EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS
A PARAOXONÁZ HATÁSA AZ OXIDATÍV DNS-KÁROSODÁSRA
DR. HARANGI MARIANN
TémavezetQ: Prof.Dr. Paragh György
DEBRECENI EGYETEM ORVOS- ÉS EGÉSZSÉGTUDOMÁNYI CENTRUM I.sz. BELGYÓGYÁSZATI KLINIKA DEBRECEN 2002
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke
3
I. Bevezetés
5
II. Irodalmi áttekintés
8
1. Az LDL oxidáció szerepe az atherosclerosis kialakulásában
8
1.1 LDL oxidáció
8
1.2 A scavenger receptorok szerepe oxidált LDL felvételében
9
1.3 Az oxidált LDL szerepe az atherosclerosis kialakulásában
10
2. A HDL preventív szerepe az atherosclerosis kialakulásában
11
2.1 A HDL szerkezete
11
2.2 A HDL érelmeszesedést gátló hatása
12
2.3 A HDL antioxidáns hatása
13
3. A paraoxonáz
14
3.1 A humán paraoxonáz-1
14
3.2 Paraoxonáz polimorfizmusok
14
3.3 A PON2 es PON3
15
4. Oxidatív DNS-károsodás
16
4.1 Az oxidatív DNS-károsodás folyamata és következményei
16
4.2 Single cell gel electrophoresis ( Comet assay )
17
5. LightCycler
19
III. Célkit_zések
21
IV. Betegek és módszerek
22
V. Eredmények
30
Új eredmények
37
VI. Megbeszélés
38
VII. Összefoglalás
41
VIII. Irodalom
43
Saját közlemények, absztraktok, poszterek, elQadások
53
IX. Köszönetnyilvánítás
59
X. Függelék
60
2
Rövidítések jegyzéke
8-OHdG: 8-hidroxi-6-dezoxiguanozin 8-OHG: 8-hidroxiguanidin apo A-I: apolipoprotein A-I apo B: apolipoprotein B apo J: apolipoprotein J Aryl: arilészteráz BMI: body mass index CETP: koleszterin észter transzfer protein CRP: C-reaktív protein EtBr: etidium-bromid FMLP: formyl-Met-Leu-Phe FRET: fluoreszcencia rezonancia energia transzfer GC-MS: gas chromatography- mass spectrometry HDL: high-density lipoprotein HPLC: high performance liquid chromatography ICAM-1: intracellular adhesion molecule 1 IFN- : interferon gamma LCAT: lecitin koleszterin aciltranszferáz LDL: low-density lipoprotein LMP agaróz: alacsony olvadáspontú agaróz LOX-1: lecitin-like oxidized LDL receptor MCP-1: monocyte chemotactic protein 1 M-CSF: makrofág kolónia stimuláló faktor MM-LDL: minimally modified LDL NCEP: National Cholesterol Education Program NMP agaróz: normál olvadáspontú agaróz NO: nitrogén monoxid NOS: NO szintetáz PAFAH: platelet-activating factor acetil hidroláz
3
PCR: polimeráz láncreakció PDGF: platelet-derived growth factor PMA: forbolmirisztát acetát PMNLs: polimorfonukleáris leukociták PON: paraoxonáz PPAR- : peroxisoma proliferator-activated receptor gamma PUFA: többszörösen telítetlen zsírsav RFLP: restrikciós fragmenthossz polimorfizmus SCGE: single cell gel electrophoresis ssDNA: egyszálú DNS TBARS: thiobarbitursav reaktív anyagok TGF- : transforming growth factor beta Tm: olvadáspont VCAM-1: vascular adhesion molecule 1 VLDL: very low-density lipoprotein
4
I.
Bevezetés
A kardiovaszkuláris betegségek vezetQ helyen állnak a morbiditási és mortalitási statisztikákban, ezért az atherosclerosis pathomechanizmusának megismerése kiemelkedQ jelentQség_. Az atherosclerosis kialakulásában az egyik legfontosabb rizikótényezQ a hypercholesterinaemia, ezen belül kiemelkedQ jelentQsége van az LDL-nek. Az érelmeszesedés kezdeti lépése a “fatty streak” laesio kialakulása, melyet az LDL oxidatív módosulása indít el. Az LDL foszfolipidjeinek hosszú szénláncú, többszörösen telítetlen zsírsavjai oxidálódnak, melynek következtében a foszfolipáz A2-re érzékenyebbé válnak. A foszfolipáz hatására képzQdQ zsírsavak érzékenyebbek az oxidációra, így az LDL-ben oxidatív láncreakció jön létre, melynek végeredménye az LDL fQ apolipoproteinjének, az apoB100-nak a degradációja. Az oxidált LDL-t a macrophagok és macrophag-szer_ sejtek az ún. scavenger receptoron keresztül képesek felvenni, így a sejtekben koleszterin felhalmozódását gátló negatív feedback elmarad, melynek következtében a sejtek koleszterin tartalma jelentQsen megnQ, és ún. foam sejtekké, vagy másnéven habos sejtekké alakulnak. Az oxidált LDL képes a nukleáris transzkripciós faktor, az NFmB aktivációjára is, melynek eredményeként a monocyta kemotaktikus peptidek és adhéziós molekulák expressziója fokozódik, elQsegítve az atherosclerosis folyamatát. A szervezet számos endothel-védQ mechanizmussal rendelkezik. Az NO képes gátolni az LDL oxidációt, a monocyták adhézióját és penetrációját az érfalban. Zsíroldékony antioxidánsok (ubiquinol-10, alfa-tocoferol, béta-karotin, stb.) képesek megvédeni az apoB-t a lipid-peroxidációval szemben.
5
A lipid peroxidáció során a többszörösen telítetlen zsírsavak reaktív szabadgyökök hatására több lépésen keresztül peroxi, hidroperoxi, alkoxi ill. alkil gyökökké, majd aldehiddé vagy ketonná, és hidroxi-savvá alakulnak. Ezek mindegyike képes DNS száltörést, DNS-protein keresztkötést, ill. DNS adduktot létrehozni, ezáltal genotoxikus hatást kifejteni. A lipoprotein partikulumok közül a HDL képes gátolni az atherosclerosist. Ez a gátló hatás részben a HDL által biztosított reverz koleszterin transzporttal magyarázható, másrészt a HDL-hez kötött antioxidáns hatással. Ezért az antioxidáns hatásért jelentQs részben a HDL-hez kötött észter hidroláz, a paraoxonáz (PON) felelQs, mely fQleg az apolipoprotein A1 és apolipoprotein J komponensekhez kötQdik. A PON gátolja a rézindukálta LDL oxidációt, valamint az oxidált LDL és a lipidek indukálta gyulladásos választ az artériafalban. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a lipidanyagcsere zavarával járó kórképekben, például diabetes mellitusban, krónikus veseelégtelenségben és vesetranszplantációt követQen, valamint familiáris hypercholesterinaemiában a HDLhez kötött paraoxonáz aktivitás csökken. Számos PON polimorfizmus ismert, melyek közül a Gln192->Arg (Q->R) és a Leu55>Met (L->M) a legfontosabb. Amikor a 192-es helyen glutamin van jelen az enzimben, akkor az aktivitás alacsony, ha ugyanebben a pozícióban arginin van, akkor átlagban nyolcszor nagyobb aktivitás figyelhetQ meg. Az enzim aktivitását elsQsorban a 192-es pozícióban észlelt polymorphizmus határozza meg, míg az 55-ös pozícióban lévQ polymorphizmus az enzim mennyiségét befolyásolja. Nem tisztázott, hogy hyperlipidaemiás betegeknél a csökkent antioxidáns kapacitás és a szérumban nagy mennyiségben jelenlévQ lipidek hogyan befolyásolják az oxidatív stressz
6
hatására kialakuló DNS-károsodást. Korábban nem vizsgálták a paraoxonáz esetleges preventív szerepét az oxidatív DNS-károsodásra. A két leglényegesebb paraoxonáz polimorfizmus meghatározását többnyire PCR, majd restrikciós enzimekkel történQ hasítást követQen elvégzett restrikciós fragmenthossz analízis segítségével végezték. Bár ezen módszerek széles körben elterjedtek, idQ- és munkaigényesek, és számos hibalehetQséget hordoznak a nemspecifikus PCR termékek jelenléte miatt. Ezért szükséges újabb technikák alkalmazása, korszer_, gyors és hatékony módszer kifejlesztése ezen antioxidáns hatással rendelkezQ enzim leggyakoribb genetikai változatainak meghatározására.
7
II.
Irodalmi áttekintés
1. Az LDL oxidáció szerepe az atherosclerosis kialakulásában 1.1 LDL oxidáció Az LDL lipidfrakciója a többi lipoprotein részecskéhez hasonlóan két részre osztható: magja koleszterin-észtert és trigliceridet, míg a külsQ köpeny foszfolipideket, elsQsorban lecitint, szfingomyelint és lizolecitint, valamint koleszterint tartalmaz. A fehérje frakció legfontosabb eleme az LDL fQ apolipoproteinje, az ApoB-100. Az LDL zsírsavtartalmának több mint fele többszörösen telítetlen zsírsav (PUFA), fQként linolénsav, valamint arachidonsav. Ezen PUFA-k szabadgyökök általi oxidatív károsodása ellen az LDL partikulumhoz asszociált alfa-tokoferol, karotinoid, ubiquinol, stb. védQ hatást fejt ki. Az LDL oxidációjában fémionok, lipoxigenázok, myeloperoxidázok és reaktív nitrogén gyökök játszanak szerepet. A fémionok, pld. a Fe2+ és a Cu2+ hatására az endogén antioxidánsok kimerülését követQen a telítetlen zsírsavak gyors oxidációjával lipid hidroperoxidok, majd reaktív aldehidek képzQdnek. Ezek a lizin gyökök pozitív töltés_ g-amino csoportjával reagálva az LDL töltését negatív irányba tolják el, így az nagyobb affinitással kötQdik a scavenger receptorokhoz (1). A lipoxigenázok közül a 15lipoxigenázt az endotheliális sejtek, valamit monocyták és makrofágok termelik. A többszörösen telítetlen zsírsavakat hidroperoxidokká alakítják, túltermelQdésük korai érelmeszesedéshez vezet LDL-receptor deficiens egerekben (2). A myeloperoxidázokat aktivált makrofágok termelik, melyek reaktív gyököket képeznek, pld. hypoklórossavat (HOCl), klóraminokat, tirozil gyököket, valamint nitrogén-dioxidot (NO2), melyek oxidálják az LDL lipid- és fehérje-komponenseit (3). A nitrogén-monoxidot (NO), mely gátolja a Cu2+ által indukált LDL oxidációt, számos vaszkuláris sejt termeli. Aerob 8
körülmények között nitritté alakul, mely fiziológiás koncentrációban gátolja a myeloperoxidáz általi LDL oxidációt, az alkoxil és peroxil gyökök megkötésével pedig antioxidáns hatást fejt ki. Szuperoxid anionnal reagálva viszont peroxinitritté alakul (ONOO-), mely hidroxil gyökökön keresztül oxidálja az LDL-t (4). A peroxinitrit szintén képes oxidálni a tetrahidrobiopterint, mely az NO szintetáz (NOS) fontos kofaktora, ezáltal csökkenti az NO termelést (5).
1.2 A scavenger receptorok szerepe az oxidált LDL felvételében A módosult, így az oxidált LDL-t a makrofágok és makrofág-szer_ sejtek az ún. scavenger receptorokon (SR) keresztül nagy mennyiségben, gyorsan és kontrollálatlanul képesek felvenni. A scavenger receptorok több osztályba sorolhatók. Az A osztályba sorolt SR-A az oxidált LDL felvételén keresztül fontos szerepet játszik az atheroszklerotikus
plakk
kialalkulásában.
Expresszióját
a
monocytákban
és
makrofágokban a M-CSF (makrofág kolónia stimuláló faktor) fokozza, míg az INF-i (interferon gamma), TGF-d (transforming growth factor beta) és PPAR-i (peroxisoma proliferator-activated receptor gamma) ligandjai gátolják (6). A B osztályba tartozó CD36-ot
thrombocyták,
monocyták,
endotheliális
sejtek,
valamint
adipocyták
expresszálják. Az oxidált LDL-hez kb. háromszor nagyobb affinitással kötQdnek, mint a natív LDL-hez (7). A CD68, vagy macrosialin egy makrofágok és dendritikus sejtek által expresszált scavenger receptor, melynek pontos szerepe a humán atherosclerosis folyamatában még nem tisztázott, ám egerekben a minimálisan oxidált LDL fokozta a macrosialin expresszióját (8). Az ún. lecitin-like oxidized LDL receptor (LOX-1) elsQsorban az endotheliális sejteken, kisebb mértékben simaizom sejteken és
9
makrofágokon expresszálódik. A LOX-1-en keresztüli oxidált LDL felvétel a lipidek gyors felhalmozódásához vezet, valamint endothel aktivációt és diszfunkciót indukál (9, 10).
1.3 Az oxidált LDL szerepe az atherosclerosis kialakulásában Az oxidatívan módosult LDL az atherosclerosis kezdeti szakaszának több fontos eseményében is lényeges szerepet játszik. A fatty streak kialakulásának elsQ lépése a makrofágok adhéziója és infiltrációja az érfalba. A makrofágok az oxidált LDL nagy mennyiségü kontrollálatlan felvétele és tárolása következtében habos sejtekké alakulnak át. A mérsékelten oxidált LDL fokozza néhány adhéziós molekula, így az intracellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) és a vascular adhesion molecule 1 (VCAM-1) expresszióját (11, 12). A minimally modified LDL (MM-LDL) elQsegíti a monocyta proliferációt és differenciációt is az M-CSF endothel sejtek általi termelésének fokozásával (13). Az oxidált LDL fokozza a monocyta chemotactic protein 1 (MCP-1) endotheliális szekrécióját, ami elQsegíti a monocyta infiltrációt az érfalba (14). Mindezek hatására a monocyták motilitása csökken, kitapadásuk és bejutásuk a keringésbQl a szubendotheliális térbe fokozódik. Az atherosclerosis progressziója során a simaizomsejtek fenotípusa megváltozik, melynek hatására az érfal intima rétegébQl a mediába vándorolnak, ahol proliferálnak, növekedési hormonokat, exracelluláris mátrix glycoproteineket és metalloproteázokat termelnek (15). Az oxidált LDL az endothel és simaizomsejtek PDGF (platelet-derived growth factor) expressziójának fokozásával elQsegíti a simaizomsejtek migrációját (16). A habos sejtek felhalmozódása és a simaizomsejtek migrációja és proliferációja következtében az intima
10
elvékonyodik, ami az artériafal vazodilatatív kapacitásának csökkenéséhez vezet. Az oxidált LDL az NO szintézis gátlásával érösszehúzó hatást fejt ki, és fokozza az endotheliális sejtek endothelin expresszióját (17, 18). Az endotheliális és simaizomsejtek apoptózisa az arterioszklerotikus plakk ruptúrájának egyik oka. Ennek hátterében az oxidált LDL oxiszterol-tartalma állhat, mely képes apoptózist indukálni a MAP és Jun/SAP kináz rendszeren keresztül, valamint fokozza a p53 termelést (19). Az endotheliális funkció zavarához fokozott thrombocyta-aggregáció és károsodott fibrinolitikus funkció társul. Az oxidált LDL a NO termelés csökkenésével, a prosztaciklin (PGI2) termelés gátlásával, valamint egyéb prosztaglandinok termelésének fokozásával hozzájárulnak a thrombocyták fokozott mérték_ adhéziójához és aggregációjához (20). Az oxidált LDL fokozza a szöveti faktor termelését, aktiválva ezzel az alvadási kaszkádot, ugyanakkor csökkenti a thrombomodulin transzkripciót, ezáltal prokoaguláns hatású (21, 22).
2. A HDL preventív szerepe az atheroszklerózis kialakulásában 2.1 HDL szerkezete A HDL 70-100 Å átmérQj_, 50%-ban lipidek, 50%-ban fehérjék által alkotott makromolekuláris komplex, molekulatömege 200-400 kDa. A lipid-frakció 32%-ban koleszterin-észtert, 5%-ban szabad koleszterint, 55%-ban foszfolipidet és 8%-ban trigliceridet tartalmaz. A fehérje-frakciót 70%-ban ApoA1, 20%-ban ApoA2, 10%-ban egyéb fehérjék alkotják. Ultracentrifugálással a HDL legalább két további frakcióra bontható. A “könnyebb” HDL2 relatíve gazdag lipidekben, és kevesebb fehérjét tartalmaz a “nehezebb” HDL3-hoz képest. Az apolipoprotein-tartalom alapján megkülönböztetünk
11
kizárólag 4 db ApoA1-et (HDL2), 2 ApoA1-et és 2 ApoA2-t tartalmazó (HDL3), valamint apoE-ben gazdag HDL-t. Ez utóbbi HDL frakció “könnyebb”, mint a HDL2. A két fQ apolipoprotein, az ApoA1 és az ApoA2 a májban szintetizálódik. Az apoA1-et a vékonybél is szintetizálja kisebb mennyiségben az ApoA4-el együtt (23). A májsejtekben és a bélhámsejtekben az ATP binding casette transporter ABC1 képes megkötni a szabad apolipoproteineket, pld. az ApoA1-et, és foszfolipid, valamint koleszterin hozzáadásával lapos, korong alakú nascens HDL-t képezni, mely fQként apoE-t és apoC-t tartalmaz. A keringésben a perifériás sejtekbQl a lecitin koleszterol aciltranszferáz (LCAT) hatására a HDL koleszterin észtert vesz fel, ezzel kialakul a még mindig korong alakú HDL3. Ez további koleszterin észter felvételével gömb alakú HDL2-vé alakul, miközben az apoE tartalma apoA1-re cserélQdik. A HDL2 egy kisebb része ismét HDL3-má alakul a hepatikus lipáz hatására, nagyobb része a koleszterin észter transzfer protein (CETP) segítségével a koleszterin észter tartalmát a VLDL és IDL részecskéknek adja át, vagy közvetlenül a májba juttatja az SR-BI receptorokon keresztül. (24).
2.2 A HDL érelmeszesedést gátló hatása Az atherosclerosis kezdeti lépéseként monocyták belépnek a keringésbQl a szubintimális térbe, majd a makrofággá alakult monocyták felveszik az oxidált LDL-t scavenger receptoraikon keresztül. Az így felvett koleszterin és koleszteril észter fehalmozódásának hatására azok habos sejtekké alakulnak át. A HDL több ponton képes gátolni ezt a folyamatot. Közvetlen hatást fejt ki az érfalra, mivel gátolja a monocyták a VCAM-1 és ICAM-1 által mediált endotheliális adhézióját (25). Gátolja az LDL retencióját és aggregációját az érfalban. Csökkenti az LDL oxidáció mértékét, azaz antioxidáns hatást
12
fejt ki (26). Fokozza a koleszerin kijutását a habos sejtekbQl, mely a keringésen át a májba jut (reverz koleszterin transzport) (24). ElQsegíti az endothel sejtek által termelt anti-thrombocyta eikozanoid, a posztaglandin I2 (prostacyclin) képzését, csökkentve ezzel a thrombocyta aggregációt, így az atheroszklerotikus plakk progresszióját (23).
2.3 A HDL antioxidáns hatása A szérum HDL koncentráció és az érelmeszesedés közötti negatív korrelációt számos multicentrikus vizsgálat bizonyította. A HDL érelmeszesedést gátló hatásának tisztázása intenzív kutatási terület a mai napig. Az eddigi eredmények alapján a reverz koleszterintranszportban játszott központi szerepe, valamint az érfalra gyakorolt direkt atheroprotektív hatása mellett kiemelt jelentQséggel bír a HDL antioxidáns hatása, melyért jelentQs részben a HDL-hez kötött enzimek felelQsek. Közülük legjelentQsebb a humán paraoxonáz-1 (PON1), de jóval kisebb mértékben néhány egyéb HDL-hez kötött enzim pld. platelet-activating factor acetil hidroláz (PAFAH), lecitin-koleszterol aciltranszferáz (LCAT) és az apolipoprotein A1 (ApoA1) is hozzájárul a HDL lipid peroxidációt gátló hatásához. A HDL antioxidáns hatásához hozzájárul a lipid hidroperoxidok eltávolítása az LDL-bQl, azok elszállítása a májba a reverz transzportmechanizmus részeként, valamint egyes prooxidáns hatású átmeneti fémek megkötése (27).
13
3. A paraoxonáz 3.1 A humán paraoxonáz-1 A humán paraoxonáz-1 (PON1) egy 345 aminosavból felépülQ, 43 kDa molekulasúlyú fehérje. Szerkezete emlQsökben meglehetQsen konzervatív, míg madarakban, halakban, és más gerincesekben hiányzik. Génje a 7.kromoszóma hosszú karján helyezkedik el a q21.3 és q22.1 közötti régióban (28, 29). A PON1 egy kalcium dependens észteráz, mely a májban szintetizálódik. A PON1 a szérumban csaknem kizárólag az apolipoprotein A1-et (apoA1) és clusterint (apoJ) tartalmazó HDL szubpopulációhoz kötött (30). Képes reverzibilis módon megkötni és hidrolizálni az organofoszfátokat, valamint számos egyéb szerves észtert (31). A lipidperoxidációt gátló hatását, mely gátolja az LDL oxidatív módosulását, in vitro és in vivo tanulmányok igazolták (32, 33, 34). Csökkent
PON1
aktivitást
észleltek
számos
olyan
kórképben,
amelyben
az
érelmeszesedésre való hajlam fokozott, például familiáris hiperkoleszterinémiában, 1-es és 2-es típusú diabetes mellitusban (35, 36), veleszületett HDL hiányban (37), miokardiális infarktusban (38), krónikus vesebetegségben (39), dializált és veseátültetett betegekben (40).
3.2 Paraoxonáz polimorfizmusok A PON1 aktivitást részben genetikai tényezQk határozzák meg. A két leggyakoribb PON1 polimorfizmus a Gln192->Arg (Q->R) és a Leu55->Met (L->M). A 192-es lókusz polimorfizmusának hatása a PON1 aktivitásra szubsztrátfüggQ. Míg a Q alloenzim gyorsabban hidrolizálja a diazoxont, a sarint és más ideggázokat, addig az R alloenzim
14
nagyobb affinitást mutat a paraoxon vagy feniroxon iránt. Más szubsztrátokat, mint például a fenilacetátot mindkét alloenzim hasonló sebességgel bontja (41). Az 55-ös lókusz polimorfizmusa a 192-es locus polimorfizmusától független módon, kevésbé markánsan, de szintén befolyásolja a PON1 aktivitást, elsQsorban az enzim koncentrációjának emelésén keresztül (42). A PON1 promoterének polimorfizmusai közül leggyakoribb a Cys-107->Thr, mely befolyásolja
a
PON1
gén
expresszióját
és
szérum-koncentrációját,
független
rizikótényezQnek bizonyult koszorúér-betegségben szenvedQ 2-es típusú diabeteses betegekben (43). Számos egyéb PON1 promoter polimorfizmus ismert, ezek hatása a PON1 koncentrációra és aktivitásra egyenlQre tisztázatlan (44).
3.3 A PON2 es PON3 A géncsalád másik két ismert tagja a paraoxonáz-2 (PON2) és a paraoxonáz-3 (PON3), melyek biológiai szerepe egyenlQre csak részben tisztázott. A PON2-t a máj mellett számos egyéb szerv is expresszálja, például a vesék, a herék és az agy (45). A humán PON3 a PON1-hez hasonlóan a májban szintetizálódik, HDL-hez kötött formában van jelen a szérumban, és gátolja az LDL oxidációt (46). Nyulakban laktonáz-aktivitással rendelkezik (47). A három humán PON gén aminosav szinten 65%-ban mutat azonoságot, így feltételezhetQ, hogy a géncsalád tagjai duplikáció révén keletkeztek (48).
15
4.Oxidatív DNS-károsodás 4.1 Az oxidatív DNS-károsodás folyamata és következményei A DNS szerkezetének károsodása, legyen az bázispár-mutáció, deléció, inzerció vagy egyéb változás, a karcinogenezis elsQ lépését jelenti. A DNS-károsodás többnyire oxidáció, ritkábban metiláció, depurináció, vagy dezamináció eredménye. A DNS oxidatív károsodásáért részben a reaktív oxigéngyökök felelQsek: a szuperoxid anion (O20-), hidroxil- (OH0), peroxil- (RO20) és alkoxil-gyökök (RO0), részben azok az ágensek, melyek hajlamosak reaktív oxigéngyökké konvertálódni, mint a HOCL, peroxinitrit (ONOO-), szinglet oxigén (1O2) és hidrogén-peroxid (H2O2). A metiláció, depurináció, vagy dezamináció hátterében a reaktív nitrogéngyökök, mint a nitrogén-oxid gyök (NO0), nitrogén-dioxid gyök (NO20) és a már említett peroxinitrit állnak (49). A lipid-peroxidáció a DNS-károsodás másik, ritkábban tárgyalt útja. A lipid-peroxidáció során a többszörösen telítetlen zsírsavak a már említett reaktív oxigéngyökök hatására több lépésen keresztül számos olyan köztes reaktív termékké alakulnak át, melyek a DNS-károsodását okozzák. A láncreakció kezdeti szakaszában a PUFA metilén csoportja reagál a reaktív oxigéngyökökkel, a propagációs szakaszban peroxi-, hidroperoxi-, alkoxi, illetve alkilgyökökké, a terminációs szakaszban aldehiddé, ketonná vagy hidroxisavvá alakul. Ezek bármelyike képes DNS száltörést, DNS-protein keresztkötést, illetve DNS adduktot létrehozni azokon a pontokon, melyeket ‘nuclear membranechromatin attachment site’-nak neveznek. A sejtmag ezen területein a DNS fizikailag is olyan közelségbe kerül a sejtmag membránjának lipidjeihez, mely lehetQvé teszi a fent ismertetett reakciókat (50).
16
A különbözQ ágensek eltérQ hatást fejtenek ki a DNS szerkezetére. A leggyakoribb az oxidatív báziskárosodás a 8-hidroxiguanidin (8-OHG), amit kezdetben használtak az oxidatív DNS-károsodás mértékének jellemzésére is. A vizeletben mért 8-OHG szintjét azonban táplálkozási tényezQk befolyásolják, ezért a gyakorlatban a 8-hidroxi-6dezoxiguanozin (8-OHdG) szintet mérik HPLC (high pressure liquid chromatography) vagy GC-MS (gas chromatography- mass spectrometry) technikával (49). Számos egyéb módszert is említ az irodalom az oxidatív DNS-károsodás mérésére, ezek egyike az un. single cell gel electrophoresis.
4.2 Single cell gel electrophoresis (Comet assay) A comet assay (single cell gel electrophoresis) egy, a DNS-károsodás meghatározására kifejlesztett módszer, amit széles körben használnak a karcinogenezis és a geriátriai kutatásban, valamint a toxikológiában a különbözQ környezeti ágensek genotoxikus hatásának vizsgálatára. ElsQként a svéd Rydberg és Johanson alkalmazta a DNSkárosodás detektálására az agaróz gélbe ágyazott sejtek eletroforézisét 1978-ban (51), majd 1998-ban Singh alkalmazta a módszert alkalikus puffert használva (52), mely megfelelQen szenzitívvé tette a comet-assay-t genotoxicitási vizsgálatok elvégzéséhez. A módszer lényege, hogy az izolált sejteket tárgylemezre öntött agaróz gélbe ágyazzák, detergensek és magas koncentrációjú sót tartalmazó oldat segítségével lizálják, majd alkalikus pufferbe helyezve elektroforézist alkalmaznak. A negatív töltés_ DNS az elektroforézis során az anód felé vándorol. A DNS jelölésére etidium-bromidot (EtBr) alkalmaznak. Fluoreszcens mikroszkóppal értékelve a lemezeket a nukleuszokból elvándorló DNS-száltörések miatt képzQdQ fragmentumok vagy hurkok üstököshöz
17
hasonló csóvát alkotnak, melyrQl a módszer a nevét kapta. A csóva nagysága a DNSkárosodás mértékével arányos (52). A módszer elQnye, hogy individuálisan értékelhetQek a sejtek, ezért a genotoxicitás szempontjából eltérQen viselkedQ sejtpopulációk felismerhetQek, bármely eukarióta sejten alkalmazható, ezenkívül gyors, kevéssé m_szerigényes, viszonylag olcsó, így széles körben alkalmazható. Az ismertetett módszer DNS egyesszál-törések kimutatására alkalmas már egészen kis mérték_ károsodás esetén, mivel az egyesszál-törések relaxációt okoznak a DNS többszörösen csavart szerkezetében, így a sérült DNS-lánc hosszabb-rövidebb hurkokat képez. A különbözQ DNS-t érintQ reakciók, legyen az bázis vagy nukleotid excíziós repair, direkt száltörés, interkaláló ágensek, DNS adduktok miatti excízió, endonukleáz, lizoszómális DNS hidroláz vagy topoizomeráz hatás, végül egyesszál-töréshez vezetnek, így comet-assay segítségével kimutathatóak. A különbözQ antioxidánsok DNS-károsodás szempontjából kifejtett preventív hatásának megítélésére a sejteket oxidatív hatásnak teszik ki, például H2O2 alkalmazásával. A H2O2 egyrészt reaktív OH0 gyököt képezve fejti ki károsító hatását, mely a Fenton-reakció során képzQdik átmeneti fémek, például Fe2+ jelenlétében, másrészt nukleázokat aktivál, melyek hasítják a DNS-láncot (53). A comet-assay-t egyre elterjedtebben alkalmazták az antioxidánsok hatékonyságának megítélésére. Jenkinson és mtsai az E-vitamin és a magas PUFA tartalmú diéta hatását vizsgálták a DNS-károsodásra (54). Collins és mtsai a szérum karotinoidok preventív hatását írták le (55). Korábban nem vizsgálták azonban a paraoxonáz esetleges szerepét az oxidatív DNS-károsodás prevenciójában.
18
5. LightCycler KülönbözQ gének polimorfizmusainak detektálására évitzedeken keresztül a restrikciós fragmenthossz polimorfizmus (RFLP) analízist alkalmazták. Ez a módszer idQ- és munkaigényes, nem automatizálható, mivel az amplifikációt követQen további lépésekre, mint például restrikciós enzimekkel történQ hasításra és gélelektroforézisre van szükség, így a hibák, például a kontamináció lehetQsege nem elhanyagolható. Az utóbbi években fluoreszcens technikára épülQ ún. real-time PCR készülékeket fejlesztettek ki nagy létszámú populáción elvégzendQ gyors génpolimorfizmus-vizsgálatokhoz, ezek egyike a LightCycler (Roche Molecular Biochemicals). A LightCycler egy mikrovolumen fluorométerrel kombinált gyors ciklusú PCR készülék. A polimorfizmus detektálásához szekvenciaspecifikus, fluoreszcens jelöléssel ellátott detektáló próbák szükségesek, ezek alkalmazásával nincs szükség a PCR-t követQ lépésekre, így a módszer rendkívül effektív, gyors, és a termék mennyisége is meghatározható. Az alkalmazott üvegkapillárisok gyors hQmérsékletváltozása, a reakcióelegy kis mennyisége miatt a ciklushossz erQsen lerövidült. A vizsgálni kívánt génszakasz PCR-ral történQ amplifikációjának monitorozására az ún. fluorescence resonance energy transzfer (FRET) jelenséget használják (1.ábra). Detektáló próbát terveznek a vizsgált génszakasszal komplementer módon úgy, hogy a variábilis nukleotid a próba közepére essen. A két hibridizációs próba tervezése oly módon történik, hogy azok fluoroforral történQ jelölése egymáshoz közel, 1-3 nukleotidnyi távolságra kerüljön. A detektáló próba 3’ végén elhelyezkedQ ún. donor fluorofor emissziós spektruma átfed a másik hibridizációs próba 5’ végén elhelyezkedQ ún. akceptor fluorofor excitációs spektrumával. Ez az elQbbit gerjesztve az energiát közvetít az akceptor fluorofornak,
19
melynek emittált fluoreszcenciája detektálható, és a PCR termék mennyiségének követésére alkalmas, mégpedig ciklusról ciklusra, így a PCR hatékonysága folyamatosan monitorozható. A mutáció-analízishez ún. olvadási görbéket alkalmaznak. A PCR-t követQen a reakcióelegyet kb. 45 oC-ról lassan kb. 75 oC-ra hevítik, így a donor fluoroforral jelölt detektáló próba fokozatosan leválik a vizsgált génszakaszról, mely az akceptor fluoroforral jelölt próba által kibocsájtott fluoreszcencia intenzitásának csökkenésével követhetQ. Ha a komplementer génszakasz eltér a dektektáló próba szekvenciájától, az olvadás alacsonyabb hQmérsékleten következik be, így a fluoreszcencia idQbeli változása megváltozik. Az olvadási görbéket matematikai eszközökkel olvadási csúcsokká konvertálják, melynek segítségével a génvariációk egymástól biztonságosan és könnyedén elkülöníthetQk (56). A módszert számos gén esetében már sikerrel alkalmazták, például apolipoprotein B3500 mutáció,
apolipoprotein
E
izoformok,
prothrombin
G20210A
mutáció,
metiléntetrahidrofolát reduktáz C677T mutáció, és az c1-antitripszin Z és S allél kimutatására (57, 58, 59). 1.ábra
h
P Anchor próba
P ssDNA
Hibridizációs próba Donor fluorofor Akceptor fluorofor
h P ssDNA
A fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) elve
20
III.
Célkit_zések
1. Az egészséges kontrollok és a hyperlipidaemiás betegek lymphocytáiban a hidrogénperoxid által indukált oxidatív DNS-károsodás meghatározása comet-assay alkalmazásával. 2. Ezen betegek granulocytái szuperoxid anion termelésének meghatározása nyugalmi és stimulált állapotokban, és összevetése a DNS-károsodás mértékével. 3. A szérum lipidszintek, a lipid-peroxidációt jellemzQ plazma TBARS, valamint NO, és egy másik nem enzimatikus antioxidáns, az alfa-tokoferol szintjének meghatározása, és összevetése a DNS-károsodás mértékével. 4. A HDL-hez kötött antioxidáns hatású paraoxonáz aktivitásának meghatározása, és összevetése a DNS-károsodás mértékével. 5. Egy korábban paraoxonáz polimorfizmus detektálásra még nem alkalmazott, realtime PCR módszer kifejlesztése a két leggyakoribb paraoxonáz polimorfizmus, a Leu55›Met és a Gln192›Arg genotipizálására.
21
VI.
Betegek és módszerek
Betegek A beválasztási kritériumok az alábbiak voltak: 21-70 év közötti életkor, korábban nem kezelt II/a típusú hypercholesterinaemia (szérum triglicerid <2,2 mmol/l, LDL koleszterin >4,2 mmol/l). Kizárási kritériumok voltak: máj-, endocrin- vagy vesebetegség (szérum kreatinin szint@130 omol/l), alkoholizmus, gyógyszerfüggQség, epekövesség, malignus alapbetegség, terhesség vagy szoptatás, antikoaguláns- vagy lipidcsökkentQ kezelés, dohányzás. Valamennyien a National Cholesterol Education Program (NCEP) step 1 diétáját követték. A vizsgálat ideje alatt a betegek fizikai aktivitása lényegesen nem változott. A bakteriális vagy
vírusos
fertQzésre
utaló
laboratóriumi
markerek
(CRP,
leukocytaszám,
Westergreen) normál tartományban voltak. A kontroll csoportot a klinika járóbeteg szakrendelésén megjelenQ, rutin belgyógyászati fizikális vizsgálat, laboratóriumi vizsgálatok, EKG alapján egészségesnek bizonyult, nem dohányzó, gyógyszeres kezelésben nem részesülQ egyének alkották. A betegek felvilágosítást követQen beleegyezQ nyilatkozatot írtak alá a vizsgálatba való bevonásukhoz. A vizsgálat a Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Etikai Bizottságának szabályzata szerint történt.
Laboratóriumi vizsgálatok Minimum 12 órás éhezést követQen reggel éhgyomorra történt a vérvétel. A vérmintákból hemoglobin, hematokrit, fehérvérsejt-szám, májenzimek, urea, kreatinin, CK, fibrinogén, C-reaktív protein, bilirubin, húgysav, vércukor, összkoleszterin, HDL-C, triglicerid,
22
apoA1 és apoB100, lipoprotein(a), szérum paraoxonáz aktivitás meghatározást végeztünk. A lipidparaméterek meghatározása friss szérumból történt. A paraoxonáz aktivitás mérése –20°C-on tárolt szérumból történt.
Szérum lipidszintek meghatározása A szérum koleszterin- és triglicerid-szintet Boehringer-Mannheim enzim kittel, a HDLkoleszterint foszfor wolframát-magnézium kicsapásos módszerrel határoztuk meg. Az LDL-C értékét a Friedewald-formula alapján számítottuk ki. Az apolipoproteinek mérése immun-nefelometriás módszerrel történt (Orion Diagnostica kit).
Alfa-tokoferol meghatározása Az alfa-tokoferol extrakciója 500 og fehérje/ml koncentrációjú LDL-bQl történt etanol és metanol 1:1 arányú keverékének hozzáadásával, n-hexánnal. A szerves réteget N2 alatt bepároltuk, metanolban oldottuk, majd HPLC (Hitachi-Merck) –hez csatolt fluoreszcens detektort alkalmaztunk 292 nm-es excitációs, valamint 325 nm-es emissziós hullámhosszon.
Paraoxonáz aktivitás meghatározása A szérum paraoxonáz aktivitás mérésekor paraoxont (O,O-dietil-O-p-nitrofenilfoszfát= Sigma) alkalmaztunk szubsztrátként, amely a szérumban levQ paraoxonáz enzim hatására 4-nitrofenollá alakul át, abszorpciónövekedést okozva 412 nm-en. Méréskor 50 ol szérumhoz 1 ml Tris/HCl puffert (100 mmol/l, pH:8,0) adtunk, mely 2 mmol/l CaCl2-t és 5,5 mmol/l paraoxont tartalmazott. A 4-nitrofenol keletkezését 412 nm-en, 25flC-on
23
követtük Hewlett-Packard 8453 UV-Visible spektrofotométerrel. Az enzimaktivitás számítása a moláris extinkciós koefficiens (17100 M-1cm-1) segítségével történt. 1M NaCl jelenlétében az enzim aktív helyének konformációs állapota megváltozik, amely a paraoxon könnyebb kötQdését és gyorsabb átalakulását eredményezi.
Arilészteráz aktivitás meghatározása Az
arilészteráz
aktivitás
meghatározása
fenilacetát
szubsztrát
hidrolízisével
spektrofotometriás módszerrel történt. Az enzimaktivitást U/ml egységben fejeztük ki. 1 U az arilészteráz aktivitás, ha 1 perc alatt az enzim 1 omol fenilacetátot hidrolizál.
NO meghatározása A meghatározás friss plazmából Griess-reakcióval történt (60). A friss plazmát ZuSO4 – tal ill. Cd-szuszpenzióval kezeltük. Centrifugálás után a felülúszót 1%-os szulfanilamid és 0,1%-os naftil-etilén-diaminnal inkubáltuk 10 percig 60oC -on. A keletkezQ színt 546 nm-en fotometráltuk.
TBARS meghatározás A TBARS koncentrációt a humán plazmából szerves oldószerrel történt extrakciót követQen spektrofotométerrel határoztuk meg. A plazmát SDS-sel történQ elQkezelés után (pH=3,5) tiobarbitursav vizes oldatával inkubáltuk 95oC-on 60 percig. Ezután n-butanolpiridin elegyével történQ extrakció után a szerves fázis optikai denzitását mértük spektrofotométerrel 532 nm-en.
24
Polymorphonuclearis granulocyta szeparálás A polymorphonuclearis granulocyták szeparálása s_r_séggradiens centrifugálással történt Boyum módszere szerint (61). A sejtek 96%-a tripánkék festés alapján életképes volt.
A szuperoxid anion termelés mérése A szuperoxid anion termelést ferri-citokróm-C redukált mennyiségének mérésével határoztuk meg spektrofotometriás módszerrel 550 nm-en. A nyugvó sejtek szuperoxid anion termelése mellett 10-8 M formyl-Met-Leu-Phe-vel (FMLP) és 10-8 M forbolmirisztát-acetáttal (PMA) történQ stimulációt követQen is meghatároztuk a szuperoxid anion termelést. Az eredményeket nmol/106sejt/perc egységben fejeztük ki.
Lymphocyta szeparálás perifériás vérbQl A lymphocyták szerparálása buffy coat-ból történt. 500 ol teljes vért rétegeztünk 500 ol Ficoll felé, majd 15 percig centrifugáltuk (1000 g) . A buffy coat-ot óvatosan leszívtuk, majd a sejteket PBS-ben mostuk, majd ismét centrifugáltuk 15 percig (1000 g).
Single cell gel electrophoresis (comet-assay) A szeparált humán lymphocytákat 600 ol, 1%-os LMP agarózban (pH 7,4) szuszpendálva 37 oC-on érdesített felszín_ üveg tárgylemezre pipettáztuk, melyet elQzQleg 1% NMP agarózzal fedtünk. Az agarózt 10 percig 4 oC-on tartottuk, majd a tárgylemezeket 50 ol H2O2-t tartalmazó 100 ml PBS-ben inkubáltuk 35 percig. Ezután a tárgylemezeket 4oC-os lizáló pufferbe (2,5 M NaCl, 10 mM Tris, 100 mM Na2 EDTA, NaOH, 1%, Triton X100, pH=10,0) helyeztük 60 percre, eltávolítva ezzel a sejtfehérjéket. A lysist követQen a
25
tárgylemezeket 30 percre horizontális elektroforézis tartályba helyeztük, mely 1 mM Na2EDTA, 0,3 M NaOH, pH=2,7 puffert tartalmazott, majd futtattuk (25 V, 300 mA, 20 perc,15oC). A tárgylemezeket háromszor 3 percig mostuk 4oC-os neutralizáló pufferrel (0,4 M Tris-HCl, pH=7,5), 50 ol Ethidium bromiddal (EtBr) jelöltük, majd fedQlemezzel fedtük. A comet-assay értékelése vizuális módszerrel történt. Az EtBr-al megjelölt nukleuszokat Zeiss fluorescens mikroszkóp segítségével értékeltük. Összesen 100 cometet értékeltünk vizuálisan tárgylemezenként, öt osztályba sorolva Qket a csóva intenzitása alapján, így 0,1,2,3 vagy 4 értéket kaptak az éptQl a maximálisan károsodottig, ezért az összérték lemezenként 0 és 400 között volt.
Genomiális DNS preparálás A genomiális DNS preparálását egészséges egyének EDTA-val alvadásgátolt perifériás vénás vérébQl végeztük QIAamp Blood Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) segítségével.
A polimeráz láncreakcióhoz felhasznált primerek és hibridizációs próbák A polimeráz láncreakcióhoz felhasznált primereket és hibridizációs próbákat az 1.táblázat tartalmazza. A PON1-55 antisense primert Akhmedova et al. (Akhmedova), a PON1-192 sense primert Mackness et al. (Mackness) tervezte. A PON1-55 detektáló próbát a kevésbé gyakori “Met” variánsra terveztük. A primereket és hibridizációs próbákat a TIB MOLBIOL (Berlin, Germany) szintetizálta.
26
1. Táblázat. PCR primerek és hibridizációs próbák Szekvenciaa
Orientáció PCR termék
PON1-55F
ATTCTGAACCTATTAAAGAAGAGTGATG
Sense
PON1-55R
CTTAAACTGCCAGTCCTAGAAAACG
Antisense
PON1-192F
TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG
Sense
PON1-192R
GACATACTTGCCATCGGGTGAA
Antisense
Primerek
PCR primerek 240 bp
199 bp
Detektáló próbák PON1-55DA
GCTCTGAAGACATGGAGATA-Fb
PON1-192DA
TGACCCCTACTTACAATCCT-F
Anchor próbák PON1-55A
LCRed 640-GCCTAATGGACTGGCTTTCATTAGCTCTGT-phb
PON1-192A
LCRed 640-GAGATGTATTTGGGTTTAGCGTGGTCGTAT-ph
a
A szekvenciákat 5` - 3` irányban tüntettük fel (accession number: AC004022). A
PON1-55 detektáló próbát a kevésbé gyakori, A allélre terveztük. A polimorfizmusok helyét aláhúzással jelöltük. b
F: fluorescein, ph: phosphoryl csoport.
Real-time polimeráz láncreakció és olvadáspont-analízis A PCR-t és az olvadáspont-analízist LightCycler real time PCR (Roche) készüléken végeztük, 20ol térfogatú üvegkapillárisban (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). A 20ol-es reakcióelegy összetétele a következQ volt: 9ol of H2O, 1ol 25 mmol/l koncentrációjú MgCl2, 2 ol 5 pmol/ol koncentrációjú PON1-55F és PON1-55R, illetve PON1-192F és PON1-192R primerek, 1 ol 4 pmol/ol koncentrációjú PON1-55DA és PON1-55A, illetve PON1-192DA és PON1-192A hibridizációs próbák, és 2 ol DNA-
27
Master Hybridization Probes (Roche Molecular Biochemicals), amely Taq polimerázt, reakció puffert,
dNTP elegyet, és 10 mmol/l MgCl2 -ot tartalmazott 10·
koncentrációban. Az amplifikációhoz genomiális DNS-t (2 ol, 50-200 ng) használtunk. A PON1-55 genotipizáláshoz a következQ programot alkalmaztuk: kezdeti denaturációt (94oC, 600 s) követQen, 50 ciklust alkalmaztunk a következQ paraméterekkel: denaturáció 94oC-on 0 s, hibridizálás 50oC-on 5 s, és szintézis 72oC-on 2 s, 20oC/s-os lépéssel. A fluoreszcenciát a hibridizáció minden 5. másodpercében detektáltuk. Az amplifikációt követQen olvadási görbét képeztünk, 150 s-os denaturációt (94oC), majd 30 s-os 45oC-on történQ inkubációt követQen a mintákat lassan 75oC-ig melegítettük 0.2oC/s sebességgel, közben folyamatosan monitoroztuk a fluoreszcencia-intenzitás csökkenését. Az olvadási görbéhez az x tengelyen a hQmérsékletet, az y tengelyen a (-dF/dT)-t jelöltük. A PON1-192 genotipizálás programja a következQ volt: kezdeti denaturációt (94oC, 600 s) követQen 50 ciklust alkalmaztunk az alábbiak szerint: 94oC-on 600 s, hibridizálás 57oC-on 5 s, és szintézis 72oC-on 2 s, 20oC/s-os lépéssel. A fluoreszcenciát a hibridizáció minden 5. másodpercében detektáltuk. Az amplifikációt követQen olvadási görbét képeztünk: 180 s-os 45oC-on történQ inkubációt követQen a mintákat lassan 75oC-ig melegítettük 0.2oC/s sebességgel, közben folyamatosan monitoroztuk a fluoreszcenciaintenzitás csökkenését. Az olvadási görbéhez az x tengelyen a hQmérsékletet, az y tengelyen a (-dF/dT)-t jelöltük. Az amplifikáció és a fluoreszcencia detektálás ugyanabban a zárt kapillárisban történt, kevesebb mint 40 perc alatt.
28
Statisztikai módszerek Statisztikai analízishez a PC SAS (6.12) rendszert használtuk (SAS Institute, Cary NC 275313 USA), leíró statisztikát alkalmaztunk a vizsgált paraméterekre (átlag‒SD), míg a paraméterek idQbeli változását ANOVA teszttel, ill. kétmintás t-próbával vizsgáltuk. A p<0,05 valószín_ségi szintet tekintettük szignifikánsnak. Az egyes paraméterek között korrelációszámítást végeztünk, t-próbát végezve p<0,05 korrelációt tekintettünk szignifikánsnak.
29
V.
Eredmények
A 7 kontroll és a 15 hyperlipidaemiás beteg adatait az 2.táblázatban foglaltuk össze. Nem találtunk szignifikáns eltérést a hyperlipidaemiás és a kontroll csoport alfa-tokoferol szintjében (30.9‒5.2; 36.77‒6.8 oM; p>0.05).
2.Táblázat. A kontroll csoport és a hyperlipidaemiás betegek demográfiai adatai, lipid paraméterei, és alfa-tokoferol értékei Kontroll
Hyperlipidaemiás
(n= 7)
(n= 15)
Nem
2 férfi, 5 nQ
4 férfi, 11 nQ
Életkor (év)
53.4‒8.07
54.6‒10.25
BMI (kg/m2)a
25.7‒2.15
26.3‒3.26
Koleszterin (mmol/l)
4.71‒0.89
7.63‒0.90*
Triglicerid (mmol/l)
1.06‒0.52
2.09‒0.11*
HDL (mmol/l)
1.43‒0.31
1.48‒0.25
LDL (mmol/l)
2.60‒0.60
5.20‒0.85*
Alfa-tokoferol (oM)
30.90‒5.2
36.77‒6.8
a
BMI= body mass index
*p<0.05
Szuperoxid anion termelés A nyugvó granulocyták alapoxidációs szintje a kontroll csoportban 0.7‒0.13 nmol/106sejt/perc, hyperlipidaemiás csoportban 1,17‒0,47 nmol/106sejt/perc volt. Az FMLP-vel történt stimulációt követQen szignifikánsan emelkedett a szuperoxid anion termelés mind a kontroll (7.1‒1.67 nmol/106sejt/perc; p<0.001), mind a hyperlipidaemiás csoportban (2.63‒0.92 nmol/106sejt/perc; p<0.001). A PMA az FMLP-nél jelentQsebb, a nyugvó sejtekhez képest szignifikánsan emelkedett szuperoxid anion termelést váltott ki mind a kontroll (9.94‒1.58 nmol/106sejt/perc, p<0.001), mind a hyperlipidaemiás
30
csoportban (6.76‒2.46 nmol/106sejt/perc, p<0.001). A hyperlipidaemiás csoportban a nyugvó sejtek szuperoxid anion termelése szignifikánsan magasabb volt a kontrollokhoz képest, míg a hyperlipidaemiás betegek granulocytáiban mind a PMA-val (9.94‒1.58; 6.76‒2.46 nmol/106sejt/perc, p<0.001), mind az FMLP-vel történt stimulációt követQen (7.1‒1.672.63‒0.92 nmol/106sejt/perc; p<0.001) szignifikánsan alacsonyabb szuperoxid anion termelés találtunk (2.ábra).
14 Szuperoxid anion 12 6 (nmol/10 sejt/perc) 10
Control Kontroll Hyperlipidemic Hyperlipidaemiás
*
8 6 4 2
* *
0 nyugvó restingsejtek cells
PMA
FMLP
2.ábra. A polymorhonuclearis granulocyták szuperoxid anion termelése (átlag±SD) nyugvó sejteken, PMA-val, ill. FMLP-vel történt stimulációt követQen , *p<0.001
31
TBARS és NO értékek A hyperlipidaemiás egyének plazmájában a lipid-peroxidációt jellemzQ TBARS az egészséges kontrollokhoz képest szignifikánsan magasabb volt (0,36‒0,25; 0,79‒0,31 oM, p<0,001). Az NO szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a hyperlipidaemiás csoportban a kontroll csoporthoz képest (58,1‒12,7; 19,2‒14,9 oM, p<0,001) (3.ábra).
80
1.2 TBARS (µM)
kontroll 1
hyperlipid.
0.8 0.6
kontroll
NO 70 (µM) 60
hyperlipid.
50
*
*
40 30
0.4
20 0.2
10
0
0
TBARS
NO
*p<0.001
3.ábra. A plazma TBARS és NO koncentrációja (átlag±SD) a hyperlipidaemiás ill. a kontroll csoportban, *p<0.001
Szérum paraoxonáz aktivitás A paraoxonáz aktivitás a hyperlipidaemiás betegek szérumában szignifikánsan alacsonyabb volt az egészséges kontrollokhoz képest (186.4‒44.7; 108.0‒49.0 U/l; p<0.001). A sóstimulálta PON aktivitás, amely az enzim maximális aktivitását jelzi, szintén
szignifikánsan
alacsonyabb
volt
a
hyperlipidaemiás
betegekben
a
normolipidaemiás egyénekéhez képest (441‒71.2; 220.33‒136.06 U/l; p<0.001). Az
32
elsQsorban az enzim mennyiségérQl információt adó arilészteráz aktivitás szignifikánsan alacsonyabb volt az egészséges kontrollokhoz képest (129‒31.2; 80.34‒42.1 U/l; p<0.001) (4.ábra). Az egységnyi HDL-re jutó paraoxonáz aktivitás (PON/HDL) a hyperlipidaemiás
csoportban
szignifikánsan
alacsonyabb
volt
az
egészséges
kontrollokhoz képest (182.4‒64,4; 77.8‒43.08 U/mmol; p<0.001).
600 U/l
Control Kontroll Hyperlipidaemiás Hyperlipidemic
500 400 300
*
200 * *
100 0 PON
NaCl
Aryl
4.ábra. Szérum paraoxonáz aktivitás (PON), sóstimulált PON aktivitás (NaCl), és arilészteráz aktivitás (Aryl) (átlag±SD) a hyperlipidaemiás és a kontroll csoportban, *p<0.001
Oxidatív DNS-károsodás A hidrogén-peroxiddal indukált, comet-assay-vel detektált oxidatív DNS-károsodás szignifikánsan nagyobb mérték_ volt a hyperlipidaemiás betegekben a kontrollokhoz
33
képest (visual score 289.5‒29,49; 350.97‒31,31; p<0,001). A hidrogén peroxid alkalmazását megelQzQen a két vizsgált csoportban nem találtunk eltérést (97.6‒19.11; 107.24‒20.67; n.s.). A hyperlipidaemiás betegekben a nyugvó granulocyták szuperoxid anion termelése és a comet-assay-vel detektált DNS-károsodás mértéke között pozitív korrelációt figyeltünk meg (r=0,517). A neutrophil granulocyták PMA-val és FMLP-vel történQ stimulációját követQ szuperoxid anion termelésével szintén pozitív korrelációt mutatott a visual score (r=0,326; 0,525) (5.ábra). Negatív korrelációt találtunk a PON (r=-0,469), a PON/HDL (r=-0.631), és a DNSkárosodás mértéke között, míg pozitív korreláció igazolódott a szérum koleszterin szint és a DNS-károsodás mértéke között (r=0.38) (6.ábra). Nem találtunk összefüggést a plazma NO és TBARS koncentrációja, illetve a DNS-károsodás mértéke között.
Resting cells (r=0.517)
A
Hype rlipide mic
B
Hyperlipidemic
P MA (r=0.326)
400
350
350
350
250
VS
400
300
300 250
200 1.0
2.0
Superoxide anion (nmol/10 6 cells/min)
3.0
300 250
200 0.0
Hyperlipidemic Control
400
VS
VS
FMLP (r=0.525)
C
Control
Co ntro l
200 0.0
5.0
10.0
15.0
Superoxide anion (nmol/10 6 cells/min)
0.0
5.0
10.0
15.0
Superoxide anion (nmol/10 6 cells/min)
5.ábra. A polymorhonuclearis granulocyták szuperoxid anion termelésének összefüggése a DNS-károsodás mértékét jelzQ visual score-ral nyugvó sejteken (A), PMA-val (B), ill. FMLP-vel (C) történt stimulációt követQen, VS=visual score
34
A
r=-0.469
Hy perlipidemic
r=-0.631
B
C
r=0.38
400
350
350
350
300
250
VS
400
300
250
200 50
100
150
200
250
300
PON (U/l)
300
250
200 0
Hy perlipidem ic Control
400
VS
VS
Hy perlipidemic Control
Control
200 0
50
100
150
200
0
2
PON/HDL
4
6
8
10
12
chol (mm ol/l)
6.ábra. A szérum paraoxonáz aktivitás (r=-0.469) (A), az egységnyi HDL-re vonatkoztatott PON aktivitás (r=-0.631) (B) és a szérum koleszterin szint (r=0.38) (C) összefüggése a DNS-károsodás mértékét jelzQ visual score-ral, A PON aktivitás U/l-ben, a szérum kolesterin szint mmol/l-ben van feltüntetve, VS=visual score
Paraoxonáz (PON1) Leu55
Met és Gln192 Arg polimorfizmus meghatározás real-
time fluorescence PCR és olvadási görbék alkalmazásával A detektált fluoreszcencia görbéket a 7. ábra mutatja. A PON1-192 és PON1-55 izotípusokra tervezett hibridizációs próbák alkalmazása DNS hozzáadása esetén (2, 3 és 4 minták) a fluoreszcencia intenzitás a PCR reakció végéig folyamatosan növekedQ tendenciát mutat, míg a H2O kontroll esetén (1 minta) a fluoreszcencia intenzitása változatlan marad (7/A és 7/C ábra). A 7/B és 7/D ábrán az x tengelyen az alkalmazott hQmérséklet, az y tengelyen pedig a fluoreszcencia intenzitásnak a hQmérséklet szerinti negatív deriváltja van feltüntetve. A PON1-55 Met homozigóta típusának olvasási pontja (Tm) 60.5 oC volt (2 görbe), a heterozigóta típus bifázisos görbét hozott létre (4 görbe), míg a PON1-55 Leu homozigóta olvadási pontja 54.7 oC volt (3 görbe) (7/B ábra). A PON1-192 Gln homozigóta típusának olvasási pontját (Tm) 60.4 oC –nak határoztuk meg (2 görbe), a heterozigóta típus ez esetben is bifázisos görbét mutatott (4 görbe), míg a PON1-192 Arg homozigóta olvadási pontja 53.9 oC volt (3 görbe) (7/D ábra). A PCR
35
termékek mérete a vártnak megfelelQen agaróz gélelektroforézissel meghatározva 240, illetve 199 bp volt.
7.ábra. A fluoreszcencia intenzitás változása változása a cikluszámnak megfelelQen (A, C) és olvadási csúcsok (B, D) PON1-55 és PON1-192 polimorfizmus meghatározására. Az olvadási görbékbet olvadási csúcsokká konvertáltuk a –dF/dT hQmérséklet szerinti deriváltok alkalmazásával. Az egyes görbék olvadáspontjait nyíllal jelöltük.
36
Új eredmények
1. A hyperlipidaemiás betegek lymphocytáiban a comet-assay-vel vizsgált hidrogénperoxid indukálta oxidatív DNS-károsodás szignifikánsan nagyobb mérték_nek bizonyult a kontroll csoporthoz képest. 2. A
hyperlipidaemiás
betegek
granulocytái
szuperoxid
anion
termelése
szignifikánsan nagyobb volt a kontroll csoporthoz viszonyítva mind nyugalmi állapotban, mind PMA-val és FMLP-vel történt stimulációt követQen, és pozitív korrelációt mutatott az oxidatív DNS-károsodás mértékével. 3. Az alfa-tokoferol szintjében nem találtunk szignifikáns eltérést a kontroll és a betegcsoport között. A szérum koleszterin szintje és az oxidatív DNS-károsodás mértéke között pozitív korrelációt találtunk, azonban nem volt kimutatható összefüggés a TBARS, valamint NO és az oxidatív DNS-károsodás mértéke között. 4. A betegek szérum paraoxonáz aktivitása, sóstimulált paraoxonáz aktivitása, valamint arilesztéráz aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll csoporthoz képest. Negatív korrelációt találtunk a paraoxonáz aktivitás és az oxidatív DNS-károsodás mértéke között. 5. Az általunk kifejlesztett real-time PCR és olvadási görbe analízis alkalmas a két legfontosabb PON1 polimorfizmus gyors, pontos és könnyen kivitelezhetQ detektálására.
37
VI.
Megbeszélés
Korábbi tanulmányok alapján ismert, hogy a lipoproteinek oxidációja az atheroszklerózis kialakulását elQsegítQ folyamat. A szuperoxidanion és a H2O2 redox reakciókon keresztül lipid-peroxidációhoz vezet. Munkacsoportunk korábbi vizsgálatai során azt találta, hogy idQsekben és hypercholesterinaemiás egyénekben a nyugvó granulocyták szuperoxid anion termelése növekedett (62). Jelen vizsgálatunkban a korábbi eredményekhez hasonlóan a hyperlipidaemiás betegekben a nyugalmi szuperoxid anion termelés fokozott, míg az FMLP-vel és a PMA-val való stimulálhatóság csökkent az egészséges kontrollokhoz képest. Bonneau és mtsai egy in vitro kísérletben azt tapasztalták, hogy LDL hozzáadását követQen a polymorphonuclearis sejtek FMLP indukálta szuperoxid anion termelése fokozódott, ennek hátterében az FMLP receptoron keresztül végbemenQ jelátviteli rendszer m_ködésében bekövetkezQ változás állhat (63). Az emelkedett LDL szint
a
hyperlipidaemiás
betegek
szérumában
megváltoztatja
a
PMN
sejtek
membránjának összetételét, fluiditását, és hatással van számos membránhoz kötött sejtfunkcióra
is,
így
az
FMLP
receptoron
keresztül
megvalósuló
jelátviteli
mechanizmusra és a PKC aktivitásra (64). A lipid-peroxidációt a sejtet érQ oxidatív stressz markerének tartják, fokozott lipidperoxidációt
találtak
pathogenezisében
számos
fontos
atheroszklerózisban
és
olyan
szerephez daganatos
krónikus jut
a
megbetegedésben,
sejtek
oxidatív
megbetegedésekben
(65).
melyeknek
károsodása,
így
Hyperlipidaemiás
betegeinkben a lipid-peroxidáció mértékére jellemzQ TBARS mennyisége emelkedett, míg a HDL-hez kötött antioxidáns, a PON aktivitása szignifikánsan kisebb volt a kontrollhoz
képest.
Adataink
arra
utalnak,
hogy
a
hypercholesterinaemiás
38
betegcsoportban a fokozott oxidáció mellett csökkent a természetes HDL-hez kötött antioxidáns aktivitás, mely az érelmeszesedés fokozódását hozhatja létre. Az NO mind antioxidáns, mind oxidáns hatást kifejthet, mivel scavenger hatású a lipidperoxidokra, ugyanakkor szuperoxid anionnal reagálva peroxi-nitritté alakul, mely kifejezett endothelkárosító hatással rendelkezik (4). Ezért is voltunk kíváncsiak arra, hogy az endothel által termelt NO szintje hogyan változik, és azt találtuk, hogy a betegcsoportban az NO szint csökkenése volt megfigyelhetQ. Az E-vitamin képes megakadályozni a lipid-peroxidációt a sejtmembránban és protektív hatású a többszörösen telítetlen zsírsavak kedvezQtlen hatásával szemben (54). A csökkent antioxidáns kapacitás mellett az oxidatív folyamatok fokozódása vezethet a hyperlipidaemiás betegekben comet-assay-vel detektált oxidatív DNS-károsodás fokozódásához. A PON inverz kapcsolata a DNS-károsodás mértékével arra utal, hogy a természetes HDL-hez kötött antioxidáns rendszer jelentQs szerepet játszhat nemcsak az atherogenezis, hanem a DNS-károsodás kialakulásának gátlásában is. Természetesen továbbra is kérdés, hogy egy keringésben található antioxidáns rendszer hogyan képes befolyásolni az intracelluláris oxidatív DNS-károsodást. Korábbi vizsgálatokból ismert, hogy a szabadgyökök az elektrontranszfer révén a sejtekkel történQ érintkezés során egy oxidációs láncreakciót hoznak létre, melynek eredményeként a DNS-károsodás létrejöhet (49). Feltételezésünk szerint a keringésben lévQ szabadgyökök, melyeket részben a granulocyták termelnek oxidálják a zsírsavakat, így konjugált diének, lipid-hidroperoxidok képzQdnek, melyek további oxidációs folyamatokat eredményeznek. A PON azzal, hogy hidrolizálja ezen lipid-hidroperoxidokat, gyakorlatilag meggátolja a további oxidációs folyamatok kialakulását, így csökkenti a sejteket érQ oxidatív stressz mértékét, megakadályozva ezzel a DNS-károsodás kialakulását.
39
Az utóbbi évtizedekben számos laboratórium végzett vizsgálatokat a PON1 polimorfizmusok kardiovaszkuláris kórképekben játszott szerepének tisztázása céljából, többnyire RFLP analízist alkalmazva (66, 67). Az általunk leírt real-time fluoreszcens PCR
és
olvadási
görbe
alkalmazása
kevésbé
idQigényes,
pontosabb
és
költséghatékonyabb a tradícionális PCR technikákhoz képest, és lehetQvé teszi 32 minta egyidej_ vizsgálatát. A módszer kettQs fluorofor jelöléssel (LC Red640 és LC Red705) alkalmazásával alkalmas a két polimorfizmus egyidej_ detektálására is, ami idQben még kedvezQbb, és csökkenti a laboratóriumi és reagens költségeket.
40
VII.
Összefoglalás
A humán paraoxonáz (PON1) egy kalcium-dependens észteráz, mely az ApoA-t és ApoJt tartalmazó high-density lipoproteinhez (HDL) kötQdik, és organofoszfátokat és arylésztereket hidrolizál. Számos tanulmány bizonyította, hogy a PON1 képes megvédeni az oxidációtól a low-density lipoproteint (LDL), mely az atherogenezis elsQ kulcslépése. A PON1 aktivitás csökkenését igazolák hypercholesterinaemiában és egyéb, fokozott atherogenezissel járó kórképekben. A paraoxonáz-1 két gyakori polimorfizmusa a Leu55 ›Met és a Gln192›Arg. Mindkét polimorfizmus a kardiovaszkuláris betegségek független rizikófaktora. Jelen munkánkban normolipaemiás és II/a típusú hyperlipidaemiás betegek vérébQl szeparált lymphocytákon vizsgáltuk a hidrogén-peroxid indukált DNS-károsodást cometassay segítségével, valamint a DNS-károsodás mértékét összevetettük a betegek szérumának paraoxonáz aktivitásával, ill. egyéb, a szervezet oxidatív statusát jellemzQ paraméterrel. Valamint kifejlesztettünk egy LightCycler technológiára és olvadási görbe analízisre épülQ PON1-55 és 192 polimorfizmust detektáló módszert. Vizsgálatainkba 15 hyperlipidaemiás beteget vontunk be, kontrollként 7 korban és nemben illesztett egészséges egyént vizsgáltunk. A két vizsgált csoportban szignifikáns különbséget tapasztaltunk a Comet-assay-vel detektált hidrogén-peroxid indukálta DNS-károsodás mértékében. A DNS-károsodás mértékét jellemzQ visual score a hyperlipidaemiás csoportban 351‒31,3, míg a kontroll csoportban 290‒29,5 volt (p<0,001). A hyperlipidaemiás betegcsoportban pozitív korrelációt találtunk a DNS-károsodás mértéke és a betegek vérébQl szeparált nyugvó polymorphonuclearis granulocyták szuperoxid
41
anion termelése (r=0,517), valamint a PMA-val stimulált (r=0,326) és az FMLP-vel stimulált sejtek szuperoxid anion termelése (r=0,525) között. Negatív korrelációt észleltünk a visual score és a PON1 (r=-0,469), illetve a PON1/HDL (r=-0,631) között. Nem találtunk összefüggést a plazma NO (r=0,098) és TBARS (r=0,061) koncentrációja és a DNS-károsodás mértéke között. Eredményeink azt mutatják, hogy hyperlipidaemiás betegek lymphocytáiban az oxidatív stressz hatására nagyobb mérték_ DNS-károsodás mutatható ki, melyben szerepet játszhat az antioxidáns kapacitás, ezen belül a PON1 aktivitás csökkenése. A munkám során kifejlesztett real-time PCR és olvadási görbe analízis lehetQvé teszi a két legfontosabb PON1 polimorfizmus gyors, pontos és könnyen kivitelezhetQ detektálását.
42
VIII.
Irodalom
1. Heinecke JW: Mechanisms of oxidative damage of low density lipoprotein in human atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 1997; 8:268-274 2. Harats D, Shaish A, George J, Mulkins M, Kurihara H, Levkovitz H, Sigal E: Overexpression of 15-lipoxigenase in vascular endothelium accelerates early atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20:2100-2105 3. Carr AC, McCall MR, Frei B: Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: reaction pathways and antioxidant protection. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20:1716-1723 4. Patel RP, Levonen A, Crawford JH, Darley-Usmar VM: Mechanisms of the pro- and anti-oxidant actions of nitric oxide in atherosclerosis. Cardiovasc Res 2000; 47:465474 5. Laursen JB, Somers M, Kurz S, McCann L, Warnholtz A, Freeman BA, Tarpey M, Fukai T, Harrison DG: Endothelial regulation of vasomotion in apoE-deficient mice: implications for interactions between peroxynitrite and tetrahydrobiopterin. Circulation 2001;103:1282-1288 6. Mertens A, Holvoet P: oxidized LDL and HDL: antagonists in atherosclerosis. FASEB J 2001; 15:2073-2084 7. Calvo D, Gomez-Coronado D, Suarez Y, Lasuncion MA, Vega MA: Human CD36 is a high affinity receptor for the native lipoproteins HDL, LDL, and VLDL. J Lipid Res 1998; 39:777-788
43
8. Yoshida H, Quehenberger O, Kondratenko N, Green S, Steinberg D: Minimally oxidized low-density lipoprotein increases expression of scavenger receptor CD36 and macrosialin in resident mouse peritoneal macrohages. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18:794-802 9. Sawamura T, Kume N, Aoyama T, Moriwaki H, Hoshikawa H, Aiba Y, Tanaka T, Miwa S, Katsura Y, Kita T, Masaki T: An endothelial receptro for oxidized lowdensity lipoprotein. Nature (London) 1997; 386:73-77 10. Kume N, Murase T, Moriwaki H, Aoyama T, Sawamura T, Masaki T, Kita T: Inducible expression of lecithin-like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells. Circ Res 1998; 83:322-327 11. Navab M, Imes SS, Hough GP, Hama SY, Ross LA, Bork RW, Valente AJ, Berliner JA, Drintwater DC, Laks H, Fogelman AM: Monocyte transmigration induced by modofication of low density lipoprotein in cocultures of human aortic wall cells is due to induction of monocyte chemotactic protein I synthesis and is abolished by high density lipoprotein. J Clin Invest 1991; 88:2039-2046 12. Cominacini L, Garbin U, Pasini AF, Davoli A, Campagnola M, Contessi GB, Pastorino AM, Lo CV: Antioxidants inhibit the expression of intercellular cell adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 induced by oxidized LDL on human umbilical vein endothelial cells. Free Radic Biol Med 1997; 22:117-127 13. Rajavashitsh TB, Andalibi A, Territo MC, Berliner JA, Navab M, Fogelman AM, Lusis AJ: Induction of endothelial cell expression of granulocyte and macrophage colony-stimulating factors by modified low-density lipoproteins. Nature (London) 1990; 344:254-257
44
14. Cushing SD, Berliner JA, Valente AJ, Territo MC, Navab M, Parhami F, Gerrity R, Schwartz CJ, Fogelman AM: Minimally modified low density lipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells and smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:5134-5138 15. Newby AC, Zaltsman AB: Fibrous cap formation or destruction – the critical importance of vascular smooth muscle cell proliferation, migration and matrix formation. Cardiovasc Res 1999; 41:345-360 16. Stiko-Rahm A, Hultgardh-Nilsson A, Regnstrom J, Hamsten A, Nilsson J: Native and oxidized LDL enhances production of PDGF AA and the surface expression of PDGF receptors in cultured human smooth muscle cells. Arterioscler Thromb 1992; 12:1099-1109 17. Vidal F, Colome C, Martinez-Gonzalez J, Badimon L: Atherogenic concentrations of native low-density lipoproteins down-regulate nitric-oxide-synthase mRNA and protein levels in endothelial cells. Eur J Biochem 1998; 252:378-384 18. Boulanger CM, Tanner FC, Bea ML, Hahn AW, Werner A, Luscher TF: Oxidized low density lipoproteins induce mRNA expression and release of endothelin from human and porcine endothelium. Circ Res 1992; 70:1191-1197 19. Napoli C, Quehenberger O, de Nigris F, Abete P, Glass CK, Palinski W: Midly oxidized low density lipoprotein activates multiple apoptotic signaling pathways in human coronary cells. FASEB J 2000; 14:1996-2007 20. Holvoet P, Collen D: Thrombosis and atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 1997; 8:320-328
45
21. Penn MS, Cui MZ, Winkour AL, Bethea J, Hamilton TA, DiCorleto PE, Chisolm GM: Smooth muscle cell surface tissue factor pathway activation by oxidized lowdensity lipoprotein requires cellular lipid peroxidation. Blood 2000; 96:3056-3063 22. Ishii H, Kizaki K, Horie S, Kazama M: Oxidized low density lipoprotein reduces thrombomodulin transcription in cultured human endothelial cells through degradation of lipoprotein in lysosomes. J Biol Chem 1996; 271:8458-8465 23. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, Childs B, Kinzler KW, Vogelstein B (eds): The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8th ed. New York, McGraw-Hill, 2001; p 2915-2931 24. von Eckardstein A, Nofer JR, Assmann G: High density lipoproteins and arteriosclerosis. Role of cholesterol efflux and reverse cholesterol rtansport. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:13-27Primo-Parma SL, Sorenson RC, teiber J, La DU BN: The human serum paraoxonase/arylesterase gene (PON1) is one member of a multigene family. Genomics 1996; 33:498-509 25. Tall AR: Plasma high density lipoproteins – Metabolism and relationship to atherogenesis. J Clin Invest 1990; 86:376-384 26. Parthasarathy S, Barnett J, Fong LG: High-density lipoprotein inhibits the oxidative modification of low-density lipoprotein. Biochim Biophys Acta 1990; 1044:275-283 27. Mertens A, Holvoet P: Oxidized LDL and HDL: antagonists in atherothrombosis.. FASEB J 2001; 15:2073-2084 28. Primo-Parmo
SL,
Sorenson
RC,
Teiber
J,
La
Du
BN:
The
human
paraoxonase/arylesterase gene (PON1) is one member of a multigene familiy. Genomics 1996; 33:498-507
46
29. Clendenning JB, Humbert R, Green ED, Wood C, Traver D, Furlong CE: Structural organisation of the human PON1 gene. Genomics 1996; 35:586-589 30. Kelso GJ, Suart WD, Richter RJ, Furlong CE, Jordan-Starck TC, Harmony JA: Apolipoprotein J is associated with paraoxonase in human plasma. Biochemistry 1994; 33:832-839 31. Mackness MI, Mackness B, Durrington PN, Connelly PW, Hegele RA: Paraoxonase: biochemistry, genetics and relationship to plasma lipoproteins. Curr Opin Lipidol 1996; 7:69-76 32. Mackness MI, Arrol S, Durrington PN: Paraoxonase prevents accumulation of lipoperoxides in low-density lipoprotein. FEBS Lett 1991; 286:152-154 33. Mackness MI, Arrol S, Abbott CA, Durrington PN: Protection of low-density lipoprotein against oxidative modification by high-density lipoprotein associated paraoxonase. Atherosclerosis 1993; 104:129-135 34. Watson AD, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Faull KF, Fogelmann AM, Navab M: Protective effect of high-density lipoprotein associated paraoxonase: inhibition of the biological activity of minimally oxidised low-density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96:2882-2891 35. Mackness MI, Harty D, Bhatnagar D, Winocour PH, Arrol S, Ishola M, Durrington PN: Serum paraoxonase activity in familial hypercholesterolaemia and insulindependent diabetes mellitus. Atherosclerosis 1991; 86:193-199 36. Mackness B, Mackness MI, Arrol S, Turkie W, Julier K, Abuasha B, Miller JE, Boulton AJM, Durrington PN: Serum paraoxonase (PON1) 55 and 192
47
polymorphism and paraoxonase activity and concentration in non-insulin dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis 1998; 139:341-349 37. Mackness MI, Peuchant E, Dumon MF, Walker CH, Clerc M: Absense of “A”esterase activity in the serum of a patient with Tangier disease. Clin Biochem 1989; 22:475-478 38. McElveen J, Mackness MI, Colley CM, Peard T, Warner S, Walker CH: Distribution of paraoxon hydrolytic activity in the serum of patients aftre myocardial infarction. Clin Chem 1986; 32:671-673 39. Paragh Gy, Seres I, Balogh Z, Varga Zs, Kárpáti I, Mátyus J, Újhelyi L, Kakuk Gy: The serum paraoxonase activity in patients with chronic renal failure and hyperlipidemia. Nephron 1998; 80:166-170 40. Paragh Gy, Asztalos L, Seres I, Balogh Z, LQcsey L, Kárpáti I, Mátyus J, Katona E, Harangi M, Kakuk Gy: Serum paraoxonase activity changes in uremic and kidney transplanted patients. Nephron 1999; 83:126-131 41. La Du BN: Human serum paraoxonase/arylesterase. In: Kalow W, ed. Pharmacogenetics of drug metabolism. New York: Pergamon Press; 1992; p 51-91 42. Blatter Garin MC, James RW, Dussoix P, Blanche H, Passa P, Froguel P, Ruiz J: paraoxonase polymorphism Met-Leu54 is associated with modified serum concentrations of the enzyme: a possible link between paraoxonase gene and increased risk of cardiovascular disease in diabetes. J Clin Invest 1997; 99:62-66 43. James RW, Leviev I, Ruiz J, Passa P, Froguel P, Blatter-Garin MC: Promoter polymorphism T(-107)C of the paraoxonase PON1 gene is a risk factor for coronary heart disease in type 2 diabetic patients. Diabetes 2000; 49:1390-1393
48
44. Brophy VH, Hastings MD, Clendenning JB, Richter RJ, Jarvik GP, Furlong CE: Polymorphisms in the human paraoxonase (PON1) promoter. Pharmacogenetics 2001; 11:77-84 45. Mochizuki H, Scherer SW, Xi T, Nickle DC, Majer M, Huizenga JJ, Tsui LC, Prochazka M: Human PON2 gene at 7q21.3: cloning, multiple mRNA forms, and missensepolymorphisms in the coding sequence. Gene 1998; 213:149-157 46. Reddy ST, Wadleigh DJ, Grijalva V, Ng Carey, Hama S, Gangopadhyay A, Shih DM, Lusis AJ, Navab M, Fogelman: Human paraoxonase-3 is an HDL-associated enzyme with biological activity similar to paraoxonase-1 protein but is not regulated by oxidized lipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:542-547 47. Draganov DI, Stetson PL, Watson CE, Billecke SS, La Du BN: Rabbit serum paraoxonase 3 (PON3) is a high density lipoprotein-associated lactonase and protects low density lipoprotein against oxidation. J Biol Chem 2000; 275:33435-33442 48. Primo-Parmo SL, Sorenson RC, Teiber J, La Du BN: The human serum paraoxonase/arylesterase gene (PON1) is one member of a multigene family. Genomics 1996; 33:498-507 49. Wiseman H, Halliwell B: Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem J 1996; 313:17-29 50. Vaca CE, Wilhelm J, Harms-Ringdahl M: Interaction of lipid peroxidation products with DNA. Mutat Res 1988; 195:137-149 51. Rydberg B, Johanson KJ. in DNA repair mechamism (Hanawalt PC, Friedberg EC, eds), Academic Press, New York, 1978; p 465-468
49
52. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL: A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research 1988; 175:184-191 53. Horvathova E, Slamenova D, Hlincikova L, Mandal TP, Gabelova A, Collins AR: The nature and origin od DNA single-strand braks determined with the comet assay. Mutat Res 1998; 409:163-171 54. Jenkinson AMcE, Collins AR, Duthie SJ, Wahle KWJ, Duthie GG: The effect of increased intakes of polysaturated fatty aids and vitamin E on DNA damage in human lymphocytes. FASEB J 1999; 13:2138-2142 55. Collins AR, Olmedilla B, Southon S, Granado F, Duthie SJ: Serum carotenoids and oxidative DNA damage in human lymphocytes. Carcinogenesis 1998; 19:2159-2162 56. Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV, David DA, Gundry RA, Balis UJ: The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. BioTechniques 1997; 22:176-181 57. Aslanidis C, Schmitz G: High-speed apolipoprotein E genotyping and apolipoprotein B3500 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves. Clin Chem 1999; 45:1094-1097 58. Aslanidis C, Nauck M, Schmitz G: High-speed prothrombin G›A 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase C›T 677 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves. BioTechniques 1997; 27:234-238 59. Aslanidis C, Nauck M, Schmitz G: High-speed detection of the two common c1antitrypsin deficiency alleles Pi*Z and Pi*S by real-time fluorescence PCR and melting curves. Clin Chem 1999; 45:1872-1875
50
60. Griess P: Bemerkungen zu der Abhandlung der HH. Wesley and Benedikt Ueber einige Azoverbindungen. Ber Deutsch Chem Gen 1879; 12:426 61. Boyum A: Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. J.Clin.Lab.Invest.1968; Suppl.97:77-108 62. FülöpT, Varga Z, Csongor J, Leövey A, Fóris G: Age related impairment in phosphatidylinositol breakdown in polymorphonuclear granulocytes. FEBS Lett 1989; 245:249-252 63. Bonneau C, Rémy C, Tissot M, Athias A, Roch-Arveiller M, Giroud JP: Effects of human low density lipoproteins on superoxide production by Formyl-MethionylLeucyl-Phenilalanine activated polymorphonuclear leukocytes. Eur J Chem Clin Biochem 1997; 35:73-80 64. Paragh Gy, Kovács É, Seres I, Keresztes T, Balogh Z, Szabó J, Teichmann F, Fóris G: Altered signal pathway in granulocytes from patients with hypercholesterolemia. J Lipid Res 1999; 40:1728-1733 65. Vergnani L, Hatrik S, Ricci F, Passaro A, Manzoli N, Zuliani G, Brovkovych V, Fellin R, Malinski T: Effect of native and oxidized low-density lipoprotein on endothelial nitric oxide and superoxide production: key role of L-arginine availability. Circulation 2000; 101:1261-1266 66. Durrington PN, Mackness B, Mackness MI: Paraoxonase and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:473-480 67. Mackness B, Davies GK, Turkie W, Lee E, Roberts DH, Hill E, Roberts C, Durrington PN, Mackness MI: Paraoxonase status in coronary heart disease. Are
51
activity and concentration more important tha genotype? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21:1451-1457
52
Az értekezéshez fehasznált saját közlemények
1. Harangi M, Remenyik É, Seres I, Varga Z, Katona E, Paragh G: Determination of DNA damage induced by oxidative stress in hyperlipidemic patients. Mutat Res 2002; 513:17-25
IF: 1.624
2. Harangi M, Remenyik É, Seres I, Varga Zs, Balogh Z, Kakuk Gy, Paragh Gy: Oxidatív stressz hatására kialakuló DNS-károsodás meghatározása Comet-assay-vel hyperlipidaemiás betegekben. Magyar Belorvosi Archivum 2001; 53:393-396 3. Harangi M, Aslanidis C, Paragh G, Schmitz G: High-speed detection of the two common paraoxonase polymorphisms Leu55›Met and Gln192›Arg by real-time fluorescence PCR and melting curves. Clin Chem Lab Med 2002; 40:337-340 IF: 1.595
Egyéb közlemények
1. Paragh Gy, Asztalos L, Seres I, Balogh Z, LQcsey L, Kárpáti I, Mátyus J, Katona E, Harangi M, Kakuk Gy: Serum paraoxonase activity changes in uremic and kidney transplantated patients. Nephron 1999; 83:126-131
IF: 1.696
2. Paragh G, Balogh Z, Seres I, Harangi M, Boda J, Kovacs P: Effect of gemfibrozil on HDL-associated serum paraoxonase activity and lipoprotein profile in patients with hyperlipidemia. Clin Drug Invest 2000; 19:277-282
IF: 0.888
3. Balogh Z, Seres I, Harangi M, Kovacs P, Kakuk G, Paragh G: Gemfibrozil increases paraoxonase activity in type 2 diabetic patients. A new hypothesis of beneficial action of fibrates? Diab Met 2001; 27:604-610
IF: 1.624 53
4. Balogh Z, Fülöp P, Seres I, Harangi M, Katona E, Kosztáczky B, Paragh G: Effects of simvastatin on serum paraoxonase activity. Clin Drug Invest 2001; 21:505-510 IF: 0.846 5. Paragh Gy, Balogh Z, Seres I, Harangi M, Boda J: Gemfibrozil hatása a HDL-hez kötött paraoxonáz aktivitására és a lipoprotein szintek alakulására. Háziorvosi TovábbképzQ Szemle 1999; 4:73-77 6. Balogh Z, Bacsó J, Seres I, Brúgós B, Harangi M, Paragh Gy: A haj szeléntartalmának változása hiperkoleszterinémiás betegekben. Magyar Belorvosi Archívum 2000; 53:209-213 7. Seres I, Varga Zs, Balogh Z, Harangi M, Fülöp P, Paragh Gy: Hiperkoleszterinémiás betegek szérum paraoxonáz aktivitása, fenotípus megoszlása és E vitamin szintjei. Magyar Belorvosi Archívum 2000; 53:115-117 8. Balogh Z, Paragh Gy, Seres I, Harangi M, Kovács P, Kakuk Gy: Gemfibrozil hatása 2-es típusú cukorbetegek szérum paraoxonáz aktivitására. Magyar Belorvosi Archívum 1999, 3:347-352 9. Paragh Gy, Seres I, Balogh Z, LQcsey L, Asztalos L, Harangi M, Kárpáti I, Mátyus J, Kakuk Gy: A serum paraoxonáz aktivitás változása vesetranszplantáció után. Hypertonia és Nephrológia 2000; 4:31-36 10. Paragh Gy, Balogh Z, Seres I, Harangi M, Katona E, Fülöp P, Kakuk Gy: A szimvasztatin hatása a szérum lipidszintekre és a paraoxonáz aktivitására. Magyar Belorvosi Archívum 1999; 52:255-258
54
11. Paragh Gy, Balogh Z, Kovács P, Wórum F, Harangi M, Czuriga I, Illyés L, Kakuk Gy: A szekunder prevenció szerepe korai myocardialis infarctust követQen. Cardiologia Hungarica 2000; 28:115-121 12. Paragh Gy, Seres I, Balogh Z, Harangi M, Ilyés L, Boda J, Varga Zs, Kovács P: A mikronizált fenofibrát hatása a szérum paraoxonáz aktivitására coronaria betegségben szenvedQ hyperlipidaemiás egyénekben. Magyar Belorvosi Archívum 2000; 53:227232 13. Paragh Gy, Harangi M: A HDL szerepe a kardiovaszkuláris események megelQzésében. Orvosi Hetilap 2001; 142:121-126 14. Paragh Gy, Harangi M: A lipidek szerepe az atherogenesisben a primer, szekunder és regressziós tanulmányok alapján. Családorvosi Fórum 2001; 2:43-51 15. Paragh Gy, Harangi M, Balogh Z: Diabetes mellitus és paraoxonáz. Diabetologia Hungarica 2001; 9:221-228 16. Paragh Gy, Harangi M, Balogh Z: Multimetabolikus syndroma és hypertonia. Granum 2001; 1:26-28 17. Harangi M, Katona E, Remenyik É, Paragh Gy: Sclerosis tuberosa. Hypertonia és Nephrológia 2001; 5:144-149 18. Harangi M, Seres I, Varga Zs, Remenyik É, Emri Gabriella, Paragh Gy: Az atorvastatin-kezelés hatása a paraoxonáz aktivitásra és az oxidatív DNS-károsodásra. Magyar Belorvosi Archívum 2002; 55:83-88
Összesített impact factor:
8.195
55
Nemzetközi folyóiratban megjelent idézhetQ absztraktok
1. Paragh Gy, Asztalos L, Seres I, Balogh Z,LQcsey L, Kárpáti I, Mátyus J, Katona E, Harangi M, Kakuk Gy: Serum paraoxonase activity changes in uremic and kidney transplanted patients. Atherosclerosis, 1998. 144(1):117 2. Paragh Gy, Balogh Z, Seres I, Harangi M, Boda J: Gemfibrozil effect on HDLassociated serum paraxoxonase activity and lipoprotein profile in patients with hyperlipidemia. Atherosclerosis, 1999. Sept., 146 (Suppl.) 28. 3. Seres I, Varga Zs, Balogh Z, Harangi M, Fülöp P, Kakuk Gy, Paragh Gy: Paraoxonase activity and c-tocopherol levels in hypercholesterinemic patients. Atherosclerosis, 1999. Sept., 146 (Suppl.) 35. 4. Paragh Gy, Seres I, Balogh Z, Harangi M, Illyés L, Boda J, Varga Zs, Kovács P: Micronised fenofibrate effect on serum paraoxonase activity in patients with coronary heart disease. Atherosclerosis, 2000; 151(1):263
56
ElQadások
1. European Atherosclerosis Society, 2000 EAS Workshop, „Low HDL in Cardiovascular Diseases”. Gemfibrozil effect on HDL-associated serum paraxoxonase activity and lipoprotein profile in patients with hyperlipidemia. Istambul, Turkey 2000.04.7-8.
2. Debreceni Nephrológiai Napok. A HDL-hez kötött paraoxonáz szerepe vesebetegségekben. Debrecen, 1999.05.12.
3. DE OEC ÁOK Ph.D. és TDK Tudományos diáktalálkozója1999/2000. Gemfibrozil hatása a HDL-hez kötött paraoxonáz aktivitásra és a lipoprotein szintek alakulására. Debrecen, 2000.04.3-6.
4. Magyar Atherosclerosis Társaság XIII. Kongresszusa. DNS-károsodás meghatározása oxidatív stressz hatására hyperlipidaemiás betegekben Comet-assay-vel. Sopron, 2000.10.12-14.
5. A MNT Gyermeknephrológiai Szekció Tudományos ülése. A leptin klinikai jelentQsége. Budapest, SOTE I.sz. Gyermekklinika, 2000.11.10.
6. DE OEC ÁOK Ph.D. és TDK Tudományos diáktalálkozója 2000/2001. Oxidatív stressz hatására kialakuló DNS károsodás meghatározása Comet-assay-vel hyperlipidaemiás betegekben. Debrecen, 2000.02.19-22.
57
7. A Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 51. Nagygy_lése 2002. IdQskori lipidabnormalitások. Gyula, 2002.08.28-31.
8. A Magyar Belgyógyász Társaság Északkelet-Magyarországi Szakcsoportjának Tudományos Ülése. Az atorvastatin kezelés hatása az oxidatív DNS-károsodásra és a HDL-hez kötött paraoxonáz aktivitásra. Eger, 2002.10.3-5.
58
IX.
Köszönetnyilvánítás
Köszönöm témavezetQmnek, Dr. Paragh György professzor úrnak, hogy csatlakozhattam az általa vezetett tudományos munkacsoporthoz, hogy négy éven át töretlen bizalommal és lelkesedéssel irányította tudományos tevékenységemet, tanácsai és hasznos útmutatásai nélkül ez a munka nem született volna meg. Köszönettel tartozom Dr. Kakuk György professzor úrnak, az I. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, hogy tudományos munkámat mindenben támogatta. Köszönöm Dr. Gerd Schmitz professzor úrnak, a Regensburgi Egyetem Klinikai Kémia Intézet igazgatójának, hogy az ott eltöltött egy év alatt magas szint_ szakmai irányítása mellett folytathattam tudományos munkámat. Köszönet Dr. Remenyik Évának, a BQrgyógyászati Klinika docensének, akinek az irányításával számos laboratóriumi módszert sajátítottam el, köszönöm, hogy munkám egy részét az általa vezetett laboratóriumban végezhettem. Köszönöm az I. Belklinika Kutató Laboratóriumában dolgozó Dr. Seres Ildikónak és Dr. Varga Zsuzsának a kísérleti munkában nyújtott segítségét. Külön köszönöm Dr. Ádány Róza professzornQnek, a MegelQzQ Orvostani Intézet igazgatójának a comet assay elsajátításában nyújtott segítségét. Hálával tartozom Kovács Évának az adminisztratív munkában nyújtott sok-sok segítségért. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom Szüleimnek, akiktQl a legtöbbet kaptam.
59
X.
Függelék
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények másolatai
60
