UNIVERZITA OBRANY BRNO FAKULTA VOJENSKÉHO ZDRAVOTNICTVÍ HRADEC KRÁLOVÉ
AUTOREFERÁT DIZERTAČNÍ PRÁCE
Biochemické aspekty neurodegenerativních onemocnění
RNDr. Alžběta Dlabková
Doktorský studijní program toxikologie
Hradec Králové 2016
Obsah 1
Úvod ............................................................................................................... 3 1.1 Oxidační stres ............................................................................................. 3 1.2 Zánět ........................................................................................................... 3 1.2.1
Cholinergní protizánětlivá dráha ......................................................... 4
1.3 Alzheimerova nemoc .................................................................................. 4 1.4 Schizofrenie ................................................................................................ 5 2
Cíl práce.......................................................................................................... 6
3
Metodika ......................................................................................................... 6 3.1 Vliv takrinu na oxidační rovnováhu in vivo................................................ 6 3.2 Optimalizace stanovení nízkomolekulárních antioxidantů metodou square
wave voltametrie ........................................................................................................... 8 3.3 In vitro sledování vlivu látek aktivních v cholinergním systému na zánětlivou reakci makrofágů ......................................................................................... 9 4
Výsledky a diskuze ....................................................................................... 11 4.1 Vliv takrinu na oxidační rovnováhu in vivo.............................................. 11 4.1.1
FRAP ................................................................................................. 11
4.1.2
TBARS .............................................................................................. 12
4.1.3
Koncentrace karbonylovaných proteinů ............................................ 13
4.1.4
Aktivita GR ....................................................................................... 13
4.1.5
Aktivita SOD ..................................................................................... 13
4.1.6
Aktivita CASP 3 ................................................................................ 14
4.1.7
Biochemické vyšetření plazmy.......................................................... 14
4.2 Optimalizace stanovení nízkomolekulárních antioxidantů metodou square wave voltametrie ......................................................................................................... 15 4.2.1
Optimalizace analytické metody ....................................................... 15
4.2.2
Kalibrační křivky a limity detekce .................................................... 15
4.2.3
Korelace voltametrické metody a FRAP ........................................... 16 1
4.3 In vitro sledování vlivu látek aktivních v cholinergním systému na zánětlivou reakci makrofágů ....................................................................................... 16 4.3.1
Vliv agonistů α7 nAChR na produkci IL-6 ....................................... 16
4.3.2
Vliv klozapinu na produkci IL-6 ....................................................... 18
4.3.3
Vliv takrinu a galantaminu na produkci IL-6 .................................... 18
5
Závěr ............................................................................................................. 19
6
Literatura ...................................................................................................... 24
2
1 Úvod Tématem
předkládané
disertační
práce
jsou
biochemické
aspekty
neurodegenerativních poruch. Vzhledem k rostoucí době dožití populace představují neurodegenerativní onemocnění stále větší společenský i ekonomický problém, neboť připravují pacienty o schopnost postarat se sami o sebe často na dlouhá léta a péče o tyto pacienty je pro pečující osoby velmi časově, psychicky a finančně náročná. Z důvodů neexistence účinné kauzální léčby a špatné prognózy onemocnění patří výzkum patologických procesů spojených s neurodegenerativními poruchami a také nových přístupů k jejich léčbě mezi velmi aktuální témata biomedicínského výzkumu. Biochemických aspektů, jež se podílejí na vzniku a průběhu těchto onemocnění, je řada a není možné se všem podrobně věnovat v rámci jedné disertační práce. Tato se tedy
zaměřuje
zejména
na
dva
procesy
související
nejen
s patogenezí
neurodegenerativních poruch ale i dalších onemocnění – na oxidační stres a zánět.
1.1 Oxidační stres V místech mechanického poškození tkáně nebo probíhajícího zánětu vznikají často reaktivní formy kyslíku (ROS), někdy nazývané také volné radikály. Jedná se o malé, velmi reaktivní, redoxně aktivní molekuly nebo jen fragmenty molekul. Mohou působit jako signální molekuly pro základní buněčné funkce (např. růst a adaptační odpověď), ve vyšších koncentracích však buňky poškozují na molekulární úrovni a mohou způsobit i jejich smrt[1]. Na obranu proti působení ROS je organismus vybaven antioxidačním systémem. Pokud množství vznikajících ROS přesáhne jeho kapacitu, je narušena oxidační rovnováha, vzniká oxidační stres a dochází k oxidačnímu poškození biologických molekul[2].
1.2 Zánět Zánět je imunitní reakce organismu na napadení mikroorganismy, traumata a řadu fyzikálních agens. Zároveň hraje zánět podstatnou roli v patogenezi chronických autoimunitních onemocnění, rakoviny či neurodegenerativních onemocnění [3]. V rámci rozvoje zánětlivé reakce dochází k aktivaci makrofágů a dendritických buněk, které kromě fagocytózy přítomných mikrobů a poškozených buněk produkují prozánětlivé cytokiny[4]. 3
Usazené makrofágy se nacházejí mimo jiné i v centrálním nervovém systému. Zde se jedná o mikroglie, které se za podmínek vedoucích k poškození mozku mění z klidového stavu v aktivované makrofágy, účastní se procesu zánětu, fagocytují zbytky poškozených buněk, exprimují molekuly hlavního histokompatibilního komplexu, čímž získávají schopnost prezentovat antigeny[5]. Mikroglie se aktivují po expozici např. bakteriálnímu LPS, což se projeví zvýšenou tvorbou prozánětlivých cytokinů[6]. Aktivované mikroglie jsou častou známkou probíhajícího neurodegenerativního onemocnění, např. Alzheimerovy nemoci[7]. Z těchto důvodů je zřejmě možné ovlivněním
činnosti
makrofágů,
potažmo
mikroglií,
přispět
i
k terapii
neurodegenerativních onemocnění.
1.2.1 Cholinergní protizánětlivá dráha Průsečík mezi vrozeným imunitním systémem organismu a nervovým systémem tvoří tzv. cholinergní protizánětlivá dráha (ChPD)[8]. Makrofágy a další buňky zahrnuté v imunitním systému, jež mají schopnost produkovat cytokiny, exprimují alfa 7 nikotinový acetylcholinový receptor (α7 nAChR)[9]. Pokud jsou aktivované makrofágy vystaveny neuromediátoru acetylcholinu, dochází k jejich inaktivaci. Orgány tvořící součást retikuloendoteliálního systému, tedy orgány osídlené makrofágy, jsou inervovány bloudivým nervem. Aktivace bloudivého nervu vede k uvolnění acetylcholinu, který se naváže na α7 nAChR tkáňových makrofágů. Po té dochází k inhibici produkce prozánětlivých cytokinů, především IL-6 a TNF α. Tímto mechanismem je umožněna regulace zánětlivé imunitní odpovědi nervovým systémem[8].
1.3 Alzheimerova nemoc Alzheimerova nemoc (AD) je neurodegenerativní onemocnění, na něž bych se v této práci ráda zaměřila především. Na vzniku a vývoji onemocnění se pravděpodobně podílí řada faktorů. Teorie vysvětlující patogenezi AD vycházejí z nálezu funkčních, anatomických, histologických změn a změn na molekulární úrovni zaznamenaných v mozcích pacientů trpících AD. Typická je ztráta nervové tkáně a rozpad její struktury, extracelulární plaky tvořené agregovaným amyloidem β a intracelulární neurofibrilární pletence tvořené abnormálně fosforylovaným a konformačně pozměněným tau-proteinem[10]. Jednou z nejčastějších 4
změn, pozorovaných v CNS pacientů postižených AD je také deficit cholinergního nervového systému, jenž se projeví poklesem známek cholinergní aktivity a hladiny neuromediátoru acetylcholinu[11]. Dále byly u těchto pacientů nalezeny známky poukazující na poškození cytoplazmy neuronů oxidačním stresem[12]. Uvažuje se též, že by poškození nervových buněk mohlo být způsobeno nedostatečnou perfuzí a chronickou hypoxií mozkové tkáně v důsledku poškození cév[1]. V souvislosti s rozvojem AD bývají často pozorovány i změny typické pro zánět v CNS, jako je aktivace a zmnožení mikroglií a astrocytů, zvýšení koncentrace prozánětlivých cytokinů a za určitých okolností také narušení hematoencefalické bariéry a následná invaze imunitních buněk do místa poškození[13]. V současnosti je k dispozici pouze symptomatická léčba AD, na níž se u většiny pacientů časem vyvíjí tolerance. Účinek léčiv používaných v terapii AD je založen převážně na inhibici enzymu acetylcholinesterasy (AChE) nebo na antagonismu Nmetyl-D-aspartátových receptorů[14]. Tato práce se podrobněji věnuje účinkům dvěma inhibitorů AChE, takrinu a galantaminu, ovšem zejména z hlediska jejich schopnosti ovlivnit oxidační stres a zánět.
1.4 Schizofrenie Schizofrenie je komplexní mentální porucha s poměrně variabilními projevy a složitou, ne zcela objasněnou, multifaktoriální etiologií. K jejímu vzniku přispívají faktory vnějšího prostředí v součinnosti s geneticky podmíněnou náchylností a často také s časným narušením vývoje centrální nervové soustavy[15]. Schizofrenie se nezařazuje mezi neurodegenerativní poruchy, avšak i u pacientů trpících schizofrenií dochází k úbytku nervové hmoty, přičemž míra neurodegenerace odpovídá u schizofrenie závažnosti onemocnění[16]. V současnosti se úvahy o nových přístupech v terapii tohoto onemocnění obrací podobným směrem jako v terapii neurodegenerativních poruch. Z tohoto důvodu je schizofrenii a její terapii věnována pozornost i v předkládané práci, jinak zaměřené na neurodegenerativní onemocnění v čele s AD. Klozapin je atypické antipsychotikum používané pro terapii pacientů, u nichž selhala klasická neuroleptika, nebo pacientů trpících extrapyramidálními nežádoucími účinky[17]. Přesný mechanismus účinku klozapinu nebyl dosud zcela objasněn, avšak je známá jeho afinita k několika neurotransmiterovým receptorům[18]. V důsledku 5
podání klozapinu dochází ke změnám v produkci řady cytokinů, což bylo pozorováno u pacientů trpících schizofrenií, zdravých dobrovolníků i u modelových laboratorních zvířat[19]. Navíc několik studií popisuje interakci klozapinu s α7 nAChR v centrálním nervovém systému[20]. Proto byla v rámci řešení práce ověřována hypotéza, že klozapin ovlivňuje probíhající zánět prostřednictvím ChPD.
2 Cíl práce Cílem práce bylo především identifikovat schopnost vybraných léků zavedených v léčbě Alzheimerovy nemoci a schizofrenie a agonistů α7 nAChR ovlivnit oxidační homeostázu organizmu a probíhající zánět a na základě získaných výsledků posoudit, zda se ovlivnění těchto procesů může podílet na terapeutické účinnosti těchto látek. Tyto poznatky mohou přispět k rozšíření dosavadních znalostí o používaných léčivech a usnadnit tak volbu a nastavení léčby v praxi. Zároveň pomohou lépe zacílit další výzkum zaměřený na nové terapeutické přístupy v léčbě neurodegenerativních poruch či na vývoj nových látek s kombinovaným účinkem, působících na několik terapeutických cílů současně. Dílčím cílem v rámci řešení těchto úkolů bylo mimo jiné zavést, optimalizovat a validovat
analytickou
metodu
pro
stanovení
nízkomolekulárních
oxidantů
v biologickém materiálu nebo zavést vhodný in vitro model zánětlivé reakce v organizmu.
3 Metodika 3.1 Vliv takrinu na oxidační rovnováhu in vivo Vliv takrinu na oxidační rovnováhu organizmu byl sledován na modelu laborního morčete. Práce byla schválena a dozorována etickou komisí Fakulty vojenského zdravotnictví, Univerzity Obrany. Laboratorní morčata byla rozdělena skupin po osmi jedincích. Intramuskulární injekcí do stehenního svalu jim byl podán roztok takrinu nebo fyziologický roztok (v případě kontrolních skupin) dle tabulky 1. Tab. 1: Rozdělení zvířat do skupin Skupina
Dávka takrinu [µg/kg]
1A
0 (kontrola)
2A
50
6
Čas expozice [h] 1
3A
100 (terapeutická)
4A
200 (terapeutická)
5A
400
6A
800
1B
0 (kontrola)
2B
50
3B
100 (terapeutická)
4B
200 (terapeutická)
5B
400
6B
800
24
Po usmrcení zvířat v CO2 atmosféře byly odebrány orgány (játra, srdce, ledviny, slezina, mozeček, čelní, spánkový a týlní mozkový lalok) pro stanovení známek oxidačního stresu a krev pro biochemické vyšetření plazmy. Pro stanovení hladiny nízkomolekulárních antioxidantů byla použita fotometrická technika FRAP (z angl. ferric reducing antioxidant power = síla redukující železité ionty) založená na schopnosti antioxidantů redukovat železité ionty na železnaté. Železnaté ionty vytváří v zásaditém prostředí s tris(pyridyl)triazinem barevný komplex s absorpčním maximem 593 nm. Míra
peroxidace
lipidů
byla
hodnocena
prostřednictvím
stanovení
malondialdehydu rovněž fotometricky, metodou TBARS (z angl. thiobarbituric reactive substances = látky reagující s kyselinou thiobarbiturovou). Toto stanovení je založené na kopulaci malondialdehydu s kyselinou thiobarbiturovou za vzniku barevného produktu absorbujícího při 532 nm. Oxidativní poškození proteinů bylo posouzeno dle fotometrického stanovení koncentrace karbonylovaných proteinů po reakci s dinitrofenylhydrazinem. Stav enzymatické složky antioxidačního systému organizmu byl vyhodnocen na základě stanovení aktivity enzymů glutationreduktasy Wartburgovým optickým testem, vycházejícím ze změny absorpčního maxima NADPH při oxidaci glutationem, a superoxiddismutasy (SOD). Aktivita SOD byla měřena za použití komerčně dostupného kolorimetrického kitu, na základě inhibice redukce tetrazoliové soli na žlutou komplexní sloučeninu WST-1 formazan pomocí superoxidového aniontu. V důsledku aktivity SOD dochází k přeměně superoxidového aniontu na peroxid vodíku a úměrně k poklesu absorbance v roztoku při 440 nm.
7
Podobně i aktivita kaspasy 3 (CASP 3), která vypovídá o probíhající apoptóze, byla stanovena pomocí komerčně dostupného kitu. Analýza je založena na schopnosti CASP 3 odštěpit p-nitroanalin, který má schopnost absorbovat UV záření s absorpčním maximem 405 nm, ze syntetického substrátu acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilidu. Ve vzorcích plazmy byla za použití automatického biochemického analyzátoru změřena aktivita enzymů alaninaminotranseferasy (ALT), aspartátaminotransferasy (AST), alkalické fosfatasy (ALP), laktátdehydrogenasy (LDH) a hladina celkového proteinu, albuminu, kreatininu, urey, celkového bilirubinu, celkového cholesterolu, HDL (z angl. low density lipoprotein) cholesterolu, triglyceridů a glukosy. Výsledky pro jednotlivé skupiny byly mezi sebou porovnány pomocí ANOVA analýzy s Bonferroniho korekcí. Za signifikantní byly považovány rozdíly na hladině významnosti p<0.05 a p<0.01. Statistická analýza byla provedena na softwaru Origin 8 SR2 (OriginLab Corporation, Northampton, USA).
3.2 Optimalizace
stanovení
nízkomolekulárních
antioxidantů
metodou square wave voltametrie V rámci řešení práce práce byl zaveden, optimalizován a ověřen postup stanovení nízkomolekulárních antioxidantů v séru pomocí square wave (SW) voltametrie s použitím komerčně dostupných sítotiskových senzorů s kompozitní uhlíkovou pracovní elektrodou, vyrobených firmou Metrohm (typ 6.1208.110, Herisau, Švýcarsko). Pomocí roztoků standardních antioxidantů kyseliny askorbové, N-acetylcysteinu, troloxu a melatoninu byla provedena optimalizace objemu nanášeného vzorku v rozsahu 20 – 40 µl, potenciálového kroku v rozsahu 1 - 10 mV, amplitudy 5 - 100 mV, a frekvence 1 - 4 Hz. Parametry, které vedly k nejlepší odezvě detektoru, byly vybrány pro analýzu reálných biologických vzorků. Pro každý standard byla sestrojena kalibrační křivka jako závislost plochy anodického píku na koncentraci v rozsahu koncentrací od 0,010 do 10 mmol/l a zpracována pomocí lineární regrese. Pro jednotlivé standardní látky byl stanoven limit detekce graficky metodou podle Hubauxe a Vose[21] za využití kalibrační křivky a grafického znázornění konfidenčního intervalu 95 %. Validita voltametrické metody byla ověřena srovnáním s jinou běžně užívanou metodou stanovení nízkomolekulárních antioxidantů – FRAP. Tytéž vzorky s přídavkem standardních roztoků byly analyzovány pomocí SW voltametrie a metody 8
FRAP. Následně byl vytvořen graf vyjadřující závislost příslušných ploch anodických píků na absorbanci vzorků analyzovaných postupem FRAP a vypočítán korelační koeficient r.
3.3 In vitro sledování vlivu látek aktivních v cholinergním systému na zánětlivou reakci makrofágů Sledování vlivu látek aktivních v cholinergním systému na zánětlivou reakci bylo provedeno na myší makrofágové linii j774.2 (General cell collection, Public Health England, Porton Down, Velká Británie), myší makrofágové linii raw 264.7 (ATCC, Manassas, Virginia, USA) a lidské leukemické monocytární linii THP-1 (poskytnuta doc. PharmDr. Peterem Kollárem, Ph.D z Ústavu humánní farmakologie a toxikologie Farmaceutické fakulty Veterinární a farmaceutické univerzity Brno). Diferenciace monocytů THP-1 na makrofágy byla vyvolána pomocí forbol myristátu-acetátu (PMA) podle postupu popsaného Hoškem a kol.[22] Buňky j 774.2 a raw 264.7 byly nasazeny do 96 jamkové destičky v množství 3×105 buněk v 1 ml, po 200 µl suspenze do jedné jamky a inkubovány za standardních podmínek 24 h. Buňky THP-1 byly nasazeny do 24 jamkové destičky v množství 2×105 buněk v 1 ml, po 200 ml suspenze do jedné jamky a byla vyvolána jejich diferenciace na makrofágy. Buňky byly vystaveny působení testovaných látek (látka s předpokládaným protizánětlivým účinkem) případně dalších látek (inhibitor AChE, BChE či antagonista α7 nAChR) a bakteriálního lipopolysacharidu (LPS), jenž u nich indukoval zánětlivou odpověď, podle schématu uvedeného v tabulce 2. Do všech pokusů byla zařazena negativní kontrola, tedy jamky, které obsahovaly pouze buňky v kultivačním médiu bez přidání dalších látek, dále jamky, do nichž byly přidány pouze roztoky testovaných látek bez aktivace buněk LPS. Jako pozitivní kontrola sloužily jamky, v nichž byly buňky pouze aktivované LPS bez přídavku roztoku testovaných látek. V případě, že byly testované látky rozpuštěné v etanolu nebo DMSO, byl odpovídající objem těchto rozpouštědel pipetován do jamek, které sloužily jako negativní i pozitivní kontrola. Tab. 2: Uspořádání experimentů, při nichž byly makrofágy z použitých buněčných linií vystaveny působení látek s předpokládaným protizánětlivým účinkem a zároveň, popřípadě po 30 min koinkubaci s testovanými látkami, aktivovány pomocí lipopolysacharidu. Zkratky použité v tabulce: AChE –
9
acetylcholinesterasa; BChE – butyrylcholinesterasa; nAChR – nikotinový acetylcholinový receptor; LPS – lipopolysacharid; MLA - metyllykakonitin Testovaná látka
Výsledná koncentrace v jamce
acetylcholin
10-7-10-3 mol/l 10-7-10-3 mol/l 10-7-10-3 mol/l 10-6-10-3 mol/l 10-6-10-3 mol/l
nikotin
epibatidin
cholin
klozapin takrin galantamin dexametazon
10-8-10-5 mol/l 10-8-10-5 mol/l 10-8-10-5 mol/l 10-8-10-5 mol/l 10-8-10-5 mol/l 10-8-10-5 mol/l 10-5-10-2 mol/l 10-5-10-2 mol/l 10-4-10-2 mol/l 10-4-10-1 mol/l 0,4-12 µg/ml 6 µg/ml 10-1250 ng/ml 10-1250 ng/ml 0,0011µg/ml 0,0011µg/ml 0,0011µg/ml
Inhibitor AChE, BChE nebo α7 nAChR
ethopropazin 3×10-3 mol/l huperzin 10-4 mol/l pyridostigmin 10-3 mol/l pyridostigmin 10-3 mol/l + MLA 5×10-4 mol/l
Buněčná linie
Aktivace LPS
Koncentrace LPS [µg/ml]
j774.2
současně
1
24
j774.2
současně
1
24
j774.2
současně
1
24
j774.2
po 30 min po 30 min
4
3, 12, 24*
4
3, 12, 24*
4
3, 12, 24**
4
3, 12, 24**
4
3, 12, 24**
4
3, 12, 24**
4
3, 12, 24**
4
3, 12, 24**
4
12, 24
4
12, 24
1
12, 24
raw 264.7 j774.2 j774.2 j774.2
po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min po 30 min současně současně současně
1
12, 24
1 1 1
24 24 24
j774.2
současně
1
24
j774.2
po 30 min po 30 min po 30 min
1a4
24
1a4
24
1
12, 24
j774.2
j774.2 MLA 10-12 mol/l
j774.2 THP-1
MLA 5×10-4 mol/l
THP-1
MLA 5×10-4 mol/l
raw 264.7 raw 264.7 j774.2 raw 264.7 THP-1
MLA 10-11-10-5
raw 264.7 THP-1
*postup dle Waldburger a kol.[23] **postup dle Li a kol.[24]
10
Čas expozice [h]
Průběh zánětlivé reakce byl sledován prostřednictvím stanovení koncentrace prozánětlivého cytokinu IL-6 uvolněného buňkami do kultivačního média. IL-6 byl stanoven imunologickou metodou ELISA s použitím komerčně dostupných setů. Ověření, zda testované látky v použitých koncentracích neovlivňují viabilitu buněk bylo provedeno standardním MTT testem založeným na redukci žlutého barviva MTT mitochondriálními enzymy na fialový derivát formazanu. Přítomnost α7-nAChR na buněčných liniích byla ověřena pomocí techniky western-blot s použitím primární protilátky proti α7 podjednotce nikotinového receptoru a chemiluminiscenční detekce. Všechny pokusy byly provedeny nejméně v triplikátu. V případě potřeby ověřit pozitivní výsledek byly experimenty třikrát nezávisle opakovány. Porovnání výsledků bylo provedeno pomocí neparametrického Kruskal-Wallisova testu s Bonferroniho korekcí. Pro statistickou analýzu byl použit software IBM SPSS statistics (IBM, Armonk, North Castle, New York, USA).
4 Výsledky a diskuze 4.1 Vliv takrinu na oxidační rovnováhu in vivo 4.1.1 FRAP Hodnota FRAP poskytuje informaci o hladině nízkomolekulárních antioxidantů a o antioxidační kapacitě vyšetřovaného materiálu[25]. Zvýšená hladina FRAP poukazuje na aktivaci antioxidačního systému[26]. Jak je patrné z grafů na obrázku 1, došlo 1 h po podání takrinu k signifikantnímu zvýšení hodnoty FRAP v játrech, mozečku a čelním, týlním a spánkovém mozkovém laloku (0.1
11
mozeček
čelní lalok
spánkový lalok
týlní lalok
Obr. 1: Hodnota FRAP (z angl. Ferric reducing antioxidant power = síla redukující železité ionty) ve tkáni mozečku, čelního, spánkového a týlního mozkového laloku ± standardní chyba průměru [μmol/g], * p<0,05, ** p<0,01, n=8 jedinců ve skupině
4.1.2 TBARS Hodnota TBARS vypovídá především na oxidační poškození buněčných membrán[27]. V játrech, slezině a mozku nebyla hodnota TBARS výrazně ovlivněna 1 ani 24 h po podání takrinu. Ve tkáni ledvin bylo zaznamenáno mírné zvýšení TBARS po 1 h nejvyšších dávek takrinu 400 a 800 µg/kg (viz obr. 2). Ve tkáni srdce byl naopak pozorován vzestup po 24 h od aplikace (obr. 2). Popisované jevy jsou relativně neočekávané, neboť poškození ledvin či srdce v důsledku podání takrinu není z dostupné literatury známé. Jako možné vysvětlení zvýšení TBARS v srdci se nabízí nižší aktivita antioxidačního systému. Nárůst TBARS v ledvinách v intervalu 1 h pravděpodobně souvisí s eliminací léčiva.
12
ledviny
srdce
Obr. 2: Hodnota TBARS (z angl. Thiobarbituric acid reactive substances = látky reagující s thiobarbiturovou kyselinou) ve tkáni ledvin a srdce ± standardní chyba průměru [μmol/g], ** p<0,01, n=8 jedinců ve skupině
4.1.3 Koncentrace karbonylovaných proteinů Karbonylace je nevratné poškození proteinů v důsledku oxidačního stresu[28]. Koncentrace karbonylovaných proteinů se ve všech vyšetřovaných orgánech jevila poměrně stabilní. Její změna v důsledku podání takrinu nebyla zaznamenána ani ve tkáni srdce a ledvin, kde došlo v závislosti na dávce takrinu ke zvýšení či snížení hodnoty TBARS. Jako statisticky významný byl vyhodnocen pouze pokles koncentrace karbonylovaných proteinů ve tkáni mozečku 1 h od podání takrinu v dávce 400 µg/kg a vzestup v čelním laloku 24 h od podání takrinu v dávce 200 µg/kg. Tyto výkyvy však nevykazovaly trend odpovídající dávkování takrinu.
4.1.4 Aktivita GR Podobně jako u hladiny karbonylovaných proteinů se neukázal ani vliv takrinu na aktivitu GR ve vyšetřovaných orgánech. V jednotlivých skupinách byly zaznamenány pouze mírné, většinou statisticky nevýznamné změny nezávislé na dávce takrinu.
4.1.5 Aktivita SOD Vliv takrinu na aktivitu SOD byl patrný především 1 h po aplikaci látky. Ve spánkovém a týlním mozkovém laloku a ve tkáni mozečku byla zaznamenána nejvyšší aktivita SOD u zvířat, kterým byly aplikovány střední dávky takrinu – 100 a 200 µg/kg, zatímco aktivita SOD v mozcích zvířat vystavených dávce 800 µg/kg se od kontrolní skupiny lišila jen mírně.
13
Toto pozorování je v souladu s výsledky stanovení FRAP a lze jej vysvětlit zvýšenou oxidační zátěží, která byla úspěšně potlačena, aniž by došlo k poškození tkáně. Opětovný pokles aktivity SOD u skupin vystavených takrinu v dávce 800 µg/kg by mohl být zapříčiněn tím, že tvorba superoxidových radikálů probíhala rychleji než obnova enzymu. Po uplynutí 24 h byl pozorován vzestup aktivity SOD pouze v játrech zvířat, která byla vystavena nejvyšší dávce takrinu, tedy 800 µg/kg. Ve tkáni ledvin, sleziny a srdce nebyly patrné žádné významné změny.
4.1.6 Aktivita CASP 3 Aktivita CASP 3 je za normálních okolností velmi nízká a narůstá se pouze v případě zvýšené apoptózy[29]. Ve vyšetřovaných oblastech mozku a v srdečním svalu nedosahovala aktivita CASP 3 limitu detekce použité metody stanovení. V játrech, ledvinách a slezině byly zaznamenány jen nevýrazné a statisticky nevýznamné změny. Obdobně jako aktivita SOD ve tkáni mozku i aktivita CASP 3 byla nejvyšší u zvířat vystavených středním dávkám takrinu, tedy 100 a 200 µg/kg, nicméně tyto nevýznamné změny nenaznačují zvýšenou apopózu v důsledku podání takrinu.
4.1.7 Biochemické vyšetření plazmy Hladiny celkového a HDL cholesterolu a kreatininu se nacházely pod limitem detekce, byly tedy nižší než 1,3 mmol/l pro celkový a 0,26 mmol/l pro HDL cholesterol a 27 µmol/l pro kreatinin. Známky poškození jater, tedy celkový bilirubin, celkový protein, albumin a aktivita AST, ALT a ALP nebyly podáním takrinu výrazně ovlivněny. Po jedné hodině od podání takrinu došlo k signifikantnímu poklesu hladiny BUN u zvířat vystaveným takrinu v dávce 200 a 800 µg/kg, jedná se ovšem o pokles v rámci referenčních mezí pro hladinu BUN v plazmě morčat[30]. I v ostatních skupinách byla hladina BUN nižší vůči kontrole, nejednalo se však o statisticky významný rozdíl. Na glykemii, koncentraci TG a aktivitu LDH nemělo podání takrinu účinek.
14
4.2 Optimalizace
stanovení
nízkomolekulárních
antioxidantů
metodou square wave voltametrie 4.2.1 Optimalizace analytické metody Jako nejvhodnější bylo zvoleno nastavení analyzátoru s potenciálovým skokem a amplitudou 5 mV při frekvenci 1 Hz. Čas analýzy jednoho vzorku byl za těchto podmínek maximálně 4 min. Objem naneseného vzorku neměl na analýzu výrazný vliv, s ohledem na spotřebu biologického materiálu bylo tedy na senzory aplikováno 20 μl vzorku, což je objem dostačující k překrytí všech elektrod. Na obrázku 3 je příklad typického voltamogramu získaného analýzou reálného séra. V plazmě a séru je přítomna řada nízkomolekulárních antioxidantů, které se při SW voltametrii projevují vznikem 2 anodických píků lišících se specifickým potenciálem.
Obr. 3: Voltamogram získaný měřením vzorku lidského séra. E [V] = vložené napětí, I [µA] = procházející proud. Pík č. 1 (E ˂0,6 V) odpovídá píku vzniklému oxidací např. kyseliny askorbové, Nacetylcysteinu, melatoninu, pík č. 2 (E ˃ 0,6 V) odpovídá píku vzniklému např. oxidací melatoninu a troloxu.
4.2.2 Kalibrační křivky a limity detekce Kalibrační křivky pro kyselinu askorbovou, melatonin a trolox byly sestaveny pro koncentrace 0,010 – 10 mmol/l. V tomto koncentračním rozsahu byla odezva lineární. Kalibrační křivku pro N-acetylcystein se podařilo změřit pouze v rozsahu koncentrací 0,010 – 1,0 mmol/l, což bylo způsobeno rychlou polarizací elektrod při nanesení roztoku o vyšší koncentraci. Korelační koeficienty kalibračních křivek a vypočítané limity detekce shrnuje tabulka 3. 15
Tab. 3: Specifický potenciál = E [V] píků ± standardní chyba průměru, limit detekce = LOD [mmol/l] a korelační koeficient = R kalibračních křivek pro jednotlivé standardní látky E [V]
LOD [mmol/l]
R
Kyselina askorbová
0,237 ± 0,060
0,09
0,9995
Trolox
0,618 ± 0,007
0,03
0,9953
N-acetylcystein
0,549 ± 0,110
0,07
0,9954
Melatonin
0,451 ± 0,022
0,04
0,9861
0,765 ± 0,019
4.2.3 Korelace voltametrické metody a FRAP Výsledky stanovení vzorků séra s přídavkem kyseliny askorbové SW voltametrií silně korelovaly s výsledky stanovení metodou FRAP (korelační koeficient r=0,9778), z čehož je možné usoudit, že je metoda pro kvantitativní analýzu antioxidantů v lidském séru vhodná. Oproti fotometrickým metodám s obdobnou výpovědní hodnotou o celkové hladině nízkomolekulárních antioxidantů je její výhodou především časová nenáročnost a jednoduchost provedení. Navíc umožňuje SW voltametrie alespoň částečné odlišení jednotlivých antioxidantů na základě specifického potenciálu.
4.3 In vitro sledování vlivu látek aktivních v cholinergním systému na zánětlivou reakci makrofágů 4.3.1 Vliv agonistů α7 nAChR na produkci IL-6 V žádném provedeném pokusu nedošlo ke zvýšení koncentrace IL-6 ve vzorcích vystavených pouze roztoku testované látky nebo inhibitoru bez přítomnosti LPS. Tabulka 4 shrnuje výsledky stanovení IL-6 ve vzorcích kultivačního média buněk aktivovaných LPS vystavených působení agonistů α7 nAChR. Signifikantní pokles (p<0,05) produkce IL-6 byl pozorován pouze u buněk raw 264.7 exponovaných cholinu v koncentraci 10-1 mol/l. MTT test ovšem ukázal, že cholin v této koncentraci způsobuje významný pokles viability buněk, což je pravděpodobná příčina snížení tvorby IL-6. U ostatních agonistů α7 nAChR nebyl pozorován výrazný vliv na zánětlivou reakci buněk, ačkoliv by aktivace tohoto receptoru měla hrát klíčovou úlohu v potlačení zánětu prostřednictvím ChPD[8].
16
Tab. 4: Vliv agonistů nikotinového receptoru, v přítomnosti nebo nepřítomnosti inhibitoru cholinesteras (ChE) na produkci interleukinu 6 (IL-6) makrofágy aktivovanými lipopolysacharidem, * statisticky signifikantní pokles p < 0,05. Agonista
Koncentrace
Inhibitor ChE
buňky
[mol/l]
Čas
Pokles IL-6
inkubace [h]
Acetylcholin
10-7 – 10-4
ne
j774.2
24
ne
Acetylcholin
10 – 10
huperzin
j774.2
24
ne
Acetylcholin
10-7 – 10-3
ethopropazin
j774.2
24
ne
Acetylcholin
10 – 10
-3
pyridostigmin
j774.2
3, 12, 24
ne
Nikotin
10 – 10
-5
ne
j774.2
3, 12, 24
ne
12, 24
ne
12, 24
ano*
-7
-6 -8
-3
raw 264.7 THP-1 Epibatidin
10 – 10 -5
-2
ne
j774.2 raw 264.7
Cholin
10-4 – 10-1
Ne
raw 264.7 THP-1
Pomocí Western blotu byla u všech použitých buněčných linií prokázána přítomnost α7 nAChR, absenci předpokládaného protizánětlivého efektu látek s agonistickým působením na tento receptor tudíž nelze vysvětlit jeho nedostatečnou expresí. Protizánětlivý efekt acetylcholinu nebyl pozorován ani po přidání inhibitorlů cholinesteras, negativní výsledky pokusů zaměřených na účinky acetylcholinu tudíž pravděpodobně nebyly způsobeny ani jeho rozkladem. Navíc i produkt rozkladu acetylcholinu cholin je schopný aktivovat α7 nAChR[31]. Vzhledem k tomu, že standardní protizánětlivě účinkující látka dexametazon způsobila u všech tří buněčných linií velmi výrazný statisticky významný pokles IL-6, reakce buněk vyvolaná bakteriálním LPS byla vratná. Navzdory řadě publikací popisujících pokles hladin prozánětlivých cytokinů po podání agonistů α7 nAChR cestou aktivace ChPD[23, 24, 32–35] není jejich vliv zcela jednoznačný. Thomsen a Mikkelsen popsali na kultuře mikroglií protizánětlivý účinek slabých agonistů α7 nAChR, a specifického antagonisty tohoto receptoru MLA. Naopak protizánětlivý efekt plných agonistů α7 nAChR[36]. Vyvstává tudíž otázka, zda k obvykle popisovanému protizánětlivému působení nikotinu a dalších agonistů dochází skutečně v důsledku aktivace α7 nAChR a ne třeba v důsledku jeho desensitizace nebo
17
zda k efektu potlačení zánětu v organizmu nedochází v součinnosti s dalšími mechanizmy.
4.3.2 Vliv klozapinu na produkci IL-6 Vliv antipsychotika klozapinu v koncentracích 0,40; 1,2 a 6,0 µg/ml na produkci IL-6 byl sledován na buňkách j774.2 exponovaných po dobu 24 h. Výsledkem byl výrazný statisticky významný (p < 0,001) pokles hladiny IL-6. Dosažené výsledky ukazují schopnost klozapinu potlačovat produkci IL-6 LPS stimulovanými makrofágy. Protože MTT test neprokázal snížení viability buněk vlivem klozapinu v použitých koncentracích, k poklesu produkce IL-6 pravděpodobně nedošlo v důsledku odumírání buněk. Jelikož účinky klozapinu bývají spojovány s nAChR[37, 38], bylo možné očekávat, že je pokles IL-6 zprostředkován interakcí s α7 nAChR. Při současném podání antagonisty toho receptoru MLA v koncentračním rozsahu 10-11 – 10-5 mol/l ovšem nedošlo k oslabení protizánětlivého efektu klozapinu. I při současném působení MLA byla produkce IL-6 výrazně nižší než u kontroly aktivované LPS a nelišila se od produkce buňkami vystavenými pouze LPS a klozapinu. Tyto výsledky znázorňuje obrázek 4. Protizánětlivý efekt klozapinu je pravděpodobně zprostředkován jiným, např. dopaminergním nebo serotoninovým, mechanizmem
Obr. 4: Produkce interleukinu 6 (IL-6) buňkami j774.2 aktivovanými lipopolysacharidem (LPS) vystavenými klozapinu (KLO) nebo klozapinu a metyllykakonitinu (MLA) po dobu 24 h. Koncentrace IL-6 (ng/ml) ± standardní chyba průměru, experimenty ve třech triplikátech, *p < 0,05, **p <0,001. Produkce IL-6 buňkami vystavenými pouze testovaným látkám bez aktivace LPS nebyla ovlivněna.
4.3.3 Vliv takrinu a galantaminu na produkci IL-6 Jak ukazuje obrázek 5, buňky j774.2 byly rovněž po dobu 24 h vystaveny působení takrinu a galantaminu, inhibitorů AChE používaných v terapii AD, 18
v koncentracích 10; 50; 250; 500 a 1250 ng/ml. V rozmezí koncentrací 10 – 500 ng/ml neměla tato léčiva na produkci IL-6 buňkami téměř žádný vliv. Po aplikaci takrinu o koncentraci 1 250 ng/ml došlo velmi výraznému snížení hladiny IL-6. Aplikace shodné dávky galantaminu vedla k oslabení tvorby IL-6 podstatně mírnějšímu, rozdíl oproti kontrolní skupině byl však stále vyhodnocen jako statisticky významný (p < 0,05). takrin galantamin
Obr. 5: Produkce interleukinu 6 (IL-6) buňkami j774.2 aktivovanými lipopolysacharidem (LPS) vystavenými takrinu (THA) nebo galantaminu (GAL) po dobu 24 h. Koncentrace IL-6 (ng/ml) ± standardní chyba průměru, experimenty ve třech triplikátech, *p < 0,05, **p <0,001. Produkce IL-6 buňkami vystavenými pouze testovaným látkám bez aktivace LPS nebyla ovlivněna.
Výsledky MTT testu neukázaly nižší viabilitu buněk vystavených takrinu a galantaminu ani v nejvyšších testovaných dávkách. Na použitém modelu byly tedy pozorovány protizánětlivé účinky takrinu a galantaminu v koncetraci 1 250 ng/ml. Tato koncentrace ovšem u obou léčiv více než desetinásobně přesahuje rozmezí, které se nalézá v plazmě léčených pacientů. Podle několika různých klinických studií se totiž maximální koncentrace takrinu v plazmě pohybují mezi 8,7 a 100 ng/ml s velkými interindividuálními rozdíly[39–41]. V plazmě pacientů s AD dlouhodobě léčených galantaminem byly nalezeny střední plazmatické koncentrace přibližně 63 ng/ml u mužů a 80 ng/ml u žen[42].
5 Závěr Výsledky předložené práce poukazují na vliv takrinu na oxidační homeostázu organizmu. Nebylo prokázáno výrazné oxidační poškození tkáně v důsledku aplikace takrinu, naopak zvýšení hladiny nízkomolekulárních antioxidantů v mozku by mohlo být považováno za žádoucí efekt. Takrin podávaný alternativní cestou obcházející první
19
průchod játry může být účinným léčivem s nižším výskytem nežádoucích účinků, než tomu bylo dosud. Tato možnost si zaslouží další výzkum. V
rámci
řešení
práce
byla
úspěšně
zavedena
metoda
stanovení
nízkomolekulárních antioxidantů v séru pomocí SW voltametrie na sítotiskových senzorech s uhlíkovou pracovní elektrodou. Postup byl optimalizován, ověřen na standardních antioxidantech, které se běžně vyskytují v organismu (kyselina askorbová, melatonin), i na jejich syntetických ekvivalentech, jako je trolox (ve vodě rozpustný ekvivalent vitaminu E). Pro jednotlivé standardy byly stanoveny limity detekce. Byla prokázána
dobrá
korelace
s
jinou
běžně
užívanou
metodou
stanovení
nízkomolekulárních antioxidantů (FRAP). Oproti této metodě je provedení SW voltametrie podstatně rychlejší a jednodušší. Dále byl zaveden in vitro model zánětlivé reakce na makrofágových buněčných liniích. Předpokládané protizánětlivé účinky agonistů α7 nAChR acetylcholinu, nikotinu, epibatidinu a cholinu se za daných experimentálních podmínek nepodařilo prokázat. Byl pozorován pokles tvorby prozánětlivého cytokinu IL-6 vlivem inhibitorů AChE takrinu a galantaminu, ovšem v koncentracích, které značně přesahují hladiny těchto léčiv dosažené v organizmu. Terapeutický význam tohoto efektu je tudíž diskutabilní. Na LPS aktivovaných makrofázích se podařilo prokázat protizánětlivý účinek antipsychotika klozapinu. Nebyla ovšem potvrzena role interakce s α7 nAChR v tomto procesu. Je pravděpodobné, že účinek je zprostředkován dalšími makrofágy exprimovanými receptory, např. dopaminovými nebo serotoninovými. V každém případě se jedná o efekt, který může pozitivně přispívat k terapeutické účinnosti klozapinu.
20
6 Souhrn Oxidační stres a zánět jsou dva z hlavních biochemických činitelů, které se podílí na patofyziologii neurodegenerativních poruch. Jejich vlivem na vznik, vývoj a terapii Alzheimerovy nemoci a také schizofrenie, která, ač se mezi neurodegenerativní onemocnění neřadí, s nimi má některé společné rysy, se podrobněji zabývá teoretická část předložené práce. Hlavním experimentálním cílem práce bylo identifikovat schopnost vybraných látek ovlivnit oxidační homeostázu organizmu a probíhající zánět a na základě získaných výsledků posoudit, zda se ovlivnění těchto procesů může podílet na jejich případné terapeutické účinnosti. V rámci řešení práce byla zavedena metoda stanovení nízkomolekulárních antioxidantů pomocí square wave voltametrie a in vitro model zánětlivé reakce. Na modelu laboratorních morčat byl sledován vliv podání takrinu na běžně sledované laboratorní markery oxidačního stresu (hladinu malondialdehydu, karbonylovaných proteinů, nízkomolekulárních antioxidantů a aktivitu enzymů glutationreduktasy, superoxiddismutasy a kaspasy 3) v orgánech. Pomocí stanovení hladiny prozánětlivého interleukinu 6 produkovaného makrofágovými buněčnými liniemi j774.2, raw 264.7 a THP-1 byly ověřovány potenciální imunomodulační účinky agonistů α7 nikotinového receptoru (acetylcholinu, nikotinu, epibatidinu a cholinu) a léčiv používaných v terapii Alzheimerovy nemoci a schizofrenie (takrinu, galantaminu a klozapinu). Výsledky poukazují na vliv takrinu na oxidační homeostázu organizmu. Nebylo ovšem prokázáno výrazné oxidační poškození tkáně, naopak zvýšení hladiny nízkomolekulárních antioxidantů v mozku by mohlo být považováno za žádoucí efekt. Je rovněž zvažován možný přínos alternativní cesty aplikace takrinu. Předpokládané protizánětlivé
účinky
agonistů
α7
nikotinového
receptoru
se
za
daných
experimentálních podmínek nepodařilo prokázat. Byl pozorován pokles tvorby interleukinu 6 vlivem takrinu a galantaminu, ovšem v koncentracích, které značně přesahují hladiny těchto léčiv dosahované v organizmu léčených pacientů. Naopak se na použitém buněčném modelu podařilo potvrdit protizánětlivé účinky antipsychotika klozapinu, tento efekt však pravděpodobně nebyl zprostředkován α7 nikotinovým receptorem. Získané poznatky rozšiřují dosavadní znalosti o vlivu léčiv používaných v terapii neurodegenerativních onemocnění a látek, o nichž se v této souvislosti uvažuje, na oxidační stres a zánět. 21
7 Summary The oxidative stress and inflammation are the two major biochemical factors implicated in the pathophysiology of the neurodegenerative diseases. The present study focuses on their impact on Alzheimer disease and schizophrenia. In spite of the fact that schizophrenia is not counted among the neurodegenerative diseases, it has several identical characteristics. The major goal was to identify the ability of selected compounds to act on the oxidative homeostasis and on the ongoing inflammation. The low molecular weight antioxidants assay using the square wave voltammetry and the in vitro cellular model of the inflammation were established in the relation with the study. The impact of tacrine on the oxidative stress markers (thiobarbituric acid reactive substances, carbonylated proteins, ferric reducing antioxidant power, caspase 3 activity, superoxide dismutase activity and glutathione reductase activity) was observed in the laboratory guinea pig model. The potential immunomodulating properties of the α7 nicotinic receptor agonists (acetylcholine, nicotine, epibatidine, choline) and drugs used in the Alzheimer disease therapy (tacrine, galantamine) and in the schizophrenia therapy (clozapine) were assessed by the determination of pro-inflammatory interleukin 6 produced by the macrophage cells j774.2, raw 264.7 and THP-1. The effect of tacrine on the oxidative stress markers was proved, however no serious oxidative damage of the tissue was found. Moreover, increased low molecular weight antioxidants in the central nervous system may be considered to be beneficial. Possible positive effect of the alternative way of drug administration was discussed. The assumed anti-inflammatory properties of α7 nicotinic receptor agonists were not proved in the macrophage cell model. The decline of the interleukin 6 due to the tacrine and galantamine treatment was found, but the concentration of the drugs required to deserve the effect was much higher than the common plasmatic levels are. On the other hand the anti-inflammatory ability of clozapine was confirmed nevertheless it is probably not mediated through α7 nicotinic receptor. Obtained findings extend current knowledge of the influence of the drugs used in the neurodegenerative diseases therapy and of related compounds on the oxidative stress and the inflammation.
22
8 Seznam autorských publikací vztahujících se k tématu dizertační práce Publikace v časopisech s IF: KRACMAROVA A., BANDOUCHOVA H., PIKULA J., POHANKA M. Tacrine is implicated in oxidative stress in the laboratory guinea pig model. Neuro Endocrinology Letters. 2012, roč. 33 Suppl 3, s. 136–144 KRAČMAROVÁ
A.,
POHANKA
M.
Elektrochemické
stanovení
nízkomolekulárních antioxidantů v séru. Chemické listy : =Chemical papers (Prague). 2014, roč. 108, č. 1, s. 64–69 KRACMAROVA A., POHANKA M. The impact of clozapine on regulation of inflammation in murine macrophage cells. Neuro Endocrinology Letters. 2014, roč. 35 Suppl 2, s. 175–179 Publikace v recenzovaných časopisech bez IF: KRAČMAROVÁ A., POHANKA M. Alzheimerova nemoc a oxidační stres. Psychiatrie : časopis pro moderní psychiatrii. 2012, roč. 16, č. 3, s. 145–149 KRAČMAROVÁ
A.,
DRTINOVÁ
L.,
POHANKA
M.
Possibility of
Acetylcholinesterase Overexpression in Alzheimer Disease Patients after Therapy with Acetylcholinesterase Inhibitors. Acta Medica (Hradec Králové) / Universitas Carolina, Facultas Medica Hradec Králové. 2015, roč. 58, č. 2, s. 37–42
23
9 Literatura [1] ZHU X., SMITH M. A., HONDA K., ALIEV G., MOREIRA P. I. et al. Vascular oxidative stress in Alzheimer disease. Journal of the neurological sciences. 2007, roč. 257, č. 1-2, s. 240–246 [2] POHANKA M., BANDOUCHOVA H., VLCKOVA K., ZDAROVA KARASOVA J., KUCA K. et al. Square wave voltammetry on screen printed electrodes: comparison to ferric reducing antioxidant power in plasma from model laboratory animal (Grey Partridge) and comparison to standard antioxidants. Journal of Applied Biomedicine. 2011, roč. 9, č. 2, s. 103–109 [3] Macrophage Biology Group [online]. [vid. 2016-03-23]. z: https://sites.google.com/site/macrophagebiologygroup/
Dostupné
[4] DOAN T., MELVOLD R., VISELLI S., VALTENBAUGH C. Immunology. B.m.: Lippincott Williams & Wilkins, 2012. ISBN 9781451109375. [5] ERIC THOMAS W. Brain macrophages: evaluation of microglia and their functions. Brain Research Reviews. 1992, roč. 17, č. 1, s. 61–74 [6] RACHMAWATI D., PEFEROEN L. A. N., VOGEL D. Y. S., ALSALEM I. W. A., AMOR S. et al. Metal ions potentiate microglia responsiveness to endotoxin. Journal of Neuroimmunology. 2016, roč. 291, s. 89–95 [7] PARK J-H., KIM J-N., JANG B-C., IM S-S., SONG D-K. et al. Glucosamine suppresses platelet-activating factor-induced activation of microglia through inhibition of store-operated calcium influx. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2016, roč. 42, s. 1–8 [8] TRACEY K. J. The inflammatory reflex. Nature. 2002, roč. 420, č. 6917, s. 853– 859 [9] XUE P., GUO J., YANG X., HUANG W., XIA Q. Changes of neuronal acetylcholine receptor alpha 7 of peritoneal macrophage in experimental acute pancreatitis treated by Chaiqin Chengqi Decoction. Chinese Journal of Integrative Medicine. 2014, roč. 20, č. 10, s. 770–775. [10] MAO P., REDDY P. H. Aging and amyloid beta-induced oxidative DNA damage and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: implications for early intervention and therapeutics. Biochimica Et Biophysica Acta. 2011, roč. 1812, č. 11, s. 1359–1370 [11] TALESA V. N. Acetylcholinesterase in Alzheimer’s disease. Mechanisms of Ageing and Development. 2001, roč. 122, č. 16, s. 1961–1969 [12] MAMELAK M. Alzheimer’ s disease, oxidative stress and gammahydroxybutyrate. Neurobiology of Aging. 2007, roč. 28, č. 9, s. 1340–1360 [13] FUSTER-MATANZO A., LLORENS-MARTÍN M., HERNÁNDEZ F., AVILA J. Role of neuroinflammation in adult neurogenesis and Alzheimer disease: therapeutic approaches. Mediators of Inflammation. 2013, roč. 2013, s. 260925. 24
[14] WEINER M. W., AISEN P. S., JACK C. R., JAGUST W. J., TROJANOWSKI J. Q. et al. The Alzheimer’s disease neuroimaging initiative: progress report and future plans. Alzheimer’s & Dementia: The Journal of the Alzheimer’s Association. 2010, roč. 6, č. 3, s. 202–211.e7 [15] Wiley: Schizophrenia: Current science and clinical practice - Wolfgang Gaebel [online]. [vid. 2016-03-22]. Dostupné z: http://eu.wiley.com/WileyCDA/WileyTitle/productCd-0470710543.html [16] CELIK, M., KALENDEROGLU A., SEVGI KARADAG A., BEKIR EGILMEZ O., HAN-ALMIS B. et al. Decreases in ganglion cell layer and inner plexiform layer volumes correlate better with disease severity in schizophrenia patients than retinal nerve fiber layer thickness: Findings from spectral optic coherence tomography. European Psychiatry: The Journal of the Association of European Psychiatrists. 2016, roč. 32, s. 9–15 [17] LALLY J., TULLY J., ROBERTSON D., STUBBS B., GAUGHRAN F. et al. Augmentation of clozapine with electroconvulsive therapy in treatment resistant schizophrenia: A systematic review and meta-analysis. Schizophrenia Research. 2016, roč. 171, č. 1-3, s. 215–224 [18] DZIEDZICKA-WASYLEWSKA M., FARON-GÓRECKA A., GÓRECKI A., KUŚEMIDER M. Mechanism of action of clozapine in the context of dopamine D1-D2 receptor hetero-dimerization - a working hypothesis. Pharmacological reports: PR. 2008, roč. 60, č. 5, s. 581–587 [19] RØGE R., MØLLER B. K., ANDERSEN C. R., CORRELL C. U., NIELSEN J. Immunomodulatory effects of clozapine and their clinical implications: What have we learned so far? Schizophrenia Research. 2012, roč. 140, č. 1–3, s. 204–213 [20] MARTIN L. F., KEM W. R., FREEDMAN R. Alpha-7 nicotinic receptor agonists: potential new candidates for the treatment of schizophrenia. Psychopharmacology. 2004, roč. 174, č. 1, s. 54–64 [21] HUBAUX A., VOS G. Decision and detection limits for calibration curves. Analytical Chemistry. 1970, roč. 42, č. 8, s. 849–855 [22] HOSEK J., ZÁVALOVÁ V., SMEJKAL K., BARTOS M. Effect of diplacone on LPS-induced inflammatory gene expression in macrophages. Folia Biologica. 2010, roč. 56, č. 3, s. 124–130 [23] WALDBURGER J-M., BOYLE D. L., PAVLOV V. A., TRACEY K. J., FIRESTEIN G. S. Acetylcholine Regulation of Synoviocyte Cytokine Expression by the α7 Nicotinic Receptor. Arthritis and rheumatism. 2008, roč. 58, č. 11, s. 3439–3449 [24] LI J., MATHIEU S. L., HARRIS R., JI J., ANDERSON D. J. et al. Role of α7 nicotinic acetylcholine receptors in regulating tumor necrosis factor-α (TNF-α) as revealed by subtype selective agonists. Journal of Neuroimmunology. 2011, roč. 239, č. 1-2, s. 37–43
25
[25] REDONDO D., ARIAS E., ORIA R. VENTURINI M. E. Thinned stone fruits are a source of polyphenols and antioxidant compounds. Journal of the Science of Food and Agriculture [online]. 2016. Dostupné z: doi:10.1002/jsfa.7813 [26] SCHWERTZ C. I., GABRIEL M. E., HENKER L. C., BOTTARI N. B., do CARMO G. Et al. Oxidative stress associated with pathological changes in the pancreas of cattle naturally infected by Eurytrema coelomaticum. Veterinary Parasitology. 2016, roč. 223, s. 102–110 [27] TWEEDIE D., FUKUI K., LI Y., YU Q-S., BARAK S. et al. Cognitive Impairments Induced by Concussive Mild Traumatic Brain Injury in Mouse Are Ameliorated by Treatment with Phenserine via Multiple Non-Cholinergic and Cholinergic Mechanisms. PloS One. 2016, roč. 11, č. 6, s. e0156493 [28] COLOMBO G., CLERICI M., GARAVAGLIA M. E., GIUSTARINI D., ROSSI R. et al. A step-by-step protocol for assaying protein carbonylation in biological samples. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 2016, roč. 1019, s. 178–190 [29] SCHROETER H., SPENCER J. P., RICE-EVANS C., WILLIAMS R. J. Flavonoids protect neurons from oxidized low-density-lipoprotein-induced apoptosis involving c-Jun N-terminal kinase (JNK), c-Jun and caspase-3. Biochemical Journal. 2001, roč. 358, č. Pt 3, s. 547–557 [30] RABE H. [Reference ranges for biochemical parameters in guinea pigs for the Vettest®8008 blood analyzer]. Tierärztliche Praxis. Ausgabe K, Kleintiere/Heimtiere. 2011, roč. 39, č. 3, s. 170–175 [31] PAPKE R. L., BENCHERIF M., LIPPIELLO P. An evaluation of neuronal nicotinic acetylcholine receptor activation by quaternary nitrogen compounds indicates that choline is selective for the α7 subtype. Neuroscience Letters. 1996, roč. 213, č. 3, s. 201–204 [32] SHYTLE R. D., MORI T., TOWNSEND K., VENDRAME M., SUN N. et al. Cholinergic modulation of microglial activation by alpha 7 nicotinic receptors. Journal of Neurochemistry. 2004, roč. 89, č. 2, s. 337–343 [33] TERRANDO N., YANG T., RYU J. K., NEWTON P. T., MONACO C. et al. Stimulation of the α7 nicotinic acetylcholine receptor protects against neuroinflammation after tibia fracture and endotoxemia in mice. Molecular Medicine (Cambridge, Mass.). 2014, roč. 20, s. 667–675 [34] KIM T-H., KIM S-J., LEE S-M. Stimulation of the α7 nicotinic acetylcholine receptor protects against sepsis by inhibiting Toll-like receptor via phosphoinositide 3-kinase activation. The Journal of Infectious Diseases. 2014, roč. 209, č. 10, s. 1668–1677 [35] INOUE T., ABE C., SUNG S-S. J., MOSCALU S., JANKOWSKI J. et al. Vagus nerve stimulation mediates protection from kidney ischemia-reperfusion injury through α7nAChR+ splenocytes. The Journal of Clinical Investigation. 2016, roč. 126, č. 5, s. 1939–1952 26
[36] THOMSEN M. S., MIKKELSEN J. D. The α7 nicotinic acetylcholine receptor ligands methyllycaconitine, NS6740 and GTS-21 reduce lipopolysaccharideinduced TNF-α release from microglia. Journal of Neuroimmunology. 2012, roč. 251, č. 1-2, s. 65–72 [37] SIMOSKY J. K., STEVENS K. E., ADLER L. E., FREEDMAN R. Clozapine improves deficient inhibitory auditory processing in DBA/2 mice, via a nicotinic cholinergic mechanism. Psychopharmacology. 2003, roč. 165, č. 4, s. 386–396 [38] STEVENS K. E., ZHENG L., ABRAMS D. J.. Intermittent versus continuous central administration of clozapine in DBA/2 mice, improvement in sensory inhibition deficits. Schizophrenia Research. 2013, roč. 149, č. 1-3, s. 121–126 [39] JOHANSSON M., HELLSTRÖM-LINDAHL E., NORDBERG A. Steady-state pharmacokinetics of tacrine in long-term treatment of Alzheimer patients. Dementia (Basel, Switzerland). 1996, roč. 7, č. 2, s. 111–117 [40] HARTVIG P., ASKMARK H., QUILONIUS S. M., WIKLUND L. LINDSTRÖM B. Clinical pharmacokinetics of intravenous and oral 9-amino-1,2,3,4tetrahydroacridine, tacrine. European Journal of Clinical Pharmacology. 1990, roč. 38, č. 3, s. 259–263 [41] MORIEARTY P. L., KENNY W., KUMAR V. Estimation of plasma tacrine concentrations using an in vitro cholinesterase inhibition assay. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 1989, roč. 3, č. 3, s. 143–147 [42] WATTMO C., JEDENIUS E., BLENNOW K., WALLIN Å. K. Dose and plasma concentration of galantamine in Alzheimer’s disease - clinical application. Alzheimer’s Research & Therapy. 2013, roč. 5, č. 1, s. 2
27
