibici. Hodnoty jsou vztažené ke kontrolním buňkám kultivovaným 48 hod v normoxii bez inhibitorů. L – inhibitor LW6, Y – inhibitor YC-1, Ch – chetomin. 10 (0,1 pro chetomin) – koncentrace 10uM, 50 (0,5 pro chetomin) – koncentrace 50uM, 100 (1,0 pro chetomin) – koncentrace 100uM.
1
Relativní exprese
0,5 VEGF Glut-1
0 -0,5 -1 -1,5 L10
L50
L100
Y10
Y50
Y100
Ch 0,1
Ch 0,5
Ch 1,0
Graf 7 Exprese HIF-1α cílových genů VEGFA (VEGF) a SLC2A1 (Glut 1) v hypoxii, 48 hod po inhibici. Hodnoty jsou vztažené ke kontrolním buňkám kultivovaným 48 hod v hypoxii bez inhibitorů. L – inhibitor LW6, Y – inhibitor YC-1, Ch – chetomin. 10 (0,1 pro chetomin) – koncentrace 10uM, 50 (0,5 pro chetomin) – koncentrace 50uM, 100 (1,0 pro chetomin) – koncentrace 100uM.
47
4.4.2.2
Stanovení apoptózy a viability buněk SK-N-AS po inhibici HIF-1α pomocí průtokové cytometrie
Pro následující experimenty bylo nutné zvolit vhodnou koncentraci jednotlivých inhibitorů. Kromě sledování exprese genů VEGFA a SLC2A1, díky níž jsme získali přehled o inhibici transkripční aktivity HIF-1α, jsme se zaměřili i na stanovení apoptózy a viability buněk po inhibici. Z výsledků (Grafy 8 a 9) je patrná vysoká cytotoxicita chetominu v normoxii i hypoxii, a to především v koncentraci 1,0 µM. Pro další experimenty byla zvolena koncentrace 0,5 µM, která byla kompromisem mezi inhibiční schopností (Graf 7) a cytotoxicitou chetominu. Inhibitory LW6 a YC-1 jsou pro buňky méně toxické, a byly proto dále používány v koncentraci 100 µM.
Živé buňky (%)
95
kontrola bez inhibitoru (N/H)
75 c 10µM (0,1µM pro chetomin)
55
c 50µM (0,5µM pro chetomin)
35
c 100µM (1,0µM pro chetomin)
15
Graf 8 Viabilita buněk po použití tří různých koncentrací inhibitorů LW6, YC-1 a chetominu, po 48hod kultivaci.
Časně apoptotické buňky (%)
40
kontrola bez inhibitoru (N/H)
30
c 10µM (0,1µM pro chetomin)
20 10
c 50µM (0,5µM pro chetomin)
0
c 100µM (1,0µM pro chetomin)
Graf 9 Časná apoptóza buněk po použití tří různých koncentrací inhibitorů LW6, YC-1 a chetominu, po 48hod kultivaci.
48
4.4.2.3
Stanovení buněčného cyklu buněk SK-N-AS po inhibici HIF-1α pomocí průtokové cytometrie
Pro většinu nádorových buněk je typická zástava buněčného cyklu v G0/G1 fázi v hypoxii. Mnoho chemoterapeutik ale efektivně působí jen na proliferující buňky120. Proto nás zajímal i vliv použitých inhibitorů na buněčný cyklus.
KN KH LW6 10 N
G0/G1 fáze
LW6 10 H
S fáze G2/M fáze
LW6 50 N LW6 50 H LW6 100 N LW6 100 H 0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 10 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných 48 hod s inhibitorem LW6 v normoxii (N) a hypoxii (H). Byly použity koncentrace inhibitoru 10, 50 a 100 µM.
Zdá se, že inhibitor LW6 v koncentracích 50 µM a 100 µM nemá na buněčný cyklus v normoxii ani v hypoxii téměř žádný vliv. Jeho nízká koncentrace naopak trochu prodlužuje G0 fázi. (Graf 10) KN KH Y 10 N Y 10 H Y 50 N Y 50 H Y100 N
G0/G1 fáze S fáze G2/M fáze
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 11 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných 48 hod s inhibitorem YC-1 v normoxii (N) a hypoxii (H). Byly použity koncentrace inhibitoru 10, 50 a 100 µM.
Podobně jako inhibitor LW6, ani inhibitor YC-1 nemá pravděpodobně velký vliv na buněčný cyklus. (Graf 11) Je však možné, že v koncentraci 100 µM v hypoxii prodlužuje G0/G1 fázi, stejně jako ji prodlužoval při této koncentraci v normoxii. Pro tuto analýzu však nebylo získáno dostatečné množství buněk, aby byl výsledek signifikantní. Inhibitory LW6 a YC-1 by proto mohly být vhodné pro použití v kombinaci s cytostatiky, která nejsou fázově
49
specifická, nebo působí více na buňky v G0 fázi. Takovým cytostatikem je například cisplatina165, která byla použita v následujícím experimentu pro sledování vlivu inhibice HIF1α na chemorezistenci. KN KH CH 0,1 N CH 0,1 H CH 0,5 N CH 0,5 H CH 1 N CH 1 H
G0/G1 fáze S fáze G2/M fáze
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 12 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných 48 hod s chetominem v normoxii (N) a hypoxii (H). Byly použity koncentrace inhibitoru 0,1, 0,50 a 1,0 µM.
Chetomin má pravděpodobně vliv na přechod z G1 do S fáze (Graf 12) a mohl by být proto využit i v kombinaci s fázově specifickými cytostatiky. Je však nutné brát v úvahu jeho velmi vysokou cytotoxicitu, která může mít vliv i na zdravé buňky. 4.4.2.4
Stanovení buněčného cyklu buněk SK-N-AS po inhibici HIF-1α a podání cisplatiny
Pro další sledování vlastností nízkomolekulárních inhibitorů byla stanovena kinetika buněčného cyklu, tedy zastoupení buněk v jednotlivých fázích (G0/G1, S, G2/M) buněčného cyklu. Sledovali jsme kinetiku cyklu po působení fázově nespecifického, alkylačního cytostatika, cisplatiny, jednotlivých nízkomolekulárních inhibitorů a jejich kombinaci při kultivaci v normoxii i v hypoxii. KN KH K +CDDP N K +CDDP H LW6 N LW6 H LW6 +CDDP N LW6 +CDDP H
G0/G1 fáze S fáze G2/M fáze
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 13 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných 48 hod s inhibitorem LW6 a cisplatinou. Kultivace probíhala 48 hod v normoxii (N) a hypoxii (H). CDDP – cisplatina, K – kontrolní buňky kultivované bez inhibitoru.
50
Zdá se, že ani v kombinaci s cisplatinou nemá inhibitor LW6 téměř žádný vliv na buněčný cyklus v normoxii a hypoxii. (Graf 13) Cisplatina působí více na buňky v G0 fázi, za snížení počtu buněk v této fázi může proto pravděpodobně zvýšená míra jejich apoptózy navozená potlačením chemorezistence. Dalším možným mechanismem sníženého zastoupení buněk v G0/G1 fázi může být i blokování v S nebo v G2 fázi a hromadění buněk před tímto blokem. KN KH K +CDDP N K +CDDP H YC-1 N YC-1 H YC-1 +CDDP N YC-1 +CDDP H
G0/G1 fáze S fáze G2/M fáze
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 14 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných 48 hod s inhibitorem YC-1 a cisplatinou. Kultivace probíhala 48 hod v normoxii (N) a hypoxii (H). CDDP – cisplatina, K – kontrolní buňky kultivované bez inhibitoru.
V kombinaci s cisplatinou se v hypoxii po použití inhibitoru YC-1 zvýšilo zastoupení buněk v G0/G1 fázi. Zároveň bylo ověřeno, že i samotný inhibitor YC-1 skutečně v normoxii i v hypoxii zvyšuje podíl buněk v G0/G1 fázi. (Graf 14) KN KH K +CDDP N K +CDDP H Ch N Ch H Ch +CDDP N Ch +CDDP H
G0/G1 fáze S fáze G2/M fáze
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 15 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných 48 hod s chetominem a cisplatinou. Kultivace probíhala 48 hod v normoxii (N) a hypoxii (H). CDDP – cisplatina, K – kontrolní buňky kultivované bez inhibitoru.
Buněčný cyklus po aplikaci chetominu a následně cisplatiny se významněji neliší od působení samotného chetominu. (Graf 15)
51
4.4.3
Vliv inhibice HIF-1α na hypoxií indukovanou chemorezistenci
Stanovení apoptózy a viability buněk je jednou z hlavních metod pro sledování účinku protinádorových léků. Vliv inhibice HIF-1α na chemorezistenci byl proto sledován pomocí této metody. Pro navození apoptózy u nádorových buněk jsme použili cisplatinu, cytostatikum používané v léčbě neuroblastomu. Porovnávali jsme inhibici HIF-1α pomocí siRNA a nízkomolekulárních inhibitorů LW6, YC-1 a chetominu. Inhibitory LW6 a YC-1 byly použity v koncentraci 100 µM, chetomin v koncentraci 0,5 µM.
100 80 normoxie 60
hypoxie normoxie +CDDP
40
hypoxie +cddp 20 0
Graf 16 Viabilita buněk po inhibici HIF-1α pomocí inhibitorů LW6, YC-1, chetominu a siRNA. Kultivace s inhibitory a po transfekci siRNA probíhala 48 hod v normoxii (N) a hypoxii (H). CDDP – cisplatina, K – kontrolní buňky, LW6 – buňky kultivované s inhibitorem LW6, YC-1 – buňky kultivované s inhibitorem YC-1, Chetomin – buňky kultivované s chetominem, non-siRNA – buňky transfekované kontrolní siRNA, siRNA – buňky transfekované siRNA cílené proti HIF-1α.
40 30
normoxie hypoxie
20
normoxie +CDDP hypoxie +cddp
10 0
Graf 17 Časná apoptóza buněk po inhibici HIF-1α pomocí inhibitorů LW6, YC-1, chetominu a siRNA. Kultivace s inhibitory a po transfekci siRNA probíhala 48 hod v normoxii (N) a hypoxii (H). CDDP – cisplatina, K – kontrolní buňky, LW6 – buňky kultivované s inhibitorem LW6, YC-1 – buňky kultivované s inhibitorem YC-1, Chetomin buňky kultivované s chetominem, non-siRNA – buňky transfekované kontrolní siRNA, siRNA – buňky transfekované siRNA cílené proti HIF-1α.
52
U kontrolních buněk (K; Grafy 16 a 17) byla potvrzena vysoká chemorezistence vůči cisplatině v hypoxii. U všech použitých nízkomolekulárních inhibitorů HIF-1α byl potvrzen jejich vliv na snížení hypoxií indukované chemorezistence, nejúčinnější se zdá být inhibitor YC-1 a chetomin, ačkoli použitá koncentrace chetominu 0,5 µM se v literatuře pohybuje na dolní hranici použití. Bylo tedy prokázáno, že HIF-1α se velkou měrou podílí na chemorezistenci buněčné linie SK-N-AS odvozené od neuroblastomu a jeho cílenou inhibicí lze tuto chemorezistenci potlačit. Z výsledků je však také patrné, že v rámci tohoto experimentu se nepodařilo utlumit expresi HIF-1α pomocí siRNA, protože viabilita buněk po transfekci kontrolní, nesilencující siRNA je dokonce nižší, než viabilita buněk transfekovaných siRNA cílenou proti HIF-1α (tomu adekvátně odpovídá procentuální zastoupení časně apoptotických buněk). U všech transfekovaných
buněk
kultivovaných
s cisplatinou
ale
stejně
jako
po
použití
nízkomolekulárních inhibitorů došlo ke zvýšení míry apoptózy. Zdá se tedy, že transfekce sama o sobě, i pokud nedošlo k silencingu HIF-1α, měla vliv na viabilitu a buněčný cyklus (Graf 18) buněk SK-N-AS. Důvodem neúspěchu siRNA ve snížení hypoxií indukované chemorezistence je patrně nedostatečná optimalizace této metody, její zvládnutí bude předmětem mé další práce na Klinice dětské hematologie a onkologie v rámci postgraduálního studia. Pro získání více informací o tomto jevu je nutné provést další experimenty.
KN KH K +CDDP N K +CDDP H non-siRNA N non-siRNA H non-siRNA +CDDP N non-siRNA +CDDP H siRNA N siRNA H siRNA +CDDP N siRNA +CDDP H
G0/G1 fáze S fáze G2/M fáze
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Graf 18 Buněčný cyklus SK-N-AS buněk kultivovaných s cisplatinou (CDDP) 48 hod po transfekci siRNA cílenou proti HIF-1α.
53
5
ZÁVĚR Na základě provedených experimentů jsme zjistili dynamiku exprese proteinu HIF-1α
u buněčné linie SK-N-AS odvozené od lidského neuroblastomu v normoxii (21 % O2) i hypoxii (1 % O2). V hypoxii jsme pozorovali nejvyšší expresi transkripčního faktoru HIF-1α po 8-16hodinové kultivaci. V delších časových intervalech (48 a 72 hod) bylo pozorováno snížení exprese HIF-1α a následně opět její zvýšení. Na opětovném zvýšení hladiny HIF-1α při kultivaci buněk v hypoxii se může podílet více faktorů, mezi něž patří například snížení pH média v důsledku hromadění laktátu produkovaného buňkami. Kromě pH však mohou mít na toto opětovné zvýšení exprese vliv i jiné metabolity, což je třeba ověřit dalšími experimenty. Prokázali jsme i normoxickou expresi HIF-1α, jejíž hladina také v závislosti na době kultivace buněk kolísá. Pro zjištění příčiny normoxické exprese HIF-1α u buněčné linie SKN-AS bude však ještě nutné provést imunocytochemii buněk pro určení subcelulární lokalizace proteinu HIF-1α a udělat DNA analýzu zaměřenou na mutace v genu VHL. Stanovením aktivity kaspázy 3 a vazby Annexinu-V na buňky jsme zjistili, že hypoxie výrazně snižuje citlivost zkoumaných buněk k cytostatiku cisplatině. Pro ověření HIF-1αindukované chemorezistence a jejího potlačení byly použity nízkomolekulární inhibitory HIF1α a metoda jeho silencingu pomocí siRNA. V prvních fázích výzkumu se nám podařilo ověřit úspěšnost transfekce buněk, jíž bylo dosaženo užitím Lipofectamine 2000 a fluorescenčně značené nesilencující siRNA. Následně byly buňky transfekovány siRNA cílenou proti HIF-1α a kontrolní, nesilencující siRNA. Pomocí kvantitativního Real Time PCR (qRT-PCR) byl ověřen silencing HIF-1α stanovením exprese jeho cílových genů VEGFA a SLC2A1, kterou se podařilo snížit. V dalších fázích experimentů jsme však stanovením viability a apoptózy buněk vazbou Annexinu-V ověřili, že další transfekce neproběhla úspěšně. Silencing HIF-1α se nám tedy zatím bohužel nepodařilo optimalizovat, ale do budoucna má jistě velký potenciál pro sledování dalších důsledků inhibice tohoto faktoru. Inhibice HIF-1α pomocí nízkomolekulárních inhibitorů, LW6, YC-1 a chetominu, byla úspěšná a byla prokázána pomocí qRT-PCR a stanovení viability a apoptózy buněk vazbou Annexinu-V. Zjistili jsme nejvhodnější koncentrace inhibitorů vzhledem k míře jejich inhibiční aktivity HIF-1α a cytotoxicitě, která by mohla negativně ovlivnit i nenádorové
54
buňky. Ověřili jsme, že pomocí inhibice HIF-1α je možné potlačit chemorezistenci hypoxických nádorových buněk k cisplatině. Pomocí průtokové cytometrie a vazby propidium jodidu jsme u buněčné linie SK-N-AS ověřili zástavu buněčného cyklu v G0/G1 fázi, a tudíž rezistenci těchto buněk k fázově specifickým cytostatikům, které působí převážně na proliferující buňky. Zjistili jsme, že inhibitor LW6 samotný, ani v kombinaci s cisplatinou, nemá výrazný vliv na buněčný cyklus u linie SK-N-AS. Inhibitor YC-1 v hypoxii zvyšuje podíl buněk v G0/G1 fázi, v normoxii v kombinaci s cisplatinou má pravděpodobně vliv opačný. Z těchto výsledků je možné vyvodit závěr, že látky LW6 a YC-1 inhibující transkripční aktivitu HIF-1α jsou vhodné pro použití v kombinaci s fázově nespecifickými cytostatiky. Naopak chetomin má s velkou pravděpodobností vliv na přechod buněk z G1 do S fáze a mohl by být proto využíván i pro zlepšení účinku cytostatik, která jsou fázově specifická.
55
6
LITERATURA 1.
Ross, R. A., Biedler, J. L., Spengler, B. A., A role for distinct cell types in determining malignancy in human neuroblastoma cell lines and tumors. Cacncer letters 197(1):35–39 (2003).
2.
Dang, C. V., Kim, J. W., Gao, P., Yustein, J., The interplay between MYC and HIF in cancer. Nat Rev Cancer 8(1):51–6 (2008).
3.
Pietras, A., Johnsson, A. S., Pahlman, S., The HIF-2α-Driven Pseudo-Hypoxic Phenotype in Tumor Aggressiveness, Differentiation, and Vascularization. Curr Top Microbiol Immunol. 810:1–20 (2010).
4.
Noguera, R., Fredlund, E., Piqueras, M., Pietras, A., Beckman, S., Navarro, S., Pahlman, S., HIF-1αlpha and HIF-2alpha are differentially regulated in vivo in neuroblastoma: high HIF-1αlpha correlates negatively to advanced clinical stage and tumor vascularization. Clin Cancer Res. 15(23):7130–6 (2009).
5.
Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92:5510–5514 (1995).
6.
Ivanovic, Z., Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. Journal of Cellular Physiology, 219:271–275 (2009).
7.
Patel, S. A., Simon, M. C., Biology of hypoxia-inducible factor-2alpha in development and disease. Cell Death and Differentiation, 15:628–634 (2008).
8.
Semenza, G. L., Wang, G. L., A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Molecular and Cellular Biology, 12:5447–5454 (1992).
9.
Déry, M. A., Michaud, M. D., Richard, D. E., Hypoxia-inducible factor 1: regulation by hypoxic and non-hypoxic activators. International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37:535–540 (2005).
10.
Smith, T. G., Robbins, P. A., Ratcliffe, P. J., The human side of hypoxia-inducible factor. British Journal of Haematology 141:325–334 (2008).
11.
Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L., Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:5510–5514 (1995).
12.
Semenza, G. L., Rue, E. A., Iyer, N. V., Pang, M. G., Kearns, W. G., Assignment of the hypoxia-inducible factor I a gene to a region of conserved synteny on mouse chromosome 12 and human chromosome 14q. Genomics 34:437 (1996).
56
13.
Johnson, B., Brooks, B. A., Heinzmann, C., Diep, A., Mohandas, T., Sparkes, R. S., Reyes, H., Hoffman, E., Lange, E., Gatti, R. A., The Ah receptor nuclear translocator gene (ARNT) is located on q21 of human chromosome I and on mouse chromosome 3 near Cf-3. Genomics 17:592 (1993).
14.
Jaakkola, P. et al. Targeting of HIF-a to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 292:468–472 (2001).
15.
Ivan, M. et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science 292:464–468 (2001).
16.
Semenza, G. L. et al. Structural and functional analysis of hypoxia-inducible factor 1. Kidney International 51:553–555 (1997).
17.
Hu, C. J., Sataur, A., Wang, L., Chen, H., Simon, M. C., The N-Terminal Transactivation Domain Confers Target Gene Specificity of Hypoxia-inducible Factors HIF-1α and HIF-2α. Molecular Biology of the Cell 18:4528–4542 (2007).
18.
Brahimi-Horn, M. C., Pouysségur, J., Harnessing the hypoxia-inducible factor in cancer and ischemic disease. Biochemical Pharmacology 73:450–457 (2007).
19.
Kallio, P. J., Pongratz, I., Gradin, K., McGuire, J., Poellinger, L., Activation of hypoxia-inducible factor 1α: posttranscriptional regulation and conformational change by recruitment of the Arnt transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:5667–5672 (1997).
20.
Swami, M., Hypoxia: The HIF2α puzzle. Nature Reviews Cancer 10:603–603 (2010).
21.
Lang, K. J., Kappel, A., Goodall, G. J., Hypoxia-inducible factor-1alpha mRNA contains an internal ribosome entry site that allows efficient translation during normoxia and hypoxia. Molecular Biology of the Cell 13:1792–1801 (2002).
22.
Cameron, P. et al., Cell-specific Regulation of Hypoxia-inducible Factor HIF-1? and HIF-2? Stabilization and Transactivation in a Graded Oxygen Environment. The Journal of Biological Chemistry 281(32):22575–22585 (2006).
23.
Galbán, S. et al., RNA-binding proteins HuR and PTB promote the translation of hypoxia-inducible factor 1alpha. Molecular and Cellular Biology 28:93-107 (2008).
24.
Yee Koh, M., Spivak-Kroizman, T. R., Powis, G., HIF-1 regulation: not so easy come, easy go. Trends in Biochemical Sciences 33:526–534 (2008).
25.
Singh, A. D., Shields, C. L., Shields, J. A., Von Hippel-Lindau disease. Lance 46:2059–67 (2001).
26.
Moon, E. J. et al. Hepatitis B virus X protein induces angiogenesis by stabilizing hypoxia-inducible factor-1alpha. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 18:382–384 (2004).
27.
Görlach, A. et al. Thrombin activates the hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway in vascular smooth muscle cells: Role of the p22(phox)-containing NADPH oxidase. Circulation Research 89:47–54 (2001).
28.
Richard, D. E., Berra, E., Pouyssegur, J., Nonhypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1alpha in vascular smooth muscle cells. The Journal of Biological Chemistry 275:26765–26771 (2000).
57
29.
Zhou, J., Brüne, B., Cytokines and hormones in the regulation of hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1αlpha). Cardiovascular hematological agents in medicinal chemistry 4:189–197 (2006).
30.
Semenza, G. L. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nature Reviews Cancer 3:721– 32 (2003).
31.
Toker, A., Newton, A. C., Cellular signaling: pivoting around PDK-1. Cell 103:185–188 (2000).
32.
Laughner, E., Taghavi, P., Chiles, K., Mahon, P. C., Semenza, G. L. HER2 (neu) Signaling Increases the Rate of Hypoxia-Inducible Factor 1α (HIF-1α) Synthesis: Novel Mechanism for HIF-1-Mediated Vascular Endothelial Growth Factor Expression. Molecular and Cellular Biology 21:3995–4004 (2001).
33.
Reiling, J. H., Sabatini, D. M., Stress and mTORture signaling. Oncogene 25:6373– 6383 (2006).
34.
Berra, E. et al. HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1αlpha in normoxia. The EMBO Journal 22:4082–4090 (2003).
35.
Wiener, C. M., Booth, G., Semenza, G. L., In vivo expression of mRNAs encoding hypoxia-inducible factor 1. Biochemical and Biophysical Research Communications 225:485–488 (1996).
36.
Huang, L. E., Gu, J., Schau, M., Bunn, H. F., Regulation of hypoxia-inducible factor 1α is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitinproteasome pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:7987–7992 (1998).
37.
Yu, F., White, S. B., Zhao, Q., Lee, F. S., HIF-1α binding to VHL is regulated by stimulus-sensitive proline hydroxylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 9630–9635 (2001).
38.
Bruick, R. K., McKnight, S. L., A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science 294:1337–1340 (2001).
39.
Epstein, A. C. et al. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 107:43–54 (2001).
40.
Ivan, M. et al. Biochemical purification and pharmacological inhibition of a mammalian prolyl hydroxylase acting on hypoxia-inducible factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:13459–64 (2002).
41.
Kaelin, W. G., Proline hydroxylation hyp hydroxyproline gene expression. Annual Review of Biochemistry 74:115 (2005).
42.
Metzen, E., Ratcliffe, P. J., HIF hydroxylation and cellular oxygen sensing. Biological Chemistry 385:223–230 (2004).
43.
Min, J. H. et al. Structure of an HIF-1αlpha -pVHL complex: hydroxyproline recognition in signaling. Science 296:1886–1889 (2002).
44.
Bruick, R. K., McKnight, S. L. Transcription. Oxygen sensing gets a second wind. Science 295:807–808 (2002).
58
45.
Young, A. C., Craven, R. A., Cohen, D., Taylor, C., Booth, C., Harnden, P., Cairns, D. A., Astuti, D., Gregory, W., Maher, E. R., Knowles, M. A., Joyce, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clin Cancer Res. 15(24):7582–7592 (2009).
46.
Maxwell, P. H. et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399:271–275 (1999).
47.
Ohh, M. et al. Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein. Nature Cell Biology 2:423–427 (2000).
48.
Pause, A., Peterson, B., Schaffar, G., Stearman, R., Klausner, R. D., Studying interactions of four proteins in the yeast two-hybrid system: structural resemblance of the pVHL/elongin BC/hCUL-2 complex with the ubiquitin ligase complex SKP1/cullin/F-box protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96:9533–9538 (1999).
49.
Jeong, J. W. et al. Regulation and destabilization of HIF-1α by ARD1-mediated acetylation. Cell 111:709–720 (2002).
50.
Semenza, G. L., Shimoda, L. A., Prabhakar, N. R., Regulation of Gene Expression by HIF-1. Signalling Pathways in Acute Oxygen Sensing: Novartis Foundation Symposium 272 (2008).
51.
Hagen, T., Taylor, C. T., Lam, F., Moncada, S., Redistribution of intracellular oxygen in hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha. Science 302:1975–1978 (2003).
52.
Simon, M. C., Mitochondrial reactive oxygen species are required for hypoxic HIF alpha stabilization. Advances in experimental medicine and biology 588:165–170 (2006).
53.
Chandel, N. S. et al. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxiainduced transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 11715–11720 (1998).
54.
Aprelikova, O. et al. Regulation of HIF prolyl hydroxylases by hypoxia-inducible factors. Journal of Cellular Biochemistry 92:491–501 (2004).
55.
Li, Z., Wang, D., Messing, E. M., Wu, G., VHL protein-interacting deubiquitinating enzyme 2 deubiquitinates and stabilizes HIF-1αlpha. EMBO Reports 6:373–378 (2005).
56.
Bae, S. H. et al. Sumoylation increases HIF-1αlpha stability and its transcriptional activity. Biochemical and Biophysical Research Communications 324:394–400 (2004).
57.
Cheng, J., Kang, X., Zhang, S., Yeh, E. T. H., SUMO-specific protease 1 is essential for stabilization of HIF1alpha during hypoxia. Cell 131:584–595 (2007).
58.
Carbia-Nagashima, A. et al. RSUME, a small RWD-containing protein, enhances SUMO conjugation and stabilizes HIF-1αlpha during hypoxia. Cell 131:309–323 (2007).
59
59.
Liu, Z. et al. cDNA cloning of a novel human ubiquitin carrier protein. An antigenic domain specifically recognized by endemic protein. An antigenic domain specifically recognized by endemic reading frame of this human epidermal transcript. J. Biol. Chem. 267:15829–15835 (1992).
60.
Jung, C. R. et al. E2-EPF UCP targets pVHL for degradation and associates with tumor growth and metastasis. Nature Medicine 12:809–816 (2006).
61.
Zhong, H. et al. Overexpression of hypoxia-inducible factor 1alpha in common human cancers and their metastases. Cancer Research 59:5830–5835 (1999).
62.
Su, Y. A., Hutter, C. M., Trent, J. M., Meltzer, P.S., Complete sequence analysis of a gene (OS-9) ubiquitously expressed in human tissues and amplified in sarcomas. Molecular Carcinogenesis 15:270–275 (1996).
63.
Baek, J. H. et al. OS-9 interacts with hypoxia-inducible factor 1alpha and prolyl hydroxylases to promote oxygen-dependent degradation of HIF-1αlpha. Molecular Cell 17:503–512 (2005).
64.
Baek, J. H. et al. Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase 2 is an essential component of the ubiquitin ligase complex that regulates hypoxia-inducible factor 1alpha. The Journal of Biological Chemistry 282:23572–23580 (2007).
65.
Chen, D., Li, M., Luo, J., Gu, W., Direct interactions between HIF-1 alpha and Mdm2 modulate p53 function. The Journal of Biological Chemistry 278:13595– 13598 (2003).
66.
Ravi, R. et al. Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxia-inducible factor 1a. Genes & Development 14:34–44 (2000).
67.
Schmid, T., Zhou, J., Köhl, R., Brüne, B. p300 relieves p53-evoked transcriptional repression of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). The Biochemical journal 380:289–295 (2004).
68.
Nieminen, A. L., Qanungo, S., Schneider, E. A., Jiang, B. H., Agani, F. H. Mdm2 and HIF-1αlpha interaction in tumor cells during hypoxia. Journal of Cellular Physiology 204:364–369 (2005).
69.
EMD4Biosciences – Glykogen Synthase Kinase Inhibitors: http://www.emdchemicals.com/life-science-research/glycogen-synthase-kinasegsk-inhibitors/c_R66b.s1LTrMAAAEWx2EfVhTm (22. 4. 2011).
70.
Flügel, D., Görlach, A., Michiels, C., Kietzmann, T., Glycogen Synthase Kinase 3 Phosphorylates Hypoxia-Inducible Factor 1α and Mediates Its Destabilization in a VHL-Independent Manner. Molecular and Cellular Biology 27:3253–3265 (2007).
71.
Eom, T. Y., Jope, R. S., GSK3β N-terminus binding to p53 promotes its acetylation. Mol Cancer 8:14 (2009).
72.
Tang, T. T. L., Lasky, L. A., The forkhead transcription factor FOXO4 induces the down-regulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha by a von Hippel-Lindau protein-independent mechanism. The Journal of Biological Chemistry 278:30125– 30135 (2003).
73.
Mottet, D. et al. Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase
60
kinase 3beta pathway in HepG2 cells. The Journal of Biological Chemistry 278:31277–31285 (2003). 74.
Semenza, G. L. et al. Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1. The Journal of Biological Chemistry 271:32529–32537 (1996).
75.
Ziegler, E. C., Ghosh, S., Regulating Inducible Transcription Through Controlled Localization. Sci. STKE (2005).
76.
Roitbak, T., Surviladze, Z., Cunningham, L. A., Continuous Expression of HIF-1α in Neural Stem/Progenitor Cells. Cellular and Molecular Neurobiology 119–133 (2010).
77.
Stroka, D. M. et al. HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organspecific regulation under systemic hypoxia. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 15:2445–2453 (2001).
78.
Zheng, X. et al. Cell-Type-Specific Regulation of Degradation of HypoxiaInducible Factor 1α: Role of Subcellular Compartmentalization. Molecular and Cellular Biology 26:4628–4641 (2006).
79.
Li, H., Ko, H. P., Whitlock, J. P., Induction of phosphoglycerate kinase 1 gene expression by hypoxia. Roles of Arnt and HIF1alpha. The Journal of Biological Chemistry 271:21262–21267 (1996).
80.
Arany, Z. et al. An essential role for p300/CBP in the cellular response to hypoxia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93:12969–12973 (1996).
81.
Carrero, P. et al. Redox-Regulated Recruitment of the Transcriptional Coactivators CREB-Binding Protein and SRC-1 to Hypoxia-Inducible Factor 1. Society 20:402– 415 (2000).
82.
Ema, M. et al. Molecular mechanisms of transcription activation by HLF and HIF1alpha in response to hypoxia: their stabilization and redox signal-induced interaction with CBP/p300. the The European Molecular Biology Organization Journal 18:1905–1914 (1999).
83.
Ruas, J. L., Poellinger, L., Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Seminars in cell developmental biology 16:514–522 (2005).
84.
Ruas, J. L., Poellinger, L., Pereira, T., Role of CBP in regulating HIF-1-mediated activation of transcription. Journal of Cell Science 118:301–311 (2005).
85.
Gray, M. J. et al. HIF-1αlpha, STAT3, CBP/p300 and Ref-1/APE are components of a transcriptional complex that regulates Src-dependent hypoxia-induced expression of VEGF in pancreatic and prostate carcinomas. Oncogene 24:3110– 3120 (2005).
86.
Sánchez-Elsner, T. et al. Synergistic cooperation between hypoxia and transforming growth factor-beta pathways on human vascular endothelial growth
61
factor gene expression. The Journal of Biological Chemistry 276:38527–38535 (2001). 87.
Sang, N. et al. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling up-regulates the activity of hypoxia-inducible factors by its effects on p300. J Biol Chem 278:14013–14019 (2003).
88.
Fei, P. et al. Bnip3L is induced by p53 under hypoxia, and its knockdown promotes tumor growth. Cancer Cell 6:597–609 (2004).
89.
Hewitson, K. S. et al. Hypoxia-inducible factor (HIF) asparagine hydroxylase is identical to factor inhibiting HIF (FIH) and is related to the cupin structural family. The Journal of Biological Chemistry 277:26351–26355 (2002).
90.
Lando, D., Peet, D. J., Whelan, D. A., Gorman, J. J., Whitelaw, M. L., Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch. Science 295:858–861 (2002).
91.
Dames, S. A., Martinez-Yamout, M., De Guzman, R. N., Dyson, H. J., Wright, P. E., Structural basis for Hif-1α/CBP recognition in the cellular hypoxic response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:5271–5276 (2002).
92.
Freedman, S. J. et al. Structural basis for recruitment of CBP/p300 by hypoxiainducible factor-1 alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:5367–5372 (2002).
93.
Stolze, I. P. et al. Genetic analysis of the role of the asparaginyl hydroxylase factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) in regulating hypoxia-inducible factor (HIF) transcriptional target genes [corrected]. The Journal of Biological Chemistry 279:42719–42725 (2004).
94.
Zhou, J., Schmid, T., Schnitzer, S., Brüne, B., Tumor hypoxia and cancer progression. Cancer Letters 237:10–21 (2006).
95.
Koivunen, P., Hirsilä, M., Günzler, V., Kivirikko, K. I., Myllyharju, J., Catalytic properties of the asparaginyl hydroxylase (FIH) in the oxygen sensing pathway are distinct from those of its prolyl 4-hydroxylases. The Journal of Biological Chemistry 279: 9899–9904 (2004).
96.
Lancaster, D. E. et al. Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity. The Biochemical journal 383:429–437 (2004).
97.
Dayan, F., Roux, D., Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J., Mazure, N. M., The oxygen sensor factor-inhibiting hypoxia-inducible factor-1 controls expression of distinct genes through the bifunctional transcriptional character of hypoxiainducible factor-1alpha. Cancer Research 66:3688–3698 (2006).
98.
Löfstedt, T., Fredlund, E., Holmquist-Mengelbier, L., Pietras, A., Ovenberger, M., Hypoxia Inducible Factor-2α. Cancer. Cell Cycle 6:919–926 (2007).
99.
Firth, J. D., Ebert, B. L., Pugh, C. W., Ratcliffe, P. J., Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: similarities with the erythropoietin 3' enhancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91:6496–6500 (1994).
62
100. Firth, J. D., Ebert, B. L., Ratcliffe, P. J., Hypoxic regulation of lactate dehydrogenase A. Interaction between hypoxia-inducible factor 1 and cAMP response elements. The Journal of Biological Chemistry 270:21021–21027 (1995). 101. Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L., Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. The Journal of Biological Chemistry 269:23757–63 (1994). 102. Brahimi-Horn, M. C., Pouysségur, J., Hypoxia in cancer cell metabolism and pH regulation. Essays in Biochemistry 43:165–178 (2007). 103. Forsythe, J. A. et al. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Molecular and Cellular Biology 16:4604–4613 (1996). 104. Klener P. Význam inhibice angiogeneze v protinádorové léčbě. Remedia 15:330– 335 (2005). 105. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L., Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. The Journal of Biological Chemistry 271:17771–17778 (1996). 106. Lee, P. J. et al. Hypoxia-inducible factor-1 mediates transcriptional activation of the heme oxygenase-1 gene in response to hypoxia. The Journal of Biological Chemistry 272:5375–5381 (1997). 107. Melillo, G. et al. A hypoxia-responsive element mediates a novel pathway of activation of the inducible nitric oxide synthase promoter. The Journal of Experimental Medicine 182:1683–1693 (1995). 108. Cramer, T. et al. HIF-1αlpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation. Cell 112:645–657 (2003). 109. Wang, V., Davis, D. A., Haque, M., Huang, L. E., Yarchoan, R., Differential gene up-regulation by hypoxia-inducible factor-1alpha and hypoxia-inducible factor2alpha in HEK293T cells. Cancer Research 65:3299–306 (2005). 110. Ryan, H. E., Lo, J., Johnson, R. S., HIF-1 alpha is required for solid tumor formation and embryonic vascularization. The European Molecular Biology Organization Journal 17:3005–15 (1998). 111. Blouin, C. C., Pagé, E. L., Soucy, G. M., Richard, D. E., Hypoxic gene activation by lipopolysaccharide in macrophages: implication of hypoxia-inducible factor 1alpha. Blood 103:1124–1130 (2004). 112. Qi, H., Ohh, M., The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein sensitizes renal cell carcinoma cells to tumor necrosis factor-induced cytotoxicity by suppressing the nuclear factor-kappaB-dependent antiapoptotic pathway. Cancer Research 63:7076–7080 (2003). 113. Maxwell, P. H. et al. Hypoxia-inducible factor-1 modulates gene expression in solid tumors and influences both angiogenesis and tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94:8104–8109 (1997).
63
114. Jiang, B. H., Agani, F., Passaniti, A., Semenza, G. L., V-SRC Induces Expression of Hypoxia-inducible Factor 1 (HIF-1) and Transcription of Genes Encoding Vascular Endothelial Growth Factor and Enolase 1: Involvement of HIF-1. Tumor Progression (1997). 115. O'Reilly, M. S., Holmgren, L., Chen, C., Folkman, J., Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Medicine 2:689-692 (1996). 116. Trédan, O., Galmarini, C. M., Patel, K., Tannock, I. F., Drug resistance and the solid tumor microenvironment. Journal Of The National Cancer Institute 99:1441– 1454 (2007). 117. Greijer, A. E., Van Der Wall, E., The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis. Journal of Clinical Pathology 57:1009–1014 (2004). 118. Gerald, D. et al. JunD reduces tumor angiogenesis by protecting cells from oxidative stress. Cell 118:781–794 (2004). 119. Carmeliet, P. et al. Role of HIF-1αlpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis. Nature 394:485–490 (1998). 120. Erler, J. T. et al. Hypoxia-mediated down-regulation of Bid and Bax in tumors occurs via hypoxia-inducible factor 1-dependent and -independent mechanisms and contributes to drug resistance. Molecular and Cellular Biology 24:2875–2889 (2004). 121. Baran, Y. et al. Expression of multi drug resistance (MDR1) gene in human promyelocytic leukemia cell line selected with vincristine. Turkish Journal of Cancer 35(2) (2005). 122. Holmquist-Mengelbier, L. et al. Recruitment of HIF-1αlpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell 10:413–423 (2006). 123. Wiesener, M. S. et al. Induction of endothelial PAS domain protein-1 by hypoxia: characterization and comparison with hypoxia-inducible factor-1alpha. Blood 92:2260–2268 (1998). 124. Wiesener, M. S. et al. Widespread hypoxia-inducible expression of HIF-2alpha in distinct cell populations of different organs. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 17:271–3 (2002). 125. Koukourakis, M.I. et al. Endogenous markers of two separate hypoxia response pathways (hypoxia inducible factor 2 alpha and carbonic anhydrase 9) are associated with radiotherapy failure in head and neck cancer patients. CHART randomized trial (2006). 126. Yan, Q., Bartz, S., Mao, M., Li, L., Kaelin, W. G., The hypoxia-inducible factor 2alpha N-terminal and C-terminal transactivation domains cooperate to promote renal tumorigenesis in vivo. Molecular and Cellular Biology 27:2092–2102 (2007). 127. Peet, D., Linke, S., Regulation of HIF: asparaginyl hydroxylation. Novartis Foundation Symposium 272:37–49; discussion 49–53, 131–140 (2006).
64
128. Tian, H., McKnight, S. L., Russell, D. W., Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes & Development 11:72–82 (1997). 129. Duan, L. J., Zhang-Benoit, Y., Fong, G. H., Endothelium-intrinsic requirement for Hif-2alpha during vascular development. Circulation 111:2227–2232 (2005). 130. Bracken, C. P., Whitelaw, M. L., Peet, D. J. Activity of hypoxia-inducible factor 2alpha is regulated by association with the NF-kappaB essential modulator. The Journal of Biological Chemistry 280:14240–51 (2005). 131. Freedman, S. J. et al. Structural basis for negative regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha by CITED2. Nature Structural Biology 10:504–512 (2003). 132. Covello, K. L. et al. HIF-2α regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development , and tumor growth. Genes Development 20:557– 570 (2006). 133. Helczynska, K. et al. Hypoxia promotes a dedifferentiated phenotype in ductal breast carcinoma in situ. Cancer Research 63:1441–1444 (2003). 134. Ghafar, M. A. et al. Acute hypoxia increases the aggressive characteristics and survival properties of prostate cancer cells. The Prostate 54:58–67 (2003). 135. Jögi, A. et al. Hypoxia alters gene expression in human neuroblastoma cells toward an immature and neural crest-like phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:7021–7026 (2002). 136. Pahlman, S., Stockhausen, M. T., Fredlund, E., Axelson, H., Notch signaling in neuroblastoma. Seminars in Cancer Biology 14:365–373 (2004). 137. Gustafsson, M. V. et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Developmental Cell 9:617–628 (2005). 138. Rankin, E. B., Giaccia, A. J., The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis. Cell Death and Differentiation 15:678–685 (2008). 139. Gu, Y. Z., Moran, S. M., Hogenesch, J. B., Wartman, L., Bradfield, C. A., Molecular characterization and chromosomal localization of a third alpha-class hypoxia inducible factor subunit, HIF3alpha. Gene Expression 7:205–213 (1998). 140. Makino, Y., Kanopka, A., Wilson, W. J., Tanaka, H., Poellinger, L. Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia-inducible splicing variant of the hypoxiainducible factor-3a locus. Journal of Biological Chemistry 277:32405–32408 (2002). 141. Giatromanolaki, A. et al. Relation of hypoxia inducible factor 1 alpha and 2 alpha in operable non-small cell lung cancer to angiogenic/molecular profile of tumours and survival. British Journal of Cancer 85:881–890 (2001). 142. Leek, R. D. et al. Relation of Hypoxia-inducible Factor-2α (HIF-2α) Expression in Tumor-infiltrative Macrophages to Tumor Angiogenesis and the Oxidative Thymidine Phosphorylase Pathway in Human Breast Cancer Macrophages to Tumor Angiogenesis and the Oxidative Thymidine. Cancer Research (2002).
65
143. Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Fiska, A., Koukourakis, M. I., Hypoxia-inducible factor-2a (HIF-2a) induces angiogenesis in breast carcinomas. Appl Immunohistochem Mol Morphol 14:78–82 (2006). 144. Onita, T. et al. Hypoxia-induced, perinecrotic expression of endothelial Per-ARNTSim domain protein-1/hypoxia-inducible factor-2alpha correlates with tumor progression, vascularization, and focal macrophage infiltration in bladder cancer. Clinical Cancer Research 8:471–480 (2002). 145. Ji, P. et al. Correlation study showing no concordance between EPAS-1/HIF-2alpha mRNA and protein expression in transitional cellcancer of the bladder. Urology 61:851–857 (2003). 146. Yoshimura, H. et al. Prognostic impact of hypoxia-inducible factors 1alpha and 2alpha in colorectal cancer patients: correlation with tumor angiogenesis and cyclooxygenase-2 expression. Clinical Cancer Research 10:8554–8560 (2004). 147. Birner, P. et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha in oligodendrogliomas: its impact on prognosis and on neoangiogenesis. Cancer 92:165–171 (2001). 148. Koukourakis, M. I. et al. Advances in Brief Hypoxia Inducible Factor ( HIF-1α and HIF-2a ) Expression in Early Esophageal Cancer and Response to Photodynamic Therapy and Radiotherapy. Cancer 122:1830 –1832 (2001). 149. Volm, M. & Koomägi, R. Hypoxia-inducible factor (HIF-1) and its relationship to apoptosis and proliferation in lung cancer. Anticancer Research 20:1527–1533 (2000). 150. Shyu, K. G., Wang, M. T., Wang, B. W., Chang, C. C., Leu, J. G., Kuan, P., et al. (2002). Intramyocardial injection of naked DNA encoding HIF-1αlpha/VP16 hybrid to enhance angiogenesis in an acute myocardial infarction model in the rat. Cardiovascular Research, 54:576–583. 151. Semenza, G. L., Oxygen homeostasis. Wiley interdisciplinary reviews Systems biology and medicine 2:336–361 (2010). 152. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L: Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in realtime PCR. Nucleic Acids Res 30(9):e36 (2002). 153. Aebersold, D. M., Burri, P., Beer, K. T., Laissue, V., Djonov, V., Greiner, R. H., Semenza, G. L.: Expression of hypoxia-inducible factor-1a: a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cancer. Cancer Res 61:2911–2916 (2001). 154. Birner, P., Schindl, M., Obermair, A., Breitenecker, G., Oberhuber, G., Expression of hypoxia-inducible factor-1a in epithelial ovarian tumors: its impact on prognosis and on response to chemotherapy. Clin Cancer Res 7:1661–1668 (2001). 155. Bos, R., van der Groep, P., Greijer, A. E., Shvarts, A., Meijer, S., Pinedo, H. M., Semenza, G. L., van Diest, P. J., van der Wall, E., Levels of hypoxia-inducible factor-1a independently predict prognosis in patients with lymph node negative breast carcinoma. Cancer 97:1573–1581 (2003).
66
156. Abbey Color Phenol Red Dye: http://www.abbeycolor.com/phenol-red.php (1. 5. 2011). 157. Kung, A. L. et al. Small molecule blockade of transcriptional coactivation of the hypoxia-inducible factor pathway. Cancer Cell 6:33-43 (2004). 158. Staab, A., Loeffler, J., Said, H. M., Diehlmann, D., Katzer, A., Beyer, M., Fleischer, M., Schwab, F., et al. Effects of HIF-1 inhibition by chetomin on hypoxia-related transcription and radiosensitivity in HT 1080 human fibrosarcoma cells. BMC Cancer, 7(1):213 (2007). 159. Lee, K. et al. (Aryloxyacetylamino)benzoic Acid Analogues: A New Class of Hypoxia-Inducible Factor-1 Inhibitors. J. Med. Chem. 50:1675–1684 (2007). 160. Yeo, E. J., Chun, Y. S., Cho, Y. S., Kim, J., Lee, J. C., Kim, M. S., Park, J. W., YC1: a potential anticancer drug targeting hypoxia-inducible factor 1. Journal Of The National Cancer Institute 95:516–525 (2003). 161. Jen, W. C., Jones, G. A., Effects of chetomin on growth and acidic fermentation products of rumen bacteria. Can. J. Microbiol., 29:1399–1404 (1983). 162. Lee, K. et al. LW6, a novel HIF-1 inhibitor, promotes proteasomal degradation of HIF-1αlpha via upregulation of VHL in a colon cancer cell line. Biochem Pharmacol. 80(7):982–9 (2010). 163. Ko, F. N., Wu, C. C., Kuo, S.C., Lee, F. Y.,Teng, C. M., YC-1, a novel activator of platelet guanylate cyclase. Blood 84:4226–4233 (1994) 164. Li, S. H. et al. A novel mode of action of YC-1 in HIF inhibition: stimulation of FIH-dependent p300 dissociation from HIF-1αlpha. Molecular Cancer Therapeutics 7:3729–3738 (2008). 165. Chemocare Chemotherapy Drugs – Cisplatin: http://www.chemocare.com/bio/cisplatin.asp (1. 5. 2011).
67
7
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
5´-UTR ADM AhR Akt ALDA AMK Ang1 a 2 AP-1 a 2 ARNT ATP B2M Bcl-2 bHLH BNIP-3 CATDH CBP CDDP cDNA CITED2 cMYC C-TAD Cul2 DMSO DNA dNTP DTT EGF eIF4E-BP ENO1 EPAS1 EPO ERK FBS FIH-1 FITC FOXO4 Glut1 Glut3 GSK-3ß Hdm2 HIF
5´ netranslatovaná oblast mRNA adrenomedullin arylhydrokarbonový receptor serin-threoninová kinasa Akt aldolasa A aminokyseliny angiopoetin 1 a 2 transkripční faktory AhR nukleární translokátor adenosin trifosfát ß 2-mikroglobulin regulační protein B-cell lymphoma 2 basic-helix-loop-helix rodina proteinů/doména HIF-1α BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3 katepsin D Creb-vazebný protein fázově nespecifické cytostatikum cisplatina komplementární DNA syntetizovaná podle mRNA pomocí RT CBP/p300-interagující transaktivátor 2 onkogenní forma transkripčního faktoru Myc C-koncová transaktivační doména Cullin 2 dimethylsulfoxid deoxyribonukleová kyselina deoxynukleotidy dithiotreitol epidermální růstový faktor eukaryotic Initiation Factor 4E Binding Protein enolasa 1 Endothelial PAS domain-containing protein 1 (jinak zvaný HIF-2a) erythropoetin extracellular-signal-regulated kinases (jinak zvané MAPK) fetální bovinní sérum faktor inhibující HIF fluorescein isothiokyanát Forkhead box protein O4 glukosový transportér 3 glukosový transportér 2 glykogen synthasa-kinasa 3 Human double minute 2 protein, lidský analog myšího Mdm2 hypoxií idukovaný faktor
68
HO1 HREs HRP Hsp90 HuR IGF-2 IKK-γ iNOS IPAS IRES KDR KRT LDHA LOXL2 LW6 MDR1 MMP2 mRNA mTOR NEMO NF-1 NF-κB NOXA N-TAD ODD p300/CBP p53 p70S6K PAS PCR PDGF-B PFKL PGF PGK1 PHDs PI3K PTB pVHL qRT-PCR RACK1 Rbx1 RNA
hemoxygenasa 1 hypoxia response elements křenová peroxidasa Heat shock protein 90 kDa RNA-vazebný protein známý také jako ELAV-like protein 1 insulin-like growth factor-2 inhibitor of nuclear factor κB kinase subunit gama induced nitric oxide synthase protein inhibující PAS doménu internal ribosome entry site VEGF receptor-2 keratin laktátdehydrogenasa A homolog 2 lysyloxidasy inhibitor HIF-1α ATP-dependentní P-glykoprotein Multidrug resistance 1 matrix metlloproteinasa 2 mediátorová RNA mammalian target of rapamycin NF-κB essential modulator nukleární faktor 1 nukleární faktor κB Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 N-kontová transaktivační doména oxygen dependent degradation domain transkripční koaktivátory p300 a CBP tumorsupresorový protein p53 p70S6 ribosomální kinasa doména PAS původně identifikovaná u proteinů Per-ARNT-Sim polymerázová řetězová reakce plateled-derived growth factor B fosfofruktokinasa L placentární růstový faktor fosfoglycerátkinasa 1 prolylhydroxylasy fosfatidylinositol-3-kinasa polypyrimidine tract-binding protein von Hippel-Lindau tumorsupresorový protein kvantitativní Real Time PCR receptor aktivované proteinkinasy C Ring box protein 1 ribonukleová kyselina
69
ROS RSUME RT SENP1 Siah2 Sim SLC2A1 Smad3 Sp1 SRC-1 SSAT1 SSAT2 STAT3 SUMO TADs Tie-2/TEK TIF-2 UCP E2-EPF UPAR USP20 VDU2 VEGF YC-1
reactive oxygen species, reaktivní formy kyslíku RWD-containing SUMOylation enhancer reversní transkriptasa sentrin-specifická proteasa 1 E3 ubiquitin protein ligasa Seven in absentia homologs 2 Single-minded homolog 1 gen kódující Glut1 transkripční faktor transkripční faktor Specifity protein 1 steroid receptor coactivator-1 spermidin/spermin N(1)-acetyltransferasa 1 spermidin/spermin N(1)-acetyltransferasa 2 transkripční faktor Small Ubiquitin-like Modifier transaktivační domény receptor pro angiopoetin 1 transcriptional mediators/intermediary factor 2 ubiquitin carrier protein E2-EPF urokinase plasminogen activator receptor Ubiquitin specific protease 20 (jinak zvaná VDU2) pVHL-interacting deubiquitinating enzyme 2 vaskulární endotheliální růstový faktor inhibitor HIF-1α
70
