A TRANSZLÁCIÓ Hogyan lesz a DNS-ben kódolt információból fehérje? A DNS felszínén az aminosavak sorba állnak?

A TRANSZLÁCIÓ Hogyan lesz a DNS-ben kódolt információból fehérje? A DNS felszínén az aminosavak „sorba” állnak? mRNS, tRNS, riboszómák felfedezése A GENETIKAI KÓD 20 AS és csak 4 bázis, a kódolás hogy lehetséges? Elméleti megfontolások 2 bázis sem elég (4x4 = 42 = 16) hárombetűs (43 = 64 triplet, kodon) Degenerált Genetikai kísérletek (T4 rII rendszer) Francis Crick és Sydney Brenner, Hárombetűs, vesszőmentes, nem átfedő A genetikai kód megfejtése az 1960-as évek elején. start kodon AUG, (GUG és más) stop kodonok, UGA, UAG, UAA kodon és antikodon leolvasási keret, ORF a fordítógép a RIBOSZÓMA 16-11-08

biológia BSc - Molekuláris biológia előadások - Putnoky

9-1

Kódfejtés biokémiai és genetikai kísérletekkel

Radioaktív aminosavakkal kimutaták, hogy a fehérjék a citoplazmában képződnek. Genetikai információ a sejtmagban. Mi a közvetítő? RNS ? Radioaktív uracil a sejtmagban beépül az RNS-be, a jelölt RNS kijut a citoplazmába. mRNS In vitro sejtmentes transzlációs rendszer. Milyen polipeptid keletkezik mesterséges mRNS-ek alkalmazásával? A genetikai kód néhány tripletjének megfejtése. A nukleinsavak szekvenciájának meghatározása ekkor még nem volt lehetséges! 16-11-08


9-2

Nirenberg és Leder vizsgálati rendszerével volt megfejthető véglegesen a genetikai kód: Sejtmentes rendszer. Egy radioaktív aminosav:

14

C-Ser, 14C-Leu ...

+ 3 bázis hosszú, ismert szekvenciájú „mRNS” molekulák (CUC) egyenként tesztelve riboszómák jelenlétében. Ha egy radioaktív aminosav (AA-tRNS) nem kötődött az adott mini mRNS szekvenciához (kodonhoz), akkor átjutott a filteren. Ha egy mini mRNS szekvencia (CUC) elősegítette egy radioaktív aminosav pl. 14C-Leu (AA-tRNS) kötését a riboszómákhoz, szűréskor a radioaktív jel a filteren maradt, mert a riboszómával együtt már túl nagy volt, hogy átjusson A bemutatott kísérletből kodon leucint jelent.

következik, hogy a CUC

Az összes kodon egyértelmű azonosítása ezzel a kísérleti rendszerrel vált lehetségessé.

16-11-08


9-3

Az UNIVERZÁLIS kódszótár START AUG Met STOP UAA, UGA, UAG Met (AUG) és Trp (UGG) esetén egyetlen kodon DE a legtöbb aminosavra 2-6 kodon Leu (L), Arg (R), Ser (S) 6 kodon összefügg az előfordulás gyakoriságával (kodonhasználat és G+C tartalom) Az első két bázis általában elég az aminosav meghatározásához xyU, xyC, xyA, xyG 8 aminosavnál (Leu, Val, Ser, Pro, Thr, Ala, Arg, Gly) vagy xyR (purin: A vagy G) Leu, Gln, Lys, Arg vagy xyY (pirimidin: C vagy U) Phe, Tyr, His, Asn, Cys, Ser lásd tRNS antikodon, „lőtyögő” pozíció 16-11-08


9-4

Mégsem univerzális?

Növényekben a kloroplaszt és a mitokondrium kodonok is egyeznek az univerzálissal. Más eukariótákban az mtDNS egyes kodonjai más jelentéssel bírnak (lásd a humán példát). Egyes egysejtűekben a nukleáris kodonok sem teljesen univerzálisak.

16-11-08


9-5

A START kodon nem csak AUG, de mindig Met épül be az első helyre!

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi?mode=c 16-11-08


9-6

A tRNS A keresett „adapter” molekula a mRNS és az aminosavak között. több tRNS - egy transzkript pre-tRNS rRNS vagy mRNS átírással együtt is 1965 az első szekvencia élesztő alanil-tRNS tRNAAla jellegzetes másodlagos (lóhere) és harmadlagos szerkezet (L-alak), kb. 50% bázispárosodott 73-93 bázis TψCG hurok (psi) D loop antikodon hurok 5’ (P) és 3’ –OH végek a 3’ CCA-OH köti az aktivált aminosavat utólag módosított bázisok: D dihidro-uridin I inozin - a „lötyögést” segíti! ψ pszeudouridin I6A izopentenil adenozin (hidrofobicitást erősít, antikodon 3’ végén) 16-11-08


9-7

rRNS-tRNS gének együtt íródnak át

Prokarióta tRNS érés tRNS géncsoportok rRNS-tRNS együtt íródik át mRNS-tRNS együtt íródik át Két fehérjekódoló rész között is lehet tRNS gén (spacer tRNA) -CCA-OH 3’ vég van speciális ribonukleázok segítik az érést RNáz-P RNáz-D 16-11-08


9-8

tRNS érés Az RNáz-P egy ribozim! (RNS enzim) tRNS 5’ vég érésénél

16-11-08


9-9

eukarióta tRNS érés eukariótáknál átírás RNS pol-III RNáz-P, RNáz-D hasítások, intron kivágás az antikodon hurok kialakításához nincs CCA-OH 3’ vég, utólag kerül rá tRNS nukleotidil transzferáz bázisok módosítása

16-11-08


9-10

aminoacyl-tRNS-szintetáz + AS + ATP aminoacyl-tRNS-szintetáz AS-AMP komplex + PPi ( P + P) aminoacyl-tRNS-szintetáz- AS-AMP (aktivált enzim) + tRNSx aminoacyl-tRNS-szintetáz +AMP + aminoacyl-tRNSx („töltött” tRNS, „aktivált” aminosav) specifikus enzimek minden aminosavra, antikodon triplet és más szekvencia részletek is fontosak a felismerésben tRNS 3’ CCA-OH  aminosav I. osztály főleg a bázikus aminosavakra (2’-OH aciláció) II. osztály kisebb aminosavakra (3’-OH aciláció) a legtöbb enzimen acilációs hely és hidrolitikus hely is található (hibajavító funkció is, ha véletlenül egy hasonló aminosav épült be) 16-11-08


9-11

aminoacyl-tRNS-szintetáz acilációs hely (activtion site) hidrolitikus hely (editing site) antikodon felismerő domén

16-11-08


9-12

Kodon-antikodon, a lötyögő kapcsolat előnyei Nem 61 különböző tRNS van, általában kevesebb. Egy töltött tRNS több kodonhoz is képes illeszkedni. Módosított bázisok szerepe: az antikodon 5’ végről az 1. bázis a kodon 5’ végről a 3. bázisoz illeszkedik. Ez a kapcsolat nem egészen specifikus: pl. 1. inozin (Gre hasonlít) DE párosodhat C mellett A és U bázisokkal is. (Lásd a táblázatot fent és a rajzot balra.) 16-11-08


9-13

A RIBOSZÓMA

16-11-08


9-14

A 30S kis alegység 16S rRNS, 1500 bázis

A prokarióta 16S RNS 3’ vége komplementer a fehérje kódoló nyitott leolvasási keretek (ORF-ek) előtt található riboszóma kötő hellyel (RBS) Shine-Dalgarno (SD) vagy ribosome binding site (RBS) szekvencia

16-11-08


9-15

Shine-Dalgarno (SD) vagy ribosome binding site (RBS) prokariótáknál komplementer a 16S RNS 3’ végével kb. 10 bázissal az iniciációs kodon (START kodon) előtt található, sokszor csak 3-4 bázis komplementer minden kódoló rész előtt megtalálható egy policisztronos mRNS szekvencián

5’

RBS

ORF-1

RBS

ORF-2

RBS

ORF-3

3’

egy policisztronos mRNS

16-11-08


9-16

A nyitott leolvasási keret (ORF)

16-11-08


9-17

A nyitott leolvasási keret (ORF) ORF – nyitott leolvasási keret, (open reading frame) 6 lehetőség (csak 5’  3’ irányban) első ATG – STOP között (egy valószínű ORF) STOP-STOP a maximális ORF RBS-szerű szekvencia azonosítása segíthet a START kodon tippelésében

Lehetséges nyitott leolvasási keretek egy DNS-szakaszon, mindkét szálon bejelölve 1,2,3: a felső szál három keretében megtalálható ORF-ek 4,5,6: Fordított irányban, az alsó szálon található ORF-ek. A leghosszabb a legvalószínűbb valódi kódoló ORF, azaz egy lehetséges gén helyzetét jelzi. 16-11-08


9-18

Az 50S nagy alegység 23S rRNS, 2900 bázis hosszú 5S rRNS

16-11-08


9-19

A 23S rRNA 2900 bázis

16-11-08


9-20

A aminoacil tRNS kötőhely P peptidil tRNS kötőhely E exit hely 23S rRNS 5S rRNS

új polipeptid lánc

Az iniciációs faktor IF3 a kis alegységhez, az IF6 a nagy alegységhez kötődve megakadályozza az alegységek összekapcsolódását, amelyet egy bonyolultabb iniciációs lépés előzi meg.

16-11-08


9-21

EUKARIÓTA

TRANSZLÁCIÓ INICIÁCIÓ PROKARIÓTA policisztronos mRNS-ek ! (RBS szerepe) fMet-tRNS formilálás (tetrahidrofolát) utólag, DE tRNSf más ! láncközi szintézishez tRNSm IF1, IF2, IF3 GTP, mRNS, fMet-tRNSf az első tRNS a PEPTIDIL kötőhelyre kerül! + 50S  GDP + Pi + IFx EUKARIÓTA Kozak szekvencia:

ACCAUGG

faktorok elnevezése: eIFx kezdő: Met-tRNSi más eukariótáknál is! szabályozás: eIF2-Ser-(P) GDP/GTP csere nincs, szintézis nem indul mRNS CAP: cap kötő komplex eIF4 eIF4A helikáz is (ATP felhasználás) 16-11-08


9-22

eIF3, eIF1 eIF2 - tRNSMet eIF4 komplex – mRNS Kis alegység-mRNS-tRNSMet komplex Aktivált 60S alegység -eIF5(GTP), eIF6 iniciációs faktorok átmeneti kötődése és GTP és ATP felhasználása után a teljes komplex összeállt kész az ELONGÁCIÓra

16-11-08


9-23

YouTube filmek https://www.youtube.com/watch?v=1PSwhTGFMxs

16-11-08


9-24

ELONGÁCIÓ elongációs faktorok (EF) segítik a ciklusok lebonyolítását, belépés, peptidkötés kialakítása, transzlokáció

EF1-GTP/tRNS komplex (A) helyre kötődés (antikodon/kodon kapcsolat ellenőrzése) ha rendben, akkor GTP bontás aa-tRNS

+ EF1-GDP + Pi

új tRNS kötése  EF1-GTP + aa-tRNA tRNS „megdőlés”, feltétele a kapcsolásnak PEPTIDKÖTÉS a 28s rRNS a peptidil transzferáz !!

16-11-08


9-25

PEPTIDKÖTÉS és LÉPÉS A P pozícióban lévő aminosav (később peptidlánc) áthelyeződik (észterkötés elbomlása) az A helyen lévő aa-tRNS molekulára kialakul a peptidkötés –COO NH2 – peptidkötés után transzlokáció - EF2-GTP GTP bontás  EF2-GDP + Pi - a riboszóma elmozdul, „lép” a mRNS-en - a deacilált („üres”) tRNS az E helyre kerül és távozik - a peptidil tRNS a P helyre kerül (marad a kodonon) - EF2-GDP leválás

16-11-08


9-26

TERMINÁCIÓ a mRNS-en STOP kodon kerül az A helyhez release faktorok:

eRF1,

eRF3-GTP

eRF1 alakja hasonló a tRNS-hez, STOP kodonhoz kötődik, ha nincs tRNS, ami kötődne (kivétel mutáció esetén a szupresszor tRNS!) peptidil transzferáz működik, hidrolizál - a kész fehérje leválik az utolsó tRNS molekuláról GTP bontás  RF3-GDP + Pi 60S (50S), 40S (30S) alegységek szétválnak tRNS, mRNS disszociál GTP-kötő fehérjék irányítják az egyes lépéseket (IF2-GTP , EF1-GTP , EF2-GTP , RF3-GTP) GTP-kötött aktív és GDP-kötött inaktív formák, kapcsolók GTP-kötő szupercsalád tagjai számos helyen játsszák a kapcsoló szerepét (már volt szó róluk a sejtmagi transzport folyamtoknál) 16-11-08


9-27

A TRANSZLÁCIÓ Hogyan lesz a DNS-ben kódolt információból fehérje? A DNS felszínén az aminosavak sorba állnak?

Recommend Documents