VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXVII

SRPEN 2008

ČÍSLO 3

POKROKY A ORIENTACE LETECKÉ OFTALMOLOGIE Dušan BARTOŠ Ústav leteckého zdravotnictví, Praha

Věnováno 55. výročí založení Ústavu leteckého zdravotnictví

Souhrn Klinická oftalmologie a její ergoftalmologická součást, letecká oftalmologie, zaznamenaly v posledních 20 letech velmi dynamický rozvoj. Nové zobrazovací systémy, operační, diagnostické a léčebné postupy zkvalitňují preventivně-léčebnou činnost specialistů a prodlužují zdravotní způsobilost leteckého personálu také u tak závažného onemocnění, jakým je glaukom. Jeho zjištění ještě nedávno znamenalo ztrátu zdravotní způsobilosti pilota. Klíčová slova: Ergoftalmologie; Letecký personál; Zdravotní způsobilost; Glaukom.

Progress and Orientation of Aviation Ophthalmology Dedicated to 55th anniversary of the foundation of the Institute of Aviation Medicine Summary Clinical ophthalmology and its ergo-ophthalmological component, aviation ophthalmology, has developed very dynamicly during past 20 years. New display systems, operational, diagnostic and therapeutic procedures improve the therapeutic and preventive work of specialists and extend medical capability of aviation personnel even in a such serious illness as the glaucoma is. Diagnosing glaucoma has recently represented the loss of pilot’s medical fitness. Key words: Ergo-ophthalmology; Aviation personnel; Medical fitness; Glaucoma.

Jedním z nejdynamičtěji se rozvíjejících medicínským oborů je bezesporu oftalmologie. Letecká oftalmologie, která je jakousi ergoftalmologickou součástí klinické oftalmologie, tohoto rozvoje plně využívá v celém rozsahu svého působení (1). Zavedením vysoce výkonných počítačových systémů do neustále se zdokonalujících zobrazovacích řetězců výrazně zdokonalilo jak diagnostické, tak

operační postupy, jež umožňují na jedné straně diagnostikovat již sebemenší náznaky počínajících změn funkce, nebo na druhé straně provádět operační zákroky jen s minimální traumatizací zdravé tkáně. Snad největší rozvoj nastal v oblasti zobrazovacích technik, které se staly nezbytnou součástí diagnostických postupů při vyšetřování předního i zadního segmentu oka i vyšetření oční hemodynamiky (7).

78

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

Ultrazvuková biomikroskopie (UBM), systém rotující Scheimpflugovy lampy přístroje Pentacam (barevná příl. s. III, obr. 1), resp. systém Visante OCT, umožňují detailní vyšetření duhovko-rohovkové oblasti, konfigurace a hloubky přední komory, stejně jako měření tloušťky rohovky v celém jejím rozsahu. Význam těchto vyšetření spočívá nejen v zásadních informacích pro diagnostiku glaukomu, ale i ve využití v souvislosti s chirurgickými výkony v této oblasti, jako jsou refrakční operace, keratoplastiky, event. operace katarakt (9). K vyšetření zadního segmentu oka se zaměřením na vyšetření sítnice a terče zrakového nervu byla zavedena laserová skenovací tomografie, představovaná Heidelberským retinálním tomografem (obr. 1), a laserová skenovací polarimetrie, zastoupená analysátorem vrstvy nervových vláken – GDx (barevná příl. s. III, obr. 2). Poslední novinkou je optická koherentní tomografie kombinovaná se skenovací laserovou oftalmoskopií (OCT/SLO).

Obr. 1: Heidelberský retinální tomograf a flowmetr – HRT/F

Každá z uvedených vyšetřovacích metod pracuje na jiném fyzikálním principu a provádí jiný typ analýzy různých struktur zadního segmentu oka. K dlouhodobému dynamickému sledování morfologických změn byly vyvinuty digitální zobrazovací a archivační systémy (Imagenet 2000, Discam), jež umožňují i trojrozměrné zobrazení struktur (3, 5).

ROČNÍK LXXVII, 2008, č. 3

Jako důkaz podpory neurovaskulární teorie glaukomu a jemu podobných onemocnění byly vyvinuty vyšetřovací systémy k přímému nebo nepřímému měření krevního očního průtoku (OBF) v retrobulbární oblasti choroidey, resp. optického nervu. Pomocí barevného dopplerovského zobrazení (CDI), pneumotonometrie (POBF) a skenovaní laserové flowmetrie (HRF) tak získáváme informace o stavu makrocirkulace, pulzatilního krevního očního průtoku i mikrocirkulace, které mají kromě významu v časné diagnostice glaukomu otevřeného úhlu (GOU) a normotenzního glaukomu (NTG) také úzký vztah k věkem podmíněné makulární degeneraci (VPMD) i jiným vaskulárním očním onemocněním, která se v letecké populaci vzhledem k prodlužování se aktivní letecké služby, vyskytují (4, 6). Jedním z typických příkladů významu a uplatnění výše uvedených diagnostických metod je odhalování a léčba glaukomu. Ještě před 15 lety tato choroba, která je druhou nejčastější příčinou slepoty ve všech rozvinutých zemích, často znamenala nejen ukončení letecké kariéry, ale i nejistou prognózu zachování dobrých zrakových funkcí do budoucnosti. Příčina byla většinou v pozdní diagnostice onemocnění. V té době preferovaná mechanická teorie glaukomu nejenže zveličovala význam zvýšeného nitroočního tlaku, ale také nesprávně interpretovala význam perimetrického i oftalmoskopického nálezu. Na základě nových výzkumů podpořených výše uvedenou vyšetřovací technikou je dnes všeobecně uznávána doktrína, že zvýšený nitrooční tlak je pouze jedním z rizikových faktorů glaukomu a změny zorného pole jsou již pozdními glaukomovými změnami při ztrátě již více než 50 % gangliových buněk sítnice a jejich axonů. Stejně tak dříve používaná lokální léčba miotiky byla diskvalifikující pro letecký personál vzhledem k navozené artificiální mióze, docházelo ke změnám zrakové ostrosti, zužování zorného pole, akomodačním i adaptačním obtížím. V průběhu posledních 15 let zaznamenala konzervativní léčba glaukomu velký kvalitativní skok. Neselektivní i selektivní betablokátory, lokální inhibitory karboanhydrázy, selektivní sympotomimetika, deriváty prostaglandinů a prostamidů, resp. kombinované preparáty, mají vesměs velmi dobrý hypotenzivní účinek a v řadě případů pozitivně ovlivňují oční perfuzi a tím působí i neuroprotektivně. Léčba těmito moderními antiglaukomatiky při zachování dobrých zrakových funkcí není v rozporu s přiznáním zdravotní způsobilosti k létání (7, 8).



Časná diagnostika glaukomu, to znamená diagnostika v praeskotomálním období, představuje i v současné době celý systém opatření počínaje co nejširší edukací, aktivním vyváženým skreeningem, využitím moderních vyšetřovacích metod, zvolením správného terapeutického postupu a dodržováním přísných režimových zásad. Letecká oftalmologie jako typický ergoftalmologický obor plně využívá moderní zobrazovací techniky s cílem co nejčasnější detekce subklinicky probíhajících patologických stavů. Časná léčba moderními preparáty je předpokladem pro uchování dobrých zrakových funkcí a prodloužení aktivní letecké činnosti (2).

3.

4.

5. 6.

Závěr 7.

Pokroky v časné diagnostice glaukomu a výrazné rozšíření nabídky moderních antiglaukomatik jsou jistě významným úspěchem oftalmologie, na kterém prostřednictvím svých klientů participuje i oftalmologie letecká. Nicméně jsou zde i další velmi dynamicky se rozvíjející oblasti, jako úspěchy v léčbě věkem podmíněné makulární degenerace, nové operační postupy u refrakčních operací nebo nové operační techniky a implantační materiály v mikrochirurgii katarakty (7).

Literatura 1.

2.

BARTOŠ, D. – ŠULC, J. Uplatnění ergoftalmologických principů v letecké oftalmologii. Prac. Lék., 1987, vol. 39, s. 274–276. BARTOŠ, D. Problematika vyšetřování vrstvy nervových vláken sítnice pro posuzování zdravotní způsobilosti k le-

8.

9.

79

tecké službě a v klinické oftalmologii. Závěrečná zpráva výzkumného projektu [publikace č. 398]. Praha, ÚLZ, 2001. BARTOŠ, D. – ŠLANCAROVÁ, H. – KALENDOVÁ, J. The significance of Heidelberg Retina Tomograph in diagnostic of chronic simple glaucoma at flight personnel. In Abstracts of the AsMA Scientific Sessions, Reno, Nevada, USA, 2001. 93 p. BARTOŠ, D. – ŠLANCAROVÁ, H. – JURKOVÁ, M. Automatická celoplošná perfuzní zobrazovací analýza Heidelbergským Retinálním Flowmetrem u létajícího personálu. In Sborník „Aktuální problémy leteckého lékařství“, Praha, 2003, s. 57–61. BARTOŠ, D. Nové zobrazovací metody v časné diagnostice glaukomu. Voj. zdrav. Listy, 2003, vol. 72, č. 2, s. 68–71. BARTOŠ, D. – ŠLANCAROVÁ, H. – JURKOVÁ, M. The Vascular Theory of Glaucoma. Diagnostic Possibilities in Flying Personnel. In Abstract “52nd International Congress on Aviation and Space Medicine“, Sun City, South Africa, 2004. BARTOŠ, D. – MADUNICKÝ, J. – VÝBORNÝ, P. Diagnostické a terapeutické pokroky v letecké oftalmologii. In Sborník „Aktuální problémy leteckého lékařství“, Praha, 2005. BARTOŠ, D. Vliv lokální antiglaukomové léčby na oční hemodynamiku. In Sborník „Sjezd České oftalmologické společnosti“, Ústí nad Labem, 2005. BARTOŠ, D. Pentacam a jeho význam v diagnostice glaukomu. Neomed Symposium, Jihlava, 2006.

Korespondence: MUDr. Dušan Bartoš, CSc. Ústav leteckého zdravotnictví Generála Píky 1 160 60 Praha 6 e-mail: [email protected]

Do redakce došlo 17. 3. 2008

80



DIAGNOSTIKA A LÉČBA ECHINOKOKOVÝCH CYST JATER NA ÚROVNI ROLE 2 Kazuistika 1,2

Bohuslav DOLEŽAL, 3Miroslav RYSKA, 4Božetěch JURENKA, 5Pavel NÁPLAVA, 6,7Eva VLACHOVSKÁ, 8 Ladislav KALAS, 9Petr HRABAL 1 6. polní nemocnice, Olomouc 2 Chirurgické oddělení Vojenské nemocnice Brno 3 Chirurgická klinika 2. lékařské fakulty UK a Ústřední vojenské nemocnice Praha 4 Anesteziologicko-resuscitační oddělení Ústřední vojenské nemocnice Praha 5 Ústřední vojenský zdravotní ústav Praha, středisko Brno 6 7. polní nemocnice, Hradec Králové 7 Radiodiagnostická klinika LF UK a Fakultní nemocnice Plzeň 8 Radiodiagnostické oddělení Vojenské nemocnice Brno 9 Oddělení patologie Ústřední vojenské nemocnice Praha

Souhrn Úvod: Česká polní nemocnice působící v Kábulu je v místě s vysokou incidencí parazitárních onemocnění. Cílem článku je seznámit čtenáře s možnostmi diagnostiky a terapie nemocných s jaterním cystickým onemocněním při echinokokóze. Kazuistika: 25letá žena, afghánská občanka, byla přijata s 1 rok trvající anamnézou nechutenství, ztrátou hmotnosti a bolestmi v epigastriu. Předoperační vyšetření prokázalo echinokokovou cystu v levém jaterním laloku a solidní útvar v laloku pravém. Při operaci jsme nalezli 2 cysty velikosti 5 cm v průměru v popsaných lokalizacích. Jednalo se o echinokokové cysty různého stáří. Provedli jsme pericystektomii. Pooperační průběh byl bez komplikací. Diskuse: Autoři analyzují současné možnosti diagnostiky a léčby echinokokových cyst jater. Stávající vybavení polní nemocnice umožňuje diagnostikovat a operovat nemocné s jaterním postižením při echinokokóze. Podmínkou je přítomnost chirurga se zkušeností v jaterní chirurgii. Závěr: Autoři v kazuistice prezentují případ afghánské pacientky, u níž provedli pericystektomii 2 jaterních echinokokových cyst v souvislosti se současnými možnostmi polní nemocnice úrovně ROLE 2 v Kábulu. Klíčová slova: Jaterní echinokokóza; Totální pericystektomie.

Diagnosis and Treatment of Echinococcus Liver Cysts in ROLE 2 Summary Introduction: Czech field hospital acting in Kabul is situated in a place with high incidence of parasitic diseases. The aim of this article is to inform readers about the possibilities of diagnostics and treatment of patients with hydatic liver cystic disease. Case: A 25-year-old woman, an Afghan citizen, was admitted complaining of one-year lasting loss of appetite, weight and upper abdominal pain. Preoperative examinations proved Echinococcus cyst in the left liver lobe and solid formation in the right liver lobe. During the operation we found 2 cysts of diffeent age with an average diameter of 5 cm localized in mentioned sites. We carried out total pericystectomy. No postoperative complications occurred. Discussion: The authors analyze contemporary possibilities of diagnostics and treatment of hydatic liver cysts. Current equipment at the field hospital enables to diagnose and operate on patients with liver echinococcus involvement, if an experienced liver surgeon is present. Conclusion: The authors present an Afghan patient with 2 echinococcus liver cysts in the case report. Total pericystectomy was performed. The diagnosis and treatment of those patients are presented in context of contemporary possibilities of the field hospital ROLE 2 in Kabul. Key words: Liver echinococcosis; Pericystectomy.



Úvod Česká polní nemocnice (PN) zahájila v dubnu 2007 operační úkol na základně KAIA ISAF v Kábulu. Afghánistán patří mezi země s vysokým endemickým výskytem echinokokózy (1). Odborný personál se tak může setkat s různými parazitárními onemocněními a jejich orgánovými komplikacemi u místních pacientů, kteří jsou do PN k léčbě doporučeni. Naším cílem je seznámit čtenáře s možnostmi diagnostiky a léčby echinokokových cyst jater na úrovni ROLE 2 (2, 4). V České republice, která nepatří k endemickým oblastem, se s infekcí můžeme setkat u imigrantů nebo u osob, které v endemických oblastech dlouhodobě pobývaly (5).

81

nedisponuje. Interní předoperační vyšetření včetně EKG bylo bez patologického nálezu. Kontrolní ultrasonografické vyšetření před operací potvrdilo v pravém laloku jaterním těsně při větvení porty hepatis a ventrálně cystoidní útvar velikosti 54×45 mm vyplněný izoechogenními hmotami (obr. 1). V levém laloku jaterním prokázalo anechogenní cystu velikosti 47×51 mm s čirým obsahem (obr. 2). Na ostatních nitrobřišních orgánech a v retroperitoneu nebyly prokázány patologické změny. Nativní rentgenové vyšetření hrudníku prokázalo normální nález na nitrohrudních orgánech.

Kazuistika 25letá afghánská pacientka z Kábulu byla přijata dne 7. 12. 2007 do české PN v Kábulu k plánované operaci pro echinokokové postižení jater. V anamnéze pacientka udávala 1 rok trvající bolesti v celém epigastriu, nechutenství, slabost, nejasný úbytek hmotnosti. Kromě toho uvedla chronickou cefaleu po autonehodě před 5 lety, kdy po dobu 3 let užívala barbituráty. V poslední době je bez trvalé medikace. Dále podstoupila v German Field Hospital v Kábulu v prosinci roku 2005 exstirpaci pravé submandibulární žlázy pro podezření na epidermoidní karcinom. Definitivní histologické vyšetření prokázalo chronickou sialoadenitidu. Při ultrasonografickém vyšetření jater v místní vojenské nemocnici bylo nalezeno heterogenní echogenní ložisko pravého laloku jaterního a jaterní cysta levého laloku jaterního velikosti cca 5×5 cm. CT břicha ultrasonografický nález potvrdilo a lokalizovalo heterogenní útvar pravidelného tvaru do SVIII vel. 52×46 mm a dobře ohraničenou cystu levého laloku velikosti 42×42 mm. Při přijetí byla pacientka astenická, afebrilní s normálním fyzikálním nálezem, cystické útvary jater nebyly pod obloukem žeberním hmatné. Při laboratorním vyšetření krve a biochemickém vyšetření krevního séra jsme nalezli mírnou normocytární hypochromní anémii (Ery 4,4, Hb 107, Htk 0,36) a mírnou elevaci transamináz (ALT 1,35, AST 1,07). Očekávanou eosinofilii jsme neprokázali. Indikované vyšetření panelu hepatitid jsme z technických důvodů provést nemohli, PN ROLE 2 touto metodou

Obr. 1: Ultrasonografický nález echinokokové cysty pravého laloku jater. Komplex heterogenních mas napodobující solidní tkáň s membránou – dvojitě echogenní linie oddělené hypoechogenním proužkem.

Obr. 2: Ultrasonografický nález echinokokové cysty levého laloku jater. Anechogenní cysta se ztluštělou echogenní stěnou.

82



Terapie

Diskuse

V průběhu 6 dní před operací jsme podávali albendazol (Zentel, SmithKline Beecham, USA) v denní dávce 400 mg. V celkové endotracheální anestézii při standardní neinvazivní monitoraci jsme dutinu břišní otevřeli z příčné laparotomie v pravém hypochondriu s protažením ve střední čáře pod mečík. Po mobilizaci obou laloků jaterních jsme nalezli v segmentu SV v pravém laloku jaterním (barevná příl. s. I, obr. 1) a v segmentu SIII v levém laloku jaterním (barevná příl. s. I, obr. 2) 2 cysty velikosti cca 5×5 cm. Po ohraničení operačního pole rouškami napuštěnými roztokem Betadine (Egis Pharmaceuticals, Hungary) jsme provedli totální pericystektomii obou cyst. Drobný žlučovod na spodině resekční plochy vpravo jsme ošetřili opichem. Do obou vzniklých dutin jsme vložili surgicel (Johnson-Johnson, UK), založili pojistnou drenáž a uzavřeli laparotomii. Celková krevní ztráta nepřesáhla 50 ml. Obě vyjmuté cysty měly stěnu silnou 3–4 mm. Levá cysta obsahovala čirou tekutinu, cysta odstraněná z pravého laloku obsahovala žlutavou rosolovitou hmotu (barevná příl. s. I, obr. 3). Tekutinu z echinokokových cyst jater jsme vyšetřili v PN mikroskopicky s typickým nálezem protoskolexů parazita různého stáří a dále uvolněných háčků protoskolexů (barevná příl. s. I, obr. 4 a 5). Mikroskopický nález v obou tkáňových vzorcích odpovídal echinokokové jaterní cystě. V jedné z nich byly zachovány všechny tři vrstvy, včetně vrstvy germinální. V obsahu této cysty byly mnohočetné protoskolexy (barevná příl. s. I, obr. 6). Stěna druhé cysty byla tvořena vazivovou tkání, v některých úsecích s hojnou lymfoplazmocytární celulizací s příměsí četných eosinofilních leukocytů. Na vnitřní straně stěny byly nečetné obrovské vícejaderné buňky typu z cizích těles. V jejím obsahu byly protoskolexy již zaniklé a jejich struktura byla zachována jen „stínovitě“. Velmi dobře byly identifikovatelné uvolněné háčky protoskolexů v barvení podle Giesona. Pooperační průběh byl bez komplikací. V podávání albendazolu jsme po operaci pokračovali v původní denní dávce 400 mg ještě 7 dní. Desátý pooperační den byla nemocná po odstranění stehů propuštěna do domácí péče. Kontrolní ultrasonografické vyšetření před propuštěním zobrazilo rezidua vzduchu a tekutiny v lokalizacích odstraněných jaterních cyst, bez volné tekutiny v okolí jater.

Epidemiologie Cystická echinokokóza (hydatidóza, hydatická nemoc, unilokulární forma) je zoonotická infekce způsobená hlístem Echinococcus granulosus. Životní cyklus parazita zahrnuje dva savčí hostitele. Dospělý hlíst žije v tenkém střevě masožravců – definitivní hostitel (pes, hyena, dingo) a produkuje vajíčka obsahující infekční onkosféry, které se stolicí dostávají do životního prostředí. Do těla mezihostitele se vajíčka dostávají kontaminovanou potravou, vodou nebo přímým kontaktem s napadeným psem. Po požití vajíčka savčím mezihostitelem (ovce, koza, prase, kůň, vačnatci, zajíc, králík, hlodavci, primáti) se z něj ve střevě uvolňuje onkosféra, která cestou vena portae proniká nejprve do jater a příp. do dalších vnitřních orgánů. Zde se vyvíjí larvální stadium – boubel – echinokoková cysta, metacestode (1). V typickém případě zralá larva produkuje na své vnitřní plodové bláně početné protoskolexy (hlavičky nových tasemnic) a dceřiné váčky, které obsahují větší počet hlaviček. Po pozření nakažených vnitřností mezihostitele vhodným definitivním hostitelem se v jeho střevě vyvíjí dospělý jedinec, který dosahuje po 70–90 dnech pohlavní zralosti. Vajíčka může požít i člověk a ostatní aberantní hostitelé, kteří nehrají roli v přirozeném cyklu parazita. Zatímco infekce definitivního hostitele střevní formou parazita nezpůsobuje morbiditu, infekce mezihostitele nebo aberantního hostitele larválním stadiem parazita vede k závažnému až letálnímu onemocnění. Podle původce rozlišujeme tři formy echinokokózy u lidí (8): cystická echinokokóza způsobená Echinococcus granulosus alveolární echinokokóza způsobená Echinococcus multilocularis polycystická echinokokóza způsobená E. vogeli a E. oligarthrus U naší nemocné se jednalo o cystickou echinokokózu. Čtyřicet až osmdesát procent pacientů s touto cystickou echinokokózou má postižen jeden orgán se solitární cystou. Nejčastěji jsou postižena játra, poté plíce. Dohromady to zahrnuje nejméně 90 % případů. Relativní zastoupení se může lišit v jednotlivých zemích (1). Pantoflíček a spol. (3) nalezli výskyt cyst přibližně stejný v obou jaterních lalocích. Ve třetině případů ale popisují v játrech výskyt tří a více cyst.


83


Symptomatologie Klinická symptomatologie je variabilní a není patognomická. Iniciální asymptomatická fáze může trvat podle rychlosti růstu cysty (1–30 mm/rok) až 10 let a první symptomy se u jaterních cyst objevují při její velikosti od 5 cm (6, 8). To je ve shodě s nálezem u naší pacientky. Mohou se objevit celkové příznaky dané toxickým působením parazita, komplikace (ruptura nebo bakteriální infekce cysty) s následnou imunologickou reakcí hostitelského organismu: kopřivka, astma, anafylaxe. Dále se mohou vyskytnout lokální příznaky, které se liší podle postiženého orgánu. V případě jater zahrnují nechutenství (v 70 %), břišní dyskomfort, bolesti v epigastriu, hepatomegalii (v 65 %), obstrukci biliárního traktu (3). U naší pacientky se vyskytlo nechutenství a bolesti v epigastriu s úbytkem hmotnosti a mírnou elevací transamináz.

radikální. V případě, kdy není možné echinokokovou cystu odstranit, lze provézt výkon konzervativní, tj. otevřenou cystektomii s omentoplastikou nebo cystu infikovanou či komunikující se žlučovodem jen vydrénovat. Všeobecně se doporučuje operaci provádět pod clonou albendazolu (Zentel, SmithKline Beecham, USA), nicméně délka tohoto podávání není doposud jednoznačně verifikována (6, 8). V našem případě jsme podávali albendazol týden před operací a týden po operaci. V posledních 20 letech našla klinické uplatnění metoda PAIR (punkce, aspirace, injekce, reaspirace), kdy pod ultrasonografickou kontrolou se perkutánně provede punkční aspirace obsahu echinokokové cysty s dočasnou aplikací parazitocidní substance. V některých případech je vhodné provést drenáž cysty. U multiorgánového postižení nebo tam, kde nelze uplatnit chirurgickou nebo punkční metodu, lze podat samotnou systémovou chemoterapii albendazolem či mebendazolem.

Diagnostika Závěr Většinu echinokokových postižení jater odhalí ultrasonografie, případně CT. Při sporných nálezech je indikováno provedení imunologického vyšetření s detekcí specifických sérových protilátek (ELISA). Pokud ani kombinací zobrazovacích metod a sérologického vyšetření nedospějeme k jednoznačné diagnóze, lze provézt diagnostickou punkci tenkou jehlou pod ultrasonografickou kontrolou při cloně chemoterapeutik. Toto vyšetření však může být komplikováno rozvojem anafylaktického šoku a rozsevem dceřiných cyst v dutině břišní. Biochemické vyšetření u nemocných s echinokokózou dává většinou nespecifický nález. Předoperačně je doporučeno k vyloučení echinokokového postižení plic provést rentgenové vyšetření plic. Při patologickém neurologickém nálezu je doporučeno provézt CT mozku. V naší PN byl ultrasonografický nález jater typický pro echinokové cysty jater. Při laboratorním vyšetření jsme nalezli mírnou elevaci transamináz, v krevním obraze jsme nenalezli eosinofilii. Podle literatury je častěji eosinofilie nepřítomna a objevuje se až při ruptuře cysty (8).

Současné vybavení 6. PN zobrazovacími metodami, operačními sály, pooperační intenzivní péčí a perioperačním mikrobiologickým vyšetřením s následnou konzultací s Patologickým oddělením ÚVN Praha umožňuje bezpečně ošetřit nemocného s echinokokovým postižením jater. Podmínkou je zkušenost operatéra v jaterní chirurgii. Při indikaci k operačnímu výkonu je třeba zvážit riziko nejen vlastní operace, ale i nutnosti dlouhodobé pooperační léčby. Vzhledem k tomu, že v uvedené lokalitě je operačním úkolem naší PN zajistit péči o příslušníky ISAF a koaličních jednotek, nejsou k elektivnímu operačnímu výkonu indikováni pacienti s vysokým rizikem dlouhodobé pooperační péče. Hrozí tím zablokování kapacity intenzivních lůžek PN nutných k zajištění pacientů při hromadném příjmu raněných typu P1 (priorita 1).

Literatura 1.

Léčba 2.

V léčbě cystické echinokokózy jater je totální pericystektomie či resekce považována za nejvíce

ECKERT, J. − EPLAZES, P. Biological, epidemiological and clinical aspects of echinococcosis, a zoonosis of increasing concern. Clin. Mikrob. Rev., 2004, vol. 17, no. 1, p. 107–135. Kolektiv autorů. Neodkladná péče v poli. Příručka pro kurz BATLS. Učební texty Vojenské lékařské akademie J. E. Purkyně v Hradci Králové. Sv. 319. Hradec Králové, 2000.

84

3.

4.

5.

6.

7.


PANTOFLÍČEK, J. − KAŠPAR, S. − ŽÁK, R. Jaterní echinokokové cysty – chirurgické řešení 136 případů. Bull. HPB, 1993, roč. 1, č. 1, s. 15−18. PÁRAL, J. − PLODR, M. − FERKO, A. − ŽVÁK, I. Echinokoková cysta jater a plic. Rozhl. Chir., 2003, roč. 82, č. 7, s. 349–352. ŠVÁB, J. − FEYEREISL, J. − RŮŽIČKA, P. − BURGET, F. − HOŘEJŠÍ, J. − KOLÁŘOVÁ, L. − STEJSKAL, F. Echinokoková nákaza – echinococcosis. Čas. Lék. čes., 2006, vol. 145, s. 55–58. World Health Organization. Guidelines for treatment of cystic and alveolar echinococcosis in humans. WHO Informal Working Group on Echinococcosis. Bull. WHO, 1996, vol. 74, no. 3, p. 231–242. World Health Organization. PAIR: Puncture, Aspiration, Injection, Re-aspiration. An option for the treatment of cystic echinococcosis. WHO Informal Working Group

8.


on Echinococcosis, Geneva, Switzerland, 2001. Dokument WHO/CDS/CSR/APH/2001.6. World Health Organization. WHO/OIE Manual on Echinococcosis in Humans and Animals: a Public Health Problem of Global Concern. World Health Organization + World Organization for Animal Health. Paris, France, 2001.

Korespondence: Kpt. MUDr. Bohuslav Doležal Chirurgické oddělení Vojenská nemocnice Brno Zábrdovická 3 636 00 Brno e-mail: dolež[email protected]


8. k o nf er e nc e o d b or né S p ol e čn os t i v oj e ns k ýc h l ék a ř ů, fa r m a ce u t ů a ve t e ri ná r n íc h l éka řů ČL S J E P Ve dnech 27. až 28. 11. 2008 se uskuteční 8. konference odborné Společnosti vojenských lékařů, farmaceutů a veterinárních lékařů (SVLFVL). Konference bude pořádána společně s 5. ročníkem konference Medicína katastrof, traumatologické plánování a příprava v prostorách nově otevřené budovy Fakulty informatiky a managementu Univerzity Hradec Králové.

Hlavními tématy 8. konference SVLFVL jsou: Vystoupení hlavních odborníků vojenské zdravotnické služby Pokroky v diagnostice a léčbě ve VN a POŠ Profesní příprava a výcvik, organizace a řízení vojenské zdravotnické služby, zahraniční mise Nové poznatky z vojenského zdravotnického výzkumu a vývoje Prezentace přihlášených sdělení budou formou přednášky nebo posteru. Součástí konference bude také prezentace výrobků firem vyrábějících zdravotnickou techniku a materiál. Příspěvky přednesené na konferenci budou zveřejněny ve sborníku konference. Další informace, včetně přihlášky na konferenci a požadavku na formu otištění příspěvku ve sborníku, budou v průběhu měsíce srpna umístěny na webové stránce Fakulty vojenského zdravotnictví:

http://www.pmfhk.cz Organizační výbor konference se těší na setkání s vedoucími pracovníky zdravotnické služby AČR, s odborníky z vojenských nemocnic a kolegy z posádkových ošetřoven, z dalších organizačních součástí zdravotnické služby a také s pracovníky pracovišť Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany.

Prof. MUDr. Josef Fusek, DrSc. vědecký tajemník SVLFVL



85

PROMÉTHEUS – EFEKTIVNÍ PODPORA PŘI AKUTNÍM SELHÁNÍ JATER EXPERIMENTÁLNÍ PRÁCE NA VELKÉM LABORATORNÍM ZVÍŘETI 1,2

Miroslav RYSKA, 2,3Eva LÁSZIKOVÁ, 1,2Tomáš PANTOFLÍČEK, 4Ondřej RYSKA, 5 Josef PRAŽÁK, 1,2Eva KOBLIHOVÁ, 6Jelena SKIBOVÁ 1 Chirurgická klinika 2. lékařské fakulty UK a Ústřední vojenské nemocnice Praha 2 Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad, 2. lékařské fakulty UK, Praha 3 Klinika anesteziologie a resuscitace Ústřední vojenské nemocnice Praha 4 Chirurgická klinika 1. lékařské fakulty UK a Institut postgraduálního vzdělávání ve zdravotnictví, Fakultní nemocnice Na Bulovce, Praha 5 Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní péče 2. lékařské fakulty UK, Praha 6 Oddělení statistiky Institutu klinické a experimentální medicíny, Praha

Souhrn Úvod: V posledním období dochází k rozvoji eliminačních metod, které by umožňovaly efektivně léčit nemocného s akutním jaterním selháním (ASJ) v době, kdy čeká na transplantaci jater, či po dobu, než dojde ke spontánní regeneraci jaterního parenchymu. Cíl studie: Zhodnotit účinky nebiologické eliminační metody FPSA (fractionated plasma separation and adsorption) u ASJ v experimentu na velkém laboratorním zvířeti. Metodika: Provedení chirurgického devaskularizačního modelu ASJ u prasete hmotnosti 25–40 kg a následné monitorace markerů ASJ (AST, ALT, bilirubin, amoniak, glykémie, Quickův test) včetně intrakraniálního tlaku (ICP). Vytvoření kontrolní skupiny bez léčby ASJ. U 14 prasat hmotnosti 35 kg (35 ± 5 kg) jsme k léčbě ASJ použili přístroj Prométheus (FPSA). Výsledky jsme porovnali se skupinou kontrolní a statisticky zpracovali pomocí T-testu a Mann-Whitneyovým neparametrickým testem použitím tabulátoru EXCEL a QUATRO. Výsledky: Hladina bilirubinu byla v experimentální skupině oproti kontrolní signifikantně nižší v 6. hodině 12,81 ± 6,54 vs. 29,84 ± 9,99, v 9. hodině 11,94 ± 4,14 vs. 29,95 ± 12,36 a ve 12. hodině 13,88 ± 6,31 vs. 26,10 ± 12,23 mmol/l. Signifikantní rozdíl u hodnot amoniaku jsme nenašli. Hodnoty ICP se statisticky významně lišily od 9. hodiny po 12. hodinu ve prospěch skupiny léčené FSPA (p < 0,05): 9. hodina 19,1 ± 4,09 vs. 24,1 ± 2,85, 10. hodina 21,9 ± 3,63 vs. 25,1 ± 2,19, 11. hodina 22,5 ± 3,98 vs. 26,3 ± 3,50, 12. hodina 24,0 ± 4,66 vs. 29,8 ± 5,88 mm Hg sloupce. Závěr: Na chirurgickém devaskularizačním modelu akutního selhání jater jsme v experimentu na velkém laboratorním zvířeti prokázali signifikantní snížení bilirubinu a ICP při použití metody FPSA – frakcionované plazmatické separace a adsorpce – přístrojem Prométheus. Metoda je vhodná k podpůrné léčbě akutního selhání jater na úrovni ROLE 3. Klíčová slova: Akutní jaterní selhání; Velké laboratorní zvíře; FPSA; Monitorace.

Prométheus – an Effective Supportive Therapy of Acute Liver Failure Experimental Study on a Large Laboratory Animal Summary Introduction: Lately eliminative methods have developed which enable an effective treatment of patients with acute liver failure (ALF) waiting for liver transplantation or spontaneous liver parenchyma regeneration. Aim of the study: To evaluate the effectiveness of non-biological method FPSA (Fractionated plasma separation and adsorption) in the treatment of experimental ALF on a big laboratory animal. Methods: Surgical model of ALF with liver devascularization in pigs weighting 25–40 kg was provided following monitoring of ALF markers (AST, ALT, bilirubin, ammonia, glycaemia, INR) including intracranial pressure (ICP). A control group without treatment of ALF was performed. 14 pigs weighting 35 kg (35 ± 5 kg) with the identical ALF were treated by Prométheus (FPSA). Results were compared with the control group and statistically worked on by the T-test and Mann-Whitney non-parametric test using tabulator EXCEL and QUATRO. Results: The level of bilirubin serum in the experimental group comparing with the control group was significantly lower (p < 0.05) within 6th hour 12.81 ± 6.54 vs. 29.84 ± 9.99 within 9th hour 11.94 ± 4.14 vs.

86



29.95 ± 12.36 and within 12th hour 13.88 ± 6.31 vs. 26.10 ± 12.23 mmol/l. The significant difference in ammonia serum level was not founded. ICP was significantly different from 9th hour to 12th hour in favour of FPSA group (p < 0.05): 9th hour 19.1 ± 4.09 vs. 24.1 ± 2.85, 10th hour 21.9 ± 3.63 vs. 25.1 ± 2.19, 11th hour 22.5 ± 3.98 vs. 26.3 ± 3.50 and 12th hour 24.0 ± 4.66 vs. 29.8 ± 5.88 mm Hg. Conclusion: Using the FPSA method (Prométheus) the significant decrease of bilirubin and ICP was proved by the authors on a surgical devascularization model of acute liver failure in the experiment on a big laboratory animal. The method is suitable for a supportive therapy of the acute liver failure in ROLE 3. Key words: Acute liver failure; Big laboratory animal; FPSA; Monitoring.

Úvod Přežívání nemocných s akutním selháním jater (ASJ) při konzervativní terapii dosahuje pouhých 10–40 % (1). Akutně provedená ortotopická transplantace jater (TJ) výrazně toto přežití zlepšuje. Na straně druhé může u části nemocných dojít k úplné regeneraci jaterní tkáně bez TJ, a to dokonce při destrukci více než 80 % hepatocytů (2). Regenerace pak vede k plnému uzdravení nemocného. V době, po kterou pacient čeká na vhodného dárce jaterního štěpu či po kterou může dojít nebo dochází k spontánní regeneraci, je pacient akutně ohrožen na životě. Možnosti, jak pacienta přes toto období převést (tzv. bridging), jsou omezeny. Proto dochází v posledních dvou desetiletích k rozvoji biologických i nebiologických eliminačních metod, které by umožňovaly účinný bridging se zlepšením šance na přežití. Cílem našeho sdělení je seznámit čtenáře s účinností FPSA (fractionated plasma separation and adsorption) v experimentu na velkém laboratorním zvířeti s navozeným chirurgickým modelem ASJ a diskutovat o použití metody v podmínkách ROLE 3.

Metodika I. Experimentální chirurgický model ASJ V experimentu jsme použili chirurgický model ASJ u prasete hmotnosti 25–40 kg (barevná příloha s. II, obr. 1). Metodu, kterou jsme použili k vyvolání ASJ, tj. provedení chirurgické devaskularizace jater s portokavální anastomózou (PCA – portocaval anastomosis), monitoraci hemodynamiky i laboratorních parametrů, jsme popsali v našich předchozích publikacích (3–6). Vedení pooperačního období Po chirurgické devaskularizaci jater jsme prase uložili na bok, zahřívali a ventilovali směsí kyslíku

se vzduchem s FiO2 0,5 (fractional concentration of oxygen in inspired gas – frakční koncentrace). Intravenózně jsme podávali analgosedaci s využitím farmak s převážně mimojaterní cestou eliminace: kombinaci propofolu v úvodní dávce 6 mg/kg/h (Recofol, Leiras, Finsko), remifentanilu v úvodní dávce 1 µg/kg/min (Ultiva, Glaxo Group, Velká Británie) a medetomidinu v úvodní dávce 3 µg/kg/h (Domitor, Phizer, USA). Podle potřeby jsme podávali krystaloidní a koloidní roztoky a noradrenalin (Noradrenalin, Léčiva, ČR), k forsírování diurézy bolusově furosemid (Furosemid, Hoechst – Biotika, SR) k udržení hemodynamické stability a diurézy. Ventilace, monitorace vnitřního prostředí a markerů ASJ U analgosedovaných zvířat byla umělá plicní ventilace vedena buď objemově (VCV – volume control ventilation), nebo tlakově (PCV – pressure control ventilation) s cílem udržet normoventilaci paCO2 4,6–5,3 kPa (paCO2 – partial pressure CO2, parciální tlak CO2 v arteriální krvi). V pravidelných intervalech jsme vyhodnocovali parametry acidobazické rovnováhy (pH, paO2, paCO2, laktát) s možností včasného zjištění a ovlivnění hypoxémie a hyperkapnie. Zároveň jsme kontinuálně monitorovali parametry hemodynamiky, SpO2 (pulsní dozimetrie, tj. perkutánně měřená saturace hemoglobinu kyslíkem v %), ETCO2 (end-tidal CO2 – koncentrace CO2 ve vydechovaném vzduchu na konci výdechu) a hodinovou diurézu. V pravidelných intervalech jsme odebírali krevní vzorky na stanovení hodnot iontů, glykémie, krevního obrazu, parametrů hemokoagulace, jaterních testů a sérového kreatininu. Monitoraci intrakraniálního tlaku (ICP – intracranial pressure) jsme zahájili ihned po operaci zavedeným čidlem (fa Codman, Johnson and Johnson, USA). Kontinuálně jsme monitorovali tělesnou teplotu zvířat a udržovali ji na fyziologické hladině. Monitoraci hodnot jednotlivých laboratorních ukazatelů ASJ a hodnot ICP jsme prováděli po ce-


87


lou dobu operace, rozvoje ASJ a eliminační léčby až do doby exitu zvířete. Nástup ASJ Nástup ASJ jsme zaznamenali v čase poklesu glykémie pod hodnoty 3,5 mmol/l (normální hodnota 4,0–6,9 mmol/l). Tento moment byl počátkem otevření tzv. terapeutického okna a napojením bioreaktoru. Normoglykémii jsme v dalším průběhu terapie udržovali adekvátní infuzí roztoku 40% glukózy.

II. Experimentální skupina – frakcionovaná plazmatická separace a adsorpce (FPSA) K provedení eliminační metody jsme použili přístroj Prométheus firmy Fresenius, Německo (barevná příloha s. II, obr. 2). Zapojení FPSA Krev zvířete byla krevní pumpou přístroje vedena z pravé femorální tepny do Albu Flow filtru, ve kterém byl separován albumin a na něj vázané substance. Odtud byla sekundárním okruhem vedena do adsorbéru Prometh 1 a Prometh 2. Rychlost pumpy sekundárního okruhu je o 60 % vyšší než u pumpy krevní, což umožňuje vyšší očištění v sekundárním okruhu. Albumin zbavený navázaných substancí byl vrácen zpět do krve. Poté byla krev vedena do klasického dialyzátoru (HiFlux), který odstraní pomocí hemodialýzy látky rozpuštěné ve vodě. Očištěná krev byla cestou levé femorální žíly vrácena do těla zvířete. Jako antikoagulans jsme použili heparin nebo citrát sodný. Statistické zpracování výsledků Získané hodnoty laboratorních vyšetření v průběhu léčby ASJ připojením na FPSA jsme porovnali s parametry kontrolní skupiny zvířat, u níž bylo vyvoláno ASJ a která nebyla na eliminaci napojena (3). Získané údaje jsme statisticky zpracovali pomocí T-testu a Mann-Whitneyovým neparametrickým testem použitím tabulátoru EXCEL a QUATRO. Statisticky signifikantní rozdíl jsme hodnotili při hodnotě p < 0,05. Prohlášení Předoperační přípravu, operaci a pooperační péči jsme prováděli v souladu se zákonem § 12 vyhlášky č. 311/97 Sb., o chovu a využití pokusných zvířat s povolením etické komise IKEM pro experimenty na zvířatech.

Výsledky Přístroj Prométheus jsme použili k léčbě 20 prasat průměrné hmotnosti 35 kg (35 ± 5 kg), u kterých jsme vyvolali ASJ chirurgickou devaskularizací. Z tohoto celkového množství jsme 6 zvířat do sestavy nezařadili – použili jsme je k provedení nácviku metodiky. U skupiny 14 zařazených zvířat jsme v průměru 3 h 17 min (rozmezí: 2 h 15 min až 4 h 20 min) po provedení devaskularizace zahájili léčbu FPSA, která trvala průměrně 5 h 54 min (rozmezí: 5 h 45 min až 6 h). Délka operace činila v průměru 1 h 40 min, časový interval na svorce při vytvoření PCA v průměru 18 min, celkový interval mezi časem naložení svorky a napojením přístroje Prométheus 3 h 17 min. V tabulce 1 je uvedeno srovnání laboratorních hladin amoniaku a bilirubinu v séru zvířat s ASJ léčených pomocí FPSA s průměrnými hodnotami laboratorních ukazatelů kontrolní skupiny s ASJ bez léčby eliminační metodou včetně mediánu hodnot a zhodnocením významnosti rozdílu. Hladina bilirubinu se v experimentální skupině oproti kontrolní signifikantně lišila od 6. do 12. hodiny ve prospěch skupiny s léčbou FPSA (p < 0,05): v 6. hodině 12,81 ± 6,54 vs. 29,84 ± 9,99, v 9. hodině 11,94 ± 4,14 vs. 29,95 ± 12,36 a ve 12. hodině 13,88 ± 6,31 vs. 26,10 ± 12,23 mmol/l. Statisticky signifikantní rozdíl ve srovnání laboratorních hodnot hladin amoniaku mezi kontrolní a experimentální skupinou nebyl nalezen. ICP u obou skupin je vyčísleno v tabulce 2, opět s vyjádřením mediánu hodnot a významnosti rozdílu mezi kontrolní a experimentální skupinou zvířat. Průběh křivky hodnot ICP je znázorněn na grafu 1. Hodnoty ICP ve skupině léčené pomocí FPSA a ve skupině kontrolní se v průběhu experimentu statisticky významně lišily od 9. hodiny po 12 hodinu ve prospěch skupiny léčené FPSA (p < 0,05): 9. hodina 19,1 ± 4,09 vs. 24,1 ± 2,85, 10. hodina 21,9 ± ± 3,63 vs. 25,1 ± 2,19, 11. hodina 22,5 ± 3,98 vs. 26,3 ± 3,50, 12. hodina 24,0 ± 4,66 vs. 29,8 ± 5,88 mm Hg sloupce. Hodnoty dalších laboratorních hodnot – AST, ALT, kreatininu, albuminu a Quick – se v obou skupinách zvířat signifikantně nelišily a v tabulce výsledků je proto neuvádíme.

88



Tabulka 1 Srovnání hodnot hladin amoniaku a bilirubinu ve skupině zvířat s ASJ léčeným FPSA a v kontrolní skupině (3) – průměr se směrodatnou odchylkou, hodnota mediánu a významnost rozdílu

Amoniak (µmol/l) Hodiny od začátku pokusu Kontrolní skupina (n = 8)

0

3

6

9

12

39,2 ± 14,80

212,4 ± 93,18

305,9 ± 21,83

414,3 ± 246,36

592,1 ± 387,49

46,20

176,65

284,27

341,65

508,65

59,3 ± 38,28

249,6 ± 73,83

258,2 ± 62,72

274,9 ± 91,78

391,4 ± 92,90

47,45

228,69

255,68

270,83

389,90

ns.

ns.

ns.

ns.

ns.

0

3

6

9

12

5,70 ± 4.43

22,70 ± 11.06

29,84 ± 9.99

29,95 ± 12.36

26,10 ± 12.23

4,15

24,85

33,60

29,45

21,40

medián Prometheus (n = 14) medián Významnost rozdílu

Bilirubin (mmol/l) Hodiny od začátku pokusu Kontrolní skupina (n = 8) medián Prometheus (n = 14)

5,42 ± 3,68

15,38 ± 7,39

12,81 ± 6,54

11,94 ± 4,14

13,88 ± 6,31

medián

4,90

13,30

11,25

12,00

12,20

Významnost rozdílu

ns.

ns.

s.

s.

s.

ns. – neliší se, p > 0,05 s. – statisticky významný rozdíl, p < 0,05

Tabulka 2 Srovnání hodnot ICP ve skupině zvířat s ASJ léčeným FPSA a v kontrolní skupině – průměr se směrodatnou odchylkou, hodnota mediánu a významnost rozdílu ICP (mm Hg sloupce) Hodiny od ukončení operace Kontrolní skupina (n = 8) medián

Prométheus (n = 14) medián

Významnost rozdílu

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

10,4 ± 1,51

13,0 ± 2,58

13,0 ± 2,16

17,4 ± 2,99

20,0 ± 2,20

21,4 ± 3,51

24,1 ± 2,85

25,1 ± 2,19

26,3 ± 3,50

29,8 ± 5,88

13

13

17

21

22

24

24

27

29

11,5 ± 5,08

13,6 ± 5,87

15,9 ± 5,15

17,2 ± 4,71

18,3 ± 4,89

19,1 ± 4,09

21,9 ± 3,63

22,5 ± 3,98

24,0 ± 4,66

10

13

17

16,5

18,5

19

22

23

23,5

ns

ns

ns.

ns.

ns.

s.

s.

s.

s.

11

9,0 ± 3,82 8,5

ns.

ns. – neliší se, p > 0,05 s. – statisticky významný rozdíl, p < 0,05



ICP (mmHg)

35,0

30,0

25,0 Prometh 20,0

control

15,0

10,0

5,0

0,0

čas (h) 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Graf 1: Křivky ICP u laboratorního zvířete s ASJ léčených FPSA a u kontrolní skupiny bez léčby (hodina 1 je 1 hodina po operačním výkonu, nikoli po nástupu ASJ)

Diskuse Akutní selhání jater, často nazývané vzhledem k rychlému nepříznivému vývoji pro pacienta fulminantním, je poměrně řídce se vyskytující syndrom s vysokou mortalitou. Ta závisí na věku pacienta: u mladších je 65–70 %, u starších až 90 % (7). Zatímco u menší části nemocných dojde k regeneraci jaterního parenchymu a tím ke spontánnímu přežití, u větší části nemocných rozvoj onemocnění nepříznivě pokračuje (2). Za příznaků hrozící sepse při multiorgánovém selhání pacient většinou zmírá na ireverzibilní poškození mozku při zhoršující se perfuzi mozkové tkáně a narůstajícím intrakraniálním tlaku (8). U těchto nemocných je jedinou účinnou léčbou urgentní TJ. Té se však vzhledem k nedostatku vhodného dárce v daném momentu urgentní příjemce nemusí dočkat. Významné procento nemocných tak zemře na čekací listině, aniž by bylo možné TJ provést. K překlenutí kritického období, kdy vlastní játra nejsou schopna zajistit bazální metabolické potřeby organismu nemocného, tzv. bridging, a to jak při postupné spontánní regeneraci jaterní tkáně, tak i při čekání na TJ, byla navržena od 50. let minulého století celá řada postupů a zkonstruována řada eliminačních přístrojů. Od prosté hemodialýzy a výměnné krevní transfuze přes perfuzi krve přes živá prasečí či lidská kadaverózní játra, plazmaferézu, hemoperfuzi pomocí aktivního uhlí až k současným sofistikovaným biologickým či nebiologickým eliminačním přístrojům (9).

89

Z nebiologických metod klinické uplatnění nalezl v 90. letech minulého století systém MARS (molecular adsorbent recirculating system – molekulární adsorbující recirkulační systém) (10). Nověji se začal uplatňovat systém FPSA (11). Přístroj provádí detoxikaci organismu s ASJ frakcionovanou plazmatickou separací a adsorpcí – FPSA (fractionated plasma separation and adsorption) a umožňuje eliminovat jak toxické substance rozpuštěné ve vodě, tak i toxiny vázané na albumin. Přístroj se skládá z dialyzačního přístroje FMC 4008H rozšířeného o modul pro frakcionovanou plazmatickou separaci albuminovým filtrem a dvěma adsorbery. Albumin s vázanými toxiny je přímo transportován na místo, kde jsou toxiny odstraněny. Proto není potřeba lidského albuminu a proces není limitován disociací z albuminu a difuzí tak, jak je tomu u předchozího nebiologického podpůrného přístroje MARS vyvinutého Stangem a Mitznerem na začátku 90. let minulého století (10). Přístroj Prométheus má tzv. Albu flow filtr s polysulfonovou membránou neutrálního pryskyřičného adsorberu – Prométh 01. Ten propouští molekuly do velikosti 250 kD. Tak pronikají filtrem i molekuly albuminu, zatímco fibrinogen nikoli. Tím dochází k adsorpci žlučových kyselin, aromatických aminokyselin, fenolických substancí a toxinů. Druhý adsorber Prométh 02 se styren-divinylbenzen kopolymerem s prostorovou sítí 100 µm vychytává negativně nabité ligandy (nekonjugovaný bilirubin). Ve vodě rozpustné substance jsou odstraňovány hemodialýzou (11). Celý přístroj, založený na dialyzační jednotce 4008H, je „all – in – one“ extrakorporální podpůrný systém s FPSA a hemodialýzou integrován do jednoho celku. Klinické zkušenosti s přístrojem Prométheus potvrzují bezpečnost léčby u nemocných s ASJ a efektivitu při odstranění na albumin vázaných toxinů a ve vodě rozpustných substancí. Rifai se spoluautory (12) jako první na 11 nemocných s ASJ prokázal signifikantní snížení sérové hladiny konjugovaného bilirubinu, žlučových kyselin, amoniaku, cholinesterázy, kreatininu a urey. Také v prospektivní studii na 10 nemocných nezaznamenal komplikace metody při dvou po sobě následujících minimálně 4 hodiny trvajících eliminacích (13). V randomizované studii s malým počtem nemocných s ASJ Aleman se spoluautory (14) porovnal vliv albuminové dialýzy (MARS) a FPSA (Prométheus) na hemodynamiku a vazoaktivní látky u nemocných s ASJ u chronického alkoholického poškození

90


jater. Oba postupy prokázaly srovnatelný vliv na hemodynamiku a hladinu vazoaktivních látek, ve snížení hladiny bilirubinu byl úspěšnější Prométheus. Stadlbauer se spoluautory (15) u pacientů s totožnou diagnózou prokázal, že cytokiny jsou eliminovány oběma přístroji srovnatelně, nicméně jejich hladina v séru ovlivněna není. In vivo provedená kvantifikace srovnání obou eliminačních metod prokázala na 8 nemocných signifikantně vyšší clearence jak albuminových ligandů, tak i ve vodě rozpustných substancí. Nekonjugovaný bilirubin byl eliminován pouze FPSA (16). Z 31 nemocných zařazených v klasifikaci UNOS-1 (extraurgentní indikace k TJ) použil Prométheus s dobrými výsledky v rámci „bridging therapy“ u 8 nemocných Nyckowski se spoluautory (17). I z dalších publikovaných studií (18, 19) vyplývá zlepšení biochemických markerů ASJ. K prokázání účinnosti eliminační metody jsme v naší studii použili námi vyvinutý experimentální model u prasete, který prokázal standardní nástup ASJ po provedené jaterní devaskularizaci a portokavální anastomóze (3). Léčbu FPSA jsme zahájili v průměru 3 h 17 min po provedení devaskularizace. Hodnoty transamináz, Quickova testu, kreatininu a albuminu nebyly v obou skupinách signifikantně rozdílné. Signifikantní rozdíly v hladinách bilirubinu jsme dosáhli od 6. hodiny po zahájení léčby. Hodnoty amoniaku byly také u experimentální skupiny výrazně nižší, nicméně významnost rozdílu obou skupin jsme statisticky neprokázali. Příčinu vidíme v příliš velkých hodnotách SD u kontrolní skupiny a skutečnosti, že hladina sérového amoniaku není v korelaci se snížením hladiny extracereberálního amoniaku v průběhu eliminační léčby (20). V souladu s literaturou jsme nepovažovali změny v hodnotě transamináz za směrodatné (21). Za nejvýznamnější považujeme prokázání signifikantního vlivu FPSA na snížení ICP, který na rozdíl od kontrolní skupiny nepřekročil hodnotu 25 mm Hg sloupce a nedostal se na úroveň, při které již hrozí poškození mozkové tkáně (8). Vlivy, které by ovlivňovaly ICP v průběhu experimentu jsme udržováním stálé tělesné teploty, hemodynamické stability a příznivých ventilačních poměrů, minimalizovali. V současné dostupné literatuře jsme tato měření provedená v experimentu nenašli. Jednou z problematických součástí léčby přístrojem Prométheus je i zajištění správné antikoa-


gulační terapie (22). Absence antikoagulační terapie může vyústit ve srážení v okruhu Prométhea, čímž je snižována efektivita léčby a zvyšovány celkové finanční náklady. V případě našeho pokusu jsme použili u 7 prasat jako účinné antikoagulans heparin, u druhých 7 prasat citrát sodný. Samotný heparin má minimální antikoagulační účinky. Jeho antikoagulační účinek je zprostředkován antitrombinem (vzniká komplex s heparinem a následně trombinem). Léčbu heparinem jsme monitorovali pomocí aktivovaného koagulačního testu (ACT). Prodloužení ACT je úměrné hladině heparinu. Účinky heparinu jsme rušili před návratem do systémové cirkulace infuzí protaminu. Citrát sodný svým chelačním účinkem působí významné snížení ionizovaného kalcia v krvi a tím hlubokou antikoagulaci. Dávku citrátu sodného jsme nastavili podle monitorace hodnot ionizovaného kalcia. Před návratem do systémové cirkulace je nutné ionizované kalcium, snížené ztrátou vápníku přes hemofiltr a vazbou na nemetabolizovaný citrát v oběhu, korigovat infuzí kalcia (CaCl2).

Možnosti užití nebiologické eliminace v léčbě ASJ v podmínkách ROLE 3 Do nemocnice typu ROLE 3 jsou přijímáni pacienti, ať již vojáci či civilisté, s akutním selháním jater různé etiologie (otrava hepatotoxickými jedy, akutní selhání jater v terénu chronického jaterního postižení apod.). U části nemocných po rozsáhlých jaterních resekcích dochází též k projevům jaterního selhání. Nemocné je možné rozdělit do 2 skupin: A − u pacienta splňujícího indikační kritéria k provedení TJ by mělo být kontaktováno transplantační centrum, B – pacient nesplňující kritéria zařazení na čekací listinu k provedení urgentní TJ je léčen konzervativně. U skupiny A a u části nemocných skupiny B je vhodné zahájit eliminační léčbu s cílem efektivního provedení „bridging therapy“. Ta by měla vést u skupiny A ke zlepšení šance přežití v době čekání na urgentní TJ nebo k překlenutí období regenerace jaterního parenchymu. U skupiny B k překlenutí období postupné regenerace chronicky postižených jater nebo zbytkového jaterního parenchymu po velké jaterní resekci. S výše uvedeným postupem využívajícím léčby ASJ pomocí FPSA jsou uveřejněné klinické zku-



šenosti vyjádřeny formou kazuistických sdělení (12, 14, ) či prospektivních sestav (13). Doposud nebyla provedena randomizovaná studie prokazující účinnost metody v rámci evidence – based medicine (EBM) tak, jak tomu bylo při hodnocení biologické eliminační metody (23). Vzhledem k tomu, že biologická metoda neprokázala prodloužení přežívání u nemocných s ASJ (23), současný trend upřednostňuje v klinickém experimentu eliminaci nebiologickou. Výsledky našeho experimentu s biologickou (24) a nebiologickou metodou (25) tento směr léčby ASJ podporují.

Závěr Nebiologickou eliminací pomocí FPSA přístrojem Prométheus jsme prokázali signifikantní snížení hladiny bilirubinu a především ICP u skupiny zvířat s ASJ. Tato metoda tak prokázala léčebný efekt u ASJ a je vhodnou klinicko-experimentální metodou léčby ASJ v podmínkách ROLE 3.

6.

7. 8.

9. 10.

11.

12.

13.

14. Poděkování Práce byla uskutečněna s podporou rozvoje a výzkumu 9140 a s podporou výzkumného centra LN00A065 – Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad 2. LF UK, Praha. Dále poděkování patří panu J. Čápovi z IKEM za předání poznatků při práci s Prométheem a panu prim. MUDr. B. Jurenkovi (ARO ÚVN Praha) za cenné rady týkající se ventilace a monitorace laboratorních zvířat.

16.

Literatura

17.

1.

2.

3.

4.

5.

TREY, C. − DAVIDSON, CS. The management of fulminant hepatic failure. Prog. Liver Dis., 1970, vol. 3, p. 282–298. PANEK, L. − ANDREASEN, B. − TYGSTRUP, N. Galactosamine elimination capacity as a prognostic index in patients with fulminant hepatic failure. Gut, 1980, vol. 17, p. 959−964. RYSKA, M. − KIESLICHOVÁ, E. − PANTOFLÍČEK, T. − RYSKA, O. − ZAZULA, R. − SKIBOVÁ, J. − HÁJEK, M. Devascularization Surgical Model of Acute Liver Failure in Minipigs. Eur. Surg. Res., 2004, vol. 36, p. 179−184. RYSKA, M. − KIESLICHOVÁ, E. − PANTOFLÍČEK, T. − RYSKA, O. − ZAZULA, R. − SKIBOVÁ, J. − HÁJEK, M. Chirurgický model akutního selhání jater u laboratorního miniprasete. Čes. Slov. Gastroent. Hepatol., 2004, roč. 58, s. 83− 88. RYSKA, M. − KIESLICHOVÁ, E. − PANTOFLÍČEK, T. − RYSKA, O. − ZAZULA, R. − SKIBOVÁ, J. Model akutního selhání jater u miniprasete z hlediska chirurga a anesteziologa. Rozhl. Chir., 2004, roč. 83, s. 436−442.

15.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

91

KIESLICHOVÁ, E. − RYSKA, M. − PANTOFLÍČEK, T. − RYSKA, O. − ZAZULA, R. − SKIBOVÁ, J. Hemodynamic Parameters in a Surgical Devascularization Model of Fulminant Hepatic Failure in the Minipig. Phys. Res., 2005, vol. 54, p. 485−490. HOOFNAGLE, JH., et al. Fulminant hepatic failure: summary of a workshop. Hepatology, 1995, vol. 21, p. 240−252. DETRY, O., et al. Brain edema and intracranial hypertension in fulminant elativ failure: pathophysiology and management. World J. Gastroenterol., 2006, vol. 12, p. 7405−7412. WILLIAMS, R. The elusive goal of liver suport – quest for the Holy Gril. Clin. Med., 2006, vol. 6, p. 482−487. STANGE, J., et al. Dialysis against a recycled albumin solution enables the removal of albumin – bound toxins. Artur Organs, 1993, vol. 17, p. 809−813. FALKENHAGE, D., et al. Fractionated plasma separation and absorption systém: a novel systém for blood purification to remove albumin bound substance. Artur Organs, 1999, vol. 23, p. 81−86. RIFAI, K., et al. Prometheus − a new extracorporeal system for the treatment of liver failure. J. Hepatol., 2003, vol. 39, p. 984−990. RIFAI, K., et al. The Prométheus device for extracorporeal support of combined liver and renal failure. Blood Purif, 2005, vol. 23, p. 298−302. ALEMAN, W., et al. Effect of the molecular adsorbent recirculating systém and Prométheus device on systemic haemodynamics and vasoactive agents in patiens with acute-on-chronic alcoholic liver failure. Crit. Care, 2006, vol. 10, R108. STADLBAUER, V., et al. Effect of extracorporeal liver support by MARS and Prométheus on serum cytokines in acute-on-chronic liver failure. Crit. Care, 2006, vol. 10, R169. KRISPER, P., et al. In vivo quantification of liver dialysis: comparison of albumin dialysis and fractionated plasma separation. J. Hepatology, 2005, vol. 43, p. 451−457. NYCKOWSKI, P., et al. Orthotopic liver transplantation for fulminant hepatic failure. Transplant. Proc., 2006, vol. 38, p. 219−220. EVENEPOEL, P., et al. Detoxifying capacity and kinetics of Prométheus – a new extracorporeal systém for the treatment of liver failure. Blood Purif, 2005, vol. 23, p. 349−358. SANTORO, A., et al. Prométheus system: a technological support in liver failure. Transplant. Proc., 2006, vol. 38, p. 1078−1082. ROSE, CH., et al. Association of reduced extracellular brain amonia, lactate, and Intracranial pressure in pigs with acute liver failure. Hematology, 2007, vol. 46, p. 1883−1892. CARRARO, P., et al. Early prognostic biochemical indicators of fulminant hepatic failure. Int. J. Clin. Lab. Res., 1998, vol. 28, p. 196−199. MONCHI, M., et al. Citrate vs. heparin for anticogulation in continuous venovenous hemofiltration: a prospective randomized study. Intensive Care Med., 2004, vol. 30, p. 260−265. DEMETRIOU, AA., et al. Prospective, randomized, multicenter, controlled trial of a bioartificial liver in treating acute liver failure. Ann. Surg., 2004, vol. 239, p. 660−670.

92


24. RYSKA, M. − KIESLICHOVÁ, E. − PANTOFLÍČEK, T. − RYSKA, O. − KOBLIHOVÁ, E. − TCHERENTSOVÁ, E. Bioeliminace v léčbě akutního selhání jater v experimentu na velkém laboratorním zvířeti. Čes. Slov. Gastroent. Hepatol., 2006, roč. 60, s. 157−162. 25. RYSKA, M. − LÁSZIKOVÁ, E. − PANTOFLÍČEK, T. − RYSKA, O. − PRAŽÁK, J. − KOBLIHOVÁ, E. − SKIBOVÁ, J. Prométheus v léčbě akutního selhání jater v experimentu na velkém laboratorním zvířeti. Čes. Slov. Gastroent. Hepatol., 2007, roč. 61, s. 297−303.


Korespondence: Plk. prof. MUDr. Miroslav Ryska, CSc. Chirurgická klinika 2. LF UK a ÚVN Praha U vojenské nemocnice 1200 160 00 Praha 6 e-mail: [email protected]


Zd ra vot n í a s oc iá l ní a k a de m i e Hra d e c Kr á l ov é Fa k ulta v o je ns ké h o zd ra v ot ni ct ví UO Sp ole č n ost v o je ns k ý c h lé ka ř ů , fa r m a c e ut ů a ve te ri ná r n íc h lé ka ř ů Č L S J E P Zd ra vot n ic ká zá c hra n n á sl u žba Krá lo vé hra de c ké ho k ra je Zd ra vot n ic ká zá c hra n n á sl u žba h la v n íh o m ě st a Pra h y O bla st ní sp ol e k Če s ké ho če r ve né h o kř íže Hr a de c K rá l ov é Fa k ulta i n fo rm a t ik y a m a na ge m e nt u UH K pořádají V. ročník celostátní konference MEDICÍNA KATASTROF TRAUMATOLOGICKÉ PLÁNOVÁNÍ A PŘÍPRAVA

27. až 28. listopadu 2008 v Hradci Králové

Hlavní témata konference: Koncepce rozvoje oboru medicíny katastrof Problematika ZZS a centrálních příjmů Příprava zdravotnických zařízení na mimořádné události Právo a etika v mimořádné události Řešení mimořádné události a kazuistiky, zkušenosti ze cvičení IZS Problematika CRBNE Asymetrická válka, zahraniční zkušenosti z mimořádných událostí Psychologické aspekty mimořádné události Média a komunikace Příprava a vzdělávání Svolávací systémy

Podrobné informace na http://www.pmfhk.cz/



93

NOVÉ METODY RADIOTERAPIE 1

Iveta KOLÁŘOVÁ, 1Jaroslav VAŇÁSEK, 1Karel ODRÁŽKA, 1Martin DOLEŽEL, 2Luboš PETRUŽELKA 1 Oddělení klinické a radiační onkologie, Multiscan, s. r. o., Pardubice 2 Onkologická klinika Všeobecné fakultní nemocnice, Praha

Souhrn Užití konformních technik radioterapie a IMRT (intensity modulated radiotherapy) dovoluje šetření okolních zdravých tkání a eskalaci dávky v cílovém objemu. Tyto techniky ve srovnání s konvenčními umožňují větší přesnost v plánování a aplikaci dávky záření. Pro plánování radioterapie je důležité užít takové diagnostické metody, které sníží riziko relapsu nebo komplikací. Základní metodou stále zůstává CT vyšetření, které dovoluje výpočet dávkové distribuce. Zcela nové dimenze přináší PET (pozitronová emisní tomografie), která doplňuje morfologické zobrazení (CT nebo NMR) o zobrazení funkční. Klíčová slova: Konformní ozařování; IMRT; Klinické použití.

New Methods in Radiotherapy Summary Using conformal techniques and IMRT in radiotherapy allows sparing healthy tissues and escalation of the dose in target volume. In comparison with conventional techniques it requires more accuracy in the planning and application of the radiation dose. It is important to use all relevant diagnostic methods to decrease the risk of relapse or complications. CT examination still remains the basic method which allows to calculate the dose distribution. PET brings new dimensions which supplements the morphological image (CT or MRI) with a functional view. Key words: Conformal techniques of radiotherapy; IMRT; Clinical applications.

Úvod Radioterapie má za cíl, stejně jako ostatní obory medicíny, dosáhnout co nejlepších léčebných výsledků při co nejmenším počtu komplikací a nežádoucích účinků. Pro dosažení případného kurativního účinku ozáření je nezbytně nutné zasáhnout všechny nádorové buňky takovou dávkou ionizujícího záření, která s vysokou pravděpodobností vede k jejich smrti. Současně je však nutné dbát na to, aby okolní zdravé tkáně a orgány obdržely dávku co nejmenší, která přináší přijatelné riziko nejen akutních, ale především pozdních nežádoucích účinků. Rozvoj moderních technik radioterapie započal v 50. a 60. letech minulého století zaváděním lineárních urychlovačů, betatronů a kobaltových ozařovačů, to znamená vysokoenergetických zdrojů paprsků X či gama, případně elektronů. Tyto zdroje ionizujícího záření umožnily, díky vyšší pronikavosti a efektu šetření kůže, dosažení podstatně lepšího rozložení dávky v těle nemocného, než tomu bylo při konvenční rentgenové terapii. Výsledky radioterapie jsou závislé nejen na tech-

nických možnostech aplikace léčby zářením, ale i na schopnosti diagnostických metod správně určit rozsah nádorového postižení. V sedmdesátých a osmdesátých letech došlo k výraznému zpřesnění lokalizace tumorů v důsledku zavedení CT do diagnostiky a plánování léčby zářením. CT vyšetření se stalo základním a nezbytným podkladem pro výpočet rozložení dávky v těle díky tomu, že na rozdíl od ostatních moderních zobrazovacích metod umožňuje stanovit hustotu tkání a tím i absorpci ionizujícího záření v těle pacienta. V současné době se stále více uplatňují speciální spirální CT přístroje, označované jako CT simulátory, konstruované a vybavené softwarem, který slouží pro zaměření a plánování radioterapie. Moderní spirální přístroje dovolují získat data tak rychle, že umožňují zobrazení dechových pohybů. To dovoluje vzít rozsah dechových exkurzí v úvahu při plánování radioterapie, respektive blokovat ozáření při překročení zvolených limitů pohybů hrudníku. Rozvoj nukleární magnetické rezonance (NMR), ultrazvukových metod (UZ) a pozitronové emisní tomografie (PET) dále zvýšil kvalitu léčby zářením.

94


Lokalizace nádorového postižení pomocí těchto technik se stala nepostradatelnou součástí plánování radioterapie, respektive určení cílových objemů, do nichž je dávka záření aplikována. Fúze obrazu z těchto vyšetření se snímky provedenými na CT dovoluje s podstatně vyšší přesností stanovit cílový objem pro plánování radioterapie (5, 11). Zavedení výpočetní techniky dovolilo výpočet rozložení dávky záření v trojrozměrném prostoru a její aplikaci takovým způsobem, kdy ozářená oblast je co nejvíce přizpůsobena tvaru cílového objemu (3D konformní radioterapie) (9). Jednou z nejmodernějších metod zaměřených na zlepšení fyzikálních parametrů radioterapie se stala radioterapie s využitím modulace intenzity záření (intensity modulated radiotherapy) – IMRT. Moderní technika dovolila podle potřeby modulovat rozložení dávky v ozařovaném poli, respektive cílovém objemu, a docílit vysoké shody mezi tvarem cílového objemu a ozářeným objemem i v oblastech se složitým geometrickým uspořádáním a v blízkosti kritických orgánů. Léčba pomocí IMRT vyžaduje kvalitní imobilizaci, protože jedna frakce ozáření může trvat kolem 20–30 minut při použití 5–10 polí. Obvykle se využívají termoplastické masky (barevná příl. s. II, obr. 5). Gilbeau a spol. prokázali, že u tří různých systémů termoplastických fixačních masek je směrodatná odchylka nepřesnosti nastavení 0,22 cm (7). Vývoj moderní konformní radioterapie, završený zavedením IMRT, lze charakterizovat následující časovou řadou. V počátcích radioterapie se nerovný povrch těla kompenzoval použitím kompenzačních filtrů vkládaných do svazku ozařovače. Byl to první schůdný způsob dosažení cíleně nehomogenního rozložení dávky v ozařovaném poli. V roce 1988 navrhl Brahme principiálně nový způsob plánování rozložení dávky v těle pacienta, tzv. inverzní plánování. To se stalo impulsem rozvoje radioterapie s modulovanou intenzitou svazku. V roce 1991 vytvořili Webb a Boyer způsob provedení IMRT pomocí superpozice více různě tvarovaných polí ve statickém modu (multiple static fields, MSF). Později bylo Converym navrženo tvarování polí v dynamickém modu, kdy tvar pole se při ozáření plynule mění. Pohybové ozařování, kdy urychlovač opisuje kolem pacienta část kružnice nebo celou kružnici, se objevilo v roce 1993. V roce 1995 byl vytvořen způsob ozařování, kdy pohyb je zajišťován robotickým ramenem, na němž je umístěn krátký lineární urychlovač (19).


Do klinické praxe se IMRT dostalo v polovině 90. let minulého století. Existuje řada technických řešení provádění IMRT a konstrukce ozařovačů, přičemž nelze jednoznačně určit nejlepší možnost. Nejčastější způsoby jsou uvedeny níže. Technická řešení metod IMRT Kompenzační filtry Jde o nejstarší metodu IMRT, která je klinicky využívána již po řadu desetiletí. V současné době již radioterapie s pomocí kompenzačních filtrů díky rozvoji nových metod nepředstavuje nejvýhodnější možnost techniky IMRT. Kompenzační filtr se vkládá do svazku záření, což způsobuje žádoucí modulaci dávky. Ozářením z více polí s využitím kompenzačních filtrů lze docílit vhodné rozložení dávky (4). V minulosti byly kompenzační filtry zhotovovány nejčastěji skládáním bločků kovu o stejné tloušťce, příp. vystříháním z tenkých plátů a naskládáním na nosič (6). Dnes se využívá buď odlití filtru z kovu tavitelného při nízké teplotě do připravené formy, nebo vyfrézování z vhodného materiálu (16, 18). Použití vícelistových kolimátorů (MLC) Metody využívají MLC, skládající se z řady úzkých listů, které pomocí počítače dovolují vytvářet nepravidelně tvarované pole i bez použití krycích bloků. Tyto techniky IMRT lze rozdělit na 2 základní metody – statické ozáření nebo pohybové ozáření: 1. Při statických technikách, kdy je rameno ozařovače bez pohybu (fixní poloha gantry), je nemocný ozářen z více úhlů. Větší počet poloh gantry zvyšuje flexibilitu dávkové modulace a tím zlepšuje dávkovou distribuci. Lze ozařovat dvěma způsoby: • Ozařování z více polí s pomocí vícelistového kolimátoru – multiple static-field technique (MSF) Technika je založena na tom, že modulaci dávkové intenzity v ozařovaném poli lze dosáhnout pomocí superpozice více polí, jejichž tvarování je prováděno pomocí vícelistového kolimátoru (2, 3). • Statické ozařování z více polí s použitím vícelistového kolimátoru pracujícího v dynamickém modu (sliding windows) V každé pozici gantry pracuje vícelistový kolimátor v dynamickém modu (protilehlé listy



kolimátoru průběžně určitou rychlostí mění navzájem svoji polohu), takže se plynule mění tvar ozařovaného pole. K tomuto účelu byly vyvinuty algoritmy měnící požadovaný profil dávkové intenzity na sekvence pohybů vícelistového kolimátoru (12, 14). 2. Nejčastěji používané rotační, respektive pohybové, techniky jsou následující: • Sekvenční kyv (Peacock system) (13) Jde o první systém IMRT povolený FDA v USA a zavedený v roce 1994. Ozáření je aplikováno ve více axiálních řezech. Každý řez cílového objemu je ozařován při pohybu gantry úzkým polem, jehož tvar je vymezen MLC. Po každé rotaci je pacient horizontálně posunut a následuje ozáření dalšího tenkého řezu. • Tomoterapie, tj. pohybové ozařování používající rotující gantry i pohybující se stůl. Tato technika je kombinací dvou technologií – počítačového tomografu (CT) a lineárního urychlovače. Na gantry je spolu s urychlovačem umístěno i CT, což dovoluje verifikaci zaměření v reálném čase. Při ozáření se pohybuje nemocný se stolem longitudinálně a současně rotuje gantry (10, 17).

95

sifikovány ICRU (International Comission on Radiation Units and Measurments) v reportech 50 a 62 (8, 20). Oblast postižená tumorem (Gross Tumor Volume – GTV) tvoří spolu s objemy se suspektním nádorovým postižením klinický cílový objem (Clinical Target Volume – CTV). Zvětšením tohoto objemu s ohledem na nepřesnosti při nastavení ozařovače, pohyb pacienta a orgánů v průběhu ozáření je určen PTV (Planning Target Volume). U nemocných je často potřebné určit více CTV. Například při radikálním ozařování CTV1 může být definován jako oblast zahrnující primární tumor, postižené lymfatické uzliny a přilehlé vysoce rizikové oblasti a CTV2, příp. CTV3, představuje oblasti s vysokým rizikem subklinického postižení ozařované profylakticky. V tomto případě je do vzniklého PTV1 aplikována vysoká dávka záření, např. 70 Gy v 35 frakcích, a do oblastí PTV2 a PTV3 dávky 50–60 Gy. V pooperační léčbě je CTV1 určen jako lůžko tumoru a lůžko odstraněných postižených lymfatických uzlin a CTV2 je oblast ozařovaná profylakticky. Oblasti PTV1 a PTV2 vznikají přidáním lemu s ohledem na nepřesnost nastavení přístroje a pacienta, pohyb pacienta a orgánů v průběhu iradiace. U takového pacienta jsou profylakticky ozařované oblasti PTV2 ozářeny nižší dávkou, v rozmezí 50–54 Gy, ve srovnání s oblastí PTV1 s aplikovanou dávkou 60 Gy.

Plánování rozložení dávky technikou IMRT Inverzní plánování Pro plánování rozložení dávky byla vytvořena metoda takzvaného inverzního plánování, která se liší od běžného konvečního postupu. Při konvenčním plánování je základem výpočtu definovaná ozařovací technika (směry a zatížení svazků, velikosti a tvar polí, použití modifikátorů). Výsledný výpočet rozložení dávky v cílovém objemu a kritických orgánech je zhodnocen lékařem, v případě potřeby je ozařovací technika změněna. Při inverzním plánování je postup založen na tom, že stanovení požadovaného rozložení dávky v určitém formálním vyjádření, s definicí limitů a závažnosti parametrů, je jedním ze vstupních údajů výpočtu. Software je konstruován tak, že postupně dochází k přibližování parametrů ozařovacího plánu požadovanému rozložení dávky (3). Určení cílových objemů při použití IMRT vyžaduje podrobné znalosti charakteru šíření tumorů i anatomie postižené oblasti. Cílové objemy byly kla-

Stanovení dávky Po zakreslení cílových objemů se v nich specifikují požadované dávky a dávkové limity na zdravé tkáně a orgány. Dále se určuje pro tyto oblasti priorita, která stanoví relativní závažnost dodržení požadované dávky. Ve většině případů má nejvyšší prioritu oblast tumoru, avšak i kritické orgány mohou mít vyšší prioritu, pokud jejich poškození může mít závažný negativní efekt, jako např. slepotu nebo transverzální myelopatii. Riziko postradiačního poškození je obvykle funkcí nejen velikosti dávky, ale i objemu, který je zatížen. Proto plánovací systémy obsahují další způsob určení dávkových limitů. Tím je metoda stanovení maximálního objemu daného orgánu, který může být zatížen zvolenou dávkou. Lze například určit, že při ozáření pánve je povoleno ozářit maximálně 20 % objemu močového měchýře dávkou 60 Gy. Pro cílové objemy lze stanovit minimální a případně i maximální dávku. Například u tumoru prostaty lze předepsat, že minimální dávkou 70 Gy

96



musí být ozářeno více než 95 % cílového objemu, případně že dávkou větší než 78 Gy může být ozářeno maximálně 5 % cílového objemu. Tento postup využívá hodnocení histogramů zobrazujících vztah mezi dávkou a objemem ve vybraném orgánu či struktuře. Dovolují proto porovnávat kvalitu plánů a hodnotit zisk z použití technik IMRT (15).

Klinické použití IMRT V klinické praxi se tato technika uplatňuje především u tumorů hlavy a krku, prostaty a dalších orgánů, kde možnosti konvenční radioterapie neumožňují efektivně šetřit kritické orgány. U tumorů hlavy a krku si při konvenčním ozařování přítomnost orgánů, jako jsou mícha, oči, mozkový kmen, optické nervy, vynucuje redukci dávky v části cílového objemu. Dále je nemožné efektivně redukovat dávku ve slinných žlázách, což následnou xerostomií významným způsobem zhoršuje kvalitu života nemocných. V této situaci můžeme s výhodou použít IMRT, které dovoluje šetřit uvedené kritické orgány při dodržení kancerletální dávky v cílovém objemu. Dále je zde atraktivní možnost aplikovat dávku záření cíleně nehomogenně v závislosti na rozsahu nádorového postižení (barevná příl. s. II, obr. 3) (5). U tumorů prostaty se díky IMRT dociluje výhodnějšího rozložení dávky a především efektivního šetření rekta i močového měchýře. To dovoluje ve srovnání s konvenčními technikami radioterapie zvýšení dávky v oblasti prostaty a semenných váčků při stejné nebo i nižší toxicitě (barevná příl. s. II, obr. 4) (22). V řadě dalších lokalizací (tumory mozku, prsu nebo nádory lokalizované v pánvi) při nepříznivých geometrických podmínkách je dávková distribuce za použití IMRT výhodnější než při konvenčních ozařovacích technikách.

Problémy spojené s použitím techniky IMRT Techniky IMRT přinášejí výhody ve fyzikální kvalitě léčby zářením. Tyto metody však ještě nejsou ideální, a stále proto dochází k jejich zlepšování. Rozložení dávky při IMRT je ve srovnání s konvenčními postupy výhodnější, zároveň však i neobvyklé a složitější. Pro dosažení lepší distribuce dáv-

ky v cílovém objemu je někdy nutno zvětšit počet polí, resp. objem ozářených zdravých tkání oproti konvenčním technikám. Rozložení dávky je v okolních zdravých tkáních často i méně homogenní. Proto tradiční metody specifikace a hodnocení dávky mohou být pro léčbu pomocí IMRT nedostatečné a zavádějící (21). Vzniká tak řada radiobiologických otázek. Biologické efekty ozáření velkých objemů zdravých tkání a orgánů relativně velmi malými dávkami nejsou dostatečně známy a současné modely závislosti účinku na dávce a frakcionaci je podceňují. Chybí především dlouhodobé klinické zkušenosti se vznikem pozdních komplikací. Otázkou je i biologický efekt aplikace vysoké dávky v cílovém objemu. Výsledky léčby s nekonvenční velikostí denní i celkové dávky v cílovém objemu zatím nebyly u většiny diagnóz testovány na velkých souborech pacientů. Vysoká přesnost ozáření přináší podstatně menší ozáření okolí postižených oblastí vysokými dávkami záření. Tento příznivý výsledek technik IMRT z hlediska rizika komplikací však může vést k zhoršení terapeutických výsledků. Pokud je při konvenční technice zdánlivě nepostižená oblast ozářena, může být zde přítomné subklinické postižení zlikvidováno. Naopak při přesnějším ozáření technikou IMRT dojde v takovém případě k relapsu nádorového onemocnění. Proto správnost určení cílového objemu pro danou techniku, tumor a jeho stadium je nutno ověřit dlouhodobým klinickým sledováním.

Závěr Použití IMRT v léčbě zhoubných novotvarů dovoluje přesněji ozářit cílový objem a redukovat dávku záření v okolních orgánech. Nezbytnou podmínkou kvalitní léčby je přesná lokalizace těchto struktur pomocí všech dostupných diagnostických metod. Kombinace CT a MRI nebo PET pomocí fúze přináší výhody lepší identifikace hranic orgánů a lokalizace nádorového postižení. Způsob výpočtu rozložení dávky u technik IMRT technikou inverzního plánování se odlišuje od konvenčních technik a je náročnější, avšak přináší výhodu optimálního dávkového rozložení. Existuje řada technických postupů jak ozáření pomocí IMRT realizovat, přičemž každý přináší určité výhody i nevýhody. Problematika klinického použití a radiobiologická problematika této léčby je předmětem probíhajících studií.



Literatura 1.

2.

3.

4.

5.

6. 7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

BORTFELD, T. Inverse treatment planning. Course Compendium of the 1st IMRT Winter School. Heidelberg, 9–11, December 1999, p. 117–126. BORTFELD, TR., et al. Realisation and verification of 3-D conformal radiotherapy with modulated fields. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1994, vol. 30, p. 899–908. BORTFELD, TR., et al. X-ray field compensation with multileaf collimators. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1994, vol. 28, p. 723–730. BRAHME, A. Treatment optimization using physical and radiobiological objective functions. In SMITH, AR. Medical radiology, radiation therapy physics. Berlin, Springer-Verlag, 1995, p. 209–246. EL-BASSIOUNI, M., et al. [(18)FDG] PET-CT-Based Intensity-Modulated Radiotherapy Treatment Planning of Head and Neck Cancer. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., Sep 1 2007, vol. 69, no. 1, p. 286–293. FLETCHER, GH. Textbook of radiotherapy. Philadelphia, Lea nad Febiger, 1980. GILBEAU, L., et al. Comparison of Setup accuracy of three different thermoplastic masks for the treatment of brain and head and neck tumors. Radiother Oncol., Feb 2001, vol. 58, no. 2, p. 155–162. JONES, D. ICRU – report 50 International Commission on Radiation Units and Measurements. ICRU Report No. 50: Prescribing, Recording, and Reporting Photon Beam Therapy. Bethesda, MD, ICRU, 1993. KUSZYK, BS., et al. The current state of the art in three dimensional oncologic imaging: a new overview. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1995, vol. 33, p. 1029–1039. MACKIE, TR., et al. Tomotherapy: a nex concept for the delivery of dynamic conformal radiotherapy. Med. Physics, 1993, vol. 20, p. 1709–1719. PURDY, JA. Three-dimensional physics and treatment planning. In PEREZ, CA. – BRADY, LW. (eds.). Principle and practice of radiation oncology. 3rd ed. Philadelphia, Lippincott-Raven, 1998, p. 343–370. STEIN, J., et al. Dynamic X-ray compensation for conformal radiotherapy by means of multileaf collimation. Radiother. Oncol., 1994, vol. 32, p. 163–173. STERNICK, E. The teory and practice of intensity modulated radiotherapy. Madison, Advanced Medical Publishing, 1997.

97

14. SVENSON, R., et al. An analytical solution for the dynamic control of multileaf collimators. Phys. Med. Biol., 1994, vol. 39, p. 37–61. 15. VAN HERK, M., et al. Quantification of organ motion during conformal radiotherapy of the prostate by three dimensional image registration. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1993, vol. 33, p. 1311–1320. 16. VAN SAANTVOORT, JPC., et al. Granulate of stainless steel as compensator material. Radiother. Oncol., 1995, vol. 34, p. 78–80. 17. VAN VULPEN, M., et al. Comparing step-and-shoot IMRT with dynamic helical tomotherapy IMRT plans for head-and-neck cancer. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., August 2005, vol. 62, no. 5, p. 1535–1539. 18. VAŇÁSEK, J. Optimalizace radioterapie maligních lymfomů. Praha, Galén, 1999. 19. VAŇÁSEK, J. Technická problematika radioterapie s modulovanou intenzitou rozložení dávky (IMRT). Radiač. Onkol., 2002, roč. 2, č. 1, s. 9–15. 20. WAMBERSIE, A. – LANDBERG, T. ICRU Report 62: Prescribing, Recording and Reporting Photon Beam Therapy (Suppl. to ICRU Report 50) ICRU News, December 1999. 21. WEBB, S. Advances in three-dimensional conformal radiation therapy physics with intensity modulation. Lancet Oncol., 2000, vol. 1, p. 30–38. 22. ZELEFSKY, MJ. – FUKS, Z. – LEIBEL, SA. Intensity modulated radiation therapy for prostate cancer. Sem. Radiat. Oncol., 2002, vol. 12, p. 229–237.

Korespondence: MUDr. Iveta Kolářová Komplexní onkologické centrum Pardubice Radiologické centrum Multiscan, s. r. o. Kyjevská 44 532 03 Pardubice [email protected]


98



PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE JAKO ANALYTICKÁ A SELEKČNÍ METODA I. ČÁST Zuzana ŠINKOROVÁ, Lenka ZÁRYBNICKÁ Univerzita obrany, katedra radiobiologie Fakulty vojenského zdravotnictví, Hradec Králové

Souhrn V současné době dochází k rychlému nárůstu nových poznatků v biomedicíně, který je mimo jiné umožněn neustálým vývojem kvantitativních a kvalitativních analytických metod. Tyto nové přístupy umožňují podrobné sledování dějů na buněčné a molekulární úrovni, a tak nacházejí své uplatnění v široké škále vědních oborů i klinické praxi. Závěry jimi získané jsou přínosem pro civilní i vojenskou medicínu. Jednou z progresivních metod, která dosáhla v posledních letech výrazného technologického rozvoje, je metoda průtokové cytometrie (flow cytometry, FCM). Ve své podstatě FCM představuje dnes již standardní přístup pro vysokorychlostní rozměrovou a typovou analýzu suspenzí částic, nejčastěji savčích buněk. Článek se zabývá principem a nejběžnějšími aplikacemi FCM. Klíčová slova: Průtoková cytometrie; Imunofenotypizace; Lymfocyt; Monoklonální protilátka.

Flow Cytometry As an Analytical and Selective Method Part I Summary Permanent development of qualitative and quantitative analytical methods has currently resulted in a fast increase of knowledge in biomedicine. Such new approaches have enabled very detailed observations of processes on the cellular and molecular level and thus become useful in both, research and clinical practice including military medicine. Flow cytometry (FCM) is one of the highly progressive techniques with considerable technological development. Nowadays FCM represents a standard approach for a high speed analysis of particle (mostly mammalian cells) suspensions in terms of size, internal complexity and subset composition. The article deals with principle and the most common FCM applications. Key words: Flow cytometry; Immunophenotyping; Lymphocyte; Monoclonal antibody.

Imunofenotypizace a monoklonální protilátky Studium jednotlivých buněk a jejich populací zaznamenává rychlý rozvoj díky neustále se zvyšujícímu spektru analytických metod, jež se touto problematikou zabývají. První pokusy charakterizovat lymfoidní buňky specifickými antiséry namířenými proti povrchovým znakům (imunofenotypizace) a pomocí tvorby rozet s červenými krvinkami ovcí proběhly v 60. a 70. letech minulého století, kdy se podařilo od sebe odlišit a navzájem oddělit (izolovat) jejich dvě hlavní skupiny nazývané podle svého původu u ptáků lymfocyty typu B (Fabriciova bursa) a T (thymus, česky brzlík) (2). I když se později ukázalo, že tehdy dostupná polyklonální antiséra i rozetový test nejsou příliš přesnými nástroji k analýze lymfoidního kompartmentu, ve své době představovaly oba testy průlom v imunologických metodách. Nevýhodou polyklonálních antisér byla

hlavně jejich malá specifita (křížová reaktivita s jinými povrchovými strukturami) a velká variabilita jednotlivých šarží. Jedinými prakticky použitelnými polyklonálními imunoreagenciemi jsou dnes antiséra namířená proti povrchovým imunoglobulinům, která se s úspěchem používají např. při imunofenotypizaci lymfomů řady B či při (sub)izotypově specifické nepřímé vícebarevné imunofluorescenci (5). Převratný objev nositelů Nobelovy ceny Köhlera a Milsteina z roku 1975 (3) znamenal zásadní obrat v experimentálním použití imunoreagnecií (protilátek). Tzv. hybridomy – stále rostoucí a stabilní klony vzniklé fúzí buněk produkujících protilátky a myelomových buněk, jež schopnost produkce svého vlastního imunoglobulinu ztratily – představují unikátní buněčné kultury produkující specifické imunoglobuliny, tzv. monoklonální protilátky (MoAb) coby (bio)chemicky identické makromolekuly, které se po své charakterizaci využívají k jednoznačné


99


identifikaci molekulárních struktur (antigenů) na povrchu buněk i ve vnitrobuněčném prostoru. Každá MoAb využívaná k imunofenotypizaci se specificky váže k jednomu molekulárnímu motivu (epitopu), jehož výskyt může být vázán na různé (sub)populace a diferenciační stadia buněk a na různých buněčných typech se může vyskytovat v odlišném počtu kopií. Rozsáhlé studie v rámci mezinárodních pracovních skupin zaměřených na typizaci MoAb se staly základem systému rozdělení buněk krvetvorby podle tzv. CD znaků (cluster of differentiation) (1) do desítek skupin a podskupin odrážejících rozmanitost buněčných elementů krvetvorby včetně leukocytů coby efektorů imunitního systému (4). Dnes je takto klasifikováno již více než tři sta lidských CD znaků rozpoznávaných MoAb (6), z nichž mnohé mají dobře definované protějšky u laboratorních zvířat (myš, potkan) a veterinárně důležitých druhů.

Polychromatická imunofluorescence Ke zviditelnění vazby MoAb k buňkám se používá několik přístupů. Pro účely FCM se jednotlivé MoAb kovaletně váží (konjugují) s různými fluorescenčními molekulami (fluorofory), které po expozici záření excitačního zdroje emitují fotony s jinou (delší) vlnovou délkou. Komerčně dostupných fluoroforů dnes existuje celá řada od malých polycyklických molekul, jako jsou například fluorescein (FITC) nebo cyaniny či barvičky řady Alexa, přes fluorescenční fykobiliproteiny, jejichž nejznámějšími představiteli jsou phycoerythrin (PE) a allophycocyanin (APC) až po nanokrystaly (tzv. quantum dots). Protože FCM dnes využívá téměř ve všech případech monochromatického excitačního záření laserů, existuje ke každému prakticky používanému laseru (nejčastěji 405, 488 a 633 nebo 635 nm) celá skupina fluoroforů s dostatečně silnou absorpcí v dané oblasti spektra a rozdílnou emisní charakteristikou tak, aby byla jejich fluorescence odlišitelná pomocí soustavy optických filtrů uzpůsobených k odrazu a/nebo prostupu fotonů s definovanou vlnovou délkou. Označení suspenze buněk komplexním koktejlem monoklonálních protilátek, každé z nich vázané k jinému fluoroforu (tedy molekule s jinou barvou fluorescence), je základní princip vícebarevné nebo mnohobarevné (polychromatické) imunofenotypizace. Polychromatickou imunofluorescencí pak nazýváme optický signál, který označené buňky po

ozáření excitačním zářením jednoho nebo více laserů vydávají. Intenzita fluorescence jednotlivých buněk je v ideálním případě přímo uměrná množství navázané monoklonální protilátky. Ke kvalitativní informaci (svítí–nesvítí), umožňující definovat buňky jako pozitivní nebo negativní s ohledem na přítomnost studovaného epitopu (též nazývaného marker nebo znak), se tak nabízí možnost kvantitativní analýzy, tedy určení množství epitopu na nebo ve studované buňce. Ze zjištěných rozdílů lze buňky rozčlenit do skupin, které označujeme jako populace, subpopulace, typy, subtypy, diferenciační a aktivační stadia nebo malformace (v případě krvetvorby nazývané leukémie a lymfomy). Polychromatická FCM dnes využívá paralelní analýzu čtyř a více (běžně šesti až osmi) znaků na jednotlivých buňkách, což překračuje možnosti jiných experimentálních technik, s výjimkou genetické analýzy jednotlivých buněk technikou polymerázové řetězové reakce (PCR). Na rozdíl od PCR však polychromatická imunofenotypizace ve spojení s FCM umožňuje vysokorychlostní analýzu rozsáhlých populací intaktních buněk s následnou možností jejich separace a další kultivace, eventuálně transplantace. Zvláště výhodná je pak kombinace průtokově cytometrického třídění buněk a PCR umožňující studium genové exprese u dobře definovaného biologického materiálu, včetně jednotlivých buněk.

Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie (FCM) je v současné době považována za standardní metodu analýzy částic (většinou buněk) v suspenzi. V rámci klinické praxe je nejčastěji využívána při polychromatické imunofenotypizaci krevních leukocytů a buněk kostní dřeně, ale běžné jsou i další aplikace jako imunofenotypizace buněčných suspenzí izolovaných z jiných tělních tekutin (moč, likvor, výpotky), bronchoalveolárních laváží a také z orgánů a lymfatických tkání (např. při diagnostice lymfomů) či leukocytů infiltrujících solidní nádory. Kromě technik založených na specifickém rozpoznáváni antigenů protilátkami se v FCM používají i další přístupy, jako jsou kvantitativní analýza DNA u fixovaných nebo dnes už i intaktních buněk, detekce apoptózy, biofyzikální a biochemická stanovení včetně kinetiky buněčných procesů, asociace a disociace makromolekul a v posledních letech se objevila celá řada dalších stanovení, jako je např. detekce rozpustných

100


látek pomocí nosičů ve formě fluorescenčních kuliček. Polychromatická imunofluorescence leukocytů však zůstává silně převažující technikou v experimentální biologii, biomedicíně i klinické praxi. Průtokové cytometry jsou na český trh dodávány od několika výrobců v pořizovací ceně od jednoho do více než 12 miliónů korun. Nejdražší průtokové cytometry většinou slouží pro vědecké účely. Jsou to polychromatická zařízení, u nichž počet možných kanálů fluorescence často značně převyšuje deset a jsou také často vybavena třídicí (sortovací) jednotkou. Levnější modely jsou dodávány ve formě analyzátoru a slouží pro jednodušší aplikace s využitím menšího počtu barev k analýze, kdy již o polychromatické FCM nehovoříme. Klinické přístroje jsou dnes vybaveny nejméně čtyřmi, častěji však šesti až osmi detektory fluorescence takto umožňujícími současnou detekci až osmi znaků na každé buňce. Dále existuje celá řada jednoduchých FCM analyzátorů určených ke dvou a tříbarevné imunofluorescenci a většinou zaměřených na jednodušší klinické aplikace (například CD4/CD8 imunofenotypizace a monitorování HIV-pozitivních pacientů) (barevná příloha s. III, obr. 3). Průtokový cytometr sestává ze tří základních, vzájemně propojených systémů. Fluidika zajišťuje transport buněk ze suspenze, které jedna za druhou postupně přicházejí do průtokové komory, když jsou předtím hydrodynamicky fokusovány hnací tekutinou do proudnice a konstantní rychlostí procházejí jednotlivými laserovými paprsky. Během tohoto průchodu paprskem fotonů excitačního záření dochází k detekci fluorescence a u jednoho z laserů i rozptylu záření. Buňky jsou poté unášeny do třídicí jednotky nebo do odpadní nádoby. Optika zahrnuje excitační zdroje (lasery) a sběrné optické dráhy, které systémem čoček, zrcadel a optických filtrů zachycují fluorescenční a rozptýlené záření a přivádějí je na opticky aktivní vrstvu optoelektronických detektorů (fotonásobičů a fotodiod) tvořících rozhraní mezi optickým a elektronickým podsystémem průtokového cytometru. Z technického hlediska je nejsložitějším systémem průtokového cytometru elektronika, která převádí optické signály (fluorescenci a rozptyl) na signály elektronické, ty potom zesiluje, digitalizuje a zpracovává do srozumitelné formy, kterou je grafická reprezentace jednotlivých buněk na monitoru řídicího počítače. Účelem tohoto pojednání je podat přehlednou zprávu o technice průtokové cytometrie a ne zabíhat do technických podrobností, které jsou ostatně pro každý typ ana-


lyzátoru specifické. Proto zde uvedeme jen nejdůležitější údaje, které jsou podstatné pro pochopení významu, silných stránek, ale také omezení popisovaného zařízení. Hlavní předností FCM je vysoká frekvence analýzy jednotlivých buněk. Moderní analyzátory i sortery dokáží zpracovat za vteřinu desetitisíce buněk (nebo jiných mikroskopických objektů) unášených v okamžiku analýzy rychlostí několika metrů za vteřinu. Kromě poměrně velkého počtu fluoresenčních parametrů obsahují údaje o jednotlivých buňkách tradičně také dva rozptylové parametry – rozptyl v přímém směru (forward scatter, FSC), úměrný velikosti buněk a rozptyl pod úhlem 90o (side scatter, SSC), který odráží vnitřní komplexitu buněk (například granulocyty a apoptotické buňky mají vyšší hodnoty SSC, zřejmě z důvodu granulace a/nebo fragmentace jádra). Při akvizici dat je třeba odstranit debris, tzv. konfliktní případy (například dvě buňky měřené najednou) a také kompenzovat vzájemný přesvit jednotlivých fluorochromů. V neposlední řadě u cytometrů, kde je vyšetřování buňky jednotlivými laserovými paprsky prostorově a časově oddělené (a to platí v případě všech technicky pokročilejších analyzátorů), je nutné poskládat dohromady data, která sice pocházejí z různých časových okamžiků, ale patří k jedné buňce. Je tedy zřejmé, že na elektroniku jsou kladeny ty nejvyšší nároky a nejdražší cytometry jsou vybaveny špičkovou elektronikou, včetně vysokorychlostních převodníků a dnes i vnitřním a vnějším počítačem, spolupracujícími na základě vysokorychlostního spojení typu LAN. Elektronický modul včetně programového vybavení tedy představuje významnou složku ceny přístroje. S přibývajícím počtem parametrů rostou nejen nároky na technické vybavení, ale i na kvalitu obsluhy, protože kromě schopnosti ovládání špičkového technického zařízení a správné interpretace multiparametrické analýzy je nutno zabránit systematické chybě spojené se stále komplexnější maticí kompenzací spektrálních překryvů fluorochromů. Návrh a korektní provedení multiparametrické analýzy je tedy složitá a časově náročná záležitost, při které se doporučuje vycházet z jednodušších kombinací a postupně přidávat parametry během vývoje experimentálního protokolu. Na druhou stranu jsou špičkové multiparametrické FCM analyzátory a třídiče renomovaných výrobců natolik stabilní a testy kvality již pokročily tak daleko, že ve většině případů znamená správné nastavení přístroje bezproblémové a reprodukovatelné akvizice dat stejného typu po dobu mnoha měsíců.



Příklad sedmibarevné multiparanetrické analýzy Nejběžnější vyšetření imunofenotypu se provádí povrchovým značením leukocytů z nesrážlivé krve (odebrané do heparinu, citrátového pufru či EDTA), ze které se jednou ze standardních technik (diskontinuální hustotní gradient, hypotonická nebo chloridem amonným zprostředkovaná lýza) odstraní převládající červené krvinky a krevní destičky. Značení leukocytů koktejlem vybraných monoklonálních protilátek označených fluorofory může probíhat před lýzou nebo po lýze bezjaderných krevních elementů. Buňky se s protilátkami inkubují obvykle po dobu 10−30 minut a potom se promývají jednorázovou nebo opakovanou centrifugací a resuspendací v pufrovaném izotonickém roztoku, často obsahujícím ochrannou bílkovinu a azid sodný, bránící buněčným pochodům, a někdy i fixativum ke stabilizaci vazby protilátek a buněčných struktur před měřením. Experimentálních protokolů povrchové imunofenotypizace existuje celá řada, ale v zásadě se dělí na přímé značení protilátkami konjugovanými s fluorochromy a nepřímé značení, při kterém je vazba neznačené či biotinylované primární MoAb zviditelněna fluorinovaným polyklonálním antisérem specifickým pro primární imunoreagencii, resp. komplexem streptavidinu a fluoroforu. Značicí techniky se dále dělí na protokoly s promýváním a bez promývání. Obecně lze říci, že u protokolů bez promývání, které jsou poměrně populární v klinické praxi a při kterých se imunofluorescenčně označí malé množství nesrážlivé krve a po krátké inkubaci se buňky krátce lyzují a přímo měří, je nižší podíl signálu k pozadí, především z důvodů fluorescence nenavázaných, resp. nespecificky navázaných nadbytečných protilátek. S tímto se však při přípravě komerčně dodávaných koktejlů protilátek počítá a klinické akviziční a analytické programy obsahují parametry, které vyšší pozadí korigují. V případě vlastních návrhů koktejlů protilátek, a to zvláště pro výzkumné účely nebo v případě měření malého počtu cílových molekul na jednu buňku (tzv. nízká exprese), se doporučuje používat techniky s promýváním, především pokud se jedná o mnohobarevnou imunofluorescenci. Z uvedeného je zřejmé, že součástí nezbytného vybavení pro vysokorychlostní mnohobarevnou imunofluorescenci je kromě cytometru také sada laboratorních mikropipet a v případě technik s promýváním i centrifuga. Na jeden vzorek se běžně používá 50–100 µl

101

krve a odebrané vzorky se doporučuje zpracovat co nejdříve, nejpozději do 30 hodin po odběru. Uložení biologického materiálu před značením hraje velkou roli a kupříkladu krev je vhodné skladovat při laboratorní teplotě a ne ji chladit nebo umístit do vyhřívaného inkubátoru. U jiných typů vzorků jsou požadavky na dobu zpracování přísnější, např. stanovení funkčního stavu krevních destiček se musí provádět ihned a mozkomíšní mok má být zpracován do čtyř hodin po odběru. Před měřením vzorků se doporučuje provést kontrolu kvality funkce cytometru, což v podstatě spočívá ve změření referenčních fluoreskujících kuliček a v porovnání kvality detekce s referenčními hodnotami. Dalším krokem je nastavení detektorů tak, aby bylo pro daný biologický materiál (v našem případě lymfocyty) dosaženo dostatečné citlivosti a dobrého rozlišení. Tradiční empirický přístup spoléhající na detekci autofluorescence buněk v neznačením vzorku je dnes postupně nahrazován plně automatizovanou procedurou využívající speciálního referenčního materiálu (kuliček s nízkou, střední a vysokou fluorescencí ve všech kanálech detekce). Takovéto automatické procedury provedou zároveň kontrolu kvality a optimalizaci nastavení detektorů nezávisle na subjektivním přístupu obsluhy, což vede nejen k lepší reprodukovatelnosti dat z různých měřicích dnů a dobrou korelaci mezi jednotlivými laboratořemi, ale též umožňuje automatickou korekci stárnutí cytometru. V neposlední řadě je nutné nastavit korekci překryvu emisních spekter fluorochromů pomocí jednobarevných kontrolních vzorků, tzv. kompenzaci. Dnes je i tato procedura většinou prováděna automaticky pomocí speciálních modulů akvizičních programů dodávaných s průtokovým cytometrem. Označený vzorek se měří ze standardních zkumavek nebo podavačů (karuselového či destičkového typu) a typická akvizice desítek až stovek tisíc buněk trvá několik desítek vteřin podle hustoty suspenze a je shora limitována maximální rychlostí akvizice (událost za vteřinu, events per second, EPS) cytometru. Moderní cytometry umožňují kompenzaci spektrálního překryvu, resp. její úpravy při i po akvizici. Starší modely plně analogových přístrojů vyžadují nastavení kompenzace před měřením. Obrázek 1 na straně IV barevné přílohy ukazuje příklad analýzy průtokově cytometrického stanovení sedmibarevné povrchové imunofenotypizace leukocytů lidské krve pomocí následujícího koktejlu fluorofory značených monoklonálních protilátek:

102


anti-CD3/FITC (fluorescein izothiokyanát), anti-CD16+anti-CD56/RPE (dvě monoklonální protilátky navázané na jeden nosič R-phycoerythrin), anti-CD4/RPE-Cy7 (tandem R-phycoerythrin-cyanin 7), anti-CD8/APC (allophycocyanin), anti-CD14/APC-Cy7 (allophycocyanin – Cy7), anti-CD19/PB (Pacific blue), anti-CD45/AmCyan.

Dvojrozměrný tečkový diagram A (angl. dot plot) na obr. 1 (barevná příl. s. IV) představuje hromadnou reprezentaci všech objektů vzorku s hodnotou parametru FSC vyšší než vybraný práh (angl. treshold) v kanálu 32. Protože FSC je úměrný velikosti analyzovaného objektu, mluvíme o objektech (buňkách) s nadprahovou velikostí. Každá buňka je v takovýchto diagramech reprezentována jednou tečkou, takže dvě buňky s identickou hodnotu znázorňovaných parametrů nelze rozlišit. Přesto tečkové diagramy představují při vhodném nastavení zobrazovaných buněk velmi dobrou reprezentaci umožňující snadné vizuální rozlišení buněčných populací a stále jsou nejpoužívanějším zobrazením dat v průtokové cytometrii. Další možností jsou obrysové neboli hustotní diagramy založené na principu vrstevnic, kdy jsou body dvojrozměrného diagramu se stejnou hustotou buněk spojeny čarami, nebo kombinace tečkového a hustotního diagramu, kdy jsou body tečkového diagramu zobrazeny v pseudobarevné škále podle počtu buněk zobrazovaných v daném bodě diagramu. Z diagramu A je rovněž patrné, že leukocyty periferní krve jsou značně heterogenní z hlediska parametru SSC a rozpadají se do několika zřetelně odlišitelných populací. Diagram B na obr. 1 (barevná příl. s. IV) znázorňuje typický profil exprese obecného leukocytárního antigenu CD45 na populacích s různou hodnotou SSC. Oblast (region) R1 bude použita při všech dalších analýzách, protože odlišuje populaci leukocytů, které nesou na povrchu glykoprotein CD45 (CD45+), od buněk tzv. CD45 negativních (CD45-), což jsou především zbytky erytrocytů po lýze. Další reprezentace FSC versus SSC (FSC/SSC), diagram C na obr. 1 (barevná příl. s. IV), v pseudobarevné škále ukazuje CD45+ leukocyty z oblasti R1 (angl. gate) a mezi nimi populace lymfocytů (R2) a monocytů (R3) souhrnně nazývané mononukleární buňky s typicky nízkou (R2) a střední (R3) hodnotou parametru SSC. Neoznačená populace buněk


v černé barvě s vysokou hodnotou SSC jsou granulocyty (neutrofilní a eozinofilní polymorfonukleární leukocyty). Vybraný panel monoklonálních protilátek je používán při imunologickém stanovení zastoupení hlavních leukocytárních populací (diagram B a C) a dále při klasifikaci subpopulací lymfocytů postupem naznačeným na obr. 1 (barevná příl. s. IV) v diagramech D−K. V diagramech D−F je provedena analýza hlavních lymfocytárních populací. CD19+ B-buňky představující 16 % lymfocytů (buněk s booleovským kritériem gate = R1 AND R2, nazývaným angl. lymfogate (lymfocytární oblasti) (diagram E), mají povrchový fenotyp CD16-CD56(diagram D), CD3- (diagram E) a jsou také negativní pro povrchové znaky CD4 a CD8 (není přímo ukázáno). Proto je při použitém značení analyzujeme procentuálně jako homogenní populaci. Naopak CD19- populace lymfocytů je z hlediska exprese CD3 (diagram E) a CD16+CD56 (diagram D a F) značně heterogenní, což umožňuje její rozdělení do několika subpopulací. Především se z hlediska exprese CD3 klasicky dělí na CD3+ T-buňky (v tomto případě 64 % lymfocytů) a CD3- NK-buňky (20 %) (diagram E), které je nutné analyzovat odděleně. Tečkový diagram F ukazuje heterogenitu současné exprese CD16 a CD56 na T-buňkách a CD3-lymfocytech. Je zřejmé, že většina T-buněk je CD16-CD56-. Minoritní subpopulace CD3+ lymfocytů s nízkou expresí CD16+CD56 (v našem případě 1%, diagram F) se nazývá NKT-buňky a na rozdíl od klasického dělení lymfocytů na základě exprese CD3 a CD19 se dnes považují za speciální subpopulaci NK-buněk s povrchovou expresí CD3. Na rozdíl od NKT-buněk je současná exprese CD16 a CD56 na CD3NK-buňkách vysoká (diagram F). Za normálních okolností má naprostá většina CD3-(CD16+CD56)buněk povrchový fenotyp CD19+ a dvoubarevná CD3 versus CD16+CD56 analýza v „lymphogate“ tedy umožňuje jednoznačnou kvantifikaci hlavních lymfocytárních populací periferní krve včetně NKT-buněk (porovnej diagramy D, E a F). Současná detekce přítomnosti sedmi povrchových znaků na jednotlivých buňkách poskytuje též možnost detailnější analýzy lymfocytárních subpopulací tak, jak je znázorněno na diagramech G–K. Profily exprese CD8 versus CD4 a CD8 versus CD16+CD56 na NK-buňkách (CD3-CD19- lymfocyty, regionu R4 na diagramu E) jsou znázorněny na diagramu G a H, všechny tři kombinace uvedených povrchových antigenů pro CD3+ lymfocyty (region R5 v diagramu E) a NK-buňky jsou v dia-


103


gramech I–K. Z klinického hlediska má největší význam analýza na diagramu I, ze které se poměr zastoupení CD4+ pomocných a regulačních T-lymfocytů vůči relativnímu počtu CD8+ T-buněk, ve velké většině představovaných cytotoxickými T-buňkami a jejich prekurzory, používá k imunomonitorování postupu AIDS a indikaci léčby u HIV pozitivních pacientů. Na diagramu L je ve formě histogramů znázorněna exprese CD14 na všech leukocytech (modře), lymfocytech (červeně) a populaci odpovídající FSC a SSC parametry monocytům (červeně, barvy odpovídají regionům na diagramech B a C). Protože předvedená analýza závisí na postupném vydělování subpopulací pomocí logických bran vytvořených booleovskou algebrou (zde se jedná výlučně o nejčastěji používaný operátor AND), nedá se z hlediska přesného a jednoznačného určení a kvantifikace subpopulací nahradit popsaný polychromatický přístup pomocí více vzorků s menším počtem použitých fluorochromů. Je také zřejmé, že pro účely třídění subpopulací charakterizovaných složitým expresním profilem je polychromatická FCM jediným možným řešením. Proto je multiparametrická analýza stále častěji používána nejen při výzkumu, ale i v klinické praxi, a to především při analýze malých populací s unikátním fenotypem, jako je tomu např. při diagnóze a sledování minimální reziduální nemoci.

kapce se s nejvyšší pravděpodobností buňka určená k třídění ocitne. Tato kapka je těsně před oddělením z proudu hnací tekutiny nabita elektrickým pulsem procházejícím proudem hnací tekutiny a následně je v elektrickém poli vychylovacích destiček vychýlena do sběrné nádoby. Všechny ostatní kapičky, ať již prázdné, nebo obsahující nechtěné buňky, končí v odpadu nebo jiné sběrné zkumavce. Podle konstrukce přístroje a zadání operátora je dnes možné provádět až čtyřcestné sortování (jednonásobný a dvojnásobný kladný nebo záporný náboj) do zkumavek nebo destiček, kam lze provádět i třídění jednotlivých buněk (single cell sorting).

Literura 1.

2.

3.

4.

5.

Třídiče buněk Třídiče buněk (cell sorter) využívají dat získaných při průchodu buňky jednotlivými laserovými paprsky k třídění buněk s vybranými vlastnostmi. Poté, co jsou data ze všech excitačních zdrojů k dispozici, rozhodnou elektronické obvody třídiče, zda daná buňka splňuje výběrová kritéria (např. lymfocyt z oblasti R5 na diagramu E). V negativním případě skončí v odpadu, v pozitivním případě se třídič pokusí uvedenou buňku dopravit do připravené zkumavky nebo jamky v mikrotitrační destičce. Toho se dosahuje pomocí sortovacích modulů různé konstrukce. Nízkorychlostní mechanické nebo piezoelektrické třídiče buňky sbírají či odchylují z proudu hnací tekutiny mířící do odpadní nádoby. Takto lze dosáhnout maximální rychlosti sběru 300 buněk za vteřinu. Mnohem sofistikovanější a dražší vysokorychlostní třídiče vytvářejí chvěním trysky uniformní proud kapek a protože je rychlost proudu hnací tekutiny vysoce stabilní, lze odhadnout, ve které

6.

BERNARD, A. − BOUMSELL, L. The clusters of differentiation (CD) defined by the First International Workshop on Human Leucocyte Differentiation Antigens. Humm. Immunol., 1984, vol. 11, p. 1−10. JONDAL, M. − HOLM, G. − WIGZELL, H. Surface markers on human T and B lymphocytes. I. A large population of lymphocytes forming nonimmune rosettes with sheep red blood cells. J. Exp Med., 1972, vol. 136, no. 2, p. 207. KOHLER, G. − MILSTEIN, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. 1975. Biotechnology, 1992, vol. 24, p. 524−526. Nomenclature for clusters of differentiation (CD) of antigens defined on human leukocyte populations. IUIS-WHO Nomenclature Subcommittee. Bull. World Health Organ., 1984, vol. 62, no. 5, p. 809−815. SINKORA, M. − SINKORA, J. − REHÁKOVÁ, Z. − SPLÍCHAL, I. − YANG, H. − PARKHOUSE, RM. − TREBICHAVSKY, I. Prenatal ontogeny of lymphocyte subpopulations in pigs. Imunology, 1998, vol. 95, no. 4, p. 595−603. SCHREUDER, GM., et al. HLA dictionary 2004: summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, -DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens. Hum. Immunol., 2005, vol. 66, no. 2, p. 170−210.

Práce byla podpořena projektem POV MO ČR č. OPUOFVZ 200604.

Korespondence: Mjr. MVDr. Zuzana Šinkorová, CSc. Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Katedra radiobiologie Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové e-mail: [email protected]


104



PROTEOMOVÁ ANALÝZA MIKROORGANISMU BORRELIA GARINII 1

Věra NEUBAUEROVÁ, 2Aleš MACELA, 2Lenka HERNYCHOVÁ, 2Juraj LENČO, 2Martin BRYCHTA, 2 Jana HAVLASOVÁ, 3Jan KOPECKÝ, 3Jitka PECHOVÁ 1 Ústřední vojenský zdravotní ústav, Praha 2 Univerzita obrany, Ústav molekulární patologie Fakulty vojenského zdravotnictví, Hradec Králové 3 Parazitologický ústav Akademie věd ČR, České Budějovice

Souhrn Lymeská borelióza je vážným onemocněním, jehož původcem je v Evropě nejčastěji Borrelia garinii. Pro pochopení patogeneze tohoto onemocnění je důležité získat informace o proteinovém složení původce a významným zdrojem těchto informací je proteomová analýza. Pro identifikaci pomocí dvojrozměrové elektroforézy a hmotnostní spektrometrie bylo vybráno 63 proteinových spot Borrelia garinii (kmen CB61). Z nich bylo úspěšně identifikováno 40, většina se však vyskytovala v různých izoformách. Identifikováno tak bylo celkem 16 různých proteinů. Převažují proteiny s enzymatickou funkcí, ale podařilo se také identifikovat některé proteiny zahrnuté v enzootickém cyklu. Jsou to zejména proteiny skupiny Osp, membránový protein p66 a flagelární protein. Klíčová slova: Borrelia garinii; Proteomová analýza; 2-DE; MALDI-TOF MS.

Proteome Analysis of Microorganism Borrelia garinii Summary Lyme disease is a serious illness caused in Europe most frequently by Borrelia garinii. It is important to find information about protein content for understanding pathogenesis of Lyme disease. Proteome analysis is an important source of this information. We used 2-dimensional electrophoresis and mass spectrometry for identification of 63 chosen Borrelia garinii (strain CB61) protein spots. Overall 40 protein spots were identified however most of them occurred in several isoforms. Totally 16 different proteins were identified. Among them we identified several enzymes. Proteins that participate in enzootic cycle of pathogen are more interesting. They are mainly proteins of Osp group, membrane protein p66 and flagellar protein. Key words: Borrelia garinii; Proteome analysis; 2-DE; MALDI-TOF MS.

Úvod Lymeská borelióza (LB) je nejběžnějším vektorem přenášeným onemocněním v Evropě, USA a části Asie (21). Onemocnění je způsobeno zástupci rodu Borrelia ze skupiny Borrelia burgdorferi sensu lato, kam bylo dosud zařazeno celkem 11 genospecií (4). U tří z nich byla prokázána souvislost s onemocněním LB. Jsou to Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi sensu stricto a Borrelia garinii (2). Zastoupení jednotlivých genospecií v Evropě sledovali Hubálek a Halouzka (12). Zjistili, že četnost výskytu v Evropě klesá v pořadí B. garinii (39,7 %), B. afzelii (37,1 %) a B. burgdorferi s. s. (15,9 %). Stejné výsledky byly publikovány i v další studii (27). Hlavním cílem této práce je proto přispět k poznání B. garinii za pomoci proteomové analýzy. Ta

zahrnuje identifikaci, charakterizaci a kvantifikaci proteinů ve tkáních nebo buňkách (5). Takto získané informace mohou přispět k rozšíření současných znalostí patogeneze tohoto závažného onemocnění. V porovnání s jinými patogenními mikroorganismy bylo dosud publikováno jen několik studií zaměřených na proteinové složení B. garinii. Proteom tohoto mikroorganismu byl částečně popsán v roce 1999. Autoři nejprve detekovali 217 proteinových spot B. garinii a identifikovali 6 antigenů: OspA, OspB, OspC, p83/100, p39 a flagellin p41 (15). V další práci rozdělili pomocí 2-DE proteiny B. garinii (kmen 20047 a BITS), B. afzelii a B. burgdorferi s. s. a identifikovali celkem 20 antigenů: p39, p83/100, OspB, OspC, OspB, oligopeptid permeáza, OspA, GAPDH, Hsp70 (16).


105


Materiál a metody Pro analýzu byla použita 12. pasáž kmene CB61 B. garinii, který byl izolován ze samečků klíštěte I. ricinus v oblasti jižních Čech a identifikován pomocí monoklonálních protilátek a PCR v laboratoři Parazitologického ústavu AV ČR v Českých Budějovicích. Kultivace probíhala v Barbour-Stoenner-Kelly-H médiu s obsahem 6% králičího séra a s přídavkem antibiotické směsi pro borrelie. Padesát ml sterilního média bylo inokulováno 3 ml prekultury. Inkubace probíhala po dobu 1−2 týdnů při teplotě 34 °C. Rostoucí kultury byly kontrolovány mikroskopicky v zástinu a v případě kontaminace byla kultura vyloučena z dalšího zpracování. Konečný počet spirochet byl přibližně 5×109/50 ml média (určeno podle 19). Pro přípravu celobuněčného lyzátu byla kultura centrifugována 10 min při 5000 g a 4 °C. Sediment byl 2krát promyt ve 20 ml vychlazeného PBS. Po promytí byl sediment rozpuštěn a ihned homogenizován v 1 ml lyzačního pufru obsahujícího 137 mM NaCl, 10% glycerol, 1% N-octyl-β-D-glucopyranoside, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4 a inhibitory proteáz. Lyzace na ledu s občasným vortexováním trvala 25 min a roztok byl následně centrifugován po dobu 10 min při 20 600 g a 4 °C. Supernatant byl přepipetován do nových zkumavek a takto připravené celobuněčné lyzáty byly uchovávány ve zkumavkách po 1 ml při teplotě −79 °C. Bakteriální proteiny byly precipitovány přes noc, při −18 °C, v roztoku 20% trichloroctové kyseliny v acetonu obsahujícím 0,2 % dithiothreitolu (DTT) (9). Následně byly rozpuštěny v pufru pro izoelektrickou fokusaci (IEF) (9 M močovina, 4 % w/v CHAPS, 70 mM DTT a 2 % v/v amfolyty pH 9−11). Pro provedení analýz proteinových lyzátů byla použita vysokorozlišovací dvojrozměrová elektroforéza (2-DE) v kombinaci s IEF v prvním směru a polyakrylamidovou gelovou elektroforézou v přítomnosti dodecyl-sulfátu sodného (SDS PAGE) ve směru druhém. Pro standardní elektroforézu byl použit rozsah pH 3−10. Nanášeno bylo 75 µg proteinů/ /gel pro analýzy obrazu a 250 µg proteinů/gel pro identifikaci proteinů hmotnostní spektrometrií. Postup byl již dříve publikován (10). Proteiny byly pro komparativní analýzy barveny stříbřením (11). Pro hmotnostní spektrometrii byl k barvení použit Colloidal Blue Staining KIT (G-250). Proteinové mapy byly skenovány použitím laserového denzitometru (Personal Densitometer, Molecular Dynamics).

Analýza 2-DE obrazů stříbřených referenčních map byla provedena pomocí Melanie III programu. Hodnoty izoelektrických bodů a molekulárních hmotností jednotlivých proteinů byly určeny s využitím proteinů, které již byly identifikovány. Proteinové spoty vybrané pro identifikaci proteinů byly vyřezány a zpracovány podle dříve publikovaného postupu (13). Všechna hmotnostní spektra byla získána pomocí MALDI-TOF hmotnostního spektrometru (Voyager-DETM STR, Perseptive Biosystems) dříve publikovaným postupem (18). Proteiny byly identifikovány s využitím programů ProteinProspector a ProFound a v obou případech byla použita NCBInr databáze.

Výsledky Získané proteinové mapy byly počítačově zpracovány, vyhodnoceny a byla z nich vytvořena referenční 2-DE mapa B. garinii. Pro identifikaci bylo vybráno celkem 63 proteinových spot, z nichž bylo 40 úspěšně identifikováno, což představuje 16 různých proteinů (tab. 1, obr. 1). Genom B. garinii PBi obsahuje podle údajů zveřejněných v internetových databázích celkem 932 protein kódujících genů (29, 30). Nelze předpokládat, že každá proteinová spota představuje expresi jednoho genu a několik spot lokalizovaných v rozsahu stejného pI, jsou proto modifikované skupiny proteinů kódované stejným genem. Výsledný počet jednotlivých genových produktů je tak nižší, než počet proteinových spot. Z námi identifikovaných proteinů je v literatuře publikováno nejvíce informací o proteinech označovaných jako proteiny vnějšího povrchu Osp. Z nich OspA a OspB jsou zejména proteiny asociované s cytoplazmatickou membránou, které jsou zahrnuty v procesu vazby spirochet k endoteliálním buňkám (6, 23). Existuje několik hypotéz, že OspA váže spirochety k střednímu střevu klíštěte, a tím hraje důležitou roli v kolonizaci střeva vektora. OspB má pravděpodobně stejnou funkci. Proteiny této skupiny mají vysokou variabilitu. V jedné z provedených studií byly určeny 4 fenotypy OspA. Většina z 25 izolátů pocházejících ze 4 oblastí USA byla homogenních, zatímco 21 izolátů ze 3 zemí v Evropě bylo v tomto fenotypu heterogenních. Jen 3 evropské kmeny se v OspA fenotypu podobaly kmenům severoamerickým (3, 22, 25). Z této informace je zřejmé, že vývoj účinné vakcíny proti B. burgdorferi s. l. je z důvodu vysoké heterogenity velmi obtížný.

106



Tabulka 1 Identifikované proteiny B. garinii Číslo spoty

Název proteinu (podle databáze NCBInr)

Mw (kDa)/pI teoretické

Mw (kDa)/pI naměřené

Pokrytí sekvence

132

Membrane-associated protein p66

68,2/6,0

61,2/5,4

36%

133


68,2/6,0

61,0/5,6

36%

134


68,2/6,0

61,4/5,4

32%

135


68,2/6,0

61,5/5,3

28%

197

Pyrophosphate--fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase beta subunit

49,8/5,5

55,6/6,6

11%

199

Pyruvate kinase

53,0/6,7

55,4/7,7

38%

201


49,8/5,5

55,6/6,3

12%

202


49,8/5,5

55,5/6,5

14%

204

Pyruvate kinase

53,0/6,7

55,3/7,5

27%

208

Pyruvate kinase

53,0/6,7

55,1/7,2

20%

245

Aminopeptidase I

51,5/5,8

52,8/6,1

26%

249

Aminopeptidase I

51,5/5,8

52,8/6,2

42%

394

Phosphoglycerate kinase

42,4/6,4

44,8/6,5

34%

397


42,4/6,4

44,8/6,5

33%

421


42,4/6,4

44,3/6,4

32%

449

Serine hydroxymethyltransferase

45,9/7,2

42,4/6,9

24%

452

Serine hydroxymethyltransferase

45,9/7,2

42,3/7,1

18%

465

Unknown

30,6/6,6

41,4/7,3

32%

486

Nucleotide sugar epimerase

40,5/7,8

37,6/7,0

24%

487

Nucleotide sugar epimerase

40,5/7,8

37,8/7,3

27%

509

DNA-directed RNA polymerase

38,7/5,4

36,6/5,2

37%

520

Flagellin A

38,5/8,8

34,9/6,5

33%

574

Outer surface protein B

32,0/5,9

30,8/5,2

37%

577

L-lactate dehydrogenase

34,8/6,4

30,3/7,0

28%

578


34,8/6,4

30,6/7,3

24%

579


34,8/6,4

30,2/6,7

27%

583


32,0/5,9

29,8/5,3

48%

591


32,0/5,9

30,4/5,3

24%

592


34,8/6,4

30,2/6,7

23%

596


32,0/5,9

30,2/5,2

30%

602

Outer surface protein A precursor

29,6/8,6

29,5/5,8

44%

604


29,6/8,6

29,5/6,6

57%

607


29,6/8,6

29,4/5,4

25%

621


29,6/8,6

29,4/6,6

45%

634


29,6/8,6

29,4/6,7

40%

695

Phosphoglyceromutase

28,4/6,6

27,9/6,8

58%

698

Phosphoglyceromutase

28,4/6,6

27,8/6,7

58%

708

Triosephosphate isomerase

27,8/5,9

27,2/6,7

39%

711

Triosephosphate isomerase

27,8/5,9

27,1/6,6

34%

718

pfs protein

26,6/7,0

26,7/6,9

36%


107


Mr [kDa]

IEF

70 S D S

135 134

133 132

208 204 199

245

P A G E

249

201 202 197

50

421

452

397 394

509

60

465

449

40

486 487 574 596 583

520 604 592 579 577 578 621

591 607

602

634

30

698 695

711

708

718 20

Obr. 1: Stříbřená 2-DE referenční mapa B. garinii. Extrahované proteiny byly rozděleny pomocí IEF v rozsahu pH 3−10 s následným SDS-PAGE gradientním gelem (9−16 %). Čísla spot indikují identifikované proteiny.

Bylo prokázáno, že protein p66 (Oms66) je asociován s vnější membránou spirochet a je částečně povrchově exponován (1, 7). Patří do skupiny porinů, tj. proteinů formujících nespecifické difuzní kanály, a pravděpodobně je tento protein důležitý pro patogenezi LB a fyziologii spirochet (7, 26). Periplazmatická flagela mají nezbytnou roli v pohyblivosti a buněčné morfologii spirochet. U většiny spirochet zahrnují 2 skupiny proteinů, a to proteiny vnější vrstvy, označované jako FlaA proteiny, a proteiny středové části, označované jako FlaB. Byla prokázána nezbytná role periplazmatických flagel v buněčné morfologii a motilitě (14, 8). Důležitou vlastností B. burgdorferi a dalších spirochet je schop-

nost dobře plavat ve viskózním gelovitém médiu, kde jiné bakterie selhávají, klesají a nejsou schopny pohybu. Tyto faktory invazivity mohou přispívat k jejich průchodu přes mimobuněčnou hmotu a buněčné spoje infikovaných tkání (17, 24). V literatuře bylo neočekávaně publikováno větší množství aminopeptidázy I v membránové frakci v porovnání s množstvím tohoto proteinu v cytoplazmě (20). Charakter asociací s membránou však zatím není zcela jasný. Pyruvát kináza je protein zapojený do procesu glykolýzy. Tento protein byl zjištěn v nadbytku v cytoplazmě. Fosfoglycerát kináza se účastní glykolýzy a je lokalizována v cytoplazmě. Je to enzym, který katalyzuje přeměnu ATP

108


na ADP a naopak. Serin hydroxymetyltransferáza je klíčový enzym biosyntézy purinů, lipidů, hormonů a dalších složek. Je lokalizován v cytoplazmě. L-laktát dehydrogenáza je enzym anaerobní glykolýzy, který je lokalizován v cytoplazmě. Fosfoglyceromutáza je protein, který se účastní glykolýzy. Triosefosfát izomeráza hraje důležitou roli v několika metabolických drahách a je to glykolytický enzym, který hraje nepostradatelnou roli v tvorbě energie (28, 31).

4.

5.

6.

7.

Závěr Hlavním cílem této práce je zisk nových poznatků o proteinovém složení B. garinii, které budou využitelné k další analýze faktorů virulence daného mikroorganismu. Podařilo se identifikovat i proteiny, které jsou velice důležité pro enzootický cyklus patogena a patogenezi onemocnění. Ty se mohou účastnit vzájemných interakcí s hostiteli, a být tak součástí molekulárního mechanismu patogenetického obrazu onemocnění. Některé ze sledovaných proteinů jsou zcela neznámé a jsou označovány jako tzv. hypotetické proteiny, jiné se opakují v řadě species s odlišnými hodnotami pI či dokonce odlišnou molekulovou hmotností. Ani u přesně identifikovaných proteinů však není zcela jasné, jakou funkci mají odlišné formy téhož proteinu. Rovněž tak není jasné, jak ovlivňuje funkci proteinu jeho změněná lokalizace. Možnosti využití proteomiky ve vztahu k různým onemocněním jsou obrovské. Zejména jsou to: identifikace (pozměněné) exprese proteinů a její vztah k onemocnění, vývoj nových biomarkerů pro diagnostiku a ranou detekci onemocnění, identifikace nových cílů pro léčbu, příp. kandidátů pro vývoj účinných vakcín. Identifikace některých proteinů tak může vést k vývoji nových léčiv a je tak možné získat i nové markery daného onemocnění.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

Literatura 1.

2. 3.

BARBOUR, AG. − TESSIER, SL. − HAYES, SF. Variation in a major surface protein on Lyme disease spirochetes. Infect. Immun., 1984, vol. 4, p. 94−100. BARBOUR, AG. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J. Biol. Med., 1984, vol. 57, p. 521−525. BARBOUR, AG. − HEILAND, RA. − HOWE, TR. Heterogenity of Major Proteins in Lyme Disease Borreliae:

18.

19.


Molecular Analysis of North American and European Isolates. J. Infect. Dis., 1985, vol. 152, p. 478−484. BERGSTRÖM, S., et al. Molecular and Cellular Biology of Borrelia burgdorferi sensu lato. In Lyme Borreliosis: Biology, Epidemiology and Control. UK, CAB International, 2002, p. 47−90. BOUCHAL, P. − KUČERA, I. Dvourozměrná elektroforéza v proteomice: principy a aplikace. Chem. Listy, 2003, roč. 97, s. 29−36. BRUSCA, JS., et al. Localization of outer surface proteins A and B in both the outer membrane and intracellular compartments of Borrelia burgdorferi. J. Bacteriol., 1991, vol. 173, p. 8004−8008. BUNIKIS, J. – NOPPA, L. – BERGSTRÖM, S. Molecular analysis of a 66-kDa protein associated with the outer membrane of Lyme disease Borrelia. FEMS Microbiol. Let., 1995, vol. 131, p. 139−145. GOLDSTEIN, SF. − BUTTLE, KF. − CHARON, NW. Structural Analysis of the Leptospiraceae and Borrelia burgdorferi by High- Voltage Electron Microscopy. J. Bacteriol., 1996, vol. 178, p. 6539−6545. GÖRG, A., et al. Very alkaline immobilized pH gradients for two-dimensional electrophoresis of ribosomal and nuclear proteins. Electrophoresis, 1997, vol. 18, p. 328−337. HAVLASOVÁ, J., et al. Proteomic analysis of anti-Francisella tularensis LVS antibody response in murine model of tularemia. Proteomics, 2005, vol. 5, p. 2090−2103. HOCHSTRASSER, DF. − MERRIL, CR. Catalysis for polyacrylamide gel polymerization and detection of proteins by silver staining. Appl. Theor. Electrophor., 1988, vol. 1, p. 35−40. HUBÁLEK, Z. − HALOUZKA, J. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe (Review). Eur. J. Epidemiol., 1997, vol. 13, p. 951−957. HUBALEK, M., et al. Comparative proteome analysis of the cellular proteins extracted from highly virulent Francisella tularensis ssp. tularensis and less virulent F. tularensis ssp. holarctica and F. tularensis ssp. mediaasiatica. Proteomics, 2004, vol. 4, p. 3048−3060. CHARON, NW., et al. Spirochete chemotaxis, motility, and the structure of the spirochetal periplasmic flagella. Res. Microbiol., 1992, vol. 143, p. 597−603. JUNGBLUT, PR., et al. Proteomics in human disease: Cancer, heart and infectious diseases. Electrophoresis, 1999, vol. 20, p. 2100−2110. JUNGBLUT, P. − GRABHER, G. − STÖFFLER, G. Comprehensive detection of Immunorelevant Borrelia garnii antigens by two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis, 1999, vol. 20, p. 3611−3622. KIMSEY, RB. – SPIELMAN, A. Motility of Lyme disease spirochetes in fluids as viscous as the extracellular matrix. J. Infec. Dis., 1990, vol. 162, p. 1205−1208. LENCO, J., et al. Insights into the oxidative stress response in Francisella tularensis LVS and its mutant ∆iglC1 + 2 by proteomics analysis. FEMS Microbiol. Lett., 2005, vol. 246, p. 47−54. MAGNUSSON, HJ. − HILL, C. − FLEISCHMAN, R. The minimal infectious inoculum of Spirochaeta pallida (Nichols strain) and a consideration of its rate of multiplication in vivo. Am. J. Syphilis, Gonorrhea Venerol. Dis., 1948, vol. 32, p. 1−18.


109


20. NOWALK, AJ., et al. Comparative proteome analysis of subcellular fractions from Borrelia burgdorferi by NEPHGE and IPG. Proteomics, 2006, vol. 6, p. 2121−2134. 21. O’CONNELL, S., et al. Epidemiology of European Lyme borreliosis. Zentralbl. Bakteriol., 1998, vol. 287, p. 229−240. 22. PAL, U., et al. Attachment of Borrelia burgdorferi within Ixodes scapularis mediated by outer surface protein A. J. Clin. Investig., 2000, vol. 106, p. 561−569. 23. RADOLF, JD., et al. Characterization of Outer Membranes Isolated from Borrelia Burgdorferi, the Lyme Disease Spirochete. Infect. Immun., 1995, vol. 63, p. 2154−2163. 24. SADZIENE, A., et al. A flagella-less mutant of Borrelia burgdorferi. Structural, molecular, and in vitro functional characterization. J. Clin. Investig., 1991, vol. 88, p. 82−92. 25. SCHWAN, TG. − PIESMAN, J. Temporal Changes in Outer Surface Proteins A and C of the Lyme Disease-Associated Spirochete, Borrelia burgdorferi, during the Chain of Infection in Ticks and Mice. J. Clin. Microbiol., 2000, vol. 38, p. 382−388. 26. SKARE, JT., et al. The Oms66 (p66) Protein Is a Borrelia burgdorferi Porin. Infect. Immun., 1997, vol. 65, p. 3654−3661. 27. STEERE, AC. Lyme disease: A growing threat to urban populations. Proceedings of the National Academy of Science, USA, 1994, vol. 91, p. 2378−2383.

28. Swiss-Prot Protein Knowledgebase (ExPASy) [databáze online]. Swiss Institute of Bioinformatics [citováno 200603-17]. Dostupné z: http://br.expasy.org/uniprot/ 29. TIGR-CMR [databáze online]. The Comprehensive Microbial Resource Database [citováno 2006-08-07]. Dostupné z: http://cmr.tigr.org/tigrscripts/CMR/CmrHomePage.cgi 30. Integrated microbial genomes [databáze online]. Doe Joint Genome Institute [citováno 2006-08-07]. Dostupné z: http://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/pub/main.cgi 31. EMBL-EBI Database [databáze online]. The European Molecular Biology Laboratory − The European Bioinformatics Institute [citováno 2006-03-17]. Dostupné z: http://www.ebi.ac.uk/interpro

Korespondence: Kpt. Ing. Věra Neubauerová, Ph.D. Ústřední vojenský zdravotní ústav U Vojenské nemocnice 1200 169 01 Praha 6-Střešovice [email protected]


Informace o sjezdu Ve dnech 24. až 27. 5. 2008 se konal v Brně XVI. výroční sjezd České kardiologické společnosti. Jako již tradičně byl rozdělen do řady sekcí, v nichž zazněly špičkové i rutinně koncipované práce řady odborníků. Interní klinika ÚVN Praha, především její kardiologické oddělení, se účastnila odbornými přednáškami v oblasti hypertenze, arytmologie a několika posterovými sděleními. Odborných přednášek se zúčastnily i zdravotní sestry angažované v oblasti kardiologie. Celková účast na sjezdu činila kolem 4000 osob. Kromě odborných aktivit byly pro účastníky sjezdu připraveny samozřejmě i večerní společenské akce a v neposlední řadě také již tradiční Kardioběh Jiřího Tomana, jehož se zúčastnili i čtyři příslušníci Interní kliniky ÚVN Praha.

Při neformálním rozhovoru s předsedou České internistické společnosti prof. MUDr. Richardem Češkou, DrSc., jsem byl dotázán, zda by vojenští lékaři-internisté měli zájem stát se ve větším počtu než doposud členy České internistické společnosti. Skýtalo by to jisté možnosti v oblasti publikační, vědecké a snad i výzkumné. Přislíbil jsem, že tuto informaci rozšířím mezi lékaře-vojáky z povolání a civilní zaměstnance resortu MO ČR, kteří doposud ve výše uvedené společnosti nejsou registrováni. MUDr. Ivan Jeřábek zástupce přednosty IK ÚVN Praha

110



FYKOTOXINY A NĚKTERÉ MÉNĚ ZNÁMÉ TOXINY MOŘSKÉHO PŮVODU Plk. v. v. prof. MUDr. Vratislav HRDINA, CSc., plk. v. v. doc. RNDr. Vladimír MĚRKA, CSc. 1 Jiří PATOČKA, 2Radomír HRDINA 1 Zdravotně sociální fakulta Jihočeské univerzity, České Budějovice 2 Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Souhrn Fykotoxiny mořského původu jsou produkovány toxigenními řasami a sinicemi, které představují obvyklou potravu pro řadu mořských živočichů, kteří se pak sami stávají toxickými. V posledních letech jsou předmětem zvýšeného zájmu, zejména proto, že se cestou potravního řetězce dostávají do výrobků z mořských živočichů, a tak působí u lidí onemocnění, která jsou vzhledem k současným znalostem obtížně léčitelná. Riziko onemocnění způsobeného toxigenními řasami a sinicemi vzrůstá vzhledem ke zvýšené migraci obyvatelstva i vzhledem k vysílání vojenských misí do nestabilních oblastí světa. Takové aktivity mohou vyvolat rozsáhlá zdravotní poškození somatického i psychického rázu. Jsou nastíněny možnosti a význam preventivních opatření, jejich dodržování, zvláště pro vojenské mise. Klíčová slova: ASP toxin; AZP (AZA) toxin; DSP toxin; NSP toxin; Ciguatera toxin; Saxitoxin; Tetrodotoxin; Fykotoxin.

Phycotoxins and Some Less Known Marine Toxins Summary The marine microalgae producing the phycotoxins are common food for many marine animals which then themselves become toxic. In the recent years an enhanced attention has been paid to the phycotoxins because they penetrate into the fishery products through feed chains and they can cause intoxication in humans the therapy of which is very difficult. The danger concerning toxigenic microalgae is growing as a consequence of the enhanced migration of population and military missions into unstable regions of the world. These activities can cause severe health impairment of somatic and psychological character. The possibilities and importance of preventive measures and their observance are outlined particularly for military missions. Key words: Amnesic shellfish poisoning toxin; Azaspiracid poisoning toxin; Diarrheic shellfish poisoning toxin; Neurotoxic shellfish poisoning toxin; Ciguatera toxin; Saxitoxin; Tetrodotoxin; Phycotoxin.

Úvod Řasy a sinice jsou dva typy organismů tvořících fytoplankton. Řasy i sinice mají ve vodě podobnou úlohu, ale z hlediska vlivu na lidské zdraví jsou sinice mnohem nebezpečnější. Sinice a řasy produkují řadu zdraví nebezpečných toxinů, jež označujeme souhrnně jako fykotoxiny (46). Předkládaný článek uvádí nejznámější zástupce fykotoxinů a charakterizuje je po stránce chemické a toxikologické. Mnohé z fykotoxinů představují reálné riziko pro lidské zdraví. Fytoplankton je potravou pro řadu vodních živočichů, v jejichž těle se mohou fykotoxiny kumulovat a následně pak ohrozit jejich konzumenty. V tomto směru jsou zvláště nebezpečné fykotoxiny z mořského planktonu. Dostávají se do těl mořských ryb, korýšů a měkkýšů a ohrožují člově-

ka na celém světě alimentárními otravami. Je proto snaha o jejich monitorování a vytváření jednotné legislativy týkající se posuzování zdravotní nezávadnosti mořských produktů a stanovení limitů jako jsou dávky látky nevyvolávající žádný efekt (NOEL – No Observed Effect Level) nebo dávky, jež nevyvolá žádný nepříznivý efekt (NOAEL – No Observed Adverse Effect Level), eventuálně nejnižší dávky, která již vyvolá nepříznivý efekt (LOAEL − Lowest Observed Adverse Effect Level). V zemích EU je toto řešeno direktivou č. 91/492/EEC ze dne 15. července 1991 (44). Sinice (Cyanophyta, Cyanobacteria, Cyanoprocaryonta) jsou prokaryontní aerobní mikroorganismy s jednobuněčnou nebo vláknitou stélkou, často tvořící kolonie. Bičíky chybějí. Řasy jsou jednoduché vodní rostliny tvořící nejednotnou skupinu or-



ganismů. Jejich tělo tvoří stélka, která není rozlišena na kořen, stonek a listy. Mezi řasy patří tři vývojové větve: červená, hnědá a zelená. Mezi toxikologicky významné řasy patří např. ruduchy (Rhodophyta), rozsivky (Chromophyta), bičíkovci (Dinoflagellata) nebo obrněnky (Dinophyta). Za určitých podmínek produkují řasy a sinice vysoce účinné toxiny, které ohrožují především život ryb, ale též mnoha zvířat. Vytvářejí tzv. „vodní květ“, který může mít barvu načervenalou, namodralou či zelenou. Přemnožení mořského planktonu je známé jako „rudý příliv“ (red tide) a již předkolumbovské civilizace Jižní a Střední Ameriky věděly, že v době „rudého přílivu“ není radno vyjíždět na moře a lovit ryby a plody moře, protože jsou v té době jedovaté (45). Od devatenáctého století jsou známy také otravy divokých i domácích zvířat fykotoxiny a jsou popisovány klinické příznaky alimentárních otrav lidí mořskými produkty. Toxiny produkované řasami a sinicemi vstupují do potravních řetězců, na jejichž konci stojí člověk. Fykotoxiny končí zpravidla svou pouť ve výrobcích rybářského průmyslu, nejčastěji při tom jde o ryby a jedlé mořské měkkýše nebo korýše. Fykotoxiny sladkovodních sinic nás ohrožují v létě při koupání, kdy dojde k jejich přemnožení (32). Rozšíření řas a sinic je globální, dokážou totiž žít v podmínkách antarktického ledu, ale také ve vroucích gejzírech. Fykotoxinů je dnes známo velké množství a nové se stále objevují. Fykotoxiny představující signifikantní riziko pro lidské zdraví jsou předmětem tohoto sdělení.

Toxiny typu ASP (Amnesic shellfish poisons) ASP toxiny, mezi které patří kyselina domoová (DOM) a její analogy, byly identifikovány v roce 1987 ve východní Kanadě, kde se staly původcem rozsáhlé intoxikace po konzumaci slávek jedlých (Mytilus edulis) (40). Ty byly kontaminovány toxinem produkovaným rozsivkou Pseudonitzschia pungens, forma multiseries, který byl charakterizován jako trikarboxylová kyselina odvozená od aminokyseliny prolinu a nazván kyselina domoová (obr. 1). DOM je svou chemickou strukturou blízká kyselině glutamové a podobně jako tato aminokyselina náleží mezi neurotoxické excitotoxiny (56). Její struktura je však díky přítomnosti pětičlenného kruhu mnohem rigidnější a je také asi stokrát účinnější než kyselina glutamová. Váže se na NMDA-gluta-

111

mátové receptory neuronů a otevírá iontové kanály pro vápník, čímž způsobí, že vápník se dostává ve vysoké koncentraci do nervových buněk, kde stimuluje některé enzymy štěpící proteiny a produkuje velké množství volných radikálů. Výsledkem toho je narušení funkce neuronu, resp. jeho nevratné poškození (18).

Obr. 1: Chemická struktura kyseliny domoové, fykotoxinu typu ASP (Amnesic shellfish poisons)

Vazbou DOM na NMDA-glutamátové receptory, které jsou jedním ze substrátů molekulární podstaty paměti (5), je možno vysvětlit dramatický účinek tohoto excitotoxinu na paměť. V dávce 1 mg/kg vyvolává DOM amnézii u potkanů a narušuje jejich prostorovou orientaci a krátkodobou (pracovní) paměť (36). Experimenty na zvířatech jednoznačně potvrzují, že DOM je velice nebezpečným neurotoxinem (50). Symptomy otravy DOM se objevují nejdříve 30 minut a nejpozději 24 hodin po konzumaci toxických mořských živočichů, v závislosti na množství zkonzumovaného jedu. Lehká až středně těžká intoxikace se vyznačuje zvracením, průjmy, křečemi v žaludku, bolestmi hlavy, závratí, zmateností a letargií. Symptomy zpravidla odeznívají do 24 hodin po objevení se prvních příznaků. U těžkých intoxikací se navíc objevuje silná dušnost, záchvaty křečí a bezvědomí a u starších či jinak oslabených osob může nastat smrt do 48 hodin po objevení se prvních příznaků. U části intoxikovaných, kteří přežijí, se objevuje trvalá porucha krátkodobé (pracovní) paměti, připomínající Alzheimerovu chorobu. V tomto směru se intoxikace DOM liší od všech ostatních intoxikací jinými mořskými toxiny. Maximálně přípustným limitem pro DOM v rámci EU je 20 µg.kg-1.

112


Azaspiracidy (Azaspiracid poisons) Azaspiracidy (AZA) představují nové zástupce mořských fykotoxinů nalezené v roce 1995 na pobřeží Irska. Po konzumaci slávek jedlých (Mytilus edulis) vzniklé příznaky otravy nápadně připomínají intoxikaci DSP. Z masa uvedených mlžů bylo postupně izolováno 5 strukturálně podobných látek: AZA-1 až AZA-5 (obr. 2), později ještě AZA-6 až AZA 11. AZA mají unikátní chemickou strukturu složenou z osmi pěti- a šestičlenných heterocyklických kruhů, kde heteroatomem je v osmi případech kyslík a v jednom případě dusík. U myši vyvolávají AZA poškození zažívacího traktu, jater, slinivky břišní a nervového systému (24). Dlouhodobé podávání je provázeno vznikem pneumonie a rozvojem plicních tumorů (47). Satake se spolupracovníky (49) zjistil, že i. p. letální dávka AZA-1 pro myš je 200 mg.kg-1. LD50 pro myš při p. o. podání byla 500−600 mg.kg-1 (25). I. p. letální dávka pro myš byla u AZA-2 110 mg.kg-1, u AZA-3 140 mg.kg-1, u AZA-4 470 mg.kg-1 a u AZA-5 méně než 1000 mg.kg-1 (38). Chování zvířat intoxikovaných AZA je odlišné než u jiných mořských toxinů. Myši po i. p. podání AZA-1 jsou pomalé a utlumené, sedí netečně v koutě, trpí paralýzou a obtížně a těžce dýchají. Malé dávky AZA-1 usmrcují zvíře během dvou až tří dnů. Symptomy otravy AZA u lidí se projevují nauzeou, zvracením, úpornými průjmy a křečemi v žaludku, které silně připomínají průjmový typ otravy (diarrheic shellfish poisoning) (19, 39). Mechanismus toxického účinku zůstává i nadále nedostatečně objasněn (37), proto má léčení intoxikace jen symptomatický charakter. Maximálně přípustným limitem pro AZA v rámci EU je 140 µg.kg-1. Toxiny typu DSP (Diarrheic shellfish poisons) Zdrojem onemocnění jsou některé druhy obrněnek, např. Dinophysis acuminata, Prorocentrum lima aj., obsahující kyselinu okadaovou a jí příbuzné dinophysistoxiny (obr. 3), pectenotoxiny (obr. 4) a yessotoxiny (obr. 5). Ve většině případů se nejedná o chemicky jednotné látky, ale o směs strukturně blízkých sloučenin, které lze po stránce chemické charakterizovat jako cyklické polyethery (41). DSP toxiny patří k výrazným inhibitorům fosfatáz, ale zároveň inhibují esenciální serin/threoninové proteinfosfatázy, které regulují primárně metabolické procesy v eukaryotických buňkách (12).


Tímto mechanismem modulují synaptickou transmisi a působí jako neurotoxiny (51). Jejich toxický účinek na buňku je však velmi komplexní. Tím, že hyperfosforylují cytoskeletární proteiny a receptory, mohou vyvolat apoptózu. DSP toxiny vyvolávají průjmový typ otravy projevující se vedle akutního průjmu také nauzeou, zvracením, bolestmi v krajině břišní a zimomřivostí. K projevům otravy dochází během 30 minut až 3–12 hodin. Terapie otravy je pouze symptomatická. Maximálně přípustným limitem pro DSP pro kyselinu okadaovou, dynophysistoxin a pectenotoxin je 160 µg.kg-1, pro yessotoxin 1000 µg.kg-1. Toxiny typu NSP (Neurotoxic shellfish poisons) Skupinu neurotoxických fykotoxinů tvoří několik typů látek, které charakterizují rozdíly v chemické struktuře a výskyt v planktonu, ale také mechanismus toxického účinku a klinický obraz intoxikace. Mezi nejvýznamnější zástupce NSP toxinů patří brevetoxiny, ciguatoxiny, saxitoxiny a tetrodotoxin. Brevetoxiny (BrTX) Jsou cyklické polyethery produkované mořskými obrněnkami Karenia breve, resp. Gymnodium breve či Psychodiscus brevis. V současné době je známo 10 brevetoxinů dvou rozdílných typů – brevetoxiny A a brevetoxiny B (obr. 6). Jsou to polycyklické ethery s 11 (brevetoxiny A), resp. 10 kyslíkatými heterocykly (brevetoxiny B), v žádném z nich není atom dusíku. Počet dosud známých brevetoxinů určitě není konečný, lze předpokládat nalezení dalších fykotoxinů podobné chemické struktury. Brevetoxiny se kumulují v mase některých ryb a měkkýšů, a ti se pak stávají nebezpečnými pro člověka. Brevetoxiny A se vyznačují neurotoxickými a ichtyotoxickými účinky, jež jsou popisovány jako brevetoxikóza (8). K charakteristickým projevům otravy patří parestézie, závratě, bolesti v krajině břišní, svalová slabost, nejistá chůze, třes, střídavé pocity horka a chladu, bolest hlavy, svalů a kloubů, poruchy dýchání, renální problémy a otok. Pozorovány byly také známky katarální rinitidy, plicní hemoragie a edém plic, multiorgánová hemosideróza, nehnisavý zánět mozkových obalů. Příčinou jejich destruktivního účinku na přenos nervového vzruchu je otevření napěťově řízených neuronálních sodíkových kanálů.


113


R2 R1 H

HOOC O H

H OH R3

O

R4

O

H3C H

O HO

O

CH3

H

CH2

H

O O

H N

H3 C

CH3

O

H CH3

Azaspiracidy 1 až 5 Obr.2: Chemická struktura azaspiracidů 1 až 5 AZA1: R1 = H, R2 = H, R3 = CH3, R4 = H AZA2: R1 = H, R2 = CH3, R3 = CH3, R4 = H AZA3: R1 = H, R2 = H, R3 = H, R4 = H AZA4: R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = H AZA5: R1 = H, R2 = H, R3 = H, R4 = OH

CH3 OH R3 HOOC

O

O O

H3 C

OH

CH2 O

O

OR 1CH

O

O

3

OH

R CH3 2

Kyselina okadaová a dinophysistoxiny 1 až 3 Obr. 3: Chemická struktura kyseliny okadaové a dynophysistoxinů 1 až 3, fykotoxinů typu DSP (Diarrheic shellfish poisons) Kyselina okadaová: R1 = H, R2 = H, R3 = CH3 Dinophysistoxin-1: R1 = H, R2 = CH3, R3 = CH3 Dinophysistoxin-2: R1 = H, R2 = CH3, R3 = H Dinophysistoxin-3: R1 = COOCH3, R2 = CH3, R3 = CH3

114



CH3

OH

O

CH3

O 7

O

O

O

O

OH OH

CH3 O

H3C

O

O R

O O

CH3 CH3 Pectenotoxiny

Obr. 4: Chemická struktura pectenotoxinů, fykotoxinů typu DSP (Diarrheic shellfish poisons) Pectenotoxin1: R = CH2OH, konfigurace na C-7 R Pectenotoxin2: R = CH3, konfigurace na C-7 R Pectenotoxin3: R = CHO, konfigurace na C-7 R Pectenotoxin4: R = CH2OH, konfigurace na C-7 S Pectenotoxin6: R = COOH, konfigurace na C-7 R Pectenotoxin7: R = COOH, konfigurace na C-7 S

HO

CH2

H 3C

CH2

H O H H O

H H

CH3 H

H

O

NaO 3SO

H

H

H

H H O

O O H

H

O H

O H CH3

O

O

NaO 3SO

CH3 OH H

O

H

H

CH3

CH3

Yessotoxin Obr. 5: Chemická struktura yessotoxinu, fykotoxinu typu DSP (Diarrheic shellfish poisons)

V současné době je známo již více než dvacet různých derivátů této sloučeniny, které všechny řadíme do skupiny yessotoxinů.


115


HO O

O

CHO

CH3 CH3

CH3

CH3

O

O O

O

O

O

O O

O

CH2

O

CH3 CH3

CHO HO

Brevetoxin-A

CH2 O CH3 CH3 O

O

CH3 CH3

O

O

O

O O

O

O

O Brevetoxin-B

Obr. 6: Chemické vzorce brevetoxinů, fykotoxinů typu NSP (Neurotoxic shellfish poisons)

Od obou základních typů brevetoxinu A a B byly nalezeny četné deriváty.

Obdobné účinky jako brevetoxiny A mají i brevetoxiny B. Také fungují jako modulátory napěťově řízených Na+ kanálů. Všechny brevetoxiny jsou embryotoxické a teratogenní (28) a přestupují přes placentární membránu (6). Fungují také jako aktivátory histaminu a způsobují bronchokonstrikci. Aerosolizované brevetoxiny v přímořském vzduchu, jako důsledek přemnožení fytoplanktonu, mohou být odpovědné za vznik astmatu (14). Akutní toxicita brevetoxinů testovaná na myších se pohybuje v závislosti na druhu brevetoxinu a způsobu jeho podání od 94 do 6600 mg.kg-1 (4, 11). Maximálně přípustným limitem pro skupinu brevetoxinů v rámci EU je 800 µg.kg-1. Ciguatera toxiny (Ciguatoxiny, CgTX) Ciguatoxiny se vyskytují zpravidla ve svalové hmotě a ve vnitřních orgánech četných ryb, např.:

soltýn barakuda (Sphyraena barracuda), chňapal bohar (Lutjanus bohar), kanic (Epinephelus fasciatus), murény (Muraena sp.) a další, údajně asi u 400 druhů, převážně korálových ryb, které jsou za normálních okolností považovány za nezávadné a chutné. K otravě, označované jako ciguaterová forma (ciguatera), dochází nejčastěji v tropických a subtropických oblastech Indického a Tichého oceánu a rovněž v Karibském moři. Ryby zde žijící přijímají toxin s potravou, což jsou určité druhy toxigenních řas (obrněnek) a poté se stávají samy toxickými a tím nebezpečnými. Ciguaterová forma otravy není ničím převratně novým. Byla přijímána s obavou už v době prvních zámořských plavebních výprav evropských objevitelů. Představuje riziko jak pro rybářství, tak pro celý turistický ruch v mnoha přímořských zemích.

116


Otrava těmito rybami je poměrně častá u turistů, jež cestují do těchto oblastí tzv. na vlastní pěst a sami si tam připravují jídlo. Stává se, že jim rybáři prodají tyto nemocné ryby nebo si je turisté sami uloví a po pozření onemocní. Domorodci lovící v těchto oblastech znají jednoduchý test, jak zjistit, jestli je v mase ryb obsažen ciguatoxin. Odříznou kousek a vhodí ho do mraveniště. Pokud je rybí maso nezávadné, mravenci se k němu rychle seběhnou a začnou ho konzumovat. Pokud je ryba nemocná, mravenci si vůbec masa nevšimnou, naopak se od něho odtáhnou. Podle vyjádření některých odborníků dojde každý rok na světě asi k 50 000 případů této otravy (1). Ciguatoxin se tak stává postrachem rybářů v tropických oblastech jako je Havaj, Karibik, Tichomoří a Austrálie (34). Ciguatoxin patří k nejjedovatějším známým biologickým látkám. Jeho LD50 pro myš při p. o. podání je 45 µg.kg-1. Nemá vliv na vzhled, vůni ani chuť ryb a nedá se zničit tepelnou úpravou, sušením, solením, uzením či marinováním. Chemicky se jedná o cyklické polyethery s 13 pěti- až devítičlennými kruhy v molekule. Jsou známy dva typy ciguaterových toxinů (obr. 7). Strukturně blízká a toxikologicky podobná je také skupina fykotoxinů zvaná gambieroly, izolovaná z obrněnky Gambierdiscus toxicus (23). Nástup prvních příznaků onemocnění se objevuje 3 až 4 hodiny po požití toxické ryby. Dochází ke gastrointestinálním potížím, především k nevolnosti, zvracení, průjmům a abdominálním křečím. Objevují se i nervové příznaky včetně paralýzy svalů, projevující se necitlivostí, bolestí hlavy, cyanózou, brněním obličejových svalů, poruchami dýchání, které mohou vést až ke smrti postiženého. Častými příznaky bývají i kardiovaskulární potíže jako jsou bradykardie, tachykardie, arytmie a pokles tlaku. Zvláštním příznakem je odlišné vnímání pocitu tepla a chladu. Teplé je vnímáno jako studené a studené jako horké. Po několika dnech se může objevit vyrážka na kůži. Následují neurologické problémy, jež mohou trvat několik týdnů až měsíců. K úmrtí dochází zřídka, a to v důsledku deprese dechu a křečí (3). Ciguatoxin narušuje činnost sodíkové pumpy, a dochází tak ke zvýšení propustnosti buněčné membrány pro sodíkové a draslíkové ionty (16). Maximálně přípustným limitem pro ciguatoxin je dávka 0,01 µg.kg-1. Závažnost uvedených příznaků bývá variabilní a závisí na řadě faktorů. Mezi ně patří koncentrace


jedů v těle ryb, snědené množství, dále množství ciguatoxinů, které postižený již měl ve svém těle, a v neposlední řadě i lokalita, z níž ryby pocházejí. Zdá se totiž, že účinnost těchto jedů se oblast od oblasti liší. Lidé si nevytvářejí imunitu, ale naopak zvýšenou citlivost, takže opakované požití otrávených ryb mívá čím dál závažnější průběh v důsledku kumulace toxinů v organismu. Vážné případy otravy mohou trvat týdny, měsíce, dokonce i roky. Následky se mohou překvapivě podobat chronickému únavovému syndromu (43). Předpokládá se, že počet případů ciguaterových otrav bude nadále stoupat (52). Kauzální terapie není k dispozici.

Saxitoxin (STX) Saxitoxin je neurotoxin produkovaný zejména obrněnkami. Patří mezi guanidinové toxiny (obr. 8) a blokuje napěťově řízené sodíkové kanály a jeho použití v experimentu mělo zásadní vliv na poznání iontových kanálů a jejich fyziologické funkce (31). Nejedná se o jednotnou látku, ale skupinu strukturálně podobných sloučenin. Pojmenování saxitoxin je odvozeno z názvu aljašského mlže chionky skalní, Saxidomus gigantea, který se živí toxickými obrněnkami, např. Gonyaulax catenella, G. tamarensis, Gymnodium catenatum, G. breve a některými dalšími, čímž se stává jedovatým. STX lze nalézt v útrobách mnoha jiných příbuzných druhů, ale rovněž v útrobách čtverzubců. Letální dávka pro dospělou osobu se odhaduje na 0,05 mg parenterální cestou a asi 0,5 mg při podání ústy (41). Mechanismus účinku STX je vysvětlován selektivní schopností blokovat funkci napěťově řízených sodíkových kanálů v membránách vzrušivých tkání. K počátečním symptomům intoxikace se řadí pocit dřevěnění prstů, rtů a jazyka, svalová slabost, pocit žízně a bodavá bolest v konečcích prstů. Plně rozvinutá otrava bývá provázena gastrointestinálními poruchami, bolestí hlavy, poruchou motorické koordinace, vznikem paralýzy ascendentního typu. Pozoruhodné jsou změny bulbárních a kognitivních funkcí, projevující se poruchami řeči, polykání, žvýkání aj. K nejzávažnějším projevům patří útlum dýchání. Terapie otravy STX je převážně symptomatická. Paralytickou formu otravy, prakticky stejnou jako u STX, je schopen vyvolat podobně působící neosaxitoxin (48). STX je řazen mezi potenciální bojové biologické prostředky (21).


117


CH3 H

H 3C

H

H

H H O

H O

H O

H OH O

O O O H H

O

H

H H

O

CH3 OH H

R4 CH3

O H H

CH3

O O

O

R1

H

H

H

H

H

Ciguatoxin typ 1 CH3 H

H

H

H

H

O

O R1

H

O H

R4

H

H

CH3 CH3

HH O

R2

O

O

O

O

R3

O O HH

H

OH H

O

HO CHH 3 O H H O

CH3

H

H

H

Ciguatoxin typ 2

H

Obr. 7: Chemické vzorce ciguatoxinů, fykotoxinů typu NSP (Neurotoxic shellfish poisons)

_ O

NH 2 HO O

O

H N

HN HN

+

H

N

OH OH Saxitoxin

N H

O O OH

H N

H2N NH 2

N

H

H CH2OH H

HO H

H

Tetrodotoxin

Obr. 8: Chemické vzorce saxitoxinu a tetrodotoxinu, fykotoxinů typu NSP (Neurotoxic shellfish poisons)

OH

118


Tetrodotoxin (TTX) Tetrodotoxin, alternativní názvy fugutoxin, spheroidin, maculotoxin, tetraodontoxin aj., je řazen mezi guanidinové toxiny (obr. 8). TTX je extrémně toxický, vysoce letální a rychle působící neurotoxin, vyskytující se v útrobách ryb čeledi čtverzubcovitých (Tetraodontidae) a dalších příbuzných čeledí z řádu Tetraodontiformes. Ryby tohoto druhu, např. ježík (Diodon), mají schopnost v případě ohrožení se enormně nafouknout (ve skutečnosti naplnit vodou), odtud anglický název puffer fish a japonský výraz fugu, odvozený od rizikové ryby Fugu rubripes. TTX se kumuluje převážně v gonádách, játrech, mozku a v jikrách těchto ryb a v určitém ročním období je nebezpečné je konzumovat. Při kuchyňské úpravě, která je licenčně povolena jen vybraným kuchařům, je třeba velmi pečlivě odstranit zmíněné orgány. Restaurace, kde se tyto ryby připravují, jsou pod trvalou kontrolou a porušení licenčního povolení je trestáno vysokou peněžitou pokutou, popř. i vězením. V letech 1974 až 1983 bylo v Japonsku zaznamenáno 646 případů otrav rybou fugu, z nichž 179 skončilo smrtí. Přes veškerý pokrok v legislativě i medicíně jsou otravy rybou fugu pro Japonsko velkým problémem. Každoročně je hlášeno 30 až 100 otrav (41). TTX je extrémně toxická látka. LD50 pro myš při i. p. podání je pouhých 8 µg.kg-1 a při p. o. podání 30 µg.kg-1. Odhadovaná toxicita pro člověka při inhalační otravě je 2 µg.kg-1 (41). Letalita u otrav TTX je snad ze všech alimentárních intoxikací živočišnými jedy nejvyšší a podle Halsteada (17) dosahuje až 60 %. Specifická terapie otravy není známa, zdůrazňuje se význam umělého dýchání. Tetrodotoxin je řazen mezi potenciální bojové biologické prostředky (21). Pro zajímavost se lze zmínit také o „jedu zombie“ jako o reálném fenoménu kultu voodoo, neobyčejném úkazu na ostrově Haiti. Působením jedu zombie lze „přeměnit člověka v živoucí mrtvolu – zombie“. Jako zombie se označují mrtvoly, které nejsou mrtvé a na pokyn šamana vstávají ze svých hrobů. Celá záhada zombie na Haiti není nejspíš záležitostí magie, ale spíš záležitostí chemie. Za rituálem, který vytváří z lidí „živoucí mrtvoly“ a zase je pak vrací mezi živé, není zřejmě ani magie či parapsychologie, ale tetrodotoxin, možná s dalšími látkami, které jsou obsaženy v takzvaném prášku zombie,


připravovaném mimo jiné ze sušeného ježíka (Diodon hysterix) (26, 57). Smrt po požití „prášku zombie“ může být pouze zdánlivá při zachování plného vědomí, a tak nepřekvapuje, že řada obětí tohoto podivuhodného jevu byla pohřbena zaživa (2).

Ostatní dosud nezařazené fykotoxiny Fykotoxiny jako toxické látky izolované z řas a sinic, zejména mořských, jsou v přírodě velmi rozšířenou skupinou chemických substancí. Výzkumy posledních let ukázaly, že v moři žijící organismy jsou zdrojem neobyčejně zajímavých chemických látek s neméně zajímavými biologickými vlastnostmi. Vedle mořské biologie tak vznikají dva nové obory – mořská farmakologie a mořská toxikologie. Studium látek, které moře produkuje, nejenže otevírá nový pohled na životní procesy v prostředí, které zůstává pro člověka stále tou nejméně prozkoumanou částí planety, ale současně nabízí chemické látky s možným využitím, zejména v medicíně. Každoročně jsou v moři objeveny stovky takových substancí, včetně fykotoxinů. Gymnodiminy Gymnodimin (obr. 9) je fykotoxin izolovaný v roce 1994 z ústřic Tiostrea chilensis sbíraných na východním pobřeží Jižního ostrova Nového Zélandu. Po chemické stránce se jedná o unikátní spiroimin a jeho nález v často konzumovaných plodech moře byl provázen obavami, zda nemůže vyvolat masovou intoxikaci. Obavy se ještě prohloubily, když byl gymnodimin nalezen i v jiných druzích ústřic sbíraných v letech 1993−1999. Ze 217 vzorků bylo na přítomnost gymnodiminu pozitivních 155 a jeho množství se pohybovalo od 14,8 do 23 400 µg/kg. Je velmi pravděpodobné, že gymnodimin byl příčinou mnoha alimentárních otrav lidí, které byly v minulosti zaznamenány na pobřeží Nového Zélandu právě po požití ústřic. To vedlo k bližšímu zkoumání tohoto jedu. O tom, že výskyt jedu není přísně vázán jen na pobřežní vody kolem Nového Zélandu svědčí nedávný nález gymnodiminu v mořských organismech ulovených v Tunisu (7). Kromě gymnodiminu byl izolován také gymnodimin B, který obsahuje na C-17 exocyklický methylen a allylickou hydroxylovou skupinu na C-18. Gymnodimin C je stereoizomerem gymnodiminu B na C-18 (33).


CH3 H

OH

CH3

CH3 O

O

O

119


OH

CH3 N

OH

CH3 O OH

Gymnodimin N

H3C CH3 CH3

H3C OH

H

O CH3 O OH

CH3 R O

CH2 N O

H CH3

O H3C CH3

O

HO

Spirolid

O

HO OH CH3 OH CH2

O

Prorocentrolid O HO

CH3

CH3

Obr. 9: Chemická struktura gymnodiminu, prorocentrolidu a spirolidu. Spirolid B: R = H; spirolid D: R = CH3

Akutní toxicita gymnodiminu byla studována na myších a jeho LD50 při i. p. podání byla 96 µg.kg-1. Zvířata hynula do 10 minut po injekci. Orální toxicita gymnodiminu je podstatně nižší (LD50 = 755 µg.kg-1), ale i tak je to vysoká toxicita (35). Preventivní podání fyzostigminu nebo neostigminu před podáním gymnodiminu mělo za následek snížení jeho toxicity. To svědčí o tom, že toxicita gymnodiminu je zprostředkována přes nikotinové receptory na nervosvalových spojích, takže gymnodimin lze také považovat za periferní neurotoxin cholinergního typu (42). Prorocentrolid Tento fykotoxin byl izolován z řasy Prorocentrum maculosum. Ve své molekule obsahuje hexahydroizochinolinový kruh (obr. 9) a při testování toxicity na myších se ukázal jako velmi toxický a jeho letální účinek byl velmi rychlý (20).

Spirolidy Tato nová skupina lipofilních makrocyklických fykotoxinů (obr. 9) byla nalezena v řase Alexandrium ostenfeldii (10) a v roce 2005 byly spirolidy objeveny ve Španělsku v několika druzích měkkýšů (54) a byly již také hlášeny první alimentární intoxikace lidí (53). Pinnatoxiny Tvoří skupinu cyklických iminů izolovaných z ústřic Pinna muricata z oblasti Okinawy (22). Pinnatoxin A a B (pteriatoxin A a B) (obr. 10) vykazují vysokou toxicitu, LD50 pro myš při i. m. podání je 50 µg.kg-1. Polycavernosidy Polycavernosid A (obr. 10) byl poprvé izolován z ruduchy Polycavernosa tsudai v roce 1993 (58). Makroskopická rudá řasa Polycavernosa tsudai či

120



Obr. 10: Chemická struktura pinnatoxinu B a polycavernosidu A

také Gracilaria edulis je hojně konzumovaná řasa, u níž dříve nebyly pozorovány žádné zdravotní problémy. V roce 1991 se však touto řasou otrávilo na ostrově Guam 13 lidí, z nichž 3 zemřeli. Tento fykotoxin byl identifikován jako substance odpovědná za smrtelnou intoxikaci 3 lidí na Filipínách, kteří v roce 2002 zemřeli poté, co snědli další jedlou makroskopickou rudou řasu Acanthophora specifera (60). V letech 2002 až 2003 se na Filipínách otrávilo řasami Acanthophora specifera a Gracilaria edulis celkem 36 lidí, z nichž 8 zemřelo (60). Tyto záhadné smrtelné intoxikace řasami, které byly domorodci hojně konzumovány, vyvolaly paniku a vedly k urychlenému hledání toxického agens. Tak byl objeven polycavernosid A, chemicky i biochemicky zajímavá látka se strukturou glykosidického makrolaktonu. Kromě polycavernosidu A byly identifikovány další 4 analogické látky, polycavernosidy A2, A3, B a B2 (59). Toxický účinek polycavernosidů je zřejmě zprostředkován aktivací napěťově řízených Ca2+ kanálů, ale přesný mechanismus jejich účinku není znám (9). Intoxikace u lidí

začíná gastrointestinálními příznaky (zvracení, průjem) a pokračuje neurologickými poruchami (svalové křeče, paralýza). Smrt nastává do několika dnů po pozření toxinu. Toxikologické informace o polycavernosidech jsou dosud nedostatečné.

Diskuse V článku popsané kombinace příznaků, které se objevují v Evropě po konzumaci některých plodů moře, se nejčastěji prezentují jako onemocnění ASP (amnesic shellfish poisoning), AZA (azaspiracid poisoning) a DSP (diarrheic shellfish poisoning). Informační bulletin WHO „Surveillance Programme of Foodborne Infections in Europe“ uvádí za léta 1995−1998 asi 3000 případů onemocnění v Evropě po konzumaci potravy pocházející z mořských zdrojů. Psychotropní (často nazývaný také psychedelický) efekt v článku uvedených látek je charakterizován především změnou vnímání reality, např. defor-


121


macemi vnímání času a prostoru, pocitem odcizení, úzkostí, podrážděním nebo naopak útlumem, jindy euforií, vztahovačností a halucinacemi nejrůznějšího rázu a intenzity. Zdaleka ne všechny syndromy jsou spjaty s konzumací různých druhů toxigenních řas a sinic. Některé nepochybně souvisejí s konzumací jedlých mořských ryb, například surmovky rudé (red whelk poisoning). Často se otrava mořskými živočichy projevuje typickou kombinací příznaků, většinou krátkodobého trvání, což vedlo k vyslovení názoru, že vlastně jde o „histaminovou otravu“ nebo také o „pseudoalergickou reakci“ na látky s histaminovým účinkem, které vznikají při rozkladu tkání těchto živočichů (27). Nejedná se tedy v tomto případě o fykotoxiny v pravém slova smyslu. Evropská legislativa se postupně snaží zajistit kvalitu a také bezpečnost produktů pocházejících z mořských zdrojů a zároveň zakázat prodej vybraných toxických druhů, stanovit maximálně přípustné koncentrace toxinů v potravinách, zlepšit monitorování a zdokonalit kontrolní systém. Tyto kroky jsou racionální a naprosto nezbytné, neboť podle Whittle a Gallachera (55) asi 16 % všech zvířecích proteinů ročně spotřebovaných v celosvětovém měřítku pochází ze 66 milionů tun různých mořských druhů. Zhruba se to týká 75 % ryb a 25 % korýšů, resp. měkkýšů. Cílem odborníků v této oblasti je pokusit se nahradit dosud používané, ne vždy spolehlivé biologické metody na zvířatech, analytickými metodami rychlejšími, přesnějšími a specifickými, např. chromatografickými, enzymovou imunoanalýzou, hmotovou spektrometrií apod. (13, 15). Popsanou situaci si velice dobře uvědomili pracovníci Vojenského lékařského institutu v polské Gdyni, odkud vyšlé publikace se zabývají konkrétními původci a projevy onemocnění příslušníků jejich jednotek na Blízkém a Středním východě, i když jen v omezené míře jde o fykotoxiny. V oblasti nasazení vlastních jednotek je proto nezbytné provádět zdravotnický dohled, kontrolu hygienicko-epidemiologického stavu a školení v preventivní medicíně, zamezit konzumaci místních potravin, zejména mořského původu, jakož i pití vody z neprověřených zdrojů. V přiměřené míře používat prostředky individuální ochrany proti vektorům nákazy, dodržovat osobní hygienu, zabezpečit chemoprofylaxi infekčních nemocí. Po návratu z mise je třeba zhodnotit po všech stránkách účelnost a přínos mise (21, 29, 30).

Závěr V článku uvedené mořské fykotoxiny a některé další jedy obdobného charakteru jsou produkty toxigenních řas a sinic. V poslední době upoutávají zvýšenou pozornost zejména proto, že se prostřednictvím potravinového řetězce dostávají ve zvýšené míře do výrobků z mořských živočichů, a tak vyvolávají dříve prakticky neznámé formy onemocnění i v zemích, které neleží u moře. K nejzávažnějším projevům intoxikace mořskými živočichy patří především rozsáhlá poškození životně důležitých orgánů a neurotoxické projevy různé intenzity.

Literatura 1. 2. 3.

4.

5.

6. 7. 8. 9.

10.

11.

12.

13.

14. 15.

16.

ACHAIBAR, KC. – MOORE, S. – BAIN, PG. Ciguatera poisoning. Pract. Neurol., 2007, vol. 7, p. 316−322. ALBERTS, A. − MULLER, P. Psychoaktivní rostliny, houby a živočichové. Praha, Svojtka, 2000. 268 s. ISBN 80-7237-518-0. ARNETT, MV. – LIM, JT. Ciguatera fish poisoning: impact for the military health care provider. Mil. Med., 2007, vol. 172, p. 1012−1015. BADEN, DG. − MENDE, TJ. Toxicity of two toxins from the Florida red tide marine dinoflagellate, Ptychodiscus brevis. Toxicon, 1982, vol. 20, p. 457−461. BAILEY, CH. − BARTSCH, D. – KANDEL, ER. Toward a molecular definition of long-term memory storage. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, p. 3445−13452. BENSON, JM. – GOMEZ, AP. – STATOM, GL. Placental transport of brevetoxin-3 in CD-1 mice. Toxicon, 2006, vol. 48, p. 1018−1026. BIRÉ, R., et al. First evidence on occurrence of gymnodimine in clams from Tunisia. J. Nat. Toxins., 2002, vol. 11, p. 269−275. BOSSART, GD., et al. Brevetoxicosis in manatees. Toxicol. Pathol., 1998, vol. 26, p. 276−282. CAGIDE, EM., et al. Effects of a synthetic analog of polycavernoside A on human neuroblastoma cells. Cell Physiol. Biochem. 2007, vol. 19, p. 185−194. CEMBELLA, AD. – LEWIS, NI. – QUILLIAM, MA. Spirolide composition of micro-extracted pooled cells isolated from natural plankton assemblages and from cultures of the dinoflagellate Alexandrium ostenfeldii. Nat. Toxins, 1999, vol. 7, p. 197−206. DECHRAOUI, MY., et al. Ciguatoxins and brevetoxins, neurotoxic polyether compounds active on sodium channels. Toxicon, 1999, vol. 37, p. 125−143. DOUNAY, AB. – FORSYTH, CJ. Okadaic acid: the archetypal serine/threonine protein phosphatase inhibitor. Curr. Med. Chem., 2002, vol. 9, p. 1939−1980. EGMOND van, HP. Natural toxins, risks, regulations and the analytical situation in Europe. Anal. Bioanal. Chem., 2004, vol. 378, p. 1152−1160. FLEMING, LE., et al. Aerosolized red-tide toxins (breve-toxins) and asthma. Chest, 2007, vol. 131, p. 187−194. GARTHWAITE, I. Keeping shellfish to cat, a brief review of shellfish toxins, and methods for their detection. Trends Food Sci. Technol., 2000, vol. 11, p. 235−244. GHIARONI, V., et al. Effect of ciguatoxin 3C on voltage-gated Na+ and K+ currents in mouse taste cells. Chem. Senses, 2006, vol. 31, p. 673−680.

122


17. HALSTEAD, BW. Current status of marine biotoxicology – an overview. Clin. Toxicol., 1981, vol. 19, p. 1−24. 18. HRDINA, V. − HRDINA, R. − JAHODÁŘ, L. – MARTINEC, Z. − MĚRKA, V. Přírodní toxiny a jedy. Praha, Galen a Karolinum, 2004. 302 s. ISBN 80-7262-256-0 a 80-246-0823-5 19. HRDINA, V. − PATOČKA, J. − MĚRKA, V. − HRDINA, R. Azaspiracid – nový biotoxin. Voj. zdrav. Listy, 2005, roč. 74, s. 172−174. 20. HU, T., et al. Isolation and structure of prorocentrolide B, a fastacting toxin from Prorocentrum maculosum. J. Nat. Prod., 1996, vol. 59, p. 1010−1014. 21. CHOMICZEWSKI, K. Epidemiologia działan wojennych i katastrof. Warszawa, Alfa-medica Press, 2001, 256 s. ISBN 8388778021 22. CHOU, T., et al. Isolation and structure of pinnatoxin D, a new shellfish poison from the okinawan bivalve Pinna muricata. Tetrahedron Letters, 1996, vol. 37, p. 4027–4030. 23. INOUE, M., et al. Inhibition of brevetoxin binding to the voltage-gated sodium channel by gambierol and gambieric acid-A. Toxicon, 2003, vol. 41, p. 469–474. 24. ITO, E., et al. Chronic effects in mice caused by oral administration of sublethal doses of azaspiracid, a new marine toxin isolated from mussels. Toxicon, 2002, vol. 40, p. 193–203. 25. ITO, E., et al. Multiple organ damage caused by a new toxin azaspiracid isolated from mussels produced in Ireland. Toxicon, 2000, vol. 38, p. 917–930. 26. KAO, CY. – YASUMOTO, T. Tetrodotoxin in “zombie powder”. Toxicon, 1990, vol. 28, p. 129–32. 27. KERR, GW. – PARKE, TR. Scombroid poisoning – a pseudoallergic syndrome. J. R. Soc. Med., 1998, vol. 91, p. 83–84. 28. KIMM-BRINSON, KL. – RAMSDELL, JS. The red tide toxin, brevetoxin, induces embryo toxicity and developmental abnormalities. Environ. Health Perspect., 2001, vol. 109, p. 377–381. 29. KORZENIEWSKI, K. ZagroŜenia zdrowotne w klimacie gorącym na przykladzie Iraku. Lek. Wojskowy, 2005, vol. 81, p. 5–10. 30. KORZENIEWSKI, K. Zwierzęta jadowite w Afganistanie. Lek. Wojskowy, 2006, vol. 82, p. 54–59. 31. LLEWELLYN, LE. Saxitoxin, a toxic marine natural product that targets a multitude of receptors. Nat. Prod. Rep., 2006, vol. 23, p. 200–222. 32. MÁTLOVÁ, J. – KREJČÍ, V. – PATOČKA J. Toxiny sinic (cyanotoxiny) a jejich účinky na zdraví. Kontakt, 2004, roč. 6, s. 43–51. 33. MILES, CO., et al. Gymnodimine C, an isomer of gymnodimine B, from Karenia selliformis. J. Agric. Food Chem., 2003, vol. 51, p. 4838−4840. 34. MIRANDOVÁ, R. Ciguatoxin (ciguateratoxin) − postrach rybářů žijících v tropických oblastech. 30. 5. 2007, https://toxicology. .emtrading.cz/index.php?pagenum=3 35. MUNDAY, R., et al. Acute toxicity of gymnodimine to mice. Toxicon, 2004, vol. 44, p. 173–178. 36. NAKAJIMA, S. – POTVIN, JL. Neural and behavioural effects of domoic acid, an amnesic shellfish toxin, in the rat. Canad. J. Physiol., 1992, vol. 46, p. 569–581. 37. NICHOLAS, GM. – PHILLIPS, AJ. Marine natural products: synthetic aspects. Nat. Prod. Rep,. 2006, vol. 23, p. 79–99. 38. OFUJI, K., et al. Structures of azaspiracid analogs, azaspiracid-4 and azaspiracid-5, causative toxins of azaspiracid poisoning in Europe. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001, vol. 65, p. 740–742. 39. PATOČKA, J. – HRDINA, V. – MĚRKA, V. – HRDINA, R. Azaspiracid, a new marine toxin. ASA Newsletter, 2005, vol. 110, p. 16–19. 40. PATOČKA., J. Kyselina domoová, neurotoxin způsobující ztrátu krátkodobé paměti. Psychiatrie, 1999, roč. 3, s. 182–184.


41. PATOČKA, J. – STŘEDA L. Brief review of natural nonprotein neurotoxin. ASA Newsletter, 2002, vol. 89, p. 16–24. 42. PATOČKA, J. Toxikologie cholinergního fykotoxinu gymnodiminu. 29. 9. 2007 https://toxicology.emtrading.cz/modules.php?name= News&file=article&sid=134&mode=nocomments&order=0&thold=1 43. PEARN, JH. Chronic fatigue syndrome: chronic ciguatera poisoning as a differential diagnosis. Med. J. Aust., 1997, vol. 166, p. 309–310. 44. POLETTI, R. – MILANDRI, A. – POMPEI, M. Algal biotoxins of marine origin: new indications from the European Union. Vet. Res. Commun., 2003, vol. 27, Suppl. 1, p. 173–182. 45. POTERA, C. Red tide chokehold. Environ. Health Perspect., 2007, vol. 115, p. A188. 46. QUILLIAM, MA. Phycotoxins. J. AOAC Int., 1999, vol. 82, p. 773–781. 47. RALOFF, J. Dead waters. Sci. News, 2004, vol. 165, p. 360–362. 48. RODRIGUEZ-NAVARRO, AJ., et al. Neosaxitoxin as a local anesthetic: preliminary observations from a first human trial. Anesthesiology, 2007, vol. 106, p. 339–345. 49. SATAKE, M. – OFUJI, K. – NAOKI, H. et al. Azaspiracid, a new marine toxin having unique spiro ring assemblies, isolated from Irish mussels. J. Am. Chem. Soc., 1998, vol. 120, p. 9967–9968. 50. SLIKKER, W. – SCALLET, AC. – GAYLOR, DW. Biologically-based dose-response model for neurotoxicity risk assessment. Toxicol. Lett., 1998, vol. 102–103, p. 429–433. 51. TAPIA, R. – PENA, F. – ARIAS, C. Neurotoxic and synaptic effects of okadaic acid, an inhibitor of protein phosphatases. Neurochem. Res., 1999, vol. 24, p. 1423–1430. 52. TING, JY. – BROWN, AF. Ciguatera poisoning: a global issue with common management problems. Eur. J. Emerg. Med., 2001, vol. 8, p. 295–300. 53. VILLAR-GONZÁLES, A., et al. First evidence of spirolides in Spanish shellfish. Toxicon, 2006, vol. 48, p. 1068–1074. 54. VILLAR-GONZÁLES, A., et al. Lipophilic toxin profile in Galicia (Spain): 2005 toxic episode. Toxicon, 2007, vol. 49, p. 1129–1134. 55. WHITTLE, K. – GALLACHER, S. Marine toxins. Brit. Med. Bull., 2000, vol. 56, p. 236–253. 56. XI, D. – RAMSDELL, JS. Glutamate receptors and calcium entry mechanisms for domoic acid in hippocampal neurons. NeuroReport, 1996, vol. 7, p. 1115–1120. 57. YASUMOTO, T. – KAO, CY. Tetrodotoxin and the Haitian zombie. Toxicon 1986, vol. 24, p. 747–749. 58. YOTSU-YAMASHITA, M. – HADDOCK, RL. – YASUMOTO, T. Polycavernoside A: A novel glycosidic macrolide from the red alga Polycavernosa tsudai (Gracilaria edulis). J. Am. Chem. Soc., 1993, vol. 115, p. 1147–1148. 59. YOTSU-YAMASHITA, M., et al. Four new analogs of polycavernoside A. Tetrahedron Letters, 1995, vol. 36, p. 5563–5566. 60. YOTSU-YAMASHITA, M., et al. Identification of polycavernoside A as the causative agent of the fatal food poisoning resulting from ingestion of the red alga Gracilaria edulis in the Philippines. Chem. Res. Toxicol., 2004, vol. 17, p. 1265–1271.

Korespondence: Prof. MUDr. Vratislav Hrdina, CSc. Horova 1193 500 02 Hradec Králové Do redakce došlo 20. 11. 2007


123


Dopis redakce autorům příspěvků a čtenářům Vojenských zdravotnických listů Vážené kolegyně, vážení kolegové, v tomto čísle Vojenských zdravotnických listů je již uvedeno nové složení redakční rady. Je to jeden z prvních kroků v řadě přijatých opatření, která by měla sloužit k tomu, aby náš nejstarší vojensko-odborný časopis, vydávaný od roku 1925, naplnil zásady požadované Radou vlády pro výzkum a vývoj ke splnění kritérií pro zařazení na Seznam recenzovaných neimpaktovaných periodik v České republice. Věříme, že společným úsilím redakce, redakční rady, recenzentů a autorů původních vědeckých a odborných příspěvků se nám to v co nejkratším čase podaří. Zařazení našeho časopisu na výše uvedený seznam umožní autorům příspěvků z řad vojenské, ale také civilní zdravotnické veřejnosti vykázat tyto publikace pro potřeby bodového hodnocení výsledků výzkumu a vývoje za účelem hodnocení efektivity výzkumu a vývoje podporovaného ze státního rozpočtu. Vojenské zdravotnické listy zůstanou i nadále celostátním odborným časopisem vojenských lékařů, farmaceutů a veterinárních lékařů a také civilních zaměstnanců, kteří působí ve vojenské zdravotnické službě, ve složkách integrovaného záchranného systému, dále také pro zájemce z řad zdravotnické veřejnosti, zejména v rámci vědecko-výzkumné spolupráce s Fakultou vojenského zdravotnictví Univerzity obrany. Časopis by měl být i v budoucnosti důležitým a nezastupitelným informačním zdrojem a významnou platformou pro diskusi o aktuálních problémech vojenského zdravotnictví v návaznosti na pokroky v medicíně a vývoje v oblasti vojenství. Vojenské zdravotnické listy budou informovat zejména o výsledcích vědecké práce v podmínkách vojenského zdravotnictví, přinášet výsledky z preventivní, diagnostické a léčebné činnosti a v neposlední řadě budou také informovat o zkušenostech z praktické činnosti zdravotnické služby Armády České republiky jak v podmínkách mírové služby, tak ze stále častějšího působení v bojových podmínkách zahraničních misí. Náš časopis tak bude plnit i významnou úlohu informačního zdroje na poli mezinárodní spolupráce v oblasti vojenské medicíny, urgentní medicíny a medicíny katastrof. Prof. MUDr. Josef Fusek, DrSc.

124



POKYNY PRO AUTORY publikující ve Vojenských zdravotnických listech 1. Ve Vojenských zdravotnických listech (VZL) je možno publikovat původní práce ze všech lékařských oborů, farmacie a veterinárního lékařství a další práce (recenze, zprávy ze zahraničních stáží apod.) s hlavním zaměřením do oblasti vojenského zdravotnictví. Původní práce procházejí recenzním řízením. 2. Redakce přijímá práce v jazyce českém a slovenském, příspěvky do suplement VZL v jazyce anglickém. Zahraniční autoři mohou své práce publikovat v angličtině, němčině a francouzštině. S obsahem VZL i suplement je možno se seznámit na webových stránkách http://www.pmfhk.cz. 3. Optimální je práci zaslat do redakce na disketě v textovém editoru MS Word pro Windows s přiloženým vytištěným textem. Grafy vytvářejte v MS Excel. Příspěvky lze rovněž zasílat elektronickou poštou na adresu: [email protected]. Také v tomto případě je nutno současně zaslat vytištěný text. 4. Rozsah práce má být úměrný tématu: u závažnějších sdělení 8−10 rukopisných stran (včetně dokumentace a literatury), u kazuistik, méně závažných sdělení a referátů 4−5 stran, u recenzí knih 2 strany. 5. Všechny veličiny uvedené v práci vyjadřujte v platných jednotkách měrové soustavy SI. 6. Na levém okraji rukopisné stránky vyznačte obdélníčkem s číslem místo, kde mají být v textu umístěny grafy, fotografie, tabulky apod. Grafy a nárysy, které nejsou zpracovány na počítači, proveďte černou tuší (i text) na bílý kladívkový papír nebo oleát. Uveďte přibližnou velikost reprodukce. Obrázky a fotografie podepište a očíslujte na zadní straně, nepodlepujte je. Legendu k obrázkům a grafům dodejte na samostatném listu (platí i pro grafy a obrázky dodané na disketě). Fotografie, které dodáte na disketě nebo elektronickou poštou, nevkládejte do textu, ale uložte je samostatně v původním formátu (.jpg, .tif, .bmp). 7. Odkazy na literaturu uvádějte v textu číslem v kulaté závorce. Abecedně řazený číslovaný seznam použité literatury uvádějte na konci textu. Citace musí odpovídat ČSN ISO 690 (01 0197) „Bibliografické citace“. V bibliografii uvádějte jen práce citované v článku. Doporučený maximální rozsah literárních citací je 30. 8. K práci připojte výstižný souhrn (150−200 slov) v češtině, pokud možno také v angličtině. Na konci práce uveďte klíčová slova (4−6). 9. V práci zachovávejte zásady ochrany utajovaných skutečností. Za obsah článku odpovídá autor. 10. V rukopisu uveďte přesnou adresu svého pracoviště (včetně telefonu a e-mailu) a kontaktní adresu, na kterou vám mají být zaslány autorské korektury, popř. honorář. Kontaktní adresa bude uveřejněna na konci publikované práce. Adresu bydliště uveďte na konci článku. U jména uvádějte hodnost a tituly. 11. Práce musí obsahovat čestné prohlášení autora, resp. prvního ze spoluautorů, že nebyla již publikována ani zaslána ke zveřejnění do jiného časopisu. Práce, které již byly publikovány v jiných časopisech, přijímá redakce k otištění pouze s písemným souhlasem původního vydavatele. 12. Práce publikované ve VZL mohou být otištěny v jiném časopise pouze po předchozím písemném souhlasu redakce VZL.

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

Recommend Documents