UNIVERZITA OBRANY BRNO FAKULTA VOJENSKÉHO ZDRAVOTNICTVÍ HRADEC KRÁLOVÉ
AUTOREFERÁT DISERTAČNÍ PRÁCE Analýza vybraných prognostických faktorů u pacientů s nově diagnostikovanou akutní myeloidní leukémií – vliv cytokinů a adhezních molekul kpt. MUDr. Tomáš KUPSA
Doktorský studijní program Vojenské vnitřní lékařství
Hradec Králové 2016
Obsah 1. Úvod ..................................................................................................................................... 3 2. Cíle disertační práce ............................................................................................................. 6 3. Soubor nemocných a metodika ............................................................................................ 7 3.1 Soubor nemocných v podstudii 1 .............................................................................. 7 3.2 Soubor nemocných v podstudii 2 .............................................................................. 9 3.3 Soubor nemocných v podstudii 3 .............................................................................. 9 3.4 Přehled použitých metod a statistiky ...................................................................... 10 3.4.1 Odběr a zpracování vzorků séra ......................................................................... 10 3.4.2 Způsob a rozsah stanovení cytokinů a adhezních molekul ................................ 10 3.4.3 Statistická analýza .............................................................................................. 12 4. Výsledky ............................................................................................................................. 13 4.1 Výsledky podstudie 1 .............................................................................................. 13 4.2 Výsledky podstudie 2 .............................................................................................. 14 4.3 Výsledky podstudie 3 .............................................................................................. 16 5. Souhrn poznatků disertační práce ....................................................................................... 18 6. Summary............................................................................................................................. 20 7. Seznam vlastních prací vztahujících se k tématu disertační práce ..................................... 22
2
1. Úvod Akutní myeloidní leukémie (AML) je v naší populaci nejčastějším typem akutní leukémie u dospělých jedinců. Jedná se o závažné onemocnění krvetvorby, které i přes značné léčebné úsilí zahrnující intenzivní chemoterapii a v indikovaných případech i alogenní transplantaci krvetvorných buněk často vede k fatálnímu konci. Incidence AML narůstá s věkem. Dle dostupných údajů (Medicabaze.cz) je incidence AML ve Spojených státech amerických u padesátiletých jedinců 3,5/100 000 jedinců za rok, u sedmdesátiletých již dosahuje 15/100 000 za rok a u osmdesátiletých dokonce 22/100 000 za rok. Medián věku při diagnóze je 65 let. Incidence primárních (de novo) AML zůstává ve všech věkových kategorií přibližně stejná, viz graf 1. Exponenciální růst incidence AML po 50. roce života je způsoben vyšším zastoupením sekundárních AML vzniklých zejména progresí z myelodysplastického syndromu (MDS) nebo myeloproliferativních onemocnění. Vzhledem ke zlepšení výsledků léčby některých novotvarů spojených s mladším věkem (Hodgkinův lymfom, karcinom varlete) a širokému využití některých cytostatik (např. cyklofosfamid, methotrexát) v léčbě autoimunitních onemocnění jsou i tito nemocní ve zvýšeném riziku sekundární hematologické malignity. Tato skutečnost se odráží i v horší prognóze u sekundárních AML a starších nemocných obecně. Graf 1. Incidence AML dle věku a původu nemoci
DN-AML: de novo-AML (primární AML), MD-AML: myeloid disease-AML (sekundární AML), MDS: myelodysplastický syndrom
3
AML vykazuje vysoký stupeň vnitřní heterogenity, který je odrazem široké palety genetických aberací a různých mechanismů leukemogeneze. Běžná léčba tuto různorodost překonává jen do určité míry. Dokáže sice zajistit léčebný efekt většině pacientů, avšak v mnoha
případech
chemorezistentních
onemocnění
selhává
navzdory
aplikaci
vysokodávkovaných režimů několika cytostatik. Navíc vzhledem k buněčně neselektivnímu účinku chemoterapie vedou tyto režimy k častým nežádoucím účinkům. Vysoký výskyt slizničních komplikací a infekcí v období léčbou navozené pancytopenie je spojen se signifikantním nárůstem rizika úmrtí v období aplazie dřeně. Tyto faktory zabraňují další eskalaci léčebných dávek. Dostáváme se tak do situace, kdy standardní léčebný přístup dosahuje maxima své efektivity. Tudíž další zlepšení léčebných výsledků pravděpodobně nebude možné bez zavedení nových léků či modifikace léčebného přístupu. Z výše zmíněného je patrné, že moderní onkologie čelí mnoha výzvám a jednomu společnému jmenovateli, kterým je ekonomická stránka léčby. Jediným možným východiskem je vývoj cílené, účinné a přitom málo toxické léčby, kterou by bylo možno podávat nejlépe v ambulantním režimu. Taková léčba by byla z pohledu lidského, medicínského a společensko-ekonomického velmi efektivní. Právě proto se zabýváme cytokiny a adhezními molekulami. Cytokiny jsou signální molekuly nesoucí specifickou informaci pro cílové buňky. Jsou to biologicky vysoce aktivní látky schopné přenosu této informace na velkou vzdálenost. Vazbou na své receptory předávají cílové buňce informaci o vnitřních podmínkách v organismu a navozují specifickou odpověď. Touto odpovědí často bývá stimulace k proliferaci nebo ochrana před apoptózou, v případě zánětlivé odpovědi pak aktivace provázená změnou fenotypu buňky například expresí povrchových adhezních molekul. AML je agresivní onemocnění s vysokou vnitřní heterogenitou, která je dána množstvím cytogenetických a molekulárně genetických aberací podílejících se na vzniku a progresi onemocnění. Většina rekurentně se vyskytujících aberací má dnes definovaný prognostický význam, a přímo tak ovlivňuje léčebnou strategii. I přes uspokojivou prediktivní a prognostickou hodnotu současně používané rizikové stratifikace AML stále existuje reálná možnost rozpoznání nových nezávislých faktorů. Cytokiny se k tomu zdají být vhodnými kandidáty. Vzhledem k přibývajícím poznatkům o vzájemné provázanosti cytokinové stimulace a přežívání myeloblastů nabývá tato problematika na aktuálnosti. Za abnormálních okolností může fyziologická role cytokinů napomáhat progresi onemocnění. Byl dokumentován vliv zánětlivé odpovědi a vystupňované cytokiny zprostředkované signalizace na progresi maligních onemocnění. Následně byla potvrzena
4
signifikance tumorem navozené zánětlivé odpovědi usnadňující progresi některých solidních tumorů. Krevní buňky a jejich prekurzory jsou vysoce citlivé na změny v cytokinovém mikroprostředí. Vazbou na cytokinové receptory je spouštěna aktivace signálních drah (Signal Transduction Pathways, STPs). Autonomní růst jakékoliv maligní buňky je výsledkem ztráty regulace aktivity signálních drah. U AML bylo zjištěno, že frekvence aktivace STPs značně převyšuje četnost genetických aberací nebo mutací receptorů či komponent signálních drah. Tato zjištění naznačují, že aktivace STPs, spouštěná například vazbou cytokinů i na nemutované receptory, je frekventním jevem, který by v hodnocení mechanismů leukemogeneze neměl být podceňován. U AML byly navíc aberantní hladiny cytokinů dávány do souvislosti s aktivitou onemocnění. Odchylky v hladinách cytokinů se totiž upravují po dosažení kompletní remise (CR) onemocnění. Připadá tedy v úvahu i možnost autonomní produkce cytokinů leukemickými buňkami s následnou autokrinní nebo parakrinní stimulací růstu. Tento mechanismus je zmiňován zejména v souvislosti s Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF), Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) a interleukiny IL-1 a IL-6. Někteří autoři považují schopnost autonomní sekrece těchto faktorů za tak významný jev, že na tomto základě vyvíjejí nová klasifikační schémata onemocnění. Tato nová schémata jsou značně složitá, mají však tu výhodu, že reflektují schopnost leukemických blastů stimulovat neoangiogenezi nebo chemotaxi. Tento způsob klasifikace by jistě poodhalil faktory spouštějící či podporující proliferaci, migraci a infiltraci tkání leukemickými buňkami. Jedná se tedy o hledání odpovědí na fundamentální otázky ohledně aktivity leukemických buněk in vivo. Zůstává nedořešená otázka, jestli způsob klasifikace AML podle aberací v jednotlivých rodinách cytokinů a aktivace definovaných signálních drah povede k cílené a efektivnější léčbě, která přinese signifikantní benefit významné části nemocných. Cytokiny a adhezní molekuly tedy mají důležitou roli v onkogenezi (leukemogenezi). Přežívání a potažmo i proliferace maligních buněk mohou být vlivem cytokinů a adhezních interakcí významně modifikovány. Tyto komponenty makroorganismu mají vliv na šíření maligního procesu a mohou ovlivnit výsledky léčby. Jsou dokumentovány způsoby, jak lze modulací hladin některých cytokinů nebo adhezních interakcí překonat mechanismy zajišťující vysokou rezistenci maligní buňky k terapii. Tyto interakce přitom svou povahou přesahují hranice jednoho onemocnění. Jejich ovlivňování by tak mohlo mít velmi široké využití. Bylo by tedy možno zvýšit efektivitu protinádorové léčby bez nutnosti vystavení nemocného rizikům intenzifikovaných chemoterapeutických režimů. I v současné době jsou však naše poznatky těchto mechanismů limitované, což brání jejich širšímu léčebnému
5
využití. Našim cílem je přispět námi nabytými informacemi ke všeobecnému poznání těchto mechanismů. Jedině tak bude možná příprava nových, selektivních a maximálně efektivních léčebných přístupů. Prezentací dosud nabytých poznatků o roli cytokinů v (hemato)onkologii se snažíme odbornou společnost přesvědčit, že uplatnění selektivní inhibice klíčových mechanismů v léčbě malignit není pouhou fikcí. Věříme, že hlubší poznání těchto procesů se může stát základem inovativních léčebných postupů a podstatně zlepšit výsledky léčby tohoto závažného onemocnění.
2. Cíle disertační práce
Cílem disertační práce je hodnocení hladin vybraných cytokinů, cytokinových receptorů, solubilních adhezních molekul a matrixové metaloproteinázy 9 (MMP-9) u pacientů léčených pro AML a posouzení jejich prediktivního a prognostického významu. V této práci navazujeme na poznatky z pilotní studie hladin cytokinů a adhezních molekul u nemocných s AML, realizovanou na II. interní klinice – Oddělení klinické hematologie Fakultní nemocnice Hradec Králové v letech 2002 – 2005. Cílem současné práce bylo podstatné rozšíření našich dřívějších poznatků. Hodnotili jsme hladiny výše uvedených faktorů v rozšířeném souboru 84 pacientů s nově diagnostikovanou AML v letech 2010 – 2015 na IV. interní hematologické klinice (dřívější II. interní klinika – Oddělení klinické hematologie) Fakultní nemocnice Hradec Králové. Na základě literárních údajů jsme předpokládali, že efekt cytokinové stimulace se projeví nejen na myeloblastech, ale i na endotelových buňkách a povede ke zvýšené expresi adhezních molekul, jejichž extracelulární fragmenty můžeme stanovovat ve vzorcích séra či plasmy nemocného. Naší snahou bylo popsat vzájemné vztahy hladin všech vyšetřovaných faktorů a posoudit jejich vztah ke klinicky relevantním proměnným. Těmi jsou věk, původ nemoci, parametry krevního obrazu se zvláštním zaměřením na hyperleukocytózu, fyzický stav nemocného hodnocený WHO performance statutem, rutinně stanovované známky zánětu a hladina laktát dehydrogenázy (LDH). Dále jsme znovu hodnotili vliv aktivity onemocnění na hladiny námi sledovaných proměnných. Do současného hodnocení byli zahrnuti pouze nemocní, kterým byla podána indukční chemoterapie.
6
3. Soubor nemocných a metodika Pro lepší přehlednost byla studie rozdělena na 3 části (podstudie). V podstudii 1 byla provedena korelační analýza hladin sledovaných analytů a hodnocení vlivu věku, původu nemoci, parametrů krevního obrazu a parametrů zánětu na jejich hladiny v celém souboru 84 nově diagnostikovaných nemocných. Poté byl posuzován vztah kontinuálních proměnných k původu nemoci, FAB klasifikaci, hyperleukocytóze a performance statutu dle WHO. Do podstudie 2 bylo zařazeno 45 nemocných, kteří měli vyšetřen vzorek séra z období diagnózy AML a zároveň i vzorek séra z období CR. Vzhledem k předpokladu hlubší remise bylo kritériem výběru podání nejméně 2 cyklů chemoterapie. V zájmu homogenity souboru nebyli do této podstudie zařazováni pacienti po alogenní transplantaci hematopoetických buněk. Se znalostí výsledků korelační analýzy v podstudii 1 byl ověřován vliv parametrů krevního obrazu, známek zánětu a LDH. Tímto způsobem byly identifikovány cytokiny, jejichž hladiny jsou spojeny především s aktivitou onemocnění a nemusí nutně korelovat s jinými faktory. Pomocí jednoduché korelační analýzy byly ověřeny vzájemné vztahy hladin cytokinů s ostatními faktory v době remise onemocnění (CR). V podstudii 3 popisujeme prediktivní a prognostický potenciál vyšetřovaných analytů u nemocných s AML. Na celém souboru 84 nemocných byla ověřována korelace standardní rizikové stratifikace AML s hladinami sledovaných cytokinů v době diagnózy. Byl také analyzován vztah hladin cytokinů k dosažení CR indukční terapií. Prognostický přínos vstupního vyšetření hladin cytokinů byl ověřován na souboru 65 nemocných. S ohledem na dostatečnou dobu sledování byli vybráni nemocní diagnostikovaní v letech 2010 – 2013. Později
diagnostikovaní
jedinci
byli
zařazeni
pouze
v případě,
kdy
u nich došlo ke statisticky významné události, za kterou byla považována progrese AML vyžadující cytostatickou léčbu, hematologický relaps AML, nebo úmrtí z jakékoli příčiny.
3.1 Soubor nemocných v podstudii 1 Všichni nemocní sledovaní v rámci této práce byli diagnostikováni na IV. interní hematologické klinice (dřívější II. interní klinika – Oddělení klinické hematologie) Fakultní nemocnice Hradec Králové v průběhu let 2010 – 2015. Základní charakteristika studovaného souboru nemocných hodnoceného v podstudii 1 je shrnuta v tabulce 1.
7
Tabulka 1. Charakteristika souboru nemocných v podstudii 1 Všichni nemocní
Primární AML
Sekundární AML
84
52 (62 %)
32 (38 %)
53,3 ± 12,2
49,3 ± 12,3
59,8 ± 9,2
Muž
34 (40 %)
22 (42 %)
12 (37 %)
Žena
50 (60 %)
30 (58 %)
20 (63 %)
Nízké
18
17
1
Střední
29
18
11
Vysoké
37
17
20
50,7 ± 57,3
48,1 ± 50,1
54,8 ± 69,4
(x 10 /l), medián
14,9
16,4
7,8
Hyperleukocytóza
23 (27 %)
16 (31 %)
7 (22 %)
M0
8
3
5
M1
17
11
6
M2
32
16
16
M3
7
7
0
M4
12
8
4
M5
7
7
0
M7
1
0
1
9 (11 %)
4 (8 %)
5 (16 %)
CRP (mg/l)
47,1 ± 48,4
39,3 ± 37,1
59,0 ± 68,2
FLT3-ITD
23 (21 %)
18 (35 %)
5 (16 %)
NPM-1 mutovaný
25 (30 %)
22 (42 %)
3 (9 %)
3 (4 %)
0
3 (9 %)
Komplexní karyotyp
10 (12 %)
3 (6 %)
7 (22 %)
Selhání indukční terapie
21 (25 %)
10 (19 %)
11 (34 %)
Počet nemocných Věk (roky) Pohlaví
Cytogenetika (riziko)
Počet bílých krvinek 9
FAB typ
Aktivní infekt
BCR-ABL
8
Jako primární AML byli hodnoceni nemocní bez předchorobí myelodysplastického syndromu či myeloproliferativního onemocnění, s negativní anamnézou stran aplikace cytostatik v rámci imunosupresivní či protinádorové léčby a bez signifikantních dysplastických změn v nátěru aspirátu kostní dřeně. Ve 2 nejasných případech jsme definitivní zařazení provedli se znalostí histologie kostní dřeně. Pacienti se sekundárním onemocněním (n = 32) progredovali do AML většinou z myelodysplastického syndromu (n = 21). Z chronické myelomonocytární leukémie progredovali 3 pacienti, 8 nemocných progredovalo z myeloproliferativního onemocnění (3x chronická myeloidní leukémie, 3x jinak nezařazená myeloproliferace, 1x pravá polycytémie, 1x primární myelofibróza). Kritérium hyperleukocytózy bylo splněno u nemocných s počtem bílých krvinek nad 50 x 109/l nebo v případě, kdy při počtu bílých krvinek blížící se této hranici byly klinické známky leukostázy vyžadující leukaferézu.
3.2 Soubor nemocných v podstudii 2 V podstudii 2 byly hodnoceny rozdíly v hladinách sledovaných cytokinů mezi párovými vzorky séra odebranými v době diagnózy onemocnění a první CR. Vzhledem k předpokladu hlubší remise onemocnění bylo před odběrem párového séra v remisi AML požadováno podání nejméně 2 cyklů chemoterapie. Do této podstudie tak bylo zařazeno 45 nemocných, z nichž 30 (67 %) mělo primární AML a 15 (33 %) mělo sekundární AML. Remise onemocnění byla hodnocena dle NCCN kritérií. Kompletní remise bylo dosaženo ve 42 případech, ve 3 případech bylo dosaženo CR s inkompletní regenerací v trombocytech. Alogenně transplantovaní nemocní nebyli do této podstudie zařazováni.
3.3 Soubor nemocných v podstudii 3 V rámci podstudie 3 byla na souboru 65 nemocných provedena analýza délky přežití od zahájení léčby AML do hematologického relapsu nebo úmrtí (RFS, relapse-free survival) a celkového přežití (OS, overall survival). V tomto souboru jsou zahrnuti všichni nemocní diagnostikovaní v letech 2010 – 2013, a dále nemocní diagnostikovaní i později, pokud u nich došlo ke statisticky významné události, kterou byl relaps onemocnění nebo úmrtí. Riziková stratifikace nemocných v podstudii 3 byla provedena dle European Leukemia Net, práce Döhner H et al., 2010. Data délky přežití do relapsu AML a celkového přežití byla
9
cenzorována k datu poslední dokumentované kontroly. Medián sledování nemocných byl 627 dnů. V této podskupině došlo k hematologickému relapsu u 34 jedinců s mediánem RFS 516 dní. Ve 28 případech došlo k úmrtí.
3.4 Přehled použitých metod a statistiky
3.4.1 Odběr a zpracování vzorků séra Postup vyšetření pacienta s podezřením na akutní leukémii a doporučení stran laboratorních a zobrazovacích vyšetření jsou zakotveny v Léčebných standardech IV. interní hematologické kliniky Fakultní nemocnice Hradec Králové. V rámci vstupního vyšetření je vždy vyšetřen krevní obraz včetně diferenciálního rozpočtu bílých krvinek mikroskopickou metodou, jsou stanoveny základní biochemické parametry včetně hladin albuminu, LDH a CRP. Každý nově diagnostikovaný pacient s výhledem indukční terapie AML má ze vzorku kostní dřeně provedené cytogenetické a molekulárně genetické vyšetření rekurentně se vyskytujících mutací. Pro výzkumné účely je současně odebírán vzorek séra a plasmy ke zpracování a zamražení. V případě nově diagnostikovaných nemocných s AML byl vzorek venózní krve vždy odebrán před podáním indukční terapie. V případě indikace leukaferézy nebo cytoredukční terapie hydroxyureou pro hyperleukocytózu a klinické projevy leukostázy byl vzorek séra či plasmy odebrán před provedením leukaferézy nebo podáním hydroxyurey. Vzorky musí být bez zbytečného prodlení transportovány do laboratoře ke zpracování a uskladnění. Snažíme se nepřekročit časový interval 2 hodin. Po 10 minutách centrifugace při 1500 otáčkách/minutu jsou v označených špičatkách zvlášť uchovány vzorky séra a plasmy. Vzorky jsou skladovány v monitorovaném boxu při -70°C. Před vlastním měřením jsou vybrané vzorky rozmražené v teplé vodní lázni a následně jsou ihned stanoveny hladiny sledovaných analytů ve vzorku.
3.4.2 Způsob a rozsah stanovení cytokinů a adhezních molekul Vhledem k rozsahu problematiky studia cytokinů a lepšímu pochopení vzájemných vztahů mezi cytokiny, růstovými faktory a hladinami solubilních adhezních molekul bylo nutné provádět stanovení širší palety těchto faktorů současně. Proto jsme zvolili metodu využívající technologie proteinového biočipu (biochip array technology, BAT), v našem
10
případě dodávané firmou RANDOX Laboratories Ltd., Crumlin, UK. Tato metoda umožňuje simultánní stanovení několika analytů z jednoho vzorku séra. Hladiny sledovaných analytů byly měřeny na analyzátoru RANDOX Evidence Investigator. Hladiny některých cytokinů se mohou lišit v séru a plasmě. V souladu s požadavky výrobce byly analyzovány vzorky séra. Princip metody spočívá ve vazbě cytokinů a solubilních adhezních molekul na specifické protilátky pevně navázané na proteinovém biočipu. Vazba analytu na specifickou protilátku je prokázána značenou protilátkou (křenová peroxidáza). Metoda následně využívá principu enzymoimunoanalýzy. Při reakci produkovaného peroxidu vodíku s luminolem je díky chemiluminiscenci emitovaný světelný signál ze všech polí proteinového biočipu snímán citlivou CCD (charge-coupled device) kamerou analyzátoru Evidence Investigator. Intenzita signálů je porovnána s předem naměřenou kalibrační křivkou. Výsledky jsou udávány v nanogramech na litr (ng/l) pro cytokiny a růstové faktory a mikrogramech na litr (μg/l) pro solubilní adhezní molekuly. Hodnotili jsme sérové koncentrace celkem 31 analytů, a to 21 cytokinů, 4 solubilních cytokinových receptorů, 5 solubilních adhezních molekul a MMP-9. Z cytokinů jsme stanovovali hladiny interleukinů (IL): IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-23 a dále růstových faktorů: Epidermal Growth Factor (EGF), Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), Interferon-γ (IFN-γ), Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1), Macrophage Inflammatory Protein-1α (MIP-1α), Tumour Necrosis Factor-alpha (TNF-α) a Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Dále jsme stanovovali hladiny solubilních receptorů pro IL-2 (IL-2R), IL-6 (IL-6R) a solubilní receptor pro TNFα typu I a II (TNFR-1,2). Z adhezních molekul byly hodnoceny hladiny solubilního E-selektinu (E-SEL), P-selektinu (P-SEL), L-selektinu (L-SEL), Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) a Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (VCAM-1). Cytokiny, růstové faktory, cytokinové receptory, adhezní molekuly a MMP-9 byly analyzovány pomocí souprav označených RANDOX CTK I, CTK III, CTK IV, CTK V a ADM, jejichž složení je dané výrobcem. Existuje sice možnost (po domluvě s výrobcem) složení těchto souprav individuálně upravit, to je však spojeno s dalšími náklady. Navíc jsme zpočátku neměli dostatek dat k tomu, abychom z našich měření vypustili pouze málo informativní analyty.
11
3.4.3 Statistická analýza Statistické hodnocení souboru 84 nemocných (podstudie 1) i analýza přežívání (podstudie 3) bylo provedeno ve statistickém prostředí R 3.1.2. (http://www.R-project.org) za asistence erudovaného statistika. V této analýze jsme na výsledcích z měření vstupních vzorků 84 nemocných s AML analyzovali vzájemné vztahy mezi hladinami jednotlivých analytů s věkem, základními parametry krevního obrazu (počet leukocytů, trombocytů a hladina hemoglobinu), základními biochemickými ukazateli (CRP, albumin, LDH), dosažením CR indukční terapií, sekundárním původem nemoci a přítomností definovaných cytogenetických a molekulárně genetických abnormalit. Byl sledován vliv přítomnosti normálního karyotypu, přítomnosti translokací t(9;22) – přestavba BCR/ABL a t(15;17) – přestavba PML/RARα, komplexního karyotypu definovaného jako 3 a více chromosomálních přestaveb a vliv mutace v NPM-1 a pozitivity FLT3-ITD. Pro každou dvojici kontinuálních proměnných byl vypočítán Spearmanův korelační koeficient. Vzájemný vztah všech kontinuálních a dichotomických proměnných byl analyzován pomocí Mann-Whitney U-testu. Pro vzájemné dvojice dichotomických proměnných byla provedena analýza s využitím Fisherova exaktního testu. Analýzy vlivu nezávislých proměnných na přežívání 65 nemocných (podstudie 3) byly provedeny metodou dle Kaplan-Meiera. S ohledem na vícenásobné testování byly v indikovaných případech prováděny korekce hodnot P metodou dle Bonferroni-Holma. Nakonec byla provedena multivariantní Cox-regresní analýza vlivu sledovaných proměnných na délku přežití do 1. relapsu onemocnění a celkové přežití. Ve všech analýzách byla za statisticky signifikantní považována hodnota P ˂ 0,05. Statistické zpracování dat získaných v rámci podstudie 2 bylo provedeno pomocí softwaru Statistica, verze 2.0. Pomocí tohoto programu jsme z výsledků od 45 nemocných s nově zjištěnou AML hodnotili rozdíly v hladinách sledovaných analytů mezi obdobím aktivní nemoci a CR. Dále byly hodnoceny rozdíly v parametrech krevního obrazu, hladinách CRP, albuminu a LDH. V rámci statistické analýzy byly hodnoceny rozdíly v hladinách sledovaných proměnných pomocí t-testů se spárovaným výběrem, s následnou korekcí hodnoty P na vícenásobné testování dle Bonferroniho. Hodnocení zahrnovalo i hladiny L-SEL. Výsledky naměřené ve vzorcích z období CR byly podrobeny jednoduché korelační analýze. Cílem této analýzy bylo ověřit přetrvávání vzájemných korelací zjištěných v rámci podstudie 1.
12
4. Výsledky 4.1 Výsledky podstudie 1 Hladiny VCAM-1 korelovaly pozitivně, silně nebo středně silně s hladinami TNF-α (P ˂ 0,0001), TNFR-2 (P ˂ 0,0001), TNFR-1 (P = 0,0047), LDH (P ˂ 0,0001), ICAM-1 (P ˂ 0,0001), E-SEL (P = 0,0011), IL-2R (P = 0,0224), IL-6R (P = 0,0240) a s počtem leukocytů (P = 0,0006). Hladiny ICAM-1 také významně korelovaly s E-SEL (P = 0,0285), dále byly významné korelace s TNFR-1 (P = 0,0007), CRP (P = 0,0122), LDH (P = 0,0344) a hranici statistické významnosti se blížila korelace s hladinami IL-6 (P = 0,0646). E-SEL koreloval s P-SEL (P ˂ 0.0001), počtem leukocytů (P ˂ 0,0001), LDH (P ˂ 0,0001), TNFR-1 (P = 0,0152) a TNFR-2 (P = 0,0202). P-SEL dále koreloval s MMP-9 (P = 0,0149), korelace s VCAM-1 nebyla statisticky významná (P = 0,0922). Všechny významné korelace (korelační koeficienty i přepočet hodnot P dle Bonferroni-Holma) jsou shrnuty v tabulce 4. Tabulka 4. Korelace hladin adhezních molekul a cytokinů VCAM-1
ICAM-1
E-SEL
P-SEL
IL-6
0,1856351 0,4495921 0,1035414 -0,1998541
IL-6
TNF-A
0,6474073 0,4288087 0,3467911 0,3445401
TNF-A
VCAM-1
1 0,5992622 0,5362554 0,4405768
ICAM-1
0,5992622
E-SEL
0,5362554 0,4693031
1 0,4693031
P-SEL
0,4405768
0,205835
1 0,6087241
VCAM-1
ICAM-1
E-SEL
P-SEL
1
0,0646
1
1
<0,0001
VCAM-1 ICAM-1
0,1453
1
1
<0,0001
0,0011
0,0922
<0,0001
0,0285
1
E-SEL
0,0011
0,0285
1
P-SEL
0,0922
1
<0,0001
SIL-2R
0,474892 0,2189924 0,1834631 0,1820853
SIL-2R
0,0224
1
1
1
SIL-6R
0,473284
SIL-6R
0,024
1
1
1 1
0,205835 0,6087241
0,250719 0,3612415 0,2539552
<0,0001
TNFR-1
0,5085878 0,5466287 0,4837344 0,2454546
TNFR-1
0,0047
0,0007
0,0152
TNFR-2
0,6075588 0,4431326 0,4773333 0,2834693
TNFR-2
<0,0001
0,0835
0,0202
1
MMP-9
0,3544948 0,0545493 0,4113799 0,4841647
MMP-9
1
1
0,2769
0,0149
LEUKO
0,5494848 0,4170726 0,7571891 0,4407146
LEUKO
0,0006
0,2251
<0,0001
0,0918
CRP
0,0249433 0,4885201 0,0979602 -0,2883351
CRP
1
0,0122
1
1
LDH
0,6004846 0,4649178 0,7544854 0,4498604
LDH
<0,0001
0,0344
<0,0001
0,064
Korelace CRP s albuminem byla negativní a středně silná, statisticky signifikantní (P = 0,0175). CRP dále korelovalo s IL-6 (P ˂ 0,0001) a ICAM-1 (P = 0,0122). Korelace IL-6 s ICAM-1 (P = 0,0646) a TNFR-1 (P = 0,0815) jsou na hranici statistické významnosti, korelace CRP s TNFR-1 je statisticky nevýznamná. Korelace IL-6 s hladinami albuminu byla středně silná, negativní, statisticky nevýznamná.
13
IL-1α koreloval s IL-2 (P = 0,0506) a IL-4 (P = 0,0059). EGF koreloval s VEGF (P = 0,0396). Hladiny TNF-α korelovaly pozitivně s TNFR-2 (P = 0,0011). TNFR-2 dále koreloval s TNFR-1 (P ˂ 0,0001) a IL-6R (P = 0,0001). IL-3 koreloval s IL-12 (P = 0,0383), IL-13 (P = 0,0010) a GM-CSF (P = 0,0570). Hladiny IL-12 a IL-13 korelovaly (P = 0,0060). GM-CSF koreloval s IL-5 (P ˂ 0,0001). Počet leukocytů koreloval s LDH (P ˂ 0,0001), E-SEL (P ˂ 0,0001), VCAM-1 (P = 0,0006), TNFR-1 (P ˂ 0,0001), TNFR-2 (P ˂ 0,0001) a negativně také s IL-7 (P = 0,0271). LDH dále korelovalo s TNFR-1 (P ˂ 0,0001), TNFR-2 (P ˂ 0,0001) a IL-6R (P = 0,0189). U pacientů s hyperleukocytózou byly nalezeny signifikantní odchylky v hladinách E-SEL (P = 0,0002), TNFR-1 (P = 0,0416) a TNFR-2 (P = 0,0424). Počet krevních destiček koreloval s IL-7 (P ˂ 0,0001), EGF (P ˂ 0,0001) a VEGF (P = 0,0025). Pacienti se sekundární AML byli signifikantně starší (P = 0,0175) a byli častěji klasifikováni jako AML M2 dle FAB klasifikace (Kruskal-Wallis P = 0,0327). Souvislost věku nemocných se kterýmkoli ze sledovaných parametrů jsme neprokázali. Normální karyotyp měl jasnou souvislost s primárním onemocněním (P = 0,0063), komplexní karyotyp souvisel se sekundární AML (P = 0,0383). U nemocných s mutací FLT3-ITD byly hladiny IL-7 signifikantně nižší (P = 0,0049). Výskyt mutace FLT3-ITD měl signifikantní souvislost s normálním karyotypem (P = 0,0074) a výskytem mutace NPM-1 (P = 0,0025). Mutace v NPM-1 také souvisela s primárním původem nemoci (P = 0,0013), dále byla patrná souvislost s normálním karyotypem (P ˂ 0,0001), vstupní hyperleukocytózou (P = 0,0083) a vyšší úspěšností indukční terapie (P = 0,0261).
4.2 Výsledky podstudie 2 Dosažení CR AML bylo spojeno s úpravou parametrů krevního obrazu směrem k normálním hodnotám, úpravou parametrů zánětu a ve většině případů i normalizací hladin LDH. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2. Z ostatních parametrů stanovovaných v séru byly v CR zvýšené hladiny IL-7 (P ˂ 0,0001), EGF (P ˂ 0,0001) a VEGF (P ˂ 0,0001). Zároveň byly ve srovnání s aktivní AML nižší hladiny IL-5 (P = 0,0153), IL-6 (P = 0,0134), IL-8 (P = 0,0040), L-SEL (P ˂ 0,0001), sIL-6R (P = 0,0005) a TNFR-1 (P = 0,0368).
14
Tabulka 2. Parametry krevního obrazu, zánětu a LDH v aktivní AML a v období CR Proměnná
Aktivní AML
CR
P (Bonferroni)
Počet leukocytů (x 109/l)
30,56 ± 64,66
5,75 ± 1,84
0,1685
Počet trombocytů (x 109/l)
68,67 ± 33,75
219,82 ± 89,83
2,38 x 10-8
Hemoglobin (g/l)
90,36 ± 17,80
119,43 ± 15,59
1,94 x 10-9
Albumin (g/l)
40,00 ± 3,56
43,04 ± 3,20
0,0032
CRP (mg/l)
48,24 ± 49,50
5,01 ± 3,06
0,0132
8,11 ± 4,70
3,69 ± 0,78
0,0002
LDH (μkat/l)
Hladiny hemoglobinu neměly vztah k žádnému ze sledovaných faktorů. Počet krevních destiček silně koreloval s hladinami P-SEL. Dále byla patrná silná korelace počtu trombocytů s hladinami IL-7, IL-8 a středně silná korelace s hladinami EGF a VEGF. Hladiny LDH korelovaly s IL-8. Korelace hladin VCAM-1 a ICAM-1 přetrvávala i v remisi onemocnění (P = 0,0027). Hladiny VCAM-1 statisticky významně korelovaly s L-SEL (P = 0,0270). Hladiny IL-1α korelovaly s IL-4 (P = 0,0509). Statisticky signifikantní byly korelace hladin IL-5 s GM-CSF (P = 0,0012) a IL-3 s IL-13 (P = 0,0390). Korelace TNFR-1 s TNF-α, TNFR-2, ICAM-1 a VCAM-1 jsou zachyceny v tabulce 3. Tabulka 3. Korelace hladin TNFR-1 v CR AML TNFR-1 TNF.A
TNFR-2
VCAM-1
ICAM-1
0,2946
0,2884
0,2252
0,4412
TNFR-1
1
0,6997
0,4005
0,5027
TNFR-2
0,6997
1
0,4853
0,5458
VCAM-1
0,4005
0,4853
1
0,5518
TNFR-1 TNF.A
TNFR-2
VCAM-1
ICAM-1
1
1
1
0,0810
TNFR-1
1
˂0,0001
0,2340
0,0180
TNFR-2
˂0,0001
1
0,0300
0,0060
VCAM-1
0,2340
0,0300
1
0,0027
V horní části tabulky jsou zobrazeny korelační koeficienty lineární korelace hladin jednotlivých proměnných. Ve spodní části tabulky jsou hodnoty P pro jednotlivé korelace, korigované dle Bonferroniho.
15
4.3 Výsledky podstudie 3 Délka období do 1. relapsu AML byla ovlivněna primárním původem nemoci (P ˂ 0,0001), přítomností přestavby BCR/ABL (p ˂ 0,0001) a komplexním karyotypem (P = 0,0034). Dále korelovala s hladinami IFN-γ (r = 0,4651, P = 0,0342) a negativně s hladinami TNFR-1 (r = -0,4592, P = 0,0437). Do analýzy přežití v podstudii 3 bylo zahrnuto 5 nemocných s akutní promyelocytární leukémií. Vliv mutace PML/RARa na délku období do 1. relapsu AML se blížil k hranici statisticky významného benefitu. Také přítomnost normálního karyotypu by mohla mít souvislost s delším obdobím do relapsu nemoci (nekorigované P = 0,0377). Souvislost délky trvání 1. CR a celkového přežití je patrná z jejich vzájemné velmi silné korelace (r = 0,8945, P ˂ 0,0001). Celkové přežití bylo signifikantně delší u nemocných s primárním původem AML (P = 0,0099). Nemocní s primární AML byli signifikantně mladší. Souvislost věku nad 65 let a celkového přežití dokumentuje graf 2. Všichni nemocní s akutní promyelocytární leukémií (n = 5) byli klasifikováni jako primární AML. U žádného z těchto nemocných nedošlo k hematologickému relapsu, souvislost s celkovým přežitím však nedosahovala statistické významnosti. Primární původ onemocnění dále souvisel s mutací v genu NPM-1. V univariantní analýze se však neprokázala souvislost mezi celkovým přežitím nemocných a mutací v NPM-1. Závislost celkového přežívání nemocných na mutačním stavu FLT3-ITD také nebyla statisticky signifikantní. Graf 2. Vliv věku nemocných nad 65 let na celkové přežití
16
Naopak výskyt hematologického relapsu (P ˂ 0,0001), komplexního karyotypu (P = 0,0149) a přítomnost přestavby BCR/ABL (P = 0,0399) byly faktory spojené s kratším přežíváním nemocných. Komplexní karyotyp významně predikoval hematologický relaps (P = 0,0047). Ze 3 nemocných s BCR/ABL pozitivní AML byla ve 2 případech přítomna refrakterita na indukční terapii, v posledním případě došlo k časnému hematologickému relapsu. Celkové přežití korelovalo s hladinami IFN-γ (P = 0,0151), GM-CSF (P = 0,0217), hodnoty P jsou korigované. Dále byla prokazatelná středně silná, negativní, statisticky po korekci P hraničně významná korelace s hladinami TNFR-1 (P = 0,0570). U těchto cytokinů jsme analyzovali délku celkového přežití v závislosti na mediánu naměřené hodnoty. Pro TNFR-1 bylo nekorigované P = 0,0004, viz graf 3. I po korekci P na vícenásobné testování tak zůstává hladina TNFR-1 významným prediktorem celkového přežití. Graf 3. Celkové přežití nemocných a vstupní hladiny TNFR-1
Finálně byla v multivariantní analýze analyzována délka období do 1. relapsu nemoci a celkové přežití nemocných v podstudii 3 v závislosti na výsledcích vstupních vyšetření. Analýzy byly provedeny pomocí Coxova modelu proporcionálních rizik. Z výsledků vyplývá, že období do 1. relapsu onemocnění bylo delší u jedinců s primární AML, normálním karyotypem, mutací NPM-1, dosažením CR indukční terapií, nižšími hladinami LDH, VEGF, IL-3, TNFR-1, TNFR-2 a vyššími hladinami albuminu. Delší celkové přežití nemocných souviselo s nižším věkem, příznivou kategorií stratifikace rizika, primární AML, nižšími hladinami IL-3, IL-6, IL-8, TNFR-1, TNFR-2 a vyššími hladinami IL-10 a IL-15.
17
5. Souhrn poznatků disertační práce AML jistě zůstane terapeutickou výzvou i v nejbližších letech. Současné léčebné postupy již pravděpodobně dosahují své maximální efektivity. Lepší pochopení změn v cytokinovém mikroprostředí souvisejících s touto nemocí by mohlo stát u zrodu nových léčebných modalit. V souboru 84 nemocných s nově diagnostikovanou AML byl prokázán signifikantní vztah mezi hladinami některých cytokinů, mezi nimiž lze odlišit společně regulované cytokiny. Společně regulovanými cytokiny jsou IL-1α, IL-2 a IL-4, dále IL-3, IL-12 a IL-13, zároveň byla prokázána pozitivní korelace hladin IL-3 s GM-CSF a GM-CSF s IL-5. Počet leukocytů, hladiny sIL-2R, sIL-6R, TNFR-1, TNFR-2 a MMP-9 byly identifikovány jako faktory ovlivňující hladiny solubilních adhezních molekul. Hladiny solubilních adhezních molekul byly ovlivněny jako celek, jejich vzájemná provázanost byla dokumentována četnými vzájemnými statisticky signifikantními pozitivními korelacemi. Přítomnost zánětlivé aktivity vyjádřená hladinou CRP silně korelovala s hladinou IL-6 a středně silně s hladinou ICAM-1. Je pravděpodobné, že ze solubilních adhezních molekul u aktivní AML odráží VCAM-1 a E-SEL aktivaci buňky endotelu lépe než ICAM-1 a P-SEL, které jsou více ovlivněny jinými faktory, jako jsou například probíhající infekční onemocnění nebo aktivita MMP-9. Překvapivým zjištěním jsou silné korelace hladin LDH s počtem leukocytů, VCAM-1, E-SEL, TNFR-1 a TNFR-2. Naopak IL-8 (CXCL-8) nemá prokazatelný vztah ke kterémukoli jinému analytu v období aktivní AML. Společně s TNFR-1 se však jeví jako vhodné markery aktivity onemocnění. Změny v hladinách IL-6, IL-7, EGF a VEGF mezi obdobím aktivní AML a CR jsou vysvětlitelné změnami v parametrech krevního obrazu a výskytem infekčních komplikací v době aktivní nemoci. Jsou však patrné signifikantní odchylky v regulaci cytokinové sítě mezi obdobím aktivní AML a CR. Hladiny P-SEL v období aktivní AML korelují s hladinami E-SEL a MMP-9, zatímco v období CR jsou silně závislé na počtu trombocytů. Korelační analýza hladin P-SEL, L-SEL, IL-8, LDH a počtu trombocytů může být v období CR ovlivněna reziduální leukemickou aktivitou. Využití proteinového biočipu se jeví jako vhodná metoda ke stanovení široké palety vyšetřovaných analytů z malého množství séra. Pouze stanovení L-SEL u aktivní AML bylo ovlivněno senzitivitou biočipu. Standardní prognostické ukazatele u AML budou mít své postavení i v blízké budoucnosti, jejich obecná platnost je patrná již v tomto poměrně malém souboru nemocných. Jako další nezávislé prognostické faktory u AML ale mohou nalézt využití i některé z námi vyšetřovaných cytokinů. Vhodnými ukazateli kratší doby do 1. relapsu AML se jeví vyšší
18
hladiny VEGF, IL-3, TNFR-1 a TNFR-2. Z vyšetřovaných cytokinů jsou vhodnými ukazateli celkového přežití hladiny IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNFR-1 a TNFR-2. Výše uvedené faktory se společně s věkem, hladinami LDH, standardní rizikovou stratifikací a původem nemoci uplatňují simultánně, nezávisle na sobě. Možný prognostický benefit vyšších hladin VCAM-1 nebyl při zahrnutí výše zmíněných faktorů do statistické analýzy signifikantní a bude jej třeba ověřit s delším časovým odstupem. Pro IL-6 nelze bez buněčné „cytokine releasing“ eseje rozhodnout, do jaké míry jsou jeho zvýšené hladiny odrazem probíhající infekce v době diagnózy AML a jakou měrou se uplatňuje vlastní sekrece IL-6 myeloblasty. Ovlivnění některého z ostatních výše uvedených faktorů s cílem navození léčebného efektu by mohlo nalézt využití v klinické praxi. Možnost farmakologické inhibice biologického efektu
dráhy
IL-8/CXCR-2
má
potenciál
širokého
využití
v léčbě
AML
a myelodysplastického syndromu. Imunologické mechanismy související s hladinami IL-15 a potažmo aktivací NK-buněk jsou pravděpodobně významné u širšího spektra myeloidních neoplázií. Námi učiněné závěry mohou být ovlivněny kratší dobou sledování nemocných v souboru a cenzorováním k datu poslední dokumentované kontroly. K nabytí jistoty o prognostickém přínosu jednotlivých analytů bude třeba delšího sledování. I poté bychom však znovu hodnotili jejich prediktivní a prognostický přínos ve srovnání se všemi ostatními zahrnutými faktory. V případě verifikace jejich prognostického potenciálu na nezávislém souboru nemocných by stanovení některých z výše uvedených cytokinů mohlo najít své místo v rutinní klinické praxi.
19
6. Summary AML will surely remain a therapeutic challenge over following decades. Current treatment approaches have probably reached their maximal efficacy. Better understanding of changes in cytokine microenvironment in AML may form a basis for new treatment strategies. In a cohort of 84 newly diagnosed AML patients, we found significant relationship between levels of several cytokines and distinguished cytokines showing simultaneous regulation. Simultaneously regulated cytokines are IL-1α, IL-2 and IL-4, same as IL-3, IL-12 and IL-13, at the same time we found positive correlation of IL-3 with GM-CSF and GM-CSF with IL-5. Leukocyte count, levels of sIL-2R, sIL-6R, TNFR-1, TNFR-2 and MMP-9 were identified as factors influencing levels of soluble adhesion molecules. The levels of soluble adhesion molecules were influenced as a whole, their relationship is obvious from frequent statistically significant correlations of their levels. Inflammatory activity expressed as CRP levels strongly correlated with IL-6 and moderately with ICAM-1. It is highly probable that in active AML the levels of VCAM-1 and E-SEL reflect endothelial cell activation better than ICAM-1 and P-SEL, which are more likely to be influenced by other factors as ongoing infection or MMP-9 activity. Surprisingly, the levels of LDH strongly correlated with VCAM-1, E-SEL, TNFR-1, TNFR-2 and leukocyte count. On the other hand, IL-8 (CXCL-2) in active disease had no significant correlation with any other evaluated analyte. Together with TNFR-1, they may be useful markers of disease activity. The levels of IL-6, IL-7, EGF and VEGF are different in active disease and remission which is sufficiently explained by changes in blood count and different frequency of infectious complications. Our data suggest different regulation of cytokine network in active disease and remission. P-SEL level in AML correlates with E-SEL and MMP-9, whereas in remission is P-SEL level dependent on platelet count. Correlation analysis of P-SEL, L-SEL, IL-8, LDH and platelet count in remission may be influenced by residual disease activity. The use of biochip array technology enables analysis of several cytokines from o single sample of evaluated serum. Only measurement of L-SEL in active disease was influenced by reaching the upper limit of array sensitivity. Standard prognostic indicators in AML will remain significant for clinical practice, their validity is obvious even in this relatively small patient cohort. Some evaluated cytokines may be used as further prognostic indicators in AML. Higher levels of VEGF, IL-3, TNFR-1 and TNFR-2 are suitable markers of shorter relapse free survival. From evaluated factors, the levels of IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNFR-1 and TNFR-2 are associated with overall
20
survival. These factors together with age, LDH levels, standard risk stratification and disease origin influence the overall survival independently and simultaneously. Prognostic benefit associated with higher VCAM-1 was not significant in multivariate analysis and will need further investigation with longer follow-up. For IL-6, we could not distinguish between autonomous cytokine secretion by myeloblasts and systemic inflammatory reaction in infection, a cytokine releasing assay would be useful for this purpose. Targeting levels of cytokines relevant to prognosis in AML may become a novel treatment approach. Pharmacologic inhibition of IL-8/CXCR-2 may be effective in majority of AML and myelodysplastic syndromes. Immunologic mechanism related to IL-15 levels and NK-cell activation is probably capable to influence the natural development in majority of myeloid disorders. Our conclusions are influenced by a relatively short follow-up and censoring to the date of last clinical control. Longer follow-up and re-evaluation of all tested factors is necessary to provide more evidence. If the prognostic role of some evaluated cytokines was verified in an independent patient cohort, they could be used in the routine clinical practice.
21
7. Seznam vlastních prací vztahujících se k tématu disertační práce
1. ČLÁNKY V ODBORNÝCH ČASOPISECH 1.
KUPSA, T., HORÁČEK, J.M., JEBAVÝ, L. The role of cytokines in acute myeloid leukemia: A systematic review. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 2012, 156(4), 291-301. ISSN 1213-8118. IF 0.990.
2.
HORACEK, J.M., VASATOVA, M., KUPSA, T., JEBAVY, L., ZAK, P. Multianalytical evaluation of serum levels of cytokines and adhesion molecules in patients treated for acute myeloid leukemia using biochip array technology. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 2013, vol. 157, no. 4, p. 277-279. ISSN 12138118. IF 1.661.
3.
HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P. Evaluation of serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia using biochip array technology. Exp. Oncol., 2013, vol. 35, no. 3, p. 229-230. ISSN 1812-9269.
4.
HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., ZAK, P., JEBAVY, L. Biochip array technology and evaluation of serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia. Exp. Oncol., 2014, vol. 36, no. 1, p. 50-51. ISSN 1812-9269.
5. KUPSA, T., HORACEK, J.M., JEBAVY, L. The role of adhesion molecules in acute myeloid leukemia and (hemato)oncology: A systematic review. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub., 2015, vol. 159, no. 1, p 1-11. ISSN 1213-8118. IF 1.200. 6. KUPSA, T., VASATOVA, M., KARESOVA, I., ZAK, P., HORACEK, J.M. Baseline serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients with acute myeloid leukemia - results of a pivotal trial. Exp. Oncol., 2014, vol. 36, no. 4, p. 252-257. ISSN 1812-9269. 7. HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P. Serum cytokine and adhesion molecule profile differs in newly diagnosed acute myeloid and lymphoblastic leukemia. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub., 2015, vol. 159, no. 2, p. 299-301. ISSN 1213-8118. IF 1.200. 8. KUPSA, T., VANEK, J., VASATOVA, M., KARESOVA, I., ZAK, P., JEBAVY, L., HORACEK, J.M. Evaluation of cytokines and soluble adhesion molecules in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia: the role of TNF-alpha and FLT3-ITD. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub., 2015 Sep 4. doi: 10.5507/bp.2015.036. [Epub ahead of print]. ISSN 1213-8118. IF 1.200.
22
2. ABSTRAKTA V ODBORNÝCH ČASOPISECH A SBORNÍCÍCH 1.
HORÁČEK, J.M., JEBAVÝ, L., VAŠATOVÁ, M., KUPSA, T., ŽÁK, P., TICHÝ, M., MALÝ, J. Plasma cytokine and growth factor levels in acute myeloid leukemia patients. Transfuze Hematol. dnes, 2011, roč. 17, suppl. 2, s. 51. ISSN 1213-5763.
2. HORACEK, J.M., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P., KUPSA, T., MALY, J. Evaluation of plasma levels of adhesion molecules by biochip array technology in acute myeloid leukemia patients. Bone Marrow Transplant., 2012, vol. 47, suppl. 1, p. S110. ISSN 0268-3369. IF 3.541. 3. HORACEK, J.M., JEBAVY, L., VASATOVA, M., ZAK, P., KUPSA, T., JAKL, M., MALY, J. Plasma cytokine and adhesion molecule profile in patients treated for acute myeloid leukemia. Haematologica/The Hematology Journal, 2012, vol. 97, e-suppl. 1, p. 325. ISSN 0390-6078. IF 6.424. 4. KUPSA, T., ŽÁK, P., ZAVŘELOVÁ, A., LÁNSKÁ, M., CERMANOVÁ, M., RADOCHA, J., JEBAVÝ, L. Extramedulární relaps u pacientů s akutní myeloidní leukémií po alogenní transplantaci krvetvorných buněk. In: Sborník abstrakt, XVI. československý hematologický a transfuziologický sjezd. Brno: Veletrhy Brno, a.s., 2012, s. 1. ISBN 978-80-87086-50-6. 5. HORÁČEK, J.M., JEBAVÝ, L., VAŠATOVÁ, M., ŽÁK, P., KUPSA, T., MALÝ, J. Sérové koncentrace cytokinů a adhezních molekul u pacientů léčených pro akutní myeloidní leukemii. In Sborník abstrakt, XVI. česko-slovenský hematologický a transfuziologický sjezd. Brno: Veletrhy Brno, a.s., 2012, s. 57. ISBN 978-80-87086-50-6. 6. HORÁČEK, J.M., JEBAVÝ, L., VAŠATOVÁ, M., KUPSA, T., ŽÁK, P., MALÝ, J. Sérové hladiny cytokinů a adhezních molekul u pacientů léčených pro akutní myeloidní leukemii. Vnitř. Lék., 2012, roč. 58, online publikace 11 (Sborník abstrakt, XIX. kongres České internistické společnosti ČLS JEP). eISSN 1801-7592. 7. HORACEK, J.M., VASATOVA, KUPSA, T., ZAK, P., M., JEBAVY, L. Hodnocení sérových koncentrací cytokinů a adhezních molekul u pacientů léčených pro akutní myeloidní leukemii. In: Sborník abstrakt, XXXVII. Brněnské onkologické dny a XXVII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky. Brno: Masarykův onkologický ústav, 2013, s. 110. ISBN 978-80-904596-9-4 8. KUPSA, T., HORÁČEK, J.M., VAŠATOVÁ, M., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Zhodnocení sérových koncentrací vybraných cytokinů a adhezních molekul u pacientů léčených pro akutní myeloidní leukémii. In: Sborník abstrakt, XXVII. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí. Olomouc: Vydavatelství UP Olomouc, 2013, s. 58-59. ISBN 978-80244-3480-3. 9. HORÁČEK, J.M., KUPSA, T., VAŠATOVÁ, M., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Sérové koncentrace cytokinů a adhezních molekul u pacientů s nově diagnostikovanou akutní lymfoblastickou leukemií. In: Sborník abstrakt, XXVII. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí. Olomouc: Vydavatelství UP Olomouc, 2013, s. 58-59. ISBN 978-80244-3480-3.
23
10. HORACEK, J.M., VASATOVA, M., KUPSA, T., ZAK, P., JEBAVY, L. Evaluation of serum levels of adhesion molecules by biochip array technology in acute myeloid leukemia patients. Biochimica Clinica, 2013, vol. 37, no. SS, p. S200. ISSN 0393-9564. 11. HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., ZAK, P., JEBAVY, L. Serum cytokine and adhesion molecule levels in patients with acute lymphoblastic leukemia and in healthy subjects. In: Proceedings and Abstract Book, 4th International Congress on Leukemia Lymphoma Myeloma. Ankara, Turkey: Turkish Society of Hematology, 2013, p. 282. 12. HORACEK, J.M., VASATOVA, M., KUPSA, T., JEBAVY, L., ZAK, P. Serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients treated for acute myeloid leukemia. In: Proceedings and Abstract Book, 4th International Congress on Leukemia Lymphoma Myeloma. Ankara, Turkey: Turkish Society of Hematology, 2013, p. 315-316. 13. KUPSA, T., HORÁČEK, J.M., VAŠATOVÁ, M., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Evaluation of serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients treated for acute myeloid leukemia. Haematologica/The Hematology Journal. 2013, 98(suppl. 1), p. 763. ISSN 0390-6078. IF 5.935. 14. KUPSA, T., HORÁČEK, J.M., VAŠATOVÁ, M., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Serum profile of multiple cytokines and adhesion molecules in newly diagnosed AML patiens differs in those who did not reach complete remission after Antrhracyclin/Cytarabine induction therapy. Blood, 2013, vol. 122, no. 21, p. 4997. ISSN 1528-0020 (online journal). IF 9.060. 15. HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P. Evaluation of serum cytokine and adhesion molecule profile in newly diagnosed acute leukemias using biochip array technology. Blood, 2013, vol. 122, no. 21, p. 4975. ISSN 1528-0020 (online journal). IF 9.060. 16. HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., JAKL, M., ZAK, P. Serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia and in healthy subjects. Haematologica/The Hematology Journal, 2013, vol. 98, suppl. 1, p. 500. ISSN 0390-6078. IF 5.935. 17. KUPSA, T., HORÁČEK, J.M. Evaluation of serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients treated for acute myeloid leukemia. In: Abstracts book of the 10th International Medical Postgraduate Conference. Hradec Králové: UK v Praze, LF v Hradci Králové, 2013, s. 49-51. ISBN 978-80-260-5300-2. 18. HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P. Sérové koncentrace cytokinů a adhezních molekul u pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií a u zdravých jedinců. In: Sborník abstrakt, XXXVIII. Brněnské onkologické dny a XXVIII. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky. Brno: Masarykův onkologický ústav, 2014, s. 100. ISBN 978-80-86793-32-0. 19. KUPSA, T., VAŠATOVÁ, M., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P., HORÁČEK J.M. Sérové hladiny cytokinů a adhezních molekul u pacientů s akutní myeloidní leukémií s normálním karyotypem. In: Sborník abstrakt, XXVIII. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí. Olomouc: Vydavatelství UP Olomouc, 2014, s. 77-78. ISBN 978-80-244-4099-6.
24
20. HORÁČEK, J.M., KUPSA, T., KAREŠOVÁ, I., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Hodnocení sérových koncentrací vybraných cytokinů pomocí biočipové technologie u pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií. In: Sborník abstrakt, XXVIII. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí. Olomouc: Vydavatelství UP Olomouc, 2014, s. 39-40. ISBN 978-80-244-4099-6. 21. KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P., HORACEK J.M. Secondary acute myeloid leukemia patients differ in levels of Interleukin-7 and epidermal growth factor from primary AML. Haematologica/The Hematology Journal, 2014, vol. 99, suppl. 1, p. 562. ISSN 0390-6078. IF 5.868. 22. KUPSA, T., VASATOVA, M., JEBAVY, L., ZAK, P., HORACEK J.M. Serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients with normal karyotype - acute myeloid leukemia. Haematologica/The Hematology Journal, 2014, vol. 99, suppl. 1, p. 562-563. ISSN 0390-6078. IF 5.868. 23. HORACEK, J.M., KUPSA, T., KAREŠOVÁ, I., JEBAVY, L., ZAK, P. Evaluation of serum levels of selected cytokines in patients with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia using biochip array technology. Haematologica/The Hematology Journal, 2014, vol. 99, suppl. 1, p. 547. ISSN 0390-6078. IF 5.868. 24. KUPSA, T., VASATOVA, M., KARESOVA, I., ZAK, P., HORÁČEK, J.M. Baseline serum levels of multiple cytokines and adhesion molecules in patients with primary and secondary acute myeloid leukemia. In: Abstract Book, 11th International Medical Postgraduate Conference. 2014, 81-84. ISBN 978-80-260-7244-7. 25. HORÁČEK, J.M., KUPSA, T., KAREŠOVÁ, I., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Hodnocení sérových koncentrací vybraných cytokinů a cytokinových receptorů u pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií. In: Program a abstrakta, XXI. kongres České internistické společnosti ČLS JEP. Praha: Meritis s. r. o., 2014, s. 64. 26. HORÁČEK, J.M., VAŠATOVÁ, M., KUPSA, T., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Sérové koncentrace cytokinů a adhezních molekul u pacientů s akutní leukemií a u zdravých jedinců. In: Program a abstrakta, XXI. kongres České internistické společnosti ČLS JEP. Praha: Meritis s. r. o., 2014, s. 38. 27. KUPSA, T., VANĚK, J., VAŠATOVÁ, M., KAREŠOVÁ, I., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P., HORÁČEK, J.M. Sérové hladiny vybraných cytokinů a solubilních adhezních molekul korelují u pacientů s nově diagnostikovanou akutní myeloidní leukémií: vliv TNF-alfa a FLT3-ITD. In: Sborník abstrakt, XXIX. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí. Olomouc: Vydavatelství UP Olomouc, 2015, s. 25-26, ISBN 978-80-244-4697-4. 28. KUPSA, T., VAŠATOVÁ, M., KAREŠOVÁ, I., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P., HORÁČEK J.M. Vliv cytogenetických a molekulárně-genetických aberací na hladiny cytokinů a solubilních adhezních molekul u pacientů s akutní myeloidní leukémií. Klin. Onkol., 2015, roč. 28, suppl. 1, s. S 159. ISSN 0862-495X. 29. KUPSA, T., VANĚK, J., VAŠATOVÁ, M., KAREŠOVÁ, I., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P., HORÁČEK J.M. Hladiny vybraných cytokinů a solubilních adhezních molekul u pacientů
25
s nově diagnostikovanou akutní myeloidní leukémií: vliv TNF-alfa a FLT3-ITD. Klin. Onkol., 2015, roč. 28, suppl. 1, s. S 160. ISSN 0862-495X. 30. HORÁČEK, J.M., KUPSA, T., KAREŠOVÁ, I., VAŠATOVÁ, M., SKOŘEPA, P., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Hodnocení sérových koncentrací cytokinů a adhezních molekul u pacientů s akutní leukemií a u zdravých jedinců. Klin. Onkol., 2015, roč. 28, suppl. 1, s. S161. ISSN 0862-495X. 31. HORÁČEK, J.M., KUPSA, T., KAREŠOVÁ, I., ČÁPKOVÁ, H., JEBAVÝ, L., ŽÁK, P. Sérové koncentrace vybraných cytokinů a cytokinových receptorů u pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií. Klin. Onkol., 2015, roč. 28, suppl. 1, s. S158-159. ISSN 0862495X. 32. KUPSA, T., VANEK, J., VASATOVÁ, M., KARESOVA, I., JEBAVY, L., ZAK, P., HORACEK J.M. Evaluation of cytokines and soluble adhesion molecules in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia: the role of TNF-alpha and FLT3-ITD. In: Proceedings and Abstract book, 5th International congress on Leukemia, Lymphoma and Myeloma. Ankara, Turkey: Turkish Society of Hematology, 2015, p. 180-181. 33. HORACEK, J.M., KUPSA, T., KARESOVÁ, I., JEBAVY, L., ZAK, P. Serum levels of selected cytokines and cytokine receptors in patients with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia. In: Proceedings and Abstract Book, 5th International Congress on Leukemia Lymphoma Myeloma. Ankara, Turkey: Turkish Society of Hematology, 2015, p. 121-122. 34. HORACEK, J.M., KUPSA, T., VASATOVA, M., KARESOVÁ, I., JEBAVY, L., ZAK, P. Evaluation of serum cytokine and adhesion molecule profile in newly diagnosed acute leukemias using biochip array technology. In: Proceedings and Abstract Book, 5th International Congress on Leukemia Lymphoma Myeloma. Ankara, Turkey: Turkish Society of Hematology, 2015, p. 182-183. 35. HORACEK, J.M., KUPSA, T., KARESOVA, I., ZAK, P. Evaluation of serum levels of selected cytokines and cytokine receptors in patients with newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia. In: Suplement, XVII. Slovensko-český hematologický a transfuziologický zjazd s medzinárodnou účasťou. Bratislava: A-medi management, 2015, s. 107-108. ISBN 978-80-89797-02-8.
26
