TRANSZLÁCIÓ és fehérje transzport Hogyan lesz a DNS-ben kódolt információból fehérje? A DNS felszínén az aminosavak „sorba” állnak? mRNS, tRNS, riboszómák felfedezése A GENETIKAI KÓD 20 AS és csak 4 bázis, a kódolás hogy lehetséges? Elméleti megfontolások 2 bázis sem elég (4x4 = 42 = 16) hárombetűs (43 = 64 triplet, kodon) Degenerált Genetikai kísérletek (T4 rII rendszer) Francis Crick és Sydney Brenner, Hárombetűs, vesszőmentes, nem átfedő A genetikai kód megfejtése az 1960-as évek elején. start kodon AUG, (GUG és más) stop kodonok, UGA, UAG, UAA kodon és antikodon leolvasási keret, ORF a fordítógép a RIBOSZÓMA 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-1
Az UNIVERZÁLIS kódszótár START AUG Met STOP UAA, UGA, UAG Met (AUG) és Trp (UGG) esetén egyetlen kodon DE a legtöbb aminosavra 2-6 kodon Leu (L), Arg (R), Ser (S) 6 kodon összefügg az előfordulás gyakoriságával (kodonhasználat és G+C tartalom) Az első két bázis általában elég az aminosav meghatározásához xyU, xyC, xyA, xyG 8 aminosavnál (Leu, Val, Ser, Pro, Thr, Ala, Arg, Gly) vagy xyR (purin: A vagy G) Leu, Gln, Lys, Arg vagy xyY (pirimidin: C vagy U) Phe, Tyr, His, Asn, Cys, Ser lásd tRNS antikodon, „lőtyögő” pozíció 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-2
Mégsem univerzális?
Növényekben a kloroplaszt és a mitokondrium kodonok is egyeznek az univerzálissal. Más eukariótákban az mtDNS egyes kodonjai más jelentéssel bírnak (lásd a humán példát). Egyes egysejtűekben a nukleáris kodonok sem teljesen univerzálisak.
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-3
A START kodon nem csak AUG, de mindig Met épül be az első helyre!
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=c 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-4
A tRNS A keresett „adapter” molekula a mRNS és az aminosavak között. több tRNS - egy transzkript pre-tRNS rRNS vagy mRNS átírással együtt is 1965 az első szekvencia élesztő alanil-tRNS tRNAAla jellegzetes másodlagos (lóhere) és harmadlagos szerkezet (L-alak), kb. 50% bázispárosodott 73-93 bázis TψCG hurok (psi) D loop antikodon hurok 5’ (P) és 3’ –OH végek a 3’ CCA-OH köti az aktivált aminosavat utólag módosított bázisok: D dihidro-uridin I inozin - a „lötyögést” segíti! ψ pszeudouridin I6A izopentenil adenozin (hidrofobicitást erősít, antikodon 3’ végén) 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-5
aminoacyl-tRNS-szintetáz + AS + ATP aminoacyl-tRNS-szintetáz AS-AMP komplex + PPi ( P + P) aminoacyl-tRNS-szintetáz- AS-AMP (aktivált enzim) + tRNSx aminoacyl-tRNS-szintetáz +AMP + aminoacyl-tRNSx („töltött” tRNS, „aktivált” aminosav) specifikus enzimek minden aminosavra, antikodon triplet és más szekvencia részletek is fontosak a felismerésben tRNS 3’ CCA-OH aminosav I. osztály főleg a bázikus aminosavakra (2’-OH aciláció) II. osztály kisebb aminosavakra (3’-OH aciláció) a legtöbb enzimen acilációs hely és hidrolitikus hely is található (hibajavító funkció is, ha véletlenül egy hasonló aminosav épült be) 16-11-09
7-6
Kodon-antikodon, a lötyögő kapcsolat előnyei Nem 61 különböző tRNS van, általában kevesebb. Egy töltött tRNS több kodonhoz is képes illeszkedni. Módosított bázisok szerepe: az antikodon 5’ végről az 1. bázis a kodon 5’ végről a 3. bázisoz illeszkedik. Ez a kapcsolat nem egészen specifikus: pl. 1. inozin (Gre hasonlít) DE párosodhat C mellett A és U bázisokkal is. (Lásd a táblázatot fent és a rajzot balra.) 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-7
A RIBOSZÓMA
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-8
A 30S kis alegység 16S rRNS, 1500 bázis
A prokarióta 16S RNS 3’ vége komplementer a fehérje kódoló nyitott leolvasási keretek (ORF-ek) előtt található riboszóma kötő hellyel (RBS) Shine-Dalgarno (SD) vagy ribosome binding site (RBS) szekvencia
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-9
Shine-Dalgarno (SD) vagy ribosome binding site (RBS) prokariótáknál komplementer a 16S RNS 3’ végével kb. 10 bázissal az iniciációs kodon (START kodon) előtt található, sokszor csak 3-4 bázis komplementer minden kódoló rész előtt megtalálható egy policisztronos mRNS szekvencián
5’
RBS
ORF-1
RBS
ORF-2
RBS
ORF-3
3’
egy policisztronos mRNS
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-10
A nyitott leolvasási keret (ORF)
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-11
A nyitott leolvasási keret (ORF) ORF – nyitott leolvasási keret, (open reading frame) 6 lehetőség (csak 5’ 3’ irányban) első ATG – STOP között (egy valószínű ORF) STOP-STOP a maximális ORF RBS-szerű szekvencia azonosítása segíthet a START kodon tippelésében
Lehetséges nyitott leolvasási keretek egy DNS-szakaszon, mindkét szálon bejelölve 1,2,3: a felső szál három keretében megtalálható ORF-ek 4,5,6: Fordított irányban, az alsó szálon található ORF-ek. A leghosszabb a legvalószínűbb valódi kódoló ORF, azaz egy lehetséges gén helyzetét jelzi. 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-12
Az 50S nagy alegység 23S rRNS, 2900 bázis hosszú 5S rRNS
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-13
A 23S rRNA 2900 bázis
16-11-09
7-14
A aminoacil tRNS kötőhely P peptidil tRNS kötőhely E exit hely 23S rRNS 5S rRNS
új polipeptid lánc
Az iniciációs faktor IF3 a kis alegységhez, az IF6 a nagy alegységhez kötődve megakadályozza az alegységek összekapcsolódását, amelyet egy bonyolultabb iniciációs lépés előzi meg.
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-15
EUKARIÓTA
TRANSZLÁCIÓ INICIÁCIÓ PROKARIÓTA policisztronos mRNS-ek ! (RBS szerepe) fMet-tRNS formilálás (tetrahidrofolát) utólag, DE tRNSf más ! láncközi szintézishez tRNSm IF1, IF2, IF3 GTP, mRNS, fMet-tRNSf az első tRNS a PEPTIDIL kötőhelyre kerül! + 50S GDP + Pi + IFx EUKARIÓTA Kozak szekvencia:
ACCAUGG
faktorok elnevezése: eIFx kezdő: Met-tRNSi más eukariótáknál is! szabályozás: eIF2-Ser-(P) GDP/GTP csere nincs, szintézis nem indul mRNS CAP: cap kötő komplex eIF4 eIF4A helikáz is (ATP felhasználás) 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-16
eIF3, eIF1 eIF2 - tRNSMet eIF4 komplex – mRNS Kis alegység-mRNS-tRNSMet komplex Aktivált 60S alegység -eIF5(GTP), eIF6 iniciációs faktorok átmeneti kötődése és GTP és ATP felhasználása után a teljes komplex összeállt kész az ELONGÁCIÓra
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-17
YouTube filmek https://www.youtube.com/watch?v=1PSwhTGFMxs
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-18
ELONGÁCIÓ elongációs faktorok (EF) segítik a ciklusok lebonyolítását, belépés, peptidkötés kialakítása, transzlokáció
EF1-GTP/tRNS komplex (A) helyre kötődés (antikodon/kodon kapcsolat ellenőrzése) ha rendben, akkor GTP bontás aa-tRNS
+ EF1-GDP + Pi
új tRNS kötése EF1-GTP + aa-tRNA tRNS „megdőlés”, feltétele a kapcsolásnak PEPTIDKÖTÉS a 28s rRNS a peptidil transzferáz !!
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-19
PEPTIDKÖTÉS és LÉPÉS A P pozícióban lévő aminosav (később peptidlánc) áthelyeződik (észterkötés elbomlása) az A helyen lévő aa-tRNS molekulára kialakul a peptidkötés –COO NH2 – peptidkötés után transzlokáció - EF2-GTP GTP bontás EF2-GDP + Pi - a riboszóma elmozdul, „lép” a mRNS-en - a deacilált („üres”) tRNS az E helyre kerül és távozik - a peptidil tRNS a P helyre kerül (marad a kodonon) - EF2-GDP leválás
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-20
TERMINÁCIÓ a mRNS-en STOP kodon kerül az A helyhez release faktorok:
eRF1,
eRF3-GTP
eRF1 alakja hasonló a tRNS-hez, STOP kodonhoz kötődik, ha nincs tRNS, ami kötődne (kivétel mutáció esetén a szupresszor tRNS!) peptidil transzferáz működik, hidrolizál - a kész fehérje leválik az utolsó tRNS molekuláról GTP bontás RF3-GDP + Pi 60S (50S), 40S (30S) alegységek szétválnak tRNS, mRNS disszociál GTP-kötő fehérjék irányítják az egyes lépéseket (IF2-GTP , EF1-GTP , EF2-GTP , RF2-GTP) GTP-kötött aktív és GDP-kötött inaktív formák, kapcsolók GTP-kötő szupercsalád tagjai számos helyen játsszák a kapcsoló szerepét (már volt szó róluk a sejtmagi transzport folyamtoknál) 16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-21
Fehérje transzport
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-22
Fehérje transzport mechanizmusok az eukariota sejtben: 1) transzmembrán transzport – kitekert formában, egyedi fehérjék transzportja célzottan a citoszólból → endoplazmatikus retikulum, mitokondrium, kloroplaszt, peroxiszóma. 2) póruson keresztüli transzport (gated transport) nukleusz, nukleáris pórus, aktív térszerkezet megmarad, komplexek ellenőrzött transzportja 3) vezikuláris transzport – egyik kompartmentből a másikba, membránba zárva, lefűződés és fúzió a másik kompartmenttel: ER – Golgi, lizoszómák, sejtfelszín extracelluláris tér. transzfert irányító szignálok a fehérjéken – különböző aminosav szekvenciák, melyeket a transzport apparátus fehérjéi felismernek pl.: NLS – nukleáris likalizációs szignál
16-11-09
GENETIKA ALAPOK
7-23
