Vyšetřování molekulárních markerů v prognóze onemocnění a predikci účinku protinádorové léčby u solidních tumorů: Kde jsme a kam se ubíráme? Marek Minárik
Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac International, s.r.o., Praha Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Praha
Determinanty léčebného výsledku v onkologii Rozsah onemocnění
Biologické vlastnosti nádoru
(progrese, staging)
(molekulární profil)
Léčebný výsledek
Léčba (typ, dávkování,atd.)
Individuální predispozice
Stadia vývoje zhoubného nádoru může zahrnovat mutace v genech pro opravu DNA
normální buňka
časná neoplázie
zvýšená proliferace mutace v genu A
mutace v genu B mutace v genu C
metastáza
karcinom chromozomové ztráty
rostoucí aneuploidie chromozomů
progredujíc í neoplázie
Progrese nádorového onemocnění Hereditární formy, nádorová susceptibilita
Predispozice
Prediktivní faktory, Nežádoucí účinky Minimální residuální nemoc
Léčba a monitoring
Prognostické faktory,
Prognóza přežití
Molekulárně-genetické metody
Defekty DNA Genetické: Genové mutace Alelické delece Chromozomální aberace Genové amplifikace (CNV, copy number variation) Overexprese EpiGenetické Hypermetylace RNA interference
Vrozené vs. somatické defekty DNA Vrozené (zárodečné) - vyšetřování v periferní krvi - nenáročné na detekční limit - definují predispozice pacienty
Somatické (získané) - vyšetřování v postižené tkáni - náročné na detekční limit - definují biologické chování nádoru
Genetická podstata zhoubného bujení (1) genetické onemocnění sporadické forma (somatické mutace) hereditární forma (vrozené mutace) familiární výskyt
nekontrolovaná buněčná proliferace iniciace nádorového procesu
geny kódující:
proteiny signalizačních drah pro buněčnou proliferaci regulátory mitotického cyklu složky aparátu apoptózy proteiny odpovědné za detekci a opravu mutací
Genetická podstata zhoubného bujení (2) postupné molekulárně genetické změny aktivace onkogenů inaktivace tumor supresorových genů chromozomální translokace
Diagnosticko-léčebný postup Klinická diagnostika - identifikace tumoru, staging (zobrazovací techniky, endoskopie, histologie, …) Molekulární diagnostika - nalezení defektní signální dráhy (histologie, molekulární genetika, …) Léčba - potlačení nebo kompletní vyřazení (inaktivace) dané signální dráhy - management vedlejších účinků
Molekulární mechanismy rakoviny
Cílená terapie Monoklonální protilátky - antiERBB2 (Trastuzumab) - antiERBB1 (Cetuximab) - antiVEGF (Bevacizumab)
Nízkomolekulární TK inhibitory - gefitinib, erlotinib - sunitinib, sorafenib
Terapie zacílená na HER1/EGFR Cetuximab, Panitumumab
Anti-HER1/EGFRblokující protilátky
Protilátky proti ligandám
TK inhibitory
komplexy liganda– toxin
komplexy protilátka– toxin
Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. N Engl J Med. 2001;344:783-792; Mendelsohn J, Baselga J. Oncogene. 2000;19:6550-6565; Noonberg SB, Benz CC. Drugs. 2000;59:753-767; Raymond E, Faivre S, Armann JP. Drugs. 2000;60(Suppl 1):15-23; Arteaga C. J Clin Oncol. 2001;19:32s-40s; Pedersen MW, Meltom M, Damstrup L, et al. Ann Oncol. 2001;12:745-760.
Predikce účinnosti cílené biologické léčby EGF
EGF
EGFR
EGFR
Blokace EGF-signální dráhy AMPLIFIKACE
GDP
Ras Grb2
Sos1
Shc GTP
Ras Raf
EGFR
JAK
STAT
PŘEŽITÍ
KRAS
PI3K MEK
AKT
RalGDS
ERK
INHIBICE APOPTOZY ZMĚNY CYTOSKELETONU
PROGRESE BUNĚČNÉHO CYKLU
BUNĚČNÁ PROLIFERACE DIFERENCIACE
Predikce odpovědi na léčbu Odpověď na léčbu v závislosti na přítomnosti mutace EGFR u nemalobuněčného karcinomu plic
Pešek et al., Anticancer Res, 2009
Molekulární diagnostika Základní metodické požadavky - citlivost - robustnost/spolehlivost - jednoduchost - rychlost - nízkonákladovost
Metodika detekce mutací Denaturační kapilární elektroforéza (DCE) →
PCR fl. značené primery 96 bp produkt
kapilární elektroforéza
specifická teplota bez purifikace PCR fr.
→
vyhodnocení
mírná zkušenost bez speciálního sftw.
GenoScan kit
wt
mutace
Detekce mutací Vyšetřování přítomnosti delece v exonu 19 genu EGFR
Vzorek bez delece
Analýza 120 sec
15 bp delece
Vzorek s delecí
Detekce mutací Vyšetřování přítomnosti mutace v exonu 21 genu EGFR
Vzorek bez mutace
Analýza 60 sec
Vzorek s mutací
Vyšetřování EGFR amplifikací Fluorescenční in-situ hybridizace (FISH)
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Metoda založená na kombinaci selektivní ligace a amplifikace
Rutinní metoda pro vyšetřování zárodečných delecí v lékařské genetice (BRCA1, BRCA2, MSH2 and MLH1 ..)
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Metoda založená na kombinaci selektivní ligace a amplifikace
Rutinní metoda pro vyšetřování zárodečných delecí v lékařské genetice (BRCA1, BRCA2, MSH2 and MLH1 ..)
Experimentální data Negativní kontrola
Negativní vzorek
Experimentální data Negativní kontrola
Positivní vzorek
FISH
MLPA
Zpracování vzorku
Zpracování vzorku
(krájení, mikrodisekce)
(vyjmutí, mikrodisekce)
Příprava DNA (DNA unmasking)
Izolace DNA
Ligace Denaturace vzorku a próby
PCR reakce Hybridizace vzorku a próby
Omytí próby
Detekce mikroskopem
Kapilární Elektroforéza
Vyhodnocení
Terapeutický algoritmus EGFR
AMPLIFIKACE
KRAS
MUTACE
MUTACE
T790M
CITLIVOST
RESISTENCE
Vzájemné kombinace
RESISTENCE
?
Dvojité mutace
Terapeutický algoritmus EGFR
AMPLIFIKACE
KRAS
MUTACE
MUTACE
T790M
CITLIVOST
RESISTENCE
Vzájemné kombinace
RESISTENCE
?
Přežití epidermoidních tumorů 100 MUTATION EGFR KRAS NONE
Survival probability (%)
80 pEGFR = 0,5967
60
40 pKRAS = 0,9277
20
0 0
500
1000 Days
1500
2000
Terapeutický algoritmus EGFR
AMPLIFIKACE
KRAS
MUTACE
MUTACE
T790M
CITLIVOST
RESISTENCE
Vzájemné kombinace
RESISTENCE
?
Screening vrozené susceptibility
Buněčný cyklus a poškození DNA
Mitosis (division)
Interphase (resting) G1 – growth S – DNA synthesis G2 - growth
Zastavení cyklu Poškození
Oprava Apoptóza
Sledování DNA polymorfismů DNA polymorfismus – drobná variace, která může ovlivnit funkci
Systém DNA oprav Systému kontroly buněčného cyklu Systém aktivního transportu
Významné polymorfismy ve farmakogenomice solidních nádorů Kontrola růstu na buněčné úrovni - buněčný cyklus a proliferace: - růstové faktory: - cytoskeleton: - apoptóza:
CCND1, CDKN2A (p14 a p16), CDKN1A (p21), MYC, p53 EGFR1 TUBB p53, APO-1 (FAS)
- bázová excisní oprava: - nukleotidová excisní oprava: - mutátorová oprava:
Geny DNA oprav XRCC1, XRCC3 ERCC1, ERCC2 hMSH2
Faktory tumorové invazivity a metastáz - immunitní odpovědi: - extracelulární matrice: - angiogeneze: - buněčná adheze:
TNF-alfa, TNF-beta, IL-6, IL-10 MMP-1, MMP-3 VEGF, NOS-3 ITGA2, ITGB3BP, CDH1 Polymorfismy genů syntézy a metabolismu
- androgenní syntéza: - metabolismus: - hormonální receptory:
SRD5A2 CYP17, CYP19, COMT1, MTHFR, UGT1A1 AR, VDR1 Polymorfismy membránových transporterů P-glykoprotein (MDR1)
Genotypování polymorfismů GG TT
AG CT
AA CC
C T
Závislost frekvence odpovědí na kombinacích genotypů ERCC1 a XRCC3 1,6
Respondeři
Nerespondeři
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 CCTT
CTTT
CCCT CCCC
TTTT
CTCT
CTCC
TTCT
TTCC
Monitorování a prognóza
Monitorování progrese Model progrese nádorového onemocnění
zdroj: Thibodeau/Patton, 2002
•
primární nádor → nádorové buňky v krevním řečišti → vzdálené metastázy
Minimální reziduální choroba Cirkulující nádorové buňky (CTC - circulating tumour cells) Engell HC. Cancer cells in the circulating blood; a clinical study on the occurrence of cancer cells in the peripheral blood and in venous blood draining the tumour area at operation. Acta Chir Scand Suppl. 1955;201:1-70.
Roberts SS, Watne AL, McGrew EA, McGrath RG, Nanos S, Cole WH. Cancer cells in the circulating blood. zdroj: Nature 450, 1168-1169, 2007
• • • •
Surg Forum. 1957;8:146-51.
koncentrace ∼ 5 CTC/5ml přítomnost epiteliálně-specifických antigenů exprese nádorově specifických mRNA výskyt u ∼ 50% pacientů
Minimální reziduální choroba Volná nádorová DNA (CFDNA - cell free DNA) Bendich A, Wilczok T, Borenfreund E. Circulating DNA as a possible factor in oncogenesis. Science. 1965 Apr 16;148:374-6. Anker P, Lefort F, Vasioukhin V, Lyautey J, Lederrey C, Chen XQ, Stroun M, Mulcahy HE, Farthing MJ. K-ras mutations are found in DNA extracted from the plasma of patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 1997 Apr;112(4):1114-20. zdroj: www.inostics.com
• • • •
původ z CTC - apoptóza nebo aktivní uvolňování fragmenty o velikosti ∼ 200bp výskyt somatických DNA variací přítomných v primárním tumoru výskyt u ∼ 40 - 70% pacientů
Monitorování progrese KRCA
Laboratorní část
Klinická část
Schéma experimentu ODBĚR VZORKŮ
IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN
DETEKCE NÁDOROVÝCH MARKERŮ
tkáň
plazma, moč
periferní krev
tkáňová DNA
volná DNA
mRNA z CTC
DNA mutace KRAS, APC, TP53
DNA mutace pozitivní ve tkáni
mRNA exprese CEA, GA733-2, EGFR
Monitorování progrese KRCA Časový průběh odběrů Během operace primární tumor uzlina, metastáza krev plazma moč
Časový průběh onemocnění
Před operací (kolonoskopie) primární tumor krev plazma moč
Po operaci Po operaci (1. den) (7. den)
Sledování (3. měsíc) krev plazma moč
Sledování (6 - 12. měsíc)
Set of acquired samples Primary tumors
49
Local nodes
9
Metastases
5
Plasma and blood prior to surgery
2 x 48
Plasma and blood at the surgery
2 x 28
Plasma and blood 24 hours after surgery
2 x 28
Plasma and blood 7 - 10 days after surgery
2 x 25
Plasma and blood 3 – 6 months after surgery
2x 8
Total samples
307
Correlation of cfDNA in plasma to disease stage Patients with mutation in primary tumour
20
Stage I – III (without metastases)
10
Plasma examined Plasma positive Plasma negative
10 2 (20%) 8 (80%)
Stage IV (metastatic disease)
10
Plasma examined Plasma positive Plasma negative
9 7 (78%) 2 (22%)
Monitorování progrese onemocnění Detekce exprese mRNA RT-PCR + fragmentační analýza na čipu (Agilent BioAnalyzer) - amplifikace nádorově specifických markerů - vyhodnocení přítomnosti a množství PCR produktů
Kvantifikace nádorové DNA WM
Wildtype 65%
60000 50000 40000 30000 20000
Mutace 45%
Primární nádor
10000 0 10000
11000
M Mutace 60%
W
60000 50000 40000 30000
Wildtype 40%
Uzlina
20000 10000 0 10000
11000
M 60000 50000 40000 30000
Metastáza
W
20000 10000 0 10000
11000
Mutace 80% Wildtype 20%
Možnost časového sledování
Kazuistiky
Post-surgery follow-up (Case 1) Male patient, age 62 with rectal tumour, Stage IV, liver + lung meta undergoing paliative surgery (sigmoideostomy) and bevacizumab therapy
Sampling
Plasma mut. quantity
Circulating cells
Pre-surgery
0,69
positive
1st day post-operation
0,48
positive
14th day post-operation
0,24
negative
3 months follow-up
0
negative
Post-surgery follow-up (Case 1) Male patient, age 62 with rectal tumour, Stage IV, liver + lung meta undergoing paliative surgery (sigmoideostomy) and bevacizumab therapy
Post-surgery follow-up (Case 2) Female patient, age 71 with rectal tumour, Stage IV, liver meta undergoing neoadjuvant bevacizumab therapy with subsequent pelvic exenteration
Sampling
Plasma mut. quantity
Circulating cells
Pre-surgery
1,30
negative
1st day post-operation
0,45
negative
14th day post-operation
0,75
negative
3 months follow-up
0,9
negative
Post-surgery follow-up (Case 2) Female patient, age 71 with rectal tumour, Stage IV, liver meta undergoing pelvic exenteration and neoadjuvant bevacizumab therapy
Aplikace molekulárně-genetických metod Pochopení molekulárních mechanismů Detekce časných stádií Detekce reziduální choroby Monitoring biologického chování - progrese,metastázy Prediktivní onkologie - testy rezistence - farmakogenomika Genová terapie
Poděkování Laboratoř molekulární genetiky a onkologie, Genomac, Praha RNDr. Anna Mészárosová, Barbora Belšánová, Andrea Krajčová LF Plzeň, Klinika TRN, FN Plzeň Prof. Miloš Pešek, MUDr. Ondřej Fiala, MUDr. Dana Jančaříková 1.LF UK, Interní klinika, Ústření vojenská nemocnice, Praha Prof. Miroslav Zavoral, MUDr. Cyril Šálek, MUDr. Štěpán Suchánek 1.LF UK, Chirurgická klinika, Fakultní Thomayerova nemocnice, Praha Doc.Vladimír Visokai, MUDr. Ludmila Lipská, MUDr. Miroslav Levý
Děkuji vám za pozornost
