UNIVERZITA OBRANY BRNO FAKULTA VOJENSKÉHO ZDRAVOTNICTVÍ HRADEC KRÁLOVÉ
AUTOREFERÁT DIZERTAČNÍ PRÁCE
Strukturní a funkční analýza faktorů virulence mikroba Francisella tularensis
Mgr. Iva Šenitková
Infekční biologie
Hradec Králové 2016
Obsah 1
Úvod .................................................................................................................................... 3
2
Cíle dizertační práce............................................................................................................ 6
3
Výsledky a diskuze ............................................................................................................. 7 3.1
Detekce zkráceného proteinu FTS_1067/ΔDSBA-like v celobuněčném lyzátu ......... 7
3.2
In vivo a in vitro charakterizace mutantního kmene FSC200/ΔDSBA-like................ 7
3.3
Funkční testy provedené s rekombinantním proteinem rFTS1067/ΔDSBA-like ...... 12
3.4
Ověřování potenciálních vazebných partnerů proteinu FTS_1067 metodou
bakteriálního dvouhybridového systému ............................................................................. 16 4
Shrnutí ............................................................................................................................... 18
5
Summary ........................................................................................................................... 20
6
Seznam literatury .............................................................................................................. 22
7
Publikační činnost ............................................................................................................. 28
2
1 Úvod Francisella tularensis (F. tularensis) je gram-negativní, fakultativně intracelulární patogen, který je schopen růstu uvnitř hostitelských buněk. Tato vysoce infekční bakterie, která byla poprvé izolována v roce 1911 v Kalifornii, je původcem onemocnění nazývaného tularémie (1). V současné době jsou rozlišovány tři poddruhy F. tularensis: subsp. tularensis, subsp. holarctica a subsp. mediasiatica (2). Tyto tři poddruhy se liší nejen místem svého výskytu, ale také klinickým významem. Klinicky nejvýznamnější je především subsp. tularensis (označován jako typ A) a subsp. holarctica (typ B). Typ A je vysoce virulentní a jsou známy fatální případy onemocnění (3). Typ B je méně virulentní a jen výjimečně způsobuje letální onemocnění u lidí, nicméně onemocnění má vleklý průběh (4). Člověk se může F. tularensis infikovat několika způsoby. Z důvodů snadného šíření, především formou aerosolu, extrémní virulence a nízké infekční dávky byla F. tularensis subsp. tularensis klasifikována pracovištěm The U.S. Centers for Disease Control and Prevention jako biologické agens typu A vojensky a teroristicky zneužitelné (5). Proto hlavně v několika posledních letech vzrostl zájem o dokonalé pochopení životního cyklu bakterie, interakce s hostitelem a jejích virulenčních faktorů a to za účelem vyvinutí účinné prevence. Pro profylaxi tularémie není dostupná žádná vakcína, která by měla licenci pro humánní použití a většina běžně používaných a doporučovaných antibiotik má pouze bakteriostatický účinek nebo si vůči nim F. tularensis vytváří rezistenci a nejsou pro léčbu doporučovány (6– 11). I když stále nejsou do detailů známé všechny molekulární mechanizmy virulence F. tularensis, byly již identifikovány geny nezbytné pro přežívání v hostiteli nebo pro schopnost vyvolat onemocnění. Patří mezi ně např. geny lokalizované v tzv. ostrovu patogenity (FPI – Francisella pathogenicity island) (12–20), geny kódující regulační proteiny (21–26),
geny
nezbytné
pro
tvorbu
polysacharidového
pouzdra
(27–29)
nebo
lipopolysacharidů vnější membrány (30–33) a jiné. Mezi další klíčové struktury spojené s virulencí F. tularensis patří lipoproteiny. Hrají významnou roli při adhezi na hostitelskou buňku, vstupu do hostitelské buňky a následném přežívání uvnitř a ovlivňují také zánětlivou reakci, která infekci doprovází (34). Široké zapojení lipoproteinů do procesu interakce patogenu s hostitelem z nich dělá klíčové faktory, jejichž identifikace je nezbytná pro správné pochopení všech těchto procesů a pro vývoj vakcín. Mezi nedávno potvrzené lipoproteiny patří také produkt kódovaný lokusem FTS_1067 (označení pro kmen FSC200, pro F. tularensis subsp. tularensis kmen Schu S4 je označení FTT1103). Tento lokus není součástí FPI. Lipoprotein FTS_1067 je vysoce konzervovaný 3
napříč všemi poddruhy a kmeny F. tularensis (35). Svojí strukturou se jedná o unikátní lipoprotein, který kromě signální sekvence a lipoboxu obsahuje také dvě funkční domény. N- koncová doména se nalézá u skupiny proteinů nazývaných Mips (macrophage infectivity potentiator). Tyto homodimerní proteiny s peptidyl-prolyl cis/trans izomerázovou aktivitou (PPIase) obsahují konzervovanou doménu FKBP_N (Forskolin-binding protein_N). Mip protein byl poprvé označen jako virulenční faktor u Legionella pneumophila (36,37) a další Mip proteiny spojované s virulencí byly nalezeny např. u Coxiella burneti (38), Neisseria gonorrhoeae (39), Salmonella typhimurium (40), Burkholderia pseudomallei (41) a některých druhů Chlamydie (42,43). Také u E. coli je znám homologní protein k Mip proteinům. Jedná se o periplazmatický protein FkpA. U tohoto proteinu je kromě izomerázové aktivity známá také jeho funkce jako chaperonového proteinu (44,45). C-terminální doména obsahuje motiv -CXXC- charakteristický pro skupinu Dsb proteinů. Proteiny této rodiny katalyzují tvorbu disulfidických vazeb a u gram-negativních bakterií se nacházejí především v oblasti periplazmy (46). Vysoce konzervované katalytické místo -CXXC- přisuzuje proteinům Dsb rodiny roli v oxidaci, redukci a izomerizaci disulfidických vazeb (47). Mezi proteiny s tímto katalytickým místem patří především sekreční a membránové proteiny a některé z nich jsou známými virulenčními faktory u gramnegativních patogenů, jako je Bordetella pertusis (48), Neisseria meningitidis (49,50), Pseudomonas aeruginosa (51), Proteus mirabilis (52), Salmonella enterica (53), Shigella flexneri (54) a Yersinia pestis (55,56). Protein FTS_1067 s největší pravděpodobností není virulenčním faktorem v pravém slova smyslu, ale těmi jsou proteiny ovlivňované jeho oxidoreduktázovou (57– 59)/izomerázovou
(57,60,61)
V předchozí
aktivitou.
studii
využívající
metody
imunoprecipitace a následné analýzy pomocí LC-MALDI (62) byly vytipováni potenciální vazební partneři. Prvním byl protein D-alanyl-D-alanin karboxypeptidáza patřící do rodiny „penicilín vázajících proteinů“ s označením FTS_1034, jehož funkcí je pravděpodobně katalýza finální transpeptidázové reakce během syntézy bakteriální stěny. Jeho homologní protein u Brucella abortus je známým virulenčním faktorem (63). Protein FTS_1034 má ve své sekvenci aminokyselin tři cysteiny a jeden z nich se zdá být zapojený do tvorby disulfidických vazeb mezi dvěma polypeptidovými řetězci (64–66). Druhým potenciálním vazebným partnerem byl označen protein FTS_1036 z rodiny sekrečních proteinů HlyD. Proteiny této rodiny jsou lokalizovány v membráně a hrají roli v exportu látek přes membránu (67) a také jejich aminokyselinová sekvence obsahuje čtyři cysteiny, takže by mohly být substráty pro protein FTS_1067. 4
Dizertační práce se zabývá studiem proteinu FTS_1067 a to zejména rolí jeho funkčních domén ve virulenci F. tularensis. Pro tyto účely byl vytvořen mutantní kmen F. tularensis subsp. holarctica FSC200/ΔDSBA-like s delecí DSBA-like domény a rovněž rekombinantní protein rFTS1067/ΔDSBA-like, ve kterém zůstala zachována pouze FKBP_Nlike doména. V poslední části práce jsou pomocí bakteriálních dvouhybridových systémů ověřovány pravděpodobné interakce proteinu FTS_1067.
5
2 Cíle dizertační práce
V dizertační práci byly stanoveny tyto cíle:
1.
Příprava mutantního kmene FSC200/ΔDSBA-like s delecí DSBA-like domény proteinu
FTS_1067
metodou
komplementace
in
trans
kmene
FSC200/ΔFTS_1067.
2.
In vivo a in vitro charakterizace mutantního kmene FSC200/ΔDSBA-like.
3.
Příprava a purifikace rekombinantního proteinu rFTS_1067/ ΔDSBA-like.
4.
Funkční studie s rekombinantním proteinem
5.
Ověření potenciálních vazebných partnerů proteinu FTS_1067 metodami bakteriálního dvouhybridového systému.
6
3 3.1
Výsledky a diskuze Detekce zkráceného proteinu FTS_1067/ΔDSBA-like v celobuněčném lyzátu Pro ověření exprese zkráceného proteinu v mutantním kmeni FSC200/ΔDSBA-like.
bylo použito metody LC-MS/MS a pro zjištění úrovně jeho exprese metody imunodetekce. Tato metoda ukázala, že úroveň exprese zkráceného proteinu nedosahovala úrovně proteinu FTS_1067, ale byla zhruba shodná s úrovní exprese proteinu FTS_1067 tvořeného trans komplementovaným kmenem cFSC200 (Obr. 1). Protože kmen cFSC200 vykazuje při testech virulence in vivo a in vitro stejný fenotyp jako mateřský kmen FSC200 (59,60), věříme, že rozdíly v testování mutantního kmene FSC200/ΔDSBA-like a mateřského kmene FSC200 nejsou důsledkem nižší exprese zkráceného proteinu.
Obr. 1: Ověření úrovně exprese proteinu FTS_1067/ΔDSBA-like v celobuněčném lyzátu. Celobuněčné lyzáty připravené z kmene FSC200/ ΔDSBA-like (1), cFSC200 (2) a FSC200 (3) byly separovány na SDS-PAGE a následně přeneseny pomocí „semi-dry“ western blotu na PVDF membránu, kde proběhla vizualizace protilátkou proti FTT1103.
3.2 In
vivo
a
in
vitro
charakterizace
mutantního
kmene
FSC200/ΔDSBA-like Pro prokázání role DSBA-like, ale i FKBP_N-like domény ve schopnosti F. tularensis způsobit onemocnění byl použit stejný model infekce jako v dříve publikovaných studiích (58,68). Skupinám BALB/c myší byly subkutánně podány dávky mutantního kmene FSC200/ΔDSBA-like, a mateřského kmene FSC200 a příznaky onemocnění nebo případný 7
úhyn se sledoval následujících 21 dní. Z výsledků vyplývá, že delece sekvence korespondující s DSBA-like doménou vede k oslabení virulence v myším modelu infekce a ukazuje tak na významnou roli této domény v rámci virulence F. tularensis (data neuvedena). Následné testování bylo zaměřeno na zjištění případného protektivního účinku mutantního kmene proti infekci způsobené kmenem mateřským. Přeživší myši byly opět s.c. infikovány kmenem FSC200 o koncentraci 102 CFU/myš a sledovány pro příznaky onemocnění nebo úhyn dalších 21 dní. Výsledky, které jsou znázorněny na Obr. 2, ukazují dávkově závislé navození protekce proti infekci mateřským kmenem. Podobné výsledky byly získány i při studiích prováděných s kmenem s delecí FKBP_N-like domény (59). Také tento kmen s částečnou delecí vykazuje pouze dávkově závislou protekci při použití nižších očkovacích dávek a liší se tak od kmene s delecí celého genu fts_1067, který chrání proti infekci již od nízkých dávek (58). Ponechání pouze jedné domény tedy snižuje virulenci kmene ve srovnání s kmenem mateřským, ale také snižuje jeho imunostimulační potenciál ve srovnání s kmenem s delecí obou domén.
Obr. 2: Sledování protektivního účinku kmene FSC200/ΔDSBA-like. Skupinám pěti myší BALB/c byla s.c. podána dávka kmene FSC200/ΔDSBA-like v dávkách 102 (černé čtverce), 103 (černé trojúhelníky), 104 (šedé čtverce), 105 (bílé trojúhelníky) a 106 (bílé čtverce) CFU/myš a po 21 dnech byly myši znovu infikovány mateřským kmenem FSC200 (s.c., 3 x 102 CFU/myš).
Rovněž jsme sledovali osud živých bakterií uvnitř hostitelského organizmu a zjistili jsme, že maxima replikace ve všech sledovaných orgánech (plíce, játra, slezina) bylo dosaženo třetího dne po infekci a poté počet bakterií potupně klesal až úplné eliminaci (data neuvedena). K úplnému odstranění kmene FSC200/ΔDSBA-like z plic došlo sedmý den po infekci, z jater čtrnáctý den a ze sleziny dvacátý první den. Oproti kmeni FSC200/ΔFTS_1067 8
byl kmen s částečnou delecí odstraněn ze sledovaných orgánů rychleji, což naznačuje sníženou schopnost mutantního kmene odolávat hostitelské imunitní odpovědi. Podobných výsledků bylo dosaženo i s kmenem s delecí domény FKBP_N-like s tím rozdílem, že tento kmen perzistoval ve slezině po celou dobu experimentu. Analýza fenotypu mutantního kmene FSC200/ΔDSBA-like pokračovala na in vitro úrovni sledováním schopnosti vstoupit a replikovat se uvnitř primárních kostně-dřeňových makrofágů. Z výsledků vyplývá, že mezi mutantním kmenem a kmenem mateřským FSC200 není rozdíl ve schopnosti vstoupit do makrofágů, ale je významný rozdíl v jejich schopnosti replikace uvnitř buněk. Podobný výsledek byl získán i při testech s kmenem s delecí FKBP_N-like domény. Nicméně oba kmeny s částečnou delecí měly signifikantně lepší schopnost replikace než kmen s delecí celého genu pro protein FTS_1067 (Obr. 3). Pro zachování efektivní replikace uvnitř hostitelské buňky je tedy zapotřebí obou domén a žádná z domén se v tomto směru nejeví jako významnější.
Obr. 3 Intracelulární růst bakterií kmene FSC200 a mutantních kmenů. Buňky primárních kostně dřeňových makrofágů byly infikovány mateřským kmenem FSC200 (body), cFSC200 (velké trojúhelníky), FSC200/ΔFTS_1067 (malé trojúhelníky), FSC200/∆DSBA-like (malé čtverce) a FSC200/∆FKBP_N-like (velké čtverce). Počet intracelulárně žijících bakterií byl určen výpočtem CFU. Výsledky reprezentují průměr ± standardní odchylku tří nezávislých experimentů, každý prováděný jako triplikát. Statistická významnost byla vyhodnocována s použitím one-way ANOVA následované Bonferroniho testem mnohačetného porovnávání; *, P ˂ 0.05; **, P ˂ 0.01; *** , P ˂ 0.001; ****, P ˂ 0.0001 (porovnání FSC200/ΔFTS_1067, FSC200/∆DSBA-like, FSC200/∆FKBP_Nlike s FSC200); #, P ˂ 0.05; ##, P ˂ 0.01; ###, P ˂ 0.001; ####, P<0.0001 (porovnání FSC200/∆DSBA-like, FSC200/∆FKBP_N-like s FSC200/ΔFTS_1067).
9
Při dalších testech byl mutantní kmen FSC200/ΔDSBA-like sledován při růstu a přežívání za různých stresových podmínek imitujících prostředí hostitelské buňky zasažené infekcí. Výsledky byly porovnávány s kmenem mateřským a kmenem s delecí FKBP_N-like domény a celého genu fts_1067. Největší rozdíly byly pozorovány při vystavení kultur oxidativnímu stresu vyvolaného peroxidem vodíku. Kmen FSC200/ΔDSBA-like se ukázal být mnohem citlivější k účinkům oxidativního stresu než kmen mateřský FSC200. Znatelný defekt v přežívání byl zaznamenán ve všech sledovaných intervalech, kdy statisticky významné byly intervaly 30 min a 40 min po přidání H2O2. Pokus byl následně proveden také s kmeny FSC200/ΔFTS_1067 (58) a FSC200/ΔFKBP_N-like (59) a bylo prokázáno, že i tyto deleční kmeny jsou vůči H2O2 citlivější (Obr. 4A). Další experiment zaměřený na působení oxidativního stresu využil jako oxidativní činidlo měďnaté ionty. Kultivace všech testovaných kmenů probíhala v přítomnosti CuCl2 po dobu 24 hodin a poté byl statisticky vyhodnocen rozdíl dosažených hodnot OD600. I tento test potvrdil výrazně zvýšenou citlivost všech tří typů delečních mutantních kmenů k působení oxidačních činidel ve srovnání s kmenem mateřským (Obr. 4B) a ukázal na důležitost obou domén proteinu FTS_1067 v adaptaci na oxidativní stres. Zároveň ukázal, že protein FTS_1067 není jen oxidoreduktáza, ale že se pravděpodobně jedná i o disulfid izomerázu. Tyto výsledky jsou podpořeny faktem, že pokud dojde u E. coli ke ztrátě genu kódujícího periplazmatický protein DsbC s disulfid izomerázovou aktivitou, dochází ke zvýšené citlivosti k účinkům chloridu měďnatého, zatímco delece genu kódujícího protein DsbA (disulfid oxidoreduktáza) k této zvýšené citlivosti nevede (69). Z těchto výsledků lze usuzovat, že ztráta izomerázové aktivity může vést k defektu přežívání bakterie vlivem neschopnosti opravovat nesprávně vytvořené disulfidické vazby a takto nesprávně sbalené proteiny se pak mohou hromadit v oblasti periplazmy (58).
10
Obr. 4: Sledování růstu a přežívání mateřského kmene a kmenů mutantních za stresových podmínek. (A) Přežívání bakteriálních kmenů po přidání 0,03 % peroxidu vodíku. Alikvoty bakteriálních kultur byly naředěny a vysety na McLeod agar obohacený o hovězí haemoglobin a IsoVitalex. Počet žijících bakterií byl spočítán po 72 hodinách inkubace při 37 °C. (B) Úroveň růstu bakteriálních kmenů v kompletním Chamberlainově médiu obohaceném o chlorid měďnatý ve finální koncentraci 20 µM po 24 hodinové inkubaci při 37 °C. Každý experiment byl třikrát opakován a data reprezentují průměr ± směrodatnou odchylku všech experimentů. FSC200 (body), cFSC200 (velké trojúhelníky), FSC200/∆FTS_1067
(malé
trojúhelníky),
FSC200/∆DSBA-like
(malé
čtverce),
FSC200/∆FKBP_Nlike (velké čtverce). Statistická významnost byla vyhodnocována s použitím oneway ANOVA následované Bonferroniho testem mnohačetného porovnávání; *, P ˂ 0.05; **, P ˂ 0.01; ***, P ˂ 0.001; ****, P ˂ 0.0001 (srovnání FSC200/ΔFTS_1067, FSC200/∆DSBA-like a FSC200/∆FKBP_N-like s FSC200).
11
3.3 Funkční
testy
provedené
s
rekombinantním
proteinem
rFTS1067/ΔDSBA-like Pro testy zaměřené na studium katalytických aktivit funkčních domén proteinu FTS_1067 byl připraven rekombinantní protein s delecí DSBA-like domény. Pro každou analýzu byl připravován nový rekombinantní protein a jeho koncentrace a čistota se ověřovala pomocí technik SDS_PAGE a měření koncentrace proteinů. První test ověřoval schopnost rekombinantního proteinu působit jako disulfid oxidoreduktáza. Tento test byl založen na měření schopnosti rekombinantního proteinu redukovat disulfidické můstky lidského inzulínu v přítomnosti dithiothreitolu. Redukce řetězce se projeví vysrážením z roztoku a vznikem precipitátu (70). Protože rekombinantní protein
rFTS_1067/ΔDSBA-like
neobsahuje
motiv
-CXXC-
spojovaný
s disulfid
oxidoreduktázovou aktivitou (71), očekávalo se, že tento zkrácený protein nebude aktivitu vykazovat. Výsledky funkčního testu tento předpoklad potvrdily (data neuvedena). Z dřívějších výsledků víme, že rekombinantní protein s delecí domény FKBP_N-like také nevykazuje disulfid oxidoreduktázovou aktivitu (59) a že tuto aktivitu má zachovanou pouze protein FTS_1067 obsahující obě funkční domény. Díky zvýšené citlivosti kmene s delecí DSBA-like domény k působení oxidativního stresu byl rekombinantní protein FTS_1067 také testován pro ověření jeho role jako disulfid izomerázy. K ověření bylo použito dvou různých systémů a do testů byly zahrnuty rFTS_1067 a rFTS_1067/ΔFKBP_N-like (Obr. 5 A, B). První in vitro metoda vychází z práce Hiniker et al. (69). Hovězí pankreatická RNáza A se oxiduje pomocí H2O2 a CuCl2 a v důsledku toho dojde k přeskupení jejích disulfidických vazeb a ztrátě aktivity. Pokud je oxidovaný protein pod vlivem proteinu s disulfid izomerázovou aktivitou, dochází k “opravě” chybně vytvořených disulfidických vazeb a u oxidovaného proteinu se sleduje obnovení aktivity. Druhá in vitro metoda využívala k inaktivaci RNázy A zvýšenou teplotu. Protein změní vlivem teplotního šoku svoji konformaci, což vede ke ztrátě aktivity, nicméně disulfidické vazby zůstávají zachovány. Když je protein následně ochlazen, dojde opět k vytvoření správné konformace a obnovení aktivity. V případě, že je tento protein po svém zahřátí vystaven účinkům disulfid izomerázy, dochází k nevratné ztrátě aktivity, protože disulfid izomeráza ve snaze “opravit” změněnou konformaci přeskupí disulfidické můstky. Takto ovlivněný protein po ochlazení zůstává nadále neaktivní. Získané výsledky potvrdily disulfid izomerázovou aktivitu proteinu FTS_1067 a ukázaly, že pro tuto funkci je nutná přítomnost obou domén. 12
A)
B) Obr. 5: Sledování izomerázové aktivity. (A) Měření schopnosti redukovaného rekombinantního proteinu opravit chybně vytvořené disulfidické vazby a navrátit tak aktivitu RNáze A oxidované mědí/peroxidem vodíku. Aktivita nativní RNázy A byla stanovena jako 100 % aktivity (1), aktivita oxidované RNázy A (2), aktivita oxidované RNázy A s redukovaným rFTS_1067 (3), aktivita oxidované RNázy A s redukovaným rFTS_1067/ΔDSBA-like (4), aktivita oxidované RNázy A s redukovaným rFTS_1067/ΔFKBP_N-like (5) a aktivita oxidované RNázy A s redukovaným PDI (6). (B) Měření aktivity RNázy A po teplotní inaktivaci a následném ochlazení. Aktivita teplotně inaktivované RNázy A bez rekombinatního proteinu byla stanovena jako 100 % (a), aktivita RNázy A po inkubaci při 65 °C společně s redukovaným rFTS_1067 (b), redukovaným rFTS_1067/ΔDSBA-like (c) a redukovaným rFTS_1067/ΔFKBP_N-like (d). Statistická významnost byla vyhodnocována s použitím one-way ANOVA následované Bonferroniho testem mnohačetného porovnávání; *, P ˂ 0.05; **, P ˂ 0.01; *** , P ˂ 0.001 (srovnání aktivity oxidované RNázy A s aktivitou oxidované RNázy A inkubované společně s redukovaným rFTS_1067); #, P ˂ 0.05; ##, P ˂ 0.01; ###, P ˂ 0.001
13
(srovnání aktivity RNázy A po inkubaci při 65 °C společně s redukovaným rFTS_1067 s aktivitou RNázy A po inkubaci při 65 °C společně s redukovaným rFTS_1067/ΔDSBA-like nebo redukovaným rFTS_1067/ΔFKBP_N-like).
Další funkční test měl za úkol prokázat, jaký vliv mají funkční domény na chaperonovou aktivitu proteinu FTS_1067 (59). V práci Schmidt et al. (59) byla přisouzena chaperonová funkce doméně DSBA-like aniž byla určena aktivita proteinu s delecí této domény. V našich podmínkách byla pro zjištění chaperonové aktivity použita nepřímá analýza založená na sledování aktivity teplotně inaktivované citrát syntázy (72) a byl použit komerční kit Citrate Synthase Assay Kit (Sigma-Aldrich). Při této analýze je citrát syntáza inaktivována teplotou 43 °C a do 15 minut dochází ke ztrátě aktivity a tvorbě agregátů, což je sledováno spektrofotometrickým měřením aktivity citrát syntázy (žluté zbarvení roztoku v případě aktivní citrát syntázy). V přítomnosti proteinu s chaperonovou funkcí dochází k tzv. termoprotektivnímu účinku a ke zpomalení agregace citrát syntázy. Z výsledků měření vyplývá, že rekombinantní protein s delecí domény DSBA-like (rFTS_1067/ΔDSBA-like) vykazuje in vitro podobnou chaperonovou aktivitu, jako nezkrácená forma rekombinantního proteinu FTS_1067, a tedy že FKBP_N-like doména je zodpovědná za chaperonovou aktivitu proteinu FTS_1067 (Obr. 6).
14
Obr. 6: Sledování aktivity teplotně inaktivované citrát syntázy. Aktivita nativní CS byla změřena a stanovena jako 100 %. Poté byla CS inkubována společně s 0,6 µM rFTS_1067/∆DSBAlike (černé kosočtverce) nebo s 0,6 µM rFTS_1067/∆FKBP_N-like (černé body) nebo s 0,6 µM rFTS_1067 (černé trojúhelníky) při 43 °C po dobu 16 minut a v určené intervaly byly odebírány alikvoty a měřena zbylá aktivita CS. Aktivita teplotně inaktivované CS bez rekombinantních proteinů byla měřena jako negativní kontrola (černé čtverce). Statistická významnost byla vyhodnocována s použitím one-way ANOVA následované Bonferroniho testem mnohačetného porovnávání; *, P ˂ 0.05; **, P ˂ 0.01; ***, P ˂ 0.001 (srovnání aktivity teplotně inaktivované CS s aktivitou CS inkubované společně s 0,6 µM rFTS_1067/∆DSBA-like); +, P ˂ 0.05; ++, P ˂ 0.01; +++, P ˂ 0.001 (srovnání
teplotně
inaktivované
CS
s
aktivitou
CS
inkubované
společně
s
0,6
µM
rFTS_1067/∆FKBP_N-like); #, P ˂ 0.05; ##, P ˂ 0.01; ###, P ˂ 0.001 (srovnání aktivity teplotně inaktivované CS s aktivitou CS inkubované společně s 0,6 µM rFTS_1067).
Poslední analýza prováděná s rekombinantním proteinem rFTS_1067/ΔDSBA-like byla zaměřena na studium potenciální oligomerizační funkce domény FKBP_N-like. Pro tyto účely byl rekombinantní protein dělen pomocí BN-PAGE a po separaci přenesen na PVDF membránu metodou Western blotu a vizualizován pomocí anti_His a anti-myc protilátek. Pro zjištění molekulové hmotnosti rFTS_1067/ΔDSBA-like v nativních podmínkách byla použita jeho relativní pohyblivost v gelu (73). Použitím tohoto přístupu byla vypočítána molekulová hmotnost proteinu s delecí DSBA-like domény za neredukujících podmínek na 56 kDa (teoretická molekulová hmotnost rFTS_1067/ΔDSBA-like je 17 kDa, na SDS-PAGE se protein pohybuje v oblasti pod 20 kDa). Lze tedy usuzovat, že rekombinantní protein rFTS_1067/ΔDSBA-like se vyskytuje v neredukujícím prostředí jako oligomer, konkrétně 15
jako trimer (data neuvedena).
3.4 Ověřování potenciálních vazebných partnerů proteinu FTS_1067 metodou bakteriálního dvouhybridového systému Na základě hypotézy, že samotný protein FTS_1067 není přímým virulenčním faktorem, ale že tak působí jeho vazební partneři, byla další část studií zaměřena na identifikaci substrátů proteinu FTS_1067. Při studiu se vycházelo z experimentu využívajícího metodu imunoprecipitace a následné analýzy eluovaných komplexů pomocí LC-MALDI (62,74). Data získaná z těchto experimentů byla srovnána s výsledky dříve publikované proteomické studie (58). Pro další testování byl vybrán protein D-alanyl-D-alanin karboxypeptidáza s označením FTS_1034 a protein HlyD s označením FTS_0036 (62,74). Pro ověření interakcí vytipovaných proteinů s proteinem FTS_1067 byl použit klasický bakteriální dvouhybridový systém (B2H) (75) a modifikovaný bakteriální dvouhybridový systém s označením BACTH (Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid Assay) (76). I přes sestavení všech možných kombinací daly oba tyto systémy negativní výsledky (Obr. 7 a 8). Možným vysvětlením, proč se nám nepodařilo předpokládané interakce prokázat, může být nutnost lokalizace obou proteinů mimo cytoplazmu, což použité systémy neumožňují. Další možností je potřeba dlouhodobějšího kontaktu obou proteinů a nelze ani vyloučit nutnou přítomnosti dalšího proteinu, který může pomoci interakci proteinu FTS_1067 s jeho substrátem. Oba testované proteiny však byly identifikovány v práci autorů Ren et al. (61), která se zabývala hledáním substrátů homologu proteinu FTS_1067 v nevirulentním kmeni LVS, což podporuje existenci těchto proteinových interakcí i ve virulentním kmeni FSC200. Autoři využili toho, že po záměně katalytického místa -CXXC- na -CXXS- jsou komplexy v nepřítomnosti redukujícího činidla stabilní a nerozpadají se.
16
Obr. 7: Kmen E. coli KDZif1ΔZ nesoucí plazmidy se –Zif a –ω fúzemi studovaných proteinů byl použit k měření β-galaktosidázové aktivity. Jako pozitivní kontrola byly použity fúzní proteiny MglAZif a SspA-ω. Jako negativní kontrola byly použity prázdné plazmidy pACTR-Ap-Zif a pBRGP- ω. Hodnoty β-galaktosidázové aktivity (v Millerových jednotkách) představují průměr ± standardní odchylku dvou nezávislých experimentů s dvěma různými klony. FTS_0036-ω FTS_1067-Zif (1), FTS_1034-ω FTS_1067-Zif (2), pBRGP-ω FTS_1067-Zif (3), SspA-ω MglA-Zif (4), pBRGP-ω pACTR-Ap-Zif (5).
A)
B)
Obr. 8: Testování interakcí vybraných proteinů s proteinem FTS_1067. 2μl bakteriální kultury vždy ze tří klonů E. coli DHM1 nesoucích upravené plazmidy pKT25 a pUT18C byly nakápnuty na indikátorové plotny. (A) LB plotny obsahující kanamycin, ampicilin, IPTG a X-Gal (B). MacConkey plotny obsahující kanamycin, ampicilin, maltózu a ITPG. A) BACTH negativní kontrola, B) BACTH pozitivní
kontrola,
C)
FTS_0036pUT18C
+
FTS_1067pKT25,
D)
FTS_0036pKT25
+
FTS_1067pUT18C,
E)
FTS_1034pUT18C
+
FTS_1067pKT25,
F)
FTS_1034pKT25
+
FTS_1067pUT18C, G) pUT18C + FTS_1067pKT25, H) pKT25 + FTS_1067pUT18C, I) IglApUT18C + IglBpKT25, J) IglApKT25 + IglBpUT18C.
17
4 Shrnutí Francisella tularensis je vysoce infekční intracelulární bakterie patřící do kategorie A biologických agens zneužitelných pro terorismus (5). Naše znalosti o faktorech virulence tohoto mikroba v posledních letech vzrostly, přesto zůstává mnoho molekulárních mechanizmů jeho vysoké virulence neodhaleno. Jedním z prokázaných klíčových faktorů virulence je membránový lipoprotein FTS_1067 s homologií k proteinům rodiny disulfid oxidoreduktáz. Tento lipoprotein je tvořen dvěma rozdílnými doménami: C-koncovou doménou DSBA_Com1-like (DSBA-like) a N-koncovou doménu typu FKBP_N (Forskolinbinding protein_N, FKBP_N-like). Role obou těchto funkčních domén nebyla dříve u proteinu FTS_1067 objasněna. Cílem předkládané práce bylo odhalit biologické role DSBA-like a FKBP_N-like domén proteinu FTS_1067. S využitím metod molekulární biologie byl připraven nový mutantní kmen s delecí DSBA-like domény a pojmenován FSC200/∆DSBA-like. Tento kmen byl charakterizován na in vivo a in vitro úrovni. Z výsledků vyplývá, že u mutantního kmene došlo k oslabení virulence v myším modelu infekce a kmen byl schopen navodit dávkově závislou protekci proti mateřskému virulentnímu kmeni FSC200, což ukazuje schopnost mutantního kmene dostatečně stimulovat imunitní odpověď hostitele. Tento názor potvrdily také výsledky orgánové distribuce mutantního kmene. Dále jsme ukázali, že mutantní kmen je schopen vstoupit do makrofágů, ale je pozorován výrazný defekt ve schopnosti replikace uvnitř makrofágů. Doména DSBA-like je tedy důležitá pro intracelulární přežívání a replikaci F. tularensis v hostitelské buňce. Výsledky studia působení oxidativního stresu na bakterii upozornily na významnou roli proteinu FTS_1067 a obou jeho domén v boji s oxidativními činidly. Pro následné studie zaměřené na charakterizaci funkcí spojených s FKBP_N-like či DSBA-like doménou byl připraven rekombinantní protein s delecí DSBA-like domény a se zachovanou FKBP_N-like doménou (rFTS_1067/∆DSBA-like). Test oxidoreduktázové aktivity potvrdil ztrátu disulfid oxidoreduktázové aktivity, která je spojená s -CXXCmotivem. Dvěma nezávislými testy byla potvrzena izomerázová aktivita proteinu FTS_1067 a byla prokázána nezbytná přítomnost obou domén pro zachování této funkce. Ze studie chaperonové aktivity vyplývá, že za tuto aktivitu u proteinu FTS_1067 je z větší míry zodpovědná doména FKBP_N-like. Dále bylo prokázáno, že rekombinantní protein rFTS_1067/∆DSBA-like se vyskytuje v neredukujícím prostředí jako trimer a že za schopnost oligomerizace je zodpovědná doména FKBP_N-like a nikoliv DSBA-like doména, jak se 18
dosud předpokládalo. Za účelem doplnění informací o roli proteinu FTS_1067 v mechanizmech virulence bakterie byli vybráni dva potencionální vazební partneři a jejich vzájemná interakce byla ověřována pomocí dvou různých bakteriálních dvouhybridových systémů. Ani jeden z těchto systémů ale interakci proteinů nedokázal potvrdit. Možným vysvětlením negativních výsledků může být: i) velmi krátká doba interakce, ii)
umístění studovaných interakcí
v dvouhybridových systémech do redukujícího prostředí cytoplazmy (ačkoliv naše data ukazují, že toto by nemělo být limitujícím faktorem), iii) rovněž nemůžeme vyloučit ani potřebu dalšího proteinu, který asistuje vzájemné vazbě interakčních partnerů.
19
5 Summary Francisella tularensis is a highly infectious intracellular bacteria belonging to a Category A biological agent of bioterrorism (5). Our knowledge about its virulence factors has increased recently but still a large number of molecular mechanisms remain to explore. One of the described essential virulence factor is membrane lipoprotein FTS_1067 with homology to the protein family of disulfide oxidoreductases DsbA. This lipoprotein consists of two different domains: the C-terminal DsbA_Com1-like domain (DSBA-like) and the N-terminal FKBP-type peptidyl-prolyl cis/trans isomerases (Forskolin-binding protein_N, FKBP_N-like). The exact roles of these domains have never been clarified yet. The aim of the presented work was to uncover the biological role of the DSBA-like and FKBP_N-like domains of FTS_1067 protein. A new mutant bacterial strain with deletion of DSBA-like domain was created with use of molecular biological tools and was denoted FSC200/∆DSBA-like. This strain was in vivo and in vitro characterized. The absence of the DSBA-like domain led to the diminished proliferation of the mutant strain within the murine macrophages and in vivo attenuation in murine model of BALB/c mice. The mutant strain was able to induce the dose-dependent protection against the fully virulent WT strain FSC200, which shows an ability of the mutant strain to stimulate the host immune system effectively. This theory was supported by results of bacterial distribution in target organs as well. Thus, the DSBA-like domain is important for intracellular survival and replication of F. tularensis within the host cell. Further, the important role of both domains of FTS_1067 protein in resisting the oxidative stress was revealed. Moreover, we purified the truncated recombinant protein with deleted DSBA-like domain and we performed several functional tests to characterized functions of the domains. The test of the oxidoreductase activity confirmed the loss of a disulfide oxidoreductase activity which is connected with -CXXC- motif. The isomerase activity of the FTS_1067 protein was confirmed by two independent assays and we also proved the necessity of both domains to preserve this function. The study of chaperone activity of the recombinant truncated protein shows the important role of the FKBP_N-like domain in this activity. Finally, it was also demonstrated that the recombinant protein rFTS_1067/∆DSBA-like appears as a trimer on non-reducing gel and that it is the FKBP_N-like domain, not the DSBA-like domain, which is responsible for this feature. To supplement the information about the role of the FTS_1067 protein in mechanism of bacterial virulence, two putative binding proteins were selected and its interactions were 20
tested by two different bacterial two hybrid assays. But, neither of these systems was able to confirm these interactions. There might be several reasons why the interactions were not proved: i) the very short time of interactions, ii) localization of interactions within the reducing environment of cytoplasm (but this should not be a limiting factor as shown by our other results) or iii) the need of the auxiliary protein which can assist the FTS_1067 protein during interactions.
21
6 Seznam literatury 1.
McLendon MK, Apicella MA, Allen L-AH. Francisella tularensis: taxonomy, genetics, and Immunopathogenesis of a potential agent of biowarfare. Annu Rev Microbiol. 2006;60:167–85.
2.
Larsson P, Elfsmark D, Svensson K, Wikström P, Forsman M, Brettin T, et al. Molecular evolutionary consequences of niche restriction in Francisella tularensis, a facultative intracellular pathogen. PLoS Pathog. 2009 Jun;5(6):e1000472.
3.
Feldman KA, Enscore RE, Lathrop SL, Matyas BT, McGuill M, Schriefer ME, et al. An outbreak of primary pneumonic tularemia on Martha’s Vineyard. N Engl J Med. 2001 Nov 29;345(22):1601–6.
4.
Tärnvik A, Berglund L. Tularaemia. Eur Respir J. 2003 Feb;21(2):361–73.
5.
Dennis DT, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, et al. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA J Am Med Assoc. 2001 Jun 6;285(21):2763–73.
6.
Hepburn MJ, Simpson AJH. Tularemia: current diagnosis and treatment options. Expert Rev Anti Infect Ther. 2008 Apr;6(2):231–40.
7.
Tärnvik A, Chu MC. New approaches to diagnosis and therapy of tularemia. Ann N Y Acad Sci. 2007 Jun;1105:378–404.
8.
Johansson A, Urich SK, Chu MC, Sjöstedt A, Tärnvik A. In vitro susceptibility to quinolones of Francisella tularensis subspecies tularensis. Scand J Infect Dis. 2002;34(5):327–30.
9.
Johansson A, Berglund L, Gothefors L, Sjöstedt A, Tärnvik A. Ciprofloxacin for treatment of tularemia in children. Pediatr Infect Dis J. 2000 May;19(5):449–53.
10. Sutera V, Levert M, Burmeister WP, Schneider D, Maurin M. Evolution toward highlevel fluoroquinolone resistance in Francisella species. J Antimicrob Chemother. 2014 Jan;69(1):101–10. 11. Caspar Y, Sutera V, Boisset S, Denis J-N, Maurin M. Bis-indolic compounds as potential new therapeutic alternatives for tularaemia. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:24. 12. Nano FE, Zhang N, Cowley SC, Klose KE, Cheung KKM, Roberts MJ, et al. A Francisella tularensis pathogenicity island required for intramacrophage growth. J Bacteriol. 2004 Oct;186(19):6430–6. 13. Bröms JE, Lavander M, Sjöstedt A. A conserved alpha-helix essential for a type VI secretion-like system of Francisella tularensis. J Bacteriol. 2009 Apr;191(8):2431–46. 14. Bröms JE, Lavander M, Meyer L, Sjöstedt A. IglG and IglI of the Francisella pathogenicity island are important virulence determinants of Francisella tularensis LVS. 22
Infect Immun. 2011 Sep;79(9):3683–96. 15. de Bruin OM, Ludu JS, Nano FE. The Francisella pathogenicity island protein IglA localizes to the bacterial cytoplasm and is needed for intracellular growth. BMC Microbiol. 2007;7:1. 16. Santic M, Molmeret M, Barker JR, Klose KE, Dekanic A, Doric M, et al. A Francisella tularensis pathogenicity island protein essential for bacterial proliferation within the host cell cytosol. Cell Microbiol. 2007 Oct;9(10):2391–403. 17. Straskova A, Cerveny L, Spidlova P, Dankova V, Belcic D, Santic M, et al. Deletion of IglH in virulent Francisella tularensis subsp. holarctica FSC200 strain results in attenuation and provides protection against the challenge with the parental strain. Microbes Infect Inst Pasteur. 2012 Feb;14(2):177–87. 18. Schmerk CL, Duplantis BN, Howard PL, Nano FE. A Francisella novicida pdpA mutant exhibits limited intracellular replication and remains associated with the lysosomal marker LAMP-1. Microbiol Read Engl. 2009 May;155(Pt 5):1498–504. 19. Brotcke A, Weiss DS, Kim CC, Chain P, Malfatti S, Garcia E, et al. Identification of MglA-regulated genes reveals novel virulence factors in Francisella tularensis. Infect Immun. 2006 Dec;74(12):6642–55. 20. Wehrly TD, Chong A, Virtaneva K, Sturdevant DE, Child R, Edwards JA, et al. Intracellular biology and virulence determinants of Francisella tularensis revealed by transcriptional profiling inside macrophages. Cell Microbiol. 2009 Jul;11(7):1128–50. 21. Dai S, Mohapatra NP, Schlesinger LS, Gunn JS. Regulation of francisella tularensis virulence. Front Microbiol. 2010;1:144. 22. Baron GS, Nano FE. MglA and MglB are required for the intramacrophage growth of Francisella novicida. Mol Microbiol. 1998 Jul;29(1):247–59. 23. Mohapatra NP, Soni S, Bell BL, Warren R, Ernst RK, Muszynski A, et al. Identification of an orphan response regulator required for the virulence of Francisella spp. and transcription of pathogenicity island genes. Infect Immun. 2007 Jul;75(7):3305–14. 24. Buchan BW, McCaffrey RL, Lindemann SR, Allen L-AH, Jones BD. Identification of migR, a regulatory element of the Francisella tularensis live vaccine strain iglABCD virulence operon required for normal replication and trafficking in macrophages. Infect Immun. 2009 Jun;77(6):2517–29. 25. Meibom KL, Forslund A-L, Kuoppa K, Alkhuder K, Dubail I, Dupuis M, et al. Hfq, a novel pleiotropic regulator of virulence-associated genes in Francisella tularensis. Infect Immun. 2009 May;77(5):1866–80. 26. Brotcke A, Monack DM. Identification of fevR, a novel regulator of virulence gene expression in Francisella novicida. Infect Immun. 2008 Aug;76(8):3473–80. 27. Sorokin VM, Pavlovich NV, Prozorova LA. Francisella tularensis resistance to bactericidal action of normal human serum. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996 Mar;13(3):249–52. 23
28. Sandström G, Löfgren S, Tärnvik A. A capsule-deficient mutant of Francisella tularensis LVS exhibits enhanced sensitivity to killing by serum but diminished sensitivity to killing by polymorphonuclear leukocytes. Infect Immun. 1988 May;56(5):1194–202. 29. Rohmer L, Brittnacher M, Svensson K, Buckley D, Haugen E, Zhou Y, et al. Potential source of Francisella tularensis live vaccine strain attenuation determined by genome comparison. Infect Immun. 2006 Dec;74(12):6895–906. 30. Rasmussen JA, Post DMB, Gibson BW, Lindemann SR, Apicella MA, Meyerholz DK, et al. Francisella tularensis Schu S4 Lipopolysaccharide Core Sugar and O-Antigen Mutants Are Attenuated in a Mouse Model of Tularemia. Infect Immun. 2014 Apr;82(4):1523–39. 31. Raynaud C, Meibom KL, Lety M-A, Dubail I, Candela T, Frapy E, et al. Role of the wbt Locus of Francisella tularensis in Lipopolysaccharide O-Antigen Biogenesis and Pathogenicity. Infect Immun. 2007 Jan;75(1):536–41. 32. Li J, Ryder C, Mandal M, Ahmed F, Azadi P, Snyder DS, et al. Attenuation and protective efficacy of an O-antigen-deficient mutant of Francisella tularensis LVS. Microbiol Read Engl. 2007 Sep;153(Pt 9):3141–53. 33. Hartley G, Taylor R, Prior J, Newstead S, Hitchen PG, Morris HR, et al. Grey variants of the live vaccine strain of Francisella tularensis lack lipopolysaccharide O-antigen, show reduced ability to survive in macrophages and do not induce protective immunity in mice. Vaccine. 2006 Feb 13;24(7):989–96. 34. Remaut H, Fronzes R, editors. Bacterial Membranes: Structural and Molecular Biology. Caister Academic Press; 2014. 35. Qin A, Scott DW, Rabideau MM, Moore EA, Mann BJ. Requirement of the CXXC motif of novel Francisella infectivity potentiator protein B FipB, and FipA in virulence of F. tularensis subsp. tularensis. PloS One. 2011;6(9):e24611. 36. Wintermeyer E, Ludwig B, Steinert M, Schmidt B, Fischer G, Hacker J. Influence of site specifically altered Mip proteins on intracellular survival of Legionella pneumophila in eukaryotic cells. Infect Immun. 1995 Dec;63(12):4576–83. 37. Cianciotto NP, Eisenstein BI, Mody CH, Toews GB, Engleberg NC. A Legionella pneumophila gene encoding a species-specific surface protein potentiates initiation of intracellular infection. Infect Immun. 1989 Apr;57(4):1255–62. 38. Mo YY, Cianciotto NP, Mallavia LP. Molecular cloning of a Coxiella burnetii gene encoding a macrophage infectivity potentiator (Mip) analogue. Microbiol Read Engl. 1995 Nov;141 ( Pt 11):2861–71. 39. Leuzzi R, Serino L, Scarselli M, Savino S, Fontana MR, Monaci E, et al. Ng-MIP, a surface-exposed lipoprotein of Neisseria gonorrhoeae, has a peptidyl-prolyl cis/trans isomerase (PPIase) activity and is involved in persistence in macrophages. Mol Microbiol. 2005 Nov;58(3):669–81. 40. Horne SM, Kottom TJ, Nolan LK, Young KD. Decreased intracellular survival of an fkpA mutant of Salmonella typhimurium Copenhagen. Infect Immun. 1997 24
Feb;65(2):806–10. 41. Norville IH, Breitbach K, Eske-Pogodda K, Harmer NJ, Sarkar-Tyson M, Titball RW, et al. A novel FK-506-binding-like protein that lacks peptidyl-prolyl isomerase activity is involved in intracellular infection and in vivo virulence of Burkholderia pseudomallei. Microbiol Read Engl. 2011 Sep;157(Pt 9):2629–38. 42. Neff L, Daher S, Muzzin P, Spenato U, Gülaçar F, Gabay C, et al. Molecular characterization and subcellular localization of macrophage infectivity potentiator, a Chlamydia trachomatis lipoprotein. J Bacteriol. 2007 Jul;189(13):4739–48. 43. Lundemose AG, Kay JE, Pearce JH. Chlamydia trachomatis Mip-like protein has peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity that is inhibited by FK506 and rapamycin and is implicated in initiation of chlamydial infection. Mol Microbiol. 1993 Mar;7(5):777– 83. 44. Ramm K, Plückthun A. High enzymatic activity and chaperone function are mechanistically related features of the dimeric E. coli peptidyl-prolyl-isomerase FkpA. J Mol Biol. 2001 Jul 6;310(2):485–98. 45. Arié JP, Sassoon N, Betton JM. Chaperone function of FkpA, a heat shock prolyl isomerase, in the periplasm of Escherichia coli. Mol Microbiol. 2001 Jan;39(1):199–210. 46. Heras B, Kurz M, Shouldice SR, Martin JL. The name’s bond......disulfide bond. Curr Opin Struct Biol. 2007 Dec;17(6):691–8. 47. Quan S, Schneider I, Pan J, Von Hacht A, Bardwell JCA. The CXXC motif is more than a redox rheostat. J Biol Chem. 2007 Sep 28;282(39):28823–33. 48. Stenson TH, Weiss AA. DsbA and DsbC are required for secretion of pertussis toxin by Bordetella pertussis. Infect Immun. 2002 May;70(5):2297–303. 49. Tinsley CR, Voulhoux R, Beretti J-L, Tommassen J, Nassif X. Three homologues, including two membrane-bound proteins, of the disulfide oxidoreductase DsbA in Neisseria meningitidis: effects on bacterial growth and biogenesis of functional type IV pili. J Biol Chem. 2004 Jun 25;279(26):27078–87. 50. Sinha S, Ambur OH, Langford PR, Tønjum T, Kroll JS. Reduced DNA binding and uptake in the absence of DsbA1 and DsbA2 of Neisseria meningitidis due to inefficient folding of the outer-membrane secretin PilQ. Microbiol Read Engl. 2008 Jan;154(Pt 1):217–25. 51. Ha U-H, Wang Y, Jin S. DsbA of Pseudomonas aeruginosa is essential for multiple virulence factors. Infect Immun. 2003 Mar;71(3):1590–5. 52. Burall LS, Harro JM, Li X, Lockatell CV, Himpsl SD, Hebel JR, et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infect Immun. 2004 May;72(5):2922–38. 53. Miki T, Okada N, Danbara H. Two periplasmic disulfide oxidoreductases, DsbA and SrgA, target outer membrane protein SpiA, a component of the Salmonella pathogenicity 25
island 2 type III secretion system. J Biol Chem. 2004 Aug 13;279(33):34631–42. 54. Yu J, Oragui EE, Stephens A, Kroll JS, Venkatesan MM. Inactivation of DsbA alters the behaviour of Shigella flexneri towards murine and human-derived macrophage-like cells. FEMS Microbiol Lett. 2001 Oct 16;204(1):81–8. 55. Petrovskaia LE, Kriukova EA, Kaiushin AL, Korobko VG. [Chaperone Caf1M stabilizes hybrid proteins containing sequences of F1 antigen subunit from Yersinia pestis]. Bioorg Khim. 2001 Aug;27(4):275–81. 56. Jackson MW, Plano GV. DsbA is required for stable expression of outer membrane protein YscC and for efficient Yop secretion in Yersinia pestis. J Bacteriol. 1999 Aug;181(16):5126–30. 57. Qin A, Zhang Y, Clark ME, Rabideau MM, Millan Barea LR, Mann BJ. FipB, an Essential Virulence Factor of Francisella tularensis subsp. tularensis, Has Dual Roles in Disulfide Bond Formation. J Bacteriol. 2014 Oct 15;196(20):3571–81. 58. Straskova A, Pavkova I, Link M, Forslund A-L, Kuoppa K, Noppa L, et al. Proteome analysis of an attenuated Francisella tularensis dsbA mutant: identification of potential DsbA substrate proteins. J Proteome Res. 2009 Nov;8(11):5336–46. 59. Schmidt M, Klimentova J, Rehulka P, Straskova A, Spidlova P, Szotakova B, et al. Francisella tularensis subsp. holarctica DsbA homologue: a thioredoxin-like protein with chaperone function. Microbiol Read Engl. 2013 Nov;159(Pt 11):2364–74. 60. Senitkova I, Spidlova P, Stulik J. Cooperation of both, the FKBP_N-like and the DSBAlike, domains is necessary for the correct function of FTS_1067 protein involved in Francisella tularensis virulence and pathogenesis. Pathog Dis. 2015 Apr 19; 61. Ren G, Champion MM, Huntley JF. Identification of disulfide bond isomerase substrates reveals bacterial virulence factors. Mol Microbiol. 2014 Sep 26; 62. Šenitková I. Komplementace dsbA mutantního kmene Francisella tularensis a analýza potenciálních vazebných partnerů proteinu DsbA. Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze; 2010. 63. Kikuchi H, Kim S, Watanabe K, Watarai M. Brucella abortusd-alanyl-D-alanine carboxypeptidase contributes to its intracellular replication and resistance against nitric oxide. FEMS Microbiol Lett. 2006 Jun;259(1):120–5. 64. Ferrè F, Clote P. DiANNA 1.1: an extension of the DiANNA web server for ternary cysteine classification. Nucleic Acids Res. 2006 Jul 1;34(Web Server issue):W182–5. 65. Ferrè F, Clote P. DiANNA: a web server for disulfide connectivity prediction. Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W230–2. 66. Ferrè F, Clote P. Disulfide connectivity prediction using secondary structure information and diresidue frequencies. Bioinforma Oxf Engl. 2005 May 15;21(10):2336–46. 67. Pimenta AL, Racher K, Jamieson L, Blight MA, Holland IB. Mutations in HlyD, part of the type 1 translocator for hemolysin secretion, affect the folding of the secreted toxin. J 26
Bacteriol. 2005 Nov;187(21):7471–80. 68. Qin A, Scott DW, Thompson JA, Mann BJ. Identification of an essential Francisella tularensis subsp. tularensis virulence factor. Infect Immun. 2009 Jan;77(1):152–61. 69. Hiniker A, Collet J-F, Bardwell JCA. Copper stress causes an in vivo requirement for the Escherichia coli disulfide isomerase DsbC. J Biol Chem. 2005 Oct 7;280(40):33785–91. 70. Holmgren A. Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J Biol Chem. 1979 Oct 10;254(19):9627–32. 71. Iqbalsyah TM, Moutevelis E, Warwicker J, Errington N, Doig AJ. The CXXC motif at the N terminus of an alpha-helical peptide. Protein Sci Publ Protein Soc. 2006 Aug;15(8):1945–50. 72. Buchner J, Grallert H, Jakob U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Methods Enzymol. 1998;290:323–38. 73. Pallová P, Hercík K, Sasková L, Nováková L, Branny P. A eukaryotic-type serine/threonine protein kinase StkP of Streptococcus pneumoniae acts as a dimer in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Apr 6;355(2):526–30. 74. Spidlova P, Senitkova I, Link M, Stulik J. Identification of two substrates of FTS_1067 protein – an essential virulence factor of Francisella tularensis. Acta Microbiol Immunol Hung. 2016; in revision 75. Dove SL, Hochschild A. A bacterial two-hybrid system based on transcription activation. Methods Mol Biol Clifton NJ. 2004;261:231–46. 76. Karimova G, Ullmann A, Ladant D. A bacterial two-hybrid system that exploits a cAMP signaling cascade in Escherichia coli. Methods Enzymol. 2000;328:59–73.
27
Publikační činnost Publikace SENITKOVA, I., SPIDLOVA, P., HERNYCHOVA, L., STULIK, J., The disulfide bond formation and its relationship to bacterial pathogenicity of three important gram-negative bacteria. Mil. Med. Sci. Lett. 2011, 80, 118–128.
SENITKOVA, I., SPIDLOVA, P., STULIK, J., Cooperation of both, the FKBP_N-like and the DSBA-like, domains is necessary for the correct function of FTS_1067 protein involved in Francisella tularensis virulence and pathogenesis. Pathog Dis 2015 Aug;73(6):ftv030.
PUTZOVA, D., SENITKOVA, I., STULIK, J., Tularemia vaccines. Folia Microbiol. (Praha) 2016.
SPIDLOVA, P., SENITKOVA, I., LINK, M., STULIK, J., Identification of two substrates of FTS_1067 protein – an essential virulence factor of Francisella tularensis. Acta Microbiol Immunol Hung. 2016; in revision
Abstrakt s ISBN ŠPIDLOVÁ, P., ŠENITKOVÁ, I., LINK, M., STULÍK, J. Searching for Francisella tularensis FTT1103 substrates by combination of immunoprecipitation and LC-MS/MS. In: 25th International Symposium on Microscale Bioseparation MSB 2010. Brno: Institute of Analytical Chemistry. 2010, s. 170. ISBN 978-80-254-6631-5.
Postery ŠPIDLOVÁ, P., ŠENITKOVÁ, I., LINK, M., STULÍK, J. Searching for Francisella tularensis FTT1103 substrates by combination of immunoprecipitation and LC-MS/MS. Praha. 25th international symposium on microscale bioseparation MSB 2010. 21.03.2010– 25.03.2010.
28
ŠENITKOVÁ, I. Analysis of Francisella tularensis FTT1103 binding partners. Mnichov. Medical Biodefense Conference. 25.10.2011–27.10.2011. ŠENITKOVÁ, I., ŠPIDLOVÁ, P., HERNYCHOVÁ, L., STULÍK, J. Determining the function of the DsbA-like domain of the protein FTH_1071. Breckenridge, USA. 7th International Conference on Tularemia. 17.09.2012–21.09.2012. Přednášky ŠPIDLOVÁ, P., ŠENITKOVÁ, I., LINK, M., STRAŠKOVÁ, A., STULÍK, J. Identification of putative substrates of Francisella tularensis conserved hypothetical lipoprotein FTT1103. Třeboň: Discussion forum 2010 - Host pathogen interaction. 27.04.2010–30.04.2010. ŠENITKOVÁ, I. Analýza vztahu struktury a funkce bakteriálních proteinů. Malá Úpa: Závěrečný seminář ÚMP a CPS FVZ UO 2010. 16.12.2010–17.12.2010. ŠENITKOVÁ, I. Pokrok za rok 2012. Příchovice u Tanvaldu: Závěrečný seminář spojený s výročním zasedáním ÚMP a CPS. 13.12.2012–14.12.2012. ŠENITKOVÁ, I. Charakterizace vztahu struktury a funkce proteinu FTH_1071. Hradec Králové: 6. fakultní konference studentů doktorských programů. 02.10.2012–02.10.2012. ŠPIDLOVÁ, P., ŠENITKOVÁ, I. Protein - proteinové interakce: nové možnosti studia pomocí genetických systémů. Velká Úpa: Výroční zasedání ÚMP a CPS za rok 2013. 28.11.2013–29.11.2013. ŠENITKOVÁ, I. In vivo a in vitro testování mutanta FSC200/DSBA-like. Velká Úpa, Krkonoše: Výroční zasedání ÚMP a CPS za rok 2013. 28.11.2013–29.11.2013.
SENITKOVA, I., SPIDLOVA, P. In vivo and in vitro characterization of DSBA-like mutant. Náchod: Discussion forum 2014 - Host pathogen interaction. 12.5.2014-15.5.2014. ŠENITKOVÁ, I. Spolupráce dvou domén proteinu FTS_1067. Dvorské boudy, Krkonoše: Výroční zasedání ÚMP a CPS za rok 2014, 13.11.2014-14.11.2014. 29
ŠENITKOVÁ, I. Charakterizace vztahu struktury a funkce domén proteinu FTS_1067 bakterie Francisella tularensis. Hradec Králové: 8. fakultní konference studentů doktorských programů. 07.10.2014-07.10.2014.
SENITKOVA, I. DacD, D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase FTS_1034 (F. tularensis subsp. holarctica FSC200). Hotel pod Zvičinou, Zvičina: Výroční zasedání Katedry molekulární patologie a biologie FVZ UO. 3.12.-4.12.2015. ŠPIDLOVÁ, P., DAŇKOVÁ, V., ŠENITKOVÁ, I., STOJKOVÁ, P., STULÍK, J. D-Ala DAla carboxypeptidase is involved in pathogenesis of Francisella tularensis. Broumov: Discussion Forum 2016 – Host Pathogen Interaction. 2.5.-5.5.2016.
30
