VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIV

DUBEN 2005

ČÍSLO 2

OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY − METODOLOGIE PROFESNÍCH TESTŮ PRO POTŘEBY ARMÁDY ČESKÉ REPUBLIKY 1

Pplk. MUDr. Miloš SOKOL, 2prof. MUDr. Josef FUSEK, DrSc., 3plk. MUDr. Petr NAVRÁTIL 1 Vojenský ústav soudního lékařství Ústřední vojenské nemocnice, Praha 2 Univerzita obrany, katedra vojenské toxikologie Fakulty vojenského zdravotnictví v Hradci Králové 3 Odbor vojenského zdravotnictví Sekce podpory Ministerstva obrany ČR, Praha

Souhrn Autoři příspěvku předkládají přehled testování drog (omamných a psychotropních látek) v některých armádách NATO (tzv. profesní testy), analýzu současného stavu této problematiky v České republice a především návrh metodologie testování vypracovanou pro potřeby Armády České republiky, včetně nutných legislativních a praktických kroků k zahájení profesního testování v AČR. Klíčová slova: Drogy; Omamné a psychotropní látky; Toxikologická analýza; Profesní testování; Chain of custody; NATO.

Narcotic and Psychotropic Substances − Methodology of Professional Tests for Czech Army Needs Summary The authors of this article present a drug testing survey carried out in some of the NATO armies (professional tests) and the analysis of the present status of this problem in the Czech Republic. Above all, they present a testing methodology proposal elaborated for Czech Army needs, including legislative and practical steps which should be performed to begin the professional testing in the Czech Army. Key words: Drugs; Narcotic and psychotropic substances; Toxicological analysis; Professional testing; Chain of custody; NATO.

I. Úvod V podmínkách budování profesionální Armády České republiky (AČR) je vedle požadované odborné kvalifikace uchazeče o službu v armádě i stálého stavu důležitým faktorem velmi dobrý zdravotní stav (psychický i fyzický). Je jistě nežádoucí, aby do AČR vstupovaly osoby se skrytým abúzem omamných a psychotropních látek (dále jen OPL), případně měly tendenci experimentovat s těmito látkami. Kontrola vojáků z povolání nebo studentů vojenských škol, zda nezneužívají v průběhu služebního zařazení OPL,

je implikována do kontrolních mechanismů řady vyspělých armád NATO. Vysoké nároky na povolání v ozbrojených složkách, účast v zahraničních misích s odloučením od rodiny, případně stresové situace při výkonu náročných funkcí a také problémy v určitých životních obdobích mohou vést u některých jedinců k abúzu alkoholu či drog. Dostupnost a úroveň „cen“ OPL v ČR je stále relativně příznivá (14). Příslušníci AČR nejsou separovanou komunitou bez úzkého spojení s civilním sektorem, hrozba průniku drogově závislých nebo osob experimentujících je více než reálná.

50

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

II. Význam testování Rozborem dostupné literatury a na základě kontaktů se zástupci některých armád NATO lze uvést, že z důvodů rozšiřování abúzu drog byly aplikovány různé programy prevence abúzu alkoholu a drog, s kontrolními laboratorními mechanismy depistáže osob s problematickým užíváním alkoholu a nealkoholových drog (9, 10). V sedmdesátých až osmdesátých letech dvacátého století nabyl problém konzumace drog v USA celonárodního měřítka. Z toho důvodu bylo nutné přikročit k řešení. V roce 1986 prezident USA podepsal zákonné opatření číslo 12564, kterým se nařizovalo federálním zaměstnancům vyvarovat se drog v zaměstnání i mimo něj jako podmínka zaměstnaneckého vztahu. Dne 11. 7. 1988 byla kongresem USA schválena závazná legislativa k zajištění důvěryhodných a přesných výsledků testů na drogy, o přístupu zaměstnanců k výsledkům testů a vládou organizovaného centralizovaného dozoru nad testováním. Ministerstvo zdravotnictví USA pověřilo Národní institut proti zneužívání drog (NIDA) vypracováním závazných postupů testování a stanovení přípustných koncentrací jednotlivých látek. Původní propozice NIDA, poprvé publikované v dubnu 1988, v poněkud pozměněné podobě převzalo i Ministerstvo obrany USA v Direktivě číslo 1010.1. Prvními testovanými látkami byly marihuana (THC), kokain, opiáty, amfetaminy a phencyklidin (PCP). U jednotek armády USA rozmístěných v Evropě byl aplikován program ADAPCP (The Alcohol and Drug Abuse Prevention and Control Program) zaměřený na alkohol a drogy. Každý voják je vyšetřován minimálně jedenkrát ročně. Testy jsou zaměřeny obligatorně na cannabis a dvě náhodně vybrané drogy z menu: kokain, opiáty, amfetaminy, LSD, PCP, barbituráty. Díky testování se problém drog v armádě USA z počátku 80. let 20. století podařilo minimalizovat jak na území USA, tak i u jednotek dislokovaných v Evropě. Z evropských armád je nám známo, že určité formy testování zahájily v průběhu 90. let 20. století například Velká Británie, Francie, Belgie a Německo. Přes národní a resortní legislativu nedošlo do současné doby k prosazení testování na úrovni normativy STANAG. Jaká je situace v civilním sektoru? Analogem je tzv. Workplace Drug Testing, označovaný jako tzv. „profesní testování“, které je užíváno v některých

ROČNÍK LXXIV, 2005, č. 2

zemích například u státních zaměstnanců, v letectví, u větších firem apod. (1, 2, 6, 7, 15). V České republice byly dosud prováděny jednotlivé studie a projekty spojené s odběry biologického materiálu, avšak vždy anonymně. O jednom z jednorázových projektů referoval Šaroch (11). Na základě laboratorního testování bylo zjištěno u zaměstnanců jednoho velkého průmyslového podniku 5,6 % pozitivních výsledků. Soustavné profesní testování však zahájil až resort Ministerstva vnitra (XII/2003). Na základě resortní legislativy (Vyhláška MV ČR č. 287/2002 Sb.) jsou vyžadovány laboratorní testy zaměřené na tři skupiny OPL u uchazečů k přijetí do služebního poměru u Policie ČR a Hasičského záchranného sboru (4). Snahou vojenských odborníků, paradoxně především zdravotnických pracovníků, je prosadit obdobné nařízení i v resortu Ministerstva obrany ČR. Do současné doby jsou prováděny epidemiologické, respektive laboratorně-epidemiologické anonymní studie v rámci projektů prevence nebo projektů obranného výzkumu. III. Současná situace v AČR Drogová problematika v AČR je řešena komplexně v rámci prevence sociálně nežádoucích (dříve patologických) jevů v gesci sekce personalistiky MO. Zdravotnická služba AČR garantuje sběr a hodnocení údajů cestou několika programů − DROGIS, LABIS, EDIS a DROGLAB. Získané údaje za resort MO jsou poskytovány do celonárodní databáze. Jednalo se především o epidemiologické programy mapující situaci u vojáků základní služby, studentů vojenských škol a vojáky z povolání. V rámci schválené Koncepce prevence sociálně nežádoucích jevů (P − SNJ) na roky 2005−2009 se předpokládá redukce a spojení některých programů, které by odrážely současné potřeby profesionální armády (5). Forenzní toxikologické analýzy jsou prováděny v současné době ve Vojenském ústavu soudního lékařství (VÚSL) ÚVN. Jedná se o analýzy vzorků podle požadavků Vojenské policie, zaslanou lékaři posádkových ošetřoven, z klinických pracovišť ÚVN a ze sekčního materiálu VÚSL. Určitá část vzorků z terénu je vyšetřována v civilním sektoru, což přináší centrální únik dat a vynakládání dalších finančních prostředků. Toxikologická laboratoř Ústavu leteckého zdravotnictví ve spolupráci s VÚSL zpracovala v minu-


51


losti několik projektů obranného výzkumu a výzkumných institucionálních úkolů řešících komplexně problematiku laboratorního testování drog. Odběry vzorků v rámci studií musely být prováděny anonymním způsobem, přesto výstupy projektů pomohly připravit pracoviště k přechodu k praktickému a plošnému testování (9, 10). V Armádě ČR je dosud platný Rozkaz MO č. 1/1998, který řeší poněkud okrajově testování drog. V současné době (počátek roku 2005) je ve stadiu připomínkového řízení návrh nového rozkazu, vycházejícího z nové koncepce P − SNJ. Naší snahou je navrhnout a inkorporovat laboratorní testování u příslušníků AČR, respektive alespoň u žadatelů k přijetí do vojenských škol a do služebního poměru. Do výše citované legislativní normy bylo navrženo znění: „Vyšetření na přítomnost návykové látky (OPL) se provádí analýzou tělních tekutin, zejména moči a krve, případně i jiných struktur (např. vlasy), odebraných oprávněnou a školenou osobou. Vlastní detekce je prováděna výhradně laboratorním testováním.“ IV. Metodologie testování Profesní testování má jednoznačná a přísná pravidla, jejichž cílem je zabránit vydání falešně pozitivního nebo falešně negativního výsledku. Oba případy mohou mít značné sociální, politické, ekonomické a právní následky. Správné testování musí být detailně propracováno, schváleno a zveřejněno (legislativní norma, odborná norma). Průběh vyšetření od odběru až po vydání výsledku má logické kroky s kontrolními mechanismy, označované jako Chain of Custody (2, 3, 6, 7, 8, 12, 13). Prvním krokem je oprávněné nařízení a podrobení se odběru. Následuje kontrola identity jedince, vlastní odběr pod kontrolou osoby stejného pohlaví, jednoduché testy ke zjištění pravosti vzorku, příp. vyloučení nežádoucí manipulace se vzorkem. Po zaprotokolování údajů do listinné formy a označení vzorků je tento transportován oprávněnou osobou do laboratoře. Zde je zkontrolována neporušenost vzorku a jsou porovnány údaje na štítku odběrové nádoby a průvodky. Poté následuje dvoustupňová nezávislá přístrojová analýza. Nejprve jsou analyzovány jednotlivé skupiny OPL imunochemickou metodou. Vzorky s nadlimitním výsledkem jsou podrobeny druhé, konfirmační, vysoce specifické metodě (obvykle GC/MS) (1, 15). Po vyhodnocení potřeb-

ných laboratorních vyšetření jsou výsledky zaznamenány a odeslány nařizovateli odběrů. Po dohodnutou dobu jsou vzorky skladovány ve zmrazené formě pro případ vyžádané reanalýzy. Laboratoř musí disponovat zkušeným a proškoleným personálem, kvalitní zdravotnickou technikou a dobrou organizací práce. Veškeré postupy jsou prováděny na úrovni správné laboratorní praxe, se všemi kontrolními mechanismy. Je obvykle požadována externí kontrola kvality laboratoře (1, 12, 15). V. Diskuse, návrh opatření Pro potřeby profesionální AČR na základě analýzy současných tabulkových počtů a dislokace posádek je podle našeho názoru potřebné jedno resortní, centrální, akreditované, forenzně toxikologické pracoviště vybavené personálně a materiálně, které by bylo zárukou provádění analýz lege artis. Výsledky vyšetření z takového pracoviště jsou právně nezpochybnitelné. Před zahájením testování je v první řadě nutné rozhodnout o celkových počtech vyšetřených osob. Jedná se o politicko-ekonomické rozhodnutí − zda podrobit testování jen uchazeče, dále některé vybrané profese (ČVO) nebo celou armádu, příp. v jakých periodách. V neposlední řadě stanovit postup při pozitivitě výsledků. V případě uchazečů je zastaveno přijímací řízení. U vojáků v činné službě je situace složitější, vyžaduje podrobnou personální a právní analýzu. Právně důležitým prvkem před započetím testování je zpracování kvalitního „poučení“ osoby, která je podrobena odběru. V poučení je potřebné provést pochopitelný a jednoznačný právní rozbor nařízení testování, s následky pro daného jedince jak v případech odmítnutí, tak i při pozitivitě výsledku. Velmi důležitým faktorem je správné provádění odběrů biologického materiálu, které je však možné deklarovat na vojsková zdravotnická zařízení (větší POŠ) a na vojenské nemocnice. K realizaci správného provádění odběrů je nutné odborné zaškolení zdravotnického personálu a vybavení příslušným zdravotnickým materiálem. Výhodou pro činnost zdravotnických pracovníků je fakt, že nařizovatel odběrů (velitel, vojenský policista) musí zabezpečit administrativně kontrolní mechanismus a transport vzorků. U profesních testů je obvyklé přidělení kódového označení (čísla) každé vyšetřované osobě. Vzorek „putuje“ z místa odběru přes laboratorní analý-

52


zu až k odevzdání výsledku pod tímto kódem. Rozkódování provádí odpovědná osoba, kterou je jedině nařizovatel odběru. Propojení míst odběru vzorků a toxikologické laboratoře zajišťují transportní systémy, které musí být pravidelné, spolehlivé a vybavené potřebnou technikou k uchovávání stabilních podmínek. Systém byl např. dobře rozpracován v resortu MV, kdy automobilovým kurýrem, vybaveným elektrickými převozovými chladicími boxy, je prováděn denní svoz biologického materiálu, při spojení všech jednotlivých krajských zdravotnických pracovišť. Vhodná volba skupin OPL, které budou podléhat sledování, a stanovení CUT OFF limitů je nejtěžším úkolem. Závisí nejen na odborném pohledu, ale rovněž na ekonomických možnostech resortu. Na výši CUT OFF hodnot závisí možný počet falešně negativních výsledků a množství konfirmací screeningem zachycených vzorků. Obvykle sledované skupiny OPL jsou opiáty, cannabinoidy a budivé aminy (amfetamin, metamfetaminy). Na základě epidemiologických dat získaných v AČR je nutné zvažovat rovněž testování na přítomnost kokainu (5).

Literatura 1. 2.

3.

4. 5. 6. 7. 8.

9.

10.

VI. Závěr Autoři navrhují provádění vstupních laboratorních toxikologických vyšetření u všech žadatelů do služebního poměru a studentů vojenských škol zaměřené na 3−4 skupiny OPL. Podle ekonomických možností by bylo vhodné provádět rovněž namátkové testy u všech vojáků v cyklu 1−3 roky se stejnými skupinami látek. Minimálně je však nutné testovat osoby před nástupem do zahraniční mise a po návratu. Pro potřeby testování je zapotřebí provést úpravy v resortní legislativě, vydat odbornou směrnici o způsobu provádění testování v AČR, včetně navržení CUT OFF limitů. Dále odborně vyškolit personál zdravotnických zařízení provádějící odběry, zabezpečit svoz vzorků a ustanovit centrální resortní toxikologické pracoviště oprávněné provádět analýzy a vydávat výsledky. Na základě výše ekonomické podpory rozhodnout o rozsahu a periodicitě testování v AČR.


11.

12.

13. 14.

15.

BALÍKOVÁ, M. Vývojové trendy toxikologických vyšetření. Soud. Lék., 2004, roč. 49, č. 1, s. 7−10. BENSINGER, PB. A Practical Approach to Drugs in the Workplace. Excerpts from Behavioral Sciences and the Law, 1985, vol. 3, no. 4, p. 441−453. DRUMMER, OH. − LEWIS, JH. Proficiency Programs and Accreditation in Forensic Toxicology: The Australian Experience. In Programme and Abstracts, p. 105. 39th Annual International Meeting TIAFT, Prague, 2001. DURIŠ, P. Návykové látky a policie. Bulletin NPC, 2004, roč. 10, č. 4, s. 38−39. Koncepce prevence sociálně nežádoucích jevů na období 2005−2009. Ministerstvo obrany ČR, 2005. Manual on Prevention of Problematic Use of Substances in the Aviation Workplace. Doc. 9654-AN/945, ICAO. 1995. QUAY, CS. Drug and Alcohol Testing. Aviat. Space Environ. Med., 1996, vol. 67, no. 4, p. 391−392. Recommend Methods for the Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Metamphetamine and Ring- Substituted Amphetamine Derivates. Manual for Use by National Laboratories. United Nations, 1995. 88 p. SOKOL, M. − FUSEK, J. − BAJGAR, J., et al. Pilotní studie laboratorního testování příslušníků AČR na návykové látky (drogy). Publikace č. 392. Praha, Ústav leteckého zdravotnictví, 1999. 123 s. SOKOL, M. − STŘÍBRNÝ, J. Průkaz omamných a psychotropních látek (drog) metodou hmotnostní spektrometrie. Publikace č. 399. Praha, Ústav leteckého zdravotnictví, 2001. 60 s. ŠAROCH, V. Nealkoholová toxikomanie v pracovním procesu. In Sborník ze semináře grantového úkolu G-004. Praha, Policejní akademie, 2002, s. 99−102. United Kingdom Laboratory Guidelines for Legally Defensible Workplace Drug Testing. Version 1,0. Publ. in http: //www. londontox.org.uk/wdtge.pdf Urinanalysis Coordinator Handbook, 5350.4A, Sept. 1988, 27 p. VANĚČEK, M. Prevalence a incidence léčených uživatelů drog a kategorizace drog − I. pololetí 2004. Bulletin NPC, 2004, roč. 10, č. 4, s. 40−44. WENNING, R. Drugs and Driving Problems in Europe. In Toxicological Workshop EMCDDA, Praha, 2002.

Korespondence: Pplk. MUDr. Miloš Sokol Vojenský ústav soudního lékařství Ústřední vojenská nemocnice U Vojenské nemocnice 1200 169 02 Praha 6 e-mail: [email protected] Do redakce došlo 22. 2. 2005


53


KYSELINA DOMOOVÁ, NEBEZPEČNÝ NEUROTOXIN Plk. v zál. prof. MUDr. Vratislav HRDINA, CSc, 1,2prof. RNDr. Jiří PATOČKA, DrSc., plk. v zál. doc. RNDr. Vladimír MĚRKA, CSc., 3doc. MUDr. Radomír HRDINA, CSc. 1 Univerzita obrany, katedra toxikologie Fakulty vojenského zdravotnictví v Hradci Králové 2 Jihočeská univerzita, katedra radiologie a toxikologie Zdravotně sociální fakulty, České Budějovice 3 Univerzita Karlova, katedra farmakologie a toxikologie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové

Souhrn Kyselina domoová, aminokyselina produkovaná některými mikroskopickými organismy mořského planktonu, je příčinou toxicity některých mořských živočichů, zejména korýšů a měkkýšů. Jejich konzumace je příčinou kuriózních otrav doprovázených neurodegenerací a dysfunkcí CNS a v mnoha případech také ztrátou recentní (krátkodobé) paměti, což vede ke snížené nebo zcela vymizelé schopnosti osvojovat si a vybavovat nové poznatky. V práci jsou uvedeny základní informace o tomto podivuhodném mořském excitotoxinu. Klíčová slova: Kyselina domoová; Neurotoxin; Excitotoxin; Excitační aminokyselina; Intoxikace spojená s amnézií (ASP); NMDA-glutamátový receptor.

Domoic Acid − A Dangerous Neurotoxin Summary Domoic acid, an amino acid produced by some microscopic algae and diatoms from the sea phytoplankton, causes toxicity in some sea animals, especially shellfish. Their consumption can cause curious intoxications combined with neurodegeneration and central nervous system dysfunction. In many cases a loss of recent memory occurs. It means a reduced capability or an absolute inability to remember new knowledge. Our study presents basic information on this strange excitotoxin. Key words: Domoic acid; Neurotoxin; Excitotoxin; Excitatory amino acid; Amnesic shellfish poisoning (ASP); NMDA-glutamic receptor.

Úvod Intoxikace lidí způsobené konzumací mořských živočichů, zejména korýšů, měkkýšů a ryb, jsou v přímořských oblastech poměrně časté a nejednou končí smrtí. Příčinou těchto alimentárních otrav jsou toxiny, které však nejsou produkovány samotnými živočichy, ale dostávají se do jejich organismu cestou potravních řetězců, zejména s různými mikroorganismy tvořícími mořský plankton, aniž by jim škodily. Takovýchto mořských toxinů je dnes známo velké množství a nové jsou stále objevovány. U lidí způsobují několik různých typů otrav, ale ohroženi jsou jimi i mořští savci. Mnohé mořské toxiny patří mezi nejtoxičtější známé jedy. Jejich přítomnost v mořských živočiších je však nepravidelná a často obtížně předvídatelná, což i přes jejich soustavný monitoring občas vede k hromadným otravám lidí a zvířat (10). Mořské toxiny a otravy jimi způsobené jsou především předmětem zájmu hygieniků, toxikologů,

toxinologů, ekotoxikologů a odborníků obdobného zaměření. Existuje však jeden typ otravy, který je zajímavý hlavně pro neurology a psychiatry (36, 37). Je totiž doprovázen neurologickými poruchami, halucinacemi, časovou a prostorovou dezorientací a nápadným zhoršením krátkodobé paměti připomínajícím některé neurodegenerativní nemoci, jako je např. Alzheimerova choroba. Tento druh otravy je v anglosaské literatuře označován jako „Amnesic Shellfish Poisoning“ (ASP) (21). Toxinem zodpovědným za ASP-syndrom je neobvyklá aminokyselina, kyselina domoová, které je věnován tento článek. Historie ASP Do podvědomí veřejnosti vstoupil ASP-syndrom v roce 1987, kdy došlo k intoxikaci více než 250 lidí po konzumaci slávky jedlé zvané též modrá (Mytilus edulis L.) v jedné restauraci v Zálivu svatého Vavřince v Kanadě (40, 41). Příznaky intoxi-

54


kace se objevily u 107 obětí. Nejčastějšími symptomy bylo zvracení (76 %), žaludeční křeče (50 %), průjem (42 %), bolesti hlavy a ztráta krátkodobé paměti (25 %). Devatenáct obětí otravy muselo být hospitalizováno, dvanáct z nich bylo ve velmi těžkém stavu a tři zemřeli (40). Tragickým projevem intoxikace byly poruchy paměti u přeživších pacientů. Nepamatovali si téměř nic, co se stalo po intoxikaci. Někteří nepoznávali své dřívější známé a příbuzné. U některých se projevila konfabulace, kdy pacienti líčili neskutečné události, kterými se snažili zaplnit mezery v paměti. Narušení krátkodobé paměti bylo dlouhodobé, trvalo i několik let a u 12 pacientů nabylo trvalého charakteru (55). Takový amnestický syndrom vyvolaný alimentární otravou nebyl nikdy předtím pozorován, proto nepřekvapuje, že do pátrání po původu a identifikaci toxinu s tak pozoruhodným biologickým účinkem bylo postupně zapojeno mnoho mořských biologů, chemiků a toxikologů. Jejich práce nebyla snadná, ale nakonec se jim podařilo původce této tajuplné intoxikace identifikovat. Byla jím trikarboxylová aminokyselina, známá již z dřívějška jako kyselina domoová (DOM). Bylo zjištěno, že tento neurotoxin se kumuluje ve slinivko-jaterních žlázách, žábrech a tzv. sifonu a jeho zdrojem je řasa Nitzschia pungens, kterou byly žaludky slávek modrých přeplněny. Tato řasa byla nalezena jako zdroj potravy také u některých dalších mořských živočichů, např. krabů (9). Zdroj toxinu Hlavním zdrojem DOM je mikroskopická žlutohnědě zbarvená rozsivka Pseudonitzschia multiseries, syn. Nitzschia pungens var. multiseries (Bacillariphyceae, Diatomae), ale i některé další, např. P. pseudodelicatissima, které jsou pravidelnou součástí volně plovoucího mořského fytoplanktonu (1, 51). Pozn.: Rozsivky jsou jednobuněčné řasy žijící samostatně nebo v koloniích. Jejich buňka je uzavřená do dvoudílné buněčné stěny, frustuly, která má tvar kruhové krabičky s paprsčitou souměrností (centrické rozsivky), nebo se podobá podlouhlé krabičce s bilaterální souměrností (penátní rozsivky). Hlavním stavebním materiálem frustuly je vodnatý polymer oxidu křemičitého. Vnější i vnitřní povrch frustuly pokrývá ochranná polysacharidová vrstva, diatotepin. Chloroplasty olivově hnědé barvy obsahují chlorofyly a + c, z dalších pigmentů je přítomen fukoxanthin. Zásobní látky chrysolaminaran, olej a volutin jsou uloženy v plazmě nebo ve vakuolách. Buňky rozsivek obsahují jediné diploidní jádro. Vegetativní buňky jsou vždy bez bičíků. Rozsivky se


rozmnožují dělením, při kterém vznikají dvě buňky dceřiné. Mechanismus dělení vede k postupnému zmenšování rozměru buňky. Původní rozměry se obnoví v procesu pohlavního zrání. U centrických rozsivek je pohlavní proces oogamický, u penátních druhů je izogamický. Zygota ihned po svém vzniku aktivně roste a její konečná velikost značně převyšuje rozměr rodičovských buněk. Rozsivky jsou jedinou skupinou organismů závislých na přítomnosti rozpustných forem oxidu křemičitého v jejich životním prostředí. Po vyčerpání zdrojů křemíku se zastaví replikace DNA. Přes jejich nepatrné rozměry tvoří jejich biomasa až 25 % celkové biomasy produkované rostlinami.

Rozsivky, ale také jiné mikroskopické organismy tvořící plankton (37), např. ruduchy (Rhodophyta), konkrétně Chondria armata (11), produkují DOM. Extrakty z ruduch jsou již po staletí využívány v Japonsku pro své anthelmintické účinky a DOM v nich byla nalezena již dříve (53). Až do roku 1990 však nikdo netušil, jaké další biologické účinky tato substance má a jak může být nebezpečná (40). Mořští živočichové živící se planktonem, zejména bezobratlí, jsou k účinku DOM odolní, ale jejich maso se stává toxické pro savce, včetně člověka (29, 52, 55). Kontaminace mořských bezobratlých rozsivkami Pseudonitzschia (P. australis, P. delicatissima, P. multiseries aj.) byla zjištěna také např. na Novém Zélandu (44), v Irsku (15), v Mexiku (46) i jinde. Japonští badatelé zjišťovali hladiny DOM v zálivu Ofunato, v podmínkách srovnatelných s kanadskými údaji, ale ze 44 vzorků rozsivek rodu Pseudonitzschia nalezli tento neurotoxin pouze v jediném (24). O tom, že DOM může být nebezpečným jedem nejen pro člověka, ale i pro některé mořské živočichy, svědčí např. masový úhyn lvounů kalifornských (Zolophus californianus) v květnu roku 1998 na západním pobřeží USA v oblasti Monterey (91 zvířat) (45) a znovu pak v roce 2000 o něco severněji na stejném pobřeží (184 zvířat) (16). Ve všech případech byla příčinou úhynu zvířat DOM (47). Jejím zdrojem byly pravděpodobně sardinky a ančovičky, běžná potrava lvounů, v jejichž mase byla DOM prokázána (42). Ryby s obsahem DOM jsou také zřejmě příčinou úhynu některých mořských ptáků, např. pelikánů a kormoránů (59, 60). Klinický průběh otravy lvounů kalifornských DOM uvádí ve své práci Gulland se spolupracovníky (16). Charakteristickými příznaky intoxikace byly křeče, ataxie, klátivé pohyby hlavou, nepřiměřené reakce na podráždění a opakované škrábání. V krvi byly nalezeny vysoké hodnoty hematokritu, zvýšené množství eozinofilů a vysoká aktivita sérové kreatin-


55


kinázy. Záchranáři se snažili intoxikované lvouny zachránit doplňováním tekutin pomocí infuzí a tlumit křeče podáváním diazepamu, lorazepamu a fenobarbitalu. Přesto většina léčených zvířat uhynula.

patří mezi neurotoxické excitotoxiny (12, 33, 61). Molekula DOM je díky pětičlennému kruhu rigidnější než molekula kyseliny glutamové a je asi stokrát účinnějším agonistou glutamátových receptorů, než tato přirozená excitační aminokyselina. Již první výzkumy prokázaly, že biologický účinek DOM, charakterizovaný jako neurotoxicita, je zprostředkováván pomocí glutamátových receptorů, zejména typu n-metyl-D-aspartát (NMDA) (36). Vazebné místo pro DOM na NMDA-receptoru je stejné jako pro kainát, proto i biologický účinek obou látek je velmi podobný. Vazbou DOM na NMDA-glutamátové receptory neuronů se otevírají iontové kanály pro vápník, ten vstupuje masivně do buňky, kde stimuluje řadu biochemických pochodů, které způsobí narušení funkce neuronu a mohou vést až k jeho zničení (4, 34, 54). Vazbou DOM na na NMDA-glutamátové receptory, které jsou jedním ze substrátů molekulární podstaty paměti (6), je možné vysvětlit dramatický účinek tohoto toxinu na paměť (35).

Chemická charakteristika DOM Kyselina domoová (CAS RN: 14277-97-5) je neobvyklá trikarboxylová aminokyselina o molekulové hmotnosti 311,34, sumárního vzorce C15H21NO6. Její strukturní vzorec napovídá, že je derivátem prolinu se dvěma karboxylovými skupinami v pozicích 1 a 2 a další karboxylovou skupinou v postranním sedmiuhlíkatém řetězci v pozici 3, kde jsou přítomny také dvě konjugované dvojné vazby. Z obrázku 1 je zřejmá její strukturální podobnost s excitačními aminokyselinami, kyselinou kainovou a kyselinou glutamovou. Pozn.: Kyselina kainová byla nalezena v červené mořské řase (ruducha) Digenea simplex a podobně jako kyselina domoová je řazena mezi excitační aminokyseliny.

Později bylo prokázáno, že DOM zvyšuje uvolňování dopaminu ve striatu laboratorního potkana (5), což podpořilo představu, že uvolňování dopaminu je regulováno NMDA-glutamátovými receptory (58). DOM v dávce 1 mg/kg vyvolává u laboratorních potkanů amnestický syndrom a narušuje jejich prostorovou orientaci a recentní (krátkodobou) paměť (32). Experimenty s účinkem DOM na paměť jednoznačně prokazují, že DOM je mimořádně nebezpečným neurotoxinem (48) pro savce, včetně člověka (29, 55), a to zejména proto, že je účinný i při perorální aplikaci, že poškození mozku je nevratné a terapie nemožná.

V substanci je DOM krystalická látka o bodu tání 223−224 °C, omezeně rozpustná ve vodě (8 mg/ml) a ještě méně v metanolu (0,6 mg/ml). Její rozdělovací koeficient v soustavě oktanol−voda (pH 5,32) je 0,0037 (14). Mechanismus účinku DOM je strukturním analogem kyseliny kainové a glutamové a podobně jako tyto aminokyseliny CH 3 COOH CH 2 COOH H 3C

N H

COOH

kyselina domoová

COOH

H 3C N H

kyselina kainová

COOH

COOH

H2N

COOH

kyselina glutamová

Obr. 1: Strukturální podobnost neurotoxinů ze skupiny excitačních aminokyselin (domoové a kainové) s kyselinou glutamovou, přirozeným agonistou NMDA-glutamátových receptorů.

56


Studiem klinických příznaků osob intoxikovaných DOM bylo zjištěno, že žádné příznaky nelze pozorovat u dávek 0,2 až 0,3 mg/kg p. o. Dávky 0,9 až 1,9 mg/kg způsobují středně těžké gastrointestinální potíže bez výrazných neurologických projevů a dávky 1,9 až 4,2 mg/kg způsobují těžké neurologické potíže spojené s poškozením mozku (23). Metody stanovení DOM Krátce poté, co byla DOM identifikována jako nebezpečný fykotoxin (toxiny jejichž zdrojem jsou sinice a řasy různého tvaru a velikosti − toxins of algal origin) (42) a vznikla potřeba jeho monitoringu, bylo k rutinní detekci DOM navrženo a postupně zavedeno několik analytických metod. Od jednoduché semikvantitativní TLC-metody (43) až po vysoce citlivé a přesné metody na bázi HPLC (17, 28), systémů ELISA (62), kapilární elektroforézy (27) apod. Vyvíjeny jsou rovněž citlivé imunosenzory (30). Přehled o metodách stanovení DOM a jejich validaci lze získat v recentní publikaci (19). Spolehlivé metody pro stanovení DOM ve zdrojích potravy z mořských živočichů jsou mimořádně důležité z hlediska ochrany obyvatelstva. Za bezpečné koncentrace jsou považovány obsahy DOM nižší než 20 mg/kg. Detekční limity u nejcitlivějších metod se pohybují od 0,15 do 0,5 mg DOM na kg hmotnosti mořského živočicha, což umožňuje dostatečné rozlišení bezpečných a nebezpečných koncentrací, ale nemůže to otravy lidí zcela eliminovat. Rutinně se monitoring DOM provádí pouze v některých oblastech světa, kde již k problémům s DOM došlo, ale výzkumy posledních let prokázaly přítomnost DOM i v dalších oblastech, např. v Kaspickém či Černém moři (3). Klinický obraz intoxikace u zvířat a u lidí U mladých jedinců laboratorního potkana, kteří jsou citlivější než dospělá zvířata, vyvolá podání DOM hyperaktivitu, stereotypní chování (drbání, scraping), křeče a různé neurologické poruchy, které mohou vést až k uhynutí zvířat. Reprodukovatelné behaviorální změny vyvolávají již dávky 0,05 mg/kg, dávky 0,2 mg/kg způsobují křeče (61). Při dlouhodobém podávání nízkých dávek DOM mladým jedincům přetrvávají změny v chování až do dospělosti a v mozku (hipokampu) byly nalezeny


morfologické změny (13). Clayton a spol. (8) zjistili, že jednorázové i. p. podání DOM potkanovi v dávce 2 mg/kg významným způsobem ovlivňuje pracovní paměť zvířat. Citlivým ukazatelem poškození mozku účinkem DOM může být indukce buněčného onkogenu C-Fos v hipokampu zvířat (39). V popředí klinického obrazu u lidí dominují neurotoxické symptomy zahrnující bolest hlavy, závratě, zmatenost, poruchy časové a prostorové orientace, poruchy motorické koordinace, halucinace a ztrátu krátkodobé paměti. Mnohé z toho připomíná výrazný úbytek duševních sil u Alzheimerovy nemoci (50). K tomu přistupují gastrointestinální potíže, jako jsou nauzea, déletrvající bolestivé křečové stahy v dutině břišní, nadměrná sekrece hlenu do dýchacích cest, tachykardie, periferní vazodilatace a hypotenze, srdeční dysrytmie a kóma. Byl zaznamenán také status epilepticus (7). Otravu může ukončit náhlá smrt v průběhu 12 až 14 hodin v důsledku paralýzy dýchání. Hromadná intoxikace lidí v roce 1987 v Kanadě byla výsledkem konzumace slávek modrých, které obsahovaly 31 až 128 mg DOM ve 100 g svalové hmoty. Množství DOM u obětí intoxikace bylo stanoveno na 60 až 290 mg na osobu. Inkubační doba byla extrémě rozdílná, od 15 minut až po 38 hodin. Intoxikace probíhala pod obrazem akutní gastroenteritidy. Gastrointestinální obtíže se objevily u 93 % a neurologické symptomy u 26 % postižených. Pacienti byli dehydratovaní, jejich průměrný krevní tlak byl 110/80, srdeční frekvence 100 a rektální teplota 38,5 °C. Neurologické změny, zejména zmatenost a dezorientace pacientů, dosáhly maxima desátý den po intoxikaci. Od sedmého dne po intoxikaci se začaly objevovat motorické spazmy na horních končetinách, klonicko-tonické křeče, faciální myoklonus a nekontrolované žvýkací pohyby. Bylo velmi obtížné odstranit spazmy, které byly necitlivé na phenytoin. Reagovaly pouze na vysoké dávky i. v. diazepamu a fenobarbitalu. V mozku tří pitvaných osob (stáří 71 až 84 let), které zemřely v rozpětí 11 až 24 dní po intoxikaci, byly nalezeny významné patologické změny v hipokampu a v amygdale ve smyslu poklesu počtu neuronů a menší léze také v anterior claustrum, nucleus accumbens a v thalamu (20). Hematologické a biochemické vyšetření pacientů v akutní fázi intoxikace prokázalo leukocytózu, vzestup hladiny močoviny a kreatininu, odpovídající dehydrataci a zvýšení kreatinin kinázy. Lumbální punkce provedená u dvou pacientů neprokázala žádné změny. V obraze EKG se objevovalo


57


difuzní zpomalení vln a epileptiformní aktivita, zejména v levé části temporální kůry. Kraniální CT-vyšetření prokázalo jen difuzní atrofii odpovídající věku. EMG-vyšetření prováděné 4 týdny po intoxikaci prokázalo rozsáhlou denervaci, ale rychlost vedení nervového vzruchu nebyla změněna. V následujících 4 až 6 týdnech se pacienti pomalu zotavovali a po 3 měsích od intoxikace se normalizovala jejich řeč, úsudek a sociální dovednosti. Byli však dezorientovaní v prostoru a čase a nebyli schopni si vybavit události spojené s intoxikací. Nebyli také schopni zapamatovat si nové informace, ačkoli retrográdní funkce paměti byla relativně normální (20). Možnosti terapie Gulland se spolupracovníky (16) prokázali, že terapie lvounů otrávených DOM spočívající v podávání náhradních tekutin a protikřečových léků byla neúspěšná. U většiny postižených zvířat tato terapie selhala a 68 % jich uhynulo. Jako nadějnější se jeví orientace na látky ze skupiny antagonistů NMDAglutamátových receptorů. Někteří novější antagonisté tzv. non-NMDA-glutamátových receptorů se vyznačují schopností selektivně snižovat toxicitu DOM in vivo (54). K nejúčinnějším se řadí látka označovaná jako NS-102 (6,7,8,9-tetrahydro-5-nitro-1H-benz[g]indol-2,3-dion-3-oxim) (22), která také účinně brání rozvoji motorických křečí a snižuje rozsah poškození hipokampálních neuronů v podoblasti CA3 (16). Nedávno bylo zjištěno (2), že poškození neuronů v hipokampu potkana účinkem DOM lze zabránit profylaktickým podáním melatoninu a že by tato látka mohla mít význam také při terapii intoxikací DOM. Zvážíme-li však současný reálný stav, musíme konstatovat, že dosud žádné specifické antidotum proti intoxikacím DOM nemáme, že nemáme ani žádný účinný terapeutický postup. V blízké budoucnosti nelze očekávat, že se tento stav změní. Možnosti ochrany Protože DOM je neobyčejně účinný excitotoxin vyvolávající u lidí anterográdní amnézii (25), musí být veškeré práce s ní prováděny s maximální opatrností za použití všech dostupných ochranných prostředků. Látka může do těla proniknout nejen při polknutí, ale nebezpečné může být i vdechování jejího prachu, a dokonce i potřísnění kůže jejími roz-

toky. V porovnání s kyselinou kainovou je DOM asi 19krát účinnějším neurotoxinem (26). Pokud jde o možnost ochrany před konzumací mořských živočichů s obsahem DOM, je konzument odkázán na národní centra veterinárního dozoru, která jsou vybavena technikou na zjišťování obsahu DOM a ostatních toxinů v mase ryb a ostatních živočichů. Zvýšené nebezpečí takové intoxikace se objevuje v době tzv. „rudého přílivu“ (red tide), kdy dochází k přemnožení některých mikroorganismů v planktonu (10). Pozn.: Jeho rozsah je ovlivněn klimatologickými, ekologickými a geografickými poměry (60). Svou roli zde bezesporu sehrávají i biogeochemické cykly, jako je tomu rovněž u onemocnění „ciguatera“ (56).

Při objevení se „rudého přílivu“ je vyhlašován poplach a jsou spouštěny monitorovací systémy, které jsou schopny vzniklou situaci vyhodnotit. Pro jedlé mořské korýše a měkkýše platí v Severní Americe a zemích Evropské unie maximálně přípustná koncentrace 20 ppm DOM (42). Při vyhlášení poplachu je v moři zakázáno koupání a všechny zásilky mořských živočichů na trh jsou kontrolovány na přítomnost nebezpečných toxinů. Tímto opatřením je nebezpečí otravy značně oslabeno, ovšem jen tam, kde monitorovací systémy fungují. Z literárních pramenů z 18., 19., ale i 20. století je známo, že fatálně končící otravy po konzumaci ústřic a slávek byly v této době poměrně časté v mnoha přímořských státech (49). Diskuse Existují důkazy o tom, že v posledních letech se koncentrace jedovatých mikroskopických řas v pobřežních vodách zvyšuje. Je to vysvětlováno jako důsledek znečišťování mořské vody a stále narůstající lodní dopravy, ale pravděpodobně k tomu přispívá i globální oteplování planety, které vede k prodlužování periody růstu u rozsivek spp. Pseudonitzschia (31). Tím se zvyšuje riziko rozšíření rozsivek spp. Pseudonitzschia i do oblastí, kde zatím nepředstavovaly žádné nebezpečí. Intoxikace DOM se výrazně liší od všech ostatních intoxikací vyvolaných jinými mořskými toxiny (ciguateratoxiny, kyselina okadaová, palytoxin, saxitoxiny, tetrodotoxin, yessotoxiny apod.) (38). Liší se od nich nejen svou chemickou strukturou, ale i mechanismem účinku, klinickým obrazem a dalšími parametry (18).

58


Pozn.: Úmyslná otrava DOM je klíčovým námětem amerického detektivního filmu „Sladké sny“ režiséra J. Bendera z roku 1996, známého i z našich kin. Vystupuje v něm mladá atraktivní žena, která se jednoho dne probouzí na pláži, ale není schopna si vybavit, jak se tam dostala, jak se jmenuje a kdo vůbec je. V průběhu děje se ukáže, že ztráta její paměti je způsobena účinkem DOM, kterýžto toxin je jí namíchán do nápoje manželem. Ten se tímto neobvyklým způsobem snaží řešit manželské neshody. Zůstává na divákovi, aby posoudil, zda taková intoxikace může být pouhou fikcí a vhodným námětem detektivního románu, nebo zda by mohla být skutečně realizována s úmyslem někoho poškodit. Myslíme si, že informace o DOM shrnuté v tomto článku mohou takovému posuzování napomoci.

Vtírá se otázka, jak by cílená intoxikace některých lidí či skupin lidí (politiků, úředních orgánů, řídicích centrál, armádních velitelských štábů apod.) pomocí DOM mohla ovlivnit jejich rozhodování a jaký by to mohlo mít dopad na jejich jednání a jednání ostatních osob a institucí. Přitom použití DOM jako diverzního či teroristického jedu se nejeví o nic obtížnější, než je tomu u jiných chemických látek.

7.

8. 9. 10. 11. 12.

13.

14.

Závěr 15.

Informace uvedené v této práci jednoznačně napovídají, že kyselina domoová pro své unikátní neurotoxické vlastnosti patří mezi nejnebezpečnější přírodní toxiny, že svou přítomností v některých mořských produktech, jako jsou např. ústřice a slávky, ohrožuje zdraví a životy lidí a že za jistých okolností by mohla být zneužita jako diverzní či teroristický jed.

16. 17.

18. Literatura 1.

2.

3.

4.

5.

6.

AMZIL, Z., et al. Domoic acid accumulation in French shellfish in relation to toxic species of Pseudonitzschia multiseries and P. pseudodelicatissima. Toxicon, 2001, vol. 39, p. 1245−1251. ANANTH, C., et al. Protective role of melatonin in domoic acid-induced neuronal damage in the hippocampus of adult rats. Hippocampus, 2003, vol. 13, p. 375−387. ANONYM. The problem of invaders in the Caspian Sea in the context of the findings of new zoo- and phytoplankton species from the Black Sea. [Article in Russian] Izv. Akad. Nauk Ser. Biol., 2005, issue 1, p. 78−87. APPEL, NM., et al. Sequelae of parenteral domoic acid administration in rats: comparison of effects on different metabolic markers in brain. Brain Res., 1997, vol. 754, p. 55−64. ARIAS, B., et al. In vivo release of dopamine and its metabolites from rat striatum in response to domoic acid. Neurochem. Res., 1998, vol. 23, p. 1509−1514. BAILEY, CH., et al. Toward a molecular definition of long-term memory storage. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, p. 13445−13452.

19. 20. 21. 22.

23. 24. 25.


CENDES, F., et al. Temporal lobe epilepsy caused by domoic acid intoxication: evidence for glutamate receptor-mediated excitotoxicity in humans. Ann. Neurol., 1995, vol. 37, p. 123−126. CLAYTON, EC., et al. Working memory deficits induced by single but not repeated exposures to domoic acid. Toxicon., 1999, vol. 37, p. 1025−1039. COSTA, PR., et al. A potential vector of domoic acid: the swimming crab Polybius henslowii Leach (Decapodabrachyura). Toxicon, 2003, vol. 42, p. 135−141. CULOTTA, E. Red menace in the world’s ocean. Science, 1992, vol. 257, p. 1476−1477. DAIGO, K. Studies on the constituents of Chondria armata. II. Isolation of an anthelmintical constituent. J. Jap. Pharm. Assoc., 1959, vol. 79, p. 353−356. DEBONEL, G., et al. Domoic acid, the alleged „mussel toxin“, might produce its neurotoxic effect through kainate receptor activation: an electrophysiological study in the dorsal hippocampus. Can. J. Physiol. Pharmacol., 1989, vol. 67, p. 29−33. DOUCETTE, TA., et al. Low doses of domoic acid during postnatal development produce permanent changes in rat behaviour and hippocampal morphology. Neurotox Res. 2004, vol.6, p. 555−563. FALK, M., et al. Solubility of domoic acid in water and in nonaqueous solvents. Canad. J. Chem.-Rev. Can. Chim., 1991, vol. 69, p. 1740−1744. FUREY, A., et al. Determination of domoic acid in shellfish by liquid chromatography with electrospray ionization and multiple tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A., 2001, vol. 938, p. 167−174. GULLAND, FM., at al. Domoic acid toxicity in Californian sea lions (Zolophus californianus): clinical signs, treatment and survival. Vet. Rec. 2002, vol. 150, p. 475−480. HOLLAND, PT., et al. Amnesic shellfish poisoning toxins in shellfish: estimation of uncertainty of measurement for a liquid chromatography/tandem mass spectrometry method. J. AOAC Int. 2003, vol. 86, p.1095−1100. HRDINA, V., et al. Přírodní toxiny a jedy. Praha, Galén a Karolinum, 2004. 302 s. HUNGERFORD, JM. Committee on Natural Toxins and Food Allergens. Marine and freshwater toxins. J. AOAC Int., 2005, vol. 88, p. 299−313. IPCS. Poisons Information Monograph 670: Domoic acid. (May 1996). Available from: http://www.inchem.org/documents/pims/chemical/pim670.htm as of July 19, 2004. JEFFERY, B., et al. Amnesic shellfish poison. Food Chem. Toxicol., 2004, vol. 42, p. 545−557. JOHANSEN, TH., et al. A novel non-NMDA receptor antagonist shows selective displacement of low-affinity [3H]kainate binding. Eur. J. Pharmacol., 1993, vol. 246, p. 195−204. KLASSEN, CD. (ed). Casarett and Doull’s Toxicology. The Basic Science of Poisons. 6th ed. New York, McGraw-Hill, 2001. 1079 p. KOTAKI, Y., et al. Confirmation of domoic acid production of Pseudonitzschia multiseries isolated from Ofunato Bay. Japan Toxicon., 1999, vol. 37, p. 677−682. KUNIG, G., et al. Regional differences in the interaction of excitotoxins domoate and L-beta-oxalyl-amino-alanine with [3H]-kainate binding sites in human hippocampus. Neurosci. Lett., 1995, vol. 187, p. 107−110.



26. LARM, JA., et al. Neurotoxin domoic acid produces cytotoxicity via kainate- and AMPA-sensitive receptors in cultured cortical neurones. Neurochem. Int. 1997, vol. 31, p. 677−682. 27. LI, DZ., et al. Capillary electrophoretic analysis of amnesic shellfish toxin-domoic acid [Article in Chinese] Se Pu, 2002, vol. 20, p.125−128. 28. LOPEZ-RIVERA, A., et al. Improved high-performance liquid chromatographic method for the determination of domoic acid and analogues in shellfish: effect of pH. Anal. Bioanal. Chem., 2005, Mar 16; [Epub ahead of print] 29. MAYER, AM. The marine toxin domoic acid may affect the developing brain by activation of neonatal microglia and subsequent neurotoxic mediator generation. Med. Hypotheses, 2000, vol. 54, p. 837−841. 30. MICHELI, L., et al. Disposable immunosensor for the determination of domoic acid in shellfish. Biosens Bioelectron., 2004, vol. 20, p. 190−196. 31. MOS, L. Domoic acid: a fascinating marine toxin. Environ. Toxicol. Pharmacol., 2001, vol. 9, p. 79−85. 32. NAKAJIMA, S. − POTVIN, JL. Neural and behavioural effects of domoic acid, an amnesis shellfish toxin, in the rat. Can. J. Psychol., 1992, vol. 46, p. 569−581. 33. NIEOULLON, A., et al. Excitotoxicity and the putative involvement of excitative amino acids in neurodegenerative diseases. J. Appl. Biomed., 2003, vol. 1, p. 1−5. 34. NIJJAR, MS. − NIJJAR, SS. Domoic acid-induced neurodegeneration resulting in memory loss is mediated by Ca2+ overload and inhibition of Ca2+ + calmodulin-stimulated adenylate cyclase in rat brain (review). Int. J. Mol. Med., 2000, vol. 6, p. 377−389. 35. NOVELLI, A., et al. Domoic acid-containing toxic mussels produce neurotoxicity in neuronal cultures through a synergism between excitatory amino acids. Brain Res. 1992, vol. 577, p. 41−48. 36. OLNEY, JW. Excitotoxicity: an overview. Can. Dis. Wkly. Rep., 1990, vol. 16, suppl. 1, p. 47−57. 37. PATOČKA, J. Kyselina domoová, neurotoxin způsobující ztrátu krátkodobé paměti. Psychiatrie, 1999, vol. 3, p. 182−184. 38. PATOČKA, J. − STŘEDA, L. Brief review of natural nonprotein neurotoxins. ASA Newsletter, 2002, vol. 89, p. 16−24. 39. PENG, YG. − RAMSDELL, JS. Brain Fos induction is a sensitive biomarker for the lowest observed neuroexcitatory effects of domoic acid. Fundam. Appl. Toxicol., 1996, vol. 31, p. 162−168. 40. PERL, TM., et al. An outbreak of toxic encephalopathy caused by eating mussels contaminated with domoic acid. N. Engl. J. Med., 1990, vol. 322, p. 1775−1780. 41. PERL, TM., et al. Amnesic shellfish poisoning: a new clinical syndrome due to domoic acid. Can. Dis. Wkly. Rep., 1990, vol. 16, suppl. 1, p. 7−8. 42. QUILLIAM, MA. Phycotoxins. J. AOAC Int., 1999, vol. 82, p. 773−781. 43. QUILLIAM, MA., et al. Analysis of domoic acid in shellfish by thin-layer chromatography. Nat. Toxins, 1998, vol. 6, p. 147−152. 44. RHODES, L., et al. Pseudonitzschia in New Zealand and the role of DNA probes and immunoassays in refining marine biotoxin monitoring programmes. Nat. Toxins, 1998, vol. 6, p. 105−111.

59

45. SCHOLIN, CA., et al. Mortality of sea lions along the central California coast linked to a toxic diatom bloom. Nature, 2000, vol. 403, p. 80−84. 46. SIERRA-BELTRAN, A., et al. Sea bird mortality at Cabo San Lucas, Mexico: evidence that toxic diatom blooms are spreading. Toxicon, 1997, vol. 35, p. 447−453. 47. SILVAGNI, PA., et al. Pathology of domoic acid toxicity in California sea lions (Zolophus californianus). Vet. Pathol., 2005, vol. 42, p. 184−191. 48. SLIKKER, W., et al. Biologically-based dose-response model for neurotoxicity risk assessment. Toxicol. Lett., 1998, vol. 102, 429−433. 49. SMAYDA, TJ. − SHIMIZU, Y. (eds.) Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea. New York, Elsevier Sci. Publ., 1993. 50. SPENCER, PS., et al. Are human neurodegenerative disorders linked to environmental chemicals with excitotoxic properties? Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, vol., 648, p. 154−160. 51. STEWART, JM., et al. Microbial utilization of the neurotoxin domoic acid: blue mussels (Mytilus edulis) and soft shell clams (Mya arenaria) as source of the microorganisms. Can. J. Microbiol., 1998, vol. 44, p. 456−464. 52. STOMMEL, EW. − WATTERS, MR. Marine Neurotoxins: Ingestible Toxins. Curr. Treat. Options Neurol., 2004, vol. 6, p. 105−114. 53. TAKEMOTO, T. − DAIGO, K. Constituents of Chondria armata. Chem. Pharm. Bull., 1958, vol. 6, p. 578−580. 54. TASKER, RA., et al. Selective reduction in domoic acid toxicity in vivo by a novel non-N-methyl-D-aspartate receptor antagonist. Can. J. Physiol. Pharmacol., 1996, vol. 74, p. 1047−1054. 55. TEITELBAUM, JS., et al. Neurologic sequelae of domoic acid intoxication due to the ingestion of contaminated mussels. New England J. Med., 1990, vol. 322, p. 1781−1787. 56. TOSTESON, TR. The diversity and origins of toxins in ciguatera fish poisoning. P. R. Health Sci. J., 1995, vol. 14, p. 117−129. 57. WALZ, PM., et al. Domoic acid producing diatom blooms in Monterey Bay, California; 1991−93. Natural Toxins, 1994, vol. 2, p. 271−279. 58. WANG, JK. Presynaptic glutamate receptors modulate dopamine release from striatal synaptosomes. J. Neurochem., 1991, vol. 57, p. 819−822. 59. WORK, TM., et al. Domoic acid intoxication of brown pelicans and cormorants in Santa Cruz, California. In SMAYDA, TJ., et al. Domoic acid is a potent neurotoxin to neonatal rats. Nat. Toxin, 1997, vol. 5, p. 74−79. 60. WRIGHT, JLC. Domoic acid − ten years after. Nat. Toxins, 1998, vol. 6, p. 91−92. 61. XI, D., et al. Domoic acid is a potent neurotoxin to neonatal rats. Nat. Toxins, 1997, vol. 5, p. 74−79. 62. YU, FY., et al. Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of domoic acid in shellfish. J. Agric. Food Chem., 2004, vol. 52, p. 5334−5339. Korespondence: Prof. MUDr. Vratislav Hrdina, CSc. Horova 1193 500 02 Hradec Králové Do redakce došlo 25. 3. 2005

60



T-2 TOXIN A JEHO MOŽNÉ ZNEUŽITÍ RNDr. Marie VACKOVÁ, CSc., prof. MUDr. Miroslav ŠPLIŇO, DrSc., kpt. MUDr. Jan SMETANA Univerzita obrany, katedra epidemiologie Fakulty vojenského zdravotnictví v Hradci Králové

Souhrn Cílem předloženého sdělení bylo upozornit na možné zneužití T-2 toxinu jako biologického agens ve formě aerosolu. Vzhledem k tomu, že v současné době neexistuje žádné antidotum, imunoprofylaxe nebo chemoterapie, tak lze tento trichothecenový mykotoxin považovat za velmi nebezpečný při jeho zneužití k vojenským nebo teroristickým účelům. Klíčová slova: T-2 toxin; Aerosol; Bioterorismus.

T-2 Toxin and Its Possible Misuse Summary The aim of this article is to highlight the possible misuse of T-2 toxin as a biological agent in the form of aerosol. In view of the fact that at present there are no antidotes, immunoprophylaxis or chemotherapy, this trichothecen mycotoxin can be considered as very dangerous with regard to its misuse for military or terrorist purposes. Key words: T-2 toxin; Aerosol; Bioterrorism.

Úvod Z literárních údajů je zřejmé, že problematika T-2 toxinu je předmětem zájmu nejen toxikologů, mykologů, lékařů, fytopatologů, ale také odborníků biotechnologických laboratoří, kteří si dovedou poradit s jeho přípravou v laboratorních podmínkách. V současné době je tento mykotoxin spojován asi nejčastěji s poruchami zdravotního stavu hospodářských zvířat. Vliv mykotoxinů se projevuje v narušení hematologických, biochemických a imunologických parametrů, což může následně vést ke zvýšené vnímavosti k sekundárním infekcím, snížení hmotnosti a tím i k hospodářským ztrátám v produkci zvířat. Nálezy T-2 toxinu ze vzorků kukuřice z lokalit jižní a střední Moravy popisuje například Nedělník, J. (5) a poruchy zdravotního stavu hospodářských zvířat vlivem mykotoxinů (včetně T-2 toxinu) uvádí Čonková a spol. (1). Už méně je známý fakt, že s tímto mykotoxinem musíme také počítat v souvislosti s jeho možným zneužitím k vojenským nebo teroristickým účelům (4, 6). V tabulce 1 je uveden přehled biologických agens, která představují v současné době potenciální hrozbu pro zneužití. Mezi toxiny je vedle botulotoxinu, ricinu, stafylokokového enterotoxinu B uveden také T-2 toxin.

Z celé řady známých mykotoxinů jsou právě trichotheceny (T-2 toxin) uváděny jako možné biologické agens z řady důvodů. Jsou to netěkavé látky, neztrácejí toxicitu ani po zahřátí na 100 °C a jsou špatně rozpustné ve vodě (3). Některé další údaje týkající se T-2 toxinu jsou uvedeny v tabulce 2. Historie Z historických údajů jsou dobře známé účinky těchto mykotoxinů (trichothecenů) například u lidí, kteří konzumovali obilniny kontaminované houbami rodu Fusarium. Onemocnění se projevovalo bolestmi hlavy, nauzeou, zvracením a třesavkou. Během 2. světové války byla v Rusku dokumentována epidemie ATA (alimentární toxická aleukie), způsobená nedostatkem kvalitní stravy, kdy lidé konzumovali stravu napadenou houbami (2). Mechanismus toxického účinku na živý organismus Obecně lze říci, že mykotoxiny mají široké spektrum účinku, které není stále ještě do všech detailů objasněno. Hlavní účinek trichothecenových myko-


61


Tabulka 1 Biologická agens − možné zneužití k vojenským či teroristickým účelům Bakteriální

Virové

Toxiny

Antrax

Variola

Brucelóza

Venezuelská encefalitida

Botulotoxin Ricin

Mor

Virové hemoragické horečky

Stafylokokový enterotoxin B

Q-horečka

T-2 toxin

Tularémie Malleus Pseudomalleus Zpracováno podle: USAMRIID’s medical management of biological casualties handbook. Fort Detrick, Maryland 2001. 135 p.

Tabulka 2 Charakteristika T-2 toxinu Synonyma

Mykotoxin T-2; Fusariotoxin T-2; Insariotoxin

Sumární vzorec

C24 H34 O9

Molekulová hmotnost

466,53

Bod tání

152 °C

Optická otáčivost

[α ]D21 - 15,5 (chloroform)

LD50

4 mg . kg-1 (p. o.) potkan

Hlavní producent mykotoxinu

Fusarium spp.

Zpracováno podle: Hrdina, V., Hrdina, R., Jahodář, L., Martinec, Z., Měrka, V.: Přírodní toxiny a jedy. Praha, Galén 2004. 302 s.

toxinů vychází z jejich schopnosti inhibovat syntézu proteinů a nukleových kyselin. Dále jsou schopny alterovat strukturu a funkci buněčné membrány inaktivací různých enzymů a inhibici funkce mitochondrií. Trichotheceny jsou také označovány jako radiomimetické látky (zesilují následky působení ionizujícího záření). Cytotoxický efekt se projevuje hlavně na buňkách kostní dřeně, buňkách sliznice gastrointestinálního traktu, kůže a zárodečných buňkách. Klinické projevy Klinické projevy účinku T-2 toxinu se značně odlišují podle brány vstupu toxinu do organismu. Za mimořádných situací (zneužití při bioterorismu) se jako nejvíce nebezpečné jeví použití T- 2 toxinu ve formě aerosolu. Časné příznaky účinku na kůži lze pozorovat už za několik minut (hodin) po expozici. Objevuje se popáleninová bolest, zarudnutí, puchýře a může dojít až ke vzniku nekrózy. Při poškození horních cest dýchacích toxinem

ve formě aerosolu dochází nejdříve k projevům pálení na sliznici dutiny nosní, dále se rozvíjí serózní rýma a epistaxe. Rozsáhlejší poškození dýchacích cest se může v počátku projevit sípavým hlasem, kašlem a poruchami dýchání. Dutina ústní a hrdlo jsou bolestivé, sliny a sputum mohou být s příměsí krve. Gastrointestinální toxicita se projevuje zažívacími potížemi, jako je nauzea, zvracení, krvavý průjem doprovázený křečemi apod. Snad nejdříve po expozici T-2 toxinu ve formě aerosolu dojde k postižení očí (minuty), které se projeví bolestivostí, slzením, zarudnutím, neostrým viděním. Systémová toxicita se může projevit ztrátou koordinace, ataxií, závratěmi, hubnutím, vyčerpáním. U fatálních případů se objevuje tachykardie, hypotermie a hypotenze. Smrt může nastat do několika minut, hodin nebo dnů. Za hlavní symptomy se považují zvracení, průjem, postižení kůže podobné popáleninám, krvácení a dyspnoe. Pro pozdní efekt systémové absorpce T-2 toxinu může svědčit pancytopenie, predispozice ke krvácivým stavům nebo septické projevy.

62


Diagnostika Diagnostika se opírá především o klinické a epidemiologické údaje. Vysoký „attack rate“, úhyn různých živočišných druhů v dané oblasti, nálezy žlutých, červených, zelených či jinak pigmentovaných olejovitých kapiček mohou naznačovat použití mykotoxinů. Rychlý nástup klinických projevů u zasažených osob (minuty až hodiny) také podporují diagnózu chemického nebo toxinového zasažení. Při vyslovení konečné diagnózy musí být brány v úvahu další zpuchýřující látky (například yperit). Je nutné ale podotknout, že tyto látky se často projevují pachovými vlastnostmi, jsou viditelné a na jejich identifikaci existují detekční soupravy. Například toxicita yperitu se může projevit až za několik hodin, inhalace enterotoxinu B nebo ricinu může způsobit horečku, kašel, dyspnoe či sípavý hlas, ale nevyvolává změny na kůži. Rychlá specifická diagnostika T-2 toxinu není zatím možná v polních podmínkách. Proto se doporučuje zaslat na vyšetření moč a sérum do nejbližší laboratoře, která je schopna provést detekci toxinu a jeho metabolitů. Metabolity lze prokázat ještě několik dní po expozici. Pro patologické vyšetření lze zasílat krev, moč, vzorek plicní nebo jaterní tkáně a střevní obsah. Lékařský management v ohnisku použití T-2 toxinu

sažené kůže vodou a mýdlem (i za hodinu po expozici) může snížit účinky dermální toxicity. Závěr Proč právě T-2 toxin může být zneužit pro vojenské či teroristické účely? • Ve formě aerosolu tvoří neviditelný mrak s částečkami < 10 µm, které mohou dobře pronikat do dýchacích cest a zachytávat se na nechráněné kůži či kontaminovat oděv, prostředí, potraviny atd. • T-2 toxin vzhledem k jeho účinkům na kůži může také podporovat bránu vstupu jiným biologickým agens, a zvyšovat tak jejich efektivitu. • T-2 toxin je také řazen mezi radiomimetické látky a tudíž může zesilovat následky působení ionizujícího záření. • V současné době není k dispozici žádné antidotum, imunoprofylaxe (vakcína) nebo chemoprofylaxe proti T-2 toxinu. • Příprava T-2 toxinu v laboratorních podmínkách nepředstavuje zásadní problém. • Kontaminace potravy či vodních zdrojů je méně pravděpodobná, avšak lehce proveditelná. Literatura 1.

2.

V současné době není k dispozici žádné antidotum či jiný léčebný postup po zasažení tímto toxinem. Existuje jen podpůrná terapie. Účinky dermální toxicity lze snížit omytím čistou vodou a mýdlem. Pokud je k dispozici, tak lze použít univerzální odmořovací prostředek (IPB-80) Desprach. U osob, které nebyly chráněny a došlo ke spolykání T-2 toxinu, lze použít aktivní uhlí (Carbo medicinalis). K výplachu zasažených očí lze použít fyziologický roztok nebo čistou vodu. Nezbytná je podpora dýchání. Profylaxe Imunoprofylaxe (vakcína) nebo chemoprofylaxe není v současné době k dispozici. Proto hlavní ochranou jednotlivce zůstává ochranná maska a pláštěnka nebo v krajním případě alespoň obličejová rouška a improvizovaná ochrana povrchu těla. Omytí za-


3. 4. 5.

6.

ČONKOVÁ, E. − LACIAKOVÁ, A. − KOVÁČ, G. Fuzáriotoxíny z aspektu veterinárnej medicíny. Veterinářství, 2002, roč. 52, č. 1, s. 87−92. HRDINA, V., aj. Přírodní toxiny a jedy. Praha, Galén, 2004. 302 s. Předpis: Chem-51-8 Vyhodnocování chemické situace. Praha, Ministerstvo obrany České republiky, 1993. 188 s. MALÍŘ, F., aj. Mykotoxiny a bioterorismus. Informační Zprav. MV − GŘ HZS ČR, 2003, roč. 14, č. 1, s. 35−44. NEDĚLNÍK, J. Damage to corn by fungi of the genus Fusarium and the presence of fusariotoxins. Plant Protect. Sci., 2002, vol. 38, no. 2, p. 46−54. USAMRIID’s medical management of biological casualties handbook. Maryland, Fort Detrick, 2001. 135 p.

Korespondence: RNDr. Marie Vacková, CSc. Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Katedra epidemiologie Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové e-mail: [email protected]

Do redakce došlo 11. 2. 2005



63

ČPAVKOVÁ HAVÁRIE V BĚLEHRADĚ 1998 Případová studie 1

Ing. Otakar J. MIKA, 2Vlasta NEKLAPILOVÁ, 3Slavica VUCINIC, 3Milos P. STOJILKOVIC 1 ISATech, spol. s r. o. Brno 2 Úrazová nemocnice, Brno 3 National Poison Control Center, Military Medical Academy, Belgrade, Serbia

Souhrn Problematika manipulace s toxickou látkou amoniakem. Připomenutí některých čpavkových havárií ve světě s krátkým popisem havarijní události. Je uvedena základní charakteristika nebezpečné chemické látky − amoniaku a jsou uvedeny základní postupy při první pomoci a neodkladná opatření. Podrobně je uveden a popsán průběh a řešení čpavkové havárie automobilní cisterny v Bělehradě v květnu roku 1998. Případ je zpracován jako případová studie. Významnou měrou při zpracování této informace pomohli srbští spoluautoři, kteří jsou dlouholetými zaměstnanci Národního toxikologického centra v Bělehradě, které provádělo záchranu a léčení postižených osob. Uvádí se podrobný postup prací při záchraně postižených osob a výsledky dlouhodobého léčení. Klíčová slova: Chemická havárie; Nebezpečná chemická látka; Toxicita chemických látek; Modelování havarijních následků.

Chemical Accident with Ammonia in Belgrade in 1998 Summary This article mentions the problem of manipulation with a toxic ammonia substance. The authors inform us about some chemical accidents with ammonia release in the world with a short description of the event. The basic characteristics of the hazardous ammonia substance, basic first aid steps and necessary measures are also mentioned. The history of and response to the accident of an ammonia tank in Belgrade in May 1998 is described in detail as the case study. The Serbian co-authors helped substantially to create this article. As long-term employees of the National Poison Control Centre in Belgrade, they participated actively in the rescue work and treatment of casualties. The detailed sequence of response activities and results of long-term treatment of patients are also discussed in this article. Key words: Chemical accident; Hazardous chemical substance; Toxicity of chemical substances; Modelling of accidental consequences.

Úvod Přes častý výskyt havárií spojených s únikem nebezpečných látek přináší organizace a řešení těchto chemických katastrof stále řadu specifických problémů. Mnohé nemocnice poskytující akutní péči nejsou zcela připraveny na ošetření kontaminovaných nebo otrávených osob, což může mít významný dopad na výsledek léčení těchto postižených. Kvalita lékařské péče po havárii nebezpečných látek závisí na povaze této havárie, na počtu postižených osob, dostupnosti lékařské péče, koordinaci záchranných týmů a na poskytnutém ošetření (2, 5, 6, 7). Cílem této případové studie je popsat průběh čpavkové havárie v Bělehradě v roce 1998 a ukázat

úlohu Národního toxikologického centra při organizaci záchranných akcí a poskytnutí odborné péče postiženým při hromadné otravě amoniakem. Je to ukázka týmové práce a zkušeností s lékařským ošetřením otrav, které byly poprvé využity u havárie takového rozsahu (9). Přehled některých čpavkových havárií v minulosti Havárie s únikem amoniaku (3): Londýn, 1940. Při bombardování byl zasažen sklep pivovaru, využívaný jako kryt. Poškozením zásobníku amoniaku došlo k úniku a 75 osob bylo

64


hospitalizováno pro kašel, svírání hrudníku, otok rtů a jazyka, dušnost a plicní edém. Podle údajů jedné z nemocnic zemřelo 7 pacientů ze 47 přijatých. Litva, 1989. Zásobník amoniaku v továrně na umělá hnojiva, obsahující 7000 t kapalného plynu, explodoval. Sedm osob zahynulo, 57 dalších bylo poraněno a 32 000 osob bylo nutno evakuovat. Většina postižených utrpěla poranění při výbuchu a popáleniny. Nové Skotsko, 1980. Čtrnáct rybářů bylo postiženo vysoce koncentrovaným plynným amoniakem při havárii lodního chladicího systému. Evakuace postižených do nemocnice trvala 14 hodin. Pacienti trpěli zánětem hrtanu a spojivek, jednomu z nich musela být provedena tracheostomie pro laryngeální edém. Všem byly podány kortikosteroidy, některým také bronchodilatancia. U dvou pacientů se sekundárně rozvinula bakteriální pneumonie. Bratislava, 2000. Dne 24. července 2000 došlo v Bratislavě k úniku amoniaku ze Zimního stadionu Ondreje Nepely. Na místo nehody byl povolán hasičský záchranný sbor a rychlá záchranná služba. Průzkumem bylo zjištěno, že se jedná o únik čpavku z potrubí, které bylo porušeno pracovníky vykonávajícími opravy a rekonstrukce v prostoru hrací plochy stadionu. Dva pracovníci byli intoxikováni. Byla vytvořená pracovní skupina, která řešila vzniklou situaci. Amoniak (NH3) − základní charakteristika nebezpečné chemické látky Základní charakteristika je uvedena v tabulce 1 a ve stručném popisu. Má silné dráždivé účinky na sliznice očí a dýchacích cest, může poškodit plicní tkáně. Při vysokých koncentracích způsobuje poruchy CNS. Inhalační a povrchová zasažení, možný vznik třaskavé směsi i kontaminace terénu a vod. První pomoc při zasažení • vynesení nebo vyvedení do čistého prostředí, odstranění kontaminovaného oděvu • výplach očí nezávadnou vodou nebo vodou borovou • inhalace par octa Neodkladná opatření • opuštění zasaženého prostoru a jeho uzavření • varování v další ohrožené oblasti • vyřazení veškerých zdrojů vznícení, zákaz kou-

• •


ření, vypnout motory vozidel vytvoření omezujících a ochranných vodních clon zastavení nebo omezení dalšího úniku

Asanace • budovy a venkovní zařízení omývat tříštěným proudem vody • vnitřky budov intenzivně větrat • terén lze asanovat nejlépe 3% roztokem kyseliny octové (nouzově lze užít i 3% roztok anorganické kyseliny) Tabulka 1 Vybrané fyzikálně-chemické vlastnosti amoniaku Charakteristika

hořlavý, bezbarvý, čpavě páchnoucí plyn dráždící silně oční sliznice

Molekulová hmotnost

17,3

Výparné teplo

1375 kJ.kg-1

Spalné teplo

22 060 kJ.kg-1

Výbuchové teplo

22 060 kJ.kg-1

Hustota par ke vzduchu

0,597

Hustota zkapalněného

681,4 kg.m-3 při bodu varu

Mez výbušnosti

dolní mez 15 % objemových horní mez 28 % objemových

Rozpustnost ve vodě

32,2%

Toxicita 50% mortalita

0,009 kg.m-3

IDLH

0,000358 kg.m-3

Ochrana dýchacích cest

při nižší koncentraci ochranná maska + NH3 filtr; při vyšší koncentraci izolační dýchací přístroj

Ochrana povrchu těla

kompletní ochranný oděv

Popis průběhu čpavkové havárie v Bělehradě 1998 a její postupné zvládnutí (9) Čpavková havárie se stala 27. května 1998 ve 14 hodin na bělehradském předměstí Borca, kde explodovala cisterna s 5 tunami amoniaku. Oblak čpavku se rozšířil po velké ploše a způsobil hromadnou otravu místních obyvatel a zaměstnanců společnosti „Lika system“, umístěné poblíž. Muž sto-


65


jící vedle cisterny byl při výbuchu zabit. První byly na místě vozy záchranné služby a policie. Tehdy ještě nebylo vyrozuměno Národní toxikologické centrum (NTC), proto se neúčastnilo první fáze organizačních a záchranných opatření. Lékař centra, který měl službu, byl vyrozuměn o události ve 14.40 hodin. Navrhl, aby většina postižených byla převezena do NTC. Vzhledem k tomu, že havárie se stala v pracovní době, žádný člen personálu ještě neopustil nemocnici. Ihned byl uveden do chodu již dříve připravený krizový plán zahrnující řídící řetězec, lékaře určené pro třídění postižených a systém vyrozumění dalšího personálu. Byla uvolněna další nemocniční lůžka na Toxikologické klinice a dalších 2 klinikách Vojenské lékařské akademie propuštěním pacientů hospitalizovaných pro různé diagnostické zákroky. Pacienti vyžadující další ošetření byli převezeni do Vojenské nemocnice. Byly zajištěny další zásoby potřebných léčiv a zdravotnického materiálu. První pacienti byli přivezeni hodinu po havárii, do 22.00 h dorazilo 98 pacientů. Pro třídění nebyly vybrány prostory urgentního centra, protože počet pacientů byl značný, mohlo by dojít k přetížení a narušení péče o pacienty se závažnější otravou. Byl určen rychlý přístup k místu třídění a zvláštní prostory poblíž vchodu pro občerstvení, sledování a ošetření pacientů s lehčím postižením. Vážněji postižení pacienti s vitálním ohrožením byli okamžitě hospitalizováni na Klinice toxikologie a klinické farmakologie. Po přijetí byla provedena dekontaminace a pečlivě omyty oči izotonickým fyziologickým roztokem. V průběhu dalších 2 dnů bylo ohlášeno dalších 45 pacientů s podobnými příznaky, takže celkový počet pacientů ošetřených v NTC dosáhl 143, 54 z nich bylo hospitalizováno. Po prvním vyšetření a třídění dostali všichni pacienti jednu dávku prednisolonu (80 mg) i. m. nebo i. v. Po šesti hodinách pozorování bylo 46 pacientů s mírnou otravou nebo pouhou expozicí propuštěno z nemocni-

ce. Byli dále sledováni ambulantně po dobu jednoho měsíce. Podle závažnosti otravy byli hospitalizovaní pacienti rozděleni do tří skupin: • mírná otrava (22 pacientů) • středně těžká otrava (13 pacientů) a • závažná otrava (19 pacientů) Většina pacientů s mírným postižením měla příznaky a symptomy lehkého podráždění horních cest dýchacích (kašel, dušnost, slabá dyspnoe, mírný bronchospazmus, překrvení spojivek). Pacienti se středně těžkým postižením trpěli prolongovaným kašlem, svíráním hrudníku, karbonovým sputem, sípotem a hypoxémií vyžadující dodání kyslíku. Pět z těchto pacientů mělo normální RTG plic a ostatní bronchovaskulární znaky. Jeden z nich měl pneumonii. U pacientů se závažnou otravou se projevila respirační insuficience (způsobená těžkým bronchospazmem, laryngeální obstrukcí vlivem pulmonálního edému, pneumonií), závažné popáleniny očí a pokožky. U devíti z nich se rozvinul pulmonální edém 6 hodin po expozici. V jednom případě byl edém následkem srdečního selhání. U tří pacientů byl při přijetí diagnostikován syndrom akutní dechové nedostatečnosti (ARDS), dva z nich byli intubováni a byla zavedena umělá ventilace plic s pozitivním výdechovým tlakem (PEEP). Jeden z nich zemřel šestý den po havárii. Pitva prokázala těžký hemoragický plicní edém, destrukci bronchiální sliznice a četné kapilární tromby. U druhého pacienta s umělou ventilací se rozvinula pneumonie a pulmonální tromboembolismus. Byl hospitalizován 60 dní a i po propuštění se projevuje restrikčně − obstrukční porucha s mírnou hypoxémií při rozvíjející se plicní fibróze. Léčba zahrnovala podporu průchodnosti dýchacích cest, časté odsávání bronchopulmonální sekrece, aplikaci zvlhčeného kyslíku, podávání intravenózních roztoků, bronchodilatancií, antibiotik a kortiTabulka 2

Komplikace (počet pacientů)

Následky (počet pacientů)

Stupeň otravy

Počet pacientů

Mírná

22

pneumonie (2)

−

Střední

13

pneumonie (1)

−

19

pneumonie (2) ARDS − syndrom akutní dechové nedostatečnosti (9) ACF − akutní srdeční selhání (1) PTE − pulmonální tromboembolismus (1)

Závažná

plicní fibróza (1) bronchiální hyperaktivita (1) katarakt (1) COPD − chronická obstrukční bronchitida (1)

66


kosteroidů. Pacientům s těžkou formou otravy byly podávány vysoké dávky prednisolonu (1,5−2,0 g), aby se zabránilo rozvoji plicního edému. Dávky byly po 72 hodinách sníženy, jakmile se riziko edému minimalizovalo. Přežili všichni pacienti kromě jediného výše uvedeného případu. Hospitalizace trvala 2−60 dnů. Dlouhodobé sledování potvrdilo následky u dvou pacientů. U jednoho to byla bronchiální hyperaktivita a plicní fibróza, další pacient trpěl chronickou obstrukční bronchitidou a kataraktou. Podrobnosti jsou uvedeny v tabulce 2. Diskuse Již od počátku 80. let 20. století byly závažné chemické havárie s únikem nebezpečných látek a ohrožením zdraví obyvatelstva předmětem zájmu a zkoumání, se snahou zajistit bezpečnost zpracování, transportu i skladování těchto nebezpečných materiálů. Teroristický útok s použitím sarinu v tokijském metru v březnu 1995 ukázal, že použití vysoce toxických látek teroristy je proveditelné a že je nutno pečlivě se připravit na organizaci a řešení těchto krizových situací (1). Lékařské řešení velkých chemických havárií vyžaduje úzkou spolupráci mezi záchrannými silami (na místě neštěstí a v nemocnici) a mezi toxikologickým centrem, jehož databáze a počítačové vyhodnocení rizika jsou jakožto informační podpora součástí záchranných akcí. Podle Světové zprávy o katastrofách z roku 1995 jsou chemické katastrofy vážně ohrožující obyvatelstvo i životní prostředí na 10. místě, hned za závažnými epidemiemi. Úzká spolupráce a komunikace se zdravotnickými zařízeními poskytujícími urgentní péči, dalšími úřady a institucemi a sdělovacími prostředky hraje v každé fázi klíčovou úlohu. V roce 1985 byl vytvořen komisí Evropské unie Hlavní systém hlášení havárií. Tato případová studie vysvětluje, jak Národní toxikologické centrum (NTC) reagovalo na podobnou situaci z hlediska řešení katastrofy, jaké vznikly problémy a jak byly řešeny. NTC se zde poprvé aktivně účastnilo zdolávání následků hromadné havárie s únikem amoniaku. Amoniak, chemikálie používaná běžně v průmyslu i v domácnosti, má charakteristický zápach, který je varováním před expozicí touto škodlivinou. Po havárii byly na místě neštěstí jako první osádky záchranné služby a policie, které transportovaly většinu postižených do NTC. Domnívali


se, že amoniak není chemikálie se závažnější možností kontaminace, jako jsou chemické karcinogeny a pesticidy, nebyli vhodně vybaveni, a tak se stalo, že několik záchranářů bylo také postiženo − naštěstí pouze v mírné formě. Po prvním třídění postižených na místě havárie byli pacienti převezeni do NTC, kde prošli definitivním tříděním. Klinické projevy otravy amoniakem jsou charakteristické − od podráždění dýchacích cest při mírném postižení až po závažné pulmonální potíže včetně ARDS. Mechanismus otravy se vysvětluje vysokou rozpustností amoniaku ve vodě, čímž vzniká hydroxid amonný, který současně se značným místním tepelným účinkem (vlivem uvedené chemické reakce) působí destrukci sliznic a poleptání. Kontakt s pokožkou může působit popáleniny a vezikace, podráždění očí, zánět spojivek a hrtanu. Amoniak je absorbován horním dýchacím traktem, ale postižení silně koncentrovaným plynem nebo dlouhodobá expozice může způsobit tracheobronchiální nebo pulmonální zánětlivou reakci. Působení vysoké koncentrace jakéhokoli dráždivého plynu může vyvolat hypoxémii podobně jako při působení asfyxiantů. Obecný přístup k léčbě pacientů s otravou amoniakem spočívá v podpoře průchodnosti dýchacích cest a další podpůrné terapii. Podávání kyslíku, bronchodilatancií a odsávání sekretů by mělo být prováděno, pokud je klinicky indikováno. Je důležité redukovat vdechované koncentrace kyslíku pod 50 %, jakmile je to možné, poněvadž pacienti s otravou amoniakem jsou stále více citliví na toxicitu kyslíku vlivem poškození endogenního antioxidantního systému. Včasná kortikosteroidová terapie zaměřená na redukci zánětlivé odezvy organismu je méně přínosná pro pacienty s ARDS, ale může redukovat pozdní fibroproliferativní fázi. Většina pacientů s mírným a středně těžkým postižením byla vystavena působení amoniaku po několik minut. Po léčbě se všichni plně zotavili a u nikoho se neprojevily další následky. Naproti tomu u pacientů se známkami těžkého postižení a ARDS byla léčba dlouhodobá a vznikly zde další následky otravy. I v této skupině lze však odlišit pacienty, u kterých brzký výskyt plicního edému znamenal méně závažnou formu otravy a rychlejší uzdravení. Všichni postižení byli ošetřováni v NTC, což by v budoucnosti nemuselo být vždy možné. Přitom statistiky ukazují, že mnohé nemocnice nejsou plně připraveny na ošetření takto postižených pacientů. Průzkum nemocničních zařízení poskytujících akutní péči ve státě Washington (USA) ukázal, že pouze


67


44 % z nich uvádělo připravenost přijmout chemicky postižené pacienty, 70 % uvádělo, že má vypracovány protokoly reagující na kontaminaci nemocnice a případnou evakuaci. Doporučuje se však organizovat záchranné akce při chemických haváriích v úzké spolupráci s toxikologickými centry, protože pro zhodnocení situace a volbu postupů je zde třeba mít epidemiologické, laboratorní a toxikologické znalosti a zkušenosti. Ty nemusí být všude dostupné a účinná odezva je pak opožděna. Národní toxikologické centrum sestává z Kliniky toxikologie a klinické farmakologie, Institutu toxikologie a farmakologie (oddělení analytické toxikologie, oddělení experimentální toxikologie a farmakologie, toxikologické informační oddělení) a z Mobilní toxikologické jednotky. Je zde 10 klinických toxikologů, kteří ošetřovali uvedených 100 pacientů úspěšně po několik hodin. Centrum také poskytovalo úřadům a sdělovacím prostředkům po celou dobu veškeré potřebné informace o amoniaku, čímž se zabránilo psychosociologické reakci na chemickou katastrofu s hromadným dopadem na psychiku obyvatelstva. Z toho plyne, že NTC bylo schopno vyřešit tento složitý zdravotnický problém a získané zkušenosti by byly velkou pomocí při řešení možného teroristického útoku.

• • • • •

směr a rychlost přízemního větru a jeho stálost teplotu a částečně i vlhkost vzduchu vertikální stálost atmosféry charakter terénu: otevřený terén, zalesněný terén, městská zástavba, průmyslová zástavba, sídliště aj. výšková členitost terénu (převýšení terénu)

Ve městech, ale i na vesnicích jsou provozována různá zařízení, kde se používá jako chladicí médium amoniak. Jsou to zařízení, která se mnohdy provozují v centru města, čili v místech s vysokou koncentrací osob. Jedná se například o: • chladírenská potravinářská zařízení (pivovary, mrazírny, sodovkárny, mlékárny, jatka), • zimní stadiony. Chladicí zařízení zde instalovaná jsou většinou moderní, ale i tak obsahují velká množství amoniaku. Přitom tyto objekty nespadají pod dikci zákona o prevenci závažných havárií. Například bezvodý amoniak používá na území České republiky 155 zimních stadionů a asi 500 až 600 velkokapacitních chladicích zařízení v potravinářském průmyslu. Podrobněji je o tom pojednáno v odborném sdělení (8). Závěr

Modelování havarijních následků V současné době nejsou zpracovány dostatečné analýzy rizika pro jednotlivé státní správní celky, jako jsou nově zřízené kraje. Komplexní hodnocení závažné havárie nebo možného teroristického či nepřátelského působení se zneužitím průmyslových toxických látek pak vyžaduje nejen zhodnocení potenciálních zdrojů rizika některou klasickou metodou analýzy rizika pro velké správní celky, jako je například metoda IAEA TECDOC − 727 (1996), ale i uplatnění prostředků prognostického modelování všech možných havarijních následků. Zde je možné uplatnit nový nástroj prognostického modelování s označením TEREX (zkratka z teroristický expert). Projevem havarijního úniku průmyslových toxických látek pak může být vytvoření toxického oblaku, mlhy nebo oparu. Dosahy oblaku a rozsah zamořené oblasti po havarijním úniku průmyslové toxické látky jsou značně rozdílné a navíc závisí na řadě faktorů, mezi které můžeme počítat: • druh a množství uniklé průmyslové toxické látky • fyzikální, chemické a toxikologické vlastnosti látky

Podle studia odborné literatury asi 15 % případů úniků nebezpečných látek menšího či většího rozsahu vede k poškození zdraví a úmrtím, asi 13 % případů si vynutilo evakuaci obyvatel. Mezi potenciální rizikové faktory těchto havárií lze zařadit lokalizaci rizikového materiálu, druh škodliviny a dobu, kdy k úniku došlo. Podle literatury více těchto havárií se stalo v budovách (továrnách, skladech...) než při transportu. Nejčastější případy úniku jsou dokumentovány u amoniaku, pesticidů, těkavých organických sloučenin, kyselin a ropných produktů (4, 5). Autoři ve studii (4) vyhodnotili případy úniku škodlivin v 9 státech USA, které byly podchyceny v letech 1990−1992 systémem sledujícím havárie s únikem škodlivin provozovaným Úřadem pro toxické látky a registraci chorob (Agency for Toxic Substances and Disease Registry). V uvedeném období bylo zaznamenáno 3125 úniků škodlivin. Při 467 těchto haváriích (15 %) bylo postiženo 1446 osob, z toho 11 osob zemřelo. Informace o evakuaci nebyly dostupné u všech případů, podle údajů bylo nutno přikročit k evakuaci ve 457 případech

68


(15 %) − 400 těchto evakuací bylo nařízeno úřady (policie, hasiči). K většině úniků došlo v budovách (2391, tj. 77 %), při transportu to bylo zhruba ve čtvrtině případů (723, tj. 23 %). Dvě třetiny dokumentovaných havárií se staly v pracovních dnech, v 75 % v denních hodinách. Nejvíce případů se stalo v červnu, nejméně v únoru. Pouze ve 12 % sledovaných havárií šlo o únik více než jedné látky. Z 2889 úniků jediného typu škodliviny se havárie týkala amoniaku v 424 případech (tj. 15 %), v téměř 23 % došlo k poškození zdraví. Třetina dokumentovaných havárií s únikem amoniaku si vyžádala evakuaci obyvatel (34 %). Z výzkumu vyplynulo, že právě úniky amoniaku, chlóru a kyselin znamenaly největší ohrožení obyvatelstva a nejčastěji si vyžádaly evakuaci. Pravděpodobnost havárie s únikem amoniaku je poměrně vysoká, může dojít k nehodě při výrobě, skladování nebo přepravě. Amoniak je často používán v chladicích zařízeních v potravinářském průmyslu nebo také u zimních stadionů, takže při jeho úniku by mohly být ohroženy velké skupiny obyvatelstva. Navíc v dnešní době si stále zřetelněji uvědomujeme riziko chemických havárií způsobených teroristickým útokem. Proto je velmi důležité být předem připraveni na tato ohrožení jak na místě havárie (hasiči, policie, záchranná služba), tak i v nemocnici, kde dobrá organizace péče o velký počet postižených může přispět k záchraně řady životů. Bělehradský příklad je velmi cennou zkušeností, jak lze podobné situace zvládat.


Literatura 1. 2. 3. 4.

5.

6. 7. 8. 9.

ASAI, Y − ARNOLD, JL. Terrorism in Japan. Prehospital Disaster Med., 2003, vol. 18, p. 106−114. BAXTER, PJ. Major chemical disasters. Br. Med. J., 1991, vol. 302, p. 61−62. FERNER, RE. Chemical disasters. Pharmacol. Ther., 1993, vol. 58, p. 157−171. HALL, HI., et al. Risk factors for hazardous substance releases that result in injuries and evacuations: Data from 9 states. Am. J. Public Health, June 1996, vol. 86, no. 6, p. 855−857. HALL, HI., et al. Surveillance for emergency events involving hazardous substances − United States, 1990−1992. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep., 1994, vol. 43 (SS-2), p. 1−6. HALL, SK. Management of chemical disaster victims. Clin. Toxicol., 1995, vol. 33, no. 6, p. 609−616. LEONARD, RB. − TEITELMAN, U. Manmade disasters. Crit. Care Clin., 1991, vol. 7, p. 293−320. MIKA, O. − VIK, M. − KELNAR, L. Rozšířené a závažné zdroje rizik. Časopis 112, 2004, vol. 3, č. 9, s. 28−29. VUCINIC, S., et al. The role of National Control Center in organisation and management of mass ammonia accident. Proceedings, The First World Congress of Chemical and Biological Terrorism, Dubrovnik, 21−27 April 2001. Croatian Military Academy, Laboratory for NBC Protection, Zagreb. ASA, Aberdeen, Md 2001, p. 87−90, ISSN 1092−7255.

Korespondence: Ing. Otakar Mika, CSc. ISATech, spol. s r. o. Třída Kapitána Jaroše 31 602 00 Brno e-mail: Otakar [email protected] Do redakce došlo 17. 1. 2005



69

ZE STUDENTSKÝCH PRACÍ PODÍL BOJOVÝCH OTRAVNÝCH LÁTEK NA ZDRAVOTNICKÝCH ZTRÁTÁCH V PRVNÍ SVĚTOVÉ VÁLCE Aneta CVACHOVÁ Zdravotně sociální fakulta Jihočeské univerzity, České Budějovice

Motto: „Museli jsme zemřít: Způsob zániku jsme si mohli zvolit a my jsme si zvolili ten nejstrašnější.“ Ottokar von Czernin

Souhrn Použítí bojových otravných látek ve 1. světové válce bylo iniciováno německými vojenskými kruhy. Nápad profesora Fritze Habera, budoucího nositele Nobelovy ceny, použít jedovatý plyn pro vojenské účely způsobil, že došlo k propojení akademického výzkumu s vojensko-průmyslovým komplexem. V průběhu války bylo na obou stranách fronty použito obrovské množství různých toxických látek, protože ty vyhovovaly statickému způsobu boje, přestože některé byly překvapivě méně nebezpečné než konvenční zbraně. V tomto článku je podán stručný přehled o jedovatých chemických substancích používaných v I. světové válce a jejich podíl na zdravotnických ztrátách. Klíčová slova: Bojová otravná látka; Jedovatý plyn; I. světová válka; Zdravotnické ztráty.

Contribution of Chemical Warfare Agents to Medical Casualties in World War I Summary Chemical warfare agents were used in World War I by the German Army. It was the idea of Professor Fritz Haber, a future Nobel Prize holder, to use the toxic gas for military purposes. This caused the interconnection between academic research and the military industrial complex. Huge quantities of toxic agents were used by both sides during this war because they were well adaptable to static trench warfare, even though they were surprisingly substantially less lethal than conventional arms. This article discusses the synopsis of toxic chemical substances used in World War I and their contribution to medical casualties. Key words: Chemical warfare agent; Toxic gas; World War I; Casualties.

Úvod V první světové válce se střetly nepřátelské koalice, které kolem sebe zformovaly postupně oba hlavní rivalové, Německo a Anglie. Jednou koalicí byl Trojspolek, který vznikl v letech 1879 až 1882 a zahrnoval Německo, Rakousko-Uhersko a Itálii. Druhou koalicí byla Trojdohoda, která vznikla z rusko-francouzského spojenectví v letech 1891−1893, anglo-francouzské ,,srdeční dohody“ z roku 1904 a anglo-ruské smlouvy z roku 1907 (1). Zformování obou bloků nezůstalo bez vlivu na

mezinárodní vztahy: v posledních deseti letech před válkou se množily diplomatické zápletky a vznikaly vážné mezinárodní krize z toho, jak se oba dva bloky snažily vtáhnout do své sféry vlivu dosud nezávislé státy (Maroko) nebo přetáhnout do svého tábora země ležící na styčných plochách velmocenských zájmů. To platilo zejména o balkánském prostoru. Balkán, kde se střetly politické zájmy velmocí, se tak nakonec stal ,,sudem prachu“, který vyhodil do povětří vratký evropský mír. Zapálení doutnáku obstaralo Německo, jehož „vojenská strana“ se už několik let dožadovala brzkého válečného řešení s po-

70


ukazem na to, že německé vojenské šance se rok od roku zmenšují, úměrně s tím, jak postupují válečné přípravy Dohody. Rozpoutání války Záminkou pro rozpoutání války byl atentát na následníka habsburského trůnu Františka Ferdinanda (1863−1914) (7). Atentát spáchal Gavrilo Princip, který dvěma ranami z browningu zabil jednapadesátiletého arcivévodu a nechtěně i jeho ženu. Smrtí arcivévody přetekla číše skrytých konfliktů a habsburské mocnářství se po boku svého spojence Německa chystalo k napadení Srbska. Rakousko-Uhersko posílá nepřijatelné ultimátum, které bylo velmi ostře formulováno a mělo mezi oběma státy vyvolat válku. Srbsko ultimátum nepřijalo. Dne 28. července vyhlásilo Rakousko-Uhersko válku Srbsku. Skutečným důvodem byla snaha o nové přerozdělení světa.

Periodizace 1. světové války První světová válka procházela během svého trvání různými fázemi, a proto je v historii a různých publikacích periodizována (12). I. fáze: od počátku srpna do prosince 1914 Ztroskotaly snahy velmocí prosadit své cíle rychlou útočnou válkou, takže ta se postupně změnila ve válku vleklou (zákopovou) (7). II. fáze: 1915−1916 Válčící země se snažily rozhodnout válku v bojích, které přinesly dosud jen mrhání lidskými životy a válečným materiálem. Dochází k rozvoji revolučního hnutí, odporu proti válce, přizpůsobení politiky i ekonomiky velmocí totální válce. Na konci roku 1916 se projevuje vyčerpanost z války. III. fáze: od počátku r. 1917 do března 1918 Rozvoj revolučního hnutí vyvrcholil Velkou říjnovou revolucí, která ovlivnila významně průběh války a její výsledky. IV. fáze: od března 1918 do podepsání příměří v listopadu 1918 Poměr sil se změnil ve prospěch dohodových zemí díky vstupu amerických sil do války.


Použití chemických zbraní v 1. světové válce Koncem roku 1914 stály bojující státy nad troskami svých strategických plánů a nepříjemným faktem, že válka narostla do tak obrovských rozměrů (pohlcovala velké množství životů a válečného materiálu), že si s ní nikdo nevěděl rady. Na západní frontě vznikla koncem r. 1914 a začátkem r. 1915 takzvaná poziční válka. Armády po celé linii fronty vybudovaly systém zákopů a jen ojediněle vyrážely k útoku. Začalo dlouhé období ,,pozičního vyčkávání“. Pozn.: Deformující život v zákopech − z deníku pražského novináře E. E. Kische: „ Smrt je nám uchystána, že už nemůže přinést žádnou další změnu s našim současným stavem. Chuť k životu v nás odumřela, všude kolem nás jsou mrtví a umírající, naše myšlenky přivykly mnohem více smrti, než mohou kdy přivyknout myšlence na smrt nemocného, smrt zestárlého, nebo smrt odsouzeného. Naplnila nás beznaděj. Jsme svými návyky spíše mrtví nežli živí. Neznáme už žádné pocity života, žádnou ctižádost, která by se upínala na další život, nepřevlékáme se, sotva jíme, nemyjeme se nečistíme si zuby, spíme v hrobě a naše netečnost se nemůže lišit od myšlenkového klidu člověka práchnivějícího v hrobě.“

Začalo se proto uvažovat o nových možnostech boje, a přestože používání chemických látek k válečným účelům bylo zakázáno Haagskou konferencí z roku 1907 (2), vše se schylovalo k chemické válce. Když padly první oběti chemické války, bylo již pozdě celou věc rychle zastavit (7). Chemické otravné látky použité v 1. světové válce Celkem bylo na bojištích 1. světové války použito asi 45 druhů otravných chemických látek, z nichž 18 bylo letálních a 27 v různé míře dráždivých. Mezi nejnebezpečnější patřily chlór, fosgen, difosgen a především yperit. Zdravotnické ztráty způsobené yperitem převyšovaly asi 8krát ztráty způsobené všemi ostatními látkami použitými v průběhu války. Yperit byl proto někdy nazýván „králem plynů“ (2). Chemické otravné látky byly do výzbroje armád zaváděny postupně, tak jak se dařilo jednotlivým zemím vyrábět chemickou munici: • 1915 − chlór, fosgen, benzylbromid, xylylbromid • 1916 − difosgen, dibrommethylethylketon, chloropirkin, dichlorethylsulfid (yperit) • 1917 − difenylchloroarsin • 1918 − difenylkyanoarsin, ethyldichloroarsin, dichlormethylether


71


Některé otravné látky se ukázaly jako mimořádně účinné, jiné naopak po vojenské stránce zklamaly (11). Přesto použití bojových chemických látek přineslo nezměrné utrpení statisícům lidí. Ve válce zahynulo 8 538 316 a raněno bylo 21 219 452 vojáků. Na zranění a ztrátách na lidských životech se

významnou měrou podílely i bojové otravné látky. Ve válce zahynuly také milióny civilistů. Základní vojenské charakteristiky některých chemických otravných látek použitých v 1. světové válce jsou sumarizovány v tabulkách 1 až 3. Tabulka 1

Základní charakteristika chlóru Skupenství, barva, zápach

Stálost v terénu

Rychlost účinku

Vysoké koncentrace jsou schopné usmrtit člověka do několika Málo stálý, v otevřeném Žlutozelený plyn tuhnoucí minut, u nižších koncentrací je terénu se udrží 5−10 min, při −100,5 °C, snadno zkaotrava pomalejší. Po 3−6hodinové v uzavřeném terénu nebo palnitelný a dráždící ke kašli. latenci se objevují první příznaky, v budovách déle. po 6−12 hodinách se vyvíjí plicní edém, který trvá 2−3 dny.

Příznaky a účinky

Dráždí oči, nos, dýchací cesty, vede k zánětu spojivek a dráždivému kašli. Leptá kůži a sliznice a způsobuje plicní edém.

Tabulka 2 Základní charakteristika fosgenu Skupenství, barva, zápach

Stálost v terénu

Za nízkých teplot bezbarvá Málo stálý, v terénu se kapalina (bod varu 8,2 °C), udrží v létě 5−10 min, zapáchající po ztuchlém senu v zimě do 30 min. nebo tlejícím listí.

Rychlost účinku


Vysoké koncentrace jsou schopné usmrtit člověka do několika minut, u nižších koncentrací je otrava pomalejší. Po 3−6hodinové latenci se objevují první příznaky, po 6−12 hodinách se vyvíjí plicní edém, který trvá 2−3 dny.

Podráždění dýchacích cest, dušnost, dezorientace, plicní edém, dušení, šok.

Tabulka 3 Základní charakteristika yperitu Skupenství, barva, zápach

Stálost v terénu

Olejovitá bezbarvá (destilovaný) nebo hnědočervená V létě 3−7 dní, v zimě (technický) kapalina s bodem několik týdnů (podle tepvaru 227,8 °C a bodem tání loty). 14,4 °C. Zapáchá po hořčici nebo cibuli.

Rychlost účinku


Účinkuje na kůži do 4−8 hodin, v zažívacím traktu po 30 až 60 minutách, při vdechování par do několika hodin.

Do organismu proniká všemi cestami a v místech zasažení vyvolává změny v tkáních. Poměrně snadno proniká pórovitými materiály. Zasažená pokožka svrbí, pálí a zčervená. Do 24 hodin se vytvoří puchýře, ty do 48 hodin prasknou a vzniknou hluboké, snadno infikovatelné rány. Při vdechování dochází k zápalům a zduřením dýchacích cest. V zažívacím traktu způsobuje bolesti žaludku, zvracení a průjem. Velmi nebezpečné je zasažení očí. Je narušen imunitní systém, řídicí funkce centrální nervové soustavy, tvorba krvinek a látková výměna.

72


Vlastnosti chemických zbraní použitých v 1. světové válce (14) Chlór Když začala 1. světová válka, zvýšila se spotřeba hydroxidu sodného potřebného k výrobě celulózy. Vedlejším produktem a nebezpečným odpadem při výrobě byl chlór, pro nějž nebylo využití a vypouštěl se do ovzduší. Vzhledem k válečnému stavu nebyl čas na útlocitná řešení, i civilisté museli vydržet nějaké útrapy v zájmu vítězství. V Porýní emise chlóru ohrožovaly zdraví obyvatel. Tehdy kdosi dostal dobrý nápad, že by se chlór mohl prodat armádě, která by mohla odvézt ekologicky závadný odpad do nepřátelské ciziny a tam jej výhodně využít. Citujeme z dobového tisku: ,,... chlórem by se měli otravovat Francouzi a ne dobří občané Německa. Kdyby se chlór vypustil blízko fronty za příznivého větru vanoucího na francouzskou stranu, tak by to mohlo mít pořádný účinek. A armáda by ještě za odpad továrnám zaplatila.“ Teoretické podklady pro plynový útok vypracoval známý fyzikální chemik Walter Nernst a samotný návrh přednesl náčelníkovi generálního štábu hejtman Fritz Haber. Abychom pochopili, proč náčelník generálního štábu přijal obyčejného kapitána, musíme vědět, že hejtman Fritz Haber byl v civilu profesor, ředitel vědeckého ústavu císaře Viléma a v celém světě uznávanou veličinou v oblasti průmyslové chemie. O tři roky později dostal Nobelovu cenu, ovšem nikoli za svou válečnou iniciativu, ale za zvládnutí vysokotlaké syntézy amoniaku. To byl pro válčící zemi neocenitelný vynález, umožňující vyrábět z vody a vzduchu (dusíku v něm obsaženém) strategicky důležitou surovinu nutnou pro výrobu bezdýmého střelného prachu a různých druhů výbušnin a trhavin. V německé armádě měl proto podobné postavení jako později Einstein v USA. Plán na použití chlóru jako bojového plynu byl jednoduchý. Zkapalněný chlór je v láhvi pod tlakem a po otevření láhve z ní uniká a na vzduchu se odpařuje. Protože je těžší než vzduch, drží se u země a za vhodných meteorologických podmínek (slabý vítr a pokud možno teplotní inverze) se vytvoří po vypuštění dostatečně velkého množství plynu jeho smrtelná koncentrace do hloubky několika kilometrů. V prosinci 1914 byl tedy zformován zvláštní ženijní prapor. Během několika měsíců byl vybaven láhvemi s chlórem, kyslíkovými přístroji, vycvičen


v obsluze a přesunut na frontu u Yprů, kde byla rovina vhodná pro útok. Do první linie se muselo dopravit několik tisíc lahví s chlórem. Teprve druhá vypouštěcí linie, do které umístili 5730 lahví se 168 t chlóru, byla opravdu využita. Je samozřejmé, že taková těžkopádná operace několik set metrů od nepřátelské linie nezůstala protivníkovi utajena. Ten však, ačkoli byl o akci informován, např. přeběhlíky, nevěnoval přípravám potřebnou pozornost. Pozn.: Kanadské jednotky, které stály na pozicích proti zákopnickému praporu, si neodpustily žert, který lze označit za bezesporu nejskandálnější žert v dějinách. Vystrčily za zákopů plakát s nápisem: „Můžete dlouho čekat, než povane správný vítr.“ Němci čekali na druhé základně na příznivý vítr trpělivě celých jedenáct dní.

Když byl 22. dubna 1915 v 17.00 hodin (některé prameny, např. Kronika 20. století, uvádějí, že začátek útoku byl v 5 hodin ráno, jiné naopak začátek útoku posunují až na 18. hodinu) vypuštěn během 5 minut žlutozelený mrak chlóru, byl šokován celý svět. Velení ale nebylo připraveno na dokonalý úspěch pokusu. Jednotky vyšly až 10 minut po vypuštění chlóru. Na frontě široké 6 kilometrů našly v zákopech 5000 mrtvých a 15 000 raněných. Postupovaly vpřed téměř bez výstřelu až do splnění úkolu. Operační zálohy nebyly však připraveny, a tak se útok zastavil a průlom první linie se nevyužil k větší ofenzívě (6). Velení se snažilo o opakování úspěšné operace. Při plynovém útoku na východní frontě 2. května 1915 u Bolimova bylo zasaženo 9000 ruských vojáků a 6000 otravě podlehlo. Tehdy se spotřebovalo 1200 nádob s 264 tunami chlóru. Vůbec největší plynový útok byl proveden 19.−20. října 1915 u Remeše u pevnosti Pompelle, kde Němci použili 25 tisíc lahví s 550 tunami chlóru, vypuštěného ve dvou vlnách během 24 hodin. Otrava chlórem je provázena velkými bolestmi postiženého. Chlór nejprve dráždí průdušky ke křeči, poškozuje jejich stěny a ztěžuje dýchání. V plicích pak naleptává stěny plicních sklípků, které se naplňují tekutinou. Vzniká otok plic, plicní edém spojený s krvácením do plic. Těžká otrava končí pozvolnou smrtí udušením (tab. 1). Ačkoli se chlór používal k plynovým útokům jen několik měsíců, zemřelo na následky otrav chlórem 13 000 vojáků a dalších 30 000 bylo zraněno. Spotřeba chlóru byla 1500 tun. To znamenalo asi 115 kg na jednoho mrtvého a dva raněné.



Vojáci zkoušeli proti chlóru všelicos. V největší nouzi, když se dusili, močili na kapesníky, přikládali si je ke tváři a pokoušeli se dýchat přes vlhkou tkaninu. I tato primitivní ochrana trochu pomáhala. Ani velitelství, které před útokem nebezpečí přehlíželo, nezahálelo. Dohodové jednotky už 14 dnů po prvním útoku dostávaly respirátory podobné maskám, které dnes při smogu nosí Japonci. Před ústa a nos se pevně přitiskla vrstva bavlněného tkaniva nasyceného sodou a thiosíranem sodným. Při zahájení plynového útoku se tampóny navlhčily a připevnily na obličej. Když přes ně voják dokázal dýchat (odpor vlhké vrstvy byl značný a člověk se musel na dýchání plně soustředit), účinek chlóru se snížil, protože chlór se v tampónu chemicky vázal. Postupně se začaly vyrábět a používat i plynové masky a vojáci se s nimi učili zacházet. Časem dosáhli takové dokonalosti, že s nimi i četli, odpočívali, bojovali a vybavili jimi i své koně. Protože ochrana snížila účinnost chlóru, bylo třeba vymyslet něco jiného. Začaly se objevovat nové chemické bojové látky, které vědci postupně vyvíjeli. Fosgen Fosgen se používal stejně jako chlór k plynovým útokům a mimo to s ním byly plněny dělostřelecké granáty. Tím odpadla nutnost čekat na nespolehlivý vítr a požadavky na počasí byly méně náročné. Pro své výhody se stal nejpoužívanější otravnou látkou 1. světové války. V některých armádních skladech přečkaly jeho zásoby i 2. světovou válku. Fosgen, chlorid kyseliny chlormravenčí či správně karbonyldichlorid (COCl2), se snadno vyrobí sloučením chlóru s oxidem uhelnatým na aktivním uhlí. Dva jedovaté plyny se spojí za působení aktivního uhlí při teplotě 200 °C nebo při působení světla (řecky fos = světlo, gennao = tvořit), a tak vznikne plyn ještě jedovatější. Plynný fosgen má vyšší specifickou hmotnost než chlór. Proto se nerozptyluje tak snadno jako chlór. Jeho nebezpečnost spočívala v tom, že při styku s vlhkými sliznicemi se fosgen rozkládal na oxid uhličitý a kyselinu chlorovodíkovou. Ta ničila tkáně plic a dalších orgánů, které byly vystaveny působení fosgenu (tab. 2). Vojáci se proti působení fosgenu, předtím něž jim byly přidělovány plynové masky, chránili tím, že si přes obličej vázali mokré kusy látky. Ochrana byla složitější než u chlóru. Později byly vyvinuty filtry k ochranným maskám na bázi aktivního uhlí. Používání chemické munice bylo stále častější.

73

Postupně došlo k tomu, že každý čtvrtý granát vystřelený na frontě v 1. světové válce byl plynový. Začaly se také používat jedovaté dýmy, které většinou neměly smrtící účinek. Stačilo však, že nutily ke kašli a zvracení. Nevolnost přiměla vojáky sejmout ochranné masky. To je vystavilo působení fosgenu, se kterým se často kombinovaly (3). Chlorpikrin Chlorpikrin se vyráběl z odpadní kyseliny pikrové (trinitrofenolu), která nebyla dost kvalitní pro výrobu munice a představovala odpad. Tuto bojovou chemickou látku začaly používat carské jednotky. Je to nažloutlá olejovitá kapalina se silným dusivým zápachem a dráždivým účinkem na oči a dýchací cesty. Vysoké koncentrace chlorpikrinu usmrtí člověka do 10 minut (9). Yperit Poprvé byl použit opět u Ypres a dostal podle tohoto místa své francouzské jméno. Němci mu říkali Lost, Američané hořčičný plyn (mustard gas) podle charakteristického zápachu. Byl to tzv. sirný yperit, později byly vyvinuty i jiné typy yperitů (9). Mechanismus toxického účinku yperitu není dosud uspokojivě vysvětlen. Zasahuje do celé řady biochemických pochodů v organismu a neexistuje proti němu účinný protijed. Léčba je proto jen symptomatická a snaží se zejména zabránit sekundární infekci ran, které se hojí jen velice pomalu. Páry yperitu působí zarudnutí pokožky a její poškození, zejména poškozují sliznice a oči. Pokud se dostanou do plic, účinek je podobný jako u látek dusivých. Kapalný yperit vyvolává na kůži a sliznicích puchýře. Puchýře způsobené yperitem se jen zdlouhavě léčí a jsou náchylné k druhotným infekcím (tab. 3). Péče o zasažené vojáky vyřadí další, kteří se o ně musí starat. Před yperitem je nutno chránit celé tělo, nikoli jen dýchací cesty. To vyžaduje izolování celého těla od zamořeného prostředí vhodným chemickým oblekem, který musí být vyroben z materiálů nepropouštějících yperit. Pohyb v takovém obleku je však namáhavý a časově omezený, protože je v něm zamezeno odpařování potu, tělo se v něm rychle přehřívá a hrozí tepelný šok. Otravy yperitem byly obtížně řešitelné také proto, že neexistovala žádná specifická antidotní terapie a ve velkém množství případů se vyskytovaly pozdní komplikace. Na tomto faktu se dosud nic nezměnilo (5, 13).

74


Produkce chemických látek v období před 1. světovou válkou V předválečném období byla produkce chemických látek použitelných k vedení chemické války zanedbatelná a omezená prakticky jen na chlór. V roce 1892 byly v Německu vyrobeny první 3 t chlóru, ale již v roce 1900 to bylo 23 t, v roce 1913 již 57 t, v roce 1918 pak 66 t a jeho poválečná výroba se v Německu pohybuje ve stovkách tun. Předválečná výroba mimo Německo byla zanedbatelná (tab. 4). Tabulka 4 Produkce chlóru (údaje v tisících tun) Rok

1892

1894

1900

1913

1918

Německo

3

0

23

57

66

Svět

0

1

0

0

0

Produkce bojových chemických látek v období 1. světové války V období války se produkce bojových otravných látek prudce zvýšila ve všech zemích, které vstoupily do války, zejména však v Německu, které v té době mělo nejrozvinutější chemický průmysl. Přehled o výrobě bojových chemických látek v jednotlivých zemích poskytuje tabulka 5. Celkově bylo vyrobeno téměř 190 000 tun jedovatých chemikálií. Kdo použil v 1. světové válce bojové otravné látky? Otravné plyny použily v 1. světové válce všechny hlavní válčící mocnosti. První byla Francie na zá-


padní frontě na jaře 1915 (použila málo účinné ruční a puškové granáty plněné slzotvorným chloracetonem a perchlormethyl-merkaptanem vyrobeným ze sirouhlíku a chlóru), potom Německo provedlo 22. dubna 1915 již zmíněný útok chlórem u Yprů, v srpnu 1915 použili chlór Britové u Loosu. Po těchto začátcích se chemická válka dále vystupňovala. Začátkem roku 1916 zavedli Francouzi do výzbroje dělostřelecké granáty s fosgenem a kyanovodíkem, v květnu téhož roku použili Němci u Verdunu tzv. zelený kříž (chlormravenčan) a 13. července 1917 opět Němci použili yperit u Langenmarcku ve Flandrech (8). Jako poslední vstoupily do plynové války Rakousko-Uhersko s Itálií. Na základě německých zkušeností byl na jaře 1916 v dolnorakouské Křemži postaven tzv. Gaskampfbataillon c. a k. armády, jemuž velel hejtman Owen, vyškolený v Berlíně. Pro použití tohoto vojenského útvaru se rozhodl začátkem června 1916 velitel rakousko-uherského VII. armádního sboru arcivévoda Josef na řece Soče, kde v prostoru kopce Monte St. Michele hrozil italský průlom jeho obrany. Prosadil svůj záměr přes odmítavé stanovisko velitele 5. armády generála Boroeviće a po vleklých přípravách byl plyn použit dne 29. června 1916 k odražení italského útoku. K plynové válce nebyla tehdy rakousko-uherská armáda technicky vybavena a jednalo se o velmi primitivní vypouštění směsi chlóru a fosgenu z tlakových lahví za pomoci speciálních trysek z vlastního zákopu. Výsledek nebyl vzhledem k malé koncentraci oblaku a proměnlivému směru větru valný − v italské sestavě padlo za útoku asi 6000 mužů, z toho na účinky plynu zahynuli pouze jednotlivci.

Tabulka 5 Množství chemických otravných látek vyrobených v průběhu 1. světové války (údaje v tisících tun) Země

Chlór

Fosgen

Difosgen

Yperit

Chloropikrin

Kyanidy

Celkem

Německo

58 100

18 100

11 600

7600

4100

−

99 500

Francie

12 500

15 700

−

2000

500

7700

38 400

Británie

20 800

1400

−

500

8000

400

31 100

2400

1400

−

900

2500

−

7200

USA Rakousko

−

−

−

−

−

−

5245

Itálie

−

−

−

−

−

−

4100

Rusko

−

−

−

−

−

−

3650

Celkem

93 800

36 600

11 600

15 100

8100

11 000

189 195


75


Podíl ztrát na zdravotnických ztrátách v 1. světové válce Přesný podíl na zdravotnických ztrátách v důsledku použití chemických látek není znám, jelikož někteří vojáci zemřeli hned na místě a jiní až na následky zasažení později. Vyčíslení ztrát se proto liší. Kniha amerického specialisty A. M. Prentisse (10) udává, že v průběhu 1. světové války bylo celkem 1 296 853 vojáků zasaženo chemickými zbraněmi, z toho 91 200 zemřelo. Vědci se shodují na tom, že množství těchto ztrát se pohybuje mezi 2,9 až 3 % celkových ztrát na lidských životech. Vývoj ochranných pomůcek proti otravným látkám v 1. světové válce V roce 1917 se začalo využívat ochranných masek, jejichž filtry byly plněny aktivním uhlím. Nejlépe byla prostředky individuální ochrany proti bojovým otravným látkám vybavena německá armáda. Německo mělo od začátku bojů plynové masky, nosní svorky a dýchání ústy umožňovala vzduchová hadice spojená s filtrační nádobkou. Nejúčinnější maskou v té době byla francouzská maska (Tissotova). Neprodyšná obličejová část této masky byla ze slabé a ohebné gumy a byla konstruována tak, že filtrovaný vzduch v ní proudil kolem nosu nejprve na zorníky, a bránil tak jejich opocování. Zásadní změnu do konstrukce individuálních ochranných prostředků přineslo nasazení yperitu na bojištích 1. světové války. Při použití yperitu plynové masky nedostačovaly, neboť plyn pronikal přes oděv a působil celým povrchem těla. Ochrana proti yperitu vyžadovala izolování celého těla od zamořeného prostředí pogumovanými tkaninami. V té době byla technologie výroby pogumovaných tkanin nedokonalá, takže takové obleky chránily člověka jen několik hodin, dokud yperit nepronikl vrstvou látky. Pohyb v obleku byl navíc mimořádně nepříjemný a fyzicky i psychicky namáhavý. V takovém oděvu se dalo vydržet, zvláště na slunci a při vyšších teplotách, jen omezenou dobu. Zdravotnická služba a lékařství Velikost mobilizovaných armád a obrovské ztráty 1. světové války postavily vojenskou zdravotnickou službu před velké problémy. Ranění museli být čas-

to evakuováni z palebných linii v noci nebo při užití přehrad, kdy se nosiči raněných vydávali vpřed kryti palbou. Lékaři poskytovali první pomoc v improvizovaných podmínkách. Velkým problémem bylo objevení se nových typů poranění. Novou nepoznanou nemocí byl i traumatický šok ze zranění (4). Byl přijat jako psychická porucha. Nemocní trpící touto chorobou se stávali hysterickými, dezorientovanými a přestali poslouchat rozkazy. Největší změnou v charakteru válečných poranění byly účinky chemických otravných látek, zejména yperitu. Postižení yperitem bylo zásadně novým, do té doby neznámým fenoménem. Zasažení yperitem postihovalo celý povrch těla a projevovalo se tvorbou špatně se hojících vředů. V té době ještě nebyl znám penicilin (Fleming, 1928) a udržet otevřenou a dlouho se hojící ránu ve sterilních podmínkách bylo prakticky nemožné. Velmi časté proto byly rozsáhlé gangrény, které bylo nutno řešit amputací končetin. Poprvé se také projevil ,,pooperační šok“. Vojenští chirurgové se museli také vyrovnat s tzv. zákopovou nohou, ve které byla v roce 1916 rozpoznána plíseň z vlhka. Válka si vyžádala velké oběti na životech, ale současně paradoxně vyvolala velký pokrok v medicíně. Byly vyzkoušeny nové léčebné metody. Úspěšně byla v bojových podmínkách provedena transfuze krve. V některých případech se užívalo uskladněné krve namísto krve od bezprostředních dárců. Byl zahájen vývoj antidotních prostředků, které by mohly eliminovat toxický účinek bojových chemických látek. Rentgenové zařízení bylo běžné na předsunutých ošetřovnách na zjištění přesného umístění kulek a střepin. Na frontě začaly pracovat také ošetřovatelky. Závěr Tématem této práce jsou chemické zbraně a jejich podíl na ztrátách v 1. světové válce. V úvodu práce jsme se stručně zabývali průběhem a periodizací 1. světové války. V dalších částech pak jednotlivými nejvýznamnějšími bojovými látkami a případnou ochranou proti nim. Během 1. světové války bylo podle dostupných údajů zasaženo chemickými zbraněmi téměř 1,3 miliónu vojáků, z toho téměř 100 000 na následky zasažení zemřelo. Podíl chemických bojových látek na celkových ztrátách tak činí přibližně 3 %. Statistika zraněných je však nepřesná a není možné přesně určit tento podíl.

76


Poděkování Tato práce vznikla jako pokračování semestrální práce. Děkuji prof. RNDr. Jiřímu Patočkovi, DrSc. za poskytnutí studijních materiálů a za cennou pomoc při zpracování rukopisu a doc. MUDr. Jiřímu Bajgarovi, DrSc. za kritické připomínky.

7. 8. 9. 10.

Literatura 1. 2.

3. 4.

5.

6.

ADDINGTON, LH. The great war: An imperial history. J. Milit. History, 2004, vol. 68, p. 621−622. BAJGAR, J. Historie používání chemických zbraní a jednání o jejich zákazu. 1. vyd. Hradec Králové, Vojenská lékařská akademie JEP, 1996. 114 s. Učební texty VLA JEP. Sv. 302. ISBN 80-85109-40-9. ETTEL, V. Chemická válka. Praha, 1932. FORD, JD., et al. Posttraumatic stress disorder symptoms, physical health, and health care utilization 50 years after repeated exposure to a toxic gas. J. Trauma. Stress, 2004, vol. 17, p. 185−194. GHASSEMI-BROUMAND, M − AGIN, K. − KANGARI, H. The delayed ocular and pulmonary complications of mustard gas. J. Toxicol-Cutaneous Ocular Toxicol., 2004, vol. 23, p. 293−302. HABER LF. The poisonous cloud. Chemical warfare in the first World War. Oxford, Clarendon Press, 1986.

11.

12. 13.


HEŘTOVÁ, Y. Zákopová válka. Praha, 1983. MARTINETZ, D. Der Gaskrieg 1914−1918. Bonn, Bernard and Graefe Verlag, 1996. PATOČKA, J., et al. Vojenská toxikologie. Praha, Grada, 2004. PRENTISS, AM. Chemicals in War (A Treatise on Chemical Warfare). New York; London, McGraw-Hill Book Comp., 1937. VAN der KLOOT, W. April 1915: Five future nobel prize-winners inaugurate weapons of mass destruction and the academic-industrial-military complex. Notes Records Royal Soc., London, 2004, vol. 88, p. 149−160. WINTER, JM. 1. světová válka. Praha, 1995. ZARCHI, K. − AKBAR, A. − NAIENI, KH. Long-term pulmonary complications in combatants exposed to mustard gas: a historical cohort study. Int. J. Epidemiol., 2004, vol. 33, p. 579−581.

Korespondence: Aneta Cvachová Jungmanova 9 669 02 Znojmo e-mail: [email protected]




77

RADIAČNÍ ENTERITIDA: ČASOVÁ A DÁVKOVÁ ZÁVISLOST POKLESU STŘEVNÍCH KRYPT NA MODELU OZÁŘENÝCH POTKANŮ 1

Mjr. doc. MUDr. Jan ÖSTERREICHER, Ph.D., 1, 2MUDr. Daniel DRIÁK, 1Šárka PRŮCHOVÁ, 1por. Mgr. Zdena VILASOVÁ 1 Univerzita obrany, katedra radiobiologie Fakulty vojenského zdravotnictví v Hradci Králové 2 Gynekologicko-porodnická klinika 1. lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice Na Bulovce, Praha

Souhrn Na modelu celotělově a jednorázově ozářených potkanů jsme měřili počet střevních krypt v zorném poli jako fundamentální biodozimetrický ukazatel, jenž bude porovnáván s ostatními biodozimentrickými markery. Byly vyšetřovány oblasti jejuna a příčného tračníku, mezi jejichž hodnotami nebyl zjistěn signifikantní rozdíl. Při vyšetření ozářeného jejuna podprahovými dávkami byl zjištěn úbytek počtu krypt již 3. den po ozáření dávkami od 5 Gy. Klíčová slova: Radiační enteritida; Patogeneze; Počet krypt; Biodozimetrie.

Radiation-Induced Enteritis: Intestinal Crypt Decrease in a Model of Irradiated Rats Depending on Time and Dose Summary In our model of male Wistar rats irradiated all over their bodies by a single dose, we measured crypt survival as a fundamental biodosimetric marker which will be compared to other biodosimetric markers. We examined the jejunum and the colon of rats and found no significant differences, although marked crypt decrease was measured as early as the 3rd day after the irradiation with a dose of 5 Gy. Key words: Radiation-induced enteritis; Patogenesis; Crypt survival; Biodosimetry.

Úvod Gastrointestinální syndrom akutní nemoci z ozáření (ANO) je zcela letální klinicko-patologickou jednotkou a manifestuje se 5. až 8. den po jednorázovém ozáření na oblast krajiny břišní dávkou 8 Gy a vyšší (4). Jde o souhrn zánětlivě degenerativních procesů postihujících všechny úseky gastrointestinálního traktu (GIT). Vedoucími příznaky jsou masivní průjmy vedoucí k dehydrataci, oběhovému selhání, intoxikaci a septickému šoku (2, 8). Patologickoanatomicky jde o enteritis necroheamorrhagica acuta, respektive duodenitis, jejunitis či ileitis (1, 2). Ačkoli stále platí názor, že subcelulární a celulární podstata patogeneze střevního syndromu ANO není známa, na základě mnoha prací se můžeme domnívat, že tento syndrom vzniká na podkladě insuficientní novotvorby enterocytů (3, 5, 11). Je obecně příjímanou hypotézou, že nové enterocyty jsou tvořeny kmenovými buňkami ve střevních kryptách. Při in vitro experimentech byla zjištěna radiosenzitivita střevní linie s D0 cca 4 Gy, což

vysvětluje vyšší rezistenci, než je tomu například u kostní dřeně (10). Morfologicky je již během prvních hodin po ozáření nadprahovými dávkami patrná rychle progredující pyknóza, karyolýza, karyorexe a extruze buněčných reziduí do lumina. Relativně vysoká mitotická aktivita ve střevních kryptách se rapidně snižuje a po 24 hodinách ustává úplně, zatímco deplece enterocytů na vrcholcích klků pokračuje (4). Tým profesora Pottena (6, 7) publikoval, že počet střevních krypt v zorném poli, resp. na transverzálním řezu, lze využít jako histologicky zjistitelného hrubého biodozimetrického ukazatele, který vykazuje podobnou dynamiku jako klasický ukazatel přežívání ozářených jedinců, tj. je závislý na čase a absorbované dávce záření. Proto jsme měření počtu střevních krypt v zorném poli použili jako výchozí na našem modelu celotělově ozářených potkanů dávkami 1−20 Gy. Dalším účelem tohoto měření je zjištění rozdílné radiosenzitivity tenkého a tlustého střeva.

78


Materiál a metoda Pokusná zvířata a jejich ozařování K experimentu byli použiti potkaní samci kmene Wistar ve stáří 12−16 týdnů o hmotnosti 250 až 300 gramů. Všechna laboratorní zvířata byla krmena dietou DOS-2B a napájena vodovodní vodou ad libitum. Potkaní samci byli ozářeni pro zjišťování křivek přežití dávkami 1, 5, 10, 15, 20, 25 a 30 Gy, pro morfometrická a imunohistochemická vyšetření dávkami 1, 5, 10, 15, 20 Gy použitím kobaltového zdroje Chisotron Chirana ve vzdálenosti 1 m od zdroje dávkovým příkonem 1,44 Gy/min. Před ozářením byla navozena lehká narkóza roztokem složeným z 1 dílu Rometaru (Spofa, Praha), ze 3 dílů Narkamonu (Léčiva, Praha) a z 12 dílů fyziologického roztoku. Tento narkotizační roztok byl aplikován intramuskulárně v dávce 10 ml/kg. Schéma experimentu Potkani ozáření celotělově zářením γdávkami 1 až 20 Gy byli rozděleni na 21 skupin po 10 jedincích (celkem 210 zvířat) podle výše absorbované dávky: 0, 1, 5, 10, 15, 20 Gy. Ozářená zvířata byla odebrána k histologickému vyšetření 24, 48, 72 a 96 hodin po ozáření, neozáření potkani byli vyšetřeni 72 hodin po klamném ozáření. Histologické vyšetření Po uplynutí daných časových intervalů byly laboratorní potkani usmrceni cervikální dislokací. Při pitvě odebraná první klička jejuna za duodenálním ohbím byla fixována ve formolu, tkáňové partikule posléze zality do parafínu a nakrájeny pomocí mikrotomu (Meopta). Po natažení řezů na sklíčka byly preparáty histochemicky barveny hematoxylinem-eozinem (k měření morfometrických parametrů epitelu jejuna) a Grammovým barvením (k posouzení bakteriální infekce). Po obarvení byly preparáty odvodněny a zamontovány použitím kanadského balzámu a krycího sklíčka (9). Měření počtu střevních krypt Počet střevních krypt v zorném poli byl měřen u každého zvířete v jednom náhodně vybraném zorném poli o průměru 300 µm a stonásobném zvětšení použitím mikroskopu Olympus CX 30. Při měření byla linie krypt centrována do nejširšího úseku zorného pole.


Statistické hodnocení K určení významnosti rozdílu dat byly získané údaje počítány testem podle Mann-Whitneyho. V tabulkách jsou uvedeny hodnoty průměrů jednotlivých skupin ± intervaly spolehlivosti na hladině 95% spolehlivosti, tj. dvojnásobek směrodatné odchylky průměru (2 x S.E.M.). Hodnota korelačního koeficientu r byla získána využitím standardního testu programu Excel (Microsoft). Výsledky Úhyn 2 potkanů z 10 byl pozorován 3. den po ozáření dávkou 20 Gy. V průběhu 4. dne po ozáření dávkami 15 a 20 Gy uhynulo 9 potkanů z 10. Měření počtu krypt v colon transversum Ve srovnání s hodnotami kontrolních potkanů byl zjištěn signifikantní úbytek počtu krypt v zorném poli při vyšetření příčného tračníku zvířat 48 hodin po ozáření dávkou 20 Gy (p = 0,008) a 72 hodin po ozáření dávkami 15 a 20 Gy (p ≤ 0,01; viz tab. 1). Dva dny po ozáření dávkou 20 Gy byl počet krypt statisticky významně nižší než u zvířat ozářených dávkami 1, 5 a 10 Gy (p ≤ 0,014). Také 72 hodin po celotělovém ozáření potkanů dávkami 15 a 20 Gy byly pozorovány statisticky významně nižší počty krypt v zorném poli než u zvířat ozářených dávkami 1, 5 a 10 Gy (p ≤ 0,01). U zvířat ozářených dávkou 15 Gy byl naměřen statisticky významný úbytek počtu krypt mezi 72 hodinami po ozáření a časnějšími časovými intervaly (p ≤ 0,045). U laboratorních potkanů ozářených dávkou 20 Gy byl patrný pokles počtu krypt u zvířat vyšetřených 48 a 72 hodin po ozáření vůči jedincům vyšetřených 24 hodin po ozáření (p ≤ 0,001). Měření počtu krypt v jejunu Vůči hodnotám naměřeným u neozářených zvířat byl zjištěn u potkanů vyšetřených 24 hodin po ozáření dávkou 20 Gy, 48 hodin po ozáření dávkami od 10 Gy, 72 a 96 hodin po ozáření dávkami od 5 Gy signifikantní úbytek počtu krypt (p ≤ 0,031; viz tab. 2). Mezi potkany vyšetřenými 24 hodin po ozáření dávkou 20 Gy byl naměřen statisticky významný pokles počtu krypt vůči zvířatům ozářených dávkami 10 a 15 Gy (p < 0,05). U potkanů vyšetřených 48 hodin po ozáření byly patrné významné rozdíly v počtu krypt mezi jedinci ozářenými dáv-


79


Tabulka 1 Průměrné hodnoty počtu krypt v colon transversum v zorném poli u ozářených potkanů ± 2 x S.E.M. Doba po ozáření

0 Gy

1 Gy

5 Gy

10 Gy

15 Gy

20 Gy

24 hodin

8,3 ± 1,50

7,9 ± 0,72

8,3 ± 0,57

7,7 ± 0,75

8,1 ± 0,52

48 hodin

7,8 ± 0,38

7,78 ± 0,52

7,3 ± 0,64

7 ± 0,8

6 ± 0,562

7,7 ± 0,58

8,2 ± 0,79

7,7 ± 0,75

5,5 ± 0,942

5,56 ± 0,672

7,0 ± 0,54

7,89 ± 0,80

7,8 ± 0,55

přežilo 1 zvíře

přežilo 1 zvíře

7,5 ± 0,58

72 hodin 96 hodin

Pravděpodobnost rozdílů měřených hodnot vůči hodnotám neozářených kontrolních zvířat: p ≤ 0,051; p ≤ 0,012; p ≤ 0,0013 Tabulka 2 Průměrné hodnoty počtu krypt v jejunu v zorném poli u ozářených potkanů ± 2 x S.E.M. Doba po ozáření

0 Gy

1 Gy

5 Gy

10 Gy

15 Gy

20 Gy

24 hodin

7,9

± 0,77

8,1

± 0,52

8,3

± 0,64

8,6

± 0,64

7,4

48 hodin

8,7

± 0,94

8,2

± 0,47

7,4

± 0,581

6,8

± 0,552

6

7,7

± 0,57

7,3

± 0,571

6,9

± 0,722

5,2

± 0,683

4,9

7,7

± 0,40

7,4

± 0,511

5,67

± 0,773

72 hodin 96 hodin

8,6

± 0,64

přežilo 1 zvíře

± 0,421

± 0,892 ± 0,663

přežilo 1 zvíře

Pravděpodobnost rozdílů měřených hodnot vůči hodnotám neozářených kontrolních zvířat: p < 0,051; p < 0,012; p < 0,0013

Obr. 1: U neozářeného potkana lze na řezu jejuna obarveného hematoxylinem-eozinem pozorovat při 200násobném zvětšení četné střevní krypty.

Obr. 2: U potkana vyšetřeného 3 dny po ozáření 20 Gy lze na řezu jejuna obarveného hematoxylinem-eozinem pozorovat při 200násobném zvětšení patrný významný úbytek střevních krypt. Na obrázku můžeme dále pozorovat poruchu epiteliální architektoniky vedoucí k denudaci střevní sliznice.

80


kami 10 a 20 Gy (p = 0,028). Signifikantní rozdíly byly také naměřeny mezi potkany vyšetřenými 72 hodin po ozáření dávkou 10 Gy a dávkami vyššími (p ≤ 0,007). U ozářených zvířat byl v jednotlivých časových intervalech zjištěn postupný pokles počtu krypt, který byl významný mezi potkany ozářenými dávkou 10 Gy a vyšetřenými 24 a 48 hodin po ozáření vůči jedincům vyšetřeným 96 hodin po ozáření (p ≤ 0,006). Dále byl pozorován statisticky významný pokles mezi všemi intervaly zvířat ozářených dávkou 15 Gy (p ≤ 0,006). Mezi zvířaty vyšetřených 24 hodin po ozáření dávkou 20 Gy byly naměřeny významné rozdíly vůči potkanům vyšetřených 48 a 72 hodin po ozáření (p ≤ 0,012). Při srovnání hodnot počtu krypt v jejunu a v colon transversum nebyly mezi ozářenými zvířaty zjištěny statisticky významné rozdíly. Korelační koeficient r mezi hodnotami počtu krypt v jejunu a v colon transversum je roven 0,74, tj. naměřené hodnoty v obou lokalizacích jsou na sobě závislé. Diskuse Z hlediska zdravotního zabezpečení vojsk je detailní poznání patogenetických mechanismů a kauzálních terapeutických možností gastrointestinálního syndromu ANO stěžejní pro snížení zdravotnických ztrát a zvýšení bojeschopnosti vojáků. Civilním aspektem potlačení rozvoje střevního syndromu ANO je zvýšení toleranční dávky gastrointestinálního systému při radioterapii abdomino-pánevních a retroperitoneálních malignit, jejichž incidence v posledních dekádách vzrůstá. Z našich výsledků na modelu jednorázově celotělově ozářených potkanů vyplývá, že v radiosenzitivitě tenkého a tlustého střeva není statisticky významný rozdíl. Reakce obou střevních partií je podobná, ačkoli při měření počtu střevních krypt bylo možné od 3 dnů po ozáření pozorovat v jejunální oblasti statisticky významný úbytek střevních krypt v zorném poli již po ozáření dávkami od 5 Gy. To je významné z biodozimetrického hlediska, jelikož dávky menší než 8 Gy jsou považovány za podprahové. Dále jsme ověřili, že dynamika počtu střevních krypt je velmi podobná dynamice klonogení aktivity, ačkoli v rámci posuzování celého střevního kompartmentu se D0 nachází v letální oblasti časově-dávkového schématu. V literárních zdrojích je popisována vrcholící deepitelizace střevní sliznice vrcholící 5−7 dní po


ozáření s následným funkčním selháním mikrobiální bariéry rezultující do peritonitidy (3, 4, 8). Na našem modelu ozářených potkanů jsou letální účinky patrné již 4 dny po ozáření dávkou 15 Gy. Můžeme se domnívat, že 5. až 7. den po ozáření by bylo možné pozorovat úhyn potkanů ozářených dávkou 10 Gy. Z toho vyplývá, že dynamika střevního syndromu ANO je u potkanů podobná jako u ozářených pacientů. Závěrem lze uvést, že ukazatel počtu střevních krypt lze označit za fundamentální biodozimetrický ukazatel aplikovatelný jako základní marker u ozářených partií intestinálního traktu. Měřením počtu střevních krypt jsou zjistitelné signifikantní rozdíly i po subletálním ozáření a není významný rozdíl mezi výsledky měřenými v tenkém a tlustém střevě. V budoucnosti budou další perspektivní biodozimetrické ukazatele vztahovány k citlivosti právě počtu střevních krypt. Literatura 1. 2. 3.

BEDNÁŘ, B. aj. Patologie. Praha, Avicenum, 1982. 684 s. BEDNÁŘ, B. aj. Patologie II. Praha, Avicenum, 1983. 583 s. CLASSEN, J., et al. Radiation-induced gastrointestinal toxicity. Strahlenter. Onkol., 1998, vol. 174 (Su. III), p. 82−84. 4. FAJARDO, LF. Pathology of radiation injury. New York, Masson Publishing, 1982. 286 p. 5. MacNAUGHTON, WK. Review article: new insights into the pathogenesis of radiation-induced intestinal dysfunction. Aliment. Pharmacol. Ther., 2000, vol. 14, p. 523−528. 6. POTTEN, CS. Radiation, the Ideal Cytotoxic Agent for Studying the Cell Biology of Tissues such as the Small Intestine. Radiat. Res., 2004, vol. 161, p. 123−136. 7. ROBERTS, SA., et al. Intestinal crypt clonogens: a new interpretation of radiation survival curve shape and clonogenic cell number. Cell Prolif., 2003, vol. 36, p. 215−231. 8. SHER, ME. − BAUER, J. Radiation-induced enteropathy. Am. J. Gastroenterol., 1990, vol. 85, p. 121−128. 9. VACEK, Z. Histologie a histologická technika II. 1. vyd. Brno, Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1996. 185 s. 10. VÁVROVÁ, J. − FILIP, S. Radiosenzitivita hematopoetického systému. Praha, Galén, 2002. 100 s. 11. ZORC-PLESKOVIČ, R., et al. Colon mucosal cells after high-dose fractional irradiation. Fol. Biol., 2000, vol. 46, p. 43−48. Korespondence: Mjr. doc. MUDr. Jan Österreicher, Ph.D. Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové e-mail: [email protected] Do redakce došlo 2. 11. 2004



81

BIODOZIMETRIE I: PRAKTICKÁ POTŘEBA BIODOZIMETRIE A NEJDŮLEŽITĚJŠÍ AKTIVOVANÉ MECHANISMY PO OZÁŘENÍ Mgr. Zdeňka VILASOVÁ, mjr. doc. MUDr. Jan ÖSTERREICHER, Ph.D, prof. RNDr. Jiřina VÁVROVÁ, CSc. Univerzita obrany, katedra radiobiologie Fakulty vojenského zdravotnictví v Hradci Králové

Souhrn Práce pojednává o možnostech praktického použití současných metod biodozimetrie včetně informací o jejich omezeních. V další části obsahuje ucelené shrnutí nejdůležitějších poznatků účinků ionizujícího záření na molekulární úrovni, zejména pak postradiační aktivace p53, navození bloku v G2/M buněčného cyklu a související aktivace MAP-kinázové cesty. Klíčová slova: Biodozimetrie; p53; G2/M blok; MAPK.

Biodosimetry Part I: Practical Need of Biodosimetry and the Most Important Mechanisms Activated After Irradiation Summary This study analyzes possibilities of the use of biodosimetric methods in military practice. It also mentions information concerning limited use of these methods. Subsequently it contains a summary of the most important facts concerning radiation-induced mechanisms at the molecular level, in paticular those concerning p53 activation, induction of G2/M cell cycle arrest and related activation of the MAP kinase pathway at the molecular level. Klíčová slova: Biodosimetry; p53; G2/M block; MAPK.

Možnosti použití biodozimetrie V této práci pojednáváme především o účincích gama záření na lidský organismus, jakož i o ozáření rychlými elektrony a neutrony. Tyto účinky jsou závislé na druhu záření, velikosti absorbované dávky a také na časové a prostorové distribuci ozáření. Proto už od počátku existence radiobiologie je kladen důraz na co nejpřesnější určení velikosti absorbované či efektivní dávky u ozářených osob. Jedním z důležitých směrů, jak zjistit obdrženou dávku záření až v období po ozáření, je tzv. biologická dozimetrie či biodozimetrie. Biodozimetrii lze charakterizovat jako subdisciplínu oboru radiobiologie, která pomáhá určit velikost absorbované dávky podle intenzity a druhu postradiační odpovědi organismu. Dosud jsou detailně popsány postradiační děje a biodozimetrické ukazatele na úrovni organismu a orgánů samotných. Avšak jejich použití v praxi má řadu úskalí, počínaje jejich nízkou citlivostí a relativně dlouhou latencí, anebo vysokou finanční či edukační náročností.

Praktické využívání biodozimetrie lze předpokládat ve všech oblastech lidského konání, kde je zahrnut faktor ionizujícího záření. Jedná se tedy o pracovníky činné v riziku ionizujícího záření. První oblastí je výroba, zpracování a likvidace zdrojů ionizujícího záření. Zde jde zejména o pracovníky uranových dolů (kteří jsou nejvíce ohroženi vysokým obsahem radonu především ve vzduchu, na což dosud nemá současná věda žádný biodozimetrický ukazatel), zpracovatelského průmyslu, jaderných elektráren a úložišť radioaktivních látek. Pro široké uplatnění radionuklidů v medicíně je nutné do okruhu pracovníků v riziku zahrnout i pracovníky nemocničních oddělení nukleární medicíny, radioterapie, radiodiagnostiky, ale i balneologie, kdy jako příklad lze uvést jáchymovské lázeňské kúry. Významným expozicím jsou dále vystaveni představitelé chirurgických oborů používající kontrastních vyšetření při operaci a peroperační RTG metody. Další skupinou jsou pracovníci laboratorních zařízení využívající ve výzkumných projektech zdroje ionizujícího záření. V neposlední řadě je také nutné zmínit

82


letový personál, vojáky a kosmonauty. Ve všech výše uvedených oblastech lidského konání je možné se za nestandardních okolností setkat s významnějším ozářením, kdy je nutné všemi dostupnými metodami odhadnout absorbovanou dávku. Použití biodozimetrických metod v polních podmínkách AČR je limitováno časovými a technologickými možnostmi jejich použití. V první řadě lze použít pouze takové metody, které nejsou příliš finančně nákladné, jsou nenáročné na zaučení zodpovědných laboratorních pracovníků, ale přitom se musí jednat o vysoce specifické metodické postupy s nízkým detekčním prahem. Takovým požadavkům vyhovují metody ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) detekující požadovaný protein a RT-PCR (real time − polymerase chain reaction) detekující požadovaný gen mRNA nebo DNA samotné. Dalším limitem je časové období po ozáření vojáka. Biochemická laboratoř s adekvátním vybavením umožňující použití výše uvedených metod se v léčebně odsunovém systému nachází až od stupně Level 2. Na zdravotnickou etapu stupně Level 2 jsou ozáření pacienti přiváženi mezi 2 a 6 hodinami po ozáření (21). A jelikož je nezbytné efektivní léčbu započít již do konce prvního dne po ozáření, výsledné časové rozmezí je mezi 2 a 24 hodinami po ozáření vojáka. Z uvedeného vyplývá praktická potřeba takových biodozimetrických ukazatelů, které by byly validní v intervalu od 2 do 24 hodin po ozáření a zároveň detekovatelné ELISA nebo RT-PCR metodami. Mechanismus účinku ionizujícího záření Abychom dobře porozuměli významu biodozimetrických ukazatelů, je vhodné si nastínit nejdůležitější cesty aktivované v ozářených buňkách a jejich význam pro regulaci buněčného prostředí. V odpovědi na ozáření buňky má důležitou úlohu aktivace tumor supresorového proteinu P53, který dále reguluje blok buněčného cyklu, reparaci poškozené DNA nebo aktivuje apoptózu cestou aktivace dalších proteinů a genů. Ionizující záření vytváří v jádře ozářených buněk dvojité zlomy dvoušroubovice DNA. Forma reparace dvojitých zlomů DNA je dvojí: nehomologní rekombinantní reparace (non-homologous end-joining; NHES) probíhající v G1-fázi buněčného cyklu a homologní rekombinantní reparace (homologous recombination; HR) DNA. Homologní reparace je


významná především v G2-fázi buněčného cyklu (32, 37), kdy jsou v jádře dvě sady chromozomů a dvoušroubovice DNA nepoškozená dvojitým zlomem slouží jako vzor k opravě poškozeného úseku DNA druhé dvoušroubovice. Proto blok buněčného cyklu v G1 a v G2/M-fázi slouží k opravě DNA a jsou důležitými faktory pro další existenci a funkci ozářených buněk (37). Jako odpověď na přítomnost dvojitých zlomů DNA se mimo jiné aktivuje i ATM-protein kináza. ATM je produktem tumor supresorového genu, který je mutovaný u nemoci označované jako ataxie-teleangiektázie. Tato autozomálně recesivně dědičná choroba se projevuje tvorbou teleangiektázií (patologickým rozšířením cév na periférii) a ataxií jako formy poruchy mozečkových funkcí. Dalšími příznaky důležitými pro radiobiologii jsou vyšší radiosenzitivita a vyšší incidence nádorových onemocnění u takto defektních pacientů (22). Tato ATM-protein kináza je v odpovědi již na malé dávky záření autofosforylována (3) a dále fosforyluje řadu cílů, mezi nimi i p53. Dále bylo zjištěno (2, 34), že bez ATM-protein kinázy není fosforylace p53 v ozářených buňkách dostatečně rychlá. Fosforylace p53 zejména na serinových aminokyselinách pak dále určuje roli tohoto proteinu v regulaci buněčných mechanismů. Je zřejmé, že účinky aktivované p53 se mohou lišit lokalizací fosforylovaného serinu. Jak vyplynulo z in vitro studií Banina a spol. (5) a Canmana a spol. (8), ATM-protein kináza dokáže in vivo přímo fosforylovat serin 15 p53 (p53 ser15). Dále ATM-protein kináza dokáže aktivovat serin 20 p53 nepřímo prostřednictvím Chk1 nebo Chk2-protein kinázy, ačkoli tato skutečnost byla prokázána pouze in vitro pokusem (15, 17, 18, 29, 30). Saito a spol. (23) prokázali in vitro také fosforylaci p53 na serinu 9 a serinu 46. Higashimoto a spol. (14) prokázali ATM-dependentní fosforylaci p53 ser6. Lidský serin 15, korespondující s myším serinem 18, je přímo aktivován rodinou fosfatidylinositol-3-kináz, což zahrnuje DNA-protein kinázu (20), ATR (31) a vlastní ATM kinázu (5, 8). Fosforylace p53 na serinu 15 bez přítomnosti aktivní ATM-protein kinázy je inhibována ve smyslu opožděné nebo nižší aktivace (16, 23) a velmi časná aktivace tohoto serinového rezidua je nezbytná pro plnou p53-dependentní odpověď v buňkách vystaveným vlivu škodlivých látek a činitelů poškozujících DNA, včetně ionizujícího a UV záření (16).


83


Jak bylo zmíněno výše, serin 20 je fosforylován ATM-protein kinázou cestou Chk1 a Chk2-protein kinázy. Význam aktivace tohoto serinového rezidua spočívá patrně ve stabilizaci samotné p53 v jádru ozářené buňky a plné aktivaci ATM-dependentního p53 fosforylací na serinu 15 (5, 8). Fosforylace p53 na serinu 46 byla prokázána po ozáření buněčné epiteliální linie ultrafialovým (UV) zářením (7, 20) prostřednictvím p38 MAP-kinázy (7) HIP-kinázy a kinázy HIPK2 (10). Jelikož aktivace p38 MAP-kinázy se projevuje po UV ozáření, a nikoli po ozáření buněk ionizujícím zářením, domnívají se Saito a spol. (23), že fosforylace p53 na ser46 je způsobena jinou protein kinázou, například p53DINP1. Ačkoli fosforylace p53 na serinu 9 neprobíhá přímo, autoři (23) se domnívají, že ATM-protein kináza je k této aktivaci nezbytná a že dokáže tento tumor supresorový protein aktivovat nepřímo cestou aktivace dosud neznámé protein kinázy. Higashimoto a spol. (14) prokázali fosforylaci p53 na serinu 6 i 9 po ozáření UV i ionizujícím zářením. Dále zjistili vztah mezi fosforylací p53 na ser6 a ser9, kdy fosforylace na ser6 cestou Chk1 může způsobit fosforylaci ser9. Následky aktivované p53 ser6 a p53 ser9 nejsou zcela známy, ale Saito a spol. (23) se domnívají, že aktivace těchto serinových reziduí po ozáření slouží k amplifikaci primárního účinku ATM-protein kinázy, tj. fosforylaci p53ser15. Další významnou oblastí funkce a regulace p53 je degradace tohoto proteinu. U neozářených buněk dochází v buněčném jádru prostřednictvím vazby mdm2 na p53 k degradaci tohoto proteinu (6, 36). Takto je zachována adekvátnost odpovědi vůči indukovanému signálu. U ozářených buněk dochází k vzestupu p53 především v důsledku zabránění degradace p53. Tento mechanismus lze vysvětlit fosforylací jak mdm2 ATM-kinázou, tak fosforylací p53 na serinu 15 nebo 20. Aktivovaný mdm2 se poté neváže na aktivovaný p53, který se v jádře stabilizuje a jeho obsah v buňce se zvyšuje. Není však zcela jasné, která z modifikací je zásadní pro zrušení vazby mdm2 na p53. Na inhibici degradace p53 se dále mohou podílet také některé další buněčné proteiny, jako jsou E2F1, Ras, Myc, beta-catenin, pRb a c-Abl (28), které cestou indukce tumor supresorového proteinu ARF blokují aktivitu Mdm2 proteinu (26). Tímto mechanismem je dosaženo výraznější, tj. neadekvátní, odpovědi na indukující signál. Dalšími důležitými buněčnými molekulami, kte-

ré jsou aktivovány ionizujícím zářením, jsou JNK (19), p38 MAPK (25), SEK (25) a NF-kappaB (35). Tyto molekuly vyvolávají kaskádovou reakci vedoucí k aktivaci časných genů, jako jsou c-jun, c-fos a egr-1 (9, 11, 12, 13, 27). Po aktivaci ATM-kinázy jsou jedním z dalších cílů fosforylace proteiny p53, Chk1, Chk2. Zásadními proteiny jsou Chk1 a Chk2-proteinkinázy, jejichž fosforylace ATM-kinázou vede k inhibici funkce fosfatáz cdc25a a cdc25c odpovědných za průchod přes G1/S a G2/M klíčové body a za pokračování buněčného dělení (33). Významnou prací je studie Abotta a spolupracovníků (1), kteří sledovali úlohu mitogenem aktivované protein (MAP) kinázy kinázy 1 (MEK 1) a MAP-kinázy kinázy 2 (MEK 2) v ozářených buňkách s blokovaným buněčným cyklem ve fázi G2/M. Tyto dvě kinázy jsou členy MAP-kinázové signální cesty a jsou aktivovány RAF (4). Oba tyto proteiny mohou dále fosforylovat další členy MAPK-kaskády, ERK1 a ERK2 (24). Autoři zjistili, že po expozicích buněk ionizujícímu záření je velmi významně exprimována signální cesta MAPK/RAF/MEK1-MEK2, která zajišťuje včasnou indukci G2/M-bloku buněčného cyklu. Abott a spol. (1) dále pozorovali, že u buněk s dominantně negativní MEK1 a MEK2 nastává postradiační G2/M-blok opožděně a buňky posléze hůře tento blok buněčného cyklu překonávají. Nicméně, inhibice exprese MEK1 a MEK2 neovlivňuje reparaci dvojitých zlomů DNA vzniklých po ozáření. Z jejich výsledků vyplývá, že radiačně indukovaná aktivace MAP-kinázové cesty je nezbytná k navození bloku v G2/M-fázi buněčného cyklu a jeho rychlejší překonání a vstupu ozářených buněk do mitózy. Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem jsme se v naší experimentální práci zaměřili na studium fosforylace ATM-kinázy a p53 v ozářených lymfocytech izolovaných z periferní krve, které by mohly být použity pro stanovení biodozimetrických ukazatelů u ozářených při radiačních nehodách, příp. za válečného konfliktu. Literatura 1.

2.

ABBOTT, DW. − HOLT, JT. Mitogen-activated protein kinase kinase 2 activation is essential for progression through the G2/M Checkpoint arrest in cells exposed to ionizing radiation. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, p. 2732−2742. ABRAHAM, RT. Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev., 2001, vol. 15, p. 2177−2196.

84

3.

4.

5.

6. 7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21. 22.


BAKKENIST, CJ. − KASTAN, MB. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature, 2003, vol. 21, p. 486−488. ALESSI, DR., et al. PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, p. 27489−27494. BANIN, S., et al. Enhan-ced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science, 1998, vol. 281, p. 1674−1677. BARAK, Y., et al. Mdm2 expression is induced by wild type p53 activity. EMBO J., 1993, vol. 12, p. 461−468. BULAVIN, DV., et al. Phosphorylation of human p53 by p38 kinase coordinates N-terminal phosphorylation and apoptosis in response to UV radiation. EMBO J., 1999, vol. 18, p. 6845−6854. CANMAN, CE., et al. Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phos-phorylation of p53. Science, 1998, vol. 281, p. 1677−1679. DATTA, et al. Ionizing radiation activates transcription of the EGR1 gene via CArG elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, p. 10149−10153. D’ORAZI, G., et al. Homeodomain-interacting protein kinase-2 phosphorylates p53 at Ser 46 and mediates apoptosis. Nat. Cell Biol., 2002, vol. 4, p. 11−19. HALLAHAN, DE., et al. C-jun and Egr-1 participate in DNA synthesis and cell survival in response to ionizing radiation exposure. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, p. 30303−30309. HALLAHAN, DE., et al. Radiation signaling mediated by Jun activation following dissociation from a cell type-specific repressor. J. Biol. Chem., 1993, vol. 268, p. 4903−4904. HALLAHAN, DE., et al. Protein kinase C mediates x-ray inducibility of nuclear signal transducers EGR1 and JUN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, p. 2156−2160. HIGASHIMOTO, Y., et al. Human p53 is phosphorylated on serine 6 and 9 in response to DNA damage-inducing Agents. J. Biol. Chem., 2000, vol. 275, p. 23199−23203. HIRAO, A., et al. DNA damage-induced activation of p53 by the checkpoint kinase Chk2. Science, 2000, vol. 287, p. 1824−1827. CHAO, C., et al. Phosphorylation of murine p53 at ser-18 regulates the p53 responses to DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, p. 11936−11941. CHEHAB, NH., et al. Chk2/hCds1 functions as a DNA damage checkpoint in G(1) by stabilizing p53. Genes Dev., 2000, vol. 14, p. 278−288. CHEHAB, NH., S., et al. Phosphorylation of ser-20 mediates stabilization of human p53 in response to DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol. 96, p. 13777−13782. CHEN, YR., et al. The role of c-Jun N-terminal kinase (JNK) in apoptosis induced by ultraviolet C and gamma radiation. Duration of JNK activation may determine cell death and proliferation. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, p. 31929−31936. LEES-MILLER, SP., et al. Human DNA-activated protein kinase phosphorylates serines 15 and 37 in the amino-terminal transactivation domain of human p53. Mol. Cell. Biol., 1992, vol. 12, p. 5041−5049. ÖSTERREICHER, J. − VÁVROVÁ, J. Přednášky z radiobiologie. 1. vyd. MANUS, 2003. 116 s. ROTMAN, G. − SHILOH, Y. The ATM gene and protein: possible roles in genome surveillance, checkpoint controls

23.

24. 25.

26.

27.

28. 29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36. 37.


and cellular defence against oxidative stress. Cancer Surv., 1997, vol. 29, p. 285−304. SAITO, S., et al. ATM mediates phosphorylation at multiple p53 sites, including ser 46, in response to ionizing radiation. J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, p. 12491−12494. SEGER, R. − KREBS, EG. The MAPK signaling cascade. FASEB J., 1995, vol. 9, p. 726−735. SHAFMAN, TD., et al. Defective induction of stress-activated protein kinase activity in ataxia-telangiectasia cells exposed to ionizing radiation. Cancer Res., 1995, vol. 55, p. 3242−3245. SHARPLESS, NE. − DEPINHO, RA. The INK4A/ARF locus and its two gene products. Curr. Opin. Genet. Dev., 1999, vol. 9, p. 22−30. SHERMAN, ML., et al. Ionizing radiation regulates expression of the c-jun protooncogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, p. 5663−5666. SHERR, CJ. − WEBER, JD. The ARF/p53 pathway. Curr. Opin. Genet. Dev., 2000, vol. 10, p. 94−99. SHIEH, SY., et al. The human homologs of checkpoint kinases Chk1 and Cds1 (Chk2) phosphorylate p53 at multiple DNA damage-inducible sites. Genes Dev., 2000, vol. 14, p. 289−300. SHIEH, SY. − TAYA, Y. − PRIVES, C. DNA damage-inducible phosphorylation of p53 at N-terminal sites including a novel site, Ser20, requires tetramerization. EMBO J., 1999, vol. 18, p. 1815−1823. TIBBETTS, RS., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev., 1999, vol. 13, p. 152−157. TSUKAMOTO, Y. − KATO, J. − IKEDA, H. Silencing factors participate in DNA repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 1997, vol. 388, p. 900−903. VÁVROVÁ, J., et al. Indukce apoptózy protinádorovými látkami a ionizujícím zářením. 1. vyd. Hradec Králové, VLA JEP, 2002. 44 s. Učební texty VLA JEP. Sv. 333. ISBN 80-85109-23-9. WAHL, GM. − CARR, AM. The evolution of diverse biological responses to DNA damage: insights from yeast and p53. Nat. Cell Biol., 2001, vol. 3, p. E277−E286. WANG, CY. − MAYO, MW. − BALDWIN, AS. Jr. TNFand cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition of NF-kappaB. Science, 1996, vol. 274, p. 784−787. WU, X., et al. The p53-mdm2 autoregulatory feedback loop. Genes. Dev., 1993, vol. 7, p. 1126−1132. YANEVA, M. − KOWALEWSKI, T. − LIEBER, MR. Interaction of DNA-dependent protein kinase with DNA and with Ku: biochemical and atomic-force microscopy studies. EMBO J., 1997, vol. 16, p. 5098−5112.

Korespondence: Mgr. Zdeňka Vilasová Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Katedra radiobiologie Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové e-mail: [email protected]


VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

Recommend Documents