(~
1
L/\P()RAN AKHIR PENELITiAN DISERTASI DOKT()R
II
'fm~ml~lnm'Ii~'11 15001190
PR()TEIN (I-ISPs) ULAT SUTERA (Bolnbyx Inori) HASIL PERSILANGAN LOKAL
Tahun ke I dar: rencana I tahun
IVIASITT A T ANJUNG, S.Si., M.Si.!OOl 0097101
Dibiayai oleh DIPA Universitas Sumatera Utara Tabun Anggaran 2014, sesllai de~gan Surat Perjanjia!1 Pelaksanaan Penu~as~n PeJielitian Disertasi Doktor Nomor: 1o86/UN5.1.RlKEU/2014, TanggaJ 17 Februari 2014
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA NOVEMBER 2014
HALAMAN PENGESAHAN Judul Kegiat2.n
Isolasi gen penyandi heat shock protein (HSPs) ulat sutera (Bombyx mori) hasil persilangan lokal
Peneliti / Pel::ksana Nama Lengkap
MASITT A T ANJUNG S.si_, tvLSi_
NIDN
0010097101
labatan Fungsional Program Stucli
Biologi
NomorHP Sure! (e-:11Clii)
m:c."ittM:c.nillnolnlvl'lh{){) ('() irl ------ - - -------:.1 ---O\';-./J ..... - ....... - .....
082160777933 -~----
Institusi Mitra (jika ada) Nama Institusi Mitra Alamat Penanggung Jawab
Tahun Pelaksanaan Biaya Tahun Betjalan Biaya Keseluruhan
Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun
Rp_ 44_750_000,00 Rp_ 0,00 Medan, Ketua
11- 11 - 2014,
Prreliti,
MSc.)
~t
lA TANJUNG S_Si_, M_Si_)
96310261991031001 ¥~l)y.~Njui;:: .
c , ' ••
:Ketuatemb~F:penelitian USU
(Prof. Dr. IT. Hannein Nasution, MSIE) ~~ll(195205251980031003
ii
RINGKASAN
Isolasi zen penyandi heat shock proteins (HSPs) ulat sutera (Bombyx mori) hasil persilangan lakal
Penumhuhan, perkembangan dan produktivitas ulat sutera sangat dipengaruhi olch r~rulxlh~,n suhu lingkungan pemeliharaan. Suhu menjadi raktor utama dalam l11eningbtLm pmdubi benang sutera. Pemeliharaan ulat sutera pada daeraah tropis mengl1Cllbpi banyak tantangan dan hambatan karena bibit ulat sutera berasal duri daerah suhtropi~. Usaha dalam meningkatkan produksi benang diharapkan adanya bibit ulat sutera yang bisa bertahan terhadap perubahan faktor Iingkungan terutama suhu. Untuk mengembangan usaha persuteraan alam di daerah tropis diperlukan bibit Lila! sulna yang (ermotolcran. Termotoleran terhadap faktor lingkungan dapat dikontrol gen. (Jen Y~ll1g herllmgsi untuk proses pertahannan tubuh terhadap ("aktor suhu adalah gen IISP (heat shock proteins). (jen J ISP dapat diisolasi dengan eara mclakukan kejutan p~ma:; :;ehingga bisa mer.ginduksi ekspresi gen tersbut. liSP adalah protein yang memungkinkan sel untuk ll1engatasi masalah protein selelah adanya st'·es (eekaman) sehingga dapat mengenali dan mengikat ke sisi yang terkcn;l. r ISP merupakan molekul chaperone yang dapat meneegah kclumpok sisi terikat untuk Inlibal dalam interaksi yang tidak pantas c1engan komponcn selulcr lainnya, serta m\.11stabilkan protein terikat dalam kcadaan tidakdilipat at'lU berdampingan dapat menargetkan protein terikat untuk ::Jegradasi aiau penghapUSill1 dari sel. HSP mclakukan rcran ini untuk mcmhentuk polipcptida baru '.l.tau protein yang terungkap sclama proses sl21ulcr nurmaL sedangkan yang diinduksi HSPs bcrfungsi uuiam mcm:nggapi denaturasi protein akibal stres. Pe;]elitian im hcrtujuan untuk mengisolasi gen penyanJi heat shock protein (IISPs) ubt sutera yang berasal dari bibit hasil persilar..gan lobi dari pusat pcmbibitan sutera alam Candiroto Temanggung Jawa Tengah yang dibcri kejutan suhu tinggi. Pcneiitian ini diawali dcnga.'1 isola<;i RNA, kemud;an diubah men:;adi eDNA dilanjutkan mC11desain primer yai1g sesuai untuk mendapatkan gen pcnyandi heat shoek protein (I1SP,) uari ulat ,;utera.
Key word: BomhYI: mori, ge!1 HSP, heqt shock
iii
PRAKATA
F!lj: chn syukur penulis panjatkan kepada Allah S.W.T atas segala
kan:ni
shock jHo/cil7s (J·ISPs) ulat sutera (Bombyx mori) hasil persilangan local. UC:lpan terima kasih kepada komisi pembimbing Disertasi Doktor, yaitu Ibu ProL Dr. Maryani Cyccu Tobing, 1'-1S. dan
Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed
Prof Dr. Ir. Danna Bakti, MS yang teJah memberikan bimbingan, saran dan
waktll sehingga penelitian ini dapat beriangsung. Ucapan tenmakasli1 dlsampalkan
juga kepilc!a yang membiayai penelitian ini yaitu Direktorat Pendidikan Tinggi Republik lndnncsia melalui DIPA Universitas Sumatera Utara Tahun Anggaran 2014. clan
merupakan tugas akhir penyelesaiar. Program Studi Doktor yang
cliharapkan clapat untuk pengembagan diri dan menarnbah pengalrlman peneliti serta memperkaya ilmu pengetahuan. Peneliti
menyadari hporan ini masih belum sempuma, sehingga sangat
cliharapkan adanya kritikan dan saran yang sitatnya membangun, semoga penelif·· ini clapat menambah
wawasan dan bermanfaat bagi pengembangan
iJmu pengetahuan.
Medan, November 2014 Penulis
iv
DAFTAR lSI
Halaman Pengesahan RI;-
1I
PRAKA';-A Dj\FT·'l.R IS] DAFL\R TABEL
111 IV V
DAFTAR GAi\1BAR DAFT·\IZ LAlvlPIRAN
VI
VlI
BAB L PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1,2 Pe'masalahan
2
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
4
BAB IlL TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
6
13A13 IV. METODOLOGI PENELITIAN
6 6 6 7 8
Tahapan Kelja a. Penetasan dan pemeliharaan Lila! sutera b. Pemberian l'erlakuan c. Isolasi RNA Total BAB V. !-IASIL YANG DICAPAI BAG VI. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
i7
BAB VII. KE~IMPULAN DAN SARAN
17
DAFTAR PUSTAKA
17
LAMPIRAN
21
v
DAFTAR TABEL
Hal
I. !
3.
Sekuensing Primer
9
Kualitas RNA total hasil isolasi dari beberapa bagian tubuh larva sutera (Bornhyx rnori) instar V dengan spektrofotometer UV-Vis
10
Kualitas RNA total hasil isohsi dari bagian kepala larva sutera (Bomhyx mori) instar V pada beberapa perlakuan kejut panas c1engan spektrofotometer UV -Vis
10
vi
DAFT AR GAMBAR
Gambar
Hal
1. Basil peR Optimalisasi Suhu Primer HSP 70 2. Hasil peR Optimalisasi Suhu Primer HSP 01 dan 20,4 3. Basil peR Optimalisasi Suhu Primer HSP 20,4 dan 70 4. Hasil peR Optimalisasi Suhu Primer HSP 01 S. Basil peR dengan primer HSP 01; HSP 20,4 dan HSP 70 6. Urutan nukleotida gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primer HSP 01 7. I-lasil blastn sekuen gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primerHSPOl 8. Unltan nukleotida gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primer BSP 20A 9. Basil blastn sekuen gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primer HSP 20A 10. Urutan nukleotida gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primer HSP 70 II. Hasil blastn sekuen gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan pruner BSP 70
vii
10 11 11 11 12 12 13 14 15
15 16
DAFT AR LAMPIRAN
Lampiran
Hal
1. HasiI Sekuensing ') Foto PemeIiharaan uIat
22
:::. PersonaIia Tenaga PeneIiti
26
4. SertiJikat Seminar NasionaI
27
s.
28
19
KumpuIan Abstrak Seminar NasionaI
6. Ahstrak Seminar Nasional
29
7. Ahstrak Seminar IntemasionaI
30
8. Abstrak ArtikeI Ilmiah
31
9. Jmal Intem,'sionaI Yang dituju
32
10. Poster
11. Fonnulir evaIuasi atas capaian luaran kegiatan Penelitian
12. MakaIah Seminar Nasional 13. Drat" Artikel Ilmiah yang akan dipulikasi
viii
34
E.\.: 1. ('/NDAHULUAN 1.1. Latar Belakang
Paradigma baru sektor kehutanan memandang hutan sebagai sumber daya yang bersifat multi fungsi, multi guna dan memuat multi kepentingan serta pemanfaatannya diarahkan untuk mewujudkan sebesar-besamya kemakmuran rakyat. Hasil hutan bukao kayu (HHBK) merupakan salah satu sumber daya hutan yang memiliki keunggulan komparatif dan paling bersinggungan dengan masyarakat sekitar hutan. HHBK terbukti dapat memberikan kontribusi yang berarti bagi penambahan de'/isa negara (Rapat Koordinasi Pengembangan f las:l Hutan l3ukan Kayu Oi Regional IV 2010). Hasil hutan non kayu terbesar dim:tar,l11ya adalah benang sutera.
Pivdiiksi benCing sutera dari iahuii ke tahull tidak pefnah
(llcfl1efllihi
ta.fget
yang di rencanakan, selalu mengalami penurunan produksi. (Oepartemen Kehutanan, 20 I 1). Besamya target yang dicanangkan, kemungkinan sar.g2.t suJit untuk dicapai karena mengingat banyaknya kendala yang rl.ihadapi oleh petani sutera.
Kendala utamC1. antma lain banyaknya petani sutera yang beralih ke
komoditi yang lebih menjanjikan pasaran seperti coklat, kelapa sawit dan karet. Kebutuhan benang sutera dllnia mem:apai 118.000 ton per tahun. Irnpor bibit rnerupakan salah satLl l!?aya untuk meningkatkan produktivitas benang sutera di Indollesia yang dalam beberapa tahun terakhir mengalami penurunan yang cukup tajam. Meskipun demikian, upaya impor bibit terse but menghadapi beberapa kendala seperti ceka.rnan (stress) yill'g diakibatkan oleh faktor lingkungan. Ulat sutera impor yang berasal dari negara-negara penghasil
sut~i::o
seperti Jepang, Korea, Thailand dan Rumania, akan mengalami berbagai macam cekaman, seperti suhu. Keadaan ini dapat menirnbulkan ulat sutera tersebut tidak dapat mengekspresikan fenotipnya secara penuh, walaupun memiliki potensi genetik yang tinggi dibandingkan dengan ulat sutera loka!. Suhu merupakan faktor yang sangat mempengaruhi pertumbuhan, perkembangan, reproduksi Clan distribusi organisme.
Pada kondisi lingkungan
yang ekstrim seperti suhu tinggi, organisme berusaha melakukan adaptasi biologis untuk dapat bertahan. (Hochachka dan Somero, 2002; Bhattacharjee, 2008; Kumar dan Tripathy, 2009). Telah dilaporkan bahwa organisme memiliki
1
kel11<m,pUan
untuk
memperoleh
IhermolOlerance
pada suhu tertentu
dan
menimbulkan respon adaptif(Hong dan Vierling, 2000). Ulat,
Bomhyx
mori merupakan
serangga
yang
telah
mengalami
elemostifikasi terus menerus dan telah menjadi lebih rentan terhaelap lingkungan yang mengakibatkan kerugian yang cukup besar terutama dalam kondisi iklim panas. Suhu panas memiliki efek langsung terhadap berbagai aktivitas fisiologis ulat sutera. Secara umum, larva instar awal tahan terhadap suhu tinggi yang dapat membantu meningkatkan tingkat kelangsungan hidup dan karakter kokon. Suhu juga memiliki korelasi langsung dengan pertumbuhan ulat sutera, dim ana fluktuasi suhu yang lebar berbahaya bagi perkembangan ulat. Kenaikan Suhu meningkatkan fungsi fisiologis dan penurunan suhu juga
sutera
khuSl!Snya
eli
instar akhir mempercepat
pertumbuhan
larva
dan
memperpenclek peri ode larva. Di sisi lain, pada suhu rendah, pertumbuhan menjadi lambat dan periede larva akan lebih lama. Suhu optimum untuk pertumbuhan normal ulat sutera adalah antara 20 0 e dan 28°C dan suhu yang diinginkan untuk rentang produktivitas maksimum dari 23°e sampai '2~r)c. Suhu di atas 30°C lallgsung mempengarllhi kesehatan uiat.
Jika suhu beracla di oawc~ 200 e semua kegiatan fisiologis terlambat, terutama di awal instar, sebagai akibatnya, ulat menjadi terlalu lemah dan rentan terhadar berbagai penyakit. Dalam hal ini kebijakan pemasukan bibit unggul dari daerah dingin atau d8.€rah beriklim sec':-;~'.g ke daerah tropis bukan merupakan suatu altematif yang paling tepat. Pada·, :at sutera, fenomena interaksi antara genetik dan lingkungan nyata keberadaannya terutama pada sifat bobot badan, daya tahan hidup dan daya tetas telur (Jakaria et al., 2001). Noor (1996) menyatakan bahwa salah satu pendekatan yang dapat dilakukan untuk mengatasi adanya interaksi antara genetik dan lingkungan yaitu dengan cara membentuk bibit yang secara genetik dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan tanpa banyak mengalami perubabn perfonna. Individu yang mampu menyesuaikan diri terhadap perubahan kondisi lingkungan atau mampu menampilkan lebih dari satu bentuk morfologi, status fisiologi dan tingkah laku, maka dikatakan memiliki kelentJran fenotipik (phenotypic plasticity) yang dikontrol oleh gen.
1.2 Permasalahan Produksi benang sutera nasional yang terus menerus mengalami penurunan diharapkan dapat di tingkatkan dengan memasukkan bibit unggul dari
2
negara-negara penghasil sutera. Keberhasilan dari setiap
str~in
ul,n baru di
lapangan tergantung pada mekanisme molekuler dari sel yang melibatkan gen
heat shnck pro{ein respon (HSP). Peristiwa ini merupakan sintesis cepat protein khusus yaitu protein heat shock (Park et ai, 2008). Protein heat shock (J-lSPs) bertindak sebagai 'mo/ekui chaperone' untuk menjamin kelangsungan hicJup yang lebih baik dalam kondisi stres, termasuk fhermoslress ( Mosser dan Morimoto, 2004). HSP adalah protein yang memungkinkan sel untuk mengatasi masalah protein. Hal ini biasanya terjadi setelah sel mengalami stres, kemudian ben akan clapat mengenali dan mengikat ke sisi yang terkena. Dengan demikian mo/eklli
chaperone mencegah kelompok sisi terikat untuk terlibat dalam interaksi yang tidak pantas dei'lgan kompOileii scluler lairmya, selta i1!eilstabilkdfl
~'fot~in
tdiKdt.
Heal s}wck proteins melakukan peran ini untuk membentuk polipcpjda baru atau protein yang terungkap selama proses seluler normal, sedangkar. yang diinduksi HSPs berfungsi dalam menanggapi
d~naturasi
protein akiba i stres.
faktor KeJutan Panas (HSFs), hadir dalam sitosol, terikat oleh protein heat shock (HSPs) dan dipelihara dalam keadaan tidak aktif. Rangsangan fisiologis ("stres") clapat mengaktifkan HSFs, menyebabkan terjadi pemisahkan diri dari HSPs. HSFs terfosfc:ilasi oleh protein kinase dan terbentuk trimer dalam sitosol. Trimer HSF kompleks memasuki inti dan mengikat untuk memanaskan elemen kejutan (HSE)
oi
wilayah promotor dari gen HSP. mRNA HSP kemudian
ditranskripsi dan meninggalkan inti menuju sitosol, sehingga HS? Mekanisme pertahanan yang dilakukan gen diharapkan
dapat
diterapkan
dalam
H: l
ban-,~
disintesis.
akibat stress suhu ti!1ggi,
mempertahankan
pertumbuhan
dan
perkembangan ulat sutera yang di budidayakan di daerall rropis. Bibit ulat yang dibadidayakan di Indonesia terutama kota medan, berasal dari daerah sub !ropis sehingga akan mengalami cekaman (stress) akibat perubahan sunu pemeliharaan, maka dicoba melakukan isolasi gen penyandi heat shock protein (sHSP) pada ulat Sutera (Bombyx mari) yang diberi stress suhu tinggi. Gen yang diperoleh akan diklon dan ditransformasikan dcngan harapan didapatkan bibit transgenik dari ulat sutera yang tahan terhadap perubahan suhu.
3
i
."' ..,'._ .........~~~M ...
... &t!I.
..... ...
--~
.
I
'~.r-'-T~--·"'-~lp.,~'tt:·~RiJi~I~.'.gthKAAP!' ,\):30 .);;:; .I.,f~'il.~~~.,."
"
po
No.
No.
~,I
---Jt..
'''~k;~:/L;~1~09.\\ q~'m-~A
:;:::~;'= tffj~~~j \~~-;.:;:;:-.-:~. AI ,'; q.:" 'Le:) f S .. ,' lJ .
,,'UI" .".,'
BAH
~L
T:;-UAUAN PUSTAKA
o
':":'::-"'---,
D:IH~I'l:;~~~.
~_._~......... _
.. --., .• r ..
---~---"",-=
-"""-'-~·
Heat shock adalah proses cedera tennal yang disebabkan oleh peningkatan suhu sccara mendadak atau tiba-tiba pada molekul biologis seperti DNA, RNA, lipid, dan lain-lain dari sel yang rentan terhadap stres panas. Hal ini menyebabkan sejumlah kelainan pada tingkat sel. protein.
Pola yang nonnal menghentikan sintesis
RNA transfer dan RNA ribosomal memiliki konfonnasi yang longgar
sehingga menyebabkan degradasi. DNA mengalami kehilangan kemampuan untuk berfungsi dengan baik. Agregasi protein berfilamen pada inti tidak mampu membentuk sitcskeleton sehingga pad a saat yang sarna pH ca:rar. tubuh tunm. Kenaikan temperatur menyebabkan peningkatan energi kinetik dari makromolekul daIl penurunan ikatan ion, ikatan hidrogen serta Van-der- Wals dan meningkatkan
mengalami denaturasi dan akses enzimatik DNA menyebabkan skala besar kerusabn DNA. Stress panas akhimya menyebabkan kematian sel. Efek lain yang paling penting dari teJTlperatur (atau stres dalam bentuk apapun) adalah pada protein seluler. Protein seluler biasanya berfungsi dalam scI, seperti 1) selama sintesis de novo dari polipeptida dan perakitan protein multimetrik, 2) selama transportasi intra seluler dan organel ket:ka protein harus terungkap at<:111 !etap membuka untuk menyeberangi batas kompartemen selulcu, 3) selama atau setelah terpapar stres protein mengalami denaturasi. Pada saat-sm:t dirakit, protein dapat mengalami interaksi yang tidak pantas satu sarna lain atau dengan kOJ.lponen seluler lainnya terutarna pada saat perakitan protein. Hal
lnI
dapat mengarangi protein fungsional dan bersifat sitotoksik (Feder, 1996). Dalam sebuah studi kejut panas pada Drosophila subobscura oleh Digley dan Smith (1968) meJaporkan kelangsungan hidup terus dan aklimatisasi serangga eksperimental pada suhu yang lebih tinggi. Ritossa (1962) melaporkan bahwa dinitrophenol inhibitor metabolisme dan panas disebabkan poia karakteristik dalarn kromosom Drosophila. Hal ini diamati oleh penulis bahwa ketika lar'la Drosophila bergeser dari 27°e menjadi 37°e muncul gen di kromosom politen. Penemuan ini akhimya capat mengidentifikasi gen heat-shock protein (HSP). Pada pertengahan tahun 1980-an, peneliti mengakui bahwa HSPs banyak berfungsi sebagai molekul chaperone. molekul chaperone adalah kelas protein
4
r:/
yang memungkinkan sel untuk mengatasi m&salah protein setelah stres. Dengan demikian molekul chaperone mencegah kelompok sisi terikat untuk terlibat dalam interaksi yang ticlak pantas dengan komponen seluler lainnya, serta menstabilkan protein terikat. Protein stress panas melakukan peran ini untuk membentuk polipeptida baru atau protein yang terungkap selama proses seluler normal, sedangkan yang diinduksi HSPs berfungsi dalam menanggapi denaturasi protein akibat stres. Heat-shock protein diklasifikasikan berdasarkan urutan homologi dan berat molekul seperti Hsp 11 0, Hsp 100, Hsp 90, Hsp 70, IIsp 40, Hsp 10 clan kelompok
protein heat-shock kecil.
Suhu ambang batas untuk induksi Hsp
berkorelasi dengan suhu yang khas di mana spesies hidup. Spesies termotilik
menunjukkan pola karakteristik dan ekspresi Hsp khas (atau non ekspresi) selama berbagai tahap perkembangan, termasuk gametogenesis, embriogenesis dan meta111()rfosis. Respun heat-shock bClnyak dicobakan pada berbagai speSles serangga seperti Drosophila sr. (Tissiers et.ai., 1974; Lindquist, 1980, Gilchrist & Huey 1999; Karunanidhi el af., 1999), belalang Locusla migraloria (Whyard, el al., J986) A l1/jpheles stephensi (Nath dan Lakhotia, 1989), Mandl/ca horrlri'Orm -
Sexta (Fittinghoff dan Riddiford 1990), Sarcophaga crassipalpis, (lopiin dan Denlinger j 990), Lymantria dispar (Denlinger et ai., 1992.). Studi ekspresi stres protein di alam atau sebagai respons
terhad~9
rangsangan laboratoriur ,nasih sedikit diteliti. Meskipun demikian, studi ini menunjukkan bahwa pola ekspresi protein stres dapat dikorelasikan dengan lingkungan species, yaitu sd-sel dan spesies dari lingkungan yang hangat menjalani respon stres pada suhu lingkungan dingin (Lindquist, 1986 , Huey & Bennet, 1990, Sarge et ai., 1995;. Somero, 1995). Sejumlah penelitian telah menurJukkan
bahwa
HSP
bertanggung
jawab
untuk
komponen
besar
thermotolerance (Morimoto et al., 1994). Jika gen hsp dihapus atau dihambat menunjukka'1 penun:nan thermotolerance (Sanchez dan Lindquist, 1990; Craig dan Jacobsen, 1984; Johnston dan Kucey, 1988).
Demikian juga penyisipan
salinan dari gen hsp70 meningkat thermo tolerance pada sel (Li, et af., 1991;
5
Solomon,
el (I/,
1991;. Li dan Duncan, 1995) dan organisme utuh (\Velte,
c[
ul.
1993;. Feder, e/ ai., 1996).
BAB Ill. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN Tujuan dari pene1itian ini adalah : a. Mengisolasi gen heat shock proteins (HSPs) pada ulat sutera b. Membandingkan ekspresi gen heat shock proteins (HSPs) pada ulat yang diberi kejutan panas pad a suhu berbeda. Manfaat penelitian diharapkan : a. Memberikan masukan untuk menciptakan bibit ulat sutera yang lebih tahan terhadap perubahan suhu lingkungan b. Meningkatkan minat dan perhatian serta peran aktif persuteraan alam dalam pemenuhan kebutuhan bibit ulat sutera. c. Dapat rneningkatkan produksi sutera nasional. BAB IV. METODOLOGI PENELITIAN Penelitian menggunakan metode eksperimen dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) ernpat perlakuan dengan 3 ulangan. Masing-masing ulangan tcrdiri atas 30 ulat sutera instar V. Perla..1<:uan terdiri dari kejlltan panas deng3.n suhu 34, 38. 42"C dan kontrol (tanpa kejutan Panas)
Tahapan Kerja a. Peneh;san dan pememlaran Diat Sutera. Bibit ulat sutera diperoleh dari pusat
persu:.~,.Ull1
alam Cantiroto
Temanggung Jawa Tengah. Telur ditetqskan masing-masingnya sebanyak 100 butir. kemudian dilakukai1 inkubasi telur secara baik agar penetasannya seragam. lnkubasi telur dilakukan dengan cam; tetur disebarkan pada kotak penetasao, masing-masing kotak berisikan 100 butir telur dan ditutup dengan kertas putih yang tipis.
Setelah terlihat bintik biru pada telur, kemudian telm dibungkus
dengan kertas karbol hitam untuk menghindari cahaya sehingga diharapkan penetasan dap2.t terjadi secara bersamaan. Telur diamati setiap hari. Tiga hari sebelum pemeliharaan, ruangan dan semua peralatan didesinfeksi dengan menggunakan fonnalin 2-3% dengan cara disemprotkan secara merata. Upaya
6
desinfektan dilakukan untuk menjaga kesehatan larva (Scunsijah dan Andadari, 1992). Setelah menetas dipindahkan ke wadah pemeliharaan. Pemeliharaan
ulat
sutera
meliputi
pemeliharaan
1I1at
instar
I~V.
Pemeliharaan 1I1at instar I-II didahu!ui dengan kegiatan hakitate yaitll pekeljaan penanganan ulat yang baru menetas disertai dengan pemberian pakan pertama. Ulat yang baru menetas (instar I) didesinfeksi dengan bubuk campuran kapur dan kaporit (95:5), lalu diberi daun murbei yang muda dan segar yang dipotong kecilkecil, kemudian ulat dipindahkan ke tampi yang dialasi dengan kertas minyak at au paraffin. Pemberian pakan dilakukan 3 kali sehari. Pacta setiap instar ulat akan mengalami masa istirahat dan pergantian kutikula. Apabila sebagian besar ulat istirahat (90%), pemberian pakan dihentikan dan ditaburi kapur. Pada setiap
perkembangan ulat. Pembersihan tempat ulat, pencegahan hama dan penyakit clilakukan secara teratur. Pada instar I dan II, pembersihan dilakukan masing-masing 1 kali sedangkan instar TIl sampai V dilakukan 2 kali yaitu setelah pemberian pahm kedua dan menjeJang pergantian kulikula.
Desinfeksi tubuh ulat dilaksanakan
:;Etiap kali ulat ganti kutikula dan sebelum pemberian pakan pertama. Setelah ulat memHsuki instar III sampai V, daun yang diberikan adalah daun utuh bersama cabang, penempatannya diselang selingi secara teratuf bagian ujung dan pangkal. Telur ulat sutera ditetaskan pada suhu kamar 28-30 oC dan dipelih2.ra sampai instar
V. b. Pemberian Perlakuan
Setelah ulat memasuki instllr V, diberi perJakuan kejut panas pada suhu 34, 38, dan 42°C serta suhu ruang (kontrol). Setiap perlakuan heat shock terdiri dari 30 larva dan percobaan diulang sebanyak 3
kali. Larva ulat instar V
ditempatkan pada inkubator dengan suhu suhu 34, 38 dan 42°C (terkena heat shock), selama 3 jam, kemudian larva dipindahkan ke suhu kamar untuk masa pemulihan selama 3 jam. Setelah 3 jam pemulihan larva dibedah, semua feses dibuang. Seluruh tubuh dan organ di gems (dihancurkan) untuk dilakukan isolasi RNA total.
7
c. Isoh:,si
!~NA
Total
Sampel (kepa1a larva sutera instar V)
sebanyak 5 g digerus dengan
bantuan nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hnsil gerusan dimasukkan ke ependorf yang telah berisi 1 ml trizol homogenisasi dan lisis dengan pipetting, kemudian divorteks dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 5 men it. Ditambahkan 0.2 ml chloroform, dan goyang dengan tangan kemudian inkubasi seJama 3 menit. Campuran kemudian divorteks dan disentrifugasi pada keeepatan 12000rpm pada suhu 4°C selama 15 menit. Cairan bagian atas clipindahkan ke ependo!f bam, ditambahkw 500).1.1 isoprophy1 alkohol dan cliinkubasi pacla suhu mang selama 10 menit. Campuran clisentrifugasi pacla 12000rpm pacla suhu 4°C selama 10 menit. Cairan clibuang, Enclapan RNA total
4()C selama 5 menit. Endapan RNA total clikeringkan clengan vaccum clryer clan disuspensikan di dalam dH20. Kualitas dan kuantitas RNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang gclombang 260 nm dan 280 nm. Keutllhan R0JA total dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarose 1% di dalam larutan penyangga T AE 1x. Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transiluminator GelDoe (Labquip) setelah div;,amai dengan EtBr (0,5 ).I.glmL) selama 1.5 mel1it dan d:bilas dengan air. Sintesa cDNA Total. Sintesis eDNA total dilakui
1 )11:;
RNA total, 10 pmol oligo(dT), dan ditambahkan dH 2 0 untuk volume total reaksi 20 ).1.1, kemudian diinkubasi di 65°C selama 5menit dan 4 Kemudian ke dalam larutan
~itambahkan
°c
selama 5 menit.
Ix (5xqiagen Kf-PCR buffier, 10 mM
dNTP mix, 5-10 U DNAse inhibitor, 100 U qiagen one step RT-PCR enzyme mix (Invitrogen). Isoiasi Fragmen eDNA HSP dengan PCR menggunakan 3 primer (Tabel
1). Komposisi PCR untuk amplifikusi eDNA HSP adalah l).l.l eDNA, ixbuffef (5xqiagen one step RT-PCR buffer), 2 ).1.1 dNTP mix,lO pmol primer forward, 10 pmol primer reserve, 2 ).1.1 qiagen one step RT-PCR enzyme mix
dan dH 2 0
dengan volume reaksi 20 ).tI. Primer spesifik didapatkan dengan menggunakan software primer 3 (v.OA.O, http://www.frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.egi) (Tabel 1).
8
Tabel 1. Sekuellsing Primer (5'-3') (Li, el ai., 2012) I~~(;~l~-----~~~r
Primer kiri
l'riml:r Kanan sckul:nsing (hp)
I I ISP70
BOlllb)~>: lIlori
ttcagcaggacatgaagcae
atgccggaactgtgactacc
aagaaagacgagcacgggta
tcttcgctctggtccttgat
2.266
GenlD:692xn
J ISP20A Bomb),:,' mori
I 771
GendD:692S9! HSPOI Bomhyx mori
Atgatcgccttagtgttgtgc
Cacttaat\\'cattaattccac
(desail1~'ielldiri)
~-~-~~~~~~~~~~~~~~~~~~~----
I I
_l
eDNA diamplifikasi dengan menegunakan rotor-gene 3000 real-time PCR dengan cara diawali dengan denaturasi pada suhu 95°C selama 90 men it, dan 40 siklus pacb 95°C selama 5 menit dan 58 DC selama 30 menit. Kurva dissosiasi
selama 1 men it, 55°C selama I menit dan temperatur dinaikkan hingga 95
(Ic,
data kejernihan pada suhu 55-95°C interval 80 siklus pada 0.5()C/siklus. BAB V. BASIL YANG D1CAPAl n.
Isolasi RNA Total
Telur ulat sutera ditetaskan selama 10 hari. Setelah menetas dipelihara pacta suhu kamar sampai pada instar V. Larva instar 1 dipelihara dalam petridis plastik yang dilapisi oleh kertas parafin dengan alas tissue basah untuk menghindari pakan daun murbei eepat kering. Ini dilakukan sampai larva mstar III. Setelah larva memasuki instar IV, iarva di letakkan di keranjang atau sagsag sampai instar V (Lampiran 2). Larva instar V sebelum dilakukan isolasi RNA dibagi menjadi 4 kelompok untuk diberi kejut panas dengan suhu kamar, 34, 38 dan 42°C selama 3 jam dan setelah itu dibiarkan selama 3 jam, kemudian dilakukan isolasi RNA. Isolasi RNA total pada beberapa bagian tubuh.
Bagian fubuh yang diisolasi adalah kepala,
kelenjar sutera, kulit dan rectum. Hasil konsentrasi
RNA total pada beberapa
bagian tuuuh larva sutera instar V dapat dilihat pada Tabel2. Dari Tabel 2 dapat dilihat bahwa hasil uji kuantitas RNA total pada bagian kepala, kelenjar sutera dan rectum ditemukan RNA total sedangkan pada kulit tidak ditemukan. Pada kulit teIjadi gumpalan (endapan) putih yang tidak dapat . dihancurkan. Endapan tersebut dapat saja berupa garam karena Isopropanol dapat
9
mengendapkan garam. Isopropanol sering digunakan untuk pr2sipitasi per-tama, tetapi tidal-;: untuk tahap akhir karena cenderung mengendapkan garam. Tabel 2. Kualitas RNA total hasil isolasi dari beberapa bagian tubuh larva sutera (BOl!lhyx mori) instar V dengan spektrofotometer UV -Vis ,.-------'--.
I Organ I--~.----
Konsentrasi ..-.-.-. - .. - . -
ng/~l
absorbansi .-=---=~=====·I
)2601280 -.-.---------c-------------.- -
;'260/230
I
.... -.---. .--- ......-._- - ._,
I<;t:I2al a __1£5_L__ . __ .r---_..J2.~22. __ . _1., 340 I Kepala 2704 1,025 1,275 j Kelenjarslltera 210 1,296 1,010 1 Kulit L-I·:z-e-·c-'~·.tI.-l=n===-_-- .. ---+-----1-9-6----+----1-,3-8-0----t-_===·-0-,9-0-7-==--=-1 I
Tabel 3. Kualitas RNA total hasil isolasi dari bagian kepala larva sutera (Romhyx mori) instar V pada beberapa perlakuan kejut panas dengan spektrofotometer u V - vis .. Perlakuan suhu Konsentrasi ng/~l absorbansi (oC) ;'260/280 1.260/230 -_._---------334 34 1,621 0,097 34 412 1,573 0,128 I 34 416 1,733 0,155 ! I 38 290 0,122 ._-,-1.480 I 38 330 1,634 0,115 I 0,544 1240 38 2,013 .------
r-..
---------
~-~--~-~
b. Optimalisasi Suhu Primer HSP
500 2S~
Gam.bar 1. Hasil PCR Optimalisasi Suhu Primer HSP 70 M = marker; 1 = HSP 70 suhu S20C (kepala); 2 = HSP 70 suhu S2oC; 3 = HSP 70 suhu SSoC; 4 = HSP 70 suhu SSoC
7~O
500
250
Gambar 1.. Hasil peR Optima!isasi Suhu Primer HSP 01 dan 20,4. M = marker; 1 = HSP 01 suhu 52°C; 2 = HSP 01 suhu 50°C; 3 = HSP 20,4 suhu 52°C; 4 = HSP 20A suhu 55°C.
1
M
2
3
4
5
6
500 250
Gambar 3.. Basi! PCR Optimalisasi Sub Primer HSP 20,4 c;:m 70 M = marker; 1 = HSP 20,4 (kontrol) suhu 52 uC; 2 = HSF 20,4 (kejut suhu 34°C) suhu 52°C; 3 = HSP 20,4 (kejut suhu 38°C) suhn S20C; 4 = HSP 70 (control) suhu S2oe; 5 = tISP 70 (kejut suhu 34°C) suhu 52°C; 6 = HSP 70 (kejut ",1hu 38°C) suhu 52°e. M
2
Gambar 4. Hasil PCR Optimalisasi Suhu Primer HSP 01 M = marker; 1 = HSP 20,4 (kejut suhu 42°C) suhu 50°C: 2 = HSP 01 (kejut suhu 42°C) suhu 52°C
nasi! PCl "::':12 disekuensing
750 500 250
2
3
M
Gambar S. Hasil peR dengan primer HSP 01; HSP 20,4 dan HSP 70 . M = marker; I =HSP 01 (750 kb); 2 = HSP 20,4 (250 kb) dan 3 HSP 70 (250 kb).
=
c. Reserve Transcriptase PC:R
Setelah clilakukan sekuensing dan dianalisi:: untuk primer HSP 01 dapat dilihat pad a Gambar 6. AfGACCCGCCCTl'AGl'GTTGTGCGGACTGCTGGCGGCG(iTCrCGC iCCCiCC; CCAC AGTA CIACCI\ TGGCTCGTC ACATTGGCCGTA TC A CCAfTA CCiACCC CnCAGTCCTTACGTTCGGGI\AAGCATGTl'GGACAC ACATTCGC["[TC;(I'[' CCAi\CCTfGCCAACGAAATGCAACACTIGGAC/\ACATGATGAAGGAGCn; 'rCGTTGAAGTTCCCCAGCATTATAAACGAAGGACGCGTGGAAGC;CGACAf... GTA1'CAGA TATCTATTCACCTGCCTGGTTAC(Ji\ACAGAA. \GACAiCl\/\CG TGAAAGCGAAAAA'fGGAGTGCTGATGGfGCAGGC!'AACAGH;CrTrTAXl' CATf'ACTTGJ\ i\AATACAGAACCrTCCCTGGGATGTGAATTCCGAAGGCAG CTGGGTTTACGAGAAAGACGTCn TGAAAATCACCTTCCCGCTGAAGCAAA AGCAG(TA(iAGGATAGCAAGAGGCCAGITGCAGAGCCCACTGAGACGACC TCTACGAATGTAAGTCGTGAAGAGATGGAGTTCACCACCGAGAGCAACGT GCGGGACCrlTGACGTCGGCTTGGAGACAGCCCAGAA GACCAATGAGATCG CGAAAGCTCJ']'AGAAGCGACCACGTACGCfGTCAACATCAGAGACGATGC(i GAGTTCTTGCCGATTCCATATTAA TfTGA TCAAAT ATAAATGTGAGAATT AATGTATfAAGTGGGGCCAACAACTAAGGGCGATCATAATA
Gambar 6. Urutan nukleotida gen HSP larva sutera (Bombyx mon) dengan primer HSP 01
homolog terbaJap Bombyx mori heat shock protein 25.4 dengaJ1 r-: value (J.D (llH:-: identity 9 C)%)
~epertj
pada Gambar 7.
i:·i::ribli'tion of3 Blast Hits on the Oue-r'l Se-quence ~ .
Sequences producing significant alibrnments:
1219 1219
%% 00
99% rTf.
m~ 121~
rnli
1-"1)/ :tl I( t.":~;t ;:~~;).Ji
~J'O
00
i93 i93 9-\% 0.0 59%
~'u1 '.1::;%:::.1
.;(\~ i:iG4:~jni:::~i4, i
Gambar 7. Hasil blastn sekuen gen HSP larva sutera (Bambyx man) dengaf1. primer HSP 01 Hasil sekuensing daJ1 dianalisis untuk primer HSP 20.4 dapat <.lilihat pada Gambar
8. ACAAGA1'ACCAGCTCTTCACGGGGAGATCA GCATCACAATTAGAAAAAAAAAGCACCCTACAACCCCCATGACCCAATAC AAG'I'CTCCTCCTfAAAAP..AACAAGITACTG'HACTCTTHACGGIT AGGG GCCGCGGCCCGTAACA'HGGTCAGGGGCCGGCTGGGCCTTCITACTHAG CCAGAGGGGATGGTAITCGGTAACCGGCCGGGGITGAAGITGCCGAAITC
13
CCTTCIT1!C!~lCiJC'TCTAjAnT[AIAjjTG(i'lATA(i(iG[i\/\c(iTL\i
/\AAAI/\Ti\/\']'('["]"["IC1'AGTAi\GATITGJ'AALi\GGG(jCJ"IC/\CCA/\CAA1' AAACi\C('ACACiCiA['ACl'C'fC),}'GTT1GArl'ATAAl'/I:IAI'1\A(il\A( ;;\I\,'\I\AC AAGA!\CACJ'lArrCrrCGC'['C'['GGTCCTfGATCTCC11'GCGAACC;GCiACCG CTJ'CI'Ci'IC;C(i,\TGGGCACCT[TCTCTCTCCCTTGACGGCGTC(;CiGC1\('("["1' CCTCGCiCC;C/\Ci'l'C;ATGGTGAGTACCCCGTCTGATGACA(j'rCGCGA[TCCA CAGTCrCACiGC(iCCGCGCCTCAGGCAGCGCCnAAC(il'C GGACGA;\CrC3CCTTGAAATATACCCC]"['CTCGTCrl"rcn"1'AAAAACC("Ie:; GI'C]'TG'I"I"I'CCCCCTGAAAAAATACATCACCGAAAA(JCGACCACCGTGI'G GIAITJA]"I GIGGCiTG/\TCCCCCTATTATAGCGCTACTAAl'AJ\/\/\ACCTA A'['/\ 1Tf]1\'lAI'CGI'JAI'CCT
Gambar 8. Urutan nukleotida gen IISP larva sutera (Bombyx monj dcnga:l primer HSP 2004 Hasil anal isis blastn (\\\\\\,ncbi) gen HSP larva sutera dengan primer !-ISP 20A homclog terhadap Bombyx mori heat shock protein 20.4 mRNA dengan E value 3e-l05 (max identity 99%) seperti pada Gambar 9,
Distribution iA9 Blo:st Hits on the Ou~r:i Sequence > -- --
-"------- ---
-----------------_._.._-_..-- -
------~--
_._- ---_..- --------
---
.
--~.
-------_.
~--
.. - -----
:FJ602772 BDITJbyx morl~ea~sho_~k prot~in 20il (Hsp~O',8L~£l!~~_~_~f'0.:~,~,==3§_f:~2.413:9§
-'-
14
-
,-:----' .' "' It Mlu~t'~puil··,~;·~· Io~ ;......... "-'''"'--,,
-,
1
~,.~'"
!
[iesc1~tion
f~jt
TG!~: Qi~S;"'~
su/e
SCU€ ::';C';?f
:m :m.
23%
~.,r
'"'("'01
Jlj
375
fjlf)
:'~jt\'ERStTASSU".TERAUTARf' i
r
1,lue
' !'[CeSSiOn
Ijerl
If) S~lC5 cqlll
,/
_~
3!i-1ffi Jl%
375 375 23% 3e-1O::
S{l%
~lr'"II~;-~
......
~..
,~.i· ~i:::t·l=51 ':F::y1~~!
1
~_:i~,~~~7~
1
1.1 Pj.J
~'3%
2e-S6
J"j.J
~
LJ~'o
'"'fj":
2e-S6 97%
}:J
?(3
23% 2e-S6 57%
X-J
X3
"(j!).! ~Ij /1)
2e-% 1Ji%
~~::
l51 l51
'-'JI)l
5e-93 %%
:£:JG,~I~'31
'X-'j
X>J
!...J~
7e-iQ L 34B 34B 73'" Ifj
Ci70i ...;.' .'0
r)r-l}.f
;:ell
! ).
~
\
C!C1 :::;8::,14 "
5;') 'j ,
F,.!~iC;278fl
1
Gambar 9. Basil blastn sekuen gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primer HSF 20.4
Hasil sekucnsing dun ::maJisis untuk primer HSP 70 dapat dilihat pada Gambar 10. TCCCCCCGCn'AGC;Gl'ATTfCCTCTCTTGTTfCTT1TfCTGGACiAAAfv\TA CCCCI'CTGCJ'1Tl"l'X!T]"lvIAC]'l'CAAATCACAGTTTfTTCAGCAGGACA']'G AAGCACTGCiCCC1TCAAAGTGATCAACGACTGCGGCAAACCGAAAATACA GATCGAGrTCAAAGGTGAGACGAAACGA lTTGCGCCAGAAGAAATrAGCA GCATGGTGC]'GACAAAAATGAAGGAGACGGCGGAAGCCTATCTGGGAAGT ACAGTGCGGGATGCGGTAGTCCAG1TCCGGCATAAAAAACCAG'l'GCTGGT CTGTCTTATATCAACAGGGTGTTTTTCTCCTrr AAA T AGACA TACCCGAA AACGGACrACCGTGTGGGGGATAGCG1TGATGTGTCCrATArTATC1'TI'C CACCAAGAAAATCTAATAITATAITTGGTTATCCITGCACAAGGTATATA AGGAGAGATT AGGGGAGAAG
Gambar 10, Urutan nukleotida gen HSP larva sutera (Bombyx morrJ dengan primer HSP 70
15
.
homolog terhadap Bombyx mori heat shock 70 mRNA dengan E value 5e-96 (max identity 99%) seperti pada Gambar 11.
Query ~
I
80
1
Ss~:ct: ~
I,: ~ ",~
240
160
320
400
Se!~cted:O
Mal Tctai GLfri E idBn1 ·;core score (C',a !'a~Je
,Atcession
Y.h 15 47% 2s-g,; 93%
'.>
JiJ Y.h .p' tiC 2&-94
.F8;:6794.1
E
E
47~
g)%
10 33%
~i!)~9)}~29 :
2&-9-\ 93% .·BQ353261
E ?8i 47% 1fr-92 :ll% l()
,-1,1
1~i7
100%
:~J:,t:
004']34096.1
>11( CD~91S:BD. ~
J8 :;m 27% 2eill 513% WI '7252.1 6,ih .U
57.6
1Hr,.
~liC
54.7 547 6%
1&D7 76% tC206C851 O(lJ1
100% CPOOO874.1
Gambar 11. Hasil blastn sekuen gen HSP larva sutera (Bombyx mori) dengan primer HSP 70
16
8/\.8 '.II. RFl,:('AN/\TAHAPAN I3ERIKUTNYA
Basil sekuensing akan dianalisis dan ditentukan panjang gen yang dapat kemuclian akan clidaftarkan untuk member nama atau kode gen HSP yang didapat Harapannya untuk penelitian tahun kedepan akan diusulkan untuk melanjutkan penelitian . Setelah didapatkan gen HSP, akan dilanjutkan cloning dan ekspresi gen masing-masing perlakuan kejut panas atau suhu yang berbeda yaitu 34; 38; dan 42
()c.
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN Ditemukan gen HSP yang beda dengan yang telah ada sebelumnya, dimana L1lat sutera yang selama ini diisolasi gen HSPnya berasal dar! daerah sUbtropis.
7 I 2 bp homolog terhadap Bombyx mori heal shock prOle ins 25.4 dengan E value 0.0 (max identity 99%). Primer hsp 20,4 berukuran 535 pb homolog terhadap
Bomhyx
lJ10ri
hee!t shock proteins 20A mRr:A dengan E value 3e-105 (max
identity 99%) dan primer hsp 70 berukuran 240 pb homolog terhadap Bombyx
mori heal shock proteins 70 mRNA dengan E value )e-96 (max identity 99%).
DAFTAR FUSTAKA
Bhattacharjee, S. 2008.TriCldimefon pretreatment protects newly assembled membrane system and causes up-regulation of stress proteins in salinity stresspd Amaranthus lividus L. during early germination. J Environ. BioI., 29
Craig, E.A., and K. Jacobsen. 1984. Mutations of the heat- inducible 70 kilodalton genes of yeast confer temperature-sensitive growth. Cell 38:841-849. Denlinger DL. Lee RE, Yocum GD and Kukal O. 1992. Role of chilling in the acquisition of cold tolerance and the capacitation to express stress proteins in diapausing pharate larvae of the gypsy moth Lymantria dispar. Arch. Insect Biochem. Physiol., 21:271-80. Dingley F, Maynard Smith J. 1968. Temperature acclimatization in the absence of protein synthesis of Drosophila subobscura. J Insect Physiol., 14:1185-
94.
17
Dep:,,·tc:n ;(;, ;~ehutanan. 200 I. PCl1Injilk I'rukris i'enguj/oi1 dun K!as[jikasi All/Ill
F:o/cOf} Departemen Kehutanan. Direktorat Jenderal dan Perhutanan
Feder. !\L L:. 1996. Ecological ond evo!lItionCll:V ph.vsiology of stress proteins and rhe sIress re.ljJonse: the Drosophila me/anogasler model. In Animals and Temperoture.· Phenotypic and Evo/utionar.v Adaptation
10
Tcmpero/ure
Eds. lA. Johnston and A.F. Bennett, Cambridge University Press. pp.79102 Feder, M.E., Cartano, N. V., Milos, L., Krebs, R.A. and Lindquist, S.L. 1996. EfTecI of engineering Hsp70 copy number on Hsp70 expression and tolerance of ecologically relevant heat shock in larvae and pupae of
Fittinghoff. Cl'd and R iddiford, LM. 1990. Heat Sensitivity and Protein synthesis during heat shock in the tobacco hom worm, Manduca Sexta. J Compo
Physioi, B 160: 349-356. Gilchrist. G. \\I. &
Huey, R.B. 1999. The direct response of Drosophila
melanogaster to selection on knock-clown temperature. Heredity, 83: 1529. Hochachka. P.W. and Somero, G.N .. 2002. Tn: Biocheli1ical adaptation, Oxford University Piess. New York Hong, S. Vi. and Vierling, E. 2000. Mutants of Arabidopsis thaliana defective in :tcquisition of tolerance to high temperature stress. Proe. Nat. Acad Sci. USA, qv, 4392-4397 Hue}, R.B. & Bennet, A. F. 1990.
Physiological adjustments to fluctuating
thermal environments: an ecological and evolutiormry perspective. In Stress Prot~ins in Biology and Medicine, ed. R.I. Morimoto, A. Tissieres &
c.
Georgopou1us, pp.37-59. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring
Harbor Laooratory Press. Jakaria, el ai., 2001. Evaluation Of Phenotypic Plasticty On Silkwonn Bombyx
Mori L. Under Hight Temperature. Zuriat, 15 (2) : 170 Johnston, R.N., and Kucey, B.L. 1988. Competitive inhibition of hsp70 gene expression causes thennosensitivity. Science 242:1552-1554
18
Jopiin K H.
"J!)
(ind Denl inger, D.L. 1990. Cold shock elicits expression of heat
shock proteins in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis . .J. Insect Physio/., 36:825-834.
Karunanidhi. S; Barclay', JW; Robertson, RM; BrO\vn, IR and Atwood, HL. 1999. Neuro protection at Drosophilla synapsis conferred by prior heat shock. The Journal qlNeuro Science, 19:4360-4369.
Kumar, G. and R. Tripathy. 2009. Influence of heat stress on genome of grass pea
(Lalhyrus salivlls L.) . .J. Environ. Bioi., 30, 403-408 Li, G.c., L.G. Li. Y.K. Liu, J.Y. Mak, L.L. Chen, and W.M. Lee. 1991. Thermal
response of rat fibroblasts stably transfected with the human 70-kDa heat shock protein-encoding gene. Proc. Natl. Amd. Sci. 88:1681-1685.
correlated with rapid degradation of bsp70 during recovery. Eu .... J Diochem. 231 :454-465.
Li, J; S H. H. i\'fC'::',haddam; X. Du; B-x. Zhong and Y-YChen. 2012. Comparative analysis on the expression of inducible HSP::; in the silkworm, Bumhyx fIlori. j'vfoi. Bioi Rep. 39:3915-3923.
Lindquist S. 1980. Variying patterns of protein synthesis in Drosophilla during heat shock; implications for regUlation. Developmental Biology, 77:463479.
:'v'[osser, D.O. ,md R.L Morimoto, 2004. Molecular chaperones and the stress of oncogenesis. Oncogene, 23, 1105-1116 Nath BB, and Lakhotia Sc. 1989. Heat shock response in ovarian nurse cells of Anopheles stephensi. J. Biosci., 14:143-52. Noor RR. 2006. Gene!ika Ternak.Cetakan pertama PT. Penebar Swadaya. Jakarta Park, E.M, Y.O. Kim, RH. Nam, HJ. Kong, WJ. Kim, SJ. Lee, Y.J. Jee, l.S. Kong and TJ. Choi 2008. Cloning and expression analysis of a small Hsp2G gene of Pacific abalone (Haliotis discus Hannai). J. Environ. Bioi., 29, Ritossa F. 1962. A new puffing pattern induced by a temperature shock and DNA in Drosophila. Experientien, 18:571-573.
19
Sanche:,.
Y.
,me!
S.L.
Lindquist.
1990.
HSP104
required
for
induced
thermololerance. 5;cience 248:1112-1115 Sarge. K. D., Bray. A.E. & Goodson, M. L. 1995. Altered Stress response
In
insects. Na/lire 374. 126 Santoro, M.G. 2000. Heat shock factor and the control of stress response. Biochem. Pharmaco/., 59, 55-63
Solomon. 1.M., 1.M. Rossi, K. Golic, T. McGarry, and S. Lindquist. 1991. Changes in hsp70 alter them10tolerance and heat shock regulation in Drosophila. New BioI. 3: II 06-1120. Somera. G.N., 1995. Proteins and temperature. Annu. Rev. Physioi., 57: 43-68. Tissiers !\,I'vlitchell HK and Tracy UM. 1974. Protein synthesis in salivary glands
84:389-398. Welte, 1\1.A .. 1.M. Tetrault. R.P. Dellavalle, and S.L. Lindquist. 1993. A new method for manipulating transgenes: en;ineering heat tolerance
In
a
compiex, multicelluhr organism. Curreri! Bioi. 3:842-853. Whyard S, Wyatt GR and Walker VK. 1986. The heat-shock response in Locusta migratori1 . .1. Compo Physiol., 156B:813-817.
20
1. i-Iasjl sekuenslng
•
I
~: ,_P,;
'/',
,,,:
c.,:~
.'
L
..
'.
" '.:".j .. r., ••. ', ' ...
: .-'.'
.-'.,
.'t'l.
;-;
i,
II"
;:j
,1
1
"--------~. peR Primer BSP 70 R ;;:.(J'C·i H:·j' M
:·:.:7_~.1~
7;,1
_.
:-:>J'
_
'~I
~
j ;.i!".:
(til ~.':P ,':' ri.\~' .\ .'
-
- -
~',
"
",i11
'L
(1 I.! i;j
"
'r
- 'i,'-',:,;':;
;.... f;-
1011
I~ r'
n.:,'t;.:::
~.:rj;;'-
Jij Jl :' G;:(;li:nnl!';'Ti
r)l
..~;·i·
::1 :r~:
, :-__ .... t
......:j~~_--..i~_;~~~~; i~' _ _~_
;;til i'J . ~;;t~t.: .. I
v ... P.:
:...1 Ie ji..i::'. " . : I I
peR Primer HSP 70 L
\~
,
'\
.:'
'"
I,;
,
tBl I I
I I
;"!i:!
~~!
:'~
I
):
ij;}:'
,~G
i ,. j
~:u
'.~~·~·"U.,l
.
.~.,,)
'a;ill,~",
:1: .-
j'~
,-------- __ ._.
.. _--_._.
__._--------------_...-
,"":1 ..'·
"","
..'
'.,
_....:.~ ..':.'. t '. l' ~'.'~
..;.:
;.
"
Hi '.[1' <".1
. !I
""
""
.,. "
,;
,;,
,;
: ~ '.
.. J:'I.,.
10.1 .. (;, '-
.'1
,;
l;i :"J;
~.J.,I
,r
;
1 'j
..
,--=1
T
:. --
'j--
-_ .
:~"
'Tn
.:::~
.:.:.j
~al
j
" .- "
r n-=-,-',
"
,'1
l';a;
IT
,';
'.~·r{;r
ell ::;
.L. __ ..,.~_~__
.L~ _____ .!- _ _ _ _ _ . '_I.. __. _ ____
,:.;.
",'
nru
n~;.,,~.-
J.
J. J l.l 1 1'-'1
'-.1'-
; !.:....
!
UCD
".'
A D
')fi
..;..v.,'.1.'-
.I. J~Jl
1 .~: ••\'_.;' __ ' • _. ,};' ',,"
1.1,
I
!, ....!., •
_.
'j
.,'"
,'1-
(j
;, :':.t
I')
"-.',,- r,"".
•... '" r:
,
J" G
I'JoJ
,;;;-....
'U,
11.1
...·;,1
;""
:.:
r(·(· -
i
~,'J -:i'~~:;':::;
T':
~y
·r:;G<:O.:-;.:;rr,:&
.:;r
.:~
!;'}
'~i
"",
::' 1
i
:1\:
:....
.
T0Tr:-T1':;:T~-1l"
;-:'",.",
I
- - - -
(.::~I':
.~ .•,::.j','.II.T(
~,.'.
~,.:o;;;:-G-·.:-T·'r:-n-rT-:"'"":"
',-'
!-'!~
7:"iO"I'::
T..:L:"7::;;
I.;r·;
...:;.:;,.;; .",';-'';.''(;('.'' '.'T
~h 7::-::'"·:'!~.:aT:::
0
_ ~ :';\"7:J<:;",
,.:;-r
.;
,cr
I. . ~-'
li,:;:-n'l: ~
~~."'j
:-';"Tl':rr
~---------------------------------------------~ peR Primer HSP 20,4 L
22
, '" I
---.-------..
--.~---------~--~~-------------.~------.-.---.--".,.--,~:--C'1'="c:".,
!. ' . , f
....:":-_,.'.
".'.-.:."
;·· .. i' ...
:.
:-."'.~
:~.'-. ~
1
"-'""~'!
,.~", •
'1'
'rl
.
.' ~!, '
":.,--.
'f"
.'_'_ CI,.,
t.,.;': J
,;.;
;"
:". ",:.
I:...
1 I. i
Ill.
. {;.
I'
II'
(,,".!
':i(l',
,~,;,:,
' •. '...
-'-' j:
I :
'""J
(j
F:
,;.
III
I
• •:,
1:\
+>
'.11,
L _____~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~_~~~~~~~~~~~~
peR Primer IISP 01 F '""":.f'· 'Jl':'.-. "'_".'.' i', ;: -:
'.; ;,-:.",';
'"
I'
':.1
t·..,;
11;
"
l'.J.I<j
''''-.JI'.·.t"
'."j.!
1'"
I
- 'I:' '-,
"-"
::....
J'.:
.c ... ;r.;:·;:-'
- r:-","r
.
:H t;;
~;;?I'
:W
;,f"'T'
"
::'-T;-;-~"'.;
'
",
-0' ",;,'
1
.
. __ ....:-"--_....:...'--- ... _~~'- __ L.o_~ ~:,.- .......:....:................ --..J._...;.'...J. __ ~ ..----L.J...-'-_""...:.........-. ...
(0-_:::"
,',oj
.'~
-,;T -;- ,:;;,
,,.
,,~
1]." 1,,1'
-.
1',;11"
':::1 ~
. ·;;T T C;,:;;
.... ,-,:,
,,~;
:;',',:::;
'':''':';1.'. I ~I
I J I ,,-
>:,,;:
"OT'.','}!":-
~".
SI
7~·~f'Gt'·::'
"":[;('7"TT,":'",-;
peR Primer HSP 01 R.
23
,'(~t ••
~-"
r·
-r"';-:~l
~~.
,'''4:1'
:.1<, t __
-~:·
_-'-._ .... l!.. __ ..
':;;1
4-"'A (i
rn
r.:;:;: ::T,::
r,.'rf":"''''
r
~::;;
...::c.z,,""7.:'r;r
,~
-. T' ,'-
Lampi;'!J1
larva instar
;1
Larva Instar V
Pemeliharaan Ulat sutera
1 JfV2 ~';lcngokon
Kokon Larva Sutera
Larva istirahat
Ngengat kawin
i ocllilpir,\i; 3_ Personalia Tenaga Peneliti ----_._,-:-
1-1'00_
i Na;;1~-/NTD~N
i,
!I
I Instansi
ir- --- -t-----;--_·_! --- -- -! 1- i Mas1tta
I
i Tcmjung/
i
i 00 I 00971 0 I
h--~----: i NurhasnI M uluk
____ L ____~ ___ _ I 3_ I~ Imam J\ulia
Alokasi Waktu
Uraian
Asal
Ilmu
(j am a/m inggu)
Tugas
Biologi
Fisiologi
24
Peneliti
Hewan
Biologi
I --
~
----~-
Bidang
I Biologi
Laboran
12
Mahasiswa
12
Membantu -----
26
I
utama
I
l __ ~_, ______________________ _
I
I
~lembant~ ----
_ _ _ _ _ _. . ...,_ _ _. . . . . . . . . .
... _ . , ......
~._,·
'V_:O""'o.!U""~"
..
~....,..,....,.,
...
3L1OIi!)
_
;.".~
;. .•••J
-~ "--~----
. --...
~---~---
. "1
~..0
..
t>l
~~
..,Jt\; oq;:;;;j
~~
O~ -..., Vj~
~~.:.:
In fil
PAI)A KEGlAl'AN SeMINAR NASIONAl HIOI.OGI DAN PEMBELAJAHANNYA
I,
~'"
E.l
~
~
c:: z
..-,;;;;:::,:::" ..
~~ ,~
:;: -ti1
b
DENGAN TEMA : "B10DlVEHSITAS, KO:-JSEHVASI DAN BIOTEKNOLOGI SEllTA PEMBELAJARANNYA"
I
//~\~~:JiA.'~Ll'forUNIMED' II~",,' ,"" .' "'..•, ",\~
//'( ,.'
(:)
\.'
",
-
.. "'c"""'~"
-
\t.:':/ . , ~.(-~'~-' i .-- - ,~ ..-, r..,I!IJ~'~..~[!}\ \\ -, ,., }~~,. ..;Z'r~/.,- :''." ';'/" ' \ , .Pr.ot'. 1i.'.lr8; .J\lQ~ll\lIl M.Sc, Ph.D
_ [!I, r:.:,
KET!JA PELAKSANA,
\'\:..:~~~_Hl~908051986011 001
,i~-:-7 ..'\:.) )
1,'
•
•
C
j'
~ ~
ell
z
m III :':!
',\
•
Prl)f. Dr, rer nat. Bluari Manurung, M.SI NIP. 19640404 198903 I 006
Vl (ll
3
5'
..,
~
Z
::>:> Vl
~
ttl
I
;0;-
~
e.
o
PEMAKALAH
-'
::.l
o·
litas Partisipasinya Ssbagai :
i
n
!!!
:cIn
I
Q::",
V}
~ if.
tl
..,J!Ii:
lI..l
;l;I
til
MASITTA TANJUNG, S.Si. M.Si
O!;.l
!. S2 tel
~1 ;
It1
.::i ~
.
.jC~
r,'-"
::: /t1
DifJ"dilCln f.<spada :
\,.; ~ ~
, .ts
j,
~: ~
~
teerttftkat
H+:! ~ I ' c::t:
i-;
);.
it~ii ~
.
-.", .
,.,..".'-""".,.--_~~,.
~~)
~
'."
!
__
JURU8AN BIOLOGI FArmL'l'AS MATEMA'fIKA DAN ILMU PENGE'l'AHUAN AllAM UNIVERSiTAS NEGERl MEDAN
.. ' ,S::
-....J
.,.....-~!
I
I Il;,
'V
•
~
HI !:I );>
?:
~
L.;:ilipir("l1 ).
;
SEMINAR NASIONAL BIOLOGI DAN PEMBELAJARANNYA
28
Kumpulan Abstrak Seminar Nasional Biologi dan Pembelaja!2nnyCl Meclan. 23 A9ustus 201-4
r:>,;:TS still usc synth~::ic f'-''S':cidcs in use at the plant. Synthetic pesticides have higher prices than p'CSlicide pb.llt. Bot;:mical ?Co:sticides also reduces environmental pollution. waste jengkol can be ~..::d for vegct:lble fungicides because jengkol mateg~ls containing secondary metabolites. The i'"ij,;on of EM-4 on waste jengkol to increase the content of organic carbon, phosphorus and
C~,-,"'ords
: citrus. jengkol waste. phylophlhora.
t.M~
ABSTRAK (,:cmoditas buah jeruk di Kabupaten Karo mengalami penurunan produksi setiap tahun. Produksi tw..h jeruk yang menurun diakibatkan serangan penyakit tanaman pada jeruk yang berasal dari ~elompok jamur phytophthora. Jamur phytophthora menyerang batang tanaman jeruk sehingga ;r.:rturnbuhan claun dan pembungaan tanaman jeruk menjadi terhambat. Phytophthora juga ;nenycrang buah yang masih muda yang mengakibatkan buah menjadi gugur. Saat ini, petani jeruk ::!iasih menggunakan pestisida sintesis dalam penggunaan pada tanaman. Pestisida sintesis merniliki narga yang lebih mahal dibandingkan pestisida nabati. Pestisida nabati juga men gurnn gi peneemaran lingkungan, Limbah jengkol dapat digunakan untuk bahan fungisida nabati karena ~engKoi menganciung senyawa meiaboiii :;eKulluel. Femrrnbahau EM-4 paJa 1i:mbah je,.gkul wit-uk meningkatkan kandungan karbon organik, fosfer dan kalium. Kata Kunei :jerok, Iimbahjengkol. phylophlhora. EM--I
BG-29 ISOLASI RNA TOTAL LARVA SUTERA Bnmbvxmori LEPIDOPTERA: BOMBICIDAE HASIL PERSILANGAN LOKAL (C301) Masitta Tanjung,' Maryani Cyeeu TobiItg,LSyafnlddin !lyas l dan Danna Bakti2 Il)e~emen Biologi. Fakultos Matematilra :lan I1mu Pe~getahuan Alam, USV. JI. Bioteknologi No. I Kampus USU Padang Buian Medan- 20155 Telp. 061-82223564
e-mail: [email protected] 2Departemcn Hama dan Penyakit Tamrnan, fakultas Pertanian Universitas Sumatera Uta.--a,
ABSTRAK Bombyx moTi merupakan serangga memiliki nilai ekonomi ringgi, yang telah mengalami demostifikasi terus menerus dan telah menjadi lebih renta."J. terhadap Iingkungan yang men£akibatkan kerugian yang cukup besar terui:ama dalam kondisi ikiim panas. Untuk melihat teIjadinya perubahan dalam tingkat genetik dilakukan penelitian mengCflru lsolasi RNA Total ~"V'b.~.J~lltftU'..Rnml;\IY.mnt'i.lJ>~~ntern : Rombicidae Hasil PersiIanga."'l Lokal (C30l). Penelitian dilakukan di Laboratoriurn Terpadu dan Fisiologi Hewan FakuliaS Matematika Ibn!! Pengetahuan A.1am Universitas Sumatera Utara.. IsoJasi RNA Total diJakukan pada stadiwn larva instar V dari jeberapa organ tubuh larva meIiputi kepala, kelertiar sutera, kuIit dan rectum HasiI penelitian nenunjukkan bahwa lsolasi RNA tora] hanya ditemuJr.an pada kepala, kelenjar sutera dan rectum ;edangkan kulit tetjadi penggupalan kapur dan dari hasil Nanodrof tidak terdeteksi adanya RNA :otal. Jadi tidak disarankan isolasi RNA total dari lmlit la.-va sutera Bombyx mori.
Kata kunci : Bomb)'X ",ori. RNA, kulit larva
Juru~~n Biologi FMIPA Universitas Negeri Medan 7ietJk-~~
Lampiran 7 ;\bstrak Seminar Internasional
Isolation of heat shock proteins gene (HSPs-gene) in the silkworm, Bombyx mori (C301)
l'vIasitta Tanjung,l Maryani Cyccu Tobing/ Syafruddin lIyas l dan Darma Bakti2
I J)"parImcnt of lJioiogy, .Iac"ity (!f mathematics and natural sciences, University of Sumalera !flara, Aledan indonesian JI. 13iorekl1ologi No.1 K:unpus USU Padang Bulan Medan·· 20155 Telp. 061-82223564 e-mail _ masiltatanjung!Qlvahoo.co.id ] J )Cl'orllllcnl o/"Pesls (lnd Planl Diseases, Faculty of Agriculture, University of Sum a/era TJlara, Medon Indonesian
ABSTRACT Isolation of Genes Encoding Heat Shock Proteins (HSPs) in the Siikworm (!Jombyx muri C301) performed by RT-PCR method. Primer on the design ofa gene bank based on data T-ISPs genes in the gene J->ank. HSPs gene isolation begins with the isolation of total RNA derived from silkworm larvae head of the inst::tr V. The results showed that HSPs gene fragment with a length of 750 kb. Based alig!1ment HSP gene fragments with gene banks homolog to Bomhyx mori of heat shosk proteins gene 25.4 with E value of 0.0 (max identity 99%).
Keyv\'ords: Bombyx mori, HSPs, gene isolation, sequensmg
30
MIUX PERPUSTAIlAAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
ISOLATiCN /~t{D CHARACTERIZATION OF THE HEf(HSPs) iN THE SILKWORM Bombyx mori FROM LOCAL INBREEDING
E~
MasiHa Tanjung,t Maryani Cyeeu Tobing/ Syafruddin Ilyas 1 dan Darma Bakti 2 J
Depar!ment ojBi%gv, /aculty 0/ mathematics mzd natura! sciences, Universit;v o/SllInalera Utaru, ~lfedan Indonesian ./!. iJio/ekl1ologi No, I Kampus USU Padang Bulan Medan- 20155 Telp, ()61-82223564 e-mail .. lI1asitlulal1jul1.?lii.1.ohoo.co.iei .. /)"p{)rlmen.' i'r.'Sfs and Plant Diseases, Faculty 0/Agriculture, University of Sum at era Utara, ,\1edrln Indonesiaf)
Abstl'act Temperatures have a direct effect on various physiological actIvItIes silkworm. Heat shock proteins (lISPs ) to act as ' molecular chaperones' to ensure better survival under stress conditions, including thermostress. RNA isolation performed in the Integrated Laboratory Animal Phys i ol0gy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences University of Sumatera Utara. Total RNA Isolation fifth instar larvae stage on the head and then homogenized with trizol ,deproteination and removes lipids with chloroform, phase separation with isoprophyl and wa<;hed with alcohol 75 % and total RNA precipitation was dried in vaecum dryer and resuspended in dH20_ Isolation of cDNA fragment of the HSP by peR using primer 3 QiAGEN ampiification wear one step RT-PCR (Invitrogen ). Totai RNA has been Isolated dnd used a'> template for eDNA synthesis by reverse transcription. Nucleotide sequence analysis showed that the primer hsp 01 has a si~l: uf 712 bp homologous to Bombyx mori heat shock proteins 25.4 with E value 0.0 (max 99 % identity). !>;:'imcr hsp 20.4 sized 535 bp homologous to heat shock proteins of Bombyr; mori 2C.4 mHNA with E value of 3e-1 05 (max 99 % identity) and primer hsp 70 size 240 bp homologous to Bombyx mori h:at shock proteins 70 rnRNA with E value 5e-96 (max 99 % identity). Keywords: Bombyx tnori, JISPs, gene isolation, sequensing
31
Inlematiornf Jcxlmal of Pham-e slid Bio Scie::ces
i" '\ 1NTERNATIOf'.,.:·\i. i OlJtZ7'~AL
'L?R~ \.....
INTERNA TIONALL. ... INDEXE D JOURNA l
.-"
ISSN 0975 -6 299
~
*Impact Factor = 2.9S8
i ';O,i€'1 Cr1..JQ
aEl1vEr'~'
S'r'stEr:l
N.2 r!~)te(h;-joto9v i' ~ti::. n,,:~ ac C::"Ot;'~'
!nt';:-ri1ational Journ21...;rf
r.
[:·;0
Scie nc~s
;:::JE1r;-.!~
[) ~:<" r"n12 CGt;::1osy
:1, ;-,2i'/tlG:d ?r-,2rm~(v
cher7'1lstr}'
f'1011?CUJ 2':r t,i<)l ~J'-:::..,'
practice
i\jeurobi rjlN1Y C ytOl0QY
j'-·i 2 Ur 2.1
c r~e;";1 istry
Indexed in Elsevier Bibliographic Database leV Value is 4.53 *Vi5it i nstrucuons to ;'.lJthors :-" ,,', - ~_ '. l'
;~:
....
~.
32
.. -, :: j: '.:
r :,
.:,
i-,
Click here for details
:;'2/4/2014
'sc.':;,si
~;e,!
penyandi heat shock proteins (HSPs) ulat sutera (Bombyx morl) hasil persilangan lokal
. . . . . . 2.. I.Jnra:.t DIddeotid:a g.. HSP tar-wa ~ {8D/ttt:byx nIOri ~n ~_01
""'~','"",.',';;;',',,,,",","':',', ./0,,; .,;' ""'"
,"
.
.
"-.
.
~. ~.:
.:.'
.. . .. . .' ., ' .
........ K.,q..~.
.
••
Pemuh8an urat sutera..dengan
""en9t1ktifk~ ~1"t;SIS protein aIlfbat stres
"., : ",:" L __ ~" __,,_,,,, __ ,,_
.;
".'.'.,':-
c..---,'-,',: ""----;
- Perlak~an neat shock j stress [ suhu lin99i pacta Larv.a sutera
..
20-"
Ga.:INw 3.. ...;....... -*Ieot:ida _ _ HSP bnra s.vtanI , prior.er _
. - ". >,,"'.:-,",:::>.'::=-:
! Penetasa.. Tolur lpe.neliharaan larva
j'
(1:NNGbpr ~ deng;ut.
r
-----....------!
I
IsoJasi RNA
l~!'~
~ !~ra9m~n ~ttr.
!~DNAj' L _____ _
HSP
...:.ra_,.._HSP01_ 20..4_ ...... _-'-"""""_20-".--
':~~_~---..,........".-ri_ _ _ 25A_E.-D.DI_ "'-tity 99%)0 _ _
~ __ ......... 70 _E _ --,E_ :>'-i11![ (._ ideootily99%'_ . . ._ - ......_ 70 __ _ 99%) _
.,
':-~~ ~_< ~ ?jIe~~~T.a.ggi ~ DIICn):png ~ ~ ~ iIIi meIaIIii PeiIc5diIr.,., DiSert:asi JJOktor 2014
1 33
FORMtJLJR EVALlJASI ATAS CAPAIAN LUARAN Kl<:GIATAN
Ketui1
MASITTA TANJUNG S.Si., M.Si.
Pergmuan Tinggi
Universitas Sumatera Utara
.Iuclul
: Isolasi gen penyancli heat shock protein (HSPs) ulat sutera (Bombyx mori) hasil persilangan iokal PCllelitian Disertasi Doktor
Skema Waktu Kegiatan
: Tahun ke I dari rcncana I tahun
Lnaran yang clircncanakan dan jumlah capaian No
Luaran yang Direncanakan
Jumlah Capaian
CAPAIAN DISERTAI DENGAN LAMPIRAN BUKTI-BUKTI LUARAN KEGJATAN j.
Pi.TBLiKi\Si iLMiAE Keterangan
!~rtikcl
jurnal kc-l. International juurnal of Pharma and Bio Science
Klasifikw;i jurnal
Internasional
Impact factoriurnal I
-
Nama.jurnal yang dituju
2.96
--
ISOLA nON AND CHARACTERIZATION OF THE II E\ T
Judu} clrtikcl
I
I,
SHOCK PROTEINS GENE (IlSPs) IN THE SILKWORM
, Bombyx mori FROM LOCAL INBREEDING
I
Status r:.askah
Draf artikel
---
I
I
I ------'
I
2. BUKU AJAR Keterangan
3. PEMBICARA PADA PERTEMUAN ILMIAH (SEMINAR/SIMPOSIUM) Keterangan ~.
Pcrtemuan Ilmiah kc-l. Judul Makalah
I
-----j
Isolation of heat shock proteins gene (HSPs-genc) in the silkworm, Bombyx mori (C301)
34
Nama Pertcmuan llrniah
First Annual International Seminar an Trends
il~
I
Science
~mcl
Science Edugation Tcmpat Pclaksanaan
Mcdan
Waktu Pclaksanaan
12/512014 12:00:00 AM
Jcnis Pcnel11l1an
lntcmasional
Status naskah
Sudah dikirim
I I --
--
Pertemuan I1miah kc-2.
Judul l'vIakalah
Isolasi RNA Total Larva Sutera Bombyx mori Lepidoptera: Bombicidae Hasil Persilangan Lokal (C30 1)
Nama Pertcmuan Ilmiah
Scmir.ar Nasional Biologi Dan Pcmbelajar;..nnya
Tcmpat Pelaksanaan
Medan
\Vaktu Pclaksanaan
8/23/201412:00:00 AM
Jcni!' Pcrtemuan
Nasional
Statlls naskah
Sudah dilaksanakan
.-
I 4. SEBMJ1\[ PEMBlCARA. KUNCI (KEYNOTE SPEAKER)
[
I
Keter_a_n::::ga_n_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _-----'
5. UNDANGAN SE3AGAI VISITING SCIENTIST PADA PERGURUAN TINCiGI LAIN
L
I
Keterangan
G. CAPAJAN LUARAN LAINNYA
~ Capaia"
---~I
Uraian
II - 2014
;rlj1 TANJUNG S.Si., M.Si.)
35
ISOLATION OF HEAT SHOCK PROTEINS GI':,Nl<~ (HSF's) IN THE SILKWORM, Bombyx mori FROM Cantiroto (C301! Masitta T:mjung,l Maryani Cyccu Tobing/ Syafruddin Jlyas 1 dan Danna Bakti 2 /})cparlmCil! ()/lJ/%gy.Iacu/ry of lnarliell1utics and l1atural sciences. (:llIversiry ofSulI1atero {,'{(Iro. Mi·doll !m!()nCSIfIli .JI. BiOiCk!7%gi !Vo. 1 Kamplls USU Padang Bu/an Medon 20155 7(>/p. 061-822235(,4
e-mail:
nl
.: Ue,!larlnu..:n! (~lPe,(;IS und Plant IJiseascs. Faculty of Agriculture, Universify
qr.\~urn(l!eru U{oro, .\,fi..:don IndonesIan
Abstract Temperatures have a direct etTect on various physiological activitIes silkworm. I leat sh('ek proteins ( liSPs) to act as ' molecular chaperones' to ensure better survival under stress conditions. including thcrmostrcss. RNA isolation performed in the Integrated Laboratory Animal Physiology. Faculty of Mathematics and Natural Sciences University of Sumatera Utara. Total RNA Isolation fif1h instar larvae stage on the head and then homogenized with trizol, deproteination and removes lipids with chloroform, phase separation with isoprophyl and washed with alcohol 75 % and total UN A A~A
.~
_
nt"'~i"inlt'_tf'''' ya __ at' .... _ ... -
n.l-:lC
~.-...
,1r1P,l _ .. ,, __ in .....
"~£""'1lT'n .. ~_ .... _ .......
'~.."rP"l" ""-".J.........
A ...... .,..'O:::"("lIH· ...... ..,...,.rI.t-... A ...... J.J._'""""
F). ...... ~.-.
J~p
~LJ..1 .....
,n ]'11'\ """.I. J._'-".
1£"..,.1,~+:, .........
l..:J\.JIUl,.l\Jll
,,,r
\'.1
~I~).,T 1\ '--'1./1'4" \,
fragment of the IISP by peR using primer 3 QIAGEN amplification wear on..: step In-peR (Invitrogen ). Total RNA has been isolated ano used as template for eDNA synthesi:, by reverse tracseription. Nucleotide sequence analysis showed that the primer hsp 0 J !'la.,> a size of 712 op homologous to heat shock proteins of Bombyx moTi with E value 0.0 25.4 (max 99 % identity). Primer hsp 20A -sized 535 bp homologous to heat shock proteins of Bom!;y., mori 20A mRNA with E value of 3e - !O5 ( max 99 % identity) and primer hsp 70 size 240 bp homologous to fJomhyx mari heat shock proteins 70 mRNA with E value 5e- 96 ( max 99 ~·o identity). Kcywords: TJombyx l71ori, HSPs, gcnc isolation, seqllcpsing
kemungkinan sangat sulit untLlk ·jicapai karen a mengingat bar.ya;';nya kt':l1dala yan~ dihadapi (lkh pctani suter:!. Kcndala utama anlara lain bo.nyako; a pctuni ~Ulera :' ang beraiih ke komuc!iti yang lcbih mcnjanjikan pasaran scperti cokiat, kelap'l sawil dan KareL Kehlltuhan hcnang sutera dunia mencapai lI8.0()O ton pn tah'.lll. lmpor bibit merupakan sabh satL! upaya untuk meningkatkan produktivitas bcnang sutera di Indonesia yang daJam beberapa tahun terakhir mengalami pcnurunao yang cukup tajam. Meskipun demikian, L,paya imf'Of bibit ter~ebut mcnghadapi bcberapa kcndaJa seperti cekaman (stress) y,mg diakibatkan oleh faktor lingkungan. Ulal SU(I::ra impor yang berasaJ dari negara-ncgara penghasil sutera seperti Jcpang, Korea, Thailai1d Jan Rumania, akan mcngalami berbagai macam cekaman, seperti suhu. Kcadaan ioi dapat menimbulkan ulat sutera tersebut tidak dapat mengekspresikan fenotipnya sccara penuh,
PENDAHULUAN Paradigma baru sektor kehutanan mcmandang nuta.'1 sebagai sumber daya yang bersiCat multi fungsi, multi guna da."! memUal multi kepcntingan serta peman faatannya diarahkui' untuk I'newujudkap sebesarbcsarnya kcmakmuran rakyat. Basil hutan bukan kayu (rn-!BK) merupakan salah satu sumber daya hutac yang m-::miliki keunggulan komparatif dan paling hcrsinggungan dc:ngan masyarakat sekitar hulan. fIHBK terbukti dapat mernberikan kontribus: yang berarti bagi penambahan clevisa ncgara (Rapat Koordinasi Pengembangan Basil Hutan Bukan Kayu Di Regional IV 2010). Hasil hutan non kayu tcrbesar diantaranya adalah benang sutera. Produksi benang sutera dari tahun ke tcthun tidaic pemah rncmenuhi target yang di rencanakan, selalu mengalami penurunan produksi. (Dcpartcmen Kehutanan, 2011). Besarnya target yang dieanangkan,
1
wuJaupun mcmiliki pOlcnsi gcnclik yang linggi dibandingkan dcngill1 ulat sutera lokal. Suhu mcrupakan I~lktor yang sangat pcrtumbuhill1, mcmpengaruhi pcrkcmbangan, n:produksi dan distribusi organisme. Pada kondisi lingkungan yang ekstrim sepcrli suhu tinggi, org<misme hcrusaha melakukan adaptasi hiologis untuk clapat bcrtahan. (llochachka dan Somero, 2002; Bhattacharjce, 2008; Kumar dan Tripathy, 20(9). Telah dilaporkan bahwa organismc l11emiliki kemampuan untuk mcmpcrokh fhermotolerctnce pada suhu tertcntu dan mcnimbulkan respon adapti f (Ilong dan Vierling, 20(0). tJlat, Homhyx mori merupakan scrangga yang telah mcngalami dcmostifikasi " ' _ " " __
r _
___
" ________
."
.1 ___ ...... __ l_L
____
._~_
.1: 1_1_:L
l\.....lll;') JIl\,...lHAU;') Ulllt lClilll IlJCl1JaUl lCU1Jl
Dalam hal ini kcbijakan pcmasukan bihit unggul dari daerah dingin ulau dacrah beriklim sedang kc daerah lropis hukan merupakan suatu alternatir yang paling lqXll. Pada ulat SUlera, JCnomena interaksi antara gcnctik dan lingkungan nyala keberadaannya lerutama pad a sitat hohol badan, daya lahan hidup dan daya tetas lclur (Jakaria el aI., 20(1). Noo[ (1996) menyatakan bahwa salah satu pendekatan yang dapat dilakukan untuk mengatasi adanya intcraksi an tara gcnctik dan lingkungan yaitu den gar, Cal J membe'1tclk bibit yang secara genetik dapal menyesuaikan diri dengan lingkungan tanpa hanyak mengalami peruhahan pcri'orma. Individu yang mampu mcnycsuaikan diri lerhadap pcruhahan kondisi lingkungan atau III<1JlJPU IIICII<1lf1pilk,llI lc1Jill uari ~(llu llcllluk morfologi, status fi~j,)I"gj dan tingkah laku, maka dikatakan mcmiliki kcl cntu ran fcnotipik (phen')()pic plas! icily) yan~ dikontrol olch ge'1. Produksi benang sutera nasional yang tcrus mencru~ mengaia111i penurunan diharapkan dapat di lmgkalkan dcngan memasukkan bibit unggul dan ncgara-ncgara penghasil sutera. Kehcrhasilan dari sctiap strain ulat baru di lapangan tcrgal1lung pada mekanisme molckulcr dari sel yang melibatkan gen heat shock pro rein ~espoll (HSP). Pcristiw:i ini mef 11 !,ahm sintcsis ccpat protein khusus yaitu protein heal shock (Pa!"k et ai, 200R). Protein heat shuck (l-ISPs) bcrtindak scba~ai '!l1o!ekllf chaperone' untuk menjamin kclangsungan hidup yang lebih baik d::;.lam kondisi sli'es, termasuk thermosfress ( Mosser dan Morimoto, 2004). HSP adalah protein yang memungkinkan scl untuk mengatasi masabh protein. Hal ini biasanya terjadi setelah sci mengal3lT!i stres, kemLidian gen akan dapa! mcngenali dan mCllgikat kc sisi yang terkcna. Dengan demikian mdekul chaperone mcncq;ah kclompok sisi terikat untuk tcrlibat dalam interaksi yang tidak pantas dengan komponen seluler lainnya, serta mcnstabilkan Hea! shock proteins protein terikat. melakukan peran 1111 untuk mcmbentuk polipeptida baru atau protein yang terungkap
_ .._ ... __
Il,;llU.tll
lcrhadap lingkungan yang mcngakibatkan kcrugian yang cukup bcsar tcrutama dalam kondisi iklim panas. Suhu panas memiliki cf~k langsung lerhadap berbagai aklivitas fisiologis ulat sutera. SCC''Ia umum, larva instar awa! tahan. tcrhadap suhu tinggi yang clapal mcmbantu mcningkatkan ti:1gkat kclangsungan hidup dan karakter kokon. Suhujl1ga mcmiliki korelasi langsung dcrlgan pertumbuhan ulat sutera, dimana fluktuasi suhu yang kbar berbahaya bagi pcrkembangan ulat. Kenaikan Suhu mcningkatkan fungsi fisioiogis dan pcnurunan suhu juga akan menurunkan kegiatan fisiologis. Peningkat,m suhu sc1ama pcmc!iharaan ulat sut~ra khllsusnya di instar akhir mempereepat pertumbuhan larva dan memperpendek period.:; larvL!. Di sisi lain, pad a suhu rendah, pertumbuhL!n menjadi lumbat dan peri ode larva akan lebih lama. Suhu optimum untuk pcrtumbuhan 0 normal ulat sutcm ad3lah antara 20 e dan 28°C dan suhu yang diinginkan untuk rentang produktivitas maksimum dari 23°e saInpai 28°C. Suhu di atas 30 0 e langsung mewpengaruhi keschatan ulat. Jika suhu 0 berada di bawah 20 e semua kegiatan fisiologis terlambat, terutama di awal instar, sebagai akibatnya, ulat menjadi terlalu Iemah dan rentan tcrhadap berbagai penyakit.
2
pcningkatan ;:ncrgJ kinctik (bri makromolcklll dan penurllnan ikatan 1(111, ikatan hidrogcn serta V ::ll1"lkr- Wals cLm mcningkatkan interaksi hidruj"ohik terschUl yang akhirnya sc1 menjadi hancllL Pr(llcin mengalami dcnaturJsi dan akscs en/innl d, DNA menychabl-::.m skala hesar kcrusakan DNA. Stress pana~ akhirnya menyehahkan kematian scI. BAHAN DAN METODE Pcnclitian menggunakcm met,)(\c cksperimen dengan Ranec,ngan ;\clk Lengkap (RAI.) empat pcrlakuan dengan 3 ulangan. Masing-masll1g ulangan tenliri alas 30 ulal sutera instar V. Pcrlakuun tcrdiri dari kcjutan panas dengan suhu 3·L 3~. 4:2"(, dan kontrol (tanpa kej utan Panas)
sclamu [iroscs scluler normal, scdangkan yang diinclllksi llSPs herlungsi dalam mcnanggapi dCTwl11rasi protein akibat stres. Faktor keiutan Panas (HSFs), hadir clalam sit()~ol, tcrikat oleh protein heat shock (lISPs) dan dipelihara dalam keadaan tidak aktiL Rangsangan fisiologis ("stres") dapat mengaktilkan HSFs, menyehabkan tcrjadi pcmisahkan diri dari JISPs. HSFs tcrfosr;xilasi oleh protein kina')e dan terbcntuk [rimer dalam sitosol. Trimer 11SF kompleks mcmasuki inti Jan mcngikat untuk mcmanaskan elemcn kcjutan (I-ISE) di wilayah promotor dari gcn IISP. mRNA llSP kemudian elitranskripsi dan meninggalkan inti mClluj u sitosol. schingga I-ISP baru elisintcsis. ivickanisITlc pcrlananan yang dilakukan gen IISP abbat stress suhu tinggi. diharapkan clapat elitcrapkan elalam mempcrtahankan pcrtumbuhan dan pcrkcmb,mgan ulat sutera yang eli hudidayakan di daerar. tropis. Bibit ulat yang dibudiJaY2;~an di Indonesia tcrutama kota medan, berasal dari daerah sub tropis sehingga akllil mengalami eekaman (stress) akihat perubahan suhu pemeliharaan, mab dicoba melakukan isolasi gen pcnyandi heat shock protein (sI-ISP) pada ulat Sutera (Bomhyx mori) yang dihcri stress suhu tinggi. GeD yang dipcro1ch akan diklon dan ditransformasikan dengan harapan didapatkan bibit transgenik dari ulat sutera yang lahar' terhadap perubahan suhu. i:-kat shock adalah proses cedera termal yang dlscbabbn oleh peningkatan suhu secara mendadak atau tiba-tiba pada molcku! biologis scperti DNA, RNA, lipid, dan lain lain dari sel yang rentan terhadap stres panas. Hal ini mcnyebabkan sejumlah kdain:.m pad::! tingkat sel. Pola yang normal mellghcntib.n sintcsis protein. RNA transfer dan RNA ribosomal memiliki konfonnasi yang longgar sehingga menyebabkan dcgradasi. DNA mengalami kehilangan kemampuan untuk berfungsi dengan baik. Agregasi protein beriilamcn pada inti tidak mampu membentuk sitoskelcton sehingga pada saat yang sarna pH cairan tubuh turun. Kenaikan temperatur menyebabkan
Tahapan Kcrja
3
ependorf yang telah [,eJ'l~J 1l1; trill)1 homogcnisasi dan lisis deng;) dan disentrilugasi pada l2000rpm pada suhu 4{)C sc1ama 5 lllenit. I:ndapan RNA total uikuingkafl ucngan vaeeum uryer UCR enzyme mix (Invitrogen). lsolasi Fragmcn eDNA I IS]> dengan PCR menr,gunakan 3 primer (Tabc1 I). Komposisi peR UJ1tuk amplifikcsi cDNA HSP adclah 1 III eDNA, lxbutTcr (5xqiagen or.e step RT-PCR buffer), 2 ill dNTP mix, I 0 pmol primer forward, 10 pmol primer reserve, 2 ill qiagen one step RT-PCR enzyme mIx dan dH 2 0 dengan volume reaksi 20 Ill. Primer spesifik didapatkan dengan menggunakan software primer 3 hltp:!/www.frodo.wi.mit.cdwcgi(v.OA.O, bin/primcr3/primer3 www.cgi) (Tabcl I).
campllran kapur Jan kaporit (95:5), lalu dihcri dalln murhei yang muda dan segar yang dipotor,g kccil-ki.::cil, kcmudian ulat dipindahkan kc tampi yang dialasi dcngan kertas minyak ataL! parallin. Pcmbcrian pakan dilakukan 3 kali schari. Pada setiap instar ulat abn mcngalami masa istirahat dan pergantian klllikula. A pabila scbagian besar lllat istirahat ()()';;;'), pcmbcrian pakan dihentikan dan ditaburi Kapur. Pada setiap akhir instar dilakukan pcnjarangan dan daya tampung tcmpat discsllaikan dengan J1i..:rkcmlxmgan ulat. Pcmbcrsihan tempat ulat, pencegahan hama dan penyakil dilakukan sccara tcratur. Pada instar I dan II, pcmbersihan dilakukan masing-masing 1 kali sedangkan ~
. __ .... _..
JlIMi:U
IT T
.•
III
~i..IlllpUI
1: T
V
.1' 1
1.
1
UIIUII.UII.Ull
".
1
.:.
II.Ull
1 •
..
y
setclah pcmherian pakan kedua dan mcnjelang pergantian kulikula. Desinfcksi lubuh lllal dibksanakan setiap kali ulat ganti kutikula dan sebcl um lJcmberian pakan pertama. Selcl·,l, lllat memasuki instar III samr:li V, claun yang diberikan adalah daun utuh bersama eabang, pcnempatannya disclang sclingi secara teratur bagian ujung dan pangkal. Tclur ulat sutera ditetask2.n pada o suhu kamar 28-30 C dan dipclihara sampai instar V. h. Pembcrian Pcr!aku;m Setclah illat memasuki instal' V. dibcri pcrlakuan kcjut panas pada suhu 34, 38, dan 42 0(' scrta suhu ruang (kontro!). Seti<1p perlakmm heal shock terdiri dari 30 larv,t dan pcrcobaan diulang sebanyak 3 kali. Larva ulat instar V ditcmpatkan pada inkubator deng
Isolasi RNA Total Sampel (kcpala larva sutera instar V) sebanyak 5 g digerus dengan bantua!1 11itrogcn eair eli dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan dimasukkan ke C.
4
Tahcl I. SCkucllsing Primer (5'-3') (Li,
ef
0/.,
l()ll) --~------·~"'-""-,",~"n-
Pnm~r K>in:lll
l'kur:.1It
G,·t)I!).(,~1...'l;:;::
7"71
IISI>f)1 B,>mbyx :non
cDNA diamplifikasi dengan l11enggunakun rotor-gene 3000 real-time PCR dcngan cara Jiawali dengan denaturasi pada u suhu 95 C sclama 90 mcnit, dan 40 siklus paJa 95 DC sclama 5 mcnit Jan 58°C sc1ama 30 mcnit. Kurva dissosiasi hasil PCR menggunakan program rotor-gene dengan soHware analisis G.O : 95°C sc1ama 1 menit, 55°C sclama I mcnit Jan temperatur dinaikkan hingga 95 "C, data kejernihan paJa suhu 55-95°C interval 80 siklus paJa () .5°c/sikl us. HASIL DAN PEMBAHASAN a. lsolasi RNA Total Telur ulat sutem ditetaskan sclama 10 hari. Setclah menetas dinelihara pada suhu kamar sampai pada instar V. Larva instar 1 dipc1ihara Jalam pctridis plastik yang dilapisi olch kertas pardin dengan alas tissue basah untuk menghindari pakan daun murbci cepat kcring. Ini dilakukan sampai larva ins tar III. Setclah larva memasuki instar IV, larva Jj lctakkan Ji kenmjang atau sagsag sampai instar V (Lampiran 2). Larva instar V scbelum dilakukJ.:
Lndapan tcrschut Japat sajn hcrupa gar~!111 karena Isopropanol dapat mcngendapkan garam. Isopropanol scring digunakan llnlllk prcsipitasi pcrtama, tctapi tida/( llmuk lahap akhir karcna ccnJcrung mcngcmlapkan garam. Tabel 2. Kualitas RNA total hasil isolasi dari hchcrapa hagian tuhuh larva sutera (Bomhyx mori) instar V dengan spektroroto~_l:t~!J.!_y~yi~__ _ Organ
Konscntrasi ng/lli
Kcpala Kcpala KcJenjar sutera Kulit Rectum
ab~orbansi
/,260/280 1Jl99 1,025 1.296
1656 2704 210
196
i260/2W 1.3-+0 1.275 1.0 I ()
l.380 _____.J!:907 _
Kualit"s RNA total lwsil iso!asi Jari hagian kcpala larva sutera pada hehcrapa sllhu pcrlakuan dapat dilihat pada Tahel 3. Tahc1 3. Kualitas RNA total hasil isolasi dari bagian kepala larva sutera (Romb.vx mori) instar V paJa bcbcrapa perlaku
KOIisentrasi ng/)ll
34 34 34
334 412 416
1,621 1,573 1,733
0,09: O,l:g 0,155
38 38 38
no
l.-t:m
330 1240
L634 2,013
0,122 D.l 15
absorhansi ).26()/280 ).260/230
0.544
b. Optiml\iisasi Suhu Primer HSJ>
500
2.S-0
Gamhar
Ulasil PCR Optimalisasi Suhu Primer 70 M = marker; 1 = IISP 70 suhu 52°C (kcpala); 2 = HSP 70 suhu 52°C; .3 = IISP 70 suhu 55°C; 4 = HSP 70 suhu 55°C.
nsp
Hasil peR yang t1isekutnsing
750 SOO
250 150 500
250
Gambar 2. I !asiJ PCR Optimalisasi Suhu Primer liSP 01 dan 20,4. M = u marker; I = IISP 01 suhu 52 C; u 2 == I !SP () i suhu 50 C; 3 = IISP 20.4 suhu 52°(,; 4 = IISP 20.4 :iuhu 55°C. M
I
2
Gambar 5. Ilasil PCR dengan prin1l:r liSP 01; IISP 20,4 dan I lSi} 70. rvJ == marker: I =IISP 01 (750 kh):::2 = liSP 20,4 (250 kh) dan 3 =c liSP 70 (250 kh).
123456
c. Reserve Transcriptase peR Sctclah dilakukan sekuensing dan dianalisis unluk primer liSP i) i dapat di1ihat pada gamhar 6. SC,~
250
Gambar 3.
I !asiJ PCR OptimaJisasi Sllhu Primer IISP 20,4 dan 70 M = marker; 1 = IISP 20,4 (konlrnJ)
suhu 52°(,; 2 = IISP 20,4 (kejut suhu 34°C) suhu 52°C; 3 = HSP 20.4 (keiut suhu 38°C) suhu S2°e: 4'= IISP 70 (control) suhu 52°e; 5 = HSP 70 (kejut SUhl] 34°C) suhu 52°C; 6 = ~ISP 70 (kejul suhu 38°C) suhu 52°e.
.,
. . -
..
2 ~
.
.. _. ..: .. .. ... _. .. .
Gambar 4. lIasil PCR Optimalisasi Suhu Primer HSP 01 M = marker; 1 = HSP 20,4 (kejut suhu 42uC) suhu 50°C; 2 = HSP 01 (kejut suhu 42°C) suhu 52°C
ATGi\CCCGCCCI'!';\(iTGTICn\iCCiCii\C TCiCTGGCCiCiCC;( iTCICC;C;CCCiCC i CCACAGIACI ACCAI'GGC!C(j'! C/\CJ\'I' TGGCCCd'AICACCl\"I'I'ACCiACCC C"ITCAGI'CCI"l'ACGI"!'CCiGGAAACiCA"!' GTTGGACACACATI'CGC]"JTGG!' CCAi\CCTTGCCAACGAAA1'C;C.'\!,CAC TIGCiACAACAT(;t\TCiAA()CiACiCTG TCC;'Ji'Gi\\CTfCCCC '\(JCAj"J.\'!J\AAC GAAGGACGCGrGGi\i\(;CiCGACAA GTATCAGATA!'CIAJ"rCACCrGCCTClG ~rTACGAACAGAAAClACATCAACCJ
TGAAi\GCGAAAA.A]'GGAGTGC]'GATG (,nGCAGGCTAACACn'GC!VnTAAJ' C\TTACTrGAAAAIACAGAACC!'[CCC TGGGAfGTGA1\'ITCCGA,'\GCCAG CTGGGTfTACGAGAAAGACGJ'CiTrGA AAA TCACCTrCCCGCTGAAGCAA/\ AGCAGCCAGAGGA[,AGCAAGAGGCCA GITGCAGAGCCCACTGAGACGACC TCTACGAAI'GT AAGTCGTGAAGAGAI' GGAGTTCACCACCCiAGAGCAACGT GCGGGACGTTGACCnCGGCTTGGAGA CAGCCCAGA.AGACCAATGAGAJ'CG CGAAAGCTGTAGAAGCGACCACGTAC GCTGTCAACATCAGAGACGATGCG GAGTrCTTGCCGAl~rCCATATlAAI"I"I'
GATCAAATATAAATGTGAGAATf
protein 20A mRN;\ dengan i~ value 3e- J 05 (max identity 99%), Ilasil sekucnsing dan analisis untuk primer HSP 70 dapat diJihat pad a Gambar 8.
,\AIC;'IAITAlJ ;T( i( ;CiGCCAACAACTA A(JG( ;CGA1CATAATA Ciambclf (), UruUln lluklcotida gcn llSP larva sutera (Homhyx mori) dengan primer liSP () I
'j'CCCCCCGGTAGGGl,;\l"j'ICCI'CIC'I"I' GT1TCTTTTICIGGA GA AAAATA CCCCTCTGGrTTLI\'I"lT'l'!ACirCAI\Af CACAGTTTn"I'CAGCAGGACAIG AAGCACTGGCCCTTCAAAGTCiAl'CAA CGACTGCCiGCAAACCGAAAATJI\CA GA TCCAGITCAAAGGTGAGACGAAAC GA'l'TTGCGCCACiAAGAAA'I"jAeiCA GCATGGI'GCTGACAAAAAIGAACiGAG ACGGCGGAACiCCrAfCI'e;C;GA,I\Gf ACAGTGCGGCiAI'(iCCiGLI\(i'!CCAUn' CCGGCATAAAAAACCAG'I'GC!'CjGJ' CTi..;TCTTATATCi\/\CAGGGTGTTi"i'i'C TCCTITAJ\AT,I\GACAI';\CCC(jAA A;\CGGACTACCG'IGl'GCiGGCiAIA(JCG 'I'TGAl'GI'G'I'CCIAI'J\TfAI'Cl"!"lC CACCAAGAAAArCI'AAIXrjAIAj"I"I'ej GTTArCCTfGCACAAC;CiTATA'TA AGGAGAGATTAGGGCAGAA(j Gambar 8. Urutan nuklcotida gen liSP larva sutera (Bomh}'X mori) Jengan primer IJSP 70
I Iasil anal isis b1
/'1~r,,-,rr'~I'
j-\~ 1 '11
A
,,'l'"l~/
,r1 v-I ..... '-C~ . .~
A / " ' ' I /-."......,..., A
r"' /--.,,r-.
11\\." 1 ~ 1 1 1 11\'-"U\.J 1 1 /,H,JU\.J
GCCCiCGGCCC(J'I'AACATTGG'f'CACiGG GCC(lGCTC)(iGCCI'ICI"j'ACTJ''['I\G CCAGAC;(JCjCiAI'GG'I'ATTCGGTAACCCi GCCGGG\ i'rI'GAAGI"rGCCGAATrC CC1'J'C'I'TI"I'Crl'C;'I'CTCTATA1TnAT ATlTG(jTAI AGGGfAACGlTAT AAAAJ'A!'AAI'("I"I"I"I'Cl'AGTAAGATTT CJ'l'AAI'ACiGGt...:;CTTCACCAALAAT AAACACC\Cl,GGATACTCTGI'GTlTC; Id"IAIAAIAJATAAGAAGAAAAAC AAGAACACnAl"I'Cl"l'CGCTCTGGfCCT TGATCTCCITGCGAACGGGACCG Gl'CrGrCiCGA'!'GCi(1CACCfrTCrC['C'I' CCCI"lGACGGCC;rCGGGCACCTT CCfCGGCGCAGIGAfC:;GTGAGT1\CCC CGTCTGATGACAG'{ CGCGA TrCCA CAGTCTlAGGCGCCGCGCCTCAGGCA GCGCGTAACGTC ClGACGAACTGCCTTGAAATATACCCG TCrCGI'CITfCTTTAAAAACCCTG Gl'CTrGTTfCCCCCTGAAAAAATACAT CACCGAAAAGGGACCACCGTGTG GTA1TTATTGI'GGGTGATCCCCCTATT ATAGCGCTAC'lAA'l'AAAAACCTA ATATITTA TA TCGTTATCCT Gambar 7. Urutan nukJeOlida gen HSP larva sutera (Bombyx mcri) dengan primer HSP 20.4
Hasil analisis bl
Hasil analisis blastn (www.ncbi) gen HSP larva sutera dengan primer HSP 20.4 homolog tcrhadap Bombyx mori heat shoek
7
DAFTA.R PUSTAKA Bhatu!charjec. S.
Craig.
littinghor:. ()vl and I
2008 .'lri adimc I eJn rn:tr','~ltrncnt protects newly as~ernhled membranc system anu causes up-regulation of stress protcins in salinity stressed i\rnaranthus lividus L. during early germinati(ln . .!. Fnviron. Riol .. 29 1:./\., ,mc! K. Jacobsen. 1984. rv1utatilH1S or the heat- inducible 70 kilodalton genes or yeast confer temperature-sensitive grmvth. Cell 3~:X'!I-S49.
Denlinger DL, Lee RE, Yocum GD anu Kukal O. 1992. Role or chilling in ,he acquisition of cold tolerance and the capacitution to cxpress ~lIe~:-,
pruleifls
III
UiCl[lClUsing
pharatc larvae (ll' the gypsy muth Lymantria dispar. Arch. InseC! iJiochem. Ph.vsiol., 21 :271-30. Dinr)cy F, Maynard Smith J. 1968. Tcmperature acelirnatizatiun in the ~,bsenee of prokin synlhe~is or Drosophila subobscura. J Insecf Physiol., 14: 118)-94. ])epa,tel11cn Kehutanan. 2001. Perlin/ilk Pmktis Pengujian don KfasUikasi iv!utll Kokon. ])epartemen Kehutanan, ])irektorat lenderal dan FerhutamlD Susial. Jakarta. Feder. M. L 1996. Fc%gical {['Hi evofllfionwy physiology of stress pro!eins (inc! {he sTress respunse: the f)ro.\·u!)hiia mei{lnogasrer model. In Animals and Temperafure: Phenotypic and Evo/utionwy Adaptation to Temperature Eds. IA. johnston aDd A.F. Bennett, Cambridge University Press. pp.79-102 Feder, f\iI.E., Cartano, N. V., Milos, L, Krehs, R.A. and Lindquist, S.L. 19Y6. Effect of engineering Hsp70 copy number on I-Isp70 expression and tolerance of ecologically relevant heat shock in larvae and pupae of Drosophila melanogaster. J F:xp Bioi 199: 1845-1855.
8
Kumar,
Tripathy. 200<J. Inlluenee stress on genome of grass pGl (/,o!hYnts sa!il'lIs L). J FI1\'imt7. BioI .. 30, 403-408 Li, C.e., L.Ci. jj, Y.K. Liu, J.Y. Mak, Lt. Chen, ami W.Tv1. Lee. 199 L Thermal response of rat fibroblasts qably transCccted with the human 7D-kDa heat shock proteinencoding gcne. Proc. Na!1. Aead Sci. 88:1681-1685. I j, D., and R.I-'. Duncan. 1995. Transient acquircd thern1otolerance In ])ros(\phila, corn.::latcd with rapid degradation of hsp70 during rccovcrv. hll'. J Biochem. 231 :454-46'\. Ll, j; S.i i. i i. iv[ogrlLluoam: X. Du; B-x. I.hong and Y-YChen. 2012. C()mpurative analysis on the expressiun of indueihle I-fSPs in the silkworm, Bomhyx :nori ..\101. BioI (i.
and
uf
Sanche;,
Y. and S.L. Lindquist. 1l)l)O. lISP104 required il)r induced thermotolerancc. Science 248: 1 I 121115 Sarge, K. D., Bray. /\.E. & Goodson, M. L. 1995. Altered Stress response in insect~. Na/llre 374, 126 Santore, M,G, 20()O. r leat shock bctor and the control of stress response. lJiochem. Pharmaco/., 59, 55-63 Solomon. J.M., J.M. Rossi, K. Ciolie, T. McGarry, and S. r-indquist. 19Y I. Changes in hsp70 alter thermo[olcrancc and heat shoek regulatior; in Drosophila. New Bioi. 3:1106-1120. 1995, Somero, Ci.N., Proteins and temperature. //l1IlII. ReF. PhYSlOi .. :) 7: 43-()x, Tissicrs J\.ivlitchell 11K and Tracy lIM. 1974. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila mclanogaster rdation to chromosome puns. J
j{.
h~at
Rep. 39:3915-3923.
Mol. Bioi., 84:389-398.
Lindquist S. 1980. Variying ;)attems of prolcin synthesis in Drosophilla during heat shnck; Implications for regul;ltion. Developmental Biology, 77:463-479. Mosser, D.D. and IU. Morimoto, 2004. Molecular chaperones and the stress Ol')cogene. 01 i j 05-1116 Nath BB, and ! .akh()ti~; Se. 1989, Heat shock reSp()DSl' ;n ovarian nurse cells or Anopheles slcphen~;i. J Biasci., 14: 143-52. Noor RR. 2006. (;enetika Ternak.Cetakan pertama PT. Pcnebar Swadaya, Jakarta Park, EM, Y.O. Kim, B.H, Nam, B.l. Kong, WJ. Kim, SJ Lee, YJ. Jee, l.S. Kong and TJ. Choi 200S, Cloning and cxprc;sion analysis of a small I Isp26 gen/~ of Pacific abalone (Ilaliotis discus Bannai). J E'nviron. Riol., 29, Ritossa F. 1962. A new puffing pattern induc~d by a temperature shock and DNA in Drosophila. Experientien, 18:571-573.
Welte. M.A., .LM, Tetrault, RY. Dellavalle. and S.L. Lindquist. 1993. ;\ new method for J.lar.ipulating transgcncs: cnglllccnr,g heat tolerance ITl a complex. multicellular ~)rgaf'ism. Current mol. 3 :S42-853, \V},yard S, Wyatt GR and Walker YK, ! 986. The heat-shock res!,onse in Locusta r.1igratoria. J. Compo Physiol.. 156B:813-817.
9
E:CLASI RNA TOTAL LARVA SUTERA Bombyx mori LEPIDOPTERA: BOMBICIDAE HASIL PERSILANGAN LOKAL (C301)
iV1asitta Tanjung,1 Maryani Cyccu Tobing,z Syafruddin lIyas 1 dan Darma Bakti2
10epartemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, USU. Medan JI. Gioteknologi No.1 Kampus USU Padang Bulan Medan- 20155 Telp. 061-82223564
e-mail: [email protected] 2Departemen Hama dan Penyakit Tanaman, Fakuitas Pertanian USU, Medan
ABSTRAK Bombyx mori merupakan serangga ~'ang memiliki nilai ekonomi tinggi, telah men gal ami demostifikasi terus menerus dan menjadi lebih rentan terhadap lingkungan yang mengakibatkan kerugian yang cukup besar terutama dalam kondisi iklim panas. Gen yang bertanggungjawab dalam mempertahankan diri dari stress lingkungan adalah gen HSP. Untuk .nendapatkan gen dari larva sutera Bombyx mori, diawali dengan melakukan isolasi RNA Total. Isolasi RNA dilakukan di Laboratorium Terpadu dan Fisiologi Hewan Fakultas Matematika IIm'J Pengetahuan Alam Universitas Sumatera' Utara. Isolasi RNA Tota' pada stadium larva instar V dari beberapa organ tubuh larva meliputi kepala, kelenjar sutera, kulit dan rectum. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Isol::::si RNA total d!temukan pada kepald, ke!enjar sutera ddn rectum sedangkan kulit terjadi penggupalan kapur. Hasil analisis kualitas dan kuantitatif RNA berdasarkan Nanospectrophotometer UV tidak terdetcl<si adanya RNA total pada kulit larva.
Kata kunc! : Bombyx, RN.A, kulit, kelonjar. rektum
PENDAHULUAN Suhu
merupakan
faktor
yang
sangat
perkembangan, reproduksi dan distribusi organisme.
mempengaruhi
pertumbuhan,
Parla kondisi lingkungan yang
ekstrim seperti suhu tinggi, organisme berusaha melakukan adaptasi biologis untuk dapat bertahan. (Hochachka dan Somero, 2002; Bhattacharjee, 2008; Kumar dan Tripathy, 2009). Telah dilaporkan bahwa organisme memiliki kemampuan untuk memperoleh thermotolerance pada suhu tertentu dan menimbulkan respon adaptif (Hong dan Vierling, 2000). Bombyx mori merupakan serangga yang telah mengalami demostifikasi terus menerus dan telah menjadi lebih
rentan terhadap lingkungan yang mengakibatkan
kerugian yang cukup besar terutama dalam kondisi iklim panas. Suhu panas memiliki efek langsung terhadap berbagai aktivitas fisiologis ulat sutera. Secara umum, larva instar
3wal
lahan
te,hadap
suhu
tinggi
yang
ciapai
membantu
rneningkatkan
tingkat
kelangsungan hidup dan karakter kokon. Suhu juga merniliki korelasi iangsung dengan pertumbuhan
ulat
sutera,
dimana
fluktuasi
suhu
yang
lebar
berbClhaya
bagi
perkembangan ulat Kenaikan Suhu meningkatkan fungsi fisiologis dan menurunkan kegiatan fisiologis
penurunan suhu juga akan
Peningkatan suhu selama pemeliharaan ulat sutera
khususnya di inslar akhir mempercepat pertumbuhan larva dan memperpendek periode larva. Di sisi lain, pada suhu rendah, pertumbuhan menjadi lambat dan p€riode larva akan lebih lama. Suilu optimum untuk pertumbuhan normal u!at sutera adalah antara 20°C dan 28°C dan suhu yang diinginkan untuk rentang produktivit2s maksimum dari 23°C sampai 28°C. Suhu di atas 30 D C langsung mempengaruhi kesehatan ~Iat Jika suhu berada di
akibatnya, ulat menjadi terlalu lemah dan rentan terhadap berQagai penyakit. Dalam hal ini kebijakan pemasukan bibit unggul dari daerah dingin atau daerah beriklim sedang ke daerah tropis bukan merupakan suatu a!ternatif yang paling terat. Pada uiat sutera, fenomena interaksi antara genetik dan lingkungan nyata keberadaannya terutarna pada sifat bobot badan, daya tahan hidup dan daya tetas telur (Jakaria et aI., 2001).
Noar (1996) menyatakan bahwa salah satu pendekatan yang dapat dilakukan
untuk rnengatasi adar.ya interaksi antara genetik dan lingkung:::ln yaitu dengan caro membentuk bibit yang secara genetik napat menyesuai~an diri dengan lingkungan tanpa banyak r:.engaiam i perubahQll performa.
Individu y;::mg marT'pu men}'esuaikan diri
terhadap perubahC:ln kondisi lingkungan atau marT'pu menampilkan lebih dari satu bentuk morfologi. status fisio!ogi dan tingkah laku, maka dikatakan memiliki kelenturan fenotipik (phenotypic plasticity) yang d:kontrol oleh gen.
Gen terdapat di dalam sel. Sel mengandung protein, DNA dan RNA. RNA terd!ri atas tRNA, rRNA dan mRNA yang jumlahnya berkisar 1-5%. RNA merupakan biomolekul yang berisikan untai panjang unit nuklotida. Seperti nuklotida RNA tersususn atas basa r;itrogen, gugus gula dan phosphate. RNA mirip dengan DNA, akan tetapi berbeda jika melihi'lt stukturnya. RNA biasanya berutas tunggal, dan DNA utas ganda. Nukleotida RNA berisikan ribose yang DNA berisikan deoksiribosa (sebuah tipe dari ribose yang kurangnya satu atom oksigen). RNA terdapat Urasil dan DNA terdapat thymin. Isolasi RNA sebuah tahapan krusial dari banyak analisis termasuk analisis ekspres! (RT-PCR, nortern bloting), konstruksi eDNA dan gen kloning. Tahapan isolasi RNA terdiri dari; penangaan RNA, preparasi sempel, isolasi, cek quantifikasi dan kual!tas dan purifikasi. Isolasi RNA yang harus diperhatikan adalah aktivitas RNAse dan struktur
_l __ _
F~NA yZlIlg U~c::S
lU!iggal. RNAase merupakan enzim yang mempunyai kemampuan untuk
mendegradasi RNA Struktur RNA yang utas tunggal jika terdapat suhu tinggi maka RNA dapat terdegracasi.
BAHAN DAN METODE BailGn yan9 cJipakai untuk isolasi RNA adalah Trizol reagent yang mengandung a mono-phasic of phenol dan guanidine isothiocyanate (untuk denaturasi protein). Selama proses homogenisasi dan lisis, trizol reagent akan menjaga integritas RNA dan melarutkan korr.ponen-komponen sel lain. Penamb8han Cloroform yang diikuti oleh sentrifuge tetap menjaga RNA dalam phasa air dail yang lain dalam phasa organik. RNA diendapkan dengan isopropyl alcohol, 75 % Ethanol (in DEPC-water), RNAse-free water Sam pel yang digunakan adalah larva sutera insta, V yang telurnya berasal dari
membungkus dalam kain berwarna hitam supaya penetasan terjadi sempurna. Kemudian larva dipelihara dengan cara rearing sutera mulai dari instar I sampai instar V. Larva diberi pakan daun murbei (Morus sp). Setelah larva memasuki instar V C:ilakukan isol8Si RNA total dari beberapa bag ian tubuh larva yaitu kulit,kepala, ke1enjai sutera dan rectum Tahapan Kerja a. Penetasan dan pemeliharan Ulat Sutera.
Bibit ulat sutera diperoleh dari pusat persde,aan 81am Cantiroto Temanggung jawa Tengah. "Telur ditetaskan rTli'1sing-masingnya sebanyak 100 buiir, kemudian dilakGka" inkubasi telur
secara baik agar penetasannya seragam. Inkubasi telur
dilakukan dengan cara; telur disebarkan pad a kotak penetasan, masing-masing kotak berisikan 100 butir telur dan ditutup dengan kertas putih yang tipis. Setelah terlihat bintik biru pada telur, kemudiCln telur dibungkus dengan kertas karbol hit8m untuk menghindari cahaya sehingga diharapkan peneiasan dapat te!"jadi secara bersamaan. Telur diamati setiap hari. Tiga hari sebelum pemeliharaan, ruangan dar. semua peralatan didesinfeksi dengan menggunakan formalin 2-3% dengan cara disemprotkan secara merata. Upaya desinfektan dii<Jkukan untuk menjaga kesehatan larva (Samsijah dan Andadari, 1992). Setelah menetas dipindahkan ke wadah pemeliharaan. Pemeliharaan ulat sutera meliputi pemeliharaan ulat instar I-V. Pemeliharaan ulat instar I-II didahului dengan kegiatan hakitate yaitu pekerjaan penanganan ulat yang baru menetas disertai dengan pemberian pakan pertama. Ulat yang baru menetas (instar I) didesinfeksi dengan bubuk campuran Kapur dan kaporit (95:5), lalu diberi daun murb8i yang muda dan segar yang dipotong kedl-kedl, kemudian ulat dipindahkan ke
tampi
yang die:!:',:
C;~J~~jcHI
kertas rninyak atau paraffin. Pemberian pakan dilakukan 3 kali
sehari. Pc,dCl seti2p instm ulat akan mengalami masa istirahat dan pergantian kutikula Apabiia sebagi,;n besar ulat istirahat (90%), pemberian pakan dihentikan dan ditaburi Kapur.
P8da setiap akhir instar dilakukan penjarangan dan daya tampung tempat
disesuaikan dengan perkembangan uiat. Pembersihan tempa! ulat, pencegahan hama dan penY2kit dilc;kukan secara teratur. Pada instar I dan II, pembersihan dilakukan masing-masing 1 kali sedangkan instar III sampai V dilakukan 2 kali yaitu setelah pemberian pakan kedua dan menjelang pergantian kulikula. Desinfeksi tubuh ulat dilaksanakan setiap kali ulat ganti kutikula dan sebelum pemberian pakan pertama. Setelah ulat memasuki instar III sampai V, daun yang diberikan adalah daun utuh bersama cabang, penempatannya diselang selingi secara teratur bagian uiung d~n panqkal. Telur ulat sutera ditetaskan Dada suhu kamar 28-30 oC dan dipelihara sampai instar V. b. Isolasi RNA Total
SClmpel (kulit, kepala, kelenjar sutera dan rectum) sebanyak 5 £1
d~gerus
dengdrl
bantuan nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi teiJung. Hasil gerusan dimasukkan ke ependorf yang telah berisi 1 ml trizol homogenisasi dan lisis dengan pipetting, kemudian divorteks dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 5 meJ.it. Dit::imbahkan 02 ml chloroform, dem goyang dengan tangan kemlJdian inkubasi sela;na 3 rner.it. Campuran kem udian divorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 120QOrpm pad a suhu 4'C selama 15 menit. Cairan bagia" atas dipindahkaJl ke ependorf baru, ditambahkan 500fj: isoprophyl alkoho! dan diinkubasi pada sunu ruang selama 10 menit. Campuran disentrifugasi pada 12000rpm pad a suhu 4°C selama 10 menit. Cair3n dibuang, Endapan RNA total dibilas dengan 1 ml alkohol 75% dan disentrifugasi pada 12000rpm pada suhu 4°C selama 5 menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan vaccum dryer dan disuspensikan
di
dalam
dH20.
Kualitas
dan
kuantitas
RNA
ditentukan
dengan
spektrometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan RNA total diana lis is dengan elektroforesis pada gel agarose 1% di dalam larutan penyangga T AE 1 x. VisuCllisasi RNA total dilakukan di atas UV transiluminator Gel Doc (Labquip) sete:ah diwarnai dengan EtBr (0,5 fJg/mL) selama 15 menit dan dibilas dengan air. Larutkan RNA dengan DEPC-water dan inkubasi pada 55°C selama 10 menit.
HASIL DAN PEMBAHASAN Tahap Isolasi RNA meliputi penghancuran dinding sel. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi, kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang
telah dipisariKan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Penghilangan protein dan DNA Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA dapat diisolasi secara
utuh.
Pemurnian
RNA (purifikasi
RNA) dapat dilakukan dengan
mencampur larutan DNA tersebut dengan PCI yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan Isolasi RNA total dari beberapa bagian organ tubuh larva sutera (Bombyx maTi) telah
berhasil
diisolasi
Eerdasarkan
pengukuran
nanospektrofotometer UV,
rasio
0026010D280 dari RNA total menunjukkan bahwa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian yang tinggi dari kontaminan protein. Elektroforesis RNA total untuk analisis keutuhannya mcnunjukkan adanya duapita
R~jA
yang dominan. Kedua pita ini adalah
; ...... ;
--.._ ...... , , ...... : •• 1.... 1..............
h ....... h ........
Dl\I"
"'..-.-.&...-.1
IIII
111'C:iIIU11JUr\.r'\OII
UClIIVVO
"I'tF""'\
lUlell
............ _
yOI'8
diisolasi ini mempunyai keutuhan yang tinggi sehingga sangat baik digunakan sebagai cetakan (template) untuk sintesis cONA total. Hasil isolasi RNA total pada beberapa ba~ian
organ tubuh larva sutera dapat dilihat pada Tabel
~.
Tabel 1. Uji Kuantitas RNA total pada beberapa bagian tubuh 18rva sutera (Bombyx mcri) instar V Absorbansi Organ Konsentrasi ng/fJl
260/280
260/230
Kepala
+
+
+
Kelenjar sutera
+
+
+
+
+
+
KuHt Rectum
Keterangan: (-) tidak ditemukan, (+) ditemukan Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa hasil uji kuantitas RNA total pada bagian kepala, kelenjar sutera dan rectum ditemukan RNA total sedangkan pad a kulit tidak ditemukan. Pada kulit terjad; gumpalan (endapan) putih yang
tida~
dapat dihancurkan. Endapan
tersebut dapat saja berupa garam karena Isopropanol dapat mengendapkan garam Isopropanol ser:ng digunakan untuk presipitasi pertama, tetapi tidak untuk tahap akhir karena cenderung mengendapkan garam.
f<:=SIi\1PUU\r'!
[,t.'~
PROSPEK
Iselasi RW\ total hanya ditemukan pada kepala, kelenjar sutera dan rectum sedungkan kulit ter"jacli penggupalan kapur dan dari hasil analisis kualitas dan kuantitas RNA berdasar Nanospectrophotometer UV tidak terdeteksi adanya RNA total. DAFT AR PUST AKA Bhattacharjee, S. 2008.Triadimefon pretreatment protects newly assembled membrane system and causes up-regulation of stress proteins in salinity stressed Amaranthus livid us L. during early germination. J. Environ. BioI., 29 Hochachka, P.W. and Somero, G.N.. 2002. In: Biochemical adaptation, Oxford University Press, New York Hong, S.W and Vierling, E. 2000. Mutants of Arabidopsis thaliana defective in acquisition of tolerance to high temperature stress. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 97, 43924397 Jakaria, et al., 2001. Evaluation Of Phenotypic Plasticty On Silkworm Bombyx Mori L. lJnrJAr [-light TAmrAr::ltllrp luri::Jt, 15 (2): 170 Kurrar, G. and R. Tripathy. 2009. Influence of heat stress on genome of grass pea (Lathyrus sativus L.). J. Environ. Bio/', 30, 403-408 Noor RR. 2006. Genetika Ternak.Cetakan pertama PT. Penebar Swadaya. Jakarta
