A dezoxicitidin-kináz aktiválódásának lehetséges szerepe a DNS-hibajavítás és az apoptózis folyamatában
KESZLER GERGELY
Doktori (Ph. D.) értekezés
Pathobiokémia Doktori Program
Témavezető: Dr. Staub Mária egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest, 2004.
TARTALOMJEGYZÉK
1. BEVEZETÉS……………………………………………………………………...10 2. IRODALMI HÁTTÉR……………………………………………………………12 2.1. A DEZOXIRIBONUKLEOTID-ANYAGCSERE ÁTTEKINTÉSE………...12 2.1.1. A dezoxiribonukleotidok de novo bioszintézise……………………………12 2.1.2. A mentő útvonalak……………………………………………………………..13 2.1.3. A dezoxiliponukleotidok szintézise……………………………………….….16 2.1. A HUMÁN DEZOXIRIBONUKLEOZID-KINÁZOK JELLEMZÉSE……..18 2.1.1. A dezoxicitidin-kináz………………………………………………………….19 2.1.1.1. A dezoxicitidin-kináz génje………………………………………19 2.1.1.2. A dezoxicitidin-kináz-fehérje…………………………………….20 2.1.1.3. A dCK enzimológiai tulajdonságai……………………………….23 2.1.1.4. A dezoxicitidin-kináz expressziója……………………………….25 2.1.1.5. A dCK által aktivált nukleozid-analógok és terápiás jelentőségük………………………………………………………27 2.1.2. A timidin-kináz-1……………………………………………………………...30 2.1.3. A mitokondriális dezoxinukleozid-kinázok………………………………....31 2.2. 5’-NUKLEOTIDÁZOK: A DEZOXINUKLEOZID-KINÁZOK FUNKCIONÁLIS ANTAGONISTÁI………………………………………..33 3. CÉLKITŰZÉSEK………………………………………………………………....35 4. MÓDSZEREK…………………………………………………………………….37 4.1. ANYAGOK……………………………………………………………….….37 4.2. SEJTKULTÚRÁK, KEZELÉSEK, METABOLIKUS JELÖLÉS…………...38 4.2.1. Sejtkultúrák…………………………………………………………………….38 4.2.2. Sejtszám és élősejtszám meghatározása…………………………………....39 4.2.3. Sejtkultúrák kezelése……………………………………………………….…40
2
4.2.4. Limfociták γ-besugárzása…………………………………………………….40 4.2.5. Radioaktívan jelölt dezoxinukleozidok metabolizmusának mérése……..40 4.3. NYERSKIVONATOK ENZIMAKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE………….….42 4.3.1. Nyerskivonat készítése………………………………………………………...42 4.3.2. A fehérje-koncentráció meghatározása……..…………………………...…42 4.3.3. dCK- és TK-enzimaktivitás mérése…………………………………...……..42 4.3.4. Dezoxicitidilát-dezamináz-aktivitásmérés………………………………….43 4.3.5. 5’-nukleotidáz-aktivitás meghatározása…………………………………....43 4.4. LIMITÁLT PROTEOLÍZIS…………………………………………….…….44 4.5. POLIAKRILAMID-GÉLELEKTROFORÉZIS ÉS WESTERN BLOT……..44 4.5.1. SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis……………….…………………..44 4.5.2. Denaturáló és natív immunblot………………………………………....45 4.6. NYERSKIVONATOK KEZELÉSE λ-PROTEIN-FOSZFATÁZZAL……...46 4.7. COMET-ELJÁRÁS…………………………………………………………..46 4.8. dNTP-POOLOK MÉRÉSE…………………………………………………..47 4.9. APOPTÓZIST VIZSGÁLÓ ELJÁRÁSOK………………………………….49 4.9.1. Kaszpáz-3-aktivitásmérés………………………………………………49 4.9.2. Kromatin-fragmentáció kimutatása (DNS-létra)……………………….49 4.10. RT-PCR………..……………………………………………………………..50 5.
EREDMÉNYEK…………...………………………………………………..…..51 5.1. A DEZOXICITIDIN-KINÁZ AKTIVÁLÓDÁSA CITOTOXIKUS NUKLEOZIDOK HATÁSÁRA……………………………………………...51 5.1.1. CdA hatása normál limfocita-szubpopulációk dCK-aktivitásáraI, II…….51 5.1.2. Normál és transzformált sejtpopulációk összehasonlítása a dCK aktiválódásának szempontjábólI…………………………………………….……...57 5.1.3. Egyéb purin-analógok hatása a dCK aktivitásáraI……………………….59 5.1.4. Dezoxipurin- és dezoxipirimidin-, illetve ribopurin-analógok összehasonlító vizsgálataI…………….……………………………………...59 5.1.5. A dFdC (gemcitabin) hatása tonzilla-limfociták nukleotidanyagcseréjéreIII..……………………………………………………………..61
3
5.1.6. A dezoxicitidin-kináz in vivo aktiválása gemcitabinnal…………………..62 5.1.7. A dCK természetes szubsztrátjainak hatása az enzim aktivitásáraI, II.….64 5.1.8. A dCK aktivitásának emelése nem-metabolizálódó nukleozid-monofoszfát-analógokkal és a dezoxicitidin felfüggesztő hatásaIV…………...…….65 5.2. CÉLZOTT DNS-KÁROSÍTÁSSAL KIVÁLTOTT dCK-AKTIVÁLÓDÁS VIZSGÁLATA……………………………………………………………….69 5.2.1. Etopozid és aphidicolin hatása a dezoxicitidin-kináz aktivitásáraI …….69 5.2.2. γ-besugárzás okozta változások a nukleotid-anyagcserébenV…………...70 5.2.3. A dCK aktiválódása a DNS-károsodás korai következményeII….…….…73 5.3. A dCK-AKTIVÁLÓDÁS ÉS AZ ENZIMEXPRESSZIÓ ÖSSZEFÜGGÉSEIII, V…….…………………………………………………………74 5.4. A REVERZIBILIS PROTEIN-FOSZFORILÁCIÓ ÉS A dCKAKTIVÁLÓDÁS KAPCSOLATA…………………………………………..75 5.4.1. A dCK aktiválása calyculin A-valV……………………………………….…75 5.4.2. Hiperozmotikus stressz hatása az enzimaktivitásraV……………………...76 5.4.3. Tirozin-kináz-inhibitorok dCK-aktiváló hatásaII….………………………77 5.5. A dCK-AKTIVÁLÓDÁS LEHETSÉGES SZEREPE AZ APOPTÓZIS FOLYAMATÁBAN……………………………………………………….....80 5.5.1. Apoptózis-markerek vizsgálata………………………………………………80 5.5.2. A dATP-pool szelektív növekedése a dCK aktiválódása nyománVI……..81 5.5.3. A p53 és a dCK-aktiválódás kapcsolataVI………………………………….82 5.6. A dCK AKTIVÁLÓDÁSA KALCIUMFÜGGŐ FOLYAMAT……………..84 5.6.1. A szabad citoplazmatikus Ca2+-szint csökkentése a dCK aktivitását gátoljaVII………..……………………………………………………………….84 5.6.2. A kalcium permisszív szerepet játszik a dezoxicitidin-kináz aktiválódásábanVII……………………………………………………………..86 5.6.3. A kalcium a dCK-aktivitásnak nem kofaktoraVII…………………………..87 5.7. A dCK AKTIVÁLÓDÁSÁT FOKOZOTT ELLENANYAG-KÖTÉS KÍSÉRI……………………………………………………………………….88 5.7.1. Az enzimaktivitás és a konformációs állapot összefüggéseiVII….….…...88 5.7.2. A konformációs változás követése limitált proteolízisselII……………….91
4
5.7.3. A konformáció-változás valószínűleg reverzibilis foszforiláció következménye………………………………………………………………...92 6.
MEGBESZÉLÉS………………………………………………………………..93 6.1. A DEZOXICITIDIN-KINÁZ AKTIVÁLÓDÁSA CITOTOXIKUS NUKLEOZIDOK HATÁSÁRAI, II, III, IV………………………………………….94 6.2. A DNS-KÁROSODÁS ÉS AZ ENZIMAKTIVÁLÓDÁS ÖSSZEFÜGGÉSEII, II, III, V……………………………..………………………….100 6.3. A dCK AKTIVÁLÓDÁSÁNAK FELTÉTELEZETT MECHANIZMUSA.104 6.3.1. A reverzibilis foszforiláció szerepe a dCK aktivitásának szabályozásábanV………………………………………………………………..……104 6.3.2. A dCK aktiválódása kalciumfüggő folyamatVII…....……………………..107 6.3.3. A dezoxicitidin-kináz aktiválódását konformáció-változás kísériII, VII..109 6.4. A dCK AKTIVÁLÓDÁSÁNAK LEHETSÉGES SZEREPE AZ APOPTÓZIS FOLYAMATÁBANVI……………………………………………………………..112
7.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS…………………………………………….…..115
8.
IRODALOMJEGYZÉK………………………………………………….…...116
9.
A DOLGOZAT TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK…..134
5
ÖSSZEFOGLALÁS
A dezoxicitidin-kináz (dCK) a dezoxinukleozid-mentő reakciók egyik központi jelentőségű enzime, amely széles szubsztrát-specificitásánál fogva számos klinikailag fontos nukleozid-analóg foszforilálására is képes, így az enzim aktivitása a kemoterápia hatékonyságának egyik meghatározó tényezője. Irodalmi adatok szerint a dCK-t egy látszólag nem szabályozott és sejtciklustól független, állandó aktivitás jellemzi. Ennek ismeretében meglepetésként hatott munkacsoportunk azon megfigyelése, hogy normál limfociták rövid távú 2-klór-2’dezoxiadenozin-kezelésével a sejtek dCK-aktivitása a többszörösére fokozható. E klinikai szempontból is ígéretes jelenség további vizsgálata során megállapítottuk, hogy az enzim aktivitása normál és leukémiás perifériás limfocitákban is jól stimulálható, a malignus sejtvonalak viszont lényegesen különböznek a dCK aktiválhatósága szempontjából.
A
dCK
aktiválódását
a
további
purin-
és
pirimidin-típusú
szubsztrátanalógokon kívül különféle DNS-károsító ágensekkel, így a DNS-polimerázgátló aphidicolinnal és a topoizomeráz-II-inhibitor etopoziddal, illetve a sejtek γbesugárzásával is ki lehetett váltani, ami arra utal, hogy a jelenséget a DNS károsodása okozza. Az aktivitás-növekedés sejtélettani jelentőségét a Comet-eljárással nyomon követett DNS-hibajavítás fokozott nukleotidigényének kielégítése képezheti. A dCK aktiválódása során a dATP-pool szelektív növekedését tapasztaltuk, ami az enzimaktiváció és a limfociták apoptózisának kapcsolatát is felvetette. Az aktiválódás mechanizmusával kapcsolatban kimutattuk, hogy az aktivitás fokozódása nem jár együtt a dCK-fehérje mennyiségének megváltozásával. A proteinfoszfatáz gátló calyculin A aktiváló, illetve a hidrofób kalcium-kelátor BAPTA-AM gátló hatása azt bizonyítja, hogy az aktiválódás folyamata kalciumfüggő, és a reverzibilis fehérje-foszforiláció is szerepet játszik benne. Natív immunfestés segítségével összefüggést találtunk a dCK enzimaktivitása és immunreaktivitása között, ami arra utal, hogy az aktiválódás során a dCK egy olyan konformáció-változáson megy keresztül, ami egy katalitikusan aktívabb térszerkezet kialakulását eredményezi.
6
SUMMARY Deoxycytidine kinase (dCK) plays a central role in the deoxynucleoside salvage processes. Moreover, based on its surprisingly broad substrate specificity, this enzyme is responsible for the bioactivation of several nucleoside analogues of therapeutical importance, influencing the sensitivity of malignant tissues towards chemotherapy. The prevailing view suggested that the activity of dCK is not cell cycle-regulated and seemingly constant. In sharp contrast to this assumption, dCK activity was found to be elevated several fold upon short-term treatments of normal primary lymphocytes with 2-chloro-2’-deoxyadenosine, which might be a potentially important phenomenon with respect to the clinical practice, too. Further investigations showed that the activity of dCK could be augmented equally well both in normal and in leukaemic peripheral lymphocytes, but huge differences were revealed in the extent of stimulation in the malignant cell lines tested. Potentiation of enzyme activity was also elicited by a number of purine and pyrimidine substrate analogues as well as by DNA-damaging agents including the DNA polymerase inhibitor aphidicolin, the topoisomerase II inhibitor etoposide and γ-irradiation. These findings indicated that the main trigger of activation could be the damaged DNA itself, and the biological relevance might be to supply the dNTPs for the enhanced DNA repair, monitored by the Comet assay. Activation of dCK was paralleled by specifically elevated levels of intracellular dATP, raising the possibility that dCK activation might be linked to apoptosis induction. With regard to the mechanism of enzyme activation, no changes were found in the protein levels of dCK upon stimulation. The protein phosphatase inhibitor calyculin A enhanced the activity of dCK, while opposite results were obtained with BAPTAAM, a cell-permeant calcium chelator, demonstrating that the activation process is calcium dependent and comprises a protein phosphorylation step. A positive correlation was found between the enzymatic activity and the native immunoreactivity of dCK, strongly arguing that dCK undergoes a conformational change during activation that results in the formation of a catalytically more active steric structure.
7
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Enzimek ADA dCK dGK 5’-NT PARP PKC RR TK1 TK2
adenozin-dezamináz (EC 3.5.4.4) dezoxicitidin-kináz (EC 2.7.1.74) dezoxiguanozin-kináz (EC 2.7.1.113) 5’-nukleotidáz poli(ADP-ribóz)-polimeráz (EC 2.4.2.30) protein-kináz C ribonukleozid-5’-difoszfát-reduktáz (EC 1.17.4.1) citoplazmatikus dezoxitimidin-kináz (timidin-kináz-1; EC 2.7.1.21) mitokondriális dezoxitimidin-kináz (timidin-kináz-2)
Sejtek, sejtvonalak AML BL-41 CCRF-CEM CLL DG-75 HEK-293 HL60 K562 PBMC WiDr
akut mieloid leukémia humán Burkitt-limfóma eredetű sejtvonal humán T-limfoblasztoid sejtvonal krónikus limfoid leukémia humán B-limfoblasztoid sejtvonal humán embrionális vese eredetű sejtvonal humán promielocita sejtvonal humán krónikus mieloid leukémia-sejtvonal perifériás vér mononukleáris sejt humán colontumorból izolált sejtvonal
Nukleozidok, nukleotidok AaraC AMP-CP AzadC AraC AraG CAFdA CdA CrA dA dC dG dT dU dFdC FaraA dNTP FdUMP 5-FU
5-aza-1-β-D-arabinofuranozil-citozin adenozin-5’-(α,β-metilén)-difoszfát 5-aza-2’-dezoxicitidin 1-β-D-arabinofuranozil-citozin (citarabin) 9-β-D-arabinofuranozil-guanin 2-klór-2’-arabino-fluoro-2’-dezoxiadenozin (clofarabin) 2-klór-2’-dezoxiadenozin (cladribin, leustatin, pepstatin) 2-klór-riboadenozin 2’-dezoxiadenozin 2’-dezoxicitidin 2’-dezoxiguanozin 2’-dezoxitimidin 2’-dezoxiuridin 2’,2’-difluoro-2’-dezoxicitidin (gemcitabin, gemzar) 2-fluoro-1-β-D-arabinozil-adenin (fludarabin) dezoxinukleozid-trifoszfát 5-fluoro-uridin-5’-monofoszfát 5-fluoro-uracil
8
LN rPu Urd 3 H-dC 3 H-dT 3 H-CdA 3 H-dATP 3 H-dTTP 3 H-FdUMP 14 C-IMP 14 C-dCMP
liponukleotidok ribopurin ribouridin 2’-dezoxi-[5-3H]-citidin 2’-dezoxi-[5-metil-3H]-timidin 2-klór-2’-dezoxi-[8-3H]-adenozin 2’-dezoxi-[2, 8-3H]-adenozin-5’-trifoszfát [metil-3H]-timidin-5’-trifoszfát 2’-dezoxi-5-fluor-[6-3H]-uridin-5’-monofoszfát [8-14C]-inozin-5’-monofoszfát 2’-dezoxi-[2-14C]-citidin-5’-monofoszfát
Egyebek 3-ABA APC BAPTA-AM BSA DCF DEAE DEVD-pNA DMEM DTT ECL EDTA EGF(R) EGTA HEPES MAPK MEK MMLV NP-40 PBS PFT-α PI3K PMSF PVDF RPMI RT-PCR SAH SAM SDS TBST Tris TS VP16
3-aminobenzamid aphidicolin 1,2-bisz(2-aminofenoxi)etán-N,N,N’,N’-tetraecetsav tetrakisz(acetoximetil észter) borjú szérumalbumin 2’-dezoxicoformycin dietil-amino-etil N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-para-nitroanilid Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium 1,4-ditio-L-treitol enhanced chemiluminescence reaction etilén-diamin-tetraacetát epithelial growth factor (receptor) etilénglikol-bisz(2-aminoetiléter)-N,N,N’,N’-tetraacetát N-(2-hidroxietil)piperazin-N’-(2-etánszulfonsav) mitogen-activated protein kinase mitogen-activated protein kinase kinase; MAPK kinase Moloney Murine Leukemia Virus Nonidet P-40 phosphate buffered saline pifithrin-α foszfatidil-inozitol-3-kináz fenil-metil-szulfonil-fluorid polivinilidén-difluorid Roswell Park Memorial Institute reverz transzkripció - polimeráz láncreakció S-adenozil-homocisztein S-adenozil-metionin sodium dodecyl sulphate (nátrium-lauril-szulfát) Tris base, saline, Tween-20 trisz-[hidroximetil]-amino-metán tioszulfát etopozid; 4’-dezmetilepipodofillotoxin-9-[4,6-O-etilidén-β-D-glukopiranozid]
9
1. BEVEZETÉS Az onkológia egyik alaptételének tekinthető megállapítás szerint a daganatos betegségek gyógyításának három alappillérét a sebészi beavatkozás, a besugárzás és a kemoterápia képezi. Hosszú évtizedek tapasztalatai alapján dolgozták ki és napjainkban is folyamatosan javítják azokat a terápiás protokollokat, amelyekkel egy-egy daganattípus gyógyításában a legjobb eredmény érhető el. Ugyanakkor egyre szélesebb körben terjed az a szemlélet, hogy minden tumort egyedileg kell kezelni és minden beteget személyre szabott gyógymódban kell részesíteni, hiszen még a szövettanilag azonos típusú daganatok is egészen másképp reagálhatnak ugyanarra a kezelésre. Remény van arra, hogy már a nem túl távoli jövőben rutinszerűvé válik a tumoros szövetminták molekuláris genetikai vizsgálata (microarray), amelynek segítségével megállapítható a malignus transzformációhoz vezető molekuláris történés(ek) természete, ami egyénre szabott, célzott és hatékony beavatkozásokat tesz majd lehetővé. A rákos megbetegedések gyógyszeres kezelése során a tumorsejtek osztódási ütemét a legkülönfélébb támadáspontokon igyekeznek gátolni. A citosztatikumok három fő csoportjába a nukleotidok és nukleinsavak bioszintézisét gátló antimetabolitok (purin- és pirimidin-analógok, valamint a fólsav-antagonisták), a DNS-t károsító alkilálószerek, platinakomplexek és antibiotikumok, illetve a mitotikus orsót bénító vinca-alkaloidok és taxánok sorolhatók. Az elsők között alkalmazott kemoterápiás szerek egyike az arabinozil-citozin volt, amely látványos áttörést hozott az akut fehérvérűség gyógyításában, és mind a mai napig a mieloid leukémiák kezelésének alapját képezi. Napjaink kemoterápiás törekvéseinek középpontjában a citotoxikus szerek tumorszelektivitásának fokozása, más szóval a nemkívánt mellékhatások visszaszorítása, valamint az egyre gyakrabban jelentkező rezisztencia leküzdése áll. Ez utóbbi jelenség legalább akkora klinikai problémát jelent, mint a baktériumok antibiotikum-rezisztenciájának rohamos fokozódása. A nukleozid-analógok – köztük az arabinozil-citozin – ellen kialakuló rezisztencia kutatása irányította rá a figyelmet a dezoxicitidin-kináz enzimre, amelynek csökkent vagy hiányzó aktivitása gyakran áll a rezisztencia molekuláris hátterében, így az enzim vizsgálata fontos gyakorlati értelmet nyert.
10
A dezoxicitidin-kináz (dCK) a sejtekbe jutó nukleozid-analógokat foszforilálja, amely lépés elengedhetetlenül fontos azok biológiai hatásának kifejtéséhez, ugyanis a foszforilált analógok a sejtben felhalmozódnak, majd gátolják a dezoxiribonukleotidok és a DNS szintézisét, illetve programozott sejthalált válthatnak ki. A dezoxicitidin-kináz élettani szerepe a DNS katabolizmusa során keletkező, illetve a sejt környezetéből felvett nukleozidok újrahasznosítása; ennek megfelelően a dCK a nukleozid-mentő (salvage) enzimrendszerek tagja. Az enzim elnevezése annyiban pontatlan, hogy széles szubsztrát-specificitásánál
fogva
nemcsak
a
dezoxicitidint,
hanem
a
purin-
dezoxiribonukleozidokat is foszforilálni képes, sőt a természetes nukleozidok mesterségesen módosított származékait, a gyógyszerként forgalmazott nukleozidanalógokat is nagy hatásfokkal aktiválja. Ebből eredően a dCK megfelelő aktivitása ezen gyógyszerek hatékonysága szempontjából kulcsfontosságú tényező. Munkacsoportunk
már
hosszabb
ideje
foglalkozik
a
nukleozid-mentő
folyamatokban közreműködő enzimek vizsgálatával, s ennek kapcsán az egyes kemoterápiás szerek hatásmechanizmusával. A kísérletek során egy roppant érdekes jelenségre derült fény: a nukleozid-analógokkal kezelt normál limfociták dezoxicitidinfoszforiláló képessége megnőtt, s ez a változás egyértelműen a dezoxicitidin-kinázaktivitás jelentős emelkedésének volt tulajdonítható. Kutatómunkám célja a „miért, mi által és milyen célból” klasszikus kérdéskör alapján az enzimaktiválódás biokémiai hátterének feltárása volt. Eredményeink arra utalnak, hogy az enzim aktiválódása egy többféle sejttípuson is megfigyelhető, a DNS károsodása nyomán fellépő kalciumfüggő jelenség, amelynek során az enzim minden valószínűség szerint foszforilálódik és egy katalitikusan aktívabb térszerkezetet vesz fel. Ennek nyomán nemcsak természetes szubsztrátjait, hanem azok analógjait is hatékonyabban
foszforilálja,
ami
magyarázatul
szolgálhat
azon
klinikai
megfigyelésekre, hogy a daganatos betegségek kezelése során a nukleozid-analógok és más genotoxikus szerek együttes adásával lényegesen jobb terápiás hatás érhető el.
11
2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. A dezoxiribonukleotid-anyagcsere áttekintése A DNS szintéziséhez szükséges dezoxiribonukleozid-trifoszfát-prekurzorok előállításának domináns útvonala a citoszolban zajló „de novo” bioszintézis, azonban bizonyos
sejttípusokban
(limfociták
és
neuronok)
nagy
jelentősége
van
a
dezoxinukleozidok újrahasznosításán alapuló mentő (salvage) reakcióknak is, amelyek a citoszolban és a mitokondriumokban egyaránt végbemehetnek. A de novo útvonal elsősorban
a
DNS
megkettőződéséhez
szükséges
óriási
mennyiségű
dezoxiribonukleotidot szolgáltatja, míg a nyugvó sejtekben fellépő DNS-károsodás folyamatos javításának, illetve a mitokondriális DNS replikációjának és hibajavításának nukleotid-utánpótlásáról elsősorban a mentő rendszerek gondoskodnak. 2.1.1. A dezoxiribonukleotidok de novo bioszintézise A de novo reakcióút során először ribonukleozid-difoszfátok keletkeznek aminosavakból, C1-töredékekből, szén-dioxidból és ribóz-5-foszfátból bonyolult és magas energiaigényű mechanizmusok révén. A dezoxiribonukleotidok keletkezésének kulcslépése a ribóz 2’-helyzetű hidroxilcsoportjának a ribonukleotid-reduktáz által katalizált redukciója, amely egyúttal a teljes útvonal sebesség-meghatározó lépése és legfontosabb szabályozási pontja is. A ribonukleotid-reduktáz holoenzim az R1 és R2 jelű alegységekből tevődik össze. Az R1-polipeptid féléletideje 20 óra és a sejtciklus minden fázisában jelen van. A ribonukleotid-reduktáz mégis jellegzetesen az S-fázisban aktív enzim, mivel a rövid (3 órás) féléletidejű R2-alegység kizárólag ebben a fázisban szintetizálódik [1]. Aktivitását és specificitását ugyanakkor allosztérikus hatások is befolyásolják,
aminek
a
dezoxiribonukleozid-trifoszfátok
kiegyensúlyozott
szintézisében van jelentős szerepe [2]. A dNTP-koncentrációk egymáshoz viszonyított arányának eltolódása ugyanis a DNS-polimerázok hibás működéséhez vezet, azaz megnő a mutációk száma [3]. Az elmondottakból az következik, hogy a dezoxiribonukleotidok de novo szintézise kizárólag osztódó sejtekben mehet végbe, és ez a nézet évtizedeken át
12
szilárdan tartotta magát. 2000-ben viszont felfedezték a ribonukleotid-reduktáz R2-es alegységének p53R2-vel jelölt változatát, amely UV- és γ-sugárzásnak kitett sejtekben a p53 transzaktiváló hatása nyomán szintetizálódik és az R1 fehérjéhez kötődve akár nyugvó sejtekben is létrehozza a funkcionális holoenzimet [4]. Röviddel később kiderült, hogy ennek az új ribonukleotid-reduktáz-variánsnak a károsodott DNS kijavításához szükséges dezoxiribonukleotidok gyors előállításában van szerepe [5]. 2.1.2. A mentő útvonalak A mentő reakciók a táplálékból származó (extracelluláris) purin- és pirimidinnukleozidokat,
illetve
az
endogén
nukleinsavak
lebomlása
során
keletkező
nukleozidokat és szabad bázisokat képesek újrahasznosítani, ezáltal jelentős mennyiségű energiát takarítanak meg a sejt számára. A purin-nukleotidok katabolizmusából származó szabad bázisok (adenin, guanin és hipoxantin) és ezek nukleozidjai egyaránt hasznosíthatók, míg a pirimidinek általában nukleozid formában kerülnek újrafelhasználásra
a
megfelelő
nukleozid-,
illetve
dezoxinukleozid-kinázok
közreműködésével. A mentő útvonalak szerepe osztódó sejtekben valószínűleg redundáns, mert számos olyan sejtvonalat azonosítottak, amelyekből egy vagy több mentő enzim hiányzott. Ugyanakkor azt is kimutatták, hogy S-fázisú timuszsejtekben a de novo útvonal a purin-, míg a mentő reakciók a pirimidin-prekurzorok utánpótlásáért felelősek [6]. A nyugvó sejtek mentő reakcióútjai feltehetően a DNS-hibajavítás és a mitokondriumok
dNTP-ellátása
szempontjából
nélkülözhetetlenek,
továbbá
a
citosztatikus és antivirális nukleozid-analógok aktiválása miatt kiemelkedő klinikai jelentőségre tettek szert. A nukleozid-mentő enzimek élettani funkciói azonban még nincsenek pontosan tisztázva. A purinbázisok a jól ismert foszforibozil-transzferázok segítségével alakulhatnak vissza nukleotidokká. Ezen enzimek hiánya súlyos anyagcsere-betegségekhez vezet, ilyen például a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz hiányában kialakuló, jellegzetes idegrendszeri érintettséggel járó Lesh-Nyhan-szindróma, ami a neuronok purinmentő reakcióinak fontosságára utal. Olyan enzimek is ismertek, amelyek az így keletkező nukleotidok ribozil-csoportját dezoxiribózra cserélik, így megkerülhető a nyugvó sejtekből hiányzó ribonukleotid-reduktáz által katalizált redukciós lépés. A
13
dezoxiribonukleotidok mentő reakciói azonban leginkább a dezoxiribonukleozidokból indulnak ki, és a dezoxiribonukleozid-kinázok közreműködését igénylik.
DNS
DNS
DNC DNS-degradáció
dATP dGTP dCTP
dTTP
dUTP
NDPK
dATP dGTP
NDPK
NDPK
RR NDP
dADP
dGDP
AK
de novo ribonukleotid szintézis
dTDP
dCDP dUDP
GMPK UMP/CMPK
TMPK
TS dUMP
dAMP dGMP dCMP
dCTP dTTP
dTMP
dADP
dGDP
AK3
?
dCDP dTDP ?
?
dAMP dGMP
dCMP dTMP
dGK
TK2
DA
dCK dA
dTK1 TK1
dG
dC
m e n tő
dA
dT
dU
dG
?
reakci ók
dC
dT
mitokondrium
citoplazma ENT
CNT2
extracelluláris tér
dA
dG
dA
dG
dC
CNT1 dT
dC d
dT d
1. ábra. A dezoxiribonukleotidok de novo szintézise és mentő reakciói Rövidítések: CNT, koncentratív nukleozid-transzporter; ENT, ekvilibratív nukleozid-transzporter; DNC, mitokondriális dezoxiribonukleotid-karrier; RR, ribonukleotid-reduktáz; DA, dezoxicitidilátdezamináz; TS, timidilát-szintáz; AK, adenilát-kináz; GMPK, guanilát-kináz; UMP/CMPK, UMP/CMP-kináz; TMPK, timidilát-kináz; NDPK, nukleozid-difoszfát-kináz. A mitokondrium belső membránjára vetített kérdőjel a feltételezett mitokondriális dezoxinukleozid-transzportert jelöli.
A DNS lebomlása során keletkező szabad dezoxiribonukleozidok közvetlenül elérhetők a mentő enzimek számára (1. ábra). A legtöbb sejt azonban speciális nukleozid-transzporterekkel is rendelkezik, amelyeken keresztül az extracelluláris tér dezoxiribonukleozidjai a citoplazmába juthatnak (transzmembrán diffúziójuk hidrofil jellegük miatt nem lehetséges, bár ismertek olyan nukleozid-analógok, mint a 3’azidotimidin
és
a
2’,3’-didezoxi-adenozin,
amelyek
képesek
átdiffundálni
a
sejtmembránon). Két nagy nukleozid-transzportercsalád ismert. Az ekvilibratív nukleozid-transzporterek (ENT) a purin- és pirimidin-nukleozidok facilitált diffúzióját biztosítják a koncentráció-grádiensnek megfelelően, akár mindkét irányban is. A
14
koncentratív nukleozid-transzporterek (CNT) a nukleozidok sejtbe történő felvételét nátrium-kotranszport révén biztosítják, tehát a koncentráció-grádiens ellenében is működhetnek, ugyanakkor szűkebb specificitásuk van. Az 1-es típusú CNT elsősorban pirimidin-nukleozidokat, míg a 2-es típusú döntően purin-nukleozidokat képes szállítani (1. ábra) [7]. A
nukleozid-mentő
folyamatok
legfontosabb
lépése
a
nukleozidok
foszforilációja, hiszen a foszforilált nukleozidok erősen negatív töltésüknél fogva megrekednek a sejt belsejében. Az 5’-nukleotidázok azonban újra lehasíthatják a foszfátcsoportot, s ez a felszabaduló nukleozid kiáramlásához vezethet. A sejtből kijutó nukleozidok más sejtek nukleozid-membránreceptoraihoz kötődve a sejtek közötti jelátvitelt szolgálhatják, illetve visszakerülhetnek a kibocsátó sejt belsejébe. Az így létrejött szubsztrátciklus az intracelluláris nukleotid-koncentráció szabályozásának érdekes lehetőségét biztosítja [8]. Az emlős sejtekben négy különböző dezoxiribonukleozid-kináz fordul elő, amelyek
az
ATP
vagy
UTP
γ-foszfátcsoportját
a
nukleozidok
5’-helyzetű
hidroxilcsoportjával észteresítik. A timidin-kináz-1 (TK1) és a dezoxicitidin-kináz a citoplazmában, míg a timidin-kináz-2 (TK2) és a dezoxiguanozin-kináz (dGK) a mitokondriumok mátrixában található. Mindegyik enzim sajátos és részben átfedő dezoxiribonukleozid-specificitással
rendelkezik
[9]
(1.
ábra).
Homológjaik
a
baktériumokban [10] és az eddig vizsgált eukarióta fajok szinte mindegyikében megtalálhatók, az élesztősejtek kivételével. Érdekesség, hogy Drosophila-fajokban egyetlen, az ún. multiszubsztrát dezoxiribonukleozid-kináz („Drosophila-kináz”) fordul elő, amely az összes természetes dezoxiribonukleotidot foszforilálhatja [11]. A dezoxiribonukleozid-monofoszfátok további foszforilációját a sejtekben nagy mennyiségben megtalálható és magas aktivitású nukleozid-monofoszfát és -difoszfátkinázok katalizálják; előbbiek a nukleobázisokra specifikusak, viszont a ribo- és dezoxiribonukleotidokat egyaránt hatékonyan foszforilálják. A jelenleg ismert nukleozid-monofoszfát-kinázok közé a timidilát-kináz, az UMP-CMP-kináz, az adenilát-kináz ötféle izoenzime és a három guanilát-kináz-izoenzim tartozik. A nukleozid-difoszfát-kinázok viszont egyáltalán nem specifikusak (1. ábra). A három egymást követő foszforilációs lépés közül a dezoxiribonukleozid-kinázok aktivitása a sebességmeghatározó [12].
15
2.1.3. A dezoxiliponukleotidok szintézise Ismert, hogy a membránalkotó foszfolipidek prekurzorainak aktiválása CTP felhasználásával történik. A CTP dCTP-vel való helyettesíthetőségét már röviddel a foszfolipid-prekurzorok aktiválásért felelős citidilil-transzferáz felfedezését követően kimutatták [13]. Azonban sokáig úgy tűnt, hogy ennek nincs in vivo jelentősége, mígnem az időközben kifejlesztett HPLC-technikák segítségével lehetővé vált a dCDPkolin és a dCDP-etanolamin kimutatása sejtkivonatokból [14, 15]. Laboratóriumunkban kimutatták, hogy tonzilla-limfocitákban nagyon jól lehet jelezni a dCDP-kolint a sejtkultúrához adott radioaktív dezoxicitidinnel, és ezt a jelölődést a médiumhoz adott ribocitidin nagy feleslege sem csökkenti [16, 17, 18]. Ez arra utal, hogy az exogén eredetű, tehát a dezoxicitidin-kináz által foszforilált dezoxicitidinből képződő dCTP-t a citidilil-transzferáz valóban felhasználja a membrán-liponukleotidok szintézise során. A CDP-kolin és a dCDP-kolin exogén ribo- illetve dezoxicitidinnel való jelzettsége azt mutatta, hogy a sejt a kétféle nukleozidot egyaránt fel tudja használni a foszfatidil-kolin szintézise folyamán. Ennek alapján a dezoxiliponukleotidoknak in vivo is lehet szerepe. További vizsgálatok kimutatták, hogy a liponukleotidok szintézisére szolgáló dCTPpool elkülönül a de novo szintézisből származó dCTP-pooltól [14, 19]. A fent említett dCDP-kolin mellett kimutatható volt a dCDP-etanolamin és a dCDP-diacil-glicerol jelölődése is [15, 20]. Az 2. ábrán a liponukleotidok (LN) és a dezoxiliponukleotidok (dLN) lehetséges képződési útjainak sémája látható. Feltehetően az UTP-ből de novo képződő CTP-pool szolgáltatja elsődlegesen a CTP-t a citidilil-transzferáz számára. A „mentő” úton az exogén ribocitidint az uridin-citidin-kináz foszforilálja CMP-vé, amelynek CDP-vé alakulása valószínűleg az UMP-CMP-kináz révén történik, majd a nukleoziddifoszfát-kináz a CDP-t CTP-vé alakítja. Ily módon a mentő reakciók révén keletkezett CTP és a de novo CTP-pool keveredése valószínű. Ez megmagyarázhatja azt a furcsa eredményt, hogy az izotóppal jelzett ribocitidin inkorporációja a CDP-kolin-frakcióba igen alacsony, ugyanis az intracelluláris CTP-pool a radioaktív jelzést nagymértékben felhígítja. Ugyanakkor a liponukleotidok exogén dezoxicitidinnel igen jól jelölhetők. Ennek valószínű oka a dCTP-pool funkcionális megosztottsága, ami lehetővé teszi az exogén dezoxicitidin közvetlen bejutását a liponukleotid-frakcióba [15].
16
DNS
LN
UTP
CTP
UDP
CDP
dCTP de novo pool
RR
dLN
dLN
dCTP „salvage” pool
dNDP
dCDP
UMP-CMP-kináz UMP
CMP
dCMP
uridin-citidin-kináz -
dCK
U
dUMP
dTMP
dC
rC
2. ábra. A liponukleotidok (LN) és dezoxiliponukleotidok (dLN) szintézise, illetve a dCTP-pool megosztottsága RR, ribonukleotid-reduktáz; rC, ribocitidin; dC, dezoxicitidin.
Az arabinozil-citozin (araC) egy fontos antileukémiás gyógyszer [21], és 2-es pozíciójú
hidroxilcsoportjának
térállása
ezt
az
analógot
elsősorban
a
dezoxiribocitidinhez teszi hasonlatossá. Laboratóriumunk vizsgálatai szerint a limfociták radioaktív araC-vel történő jelölése esetén az araC mindössze 3 – 5%-a kerül a CDP-kolin/dCDP-kolin-frakcióba [16]. Radioaktív dC-t adva viszont 15%-os volt a liponukleotidok jelzettsége, s ez az arány akkor is megmaradt, ha a radioaktív dC-t nagy mennyiségű araC-vel együtt adták a sejtekhez. Ennek oka feltehetően az, hogy a dC és az araC eltérő úton metabolizálódik. Valószínű, hogy az araC a de novo dCTP-poolba kerül be, amely csak elenyésző mértékben fordítódik a liponukleotidok szintézisére. Az araC-t a dCK foszforilálja, az araCMP további foszforilációja az UMP-CMP-kináz révén történik, azonban a továbbiakban az araCTP mégis elkülönül a mentett dezoxicitidin-trifoszfát-pooltól. A keletkező araCTP DNS-be történő beépülése mérhető, bár a DNS-polimerázt az araCTP kifejezetten gátolja [21]. Az araC tehát inkább a de novo képződött dCTP útját követi. Ezek a kísérletek szintén alátámasztották a dCTP-pool funkcionális megosztottságát.
17
2.2. A humán dezoxiribonukleozid-kinázok jellemzése Bár a dezoxicitidin-kináz a citoplazmában található, érdekes módon mégis a mitokondriális dezoxinukleozid-mentő kinázokkal mutat hasonlóságot. A dCK, a dGK és a TK2 természetes szubsztrátjai tekintetében némi átfedés figyelhető meg; az enzimek expressziója konstitutív, továbbá aminosavsorrendjükben kb. 40%-os azonosság és ennél jóval magasabb fokú homológia figyelhető meg [9]. A TK1 ezzel szemben mind szerkezetében, mind S-fázis-specifikus expressziója tekintetében eltérő. A dCK, a dGK és a TK2 hasonlóságának filogenetikai magyarázatát az adja, hogy feltehetően valamennyien a herpeszvírusok timidin-kinázainak származékai. Ezzel szemben a TK1 az E. coli és a poxvírusok timidin-kinázaihoz hasonló [12]. Az említett dezoxiribonukleozid-kinázok legfontosabb tulajdonságait az 1. táblázat összegzi. Tulajdonképpen közéjük kellene sorolni az adenozin-kinázt is, amely a dezoxiadenozint is foszforilálhatja, de magas KM-értéke miatt fiziológiás körülmények között erre nem kerül sor [12]. A táblázatból kitűnik, hogy a dGK és a TK2 a mitokondriális kompartmenten belül valamennyi dNTP szintézisét képes biztosítani. A mitokondriális nukleozid-transzportert mindezidáig nem sikerült azonosítani (1. ábra), habár létezésének egyértelmű bizonyítéka, hogy a sejtekhez kívülről adott araG in vivo kitűnően foszforilálódik, és ez az analóg egyedül a mitokondriális dGK-nak szubsztrátja [22]. Az viszont bizonyított tény, hogy a mitokondriumok dezoxiribonukleotidokat is felvehetnek egy, a belső membránban található transzlokáz révén [23] (1. ábra). 1. táblázat. A dezoxiribonukleozid-kinázok összehasonlítása dCK
TK1
dGK
TK2
Lokalizáció
citoplazma
citoplazma
mitokondrium
mitokondrium
Expresszió
konstitutív
S-fázisban
konstitutív
konstitutív
Természetes
dC, dA, dG
dT, dU
dG, dA
dT, dU, dC
szubsztrátok
18
2.2.1. A dezoxicitidin-kináz 2.2.1.1. A dezoxicitidin-kináz génje A dCK-t kódoló gén a 4-es kromoszóma q13.3 – q21.1 lokuszán található [24]. A gén hét exonból áll, és 260 aminosavat kódol. A második intron meglepően hosszú (>19 kb), és valószínűleg az enzim szövetspecifikus expressziójában játszik szerepet. A dCK klónozása – több téves eredményt követően – 1991-ben járt sikerrel [25]. A klónozott enzimet egy dCK-hiányos egér-sejtvonalban expresszálták, és a rekombináns fehérje tulajdonságai megegyeztek az emberi szövetekből tisztított dCK paramétereivel. Az aminosav-szekvencia alapján azonosítani lehetett az enzim nukleotidkötő doménjét, és kiderült, hogy a dCK szerkezete bizonyos fokú homológiát mutat a herpeszvírusok timidin-kinázaival, sőt meglepő módon az src tirozin-kináz-család tagjaival is [25, 26]. A dCK promoterén két GC-boxot és két E-boxot azonosítottak, amelyek döntő módon befolyásolják a promoter aktivitását [27]. Kromatin-immunprecipitációval bizonyították, hogy a GC-boxokhoz in vivo az Sp1/Sp3 (specificity protein), az E-boxokhoz pedig az USF1/USF2 (upstream sequence factor) transzkripciós faktorok dimerjei kötődnek. A HepG2-sejteken végzett tranziens transzfekciók azt mutatták, hogy az USFdimer a gén transzkripcióját stimulálta, míg az Sp1 gátolta. Ez az ellentétes hatás részben az USF- és Sp1-faktorok közvetlen fehérje-fehérje kölcsönhatásán alapul, ugyanis az USF DNS-kötő doménjéhez kötődő Sp1 valószínűleg csökkenti az USF DNSkötő képességét [27]. Az eddigieken kívül még az E2F (eukarióta transzkripciós faktor2) palindrom kötőhelyének fele is kimutatható a promoteren, ahova az E2F in vitro bekötődhet és a transzkripciót is aktiválhatja [28]. A hiányos E2F-kötőhely ugyanakkor megmagyarázhatja azt a tényt, hogy a dCK in vivo nem S-fázis-függő enzim, ellentétben a TK1-gyel, amelynek promoterén megtalálható a teljes E2F-kötőhely [29], és az E2Fretinoblasztóma fehérjekomplexnek a G1/S-fázishatáron történő felbomlása az E2F bekötődését és a TK1 transzkripciójának ugrásszerű emelkedését eredményezi [30]. Az utóbbi években egymástól függetlenül több munkacsoport is beszámolt arról, hogy alternatív splicing révén inaktív dCK mutánsok keletkezhetnek, amelyeket a kettes, a hármas, a négyes vagy az ötös exon által kódolt peptidszakasz teljes hiánya jellemez. Ezeket a hibás enzimfehérjéket különböző nukleozid-analógokra rezisztens
19
sejtvonalakból [31 - 33], valamint akut mieloid leukémiában szenvedő, de araC-re nem reagáló betegek mieloblasztjaiból is izolálták [34]. Ezek az eredmények megerősítették a dCK szerepét a kemorezisztencia kialakulásában, ugyanakkor kiderült, hogy a katalitikusan inaktív (vagy nem is expresszálódó) dCK-mutánsok a vad típusú enzimre nincsenek domináns-negatív hatással [32, 35]. Felmerült, hogy egyes rezisztens sejtvonalakban a dCK promotere hipermetilált lehet, de ezt kísérletileg nem sikerült igazolni [36]. 2.2.1.2. A dezoxicitidin-kináz-fehérje A dCK homodimer formában aktív, s két azonos, 30 kDa tömegű monomerből áll [25, 37, 38]. Kétdimenziós elektroforézissel mégis két különböző izoelektromos pontú dCK-polipeptidet azonosítottak (pI: 5,5 és 5,7) [37, 39], aminek pontos magyarázata még nem ismert, de elképzelhető, hogy az alegységek töltéskülönbségét a fehérjelánc egy töltéshordozó másodlagos módosítása okozza. A dCK-fehérje stabilitását magas fehérjekoncentráció (pl. albumin), 20% glicerin, valamilyen redukáló ágens (pl. 2 – 25 μM DTT) és komplex detergensek jelenléte nagyban fokozza [37, 38]. Az enzim stabilitása a szubsztrátok és a foszfátdonorok megkötése révén tovább növekszik [40]. A rekombináns dCK térszerkezete a közelmúltban vált ismertté [41] (3. ábra). A homodimer globuláris fehérje betekeredett állapotban leginkább a Drosophila dezoxiribonukleozid-kinázra és a humán dGK-ra hasonlít [41]. A monomerek hidrofób magját öt párhuzamos lefutású β-lemez képezi, amelyeket tíz α-hélix vesz körül. A monomerek α4-es és α7-es hélixei alkotják a dimerizációs felületet; a dimer szerkezetét elsősorban a hidrofób oldalláncok kölcsönhatásai stabilizálják. A dCK működése szempontjából három szekvencia-motívumnak van kitüntetett szerepe. Az egyik az ún. P-hurok, amelynek GX4GKS/T általános aminosavsorrendje (a dCK-ban
28
GNIAAGKS35) valamennyi dezoxinukleozid-kinázban megőrzött, és a
foszfátdonor α- és β-helyzetű foszfátcsoportjainak megkötéséért felelős. A másik kritikus szerkezeti elem a Glu127, az Arg128 és a Ser129 alkotta ERS motívum, ahol a glutaminsav-oldallánc szerepe a magnéziumion rögzítése (a magnéziumionnal további koordinációs kötéseket létesít a P-hurok 35-ös szerinje, a β-foszfát egyik oxigénatomja
20
és három vízmolekula). A 128-as
arginin
a
katalitikus funkció kulcsa, ugyanis
a
nitrogénatomokban
gaz-
dag guanidinocsoportjával afféle „molekuláris csörlőként” működve a nukleozid-szubsztrát
LID Phurok
nukleofil
5’-hidroxil-csoportját 3,6 Ǻ távolságra közelíti a foszfátdonor
γ-foszfátjá-
hoz, így teremtve meg a foszfáttranszfer legfontosabb feltételét. Végül a harmadik kulcsfontosságú domén az ún. „fedőhurok”
3. ábra. A dCK-dimer térszerkezete Az alsó ábra (“felülnézet”) a felső “oldalnézeti kép” 90 fokos elforgatásával keletkezett. A kristályszerkezetbe zárt dezoxicitidin és ADP sárga színnel van jelölve.
(188RIYLRGRN195), amely az enzimhez kötődött ATP-re legyezőszerűen ráborul és három konzervatívan megőrzött arginin-oldalláncával az ATP-kötést stabilizálja, illetve a 194-es arginin oldallánca közvetlen kölcsönhatásba kerül a γ-helyzetű foszfáttal, így az átmeneti katalitikus komplex fontos stabilizátorának tekinthető. A dCK kristályosítása és röntgendiffrakciós analízise két szubsztrátanalóggal, az araCvel és a difluor-dezoxicitidinnel képzett komplex formájában is sikerrel járt. Ezek a vizsgálatok a dCK széles szubsztrát-specificitásának és a nukleozid-analógok gyakran még a természetes szubsztrátokénál is hatékonyabb foszforilációjának molekuláris szintű magyarázatát adták [41]. A 4. ábrán a humán dCK, dGK és TK2, valamint a Drosophila dezoxiribonukleozid-kináz aminosav-szekvenciái láthatók a nagyfokú homológiát érzékeltető ábrázolással. A 15 aminosavból álló „insert” domén érdekes módon csak a dCK-ban (s részben a dGK-ban) található meg. A peptidszakasz deléciója az enzim szubsztrát-specificitását jelentősen megváltoztatta [41].
21
4. ábra. A humán dCK, dGK és TK2, valamint a Drosophila nukleozid-kináz szekvenciáinak összehasonlítása Az azonos aminosavakat piros, a hasonló karakterűeket sárga, a közös szerkezeti motívumokat pedig kék szín emeli ki. Az α1 – 10 és β1 – 5 szerkezeti elemek a dCK-ra vonatkoznak. Átvéve: Sabini et al., Nat. Struct. Biol. 2003, 10, 513 – 519.
A humán dCK-fehérje ellen nyúlban termeltetett poliklonális ellenanyag az egérből, a majomból és a patkányból származó dCK-enzimet is kitűnően felismeri, ami az emlős dezoxicitidin-kinázok nagyfokú homológiájára utal [42], és ez a különböző emlősfajok dCK-cDNS-ének klónozása, majd az aminosavsorrend megállapítása révén is megerősítést nyert [43]. Az egér- és a humán dCK szekvenciájának kisfokú eltérése ugyanakkor jellegzetes enzimkinetikai különbségekben nyilvánul meg [43, 44, 45]. Johansson és munkatársai a zöld fluoreszcens fehérjéhez (GFP) kapcsolt dezoxicitidin-kinázt különböző sejtvonalakban expresszálva azt tapasztalták, hogy a
22
fúziós fehérje a magban található, és a dCK elsődleges szerkezetében megtalálható feltételezett nukleáris lokalizációs szignál elrontásával a dCK-GFP sejtmagba történő felvétele megszűnt [46]. Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a széles körben elfogadott nézettel szemben a dCK nem a citoplazmában, hanem a sejtmagban található. Eredményeiket azonban már a rákövetkező évben megcáfolták Hatzis és munkatársai, akik
az
általuk
előállított
specifikus
dCK-antitest
segítségével,
in
situ
immunfluoreszcenciával és a sejtek frakcionálásával bizonyították be, hogy az endogén dCK a citoplazmában található, ám túltermeltetése esetén valóban beléphet a sejtmagba [47]. Természetesen nem zárható ki, hogy bizonyos körülmények között az endogén dCK is a sejtmagba kerül, aminek esetleg az enzim szabályozásának szempontjából lehet jelentősége. 2.2.1.3. A dCK enzimológiai tulajdonságai A dCK természetes szubsztrátjai közé a dezoxicitidin mellett a dezoxiadenozin és a dezoxiguanozin tartoznak [48], de az enzim emellett a terápiás jelentőségű nukleozid-analógok széles skáláját is foszforilálja [12], sőt a többi dezoxinukleozidkinázzal ellentétben a nukleozid-szubsztrátok L-dezoxiribózt tartalmazó enantiomerjeit és α-térállású anomerjeit is kitűnően hasznosítja [49]. Történeti érdekesség, hogy átfedő szubsztrát-specificitása miatt ezt az enzimet tévedésből dezoxiadenozin-kináz néven is törzskönyvezték (EC 2.7.1.76) [12]. A purin-szubsztrátok alacsonyabb affinitással kötődnek az enzimhez (dA: KM = 42 μM, dG: KM = 150 μM), mint a dezoxicitidin (KM = 0,8 μM); ezek az arányok azonban a környezet ionerősségének változtatásával eltolhatók [50]. A különböző munkacsoportok által leírt vmax-értékek ugyanakkor jelentősen különböznek, ami részben módszertani eltérésekkel, részben az enzim nagyfokú instabilitásával magyarázható. Datta és munkatársai a dC-re, dA-ra és dG-ra 8500, 22000 és 12000 nmol/perc/mg tisztított fehérje vmax-értéket mértek [48], szemben a Bohman és Eriksson által meghatározott 145, 620 és 800 nmol/perc/mg tisztított fehérje adatokkal [37]. Ezek az eredmények azonban megegyeznek abban, hogy a purin-nukleozidok foszforilációja a dezoxicitidinéhez viszonyítva jóval gyorsabban történik. A dCK stabilitásának érdekes vonása, hogy a 37 ºC-on inkubált enzim dezoxiadenozin-foszforiláló kapacitása már két
23
óra elteltével a felére esik, míg dezoxicitidint foszforiláló képessége még hat óra múlva is változatlan [40]. A szubsztrátok egymással szemben kompetitív gátlószerként viselkednek. A dezoxicitidin erősen gátolja a másik két szubsztrát kötődését, míg a purin-nukleozidok kevésbé gátolják a dezoxicitidin foszforilációját, ami a Michaelis-konstansok ismeretében jól magyarázható [37]. A dCK azonban nem csupán a foszforilálandó nukleozid, hanem a foszfátdonor szempontjából is széles specificitású, hiszen az UTP-t az ATP-nél is eredményesebben hasznosítja, s elképzelhető, hogy in vivo körülmények között is elsősorban UTP-vel működik [51]. Kimutatták, hogy ATP jelenlétében a nukleozid és a foszfátdonor bekötődése bármilyen sorrendben történhet, UTP jelenlétében viszont először a foszfátdonor kötődik az enzimhez, ami megkönnyíti a nukleozid-szubsztrát dokkolását [52]. Az ATP és az UTP megkötése az enzim konformáció-változásával jár, ami az eredményesebb foszfáttranszfert segíti elő [53]. A dCK térszerkezetének tisztázása a katalitikus funkció és a széles szubsztrátspecificitás jobb megértéséhez is hozzájárult [41]. Az 5. ábrán a dCK-hoz kötődött dezoxicitidin-szubsztrátot rögzítő másodlagos kölcsönhatások láthatók. A dCK specificitásának egyik legfontosabb meghatározója a 133-as aszpartát, amely a dCK által nem foszforilálható timidinnel és dezoxiuridinnel a pirimidin-gyűrű 4-es helyzetű aminocsoportjának
hiánya
miatt nem tud kölcsönhatást 5. ábra. A dCK-hoz kötött nukleozid-szubsztrátot rögzítő kölcsönhatások A megfelelő analógokkal létesített további hidrogénkötéseket a d1 és d2 nyilak jelölik. A kék körök vízmolekulákat jelképeznek. A feltüntetett távolságok angströmben értendők; 1 Å = 0,1 nm. AraC, arabinozilcitozin; Gem., gemcitabin; Cyt., ribocitidin.
24
létesíteni. Hasonló diszkriminátor-szerepet játszik a 104-es arginin, amely jelentős térigényénél fogva nem hagy elég helyet a timidin 5-ös helyzetű, nagy térigényű metilcsoportjának. Ezeket a megállapításokat fényesen igazolja az a kísérlet, amelyben a dCK 104
Arg → Met és 133Asp → Ala kettős mutánsa a timidint is kitűnően foszforilálta [41].
A ribonukleozidok bekötődését a 86-os helyzetű tirozin-oldallánc akadályozza meg, amelynek
fenolos
hidroxilcsoportja
túlzott
közelségbe
kerülne
a
ribóz
2’-
hidroxilcsoportjával. A 86-os tirozin ugyanakkor a 197-es glutaminsavval közösen vesz részt a dezoxiribonukleozid 3’-helyzetű hidroxilcsoportjának rögzítésében. A krisztallográfiás szerkezeti modell bizonyos pirimidin-típusú nukleozidanalógok eredményes foszforilációjára is magyarázatot nyújt. Az arabinozil-citozin 2’helyzetű, a dezoxiribóz-gyűrű síkja felett elhelyezkedő hidroxilcsoportja az ERS motívum 128-as arginin-oldalláncával létesít hidrogénkötést (5. ábra; a d1 távolság 3,0 Ǻ). A gemcitabin (2’,2’-difluoro-2’-dezoxicitidin) egyik fluoratomja szintén ezzel az argininnel léphet kölcsönhatásba, míg a sík alatti másik fluor-szubsztituens a 86-os tirozin hidroxilcsoportjával létesíthet hidrogénkötést (5. ábra; d2 = 2,7 Ǻ). Ezek a kölcsönhatások azt eredményezik, hogy a két nukleozid-analóg a dezoxicitidinnel összemérhető affinitással kötődik az enzimhez. A purin-nukleozidok és analógjaik kötődésének térszerkezeti modellje azonban még nincs kidolgozva. Régóta ismert, hogy a dCTP a dCK feedback gátlószere, a KI értéke 1 μM [38, 48, 54]. A dCTP feltételezett allosztérikus kötőhelye valószínűleg nem egyezik meg az ATP-kötőhellyel, mivel kompetíció nem mutatható ki közöttük, ellenben a dCTP gátló hatását dTTP-vel fel lehetett függeszteni [54]. A tisztított enzim radioaktív dCTP-vel történő jelölése során kiderült, hogy a feedback inhibitor kötőhelye részben átfedő mind a foszfátdonor, mind a nukleozid-szubsztrát kötőhelyével. Ennek megfelelően a dCTP egy biszubsztrát analógnak is tekinthető, amely a dCK-hoz való kötődése révén mind az ATP/UTP, mind pedig a nukleozid-szubsztrát bekötődését megakadályozza [55]. 2.2.1.4. A dezoxicitidin-kináz expressziója A dCK enzim jelenléte és aktivitása az agy és a máj kivételével szinte valamennyi szövetből kimutatható [56, 57]. Kimagaslóan magas expresszió és enzimaktivitás mérhető a limfoid sejtekben, különösen a T-limfoblasztokban; a T-
25
limfociták érése során viszont a dCK expressziója fokozatosan csökken, így az enzim mennyisége az érett T- és B-sejtekben már nagyon hasonló [57]. A dCK mRNS-ének alacsony, konstitutív jelenlétét valamennyi vizsgált szövetben, így agy- és májszövetben is kimutatták, a limfocitákban viszont ezt tíz-hússzorosan meghaladó szinteket találtak [44]. A májban és az agyban viszont valamilyen poszt-transzkripciós gátló mechanizmus érvényesül, ami az enzimfehérje szintézisét megakadályozza [58]. Számos, egymásnak ellentmondó adat látott napvilágot a dCK expressziójának sejtciklus-függő szabályozásáról; az újabb eredmények viszont egyértelműen azt mutatják, hogy a dCK protein- [57] és mRNS-szintje [59] a limfocita-sejtciklus valamennyi fázisában azonos. A dCK aktivitásának szelektív meghatározása [56, 60], illetve az enzim expressziójának immunológiai [57], valamint a kvantitatív, reverz transzkripcióhoz kapcsolt polimeráz-láncreakción (real-time RT-PCR) [61, 62] alapuló módszerekkel történő pontos mérésének kidolgozása nyomán kiderült, hogy a rosszindulatú tumorok dCK-aktivitása és expressziója számos esetben meghaladja a normál szövetre jellemző értékeket [63], sőt egyes lágyrész-szarkómákból a limfoid sejtekre jellemző magas expresszió és enzimaktivitás mérhető [57]. A vizsgált humán tumorok dCK-tartalma és enzimaktivitása átlagosan háromszorosa – ötszöröse volt a megfelelő normál szövetekben mért értékeknek, ám még így is csak az ötödét érte el a normál limfocitákat jellemző aktivitásnak. A tumorok emelkedett dCK-aktivitásának oka, illetve a dCK esetleges szerepe a malignus transzformáció folyamatában még távolról sem tisztázott kérdés, ellenben a kemoterápia szempontjából fontos és hasznosítható tényező, mivel a legfontosabb nukleozid-analóg típusú daganatellenes gyógyszerek aktiválásának sebesség-meghatározó lépését a dCK katalizálja. A különböző típusú leukémiában szenvedő betegek véréből izolált transzformált limfocitákban a dCK expressziója és aktivitása számottevő különbségeket mutat, és összefüggést találtak az enzimaktivitás, valamint a betegség kemoterápiára való érzékenysége között [64, 65], amit a későbbiekben további munkacsoportok vizsgálatai is megerősítettek [35, 66, 67]. Természetesen a tumor magas dCK-aktivitása nem feltétlenül jelenti azt, hogy a daganat a nukleozid-analóg kemoterápiára jól fog reagálni [68], ám az irodalom mégis jó prediktív értéket tulajdonít ennek a paraméternek [21, 69, 70]. További bizonyítékot jelentenek
azok
a
megfigyelések,
hogy
a
dCK
mRNS-ének
antiszenz
oligonukleotidokkal, illetve ribozimokkal történő inaktiválása a nukleozid-analógokkal
26
szembeni rezisztencia kifejlődéséhez vezet [71, 72], viszont a dCK génjének nukleozidanalóg kezelésre rezisztens tumorsejtekbe történő bevitele jóval érzékenyebbé teszi a sejteket az alkalmazott terápiával szemben [66, 73, 74]. A továbbiakban rövid áttekintést szeretnék adni a dezoxicitidin-kináz által foszforilált legfontosabb nukleozid-analógokról. 2.2.1.5. A dCK által aktivált nukleozid-analógok és terápiás jelentőségük Az arabinozil-citozint (araC) a hatvanas évek óta eredményesen használják az akut mieloid és limfoid leukémiák, valamint a krónikus mieloid leukémiák blasztos fellángolásainak kezelésére. A sejtbe jutott araC-t a dCK nagy hatékonysággal monofoszfáttá alakítja, majd az UMP-CMP-kináz és a nukleozid-difoszfát-kináz araCTP-vé foszforilálja. Az araCTP közvetlen gátló hatást fejt ki a DNS-polimerázokra, valamint a szintetizálódó DNS-be épülve láncterminációt okoz [75]. A dCK-hiányos sejtekben araC-rezisztencia lép fel [70, 71], ami a sejtek hosszú ideig tartó alacsony dózisú araC-kezelésével is kiváltható [76]. A klinikai rezisztencia áttörésében sikerrel kecsegtető szellemes megoldás lehet az egyelőre in vitro körülmények között kipróbált S-acil-tioetil-araCMP nevű vegyület, az araC származéka. Ez a szer kellően apoláris ahhoz, hogy a membránon átdiffundálva a sejtbe jusson, ahol az S-acil-tioetil-csoport lehasadásával felszabadul az araCMP; így tehát a dCK katalizálta foszforilációs lépés megkerülhető [76]. Preklinikai vizsgálatok folynak az araC hosszú szénláncú zsírsavakkal konjugált származékaival is, amelyekkel kiküszöbölhető a károsodott membrántranszport miatt fellépő rezisztencia, továbbá az araC hatástartama is meghosszabbítható [77]. A dFdC (2’,2’-difluoro-2’-dezoxicitidin, gemcitabin, gemzar), a dezoxicitidin két geminális helyzetű fluoratommal szubsztituált származéka volt az első, szolid tumorok ellen is hatékony dC-analóg. Az eredetileg antivirális szernek szánt analógot 1986 óta eredményesen használják petefészek-, tüdő-, emlő- és hasnyálmirigydaganatok kezelésére. Hatásmechanizmusa rendkívül összetett. A dCK által foszforilált dFdC-t a dezoxicitidilát-dezamináz dFdUMP-vé dezaminálja, s ez a metabolit a timidilát-szintázt erősen gátolja [78]. A gemcitabin difoszfátja a ribonukleotid-reduktáz
27
inhibitora [79, 80]. A dFdC-trifoszfát gátolja a DNS- és RNS-polimerázokat, ugyanakkor az araC-hez hasonlóan beépülhet a DNS-be, ami ún. maszkírozott láncterminációt eredményez. Ez azt jelenti, hogy a DNS-szintézis leállása csak egy további nukleotid inkorporációja után következik be [78]. A szer DNS-inkorporációját elősegíti a ribonukleotid-reduktáz gátlása, ugyanis ha kevesebb természetes dCTP áll rendelkezésre, akkor nagyobb a valószínűsége annak, hogy a polimeráz a gemcitabintrifoszfátot építi be helyette. A dFdC az RNS-be is beépülhet, de ennek jelentősége még vitatott [81]. A 2-klór-2’-dezoxiadenozint (CdA, cladribin) 1972-ben szintetizálták először, és már ebben az évben kiderült antileukémiás hatása [82]. A CdA a dezoxiadenozin halogénezett származéka (6. ábra), amely rezisztenssé teszi az adenozin-dezamináz (ADA) katalizálta dezaminációval szemben, viszont a dCK-nak kitűnő szubsztrátja marad, sőt a dezoxiguanozin-kináz is jól foszforilálja [57, 83]. Jól ismert, hogy az adenozin-dezamináz hiányában a dATP koncentrációja toxikus szinteket ér el a sejtben [84]; ebből az valószínűsíthető, hogy a CdA toxicitásáért az aktív metabolit, a CdATP felhalmozódása lehet a felelős, amit a későbbiekben kísérlete-
CdA
CAFdA
FaraA
6. ábra. A cladribin (CdA), a clofarabin (CAFdA) és a fludarabin (FaraA) szerkezete
sen is igazoltak [85]. A CdA egyedülálló tulajdonsága, hogy osztódó és nyugvó sejtekre egyaránt toxikus. Osztódó sejtekben legfontosabb hatása a DNS-szintézis leállítása, amit a ribonukleotid-reduktáz és a DNS-polimerázok gátlása révén ér el [85]. A CdAkezelés során a sejt metilációs reakciói sem működhetnek tökéletesen, mivel a CdATP a transzmetilációs ciklus egyik enzimét, az S-adenozil-homocisztein-hidrolázt erősen gátolja, aminek következtében az SAM/SAH arány jelentősen lecsökken [86]. Nyugvó sejtekben a CdATP a hibajavító DNS-polimerázok gátlása révén DNS-lánctöréseket okoz, ennek következtében a poli(ADP-ribóz)-polimeráz enzim aktiválódik, s a kiterjedt
28
ADP-riboziláció a NAD koenzim mennyiségének kritikus csökkenéséhez vezet, ami az ATP-szintézis gátlásán keresztül a sejt pusztulását eredményezi [87]. E klasszikusnak tekinthető mechanizmussal párhuzamosan a CdA a sejtek apoptotikus programját is beindítja [88, 89]. Később kimutatták, hogy a sejtmentes kivonatokhoz adott CdATP és citokróm-c hatására aktiválódik a kaszpáz-rendszer [90], illetve a citokróm-c citoplazmába történő kiáramlásához a nukleozid-analógok mitokondriumra gyakorolt közvetlen hatása is hozzájárul [91]. A legújabb eredmények szerint ez utóbbi mechanizmus annyira fontos tényező, hogy a mitokondriumok CdA-kezelés indukálta citokróm-c-kibocsátásának károsodása esetén az érintett sejtek rezisztensek lesznek a CdA-ra [92]. Azt is kimutatták, hogy a programozott sejthalál indukciója a gemcitabin [93, 94] és az araC [94] hatásmechanizmusának is lényeges részét képezi. A CdA ma a hajas sejtes leukémia elsőként választandó gyógyszere; a betegek több mint 95 %-a kedvezően reagál erre a kezelésre. Ez a betegség a B-sejtes krónikus limfoid leukémia egyik változata, amely a transzformált limfociták jellegzetesen nyúlványos megjelenéséről kapta a nevét [95]. A CdA emellett az akut és krónikus mieloid leukémia, a krónikus limfoid leukémia és a rosszul differenciált non-Hodgkin-limfómák kezelésében is hatékonynak bizonyult, sőt az autoimmun betegségek terápiájában is helyet kapott, mivel immunszuppresszív hatása felülmúlja a ciklosporinét [96]. A CdA hatékonysága ösztönzőleg hatott további halogénezett dezoxiadenozinszármazékok szintézisére (6. ábra). Az arabinozil-fluor-adenint (FaraA, fludarabin) már a klinikai gyakorlatban is használják a CLL kezelésére [97]. A CAFdA (clofarabin, 2klór-2’-fluor-arabinozil-adenin) kifejlesztésével a CdA savra való érzékenységéből és az FaraA gyenge vízoldékonyságából eredő farmakokinetikai hátrányokat egyaránt sikerült kiküszöbölni [98]. Ez a vegyület pillanatnyilag a klinikai vizsgálatok II-es fázisában van [99]. A dCK a felsorolt tumorellenes szereken kívül számos olyan nukleozid-analógot is képes foszforilálni, amelyek a humán immundeficiencia- és a hepatitis B-vírusok replikációját gátolják, mint pl. a 2’,3’-didezoxicitidin és az arabinozil-adenin [12].
29
2.2.2. A timidin-kináz-1 A citoplazmatikus timidin-kináz-1 (TK1) génje a 17-es kromoszóma hosszú karján található. A humán TK1 gént 1983-ban klónozták [100]. Az enzim monomerjének molekulatömege 24 kDa, és tetramer formában aktív. Foszfátdonorként az ATP-n kívül valamennyi nukleozid- és dezoxinukleozid-trifoszfátot hasznosíthatja a CTP és a dTTP kivételével. Érdekes jelenség, hogy az enzim tetramerizációját az ATP indukálja, míg ATP nélkül a nagyon alacsony katalitikus aktivitású dimer forma alakul ki [101]. A TK1 szubsztrát-specificitása a többi nukleozid-kinázéhoz viszonyítva jóval szűkebb. Fő szubsztrátja a dezoxitimidin (KM = 0,5 – 3 μM), emellett kisebb hatékonysággal a dezoxiuridint is foszforilálja, a dezoxicitidint és a purin-nukleozidokat viszont nem képes hasznosítani. A TK1 által foszforilált antimetabolitok közül legismertebb az 5-fluor-dezoxiuridin és az azidotimidin, amit az AIDS terápiájában használnak. A TK1 kizárólag olyan nukleozidokat képes foszforilálni, amelyek a pirimidin-gyűrű 5-ös pozíciójában valamilyen nagy térkitöltésű szubsztituenst tartalmaznak [102]. A TK1 működésének szabályozása transzkripciós, transzlációs és poszttranszlációs szinten történő összetett folyamat. A TK1 aktivitása normálisan osztódó és malignus sejtekben egyaránt magas [57]. Az enzim S-fázis-specifikus expressziója az E2F és NF-Y (nuclear factor Y) transzkripciós faktorok promoteren található kötőhelyével jól magyarázható [29, 30, 103]. Az osztódásukban gátolt sejtek timidinkináza viszont gyorsan degradálódik; ez a folyamat a 30 aminosavból álló C-terminális domén épségét feltételezi, de az enzim szubsztrátjainak jelenléte a fehérje lebomlását meggátolja [104]. A C-terminális domén deléciója HeLa-sejtekben a mutáns TK1 konstitutív expressziójához vezetett [105]. Chang és munkatársai kimutatták, hogy mitózis során a TK1 foszforilálódik, ami aktivitásának csökkenését eredményezi [106], valamint a fehérje specifikus lebomlásához vezet [107]. Ugyanez a munkacsoport azt is leírta, hogy a TK1 a p21 sejtciklus-szabályzó fehérjével komplexet alkot, de a kölcsönhatás funkcionális jelentősége egyelőre nem ismert [108]. Érdekes kérdés, hogy a szervezetnek miért van szüksége a citoplazmatikus timidin-kinázra, hiszen az csupán az S-fázisban működik, éppen akkor, amikor a sokkal nagyobb dezoxitimidilát-szintetizáló kapacitással rendelkező ribonukleotid-reduktáz is
30
aktív. A magyarázat valószínűleg a „timidinmentés” kisebb energiaigényében rejlik. A TK1-génkiütött egér mindenesetre életképes, ám jellegzetes fenotípusos eltéréseket mutat. Az állatok egyéves koruk körül elpusztulnak glomerulosclerosis talaján kialakuló krónikus veseelégtelenségben. Az immunrendszer károsodására a lép megváltozott szövettani szerkezete, a lép-limfociták erősen csökkent kolónia-formáló képessége, valamint az artériák gyulladásos megbetegedései utalnak. A szérum timidinszintje jelentősen emelkedett [109]. 2.2.3. A mitokondriális dezoxinukleozid-kinázok A mitokondriális DNS szintéziséhez, illetve hibajavításához folyamatos dNTPellátásra van szükség. A mitokondrium belső membránja viszont az erősen poláris nukleotidok számára átjárhatatlan, így a mátrix nukleotid-utánpótlását egyrészt a nemrégiben azonosított nukleotid-transzporter [23], másrészt a mitokondriális mentő enzimek biztosítják (a de novo nukleotid-bioszintézis enzimeit eddig csak a citoplazmában sikerült kimutatni). A nyugvó sejtek citoplazmájában ráadásul annyira lecsökken a dNTP-szintézis sebessége, hogy a mitokondrium nukleotidigényét teljes egészében a timidin-kináz-2-nek és a dezoxiguanozin-kináznak kell fedeznie. Bár korábban a dCK mitokondriális lokalizációja is felmerült, később bebizonyosodott, hogy a dCK-nak nincsen mitokondriális izoenzime [110]. A humán TK2 génje a 16-os kromoszómán található, és 1997-ben klónozták [111]. Az enzim az N-terminálison található targetszekvencia segítségével kerül a mitokondriumba [112], ugyanakkor kis mennyiségben a citoplazmából is kimutatható, de az még nem eldöntött, hogy citoplazmatikus retenció, avagy mitokondriális „szivárgás”, netán egy mindmáig ismeretlen citoplazmatikus izoenzim miatt [113]. A TK2 expressziója konstitutív, és a különböző szövetekben mérhető aktivitása a mitokondriumok számával arányos [57, 112]. A TK2-fehérje molekulatömege 29 kDa, és szubsztrátjai bekötődése nyomán a katalitikusan aktív dimer formába megy át [114]. Az enzim természetes szubsztrátjai közé a három pirimidin-dezoxiribonukleozid tartozik, míg a purin-nukleozidokat nem hasznosítja, de számos dezoxicitidin- és dezoxiuridin-analógot is foszforilálhat [102].
31
A humán dezoxiguanozin-kináz (dGK) két 29 kDa-os alegységből álló homodimer. A dGK-t eddig minden vizsgált szervből ki tudták mutatni; expressziója a TK2-höz hasonlóan nem sejtciklus-függő, és jó összefüggést mutat az adott szövet mitokondrium-ellátottságával [12]. Egyes agytumorok és citomegalovírussal fertőzött sejtek viszont kiemelkedően magas dGK-aktivitást mutatnak [83]. Az enzim cDNS-e 277 aminosavat kódol, amelyből az első 17 a mitokondriális import-szekvencia. A sejtek
biokémiai
frakcionálása, illetve in situ immunfluoreszcens
vizsgálata
egybehangzóan azt jelzi, hogy a dGK a mitokondriális mátrixban található [115, 116], ámbár apoptózis során a dGK kijuthat a citoplazmába [116]. A dGK egy alapvetően purin-specifikus dezoxiribonukleozid-kináz (KM-je a dezoxiguanozinra nézve 2,5 – 7,6 μM, a dezoxiadenozinra pedig 60 μM), amely a pirimidin-nukleozidokat nem foszforilálja [83]. A dGK által hasznosítható nukleozidanalógok
közé
dezoxiguanozin,
tartozik valamint
a
2-klór-2’-dezoxiadenozin az
arabinozil-guanozin
(CdA), is
a
(araG),
2’,2’-difluoramelyet
a
dezoxiguanozinhoz hasonló affinitással foszforilál (KM = 8 μM) [117]. Bár az araG-t gyenge hatékonysággal a dCK is képes foszforilálni, az in vivo hatás feltétele a dGK által történő foszforiláció, amint azt Zhu és munkatársai a közelmúltban demonstrálták [118]. Radioaktívan jelzett araC-vel, illetve araG-vel inkubált sejtek autoradiográfiája során kiderült, hogy az araCTP a nukleáris DNS-be, míg az araGTP kizárólag a mitokondriális DNS-be épült be. A kísérletet egy dCK-hiányos sejtvonallal megismételve azt kapták, hogy az araC inkorporációja eltűnt, majd a dCK-cDNS transzfekciója után újra megjelent a magban, de a mitokondriumok araG-vel való jelöltsége a dCK hiányában és jelenlétében sem változott. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a nukleozid-analógok elsősorban azon kompartment DNS-ébe épülnek be, amelyben első foszforilációs lépésük megtörténik. Ezt a megfigyelést a szerzők a dCK
különböző
sejtkompartmentekbe
történő
mesterséges
irányításával
is
megerősítették, egyúttal kimutatták, hogy a mitokondriális DNS-be inkorporálódott analógok beindítják a programozott sejthalál folyamatát [119]. Az araG tehát különös klinikai jelentőségre tehet szert a csökkent vagy hiányzó dCK-aktivitást mutató daganatok kemoterápiájában, mert a tumorsejteket a mitokondriumok dGK-függő károsítása
révén
apoptózisra
bírhatja.
kialakulásának veszélye is fennáll [120].
32
Természetesen
az
araG-rezisztencia
A mitokondriális dezoxinukleozid-kinázok további gyógyászati jelentőségét az adja, hogy inaktiválódásuk az ún. mitokondriális DNS-depléciós szindrómák (MDS) kialakulását eredményezheti, amely betegségekre a mitokondriális DNS-molekulák számának (kópiaszám) csökkenése és a mitokondriumok következményes diszfunkciója jellemző.
A
súlyos
májelégtelenséggel,
hipoglikémiával,
laktát-acidózissal
és
idegrendszeri szövődményekkel jelentkező hepatocerebrális MDS hátterében a dGK kódoló régiójának pontmutációját azonosították, ami a dGK fehérje teljes hiányával jár [121]. A főként izomdisztrófiával kísért muszkuláris típusú MDS-t a TK2 gén olyan mutációi okozzák, amelyek egyetlen aminosav kicserélődéséhez vezetnek (90His → Asn, vagy
181
Ile → Asn). Ezek a mutáns enzimek viszont a vad típusú TK2
aktivitásának csak 14 – 45 %-át képesek biztosítani, ami a mitokondriumok homeosztázisának fenntartásához a jelek szerint nem elegendő [122]. Ezek a megfigyelések a mitokondriális nukleozid-mentő reakciók élettani jelentőségére is rámutatnak.
2.3. 5’-nukleotidázok: a nukleozid-kinázok funkcionális antagonistái Az 5’-nukleotidázok a dezoxinukleozid-kinázokkal ellentétes működést fejtenek ki azáltal, hogy a nukleozid-monofoszfátok 5’-helyzetű foszfátcsoportját lehasítják. Az 5’-nukleotidázok elhelyezkedésük szempontjából három fő csoportba sorolhatók [123]: ismeretesek a szérumban, a sejtmembrán külső felszínén (ektoenzimek), illetve a citoplazmában található 5’-nukleotidázok. A szérumban található 5’-nukleotidázok aktivitása májkárosodás és bizonyos daganatos megbetegedések esetén megemelkedik, így diagnosztikus jelentőségük van [124]. Az ekto-5’-nukleotidáz a membránba ágyazott enzim, amely extracelluláris nukleotidokat metabolizál; CD73 felszíni antigénnek is nevezik. Elsődleges szubsztrátja az AMP, de valamennyi purin- és pirimidin-nukleotid bontására képes. Az utóbbi időben ismerték fel a lokális hormonokként, illetve neurotranszmitterekként funkcionáló extracelluláris nukleotidok és nukleozidok biológiai szerepét a szív-érrendszer és az idegrendszer működésének szabályozásában. Az ekto-5’-nukleotidáz fontos szerepet tölt be ezen nukleotidok és nukleozidok egymáshoz viszonyított arányának beállításában [125].
33
Az intracelluláris nukleotidok hidrolízisét a citoplazmatikus 5’-nukleotidázok végzik. Az ekto-5’-nukleotidázhoz nagyon hasonló enzim az ún. citoplazmatikus alacsony KM-ű nukleotidáz, amely elsősorban AMP-t bont. A hasonlóság a két enzim molekulatömegében (70 kDa), aminosav-szekvenciájuk nagyfokú homológiájában, működésük pH-optimumában és aktivitásuk ATP-vel való gátolhatóságában nyilvánul meg. A másik sejten belüli nukleotidáz a citoplazmatikus magas KM-ű 5’-nukleotidáz, amelynek elsődleges szubsztrátjai az IMP és a GMP, és aktivitásuk ATP-vel stimulálható. Rajtuk kívül további citoplazmatikus 5’-nukleotidázokat is leírtak, amelyeknek biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott [12]. A citoplazma 5’-nukleotidázai a dCK által foszforilált nukleozid-analógokat is hatékonyan defoszforilálhatják. A két 5’-nukleotidáz emelkedett expressziója és/vagy fokozott aktivitása gyakran áll a nukleozid-analógokkal szemben in vivo és in vitro kialakuló rezisztencia hátterében, amint azt az alábbi vizsgálatok eredményei is bizonyítják (2. táblázat). Analóg
Betegség/sejtvonal
5’-nukleotidáz
Hivatkozás
CdA
hajas sejtes leukémia
magas KM
[64]
araC
akut mieloid leukémia
magas KM
[70, 126]
araC
akut mieloid leukémia
citoplazmatikus
[127]
araC/CdA
erythroleukémia
citoplazmatikus
[128]
CdA
HL-60
magas KM
[129]
araC, dFdC
K562
citoplazmatikus
[130]
CdA, dFdC
Jurkat, HEK-293
alacsony KM
[131]
CdA, FaraA,
2. táblázat. A magas 5’-nukleotidáz -aktivitás és a nukleozid-analógokkal szembeni rezisztencia közötti összefüggések hematológiai betegségekben és sejtvonalakon A „citoplazmatikus” jelző a citoplazma össz-5’-nukleotidáz-aktivitásának emelkedett voltára utal.
34
3. CÉLKITŰZÉSEK
Kutatómunkám kiindulópontját az a laboratóriumunkban tett megfigyelés képezte, hogy a CdA-val kezelt humán limfociták dCK-aktivitása jelentős mértékben megnövekedett. Mivel az aktívabb enzim több CdA-t tud foszforilálni, a nukleozidanalóg citotoxicitása fokozódik, ami azon túl, hogy bepillantást nyújt a dCK aktivitásának biokémiai szabályozásába, egyúttal komoly gyakorlati jelentőséggel is bír a
nukleozid-analógokkal
végzett
daganatterápia
hatékonysága
szempontjából.
Célkitűzésünk a dCK aktiválódásának az alábbi szempontok szerinti részletesebb tanulmányozása volt:
1. Vizsgálni kívántuk, hogy a dCK aktiválódása szelektív jelenség-e, avagy a nukleozid- és nukleotid-metabolizmus más enzimeinek az aktivitása is megváltozik a CdA hatására.
2. Az enzimaktiválódás körülményeinek feltérképezése, illetve a jelenség okának és jelentőségének tisztázása fizikai és kémiai sejtkárosító hatások alkalmazásával. Választ kerestünk arra, hogy •
A dCK aktiválhatóságának tekintetében van-e különbség a különböző eredetű nyugvó és osztódó (normál, illetve transzformált) sejtek között?
•
Van-e különbség a természetes dezoxinukleozid-szubsztrátok, illetve a purin- és pirimidin-analógok enzimaktivitásra gyakorolt hatása között?
•
Nem-metabolizálható
szubsztrát-analógokkal
(nukleozid-5’-tioszulfátok)
aktiválható-e az enzim? •
Célzott DNS-károsító hatások fokozzák-e a dCK aktivitását?
•
Szerepet játszhat-e a dCK aktiválódása a limfociták apoptózisában?
35
3. Kísérletet tettünk a dCK-aktiválódás molekuláris mechanizmusának megértésére, azaz tisztázni kívántuk a következőket: •
Változik-e a dCK-fehérje mennyisége a folyamat során?
•
Lehetséges-e, hogy az észlelt aktiválódásért az enzim foszforilációja a felelős? Milyen hatással van az aktivitásra a kináz/foszfatáz-egyensúly megzavarása protein-foszfatáz-gátlószerek, illetve hiperozmotikus kezelés alkalmazásával?
•
Történik-e stabil konformáció-változás az aktiválódás során?
•
Szerepet
játszik-e
a
p53-fehérje
enzimaktiválódásban?
36
a
DNS-károsodás
nyomán
fellépő
4. MÓDSZEREK 4.1. Anyagok 3
H-dC (specifikus aktivitás: 555 GBq/mmol, koncentráció: 37 MBq/ml) és 3H-
dT (925 GBq/mmol, 37 MBq/ml) izotópokat, Hybond ECL nitrocellulóz-membránt (RPN2020D), Hybond-P PVDF-membránt (RPN1416F), ECL western blot detektáló reagenst (RPN2108), tormaperoxidázzal konjugált anti-nyúl IgG-t, valamint FicollHypaqueTM szintetikus szukróz-polimert az Amersham Biosciences-től vásároltunk. A radioaktívan nem jelölt természetes nukleozidokat és nukleotidokat, az RPMI1640 tápoldatot, továbbá a PMSF, DTT, NP-40, glicerin, Ponceau S, DNáz, ribonukleáz A, proteináz K, etídium-bromid, BAPTA-AM, thapsigargin, Coomassie Brilliant Blue R-250, EGTA, aphidicolin, okadainsav, szorbitol, tripánkék, FaraA, araC, azadC, 3ABA, genistein, β-glicerofoszfát, AMP-CP, 5-FU, FdUMP, PD 98059, SB 203580, tripszin és szójabab eredetű tripszin-inhibitor anyagokat a Sigma cégtől szereztük be. A fehérjekoncentráció meghatározásához használt reagensek (Bio-Rad DC Protein Assay Kit No. 500-0116) és a széles sávú protein marker a Bio-Rad Laboratories termékei. A Kieselgel 60 F254 25 DC vékonyréteg-kromatográfiás szilikagél-lemezt a Merck, a BSA-t és a poolok méréséhez használt dezoxinukleozidtrifoszfátokat a Bohringer-Mannheim, a rekombináns λ protein foszfatázt (20000 U/ml) és kiegészítő reagenseit (10x reakciópuffer és MnCl2) a New England Biolabs, a dezoxicoformycint a Warner-Lambert Co. (USA), az alacsony lágyuláspontú agarózt, fötális borjúszérumot, penicillint, streptomicint és L-glutamátot pedig a Gibco Laboratories szállította. A calyculin A, a tirfosztin A47 és PD 153035 vegyszereket a Calbiochemtől, az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmentet (5000 U/ml) a Pharmacia cégtől (Uppsala, Svédország), az oligonukleotid primert és templátokat a Sigma-Genosys-től (Pampisford, UK), az üvegszálas GF/C filtereket a Whatman cégtől (Maidstone, UK) vásároltuk. A
14
C-IMP-t (2,07 GBq/mmol, 3,7 MBq/ml) és
14
C-dCMP-t (15 GBq/mmol, 4
MBq/ml) az UVUUR Co. szállította (Prága, Csehország). A 3H-CdA (152 GBq/mmol, 37 MBq/ml), 3H-dATP (1092 GBq/mmol, 37 MBq/ml) és 3H-dTTP (2257 GBq/mmol, 37 MBq/ml) izotópok pedig a Moravek Biochemicals Inc. termékei. Eagle’s MEM
37
tápoldatot, valamint steril PBS oldatot az Országos Epidemiológiai Központ Tápfolyadék Laboratóriumától (Budapest) vásároltunk. A DMEM tápfolyadékot a Flow Laboratories-től (Irvine, Skócia) szereztük be. Az etopozidot a Bristol-Myers Squibb Scandinavia, a CAFdA-t pedig dr. H. Cottam (University of California, San Diego, USA) bocsátotta rendelkezésünkre. A CdA-t, CrA-t és a nukleozid-5’-tioszulfátokat dr. Z. Kazimierczuk (Varsó, Lengyelország) szintetizálta [132, 133]. Az összes többi, itt fel nem sorolt reagens a Reanal (Budapest) analitikai tisztaságú gyártmánya volt.
4.2. Sejtkultúrák, kezelések és metabolikus jelölés 4.2.1. Sejtkultúrák A humán T-limfoblasztoid CCRF-CEM, a humán B-limfoblasztoid DG-75, a humán Burkitt-limfóma eredetű Ramos- és BL-41, valamint a krónikus mieloid leukémia K562 és promielocitás leukémia HL60-sejtek tenyésztése 10% fötális borjúsavóval kiegészített és 100 U/ml penicillint, 100 μg/ml streptomicint és 2 mM Lglutamátot tartalmazó RPMI-1640 médiumban történt 37 ºC-on, vízgőzzel telített 5% CO2 – 95% O2 atmoszférában. A sejtek kezelése céljából az exponenciális fázisban osztódó kultúrákat (4 – 8 x 105 sejt/ml) lecentrifugáltuk (1100 g, 5 perc, 4 ºC), szérummentes tápoldatban kétszer mostuk, majd dializált szérumot tartalmazó RPMI1640 tápoldatban vettük fel 2 – 10 x 106 sejt/ml sűrűségben. Az egészséges donorok, illetve gemcitabinnal kezelt pancreastumoros betegek vérlimfocitáit (perifériás mononukleáris sejtek (PBMC)), valamint krónikus limfoid vagy akut mieloid leukémiában szenvedő betegektől levett, heparinozott vérmintákból származó
CLL-PBMC-
és
AML-PBMC-
sejteket
Ficoll-Hypaque
grádiens-
centrifugálással izoláltuk. A teljes vért megegyező térfogatú PBS-sel hígítottuk, majd két rész vért óvatosan egy rész Ficoll-oldat (ρ = 1,077 g/ml) felületére rétegeztünk és 20 ºC-on 800 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A mononukleáris sejtek alkotta fehér gyűrűt óvatosan kiszívtuk a centrifugacsőből, majd a sejteket PBS-ben kétszer mostuk és RPMI-tápoldatban 107 sejt/ml koncentrációban felszuszpendáltuk.
38
Humán tonzilla-limfocitákat 3 – 6 év közötti gyermekek tonsillectomia során eltávolított szájpadmanduláiból preparáltunk [134]. A mandulákat a Heim Pál és a Bethesda Gyermekkórház bocsátotta rendelkezésünkre, és a sejtizolálás a műtétet követő másfél órán belül elkezdődött. Az apróra vagdosott és Eagle’s MEM oldattal összekevert tonzillákból a nyiroksejteket enyhe rázással távolítottuk el. A szövetdarabok két réteg gézen történő eltávolítása után a sejtszuszpenziót kétszer mostuk jéghideg Eagle’s oldatban történő centrifugálással (K23 centrifuga, 1100g, 10 perc). Végül a sejteket 107/ml koncentrációban Eagle’s MEM-oldatban felszuszpendáltuk. A tonzilla-limfociták nyugvó és osztódó sejtpopulációinak elválasztását albuminsűrűséggrádiens centrifugálás segítségével végeztük. 1 ml sejtszuszpenziót (108 sejt/ml) 1 ml, 25%-os, Eagle’s MEM tápfolyadékban oldott BSA-grádiens felületére rétegeztünk és 30 percen át 1000 g-vel centrifugáltunk. A limfoblasztok (S-fázisú sejtek) az interfázisban gyűlnek össze, a nagyobb sűrűségű kis limfociták (G-fázisú sejtek) pedig leülepednek a centrifugacső aljára. Az így szeparált sejtpopulációkat PBS-sel mostuk, majd koncentrációjukat Eagle’s MEM-ben 107/ml-re állítottuk be. Humán timocitákat szívműtéteken átesett fél – egy éves gyermekek timuszából az előző bekezdésben leírt módszer szerint izoláltunk; a műtét során eltávolított szerveket az Országos Kardiológiai Intézet bocsátotta rendelkezésünkre. Az egér timuszból és lépből történő limfocita-preparálás is a tonzillánál ismertetett módszer szerint történt. 4.2.2. Sejtszám és élősejtszám meghatározása A primer limfocita-kultúrákban a sejtszámot Türck-oldattal történő szupravitális festéssel határoztuk meg. A Türck-oldattal megfelelő mértékben hígított sejtekkel Bürker-kamrában két független számolást végeztünk. Az élősejtszámot tripánkék kizárási teszttel határoztuk meg (0,4% tripánkék 0,85%-os nátrium-klorid-oldatban). Az élősejtszám a kísérletekben 90% felett volt. A sejttenyészetek koncentrációját és a sejtek térfogatát Coulter Multisizer automata készülékkel (Coulter Electronics, Luton, UK) mértük.
39
4.2.3. Sejtkultúrák kezelése A szövetből vagy vérből izolált, illetve sejttenyészetekből nyert, 0,5 – 1 ml térfogatú sejtkultúrákat Eppendorf csövekben, 37 ºC-os vízfürdőben, az egyes kísérletek leírásánál megadott szerekkel és időtartamokig inkubáltuk. A kezeléseket a sejtszuszpenziók jégen történő gyors lehűtésével állítottuk le, majd centrifugálással ülepítettük a sejteket (Eppendorf centrifuga, 1100 g, 2 perc). A sejtcsapadékot hideg PBS-oldatban kétszer mostuk, majd extrakciós pufferben vettük fel. 4.2.4. Limfociták γ-besugárzása A primer tonzilla-limfocita-kultúrák γ-besugárzását 60Co sugárforrással, Siemens Gammatron-3 készülékkel végeztük szobahőmérsékleten, Eppendorf csövekben. A légdózis-teljesítmény 0,4882 Gy/perc volt 52,5 cm távolságból besugarazva. Az elnyelt dózis 0,5 – 4 Gy között változott, amelyet a besugárzási idő megfelelő megválasztásával (1,0 – 8,2 perc) állítottunk be. A besugárzást követően a sejteket meghatározott ideig 37 ºC-on inkubáltuk, majd jégen lehűtöttük és sejtkivonatokat készítettünk belőlük. A sejtek γ-besugárzását az Országos Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Intézetben, dr. Sáfrány Géza munkacsoportjával együttműködésben végeztük. 4.2.5. Radioaktívan jelölt dezoxinukleozidok metabolizmusának mérése A különböző hatóanyagokkal való kezelést, illetve γ-besugárzást követően a sejtszuszpenziókat (5 x 106 sejt 500 μl-es térfogatban) 30 percen át jelöltünk 3H-dC-nel vagy 3H-dT-nel (1,0 μCi/ml, a specifikus aktivitás 500 – 1000 cpm/pmol között mozgott). A centrifugált sejtcsapadékot kétszer mostuk jéghideg PBS-sel, majd 100 μl 75%-os etanol hozzáadása után a mintákat egy éjszakán át – 20 ºC-on tartva csaptuk ki a sejtfehérjéket. Az etanollal kicsapott szuszpenzió lecentrifugálását követően (1850 g, 2 perc) minden minta felülúszójából 40 – 40 μl-t mértünk két sorozat DEAE-szűrőpapírra [135]. Az első sorozat papírra cseppentett felülúszót szárítószekrényben beszárítottuk. Ez tartalmazza a sejtbe jutott összes, alkohol-oldékony radioaktivitást, amelyet
40
kísérleteinkben „felvételnek” neveztünk. A másik sorozat filtereit enyhe kevergetés mellett 10 percig jéghideg, 1,5 mM-os ammónium-formiát oldattal, majd 10 – 10 percig szobahőmérsékletű 1,5 mM-os ammónium-formiáttal, desztillált vízzel és 96%-os etanollal mostuk, majd ezeket a papírokat is beszárítottuk. Mivel a mosás után kizárólag a foszforilált dezoxinukleozidok maradnak a DEAE-papírhoz kötődve (a szintén jelölt dezoxiliponukleotidok, lemosódnak),
az
így
illetve
a
nem
elkülönített
foszforilált
frakciót
jelzett
dezoxinukleozidok
„foszforilációnak”
nevezzük.
A
dezoxiliponukleotid- és dezoxinukleozid-frakciók jelöltsége a felvétel és foszforiláció különbségének felel meg [15]. Mivel a sejtbe jutott radioaktív nukleozidok mindössze 1 – 2%-a marad foszforilálatlan, mennyiségük elhanyagolható, tehát a felvétel és foszforiláció
különbségéből
számottevő
pontossággal
tudunk
következtetni
a
dezoxiliponukleotid-frakció jelöltségére. A megszárított DEAE-filtereket szcintillációs üvegküvettákba helyeztük, majd a hozzájuk kötődött radioaktivitást 200 μl 0,5 M perklórsavval eluáltuk és 3 ml szcintillációs koktélt mértünk rá (összetétele: 33 v/v% Triton-X-100, 12,14 mM 2,5difenil-oxazol (PPO), 92 μM 1,4-di-[2-(5-fenil)oxazoil]benzol (POPOP) toluolban oldva). Alapos összerázás után a minták aktivitását Packard-Bell szcintillációs számlálóval mértük. Az alkohollal feltárt sejtek centrifugálással elkülönített csapadékát 0,5 M perklórsavban felszuszpendáltuk, majd centrifugáltuk és kétszer mostuk. A savban nem oldódó csapadékot 500 μl perklórsavban 90 ºC-on 60 percig kezeltük. A szuszpenzió lehűtését és centrifugálását követően az elhidrolizált nukleinsavakból származó nukleotidok a felülúszóban találhatók. Az ebben a frakcióban mérhető, DNS-be és RNS-be épült radioaktivitást „inkorporációnak” nevezzük (a kívülről adott, jelzett dezoxinukleozidok csak a DNS-frakcióba inkorporálódnak [17]). A savas felülúszóból 200 μl-t közvetlenül küvettába mértünk, és a radioaktivitás meghatározása a fentiekkel egyező módon történt. A felvett, a foszforilált, illetve a DNS-be inkorporált radioaktív nukleozidok pmol/106 sejt/30 perc egységben kifejezett mennyiségét az ismert mennyiségű és specifikus aktivitású standardok azonos körülmények között mért aktivitásából számítottuk.
41
4.3. Nyerskivonatok enzimaktivitásának mérése 4.3.1. Nyerskivonat készítése Az 5 x 106 sejtből származó csapadékot 100 μl extrakciós pufferben vettük fel, amelynek összetétele: 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,5% NP-40 nem-ionos detergens, 20 v/v% glicerin, 2 mM DTT és 0,5 mM PMSF. A sejtek feltárását folyékony nitrogénben történő fagyasztás és jégen történő felolvasztás háromszori ismétlésével és erős rázatással segítettük elő. Az így kapott szuszpenzióból centrifugálással távolítottuk el a mag- és membrántöredékeket (14000 g, 30 perc, 4 ºC). 4.3.2. A fehérje-koncentráció meghatározása A centrifugálással elkülönített felülúszó fehérjemérését – az extrakciós puffer magas detergenstartalmának figyelembevételével – a Bio-Rad cég Lowry módszerén alapuló
mérőoldataival
végeztük.
albuminsorozatot használtunk.
Kalibrációra
extrakciós
pufferrel
hígított
A western blotra kerülő minták fehérjetartalmát
extrakciós pufferrel történő hígítással egységesen 5 mg/ml-re állítottuk be. 4.3.3. dCK- és TK-enzimaktivitás mérése A dezoxicitidin-kináz enzimaktivitásának meghatározását 50 μl végtérfogatú kináz-reakcióelegyben végeztük, amelynek összetétele a következő: 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 5 mM ATP, 5 mM MgCl2, 10 μM 3H-dC (specifikus aktivitás: 500 – 1000 cpm/pmol), 2 mM DTT és 10 mM NaF. A reakciót 5 μl sejtkivonat hozzáadásával indítottuk, és 37 ºC-on 30 percig inkubáltuk. Mérési körülményeink között az enzimreakció
sebessége
lineáris
volt
mind
az
inkubációs
idő,
mind
az
enzimkoncentráció függvényében. A reakció leállítása 40 μl-nyi reakcióelegy DEAEfilterpapírra történő cseppentésével történt. A papírok mosását, eluálását és a radioaktivitás mérését a 4.2.5. alpontban leírtaknak megfelelően végeztük. A dCK aktivitását 50 μM 3H-CdA-szubsztráttal is megmértük a fentiekkel teljesen megegyező körülmények között.
42
A timidin-kináz aktivitásának meghatározása mindenben a fent rögzített paraméterek szerint történt azzal a kivétellel, hogy a reakcióelegy 10 μM 3H-dTradioizotópot tartalmazott a 3H-dC komponens helyett. 4.3.4. Dezoxicitidilát-dezamináz-aktivitásmérés A dCMP-dezamináz-enzimet
14
C-dCMP (15 GBq/mmol, 0,1 μCi/reakció)
szubsztráttal mértük a 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM MgCl2, 0,5 mM dCMP, 20 μM dCTP és 20 μM β-merkaptoetanol összetételű reakcióelegy 50 μl-ében, a reakciót 5 μl nyerskivonat hozzáadásával indítva. A mérést 37 ºC-on történő 30 perces inkubálást követően kétperces forralással állítottuk le, majd dCMP – dUMP-standard hozzáadása után (végkoncentrációk: 5 – 5 mM) a reakcióelegy 5 μl-ét Kieselgel 60 F254 vékonyrétegen, n-butanol : ecetsav : H2O 2:1:1 térfogatarányú elegyével elválasztottuk. A szubsztrát dCMP-nek és a termék dUMP-nek megfelelő foltokat UV-lámpa alatt vágtuk ki a szilikagélből, aktivitásukat pedig a fent részletezett folyadék-szcintillációs eljárással határoztuk meg. 4.3.5. 5’-nukleotidáz-aktivitás meghatározása Az 5’-nukleotidázok aktivitását
14
C-dIMP (56 mCi/mmol, 0,005 μCi/reakció)
szubsztrát felhasználásával az alábbi reakciópuffer 20 μl-ében mértük: 50 mM imidazolHCl pH 7,0, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 5 mM β-glicerofoszfát (nem-specifikus foszfatázgátló, az alkalikus foszfatáz aktivitását is gátolja), 1 mM AMP-CP (ekto-5’nukleotidáz gátlószere), 1 mM IMP, 0,5 mg/ml BSA és 2 μl sejtkivonat. Egy párhuzamos mérési sorozatban a fentiek mellé még 5 mM ATP-t is adtunk az ATP-vel stimulálható 5’-nukleotidáz-aktivitás meghatározására. A reakció 60 percig 37 ºC-on zajlott, és a minták kétperces forralásával állítottuk le. Kromatográfiás standardként 10 – 10 mM-os végkoncentrációban inozin – IMP keveréket adtunk a csövekhez, majd 5 μl-nyi reakcióelegyet futtattunk az előző alpontban leírt körülményeknek megfelelően. Az inozinnak és az IMP-nek megfelelő foltok radioaktivitását is a fentieknek megfelelően, folyadék-szcintillációs eljárással mértük meg.
43
4.4. Limitált proteolízis Kontroll és CdA-val kezelt sejtekből a 4.3.1. alpontnak megfelelően nyerskivonatokat készítettünk. A kivonatok részleges tripszines emésztését szobahőmérsékleten végeztük 0, 1, 3, 9, 15 és 45 percen keresztül az alábbi összetételű reakcióelegy 12 μl-nyi végtérfogataiban: 25 mM Tris-HCl pH 8,0; 100 mM NaCl; 2 mM DTT; 2 μg tripszin és 50 μg sejtfehérje. A reakciókat 2 μl szójabab eredetű tripszin-inhibitorral állítottuk le (4 mg/ml, a fenti Tris-NaCl-DTT pufferben oldva). A mintákat 15%-os SDSpoliakrilamid-gélen választottuk el, majd anti-dCK western blotot végeztünk.
4.5. Poliakrilamid-gélelektroforézis és western blot 4.5.1. SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis Az 5 mg/ml fehérje-koncentrációra beállított sejtkivonatok 5 μl-ét azonos térfogatú 2x Laemmli (SDS-) mintapufferrel (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM DTT, 4% SDS, 20% (v/v) glicerin, 0,2% brómfenolkék) kevertük össze, majd a mintákat 5 percnyi forralás után a 0,1% SDS-t tartalmazó, 12%-os diszkontinuus poliakrilamidgélre vittük. A sejtkivonatok mellett rekombináns dCK-ból, illetve humán lép limfómából affinitás-kromatográfiával tisztított natív dCK-ból is futtattunk különböző mennyiségeket (5 – 30 ng, illetve 20 μg). (Az N-terminálisán hexahisztidinnel címkézett rekombináns dCK-t S. Eriksson munkacsoportja (Uppsala, Svédország) termelte E. coliban a pQE bakteriális expressziós vektorral [50]. A humán tisztított dCK-t szintén S. Eriksson bocsátotta rendelkezésünkre [37]). A futtatás szobahőmérsékleten történt a Bio-Rad Mini Protean II elektroforézis készülékkel, konstans 120 V feszültséggel, 25 mM Tris bázist, 192 mM glicint és 0,1% SDS-t tartalmazó futtatópufferben (pH 8,3). A natív körülmények között kivitelezett fehérje-elválasztás a következőkben különbözött a fentebb leírtaktól: a mintapuffer nem tartalmazott SDS-t és DTT-t; a mintákat nem hődenaturáltuk a futtatás előtt; a gél és a futtatópuffer sem tartalmazott SDS-t; a futtatás 4 ºC-on történt. A gélekből a fehérjéket membránra transzferáltuk, illetve egyes natív géleket Coomassie-val festettünk. Az 50 v/v% metanol és 10 v/v% ecetsav elegyében oldott
44
0,2% Coomassie Brilliant Blue R 250 festékben 30 percig szobahőmérsékleten rázattuk a gélt, majd a festék feleslegét 50 v/v% metanol – 10 v/v% ecetsav elegyével mostuk ki. 4.5.2. Denaturáló és natív immunblot Az SDS-poliakrilamid-gélen elválasztott fehérjéket Hybond ECL nitrocellulózmembránra vagy PVDF-membránra blottoltuk Bio-Rad Mini Trans-Blot készülék segítségével. A transzferpuffer összetétele: 25 mM Tris-bázis, 192 mM glicin, 0,1% SDS és 20 v/v% metanol. Az elektroblottot 350 mA konstans áramerősség mellett 60 percen át szobahőmérsékleten végeztük. Ezt követően a membránokat Ponceau Soldattal megfestettük (0,1% Ponceau S 5%-os ecetsavban), hogy meggyőződjünk az egyes sávokban futtatott fehérjék azonos mennyiségéről és futási mintázatáról. A membránt annak teljes elszíntelenedéséig TBST-oldattal (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20 detergens) mostuk, majd 5% sovány tejport tartalmazó TBST-vel egy éjszakán keresztül blokkoltuk. Ezt követően a membránt 4 x 15 percig TBST-vel mostuk, majd egy órán át szobahőmérsékleten, enyhe rázás mellett 1% sovány tejport tartalmazó TBST-vel 1:5000 arányban hígított elsődleges ellenanyaggal inkubáltuk. A humán dCK C-terminális doménje (epitop:
246
YESLVEKVKEFLSTL260)
ellen nyúlban termeltetett antitestet [47] Taljanidisz János munkacsoportja (Herakleion, Görögország) készítette és bocsátotta rendelkezésünkre. Az inkubálást 4 x 15 perces mosás követte. Másodlagos antitestként tormaperoxidázzal konjugált anti-nyúl IgG-t alkalmaztunk TBST-vel történt 1:10000-szeres hígításban. A membránokat egy órán keresztül rázattuk a másodlagos antitest oldatában, majd négyszer 15 percig mostuk TBST-vel. Az immunkomplexeket kémiai lumineszcencián alapuló reakcióval tettük láthatóvá és Kodak röntgenfilmre exponáltuk a jel erősségétől függően 0,1 – 20 percig. A natív gélről félszáraz (semi-dry) módszerrel, 4 ºC-on, 2 mAh/cm2 áramsűrűséggel blottoltuk át a fehérjéket PVDF-membránra. A készülék lemezeire helyezett szűrőpapírokat 25 mM Tris-bázist és 192 mM glicint tartalmazó, 8,3-as pH-jú transzferpufferrel itattuk át. A membránt a későbbiekben a fent leírtakkal megegyező módon inkubáltuk és hívtuk elő.
45
A „dot-immunblot” céljára 75 mM-os, 8,8-as pH-jú Tris-HCl oldatában 5 percig áztatott nitrocellulóz-membránt használtunk. A minták felcseppentése és beszárítása után teljes egészében a fent részletezett lépéseket követtük.
4.6. Nyerskivonatok kezelése λ-protein-foszfatázzal A 4.3.1. alpont alapján készített sejtkivonatokból 5 μl-t (25 μg teljes fehérjetartalom) kezeltünk rekombináns λ-protein-foszfatázzal. A 20 μl végtérfogatú reakcióelegy az alábbi komponenseket tartalmazta: 400 U λ-protein-foszfatáz, 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,1 mM Na2EDTA; 5 mM DTT; 0,01% Brij-35 detergens és 2 mM MnCl2. Az emésztést 30 ºC-on 30 percig végeztük, majd a reakcióelegy 20 μl-éhez 5 μl natív 2x Laemmli-puffert adva a fehérjéket a 4.5. pontban bemutatott módszer alapján natív poliakrilamid-gélelektroforézissel szétválasztottuk és natív anti-dCK western blottal azonosítottuk.
4.7. Comet-eljárás A
γ-sugárzás
okozta
DNS-lánctörések
és
kijavításuk
szemikvantitatív
kimutatására ill. követésére az egyedi sejtek alkalikus gélelektroforézisének módszerét (Comet assay) alkalmaztuk. A mérésnél Singh és munkatársai módszertani leírására támaszkodtunk [136]. 5 x 104 besugarazott sejtet PBS-ben oldott, 0,5%-os, alacsony lágyuláspontú
agaróz
85
μl-ében
egyenletesen
felszuszpendáltunk,
majd
a
sejtszuszpenziót óvatosan, cseppenként adagolva egy tárgylemez felszínén egyenletes rétegben szétterítettük. A tárgylemez felületét előzőleg 1%-os normál lágyuláspontú agarózzal vontuk be. A gélréteg megszilárdulását követően a tárgylemezeket egy órára 4 ºC hőmérsékletű, frissen készített, enyhén lúgos kémhatású lízispufferbe merítettük (10 mM Tris-HCl pH 10,0; 2,5 M NaCl; 100 mM EDTA; 1% Triton X-100; 10 v/v% dimetil-szulfoxid), majd egy óra elteltével az erősen lúgos elektroforézis-pufferrel (1 mM EDTA, 300 mM NaOH) leöblítettük. Ezek után a lemezeket horizontális elektroforézis-kádba fektettük és annyi 4 ºC-os futtatópuffert töltöttünk rájuk, hogy a lemezeket kb. 0,25 cm rétegben ellepje. A DNS denaturálása céljából a futtatópufferbe merített lemezeket egy elsötétített helyiségben 20 percig állni hagytuk, majd a DNS-
46
fragmentumokat 20 percen át 1 V/cm térerősség mellett 300 mA áramerősséggel szétválasztottuk. Ezt egy renaturáló lépés követte: a kádból kiemelt lemezeket 5 percig 400 mM-os, pH 7,5-ös Tris-HCl oldatban semlegesítettük, majd az agarózrétegre cseppentett 60 μl etídium-bromiddal (20 μg/ml) megfestettük és fedőlemezzel borítottuk. A preparátumokat Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal, 400-szoros nagyítás mellett értékeltük. A gél közepéről 25 sejtet választottunk ki, s az üstökösre emlékeztető futási mintázatokon a „fej” illetve a „csóva” területét a Comet Single Cell Gel Electrophoresis Analysis Software Package (Kinetic Imaging Ltd., London, UK) program segítségével határoztuk meg. A DNS-károsodás mértékét a fej/csóva területarányok számtani középértékével jellemeztük.
4.8. dNTP-poolok mérése Az intracelluláris dezoxiribonukleozid-trifoszfát-poolokat Sherman és Fyfe [137] szintetikus oligonukleotid-templátokra kidolgozott módszerének általunk módosított változata alapján határoztuk meg. 5 x 106 limfocita PBS-sel mosott sejtcsapadékához 200 μl 65%-os metanolt mértünk s nagyon alapos felszuszpendálást követően a sejteket legalább egy éjszakán át –20 ºC-on tartva lizáltuk. A 15 percig 13500 g-vel történt centrifugálással elkülönített felülúszót vákuumcentrifugában beszárítottuk és a poolok méréséig –80 ºC-on tároltuk, majd a mérés előtt közvetlenül 200 mM HepesNaOH pH 7,4 és 20 mM magnézium-klorid tartalmú puffer 200 μl-ében oldottuk fel. A
Klenow-polimeráz
templátjául
az
alábbi
oligonukleotid-szekvenciák
szolgáltak: a dTTP méréséhez 5’-(TTA)6GGCGGTGGAGGCGG-3’; dCTP-re 5’(TTTG)5GGCGGTGGAGGCGG-3’; dGTP-re 5’-(TTTC)5GGCGGTGGAGGCGG-3’ és a dATP meghatározására 5’-(AAAT)5GGCGGTGGAGGCGG-3’. A felsorolt templátok
3’-végével
komplementer
közös
primer
szekvenciája:
5’-
CCGCCTCCACCGCC-3’. A polimeráz-reakció „templát-primereit” a közös primernek a négy különböző templáthoz történő hibridizálásával állítottuk elő úgy, hogy a primer és az adott templát ekvimoláris mennyiségeit 500 ml 70 ºC-os vízfürdőbe helyeztük és hagytuk fokozatosan szobahőmérsékletre hűlni. A meghatározás elve azon alapul, hogy a Klenow-fragment a szintetikus oligonukleotid-templát alapján kizárólag az adott templátnak megfelelő dNTP-t építi be
47
a reakcióelegyhez adott sejtkivonatból. Például a (TTTG)5 templáthoz az endogén dCTP-t építi be a szintetizálódó komplementer láncba, míg a „T” helyekre a nagy moláris feleslegben kívülről adott radioizotóp – jelen esetben 3H-dATP – kerül. Az inkorporált radioaktivitás mennyisége így szigorúan arányos az endogén dNTP mennyiségével, amely a polimeráz-reakció limitáló faktora is egyben. Amint az a templátok szekvenciáiból látható, a dATP-pool méréséhez 3H-dTTP-izotópra, a másik három pool meghatározásához pedig 3H-dATP-re van szükség. A polimeráz-reakcióhoz a Klenow-enzimet 3 U/μl koncentrációra hígítottuk az alábbi pufferrel: 42 mM Tris-HCl pH 7,45; 87 mM (NH4)2SO4; 8,5 mM βmerkaptoetanol; 847 μg/ml BSA és 50 v/v% glicerin. A radioizotópokat a megfelelő nem jelölt dATP-vel, illetve dTTP-vel ötszörösére hígítottuk. A poolokat az alábbi összetételű reakcióelegy 50 μl-ében mértük: 2,5 μM radioizotóp (3H-dATP a dGTP-, dCTP- és dTTP-méréshez; specifikus aktivitása 5,9 Ci/mmol, illetve 3H-dTTP a dATPpool meghatározásához; specifikus aktivitása: 12,2 Ci/mmol), 0,25 μM megfelelő templát-primer (a dGTP-templát kivételével, amelynek koncentrációját a magas háttér miatt 0,10 μM-ra csökkentettük), 0,3 U/μl Klenow-enzim és 25 μl Hepes-Mg-pufferben oldott meghatározandó nukleotid. A reakcióelegyeket 2 órán át 37 ºC-on inkubáltuk, majd a teljes reakciótérfogatot csirke-vörösvérsejt-DNS-sel bevont GF/C üvegszálas filterpapírra cseppentettük. Ezt követően a szűrőpapírokat 5%-os triklórecetsavban oldott 0,1 mólos Na4P2O7-ban 10 percig, majd 5%-os triklórecetsavban kétszer 10 percig, végül 96%-os etanolban újabb 2 x 10 percig mostuk 0 ºC-on, majd megszárítottuk
(nátrium-pirofoszfát
jelenlétében
a
nem
inkorporálódott
mononukleotidok nem kötődnek). A filterekre kötődött radioaktivitást a 4.2.5. alpontban részletezett módon, toluol/triton alapú szcintillációs méréssel határoztuk meg. Mérési standard gyanánt a hússzorosan kihígított radioizotópból cseppentettük a szűrőpapírra és mosás nélkül határoztuk meg az aktivitását. A sejtekből extrahált dNTP-ok mennyiségét az ismert koncentrációjú dNTP-ok hígítási sorozatából felvett kalibrációs görbe felhasználásával számítottuk, és a standard cpm/pmol hányados ismeretében pmol/106 sejt egységekben fejeztük ki.
48
4.9. Apoptózist vizsgáló eljárások 4.9.1. Kaszpáz-3-aktivitásmérés A 4.2.3. alpontban leírtak szerint aphidicolinnal, ill. CdA-val kezelt sejteket 2 mM EDTA-t, 1 mM DTT-t és 1% Triton-X-100-at tartalmazó PBS-ben vettük fel (200 μl lízis puffer/5 x 106 sejt), és fél órát inkubáltuk jégen, közben többször erőteljesen összeráztuk (vortex). A centrifugálással (13500 g, 15 perc, 4 ºC) elkülönített felülúszó 90 μl-éhez 5 μl 1 mg/ml koncentrációjú Ac-DEVD-pNA szubsztrátot adtunk és a fehérjekivonat kaszpáz-3-szerű aktivitását a lehasított para-nitroanilin extinkciójának 405 nm-en való követésével detektáltuk szobahőmérsékleten, a reakció lineáris időtartományában (0 – 15 perc). 4.9.2. Kromatin-fragmentáció kimutatása (DNS-létra) A nukleoszomális DNS-fragmentáció kimutatására a Hirt által kidolgozott módszert követtük, amely a kis molekulasúlyú extrakromoszomális és citoplazmatikus DNS-darabok szelektív kivonásán alapul [138]. 5 x 106 sejtet 350 μl lízispufferben vettünk fel (összetétele: 0,6% SDS és 0,1% EDTA pH 8,0), 10 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd 21 μl 5 mólos NaCl-ot adtunk hozzá és kíméletes összerázás után legalább 12 órán át 4 ºC-on állni hagytuk. Az így képződött csapadékot centrifugálással távolítottuk el (13500 g, 20 perc, 4 ºC). A felülúszót 1 mg/ml hőkezelt RNáz A-val 45 ºC-on 90 percig inkubáltuk, majd 200 μg/ml proteináz K-val kiegészítve ugyanazon hőmérsékleten további 120 percig kezeltük. A fenol/kloroform/izoamil-alkohollal (25:24:1) kivont és etanolos kicsapással tisztított DNS-t 60 μl vízben oldottuk, amelyből 20 μl-t 0,25%-nyi brómfenolkékkel színezett 40%-os szacharózoldat 4 μl-ével összekeverve 2%-os agarózgélre vittünk és kis molekulasúlyú DNS-markerrel együtt futtattunk Tris/acetát/EDTA-pufferben. A gélt 500 ng/ml koncentrációjú etídium-bromid-oldattal festettük.
49
4.10. RT-PCR Frissen preparált tonzilla-limfocitákból és SK-N-F1 humán neuroblasztómasejtekből a TRIzol módszerrel (Invitrogen) vontuk ki az RNS-t, majd 0,1 μg RNStemplátról MMLV reverz transzkriptázzal (Promega), random hexamer-primerek segítségével, a gyártó útmutatása alapján DNS-t szintetizáltunk. Az EGF-receptor cDNS-ének specifikus amplifikálására a következő primerpárt használtuk [139]: 5’GAGAGGAGAACTGCCAGAA-3’ és 5’-GTAGCATTTATGGAGAGTG-3’. A PCRreakciót az alábbi összetételű reakcióelegy 25 μl-ében végeztük: 10 mM Tris-HCl pH 9,0; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP; 25 – 25 pmol primer; 1,25 U HotStarTaq polimeráz (Qiagen) és 0,1 μg RNS-ből készített DNS-templát. A következő PCR-programot alkalmaztuk: 3 perces denaturálás 94 °C-on; 30 thermociklus: 1 perces denaturálás 94 °C-on – 30 mp-es anneálás 57 °C-on – 1,5 perces extenzió 72 °C-on; végül extenzió 72 °C-on, 7 percig [139]. A PCR-termékeket 2%-os agarózgélen megfuttattuk és 500 ng/ml koncentrációjú etídium-bromid-oldattal festettük.
50
5. EREDMÉNYEK 5.1. A dezoxicitidin-kináz aktiválódása citotoxikus nukleozidok hatására Munkacsoportunk néhány évvel ezelőtt azt az érdekes megfigyelést tette, hogy humán tonzilla-limfociták primer kultúráinak CdA-val történő néhány órás kezelése a sejtek DNS-szintézisének gátlásával párhuzamosan a dCK aktivitásának többszörös növekedéséhez vezet [140]. Az alábbiakban bemutatásra kerülő kísérletekben arra kerestünk választ, hogy ez a jelenség különböző eredetű normál és malignus sejtekben, sejtvonalakban, illetve más nukleozid-analógokkal történő kezelés hatására is bekövetkezik-e. 5.1.1. CdA hatása normál limfocita-szubpopulációk dCK-aktivitásáraI, II A humán szájpadmandulából nyerhető limfociták döntő többségükben nyugvó B-sejtek, azonban a germinális centrumokból származó nyiroksejtek mintegy 10 – 20 %-a különböző antigén-stimulusok hatására aktivált állapotban van, belép a sejtciklusba és fokozott DNS-szintézis jellemzi [134]. Felmerült a kérdés, hogy a kevert limfocitapopulációban észlelt dCK-stimuláció elsősorban a nyugvó, avagy az osztódó sejtekben történik-e.
Ennek
eldöntése
céljából
a
frissen
preparált
sejteket
albumin-
sűrűséggrádiensen történő centrifugálással túlnyomórészt G1-, illetve S-fázisú sejteket tartalmazó populációkra választottuk szét, kihasználva a nyugvó kis limfociták és az osztódó limfoblasztok közötti sűrűségkülönbséget. Az így elkülönített sejtek primer szuszpenzióit 1 μM CdA-val kezeltük 30 – 120 percen át, majd megmértük a nyerskivonatok dezoxicitidin-kináz- és timidin-kináz-aktivitását optimális körülmények között, telítési szubsztrátkoncentrációnál [56]. Az enzimaktivitásokat a tríciummal jelzett szubsztrátok nukleozid-foszfáttá történő átalakulásának sebességével jellemeztük és pmol termék /106 sejt /perc egységekben fejeztük ki. A sejtek életképességét a kétórás CdA-kezelés lényegében nem befolyásolta; tripánkék-festéssel az élő sejtek aránya a kontroll és a kezelt sejtekben egyaránt 90% felett volt. Amint azt az 7/A. és 7/C. ábra mutatja, az S-fázisú kezeletlen sejtek dCKaktivitása mintegy háromszorosa, TK-aktivitása pedig csaknem tízszerese volt a G-
51
fázisú, nem kezelt sejtekben mérhető enzimaktivitásnak. A G-fázisú sejtek 1 μM CdAval történt kétórás kezelésének hatására 2,5-szeresére fokozódott a nyerskivonat jelzett természetes szubsztráttal (3H-dC) mért dCK-aktivitása (7/A. ábra). Az S-fázisú frakció esetében a dCK maximális aktiválása már 60 perc elteltével bekövetkezett, de a 60%-os emelkedés jóval alatta maradt a G-fázisú sejtekben észlelt értéknek. Ugyanakkor a folyamat dinamikája is jelentősen eltért a nyugvó sejtekben tapasztaltaktól, hiszen míg ott közel lineárisan emelkedett az enzim aktiválódásának időgörbéje, osztódó sejtekben
dNMP, pmol/106 sejt/perc
a hatvanperces maximumot fokozatosan csökkenő értékek követték.
A
B
C
20
S
S 40 10
G
20
S
G 10
20
G 60
120
60
120
60
120 perc
7. ábra. 2-klór-2’-dezoxiadenozin- (CdA) kezelés hatása humán tonzilla-limfociták dCK- és TK-aktivitásáraI A sejteket albumin-grádiensen S-fázisú (─■─) és G-fázisú (─●─) frakciókra osztottuk, a jelzett ideig 1 μM CdA jelenlétében inkubáltuk, majd mostuk és végül nyerskivonatot készítettünk belőlük. A dCK aktivitását 3H-dC (A) és 3H-CdA (B) szubsztrátokkal mértük, a timidin-kináz-aktivitást pedig 3H-dT-nel határoztuk meg (C).
Amellett, hogy a dCK aktivitását jelentősen fokozza, a 2-klór-2’-dezoxiadenozin egyben az enzim kitűnő szubsztrátja is [102]. A kezeletlen sejtpopulációk nyerskivonatában 3H-CdA-val mért dCK-aktivitás lényegesen meghaladta a 3H-dCszubsztráttal kapott értékeket (7/B. ábra). Ez összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a dCK a purin-származékokat magasabb Vmax-értékkel foszforilálja [56]. Viszont a CdA-val történő kezelések során a 3H-CdA-foszforilációs kapacitás növekedése jóval alatta maradt a 3H-dC-szubsztráttal mért értéknek: G-fázisú sejtekben csak 60%-os emelkedést mutatott, míg az S-fázisú frakcióban egyáltalán nem fokozódott.
52
Fontosnak tartottuk annak tisztázását, hogy a CdA-kezelés során észlelt dCKaktivitás-fokozódás specifikus jelenség-e, vagy a többi nukleozid-mentő enzim aktivitásában is történnek bizonyos változások. A CdA-val különböző ideig kezelt sejtek kivonataiban 3H-dT-szubsztráttal mért timidin-foszforilációs kapacitás egyik sejtpopuláció esetében sem mutatott változásokat (7/C. ábra). Elképzelhető azonban, hogy a timidin foszforilációjáért felelős TK1-és TK2-enzimek aktivitása ellenkező irányban változik, ami a 3H-dT foszforilációjának mérése során rejtve maradt. Ezt az eshetőséget kizárandó, a TK-aktivitást 1 mM dC jelenlétében is megmértük. Irodalmi adatok szerint a TK2 a dC-t a dT-hez hasonló hatékonysággal foszforilálja [102], nagy feleslegben adott dezoxicitidinnel tehát a TK2
3
H-dT-foszforilációja erősen visszaszorítható [56].
Esetünkben a 3H-dT-foszforilációs kapacitás dC hozzáadására csupán 4 – 5%-kal csökkent mind a kontroll, mind pedig a kezelt sejtekben (az eredmények nincsenek ábrán bemutatva). Ez arra utal, hogy a tonzilla-limfociták timidin-foszforilációs kapacitásának döntő hányadát a TK1 adja, illetve a CdA-kezelés során a két timidinkináz aktivitása nem változik. A limfociták dC-foszforilációs kapacitásának emelkedését a dCK aktiválódásának tulajdonítottuk. A TK2 imént említett szubsztrát-specificitása ismeretében azonban nem lehet figyelmen kívül hagyni annak lehetőségét, hogy CdA-kezelés hatására a TK2 dCfoszforilációs kapacitása is emelkedik, habár kimutattuk, hogy az enzim dTfoszforilációs képessége nem változott. Ennek tisztázására a sejtkivonatok dCfoszforilációs kapacitását 1 mM dT jelenlétében is megmértük. Ilyen körülmények között a 3H-dC-szubsztrátot csak a dCK foszforilálja, mivel a TK2 elsősorban a nagy feleslegben adott timidint hasznosítja, a dCK viszont a dT foszforilációjára nem képes. Az eredmények azt mutatták, hogy dT jelenlétében a 3H-dC foszforilációja 2 – 3%-kal csökkent, és ez az érték CdA-kezelés során sem változott, tehát a dC-foszforilációs kapacitás megnövekedését egyértelműen a dCK aktivitásának fokozódása magyarázza. A TK2 aktiválódásának lehetőségét a később tárgyalásra kerülő összes kísérletben az itt leírtaknak megfelelően kizártuk, így ez a továbbiakban nem kerül említésre. Mivel a CdA foszforilációjára a dCK mellett a mitokondriális dezoxiguanozin-kináz is képes [83], azt is bizonyítanunk kellett, hogy a G-fázisú sejtek mérsékelten emelkedett 3
H-CdA-foszforilációs kapacitásának hátterében nem a dGK aktiválódása áll (7/B.
ábra). A kérdés eldöntésére az aktivitásmérést akkora feleslegben adott (1 mM) dezoxi-
53
citidin jelenlétében is elvégeztük, ami a limfociták dezoxicitidin-kinázát gyakorlatilag H-CdA-
foszforiláció a dGK számlájára írható. Amint az a 8. ábrán látható, a dGK a 3
H-CdA-össz-foszforiláció kb. 10%-
áért volt felelős, és enzimaktivitása a széles
koncentráció-tartományban
alkalmazott
kétórás
CdA-kezelés
hatására sem változott. Mivel metabolizáló kapcsolt
a
CdAMP, pmol/106 sejt /perc
3
telíti, így a megmaradó
dezoxicitidint
enzimek
szabályzásáról
is
dCK-enzimaktivitás-mérés képező reakciótermék, a Ahogy
azt
30
dCK
20
10
dGK
képet
az
0,01
0,1
1
10
μM CdA
tárgyát 3
H-dCMP irodalmi
áttekintésben részletesen tárgyaltuk, a 3
dCK + dGK
esetleges
akartunk kapni, nyomon követtük a
sorsát.
40
H-dCMP amellett, hogy trifoszfáttá
alakul, az 5’-nukleotidázok révén defoszforilálódhat, illetve a dCMPdezamináz dUMP-vé dezaminálhatja,
8. ábra. dCK- és dGK-enzimaktivitások változása CdA-kezelés hatására Tonzilla limfocitákat két órán át különböző koncentrációjú CdA-val kezeltünk, majd a sejtkivonat 3H-CdA-foszforilációs kapacitását dC nélkül (“dCK + dGK”), illetve 1 mM dC jelenlétében (“dGK”) is meghatároztuk. A két érték különbsége a dCK aktivitását adja (“dCK”).
majd a dUMP-t a timidilát-szintáz metilálja és timin-nukleotidokká alakítja át (9. ábra) [15]. Az utóbbi két eshetőség kísérleti rendszerünkben az össz-3H-dCMP-radioaktivitás csökkenéséhez vezet, hiszen a defoszforilált 3H-dC a DEAE-cellulóz-papírra nem kötődik, a timidilát szintézise során pedig az 5-ös helyzetű tríciumatom
TS 3HdUMP
víz formájában távozik. Másrészt
dTTP
dCMP-DA 3HdCMP
5’-NT
dCTP
RR
dCK
3HdC
54
9. ábra. A dezoxicitidin-salvage és a dezoxipirimidinek átalakulásának vázlataII A dCK aktivitását potenciálisan módosító enzimeket árnyékolt háttér jelöli. 5’-NT, 5’-nukleotidáz; dCMPDA, dCMP-dezamináz; TS, timidilátszintáz; RR, ribonukleotid-reduktáz.
annak ismeretében, hogy a kívülről adott 3H-dC 75%-a timidilát-szintézisre fordítódik [15], az is elképzelhető, hogy a szoros funkcionális kapcsoltságban működő dCK – dCMP-dezamináz – timidilát-szintáz enzimrendszer szabályozása is össze van hangolva oly módon, hogy a dCK aktiválódásával együtt a másik két enzim aktivitása is megemelkedik. A felmerült kérdések tisztázása érdekében kontroll és CdA-val kezelt tonzilla-limfociták kivonatában dCMP-dezamináz- és 5’-nukleotidáz-aktivitásokat mértünk 14C-dCMP és 14C-dIMP szubsztrátok felhasználásával. A mérési eredményeket a 3. táblázat foglalja össze. Az adatokból kiderül, hogy a felsorolt enzimek aktivitása 1 μM CdA hatására csak kis mértékben változott, míg a dCK aktivitásában 2,5-szeres növekedés következett be. (Hasonló eredményeket kaptunk a dCK egy másik aktivátorával, a későbbiekben tárgyalásra kerülő aphidicolinnal (APC) is). Ugyanakkor az is nyilvánvaló, hogy a dCMP-dezamináz és az 5’-nukleotidázok aktivitása még a stimulált dCK aktivitását is jóval meghaladta, tehát a dC → dT átalakulás sebességmeghatározó enzime a dezoxicitidin-kináz, amelynek aktiválódása a két másik enzim alapaktivitása mellett is a timin-nukleotidok intenzívebb képződéséhez vezethet. 6
enzimaktivitás (pmol reakciótermék/10 sejt /perc) dCK
dCMP-dezamináz
5’-nukleotidáz
5’-nukleotidáz
(ATP-független)
(ATP-vel stimulált)
8,0 ± 0,1
232 ± 8
30,9 ± 1,2
137 ± 9
CdA
19,7 ± 0,7
282 ± 12
26,8 ± 0,1
127 ± 5
APC
18,0 ± 0,1
241 ± 15
23,9 ± 0,9
119± 9
kontroll
3. táblázat. CdA- és aphidicolin-kezelés hatása tonzilla-limfociták dCK, dCMPdezamináz és 5’-nukleotidáz aktivitásairaII A sejteket 3 μM CdA-val, illetve 2 μg/ml aphidicolinnal (APC) kezeltük 2 órán át. A felsorolt enzimek aktivitását a nyerskivonatból 3 H-dC, 14C-dCMP és 14C-IMP szubsztrátokkal mértük. Az ATP-vel stimulált 5’-nukleotidázaktivitást a reakcióelegyhez adott 5 mM ATP jelenlétében határoztuk meg.
Az
elmondottak
összefoglalásaként
leszögezhetjük,
hogy
a
limfociták
emelkedett dC-foszforilációs kapacitása egyértelműen a dCK-aktivitás növekedésének tulajdonítható, tehát a továbbiakban a nyerskivonatok 3H-dC-foszforilációs kapacitását a dCK-aktivitás jellemzőjeként fogom kezelni.
55
A 7. ábrán bemutatott eredmények azt sugallják, hogy a nyugvó sejtek dezoxicitidin-kináza
nagyobb
mértékben
stimulálható.
További
összehasonlító
vizsgálatokra egészséges csecsemő timuszból (túlnyomórészt T-limfoblasztok) és egészséges felnőtt perifériás vérből (nyugvó sejtek, 70%-a T-limfocita), illetve fiatal timuszból
és enzimaktivitás a kontroll %-ában
egér
egérlépből (kevert sejtpopuláció) izolált limfociták
primer
kultúráit
használtuk. A 10. ábra oszlopai a kétórás CdAkezelést követően mért dCK-aktivitásokat
a
300 200
100
to
S
fel.
A
legnagyobb
mértékű, közel 300%-os aktivitás-emelkedést perifériás
vérlimfociták-
ban és tonzilla-limfociták G-fázisú frakciójában tapasztaltuk, míg a
th
vér
th
humán
megfelelő kontroll aktivitás %-ában tüntetik
G
lép egér
10. ábra. CdA hatása különböző eredetű limfociták dCKaktivitásáraII A kísérlethez használt- mononukleáris sejteket egér timuszból (“th”) és egér lépből (“lép”) (világos oszlopok), valamint emberi timuszból (“th”), perifériás vérből (“vér”) és tonzillából (“to”) preparáltuk. Az utóbbi kevert sejtpopulációt albumin grádiensen S-fázisú (“S”) illetve G-fázisú (“G”) sejtekben dúsított frakciókra választottuk szét (sötét oszlopok). A felsorolt sejtek primer kultúráit 3 μM CdA jelenlétében 2 órán át 37 ºC-on inkubáltuk. A sejtmentes kivonatokban mért dCK aktivitásokat a megfelelő kétórás kontroll aktivitások százalékában ábrázoltuk.
timuszsejtek – a tonzilla S-fázisú populációjához hasonlóan – szerényebb mértékű, mintegy másfélszeres dCK-aktivitás-fokozódással reagáltak a CdA-stimulusra. Az egérlép-limfociták
válasza
szinte
teljesen
megegyezett
a
kevert
tonzilla-
sejtpopulációban észlelt közepes léptékű aktiválódással. A felsorolt adatok megerősítik azt a feltételezést, hogy a normál limfocitákban kiváltható dCK-aktiválódás mértéke és a sejtek osztódási rátája között fordított arányosság állhat fenn. Továbbá az is nyilvánvaló, hogy a dCK aktiválódása nem sejt- és fajspecifikus (patkány lép- és timusz-eredetű limfociták CdA-kezelésével az egérből származó sejteken észlelt enzimaktiválódáshoz nagyon hasonló eredményeket kaptunk), hanem sokkal inkább egy sejtciklus-függő jelenség.
56
5.1.2. Normál és transzformált sejtpopulációk összehasonlítása a dCK aktiválódásának szempontjábólI Több munkacsoport is összefüggést talált a transzformált sejtekben mérhető dCK-aktivitás és a sejtek kemoterápiás érzékenysége között [31-35; 66-70]. Ennek fényében különös gyakorlati jelentőséget nyerhet a dezoxicitidin-kináz nukleozidanalógokkal kiváltható stimulációja, hiszen ezáltal a kemoterápia hatásfoka jelentősen javítható, a szervezetbe juttatott dózis csökkentésével pedig a nemkívánatos mellékhatások kockázata is mérsékelhető. In vitro végzett kísérleteinkben három különböző leukémiás sejtvonallal, a humán T-limfoblasztoid CCRF-CEM-, a promielocita eredetű HL60- és a krónikus mieloid leukémiából származó K562-sejtvonal exponenciálisan osztódó sejtjeivel, valamint egészséges és krónikus limfoid leukémiában szenvedő donorok perifériás mononukleáris sejtjeivel (PBMC, illetve CLL-PBMC) dolgoztunk. A sejtszuszpenziókat különböző CdA-koncentrációk mellett két órán át inkubáltuk, majd meghatároztuk a nyerskivonatok enzimaktivitását. Mindhárom sejtvonal 106 sejtre vonatkoztatott dCKalapaktivitása jóval magasabb volt a vérlimfocitákat (különösen a normál sejteket) jellemző értéknél (11. ábra). A normál és a leukémiás vérlimfociták dCK-aktivitása 40
A
10
30
(CCRF-CEM)
dCMP, pmol/ 106 sejt /perc (PBMC, CLL-PBMC)
15
CCRF-CEM CLL-PBMC 20
5
PBMC
0,01
0,1
1
10
μM CdA
B HL60
20
K 562 10
0,01
0,1
1
10
μM CdA
11. ábra. CdA hatása vérlimfociták és különböző leukémiás sejtvonalak dCKaktivitásáraI A sejteket szérummentes RPMI-tápfolyadékban két órán át kezeltük a CdA feltüntetett koncentrációival, majd a sejtkivonatokból 3H-dC-szubsztráttal dCK-aktivitást mértünk. (A): normál (PBMC, ─■─) és leukémiás (CLL-PBMC, ─▲─) vérlimfociták (bal ordináta), illetve CCRF-CEM-sejtek (···Δ···) (jobb ordináta) enzimaktivitása; (B): a HL60 (─▲─) és K562 (─□─) mieloid sejtvonalakban mért aktivitások.
57
dózisfüggő módon a kezeletlen érték 3 – 4-szeresére emelkedett. A maximális aktiválás már az analóg 1 μM-os koncentrációjánál bekövetkezett (11/A. ábra). A CCRF-CEMsejtekben viszont más tendencia érvényesült: CdA hatására a sejtek kiugróan magas dCK-alapaktivitása fokozatosan csökkent, 10 μM-nál már csak a kiindulási érték 2/3-át mértük. A HL60-sejtek viszont kifejezett enzimaktivitás-emelkedéssel reagáltak, 0,3 μM-nál közel négyszeres fokozódást észleltünk. A K562-sejtek enzimaktivitása csak minimálisan növekedett a kezelés hatására (11/B. ábra). Az eredményekből az valószínűsíthető, hogy a normál sejtek dezoxicitidin-kinázának aktiválódásához vezető mechanizmusok a leukémiás sejtvonalakban többé-kevésbé károsodtak és működésük megváltozott. A dCK aktiválhatósága tekintetében a vizsgált sejttípusok „reagáló” és „nem reagáló” csoportokba sorolhatók. A CdA-val aktiválható HL60-sejtekkel, valamint CLL-limfocitákkal felvettük a jét is (12. ábra). Amíg a limfoid
leukémiás
sejtek
dCK-aktivitásának maximális stimulálásához 1 – 3 μMos CdA-kezelés esetén 90 – 120 percre volt szükség, addig
a
HL60-sejtek
dCMP, pmol /106 sejt /perc
dCK-aktiválódás időgörbé15
HL 60 0,3 μM CdA 3 μM CdA 0,03 μM CdA
10
CLL-PBMC 1 μM CdA
esetében ezt már az alacsony dózisú
(0,3
μM)
CdA-
5
kezelés is 30 perc alatt kiváltotta. 3 μM CdA-val végzett, 90 percet meghaladó időtartamú kezelés már az
enzimaktivitás
csökkenését eredményezte. A CLL-PBMC- és HL60sejtek dCK-aktivitása tehát CdA-val stimulálható.
nagyon
60
enyhe
jól
120
180 perc
12. ábra. A CdA dCK-aktiváló hatásának idő- és koncentráció-függése HL60 - sejteken és leukémiás vér limfocitákonI CLL-PBMC- sejteket (··· ···, 1 μM CdA) és HL60-sejteket (—Δ—, 0,03 μM CdA; —z—, 0,3 μM CdA; — —, 3 μM CdA) a megadott paraméterek szerint kezeltünk és kivonataikból dCK-aktivitást mértünk.
58
5.1.3. Egyéb purin-analógok hatása a dCK aktivitásáraI A 13. ábrán bemutatott eredmények arra utalnak, hogy HL60-sejtekben a dCK a CdA-n kívül egyéb purin-analógokkal is aktiválható. A fludarabin (FaraA) a CdA-hoz hasonlóan a limfoid leukémiák hatékony gyógyszere [97, 141], a clofarabin (CAFdA) pedig egy új, ígéretes kemoterápiás szer, amelyben mind a CdA-ra, mint a FaraA-ra jellemző funkciós csoportok megtalálhatók [98, 99, 141]. Az enzimaktivitás maximális fokozásához CdA-ból 0,5 μM (11. ábra), CAFdA-ból 0,5 – 1 μM, FaraA-ból pedig 10 arányban állnak a dezoxicitidinkinázhoz
való
viszonylagos
affinitásukkal [141], ami arra utal,
hogy
enzimaktivitást
növelő hatásuk előfeltétele a dCK révén történő 5’-foszfo-
dCM, pmol/106 sejt /perc
μM koncentrációra volt szükség (13. ábra). Az analógok itt felsorolt mennyiségei 25
CAFdA FaraA
20
15
rilációjuk. Ez a megfigyelés azzal a ténnyel is összhangban
10 0,01
0,1
1
10
μΜ
van, hogy a dCK maximális aktivációja csak bizonyos idő elteltével következik be, ami a különböző sejtek és analógok
13. ábra. dCK-aktivitások arabinozil-nukleozidanalógokkal kezelt HL60-sejtek extraktumaibanI A sejteket két órán át kezeltük a CAFdA (——) és az FaraA (——) feltüntetett koncentrációival. A dCK aktivitását 3H-dC-nel mértük.
esetében más és más érték. 5.1.4. Dezoxipurin-
és
dezoxipirimidin-, illetve ribopurin-analógok össze-
hasonlító vizsgálataI A következőkben néhány pirimidin-analóg (araC, 5-aza-araC (AaraC) és 5-azadC (AdC)) dCK-aktiváló képességét vizsgáltuk tonzilla-limfocitákon (14/A. ábra). A dezoxicitidin-kináz mindhárom vegyületet hatékonyan foszforilálja [66, 102]. Az akut mieloid leukémia jól bevált gyógyszere, az araC, 10 μM-os koncentrációban közel kétszeresére emelte a kináz aktivitását, míg az AaraC megegyező koncentrációja csak másfélszeresére. Az AML alternatív gyógyszereként számontartott 5-aza-dC az enzim-
59
dCMP, pmol/106 sejt /perc
6
15
A
4
10
2
5
K
CAFdA araC araC 3 μM 1 μM 10 μM
AdC AdC AaraC AaraC 1μM 10 μM 1 μM 10 μM
B
K
CdA CrA CrA CrA 3 μM 3 μM 10 μM 100 μM
14. ábra. Különböző nukleozid-analógok humán tonzilla-limfociták dCK-aktivitására gyakorolt hatásának összehasonlításaI A frissen izolált sejteket két órán át az oszlopdiagramon feltüntetett szerek megfelelő koncentrációi mellett, illetve azok nélkül („K”) inkubáltuk. (A): a CAFdA és különböző citidin-analógok, (B): a CdA és a CrA hatékonyságának összehasonlítása. A feltüntetett adatok három független mérés eredményei.
aktivitást nem növelte, sőt nagyobb koncentrációban kismértékű gátlást tapasztaltunk. A 14/A. és 14/B. ábrákon a HL60-sejtek hatékony aktivátorának bizonyult CAFdA és CdA hatását is feltüntettem. A dezoxiadenozin-analógok által kiváltott dCK-aktiválódás messze meghaladta a pirimidin-származékokkal kapott mértéket. Ez a tény arra utal, hogy a dezoxicitidin-kináz szubsztrátjai közül a dezoxiadenozin-származékok kitüntetett szerepet játszhatnak az enzim aktiválódásának folyamatában. Az előbbiekben említett analógokkal ellentétben a 2-klór-riboadenozint (CrA) nem a dCK, hanem az adenozin-kináz foszforilálja [142], és a ribonukleotid-poolba kerül. A 14/B. ábrán megfigyelhető, hogy a 3 μM koncentrációban adott CrA a dCK működését nem befolyásolta, ugyanakkor a dezoxiszármazék CdA markáns aktivitásfokozódást eredményezett. Ez a szembetűnő különbség a dezoxinukleozid-származékok enzimaktiválásban
betöltött
szerepét
hangsúlyozza.
Ugyanakkor
a
CrA
nagyságrendekkel magasabb koncentrációi kismértékben stimulálni tudták a dCK-t, ami
60
azzal magyarázható, hogy a CrA-nukleotidok kis hányada CdATP-vé képes alakulni a ribonukleotid-reduktáz- és nukleozid-difoszfát-kináz-enzimek közreműködésével. 5.1.5. A dFdC (gemcitabin) hatása tonzilla-limfociták nukleotid-anyagcseréjéreIII A CdA dCK-ra gyakorolt aktiváló hatásának pontos mechanizmusát nem ismerjük, azonban feltételezhető, hogy a jelenség kiváltásában szerepet játszik a CdA erőteljes DNS-szintézist gátló [85, 140, 143], ribonukleotid-reduktázt gátló [85] és dCMP-dezaminázt gátló tulajdonsága [143]. A purin- és pirimidin-analógok dCKaktiváló hatásában talált különbségekre magyarázatot keresve összehasonlítottuk az enzim két szubsztrátjának, a CdA-nak és a 2’, 2’-difluoro-dezoxicitidinnek (dFdC) a
A
a kontroll inkorporáció%-ában
dNMP; pmol /106 sejt /perc
DNS-szintézisre, valamint a dCK aktivitására gyakorolt hatását (15. ábra). dCK
1
TK1
0,5
0,1
0,5
1
5
10
µM
B 100
3H-dC 3H-dT
50
0,1
0,5
1
5
10 µM
15. ábra. dFdC-kezelés hatása a dCK és a TK1 aktivitására, valamint a 3H-dT és 3H-dC DNS-inkorporációjára tonzilla-limfocitákbanIII (A): Különböző koncentrációjú, kétórás dFdC-kezelések után a limfociták nyerskivonataiban mért dCK- és TK1-enzimaktivitások. (B): A sejteket egy órán keresztül 3H-dC-nel (─Χ─), illetve 3H-dT-nel (─●─) jelöltük a dFdC növekvő koncentrációinak jelenlétében. A sejtek alkoholos feltárása után megmértük a DNS-frakcióba beépült radioizotópok mennyiségét, amelyet a kezeletlen kontroll DNSinkorporációjának százalékában fejeztünk ki.
A dezoxicitidin- és timidin-mentő folyamatok, valamint a DNS-szintézis jellemzésére a radioaktív nyomjelzés módszerét alkalmaztuk. Tonzilla-limfocitákat dFdC jelenlétében 3H-dC-nel és 3H-dT-nel jelöltünk, majd a sejtek alkoholos feltárását
61
követően megmértük a nukleotid-poolok radioaktivitását, illetve a nukleinsav-frakció jelöltségét. Ezzel párhuzamosan meghatároztuk a gemcitabin dCK-t aktiváló hatásának koncentrációfüggését. A 15/A. ábráról leolvasható, hogy a dFdC kevésbé – mintegy 60%-kal – emelte a dCK aktivitását, mint korábban bemutatott kísérleteinkben a CdA, azaz az araC-hez és az AaraC-hez hasonlóan viselkedett. Ugyanakkor a maximális stimulálás már 1 μM-nál bekövetkezett, a tízszeres koncentrációnak nem volt további aktiváló hatása. A citoplazmában található másik nukleozid-mentő enzim, a TK1 aktivitása viszont ebben az esetben sem változott. A dFdC a DNS-be történő 3H-dT-inkorporációt erőteljesen (Ki ~ 0,16 μM), a 3HdC beépülését kevésbé hatékonyan (Ki ~ 0,4 μM) gátolta (15/B. ábra). A dTTP-pool jelöltsége ugyanakkor hatszorosára, míg a dCTP-pool jelöltsége csupán 1,5 – 1,7szeresére emelkedett (ezek az adatok nincsenek ábrával illusztrálva). Ezek az eredmények lényegében megegyeznek a CdA-val végzett hasonló kísérletekből nyert adatokkal [143]. Kísérleteink során tehát nem találtunk olyan számottevő eltérést a dCK által foszforilált purin- és pirimidin-analógok celluláris hatásmechanizmusa között, ami a dCK aktiválásakor tapasztalt jelentős különbséget megnyugtatóan magyarázhatná. 5.1.6. A dezoxicitidin-kináz in vivo aktiválása gemcitabinnal A gemcitabin volt az első gyógyszer, amelyet előrehaladott hasnyálmirigyrák kezelésére engedélyeztek, mert a túlélési időt szignifikánsan meghosszabbítja. A budapesti Szent László Kórház Onkológiai Osztályával együttműködve megvizsgáltuk, hogy a lokálisan előrehaladott és távoli metasztázisokat adó pancreastumorban szenvedő és gemcitabinnal kezelt betegek perifériás vérlimfocitáinak (PBMC) dezoxicitidin-kináz-aktivitása fokozódik-e a kemoterápia során. A betegek 15 alkalommal, hetente egyszer, parenterálisan kapták a gemcitabint (1000 mg/m2 30 perc alatt), amit 4 óra elteltével 600 mg/m2 dózisú 5-fluorouracil-infúzió egészített ki. A gemcitabin beadását követően 2, illetve 20 óra elteltével vett vérmintákból limfocitákat preparáltunk, majd azok dCK- és TK1-aktivitásait mértük.
62
A 16. ábrán 11 különböző betegből mért aktivitás-értékek átlagai láthatók. Figyelemreméltó, hogy a dCK-aktivitás fokozódása gyakorlatilag megegyezik a tonzilla-limfociták kétórás in vitro gemcitabin-kezelése nyomán tapasztalt kb. 60%-os effektus
szérumot
tartalmazó
környezetben is kiváltható. A dCK aktivitásának szelektív emelkedése még
20
óra
elteltével
is
megfigyelhető volt, ám csökkent mértékben (16. ábra). Érdekes módon az utolsó kezelési ciklus során (15. hét) hasonló enzimaktiválódást már nem tapasztal-
Enzimaktivitás a kontroll %-ában
növekedéssel (15. ábra), tehát az
dCK dTK1
100 %
tunk, ami rezisztencia kialakulá-
0h
sára utalhat.
2h 20h
16. ábra. A dezoxicitidin-kináz aktiválódása gemcitabinnal kezelt betegek vérlimfocitáiban A gemcitabin-infúzió beadását követően 2 és 20 órával levett vérmintákból dCK- és TK1-aktivitásokat mértünk. Az ábra 11 különböző betegből meghatározott aktivitások átlagát és az értékek szórását mutatja. Alapaktivitások (100%): dCK: 20,54 pmol dCMP/perc/mg fehérje; TK1: 5,20 pmol dTMP/perc/mg fehérje.
63
Felmerült a kérdés, hogy
a
nukleozid-analóg
szubsztrátokon túl a dCK által foszforilált természetes nukleozidok befolyásolhatják-e az enzim aktivitását. Tonzilla-limfociták dezoxicitidin-kezelése
érdekes
módon az enzimaktivitás csökkenéséhez vezetett; a
dCMP, pmol/106 sejt /perc
5.1.7. A dCK természetes szubsztrátjainak hatása az enzim aktivitásáraI, II
15
10 dC
5 0,01
0,1
1
10
μΜ
17. ábra. Dezoxicitidin hatása a dCK aktivitásáraI 18. Tonzilla-limfocitákat a feltüntetett mennyiségű dC-nel kezeltünk, majd megmértük a sejtkivonatok dCK-aktivitását.
sejtekhez adott 10 μM dC már 50%-kal csökkentette a dCK aktivitását (17. ábra). Az irodalomból jól ismert a dezoxiadenozin toxikus hatása. Az adenozindezamináz (ADA) hiánya következtében fellépő súlyos immunhiányért a felhalmozódó dezoxiadenozint és dATP-t teszik felelőssé [144]. A CdA a dezoxiadenozin ADArezisztens származéka, amely limfocitákban az ADA-hiányhoz erősen hasonló sejtkárosodást okoz [87]. Kézenfekvő volt megvizsgálni, hogy a limfocitákhoz adott dA önmagában aktiválhatja-e a dCK-t, vagy ehhez az ADA-t bénító 2’-dezoxicoformycin (dCF) [145] jelenléte is szükséges, azaz a CdA hatása felbontható-e az ADA-gátlás és a dezoxiadenozin-felhalmozódás komponensekre. Tonzilla-limfocitákat 0 – 100 μM dezoxiadenozinnal és dCF-nel kezeltünk külön-külön, illetve kombinációban, amikor is a sejteket konstans mennyiségű (10 μM) dCF és növekvő koncentrációjú dezoxiadenozin hatásának tettük ki. Amint a 18/A. ábrán látható, egyik szer sem fokozta az enzimaktivitást, amennyiben önállóan adtuk, a kettős kezelés azonban dózisfüggő enzimaktiválódást eredményezett, amely 10 μM dezoxiadenozin-koncentrációnál érte el maximumát. Fontos megjegyezni, hogy a 10 μM dA – 10 μM dCF kombináció hatása összemérhető volt a 3 μM CdA-val kiváltható enzimaktiválódással (utóbbi oszlopdiagramként ábrázolva). A maximális dCK-aktiválódás tehát látszólag kevesebb CdA-val is elérhető volt, azonban a jelzett koncentrációk (3 és 10 μM) nagyságrendileg megegyeztek, és figyelembe kell venni, hogy sejtbe történő felvételük paraméterei
64
különbözhetnek [21], ami a hatásos metabolit sejten belüli koncentrációját nagyban befolyásolhatta. Az
eredmények
tükrében
A
illetve a dA a dezoxicitidinkináz egyformán hatásos aktivátorai abban az esetben, ha a dezoxiadenozin inaktiválódását az
ADA
farmakológiai
dCMP, pmol /106 sejt /perc
leszögezhetjük, hogy a CdA
11 9
CdA
7 5
A referenciaként használt TK1 dTMP, pmol /106 sejt /perc
aktivitását a felsorolt kezelések ábra).
dA + dCF dCF dA
3
gátlásával megakadályozzuk.
egyike sem befolyásolta (18/B.
dCK
0
0,3
B
TK1
1
3
10
30
100 μM
5 CdA
4 3
18. ábra. A dCK aktiválódása 2 dezoxiadenozin és dezoxicoformycin kombinált kezelés hatá1 sáraII Tonzilla - limfociták pár0 0,3 1 3 10 30 100 μ M huzamos kultúráit 2 órán át dezoxiadenozinnal (dA, szaggatott vonal) ill. dezoxicoformycinnel (dCF, pontozott vonal), valamint a két szer kombinációjával (dA + dCF, folyamatos vonal, a dCF koncentrációja 10 μM volt) kezeltük, majd meghatároztuk a nyerskivonatok dCK- (A) és TK1- (B) aktivitásait. A sötétített oszlopok a 3 μM CdA-val kezelt sejtek enzimaktivitásait tükrözik. A feltüntetett adatok három – három párhuzamos meghatározás átlagait jelentik.
5.1.8. A dCK aktivitásának emelése nem-metabolizálódó nukleozid-monofoszfátanalógokkal és a dezoxicitidin felfüggesztő hatásaIV Az eddigiekben vizsgált nukleozidok mindegyike a dCK szubsztrátja volt. A továbbiakban arra kerestük a választ, hogy az enzim által nem foszforilálható nukleotidanalógok képesek-e stimulálni a dCK-t. Ennek eszközéül különböző nukleozid-5’tioszulfát-analógokat választottunk [133], amelyek szabad 5’-hidroxil foszfátakceptorcsoporttal nem rendelkeznek. Ezek a vegyületek a megfelelő nukleozid-5’monofoszfátok analógjainak tekinthetők [146, 147].
65
primer
sejtkultúráit 2 órán át a 19. ábrán féle
feltüntetett
hat-
nukleozid-5’-tioszulfát-
analóg
(dezoxiadenozin-,
dezoxicitidin-, ribouridin-,
ribopurin-,
3’-azidotimidin-
és dezoxitimidin-5’-TS) 0,1
dCK aktivitás (a kontroll %-ában)
Tonzilla-limfociták
250 100 µM 1 mM
200 150 100 50
dA-5’-TS
rPu-5’-TS
dC-5’-TS Urd-5’-TS
azidoT5’-TS
dT-5’-TS
és 1 mM-os koncentrációival kezeltük és a nyerskivonatokból a szokásos módon dCKaktivitást mértünk. A hat analóg
közül
egyedül
timidinszármazék
a
befolyá-
19. ábra. Különböző nukleozid-5’-tioszulfátok hatása 20. tonzilla -- limfociták dCK-aktivitásáraIV Primer sejtkultúrákat két órán át inkubáltunk a feltüntetett analógokkal (világos oszlopok: 100 μM; sötét oszlopok: 1 mM), majd meghatároztuk a sejtkivonatok dCKaktivitásait. A közölt adatok a kontroll aktivitás (5,2 pmol/ 106 sejt/ perc) százalékában értendők.
solta számottevően a dCK aktivitását (40%-os növekedés 0,1 mM-nál és 100% 1 mM koncentrációban). A TK-izoenzimek aktivitásai egyik esetben sem változtak (19. ábra). A dT-5’-TS mM-os koncentrációi nagyságrendekkel meghaladták az előbbiekben tárgyalt nukleozid-analógokból szükséges mennyiségeket, ami ugyancsak arra utal, hogy a dT-5’-TS az eddigiektől eltérő (vagy közvetett) mechanizmussal aktiválja az enzimet. Figyelemreméltó továbbá a hatás specificitása, hiszen a dCK által foszforilált dA- és dC-szubsztrátok tioszulfát-analógjai egyáltalán nem aktiválták az enzimet (19. ábra). A sejtkivonathoz közvetlenül adott dT-5’-TS-tal az enzim aktiválódását nem lehetett előidézni (az adatok nincsenek ábrán bemutatva), és a TK-aktivitás sem változott. Ezt a kísérletet CdA-val és araC-vel megismételve hasonló eredményt kaptunk, ami arra utal, hogy a sejtek integritása és a membrán épsége a dCK aktiválódásának sine qua non előfeltétele. Ha viszont az inkubációs elegybe az analógon kívül még 100 μM dezoxicitidint is juttattunk, akkor az aktiválás teljesen elmaradt. A dezoxicitidin markáns felfüggesztő hatása CdA-val és araC-vel inkubált tonzilla-limfocitákon ugyanígy érvényesült. Ugyancsak tonzillasejteken ellenőriztük, hogy a dT-5’-TS-hoz szerkezetileg leginkább hasonlító természetes nukleozid, a dezoxitimidin képes-e felfüggeszteni a tioszulfátanalóg hatását.
A 20. ábra adataiból kiderül, hogy a dezoxitimidinnek nem volt
66
felfüggesztő hatása, míg a dezoxicitidin a dT-5’-TS jelenlétében éppúgy felére redukálta
dCMP, pmol /106 sejt /perc
a dezoxicitidin-kináz aktivitását, mint önmagában alkalmazva (20. ábra).
20 dCK
16
TK
12 8 4
dT-5’-TS 100 µM dT-5’-TS 1 mM dT 100 µM dC 100 µM
-
+ -
+ -
+ -
+ + -
+ + -
+
+ +
+ +
-
+ -
+ -
+ -
+ + -
+ + -
+
+ +
+ +
20. ábra. Dezoxicitidin és dezoxitimidin hatása a dT-5’-TS-tal kezelt sejtek dCKaktivitásáraIV Tonzilla-limfociták primer kultúráit a tioszulfát-analóg és a természetes pirimidin-nukleotidok feltüntetett kombinációival 120 percig inkubáltuk, majd meghatároztuk a sejtkivonatok dCK- és TK-aktivitásait.
Ugyanakkor a dT-5’-TS-kezelés a természetes nukleozidok jelenlététől függetlenül a sejtek TK1-aktivitásának enyhe csökkenését okozta. A dC felfüggesztő hatását elemezve kimutattuk, hogy a dezoxicitidin-kináz dT-5’-TStal kiváltott aktiválódásának kivédésére már 10 μM dezoxicitidin is elegendő volt, míg 1 μM koncentrációban részleges felfüggesztést tapasztaltunk (nincsen ábrán bemutatva). Hogy a dT-5’-TS dCK-aktivitást emelő hatásmechanizmusának megértéséhez közelebb jussunk, a nem aktiváló uridin-tioszulfáttal való összehasonlításban megvizsgáltuk a két analóg nukleozid-mentő reakcióutakra gyakorolt hatásait. Limfocita kultúrákat 0 – 180 perces tioszulfát-analóg-kezelésnek vetettünk alá, majd 20 perces 3H-dCvagy 3H-dT-pulzusjelölést alkalmaztunk (21. és 22. ábra). A „felvétel” frakció („A”) a jelzett nukleozid-, nukleotid- és liponukleotid-pool összességét reprezentálja, míg a „foszforiláció” („B”) a nukleozid-mono-, di- és trifoszfátok mennyiségét jelzi. Amint a 21. ábráról leolvasható, a dT-5’-TS a 3H-dC-nel jelölt „felvétel” poolt és a nukleotidok mennyiségét 60 – 100%-kal növelte, míg a radioizotóp DNS-inkorporációját – inkubációs időtől függően – 50 - 70%-kal visszaszorította. A mentő reakcióutak ilyetén
67
való eltolódása a CdA- és dFdC-kezelések kapcsán is megfigyelhető volt. A jelzett timidin metabolizmusában viszont merőben más változásokat észleltünk (22. ábra). 2
0,10
A
1,5
A
0,06
– d T / 106 s e j t
0,5
1
B
2
0,02
0,08
B
0,04
3H
0,5
pmol
p m o l 3H - d C / 106 s e j t
1
C
4
1,5
3
1
1
C
2
0,5
60
60
120
180 perc
120
180 perc
22. ábra. dT-5’-TS és Urd-5’-TS 25. hatásai tonzilla-limfociták 3H-dTmetabolizmusáraIVIV A kísérlet kivite21. lezése és az ábrázolás módja a 24. ábráéval megegyező, azonban 3H-dC helyett 1 μCi/ml 3H-dT-izotópot használtunk. A (C) ordináta beosztása eltérő.
21. ábra. dT-5’-TS és Urd-5’-TS hatásai tonzilla-limfociták 3H-dC-metabolizmusáraIV A sejteket 1 mM timidin-tioszulfát (---□---) ill. 1 mM uridin-tioszulfát (···Δ···) jelenlétében, vagy azok nélkül (—○—) 60, 120 illetve 180 percig inkubáltuk, majd 1,0 μCi/ml 3H-dC-nel 20 perces pulzusjelölést végeztünk. A sejtek alkoholos feltárását követően meghatároztuk az etanololdékony (A) és a DEAE-cellulózhoz kötött (B), valamint az etanolban nem oldódó (C) sejtfrakció radioaktivitását.
A timidin-5’-tioszulfát valamennyi timidin-pool jelzését drasztikusan csökkentette. Különösen szembeötlő a különbség, ha a 3H-dC és a 3H-dT felvételét és foszforilációját hasonlítjuk össze, de a timin-nukleotidok DNS-inkorporációjának gátlása is jóval kifejezettebb volt, mint a citozin-dezoxinukleotidoké (a kontrollhoz képest kevesebb, mint 10% épült csak be a DNS-be). Ezek a változások legkönnyebben azzal az elmélettel magyarázhatók, hogy a dT5’-TS a sejtmembrán timidin-transzporterén keresztül történő timidinfelvételt kompetitíven gátolja, emiatt leesik a pool jelöltsége és a prekurzorok elégtelen
68
mennyisége miatt a DNS-szintézis üteme is csökken. A timin-nukleotidok hiánya előmozdítja a dCMP-dezamináz – timidilát-szintáz útvonalon keresztül történő timidilátszintézist [134], amelynek dCMP-igényét végső soron az emelkedett dCKaktivitás biztosítja. Golos és munkatársai kimutatták, hogy a timidilát-szintáz működését a dT-5’-TS nem gátolja [147], a pirimidin-nukleotidok átalakulása tehát elméletileg az analóg jelenlétében is zavartalanul folyhat. A timidintranszport kompetitív gátlása ellen szól viszont az a tény, hogy feleslegben adott dezoxitimidinnel a dCK aktiválódását nem tudtuk kivédeni.
5.2. Célzott DNS-károsítással kiváltott dCK-aktiválódás vizsgálata A CdA és dFdC egyik legszembetűnőbb hatása a DNS-szintézis gátlása volt (15. ábra ill. [140]). Ugyanakkor a nukleozid-analógok hatásmechanizmusa összetett és még nem minden részletében tisztázott; a ribonukleotid-reduktáz gátlása révén befolyásolják a dezoxiribonukleotid-poolokat, és a nukleotid-metabolizmus különböző enzimeit is gátolják [79, 143, 148]. A nyugvó sejteket jelentős DNS-hibajavító szintetikus aktivitás jellemzi, amelynek gátlása a genom károsodásához és előbb-utóbb programozott sejthalálhoz vezet, amint azt több nukleozid-analóggal kapcsolatosan kimutatták [88-94]. A továbbiakban azt kívántuk alátámasztani, hogy a DNS károsodásának oki szerepe van a dCK-aktivitás megemelkedésében, ezért más, nem nukleozid-típusú ágensekkel – etopoziddal, aphidicolinnal és a sejtek γ-besugárzásával – próbáltuk előidézni a már jól ismert effektust. Ezekkel a kezelésekkel célzottabban lehetett a DNS-károsodást kiváltani, mint a komplexebb hatásmechanizmussal rendelkező nukleozid-analógokkal. 5.2.1. Etopozid és aphidicolin hatása a dezoxicitidin-kináz aktivitásáraI Az etopozid (VP16) egy daganatellenes gyógyszer, amely a topoizomeráz-II DNS-sel képzett komplexéhez kötődve kétszálú és egyszálú DNS-lánctöréseket okoz, valamint reverzibilisen gátolja a DNS-ligáz aktivitását [149]. Az aphidicolin (APC) egy gomba eredetű toxin, a DNS-hibajavításban fontos szerepet betöltő DNS-polimeráz δ és ε inhibitora [150]. Az etopozidnak és az aphidicolinnak a dezoxicitidin-kináz aktivitására gyakorolt hatását a 23. ábra szemlélteti. Kétórás kezelést követően mindkét
69
a
CdA-hoz
hasonló
mértékben, kb. 2,5-szeresére növelte az enzim aktivitását mind normál, mind pedig akut mieloid
leukémiás
limfocitákban.
A
vértimidin-
dCMP, pmol/106 sejt /perc
szer
A normál
B AML
20
10
kináz-izoenzimek aktivitását a CdA-hoz
hasonlóan
az
etopozid és aphidicolin sem befolyásolta (az eredmények nincsenek ábrán bemutatva).
K
CdA VP16 APC
K
CdA VP16 APC
26. 23. ábra. CdA, etopozid és aphidicolin hatása a dezoxicitidin-kináz aktivitásáraI Egészséges donor (A), illetve akut mieloid leukémiában szenvedő beteg perifériás vér-limfocitáit (B) két órán át 1 μM CdA-val (“CdA”), 100 μM etopoziddal (“VP-16”), illetve 2 μg/ml aphidicolinnal (“APC”), valamint ezek nélkül (“K”) inkubáltuk, majd megmértük a sejtkivonatok dCK-aktivitását.
5.2.2. γ-besugárzás okozta változások a nukleotid-anyagcserébenV A γ-sugárzás részben közvetlenül, részben oxigéntartalmú reaktív szabadgyökök keltése révén DNS-kettőslánctöréseket okoz, amelyek rövid időn belül kijavítódnak [151]. Eközben valószínűleg változások következnek be a dezoxiribonukleozid-mentő reakcióutakban is, amit tonzilla limfociták 0 – 2 Gy dózisú besugárzását követően 3HdC- és 3H-dT-pulzusjelöléssel vizsgáltunk. A 24/A. ábra a jelölt nukleotidok DNS-be történő beépülését a besugárzási dózis függvényében ábrázolja. A dezoxicitidin inkorporációja 1 Gy dózisnál tetőzött, míg a timidiné a vizsgált tartományban folyamatosan emelkedett. A sejtek DNS-szintézisének fokozódása a hibajavító reakciók aktiválódására utal. Ezzel párhuzamosan emelkedett a 24/B. ábrán feltüntetett „felvétel”, amely a sejtbe jutott és intracellulárisan foszforilált nukleozidok összmennyiségére utal, így megbízható jelzője a sejtek dCK- és TK-aktivitásának. Meg kell jegyezni azonban, hogy a dCK által in vivo foszforilált 3H-dC kb. 75%-a timin-nukleotidokká alakul át [15], ami a radioaktív jelzés elvesztésével jár, tehát a sejtek dCK-aktivitása sokkal magasabb, mint a különböző frakciókban mérhető dezoxicitidin-jelzés összege. Az össz-felvétel és a DNS-inkorporáció görbéinek összevetéséből kiderül, hogy a mentett 3H-dT-nukleoti-
70
dok túlnyomó többsége (mintegy 95%-a) a DNS-be került, míg a jelzett dC-nél ez az arány kb. 30%. A timin- és citozin-dezoxinukleotid-poolok nagysága az elnyelt dózissal nem volt összefüggésben, viszont a citozin-dezoxinukleotid-pool jelzettsége a timidinét
1,5
A
dNMP, pmol /10 6 sejt /30 perc
dNMP, pmol /106 sejt /30 perc
jóval meghaladta (24/B. ábra). A dezoxicitidin-liponukleotidok jelzettsége ugyanakkor a
3H-dT
1,0
0,5 3H-dC
0,5
1
1,5
2 Gy
B
1,5
3 H-dT
felvétel
3 H-dC
1,0
0,5
0
0,5
1
1,5
3 H-dC
3 H-dC
nukl . LN
3 H-dT
nukl .
2 Gy
24. ábra. A dezoxiribonukleozid-mentő reakcióutak változásai γ-besugárzás hatásáraV Humán tonzilla-limfociták párhuzamos kultúráit különböző dózisokkal (0 – 2 Gy) besugaraztuk, majd 1 μCi/ml 3H-dC-nel vagy 3H-dT-nel 30 percig jelöltük, és megmértük az etanollal feltárt sejtek különböző frakcióiba beépült radioaktivitást. (A): az alkoholban oldhatatlan nukleinsav-frakció jelöltsége; (B): a nukleotidok („nukl.”) és a liponukleotidok („LN”) jelölődése, valamint a sejtbe felvett összes radioaktivitás („felvétel”) az elnyelt dózis függvényében. Az adatok a 106 sejt jelzett frakcióiba 30 perc alatt beépült [3H]-nukleozidok mennyiségét jelzik.
dózis függvényében 1 Gy-ig mérsékelt emelkedést mutatott, és a görbe lefutása erősen emlékeztetett a 3H-dC DNS-inkorporációjára. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy besugárzás hatására mind a dezoxicitidin-, mind a dezoxitimidin-mentő útvonalak aktiválódnak, ami a dezoxitimidin esetében szinte kizárólag, a dezoxicitidin kapcsán pedig jelentős részben a hibajavító DNS-szintézis nukleotid-igényét elégíti ki. A liponukleotidok fokozott jelzettsége valószínűleg az oxidatív membránkárosodás javításához szükséges membránlipid-prekurzorok fokozott szintézisére utal. A besugárzott és a kontroll sejtek nyerskivonataiban mért enzimaktivitásokat a 25. ábra illusztrálja. γ-besugárzás hatására a dCK aktivitása dózisfüggő módon emelkedett. 2 Gy elnyelt dózis mellett, 50 perces utóinkubálást követően közel négyszeres aktivitás-fokozódást tapasztaltunk (25/A. ábra). Ugyanakkor a sejtek besugárzása nyomán nem azonnal emelkedett meg az enzim aktivitása, hanem egy 15 – 30 perces utóinkubálás volt szükséges a maximális aktiválódás eléréséhez (25/B. ábra).
71
A kontroll sejtekben csak minimálisan változott a dCK aktivitása (25/B. ábra, dCKkontroll). A jelzett timidin felvételének és foszforilációjának kifejezett növekedése ellenére sem találtunk különbséget a kontroll és a besugárzott sejtek TK1-aktivitása
dNMP, pmol /106 sejt /perc
között (25/B. ábra). A TK2 enzimaktivitása sem fokozódott a besugárzás hatására. 20
20
A
B dCKγ
16
16
dCK
12
12
8
8
4
4
dCKkontroll TK1γ TK1kontroll
0
0,5
1
1,5
2 Gy
0
30
60
90
120 perc
25. ábra. γ-sugárzás hatása tonzilla-limfociták dCK- és TK1-aktivitásáraV A különböző dózisokkal besugarazott, illetve kontroll sejteket különböző ideig 37 ºC-on tartottuk, majd nyerskivonataikból dCK- és TK1-aktivitásokat mértünk. (A): dCK-aktivitás növekvő dózisú besugárzást és 50 perces utóinkubálást követően. (B): az utóinkubációs idő függvényében mért dezoxinukleozid-kináz-aktivitások a kontroll („dCKkontroll” és „TK1kontroll”), valamint az 1 Gy dózissal besugarazott sejtek („dCKγ” és „TK1γ”) nyerskivonataiban.
A DNS-lánctörések és kijavításuk dinamikájának követésére az ún. Comet(üstökös)
teszt
nyújt
lehetőséget.
A
besugárzott
limfocitákat
teljes-sejt-
elektroforézisnek vetettük alá, így a gyorsabban vándorló töredezett DNS elválasztható és elnyújtott csóva alakjában láthatóvá válik. A csóva területe a DNS-károsodás mértékével arányos [136]; a 26. ábra bal oldalán egy ép, a jobb
oldalon
egy
erősen
károsodott
sejt
mikrofotója látható. A 4. táblázat a különböző időtartamokig utóinkubált kontroll és besugárzott
26. 29. ábra. Normál és besugarazott limfocita mikrofotója (Comet eljárás)
sejtek átlagos csóva/fej hányadosait tünteti fel. Ez az érték a kontroll sejtek esetében nem haladta meg a 4-et, míg 2 Gy besugárzást követően 26 fölé emelkedett, jelezvén, hogy
az
alkalmazott
dózis
a
DNS
jelentős
fragmentációjához
vezetett. A
kettőslánc-törések ugyanakkor teljes mértékben kijavítódtak a 60 perces utóinkubálás során (a csóva/fej hányados a 26,26 értékről fokozatosan 3,75-re csökkent). A törések
72
idő
0 perc
15 perc
30 perc
60 perc
kontroll
3,98
nincs adat
nincs adat
3,83
γ-besugárzás
26,26
21,59
11,87
3,75
kezelés
4. táblázat. A DNS lánctörések javításának dinamikája γ-besugárzás nyománV A kontroll és az 1 Gy dózissal besugarazott tonzilla-limfocita-populációkat a jelzett időtartamú utóinkubálásokat követően a Comet-eljárással vizsgáltuk. A közölt értékek 25 sejt átlagos csóva/fej területarányát mutatják.
javításának üteme a 15. perc után gyorsult fel, majd közel állandó sebességgel haladt. Ez a kinetika feltűnően hasonlít a dCK aktivációs görbéjére (25/B. ábra). A DNShibajavítás és a dCK-aktiválódás szoros időbeli kapcsoltsága arra utal, hogy ok-okozati kapcsolat állhat fenn a két jelenség között, vagyis a dCK-aktiválódás szignálja a károsodott DNS-ből eredeztethető. 5.2.3. A dCK aktiválódása a DNS-károsodás korai következményeII A poli(ADP-ribóz)-polimeráz (PARP) egy nagy mennyiségben előforduló sejtmagfehérje, amely a DNS-károsodás érzékeny szenzora [152], és számos hibajavító fehérjét ADP-ribozilál. A PARP aktiválódása fontos szerepet tölt be a nukleozidanalógok hatásmechanizmusának késői fázisában, a nekrotikus sejthalál kiváltásában [87, 153]. Mindezek figyelembevételével ésszerűnek tűnt megvizsgálni, hogy a PARP aktivációja a dCK enzimaktivitásában észlelt emelkedésnek előfeltétele-e. A kérdés eldöntéséhez tonzilla limfocitákat 60 és 120 percen át 5 mM 3-aminobenzamiddal, a PARP szelektív gátlószerével kezeltünk [87, 153]. A 3-aminobenzamid azonban sem a kontroll, sem pedig a CdA-val indukált dCK-aktivitást nem befolyásolta számottevően (az adatok nincsenek ábrán bemutatva). Hasonló eredményre vezettek az aphidicolin és 3-aminobenzamid kombinációjával végzett kísérleteink is. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy a PARP nem eleme a dCK aktiválódásához vezető jelpályának.
73
5.3. A dCK-aktiválódás és az enzimexpresszió összefüggéseiII, V Munkacsoportunk korábbi eredményei rámutattak,
31 kDa
hogy a dCK aktivitásában
1
bekövetkezett markáns emelkedést
nem
kísérte
Ugyanezt
[140,
az 154].
tapasztaltuk
3
4
5a
5b
5c
6
27. 30. ábra. Dezoxiadenozin- és dezoxicoformycin-kezelés 29. hatása a dCK-fehérje szintjéreII 12%-os denaturáló poliakrilamid-gélen 25 μg-nyi mennyiséget futtattunk az alábbi szerekkel 2 órán át kezelt sejtek nyerskivonataiból: 2, nem kezelt kontroll; 3, 100 μM dA; 4, 100 μM dCF; 5a, 1 μM dA + 10 μM dCF; 5b, 10 μM dA + 10 μM dCF; 5c, 100 μM dA + 10 μM dCF; 6, 3 μM CdA. A blot dCKspecifikus ellenanyaggal készült. 1-es sáv: 20 ng rekombináns dCK.
enzimfehérje mennyiségének növekedése
2
a
dezoxiadenozin és a dCF kombinációjával vagy CdA-
val kezelt sejtek kivonataiból készített denaturáló western blotton is (27. ábra). Pozitív kontrollként rekombináns dCK-t is futtattunk a gélen [50]. A 28. ábra a 25/A. és 25/B. ábrákon feltüntetett enzimaktivitás-mérésre került minták immunblottját mutatja. Ebben az esetben a rekombináns kontroll lassabban futott a mintákban látható dCK-nál, ami az N-terminális hexahisztidin-címkéből és a vektor
polilinkerének
megfelelő
többlet-aminosavakból
eredő
molekulatömeg-
növekedés következménye (az előző gélben nincs meg ez a különbség, mert az ott használt rekombináns enzimről trombinnal lehasították a címkét). Az ábra alsó részén az egymásnak megfelelő kontroll és besugárzott mintákat a könnyebb összehasonlítás kedvéért párokba rendezve futtattuk. Habár a sávok intenzitásában kisebb eltérések felfedezhetők, ezek nem voltak reprodukálható változások, hanem valószínűleg a blottoló eljárás közben keletkezett műtermékek. Leszögezhető tehát, hogy az enzim aktivitásában mért közel négyszeres különbség ellenére a dCK expressziója γbesugárzás
hatására
sem
változott.
Ebből
arra
következtettünk,
hogy
az
enzimaktiválódás hátterében nagy valószínűséggel a dCK-fehérje poszt-transzlációs (másodlagos) módosítása állhat.
74
A
B
30 kDa 20ng 10ng
5ng
1
2
3
4
5
6
7
8 30 kDa
K
1 Gy
0 perc
K
1 Gy
10 perc
K
1 Gy
K 1 Gy
K 1 Gy
20 perc
30 perc
60 perc
K
1 Gy 10ng
120 perc
28. ábra. γ-besugárzott tonzilla-limfociták dCK-expressziójaV Anti-dCK western blot. A: 1: kontroll (0 Gy, utóinkubálás nélkül; 2: kontroll (0 Gy, 50 perces utóinkubálással); 3: 0,25 Gy; 4: 0,5 Gy; 5: 0,75 Gy; 6: 1,0 Gy; 7: 2,0 Gy; (3 – 7: 50 perces utóinkubálással); 8: 2 órás kezelés 3 μM CdA-val. B: Kontroll, illetve 1 Gy dózissal besugarazott sejtek dCK-fehérjemennyisége az utóinkubálási idő függvényében. A ng-ban megadott értékek az adott sávban futtatott rekombináns dCK-fehérje mennyiségei.
5.4. A reverzibilis protein-foszforiláció és a dCK-aktiválódás kapcsolata Munkacsoportunk több korábbi megfigyelése – a dCK aktiválása a foszfatázgátló NaF-dal [155], illetve az enzim inaktiválása in vitro λ-protein-foszfatázkezeléssel [154] – arra utalt, hogy a dCK aktivitásának emelkedése közvetve vagy közvetlenül reverzibilis fehérje-foszforiláció következménye lehet. Ezt a feltevést alábbi kísérleteink is megerősítették.
5.4.1. A dCK aktiválása protein-foszfatáz-inhibitorokkalV Tonzilla-limfocita-sejtkultúrák rövidtávú kezelése a protein-foszfatáz-1 és -2A inhibitor calyculin A-val a dCK-aktivitás koncentrációfüggő emelkedését eredményezte; a maximális aktivitás-fokozódást 80 nM-nál észleltük, ami a kontroll érték kétszeresét érte el (29. ábra). A timidin-kináz-izoenzimek aktivitásában ugyanakkor nem történt változás. A kísérletet egy másik ismert protein-foszfatáz-gátlószerrel, az inkább PP2Ara specifikusabb okadainsavval elvégezve sokkal szerényebb mértékű stimulációt tapasztaltunk (a maximális aktiválás 10% volt 15 nM okadainsav-koncentráció mellett).
75
dCK
foszforilált
állapotban
aktív,
pedig
a
foszfát-csoportját
dNMP, pmol /106 sejt /perc
Az eredmények azt sejtetik, hogy a
foszfoszerin/foszfotreonin oldalláncokra
specifikus
protein-foszfatáz-1
távolíthatja el, ami az enzimaktivitás csökkenését eredményezi.
16
12 dCK 8
4 TK1
A 30. ábra 1 – 4. oszlopai a kombinációban
alkalmazott
γ40
besugárzás és calyculin A-kezelés dCKaktivitásra gyakorolt additív hatását
5.4.2. Hiperozmotikus stressz hatása
tős eltolódás következik be a sejt foszforilációs állapotában, okáért
példának
inaktiválódik
a
dNMP, pmol /106 sejt /perc
az enzimaktivitásraV
környezet hatására jelen-
120
160 nM
29. ábra. Calyculin A-kezelés hatása 33. tonzilla - limfociták dCK- és TK1aktivitásáraV A sejteket a calyculin A feltüntetett koncentrációi mellett 60 percen át inkubáltuk, majd megmértük a nyerskivonatok enzimaktivitásait.
szemléltetik.
A hiperozmotikus
80
dCK TK
25 20
hiperozmotikus stressz 15 10 5
protein-kináz Bα [156] és 1
a riboszómális S6-kináz [157], ellenben a MAPkináz-család tagjai közül a p38- és az Erk1/2kinázok
aktiválódnak
[158]. A hiperozmolaritás dCK-aktivitásra gyakorolt hatását limfociták 400 mM-os szorbitollal
2
γ-besugárzás calyculin A
3
4
20 nM 100 nM
5
6
7
8
20 nM 100 nM
30. ábra. γ-besugárzás, calyculin A és hiperozmotikus 34. stressz hatásai a dCK és TK aktivitásáraV A tonzilla limfocitákat 10 percig előinkubáltuk a calyculin A feltüntetett koncentrációinak jelenlétében, illetve anélkül (-), majd bizonyos kultúrákat 1 Gy dózissal besugaraztunk (+) és a sejteket 40 percig 400 mM szorbitol jelenlétében (5 – 8 oszlopok), illetve anélkül (1 – 4 oszlopok) utóinkubáltuk. A dCK- és TK-enzimaktivitásokat a sejtek nyerskivonataiból határoztuk meg.
76
történő kezelésével vizsgáltuk. A 30. ábra 1. és 5. oszlopának összevetéséből látható, hogy a szorbitollal kezelt sejtekben mért enzimaktivitás csak a kontroll érték felét érte el. γ-besugárzás hatására ugyan mind a szorbitollal kezelt (5 vs. 6. oszlop), mind a nem kezelt (1. vs. 2. oszlop) sejtekben 2-3-szoros aktivitás-fokozódást tapasztaltunk, de az aktiválódás abszolút értéke az előbbi esetben jóval kisebb volt. A calyculin A ugyanakkor már alacsony koncentrációban is csaknem teljes egészében kivédte az ozmotikus stressz gátló hatását, sőt magasabb koncentrációban kétszeresére fokozta az enzimaktivitást (7. és 8. oszlop). A kettős kezelések eredményei azt sugallják, hogy a γsugárzás és a calyculin A aktiváló, illetve a hiperozmotikus stressz inaktiváló hatása egymástól függetlenül, additív módon befolyásolja a dCK aktivitását.
5.4.3. Tirozin-kináz-inhibitorok dCK-t aktiváló hatásaII Van den Neste és munkatársai az ultraibolya fény dCK-stimuláló hatását részben a növekedési faktor-receptorok aktiválódásának tulajdonítják [159]. Erre alapozva kísérletet tettünk arra, hogy a dCK aktivitását a receptor-tirozin-kinázok gátlószereivel befolyásoljuk. Tonzilla-limfocitákat kezeltünk tirfosztin A47-tel, az epidermális növekedési faktor tirozin-kinázának inhibitorával, illetve a nem specifikus tirozin-kinázinhibitor genisteinnel. Várakozásainkkal ellentétben azt tapasztaltuk, hogy a dCK aktivációs görbe lefutása annak ellenére nagyon
hasonló,
hogy
a
genistein
nemcsak tirozin-kináz-inhibitor, hanem az etopozidhoz hasonlóan topoizomerázII-gátló tulajdonságokkal is rendelkezik [160]. A szelektív EGFR-inhibitor PD 153035 a dCK aktivitását ugyan a
Enzimaktivitás a kontroll %-ában
aktivitását mindkét vegyület koncentráció-függő módon emelte (31. ábra). A két
200
dCK
100
TK1
tirfosztin A47-nél kisebb mértékben, de 0
szignifikánsan emelte (32. ábra).
0 10 25
50 75 100
150
200 μM
31. ábra. Tirozin-kináz-inhibitorok hatása a dCK aktivitásáraII Tonzilla-limfociták primer kultúráit két órán át kezeltük a tirfosztin A47 (üres szimbólumok) és a genistein (kitöltött szimbólumok) feltüntetett koncentrációival, majd megmértük a sejtkivonatok dCK(négyzetek) és TK1- (körök) aktivitásait.
77
Ebből arra következtettünk, hogy az EGFR jelpályájának megszakítása a dCK aktiválódását eredményezi. A
növekedési
faktorok
receptorai
három
fő
foszforilációs
jelpályát
aktiválhatnak, így a Ras-aktiválta MAP-kináz-kaszkádot, a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K)/ protein-kináz B (Akt) útvonalat, illetve a Rac-függő kinázokat, többek között a MAP-kinázt
aktiválódásához
[161].
vezető
A
dCK
jelpályát
a
felsorolt szignáltranszdukciós rendszerek egy-egy
gátlószerével
igyekeztünk
azonosítani. Primer limfocita-kultúrákban a MEK-inhibitor PD 98059 és a p38 gátlószere, az SB 203580 a PD153035höz
hasonló
mértékű
dCK
enzimaktivitás-fokozódást eredményezett (32. ábra), miközben a TK1 aktivitása
dCK aktivitás a kontroll %-ában
p38
300
200
100
nem változott (nincsen ábrán bemutatva). Ezzel szemben a PI3K wortmanninnal történő blokkolása a dCK aktivitását nem
1
2
3
4
5
6
7
befolyásolta (az adatok nincsenek ábrán bemutatva). 32. ábra. Protein-kináz-gátlószerek hatása a dCK aktivitásáraII Primer tonzilla-limfociták párhuzamos kultúráit két órán át a következő szerekkel kezeltük: 1., kontroll; 2., 2 μM CdA; 3., 2 μg/ml aphidicolin; 4., 100 μM tirfosztin A47; 5., 10 μM PD 153035; 6., 50 μM PD 98059; 7., 50 μM SB 203580. A sejtek nyerskivonatából dCK-aktivitást mértünk, az értékeket a kontroll aktivitás (4,9 ± 0,2 pmol dCMP/106 sejt/perc) százalékában fejeztük ki.
Irodalmi adatok szerint a p38-kinázt a hiperozmotikus stressz is aktiválja [158, 162]. Mivel a szorbitollal kezelt limfociták dCK-aktivitása jelentősen csökkent (30. ábra), lehetségesnek tűnt, hogy ezt a hatást a p38 jelpályája közvetíti. A p38-inhibitor SB 203580-nal azonban nem sikerült kivédeni az ozmotikus stressz okozta aktivitáscsökkenést (az adatok nincsenek ábrán bemutatva).
78
Fent
ismertetett
eredményeinket
az
EGFR
tonzilla-limfocitákban
való
expressziójának bizonyításával is alátámasztottuk. A limfocitákból izolált RNS-ből RTPCR-analízist végeztünk; a 454 bázispáros reakciótermék megjelenése az EGFreceptorra specifikus [139]. Pozitív kontrollként az EGF-receptort expresszáló SK-N-F1 neuroblasztóma-sejtek
RNS-kivonatait
[163], negatív kontrollként pedig reverz transzkriptázzal
nem
kezelt
RNS-
kivonatokat használtunk (33. ábra). 33. ábra. Az EGF-receptor mRNS36. ének kimutatása tonzillaII limfocitákból Frissen izolált limfocitákból, illetve konfluens SK-NF1-sejtekből RNS-t preparáltunk, majd a humán EGF-receptorra specifikus primerpár segítségével RT-PCR analízist végeztünk [140]. Az amplifikált 139 ] termékeket 2%-os agaróz gélen megfuttattuk és etídium-bromiddal festettük. Negatív kontrollként reverz transzkriptáz enzimmel át nem írt RNSmintákat alkalmaztunk.
500 bp 400 bp
reverz transzkriptáz
+
— +
limfocita
79
—
SK-N-F1
5.5. A dCK-aktiválódás lehetséges szerepe az apoptózis folyamatában A nukleozid-analógokkal és más DNS-károsító kezelésekkel kiváltott dCKaktiválódást a DNS-hibajavítás fokozott nukleotidigénye magyarázhatja, hiszen nyugvó sejtekben
a
dezoxicitidin-kináz
valamennyi
természetes
dezoxiribonukleotid
szintézisében közreműködik [134]. Ugyanakkor az is figyelemreméltó, hogy a felsorolt DNS-károsító anyagok és behatások végső soron beindítják a programozott sejthalál folyamatát, ami terápiás hatásuk alapját is képezi [88 - 94]. Az apoptózist a DNSkárosodás nyomán aktiválódó p53-függő jelpálya indítja el [164], illetve – legalábbis a nukleozid-analógokkal kapcsolatban – a mitokondriumokra gyakorolt közvetlen toxikus hatás, amelyet tranziens citoplazmatikus Ca2+-hullámok kísérnek [91, 92]. Az apoptoszóma felépülését a mitokondriumból kiáramló citokróm-c indítja el. Ehhez a folyamathoz dATP is szükséges, amelynek in situ képződésében egyes elméletek szerint a citoplazmába kiáramló dGK is szerepet játszik [116]. Kimutatták, hogy a dATP szubsztituált analógjai, mint pl. a CdATP és FaraATP, kitűnően helyettesíthetik a természetes nukleotidot az apoptoszóma képződése során [165]. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy a dCK korai aktiválódása része lehet-e, illetve előmozdíthatja-e a limfociták apoptózisát a dezoxiadenozin fokozott foszforilációja révén.
5.5.1. Apoptózis-markerek vizsgálata Megvizsgáltuk, hogy kimutatható-e a citotoxikus szerekkel kezelt limfociták apoptózisa a sejtek néhány órás kezelése után, azaz a dCK-aktiválódás és az apoptózis folyamatának beindulása időben egybeesik-e. CdA-val, illetve aphidicolinnal 2 órán át OD405 40 (x 10-2)
aphidicolin
34. 36. ábra. Citotoxikus szerekkel kezelt limfociták kaszpáz-3 -aktivitása A 2 órán át 2 μM CdA-val vagy 2 μg/ml aphidicolinnal kezelt, illetve nem kezelt sejtek nyerskivonataihoz 55,6 μg/ml DEVD-pNA szubsztrátot adtunk, és folyamatosan regisztráltuk az optikai denzitás változását 405 nm-en.
30 CdA 20 kontroll
10
5
10 perc
80
kezelt tonzilla limfociták nyerskivonataiban DEVD-pNA-szubsztráttal kaszpáz-3-szerű aktivitást mértünk. A kezeletlen sejtekhez képest a CdA-val kezelt mintákban kétszeres, az
aphidicolinnal
kezeltekben
közel
háromszoros
kaszpázaktivitás-fokozódást
regisztráltunk (34. ábra), ami alátámasztja azt, hogy normál limfociták primer kultúráiban a programozott sejthalál mechanizmusai már órákon belül beindulnak. A
klasszikus
DNS-fragmentációs
2h
teszttel viszont még hosszabb távú (16 órás)
4h
6h
1. 2. 3. 1. 2. 3. 1. 2. 3.
16 h 1. 2. 3.
kezelés során sem sikerült kimutatnunk az alacsony molekulatömegű DNS-fragmentumok megjelenését (35. ábra). Ez a megfigyelés ugyanakkor összhangban van
1033 bp
500 bp
Lassota és munkatársai eredményeivel, akik flow-citometriával
sem
tudtak
DNS-
200 bp
fragmentációt kimutatni CdA-val kezelt normál limfocitákon [89]. 35. ábra. DNS-fragmentációs teszt genotoxikus szerekkel kezelt limfocitákon Kontroll („1”), illetve 2 μM CdA-val („2”) vagy 2 μg/ml aphidicolinnal („3”) 2, 4, 6 és 16 órán át kezelt tonzilla-limfocitákból Hirt módszere szerint [138] extrakromoszómális DNS-t preparáltunk, amelyet 2%-os agarózgélen futtattunk és etídium-bromiddal festettünk.
5.5.2. A dATP-pool szelektív növekedése a dCK aktiválódása nyománVI Az 5. táblázatban feltüntetett kezeléseknek alávetett limfociták dNTP-pooljait a Sherman és Fyfe által kidolgozott szintetikus oligonukleotid-templát módszer módosított változatával határoztuk meg [137]. A dTTP-pool az alkalmazott kezelések során egyöntetűen csökkent, míg a dGTP-pool csak az aphidicolin- és a CdA-kezelés nyomán fogyatkozott meg számottevően (5. táblázat). A dCTP-pool a dCK aktivitását emelő szerek (etopozid, aphidicolin és CdA) hatására lényeges csökkenést mutatott, míg a dCK aktivitását gátló kezelések során (hiperozmotikus stressz szorbitollal és nátriumkloriddal) alig változott. A dCK aktiválódásával párhuzamosan a három felsorolt dezoxinukleotid mennyiségében bekövetkezett csökkenéssel szemben a dATP-pool szignifikáns emelkedést mutatott (50%-os növekedés az etopoziddal, 77%-os az aphidicolinnal és 62%-os a CdA-val kezelt sejtek esetében). Mivel a dATP-pool
81
szelektív
növekedése
a
sejtek
γ-besugárzásával
is
előidézhető
volt
(T.
Szpaszokukockaja, személyes közlés), a genotoxikus behatások, a dCK aktiválódása és a dATP koncentrációjának specifikus emelkedése között ok-okozati összefüggés állhat fenn. Az is elképzelhető, hogy az aktivált dCK a természetes szubsztrátjai közül a dezoxiadenozint fokozott affinitással foszforilálja.
kontroll
szorbitol
NaCl
etopozid
APC
CdA
dCK - 8,0 ± 0,1*** 3,4 ± 0,2*** 2,1 ± 0,2*** 20,0 ± 0,1*** 18 ± 0,1*** 19,7 ± 0,7*** aktivitás 100% 42% 26% 250% 225% 246% dNTP poolok dCTP 4,6 ± 0,4 5,7 ± 0,5* 4,3 ± 0,3 2,6 ± 0,4*** 3,3 ± 0,7** 3,0 ± 0,7** 100 % 124 % 94 % 57 % 71 % 65 % 3,2 ± 0,1 2,2 ± 0,9** 2,7 ± 0,7 1,1 ± 0,1*** 2,3 ± 0,6* 2,0 ± 0,3*** dTTP 100 % 68 % 84 % 33 % 73 % 61 % dGTP 3,5 ± 0,8 3,2 ± 0,7 3,0 ± 0,1 3,0 ± 0,1 2,4 ± 0,3** 2,5 ± 0,3** 100 % 90 % 85 % 86 % 70 % 73 % dATP 1,8 ± 0,5 1,9 ± 0,7 1,9 ± 0,8 2,7 ± 0,6** 3,2 ± 0,5** 2,9 ± 0,6** 100 % 106 % 106 % 150 % 177 % 162 % 5. táblázat. Az intracelluláris dNTP-poolok változásai a dCK aktiválódása és inaktiválódása nyománVI Tonzilla-limfociták primer kultúráit a feltüntetett szerek jelenlétében két órán keresztül inkubáltuk (szorbitol: 400 mM; NaCl: 200 mM; etopozid: 100 μM; APC (aphidicolin): 2 μg/ml; CdA: 2 μM), majd a sejtkivonatokból dCK-aktivitást mértünk, ami a táblázatban pmol dCMP/ 106 sejt/ perc egységekben, illetve a kontroll érték százalékában van kifejezve. A dezoxiribonukleotid-poolok mértékegysége pmol/106 sejt, illetve a kontroll sejtekben mért érték százaléka. A középértékeket és standard deviációkat három független meghatározás eredményeiből számítottuk. A szignifikancia-szintek jelölése a következő: *: p < 0,10; **: p < 0,05; ***: p < 0,01.
5.5.3. A p53 és a dCK-aktiválódás kapcsolataVI A p53-fehérje kulcsfontosságú szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában és a genom épségének megőrzésében [164]. A nukleozid-analógokkal, UV- vagy γbesugárzással előidézett DNS-károsodás hatására a p53 hiperfoszforilálódik és stabilizálódik, hogy a sejtciklus gátlása révén elősegítse a DNS hibáinak kijavítását, illetőleg a Bax-géneket transzaktiválva beindítsa a sejt apoptózis-programját [166]. Kísérleti rendszerünkben a pifithrin-α-t (PFT-α), a p53 közelmúltban azonosított inhibitorát [167] alkalmaztuk annak eldöntésére, hogy a DNS-károsodás nyomán fellépő dCK-aktiválódást a p53 közvetíti-e. A 36. ábráról leolvasható, hogy a PFT-α dózisfüggő
82
módon gátolta a CdA-val kiváltott dCK-aktiválást. A gátlás már a PFT-α alacsony koncentrációi mellett is megfigyelhető volt (5 μM PFT-α a dCK aktivitását 198%-ról 157%-ra csökkentette). Ugyanakkor az alapaktivitás átmeneti emelkedését figyelhettük meg az 5 – 25 μM-os tartományban, amit a PFT-α magasabb koncentrációinál a dCKvolt észlelhető). A
továbbiakban
három
Burkitt-limfóma-eredetű sejtvonalon, a vad típusú p53-fehérjét expresszáló DG-75-, illetve a sugárrezisztens és p53-hiányos
BL-41-
és
Ramos-
dCK aktivitás a kontroll %-ában
aktivitás kifejezett csökkenése követett (100 μM-nál a kontroll aktivitás csupán 44%-a 200 150 100 50 kontroll
sejteken vizsgáltuk meg a dCK aktiválhatóságát.
A
konfluens
sejtkultúrákból nyert sejteket két órán át CdA- és etopozid- (VP16) kezelésnek vetettük alá, majd a nyerskivonatokból
enzimaktivitást
mértünk. Amint a 37. ábrán látható, a
CdA
25
50
75
100 μM
38. ábra. A p53- inhibitor pifithrin-α hatása a 36. dCK aktivitásáraVI Tonzilla — limfociták párhuzamos kultúráit a PFT-α növekvő koncentrációival, 2 μM CdA jelenlétében (“CdA”) vagy anélkül (“kontroll”) 2 órán át inkubáltuk. A feltárást követően mért dCK-aktivitások a kezeletlen kontroll aktivitás (4,77 ± 0,40 pmol dCMP/ 106 sejt/ perc) százalékában értendők.
DG-75 p53 +/+ sejteken tapasztalt nagymértékű dCK-aktiválódással szemben (2,5(50% alatti) enzimaktiválódás lépett fel. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a p53 lényeges szerepet tölt be a dCK aktiválódásának folyamatában. Érdekes módon a sejtek p53-státusza a dCK alapaktivitására nincs hatással, hiszen a legmagasabb
alapaktivitásokat
épp a p53-hiányos BL-41- és Ramos-sejtvonalakon mértük
dCMP, pmol /106 sejt /perc
szeres CdA-val és háromszoros etopoziddal) a két p53 -/- sejtvonalon csak minimális 50
A
DG-75 p53+/+
B
BL-41 p53-/-
C
Ramos p53-/-
25
K CdA VP16
K CdA VP16
K
CdA VP16
39. ábra. A p53-státusz és a dCK-aktiváció össze37. VI VI függései Burkitt-limfóma eredetű sejtvonalakon A feltüntetett sejtkultúrákat két órán át 2 μM CdA-val, illetve 100 μM etopoziddal (“VP16”) kezeltük, majd a sejtek nyerskivonataiból 3H-dC —szubsztráttal dCK-aktivitást mértünk.
(37. ábra).
83
5.6. A dCK aktiválódása kalciumfüggő folyamat Irodalmi adatok szerint a sejtekhez adott citotoxikus nukleozid-analógok perceken belül tranziens citoplazmatikus Ca2+-szint-emelkedéseket hoznak létre, ami összefüggésben van a mitokondrium-membrán áteresztőképességének fokozódásával [91,
92].
Mivel
ezzel
párhuzamosan
a
dezoxicitidin-kináz
aktiválódása
is
megfigyelhető, felmerült a kérdés, vajon e két jelenség kapcsolatba hozható-e, azaz a kalciumszignál szerepet játszik-e az enzim aktiválódásában.
5.6.1. A szabad citoplazmatikus Ca2+-
A
gátoljaVII Tonzilla-limfociták
szabad
2+
intracelluláris Ca -koncentrációját a médiumhoz
adott
a kontroll %-ában
szint csökkentése a dCK aktivitását
100
BAPTA-AM-mel, 0
kelátorral [92] fokozatosan csökkentettük, majd a nyerskivonatokból a szokásos módon dCK- és TK1-aktivitásokat mértünk. A BAPTA-AM acetoximetilcsoportját nem-specifikus intracelluláris hasítják
keletkezett
aktív
le.
Az
forma
így nagy
affinitással, 1:1 mólarányban köti és inaktiválja a szabad kalciumionokat [92, 168]. Ahogy az a 38/A. ábrán látható, a BAPTA-AM a kontroll és a CdA-val stimulált
dCK-aktivitást
egyaránt
koncentrációfüggő módon csökkentet-
a kontroll %-ában
egy sejtpermeábilis szelektív Ca2+-
észterázok
CdA kontroll
200
25
50
75
100 μM
25
50
75
100 μM
B 150 100 50 0
40. ábra. Az intracelluláris szabad kalcium38. koncentráció csökkentésével a dCK VII aktivitása gátolható Humán tonzilla limfociták párhuzamos kultúráit a BAPTA-AM különböző koncentrációival (1 – 100 μM) két órán át kezeltük 2 μM CdA jelenlétében (folyamatos vonal), illetve anélkül (szaggatott vonal), majd a sejtkivonatokból dCK- (“A”) és TK1- (“B”) aktivitásokat mértünk. Az enzimaktivitások a kezeletlen kontroll aktivitások százalékában vannak feltüntetve, amelyek a következők: dCK-ra: 7,85 ± 0,08 pmol dCMP/ 106 sejt/ perc; TK1-re: 3,59 ± 0,04 pmol dTMP/ 106 sejt/ perc.
te. A CdA-indukálta enzimaktiválódás már a kalcium-kelátor alacsony koncentrációja
84
mellett is számottevően csökkent (1 μM hatására 231%-ról 192%-ra), 50 μM BAPTAAM pedig teljes mértékben felfüggesztette a CdA stimuláló hatását, ezért további kísérleteink során ebben a koncentrációban alkalmaztuk. Érdekes módon a BAPTA-AM alacsony dózisban a dCK alapaktivitását kissé emelte (140% 10 μM-nál), míg magasabb koncentrációban (10 – 100 μM) markáns gátló hatást fejtett ki. (Ez a tendencia a pifithrin-α hatásában is megfigyelhető volt (36. ábra)). A BAPTA-AM esetleges citotoxikus hatását a tripánkék-festékkizárásos teszttel zártuk ki. A dCK-t inaktiváló hatás specificitását a TK1 enzimaktivitásának meghatározásával ellenőriztük; a 38/B. ábra adataiból nyilvánvaló, hogy a TK1 aktivitása a kalcium-kelátor jelenlétében sem mutatott lényeges változást. Következő kísérletünkben az extracelluláris Ca2+-koncentráció csökkentésének hatását vizsgáltuk a dCK aktivitása szempontjából. Primer tonzilla-limfocitakultúrákhoz az erősen hidrofil és ezért nem sejtpermeábilis EGTA kalcium-kelátort adtuk. Várakozásunknak megfelelően az Eagle’s MEM tápfolyadék 1,8 mM-os kalcium-koncentrációjának sem részleges (1 mM EGTA), sem pedig teljes (5 mM EGTA) megkötése sem befolyásolta a dCK enzimaktivitását. A dCK aktivitása tehát az koncentráció függvénye. Eredményeink
felvetet-
ték azt a kérdést, hogy a BAPTA-AM csupán az enzim aktivációjának folyamatát, tehát az
aktív
forma
kialakulását
dCK aktivitás a kontroll %-ában
intracelluláris szabad kalcium300
200
100
CdA CdA + + BAPTA-AM
akadályozza meg, vagy pedig a már aktiválódott enzimet is gátolja. Ennek feltérképezése érdekében időben szétválasztottuk a CdA aktiváló és a BAPTA-AM
gátló
Tonzilla-limfocitákat
hatását. 2
μM
CdA-val különböző időtartamokig kezeltünk (0 – 120 perc); a
15
30
60
90
105
120 perc
41. ábra. A BAPTA-AM gátló hatása a CdA-val 39. kiváltott dCK-aktiválódásraVII Tonzilla - limfocitákat a feltüntetett időtartamú CdA (2 μM) kezeléseknek vetettünk alá, majd dCK-aktivitást mértünk (folyamatos vonal). Párhuzamos kultúrákat 120 percen át inkubáltunk 2 μM CdA jelenlétében, majd a feltüntetett időpontokban (a 30., 60. és 90. percben) 50 μM BAPTA-AM-t adtunk, de a dCK aktivitását csak a 120 perc leteltével mértük meg (szaggatott vonalak). Kontroll dCK-aktivitás: 3,74 ± 0,07 pmol dCMP/ 106 sejt/ perc.
85
dCK aktiválódásának időfüggvényét a 39. ábra folyamatos görbéje ábrázolja. Három másik sejtkultúrát 120 percen át CdA-val inkubáltunk, és az egyes sejtszuszpenziókhoz külön-külön a kezelés 30., 60. illetve 90. percében 50 μM BAPTA-AM-t adtunk. A sejtek dCK-aktivitását a kétórás inkubálás leteltével mértük és a nem kezelt kontroll aktivitás százalékában fejeztük ki (39. ábra, szaggatott vonal). Eredményeink szerint a BAPTA-AM – a CdA folyamatos jelenléte ellenére – szignifikánsan csökkentette a hozzáadása pillanatában mérhető enzimaktivitást (példának okáért 255%-ról 125%-ra, ha a 60. percben adtuk; lásd a megfelelő szaggatott görbét). Ez azt mutatja, hogy a BAPTA-AM hozzáadásával nemcsak azt sikerült megakadályozni, hogy a CdA teljes mértékben aktiválja az enzimet a kétórás inkubálás során, hanem a hozzáadás pillanatáig elért aktiváció mértéke is jelentősen csökkent. Az a megfigyelés, hogy a 90. percben adott BAPTA-AM kevésbé volt hatékony, mivel csak 30 perc maradt hatása kifejtésére, részben annak is tulajdonítható, hogy a BAPTA-AM intracelluláris észterázok által történő hasítása valamennyi időt szintén igényel [92].
5.6.2.
A
kalcium
permisszív
szerepet
játszik
a
dezoxicitidin-kináz
aktiválódásábanVII A szabad kalciumszint dCK-aktivitásra gyakorolt gátló hatásának jellemzése után azt vizsgáltuk meg, hogy a citoszol kalciumszintjének emelkedése önmagában képes-e aktiválni az enzimet. Az intracelluláris kalciumraktárak kiürítésére a szarkoendoplazmás retikulum Ca2+-ATPáz (SERCA) hatékony gátlószerét, a thapsigargint használtuk [169], azonban sem a dCK alap-, sem CdA-val stimulált aktivitása sem növekedett a szer hatására (40. ábra). A thapsigargin 2 mM-os koncentrációja mellett megfigyelt aktivitás-csökkenés valószínűleg a thapsigargin transzmembrán kalciumcsatornákra gyakorolt gátló hatásával és a következményes intracelluláris kalciumszintcsökkenéssel magyarázható [170]. A fentiekkel összhangban, a sejtmembrán-Na+/K+-ATPáz-inhibitor strofantinnal és a kalcium-ionofór ionomycinnel végzett sejtkezelések sem eredményezték a dCK aktivitásának fokozódását. Ezen megfigyelések a kalciumnak a dCK aktiválódásában betöltött permisszív szerepére utalnak: a fiziológiás intracelluláris kalcium-koncentráció
86
a
dCK
megfelelő működéséhez, azonban a kalciumszint emelkedése önmagában nem képes az enzim aktivitásának fokozására.
enzimaktivitás a kontroll %-ában
elengedhetetlen
250 200 150 100 50
40. ábra. Thapsigargin hatása tonzilla - limfociták dCKaktivitásáraVII Primer sejtkulCdA (2 μM) — — — — — — — + + + + túrákat a thapsigargin (világos — 0,05 0,5 2 oszlopok), illetve a thapsigar- thapsigargin (μM) — 0,01 0,02 0,05 0,1 0,5 2 gin és CdA (sötét oszlopok) feltüntetett koncentrációi mellett 2 órán át inkubáltunk, majd a nyerskivonatból dCKaktivitást mértünk. A kezeletlen kontroll aktivitás (100%): 3,32 ± 0,07 pmol dCMP/ 106 sejt/ perc.
5.6.3. A kalcium a dCK-aktivitásnak nem kofaktoraVII Fontosnak tartottuk annak tisztázását, hogy a kalcium a dCK kofaktoraként viselkedik-e. Habár sem a sejtek feltárásához használt extrakciós puffer, sem pedig az enzimaktivitás-mérés puffere sem tartalmazott kalciumot, elméletileg fennáll az a lehetőség, hogy a dCK a sejten belül kalciumot köt, vagy egy kalciumkötő fehérjével olyan komplexet képez, amely a sejtek feltárása során megőrzi épségét, és az in vitro kinázreakcióban az enzim aktivitását biztosítja. Hogy az esetlegesen az enzimhez kötött kalciumot elvonjuk, a dCK reakciópufferébe 50 μM BAPTA-AM-et tettünk annak ismeretében, hogy a BAPTA kalciumkötő affinitása nagyságrendekkel meghaladja az ismert kalciumkötő fehérjékét. A BAPTA-AM jelenlétében azonban változatlan dCKés TK1-enzimaktivitásokat mértünk mind a kontroll, mind a CdA-val kezelt sejtkivonatokból, ami azt is bizonyítja, hogy a BAPTA-AM sejtkezeléskor tapasztalt, enzimaktiválódást kivédő hatása nem a dCK közvetlen gátlásának az eredménye. Azon eshetőség kizárására, hogy a sejt észterázai esetleg nem működőképesek a kinázreakció körülményei között és a BAPTA-AM prekurzor formában marad, a fenti kísérletet a reakcióelegyhez adott EGTA-val is megismételtük és ugyanazt az eredményt kaptuk (41. ábra). Ezek alapján leszögezhető, hogy a dCK katalitikus aktivitásához a kalciumra közvetlenül nincsen szükség, azaz a Ca2+ a dCK-nak nem kofaktora.
87
dCK aktivitás a kontroll %-ában
443. 1 . ábra. A dCK enzimaktivitásához a kalcium közvetlenül nem szükségesVII 2 μM CdA-val kezelt, illetve nem kezelt tonzilla - limfocitákból nyerskivonatokat készítettünk. Az extraktumok dCK- és TK1-aktivitásait a megfelelő kinázreakcióelegybe tett 500 μM EGTA jelenlétében (sötét oszlopok), illetve EGTA nélkül (világos oszlopok) is meghatároztuk. Kontroll aktivitások (100%): : dCK-ra: 3,09 ± 0,04 pmol dCMP/ 106 sejt/ perc; TK1-re: 0,79 ± 0,05 pmol dTMP/ 106 sejt/ perc.
TK1
300
200
100
CdA
— — EGTA — +
+ + — +
— — — +
+ + — +
5.7. A dCK aktiválódását fokozott ellenanyag-kötés kíséri 5.7.1. Az enzimaktivitás és a konformációs állapot összefüggéseiVII Denaturáló western blottal kimutattuk, hogy a dCK-fehérje mennyisége a BAPTA-AM-mel kezelt sejtek kivonataiban ugyanannyi, mint a kontroll vagy a CdAval, illetőleg aphidicolinnal stimulált sejtekében (42/A. ábra). Pozitív kontrollként a trombinnal emésztett rekombináns dCK feltüntetett mennyiségeit használtuk. A dCKaktivitásokban mért jelentős eltéréseket (42/D. ábra) tehát ebben az esetben sem magyarázhatta az enzim megváltozott expressziója (vö. a 27. és 28. ábrákkal). Meglepő módon egy teljesen más profilt kaptunk akkor, amikor ugyanazokat a sejtkivonatokat natív körülmények között futtattuk és blottoltuk. A sávok egyöntetű intenzitása helyett egyenes arányosság fedezhető fel az adott sejtkivonat enzimaktivitása és a natív western blotton az anti-dCK-antitesttel azonosított sávok intenzitása között (42/B. ábra). A BAPTA-AM-mel kezelt sejtek kivonatából nagyon gyenge antitestkötődési jelet észleltünk, míg a CdA-val és az aphidicolinnal kezelt sejtek extraktumai adták a legerősebb szignált. Az SDS-blot viszont minden mintában ugyanannyi dCKfehérjét mutatott ki. Ez az ellentmondás annak ismeretében oldható fel, hogy natív körülmények között az immunreaktív jel intenzitása nemcsak a fehérje mennyiségét, hanem az antitestnek az epitophoz való hozzáférését is tükrözi. Mivel a fehérjemennyiség minden mintában ugyanannyi volt, a natív blotton észlelt különbségek a dCK megváltozott konformációjának és a C-terminális epitop – amellyel szemben az
88
antitest készült – módosult hozzáférhetőségének a következményei lehettek. Megjegyzendő, hogy a denaturáló blot ábrán bemutatott felvételének expozíciós ideje (15 mp) jóval rövidebb volt a natív felvételénél (5 perc), ami kísérletes bizonyítékát adja annak, hogy a dCK tökéletesen denaturált konformációjában az epitop az antitest számára sokkal inkább hozzáférhető, mint natív állapotban.
dCK aktivitás (%)
denaturáló western blot 42. ábra. Összefüggések a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dCK aktivitása és natív 30 kDa immunreaktivitása köA zöttVII Humán tonzilla-limnatív blot focitákat két órán keresztül 1 2 3 4 5 6 7 8 9 natív inkubáltunk az alábbiak Coomassie szerint (a felsorolt számok festés az A, B és D ábrarészek jelölésének felelnek meg): 4: kezeletlen kétórás kontroll; 5: 2 μM CdA; 6: 2 B C μg/ml aphidicolin; 7: 2 μM 300 CdA + 50 μM BAPTAAM; 8: 2 μg/ml aphidicolin 200 + 50 μM BAPTA-AM; 9: 100 50 μM BAPTA-AM. Az inkubálást D követően sejtkivonatokat 4 5 6 7 8 9 készítettünk, amelyek fehérjekoncentrációját 5 μg/μl-re állítottuk be, majd minden kivonatból 25 – 25 μg fehérjét futtattunk és blottoltunk mind denaturáló („denaturáló western blot”; 15” exponálás), mind pedig natív körülmények között („natív blot”; 5 perces exponálás). Az 1 – 3. sávokban 30, 20, illetve 10 ng rekombináns dCK-t futtattunk. „C” részábra: 20 μg humán tisztított dCK-t 12%-os natív poliakrilamid-gélen futtattunk és Coomassie Brilliant Blue-val festettük. „D” részábra: a 4 – 9. pontok szerint kezelt sejtek nyerskivonatából mért dCK-aktivitások a kezeletlen kontroll (4) értékének (3,32 ± 0,07 pmol dCMP/ 106 sejt/ perc) %-ában kifejezve.
Natív körülmények között a dCK-specifikus antitest nem ismerte fel a rekombináns dCK-t (42/B. ábra, 1 – 3. sávok), tehát a pozitív kontroll hiányában nem lehettünk egészen biztosak abban, hogy a sejtkivonatból azonosított fehérje valóban a dezoxicitidin-kináz. A szignál specificitásának bizonyítására a humán léptumorból tisztított dCK [37] 20 μg-nyi mennyiségét futtattuk 12%-os natív gélen és Coomassie Brilliant Blue-val festettük meg (42/C. ábra). Két sáv festődött a fehérje dimer és monomer alakjának megfelelően. Mivel a „B” és „C” gélek összetétele és futtatási paraméterei tökéletesen megegyeztek, valamint a western blottal és a fehérjefestéssel megjelenített sávok elektroforetikus mintázata is teljes mértékben azonos volt, megállapítható, hogy a natív western blottal azonosított fehérje minden valószínűség
89
szerint a dCK. A 42/B. ábráról az is leolvasható, hogy az alkalmazott kezelésektől függetlenül a dCK domináns formája a dimer volt (felső sáv), és nem figyelhető meg jelentős átrendeződés a monomer/dimer formák arányában. Annak is megpróbáltunk utánajárni, hogy natív körülmények között miért nem láttunk kölcsönhatást a rekombináns dCK és az antitest között. A rekombináns és a tisztított humán dCK epitopjának hozzáférhetőségét dot-blot immunfestés segítségével hasonlítottuk össze natív, redukáló és denaturáló körülmények között. Mindkét fehérjepreparátum azonos mennyiségű dCK-fehérjét tartalmazó egy-egy mintáját 8,8-as pH-jú Tris-HCl pufferben tartottuk (43. ábra: „natív”), 100 mM-os DTT-vel kezeltük („+DTT”), illetve kombinált hő- és kémiai denaturációnak vetettük alá („+SDS”). Amint a 43. ábra mutatja, az antitest a natív és a DTT-vel kezelt humán enzimet egyenlő mértékben ismerte fel, míg a
natív
+ DTT
+ SDS
maximálisan denaturált fehérje jóval erősebb jelet adott. Ezzel
rekombináns dCK
szemben a rekombináns fehérje egyáltalán
nem
hozott
létre
immunkomplexet az antitesttel, ám
denaturált
állapotában
(„+ SDS”) a denaturált humán dCK-val megegyező mértékben kötötte
az
jegyezném
antitestet. meg,
hogy
Itt a
kísérlethez használt rekombináns dCK-preparátum aktivitása
a
humán
specifikus tisztított
enzim aktivitásának csupán 1/5
humán tisztított dCK
45. ábra. Különböző dCK-fehérjepreparátumok 43. immunfestéseVII 20 – 20 ng rekombináns dCK-t, illetve tisztított humán dCK-t tartalmazó egy – egy fehérjemintát 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltunk 75 mM-os, 8,8 pH-jú Tris-HCl pufferben (“natív”), 100 mM-os DTT-ben (“+DTT”), illetve 60 mM pH 6,8 Tris-HCl, 100 mM DTT és 2% SDS tartalmú oldatban (“+SDS”). Ezt követően az SDS-t tartalmazó mintákat 2 percig forraltuk, majd a többi mintával együtt az ábráról leolvasható elrendezésben nitrocellulóz membránra cseppentettük és beszárítást követően a dCK-specifikus antitesttel western blottot végeztünk (előhívás: 10 perc).
része volt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a dezoxicitidin-kináz legalább két különböző konformációs állapotban létezhet, amelyekhez eltérő katalitikus aktivitás rendelhető, továbbá az enzim aktivitása és az epitop hozzáférhetősége között összefüggés van. A rekombináns enzim natív körülmények között olyan kompakt
90
konformációt vesz fel, amelynek aktivitása minimális, és epitopja csak denaturált állapotban hozzáférhető az antitest számára.
5.7.2. A konformációs változás követése limitált proteolízisselII A fehérjék térszerkezetében bekövetkező változások gyakran járnak együtt a proteázokkal szemben mutatott rezisztenciájuk megváltozásával. A natív immunfestés során észlelt konformáció-változás tényét kontroll és CdA-val kezelt sejtek nyerskivonatainak részleges tripszinizálásával és a keletkező dCK-fragmentek western blottal való azonosításával is alátámasztottuk (44. ábra). Habár a két emésztési mintázat nagyon hasonló, a CdA-val aktivált dCK fragmentálódása időben elhúzódó. A kezeletlen sejtekből izolált enzim emésztése már egy percen belül megindult, amint azt a két alacsonyabb molekulatömegű peptid megjelenése mutatja, melyek közül a felső fragment kilencperces emésztés nyomán teljesen eltűnt. Ezzel szemben az aktivált dCK emésztése során ugyanezek a történések jóval később, a 3. és a 45. percben következtek be. Az itt megfigyelt emésztési mintázat valószínűleg a dCK amino-terminálisához legközelebb található bázikus szigeteknél (6KR7 és
17
RGTRIKK23) történő hasítás
eredménye. Az aktivált enzim fokozottabb tripszin-rezisztenciája is arra utal, hogy a dCK aktiválódását stabil konformáció-változás kíséri.
31 kDa
0’ 1’ 3’ 9’ 15’ 45’
0’ 1’ 3’ 9’ 15’ 45’
CdA
kontroll
44. ábra. A dCK térszerkezetének vizsgálata limitált proteáz-emésztésselII 2 μM CdA-val kezelt, illetve kontroll limfociták nyerskivonatait 2 μg tripszinnel emésztettük a feltüntetett ideig. A reakciókat 8 μg tripszin-inhibitorral állítottuk le, majd a mintákból dCKellenanyaggal western blottot készítettünk.
91
5.7.3. A konformáció-változás valószínűleg reverzibilis fehérje-foszforiláció következménye A fehérje-foszforiláció és a dCK-aktiválódás
kapcsolatának
5.4.
tárgyalt
fejezetben hogy
a
dCK
feltételezett kezelt
sejtek
rekombináns
kivonatait
λ-protein-foszfatázzal
kezeltünk, majd az emésztett és emésztetlen
mintákat
natív
gélen
futtattuk és anti-dCK ellenanyaggal blottoltuk.
A
8,82
kontroll
CdA
kontroll
CdA
+ λ protein foszfatáz 446. 5 ábra. λ- protein-foszfatáz-kezelés hatása a natív
foszforilációja dCK immunreaktivitásáraVII A 2 μM CdA-val
szerepet játszhat-e. Kontroll és CdAval
5,41
aktívabb
konformációjának kialakulásában az enzim
10,20
közvetett
bizonyítékaira támaszkodva megvizsgáltuk,
1,00
az
45.
ábrán
jól
kezelt, illetve nem kezelt sejtek nyerskivonatait kettéosztottuk (25 – 25 μg összes fehérje), hozzáadtuk a λ- protein-foszfatáz-reakció reagenseit, de a 400 U foszfatázt csak az egyik mintasorozathoz tettük hozzá. Az összes mintát 30 percig inkubáltuk 30 ºC-on, majd anti-dCK ellenanyaggal natív western blottot készítettünk belőlük. A foszfatázzal kezelt minták felvétele 10 perces, a nem kezelteké 1 perces expozícióval készült. A feltüntetett számok az egyes sávok denzitometriával meghatározott relatív intenzitásaira utalnak.
megfigyelhető, illetve a denzitometrálás adataiból is nyilvánvaló, hogy a foszfatázzal nem
kezelt
kivonatok
jelintenzitásai
között
fennálló
kifejezett
különbség
foszfatázkezelés hatására jelentősen csökkent (az 1:10,20-os arány 5,41:8,82 = 1:1,63-ra változott). Annak ismeretében, hogy a foszfatázzal kezelt mintákból készült blot expozíciós ideje 10 perc, míg a nem kezeltekből készülté csupán 1 perc volt, megbecsülhető, hogy foszfatáz-kezelés hatására a kontroll enzim jelintenzitása közel felére, a CdA-val aktivált enzimé körülbelül a tizedére csökkent. Ezek az adatok azt mutatták, hogy az antitest-kötés intenzitásában észlelt különbség – legalábbis nagyrészt – az enzim foszforilációjának tulajdonítható, és a kezeletlen sejtekből preparált dCK is részben foszforilált állapotban volt.
92
6. MEGBESZÉLÉS
A DNS-replikáció, -rekombináció és -hibajavítás finoman szabályozott reakciói akkor működhetnek tökéletesen, ha a dezoxiribonukleotid-prekurzorok folyamatos utánpótlása biztosított. Újabb kutatások szerint az emlős-sejtek dNTP-ellátottsága és a nukleotid-poolok
egymáshoz
viszonyított
aránya
a
DNS-replikáció
aktív
kezdőpontjainak kiválasztásában is meghatározó tényező [171]. Az osztódó sejtek dezoxiribonukleozid-trifoszfát-igényének
döntő
hányadát
az
S-fázis-specifikus
ribonukleotid-reduktáz fedezi [172], nyugvó sejtekben azonban – így a limfoid szövetek és a központi idegrendszer sejtjeiben – a nukleozid-mentő reakciók kerülnek előtérbe a DNS katabolizmusából származó, illetve az egyes nukleozid-membrántranszportereken keresztül felvett nukleozidok újrahasznosítása révén. A dezoxiribonukleozid-kinázok prominens képviselője a dezoxicitidin-kináz, amely széles szubsztrátspecificitásánál fogva a névadó dezoxicitidinen és a két purin-dezoxinukleozidon túl a leukémiák, szolid tumorok és retrovirális fertőzések kemoterápiájában használt nukleozid-analógok széles skáláját is nagy hatékonysággal foszforilálja [12, 21]. Számos daganatban emelkedett dCK-expresszió és -enzimaktivitás mérhető [57], és összefüggést találtak a tumor kemoterápiás érzékenysége és dCK-aktivitása között [31 – 35, 61 – 64]. A dCK-hiányos és nuleozid-analógokra rezisztens daganatok kemoterápiás érzékenysége drámai módon javítható a vad típusú dCK cDNS-ének bevitelével [66]. Nemrégiben fejlesztették ki a dCK egy genetikailag módosított változatát, amelynek katalitikus aktivitása sokszorosan meghaladja a vad típusú enzimét, és génterápiás felhasználásához is nagy reményeket fűznek [41]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a dCK aktivitása – sok más egyéb faktor mellett – a kemoterápia hatékonyságát döntő módon meghatározza. Az enzim aktiválódásának körülményeire és molekuláris mechanizmusára irányuló kutatásoknak a klinikai gyakorlat szempontjából tehát komoly jelentősége és létjogosultsága van, mivel a legtöbb tumor számottevő dCK-aktivitással rendelkezik, ami citosztatikumokkal és gamma-besugárzással jelentősen fokozható, míg a génterápia alkalmazásának útjában még számos megoldatlan elméleti és gyakorlati akadály áll.
93
6.1. A dezoxicitidin-kináz aktiválódása citotoxikus nukleozidok hatásáraI, II, III, IV A dCK által aktivált 2-klór-2’-dezoxiadenozin és az arabinozil-citozin különösen hatékonynak bizonyult egyes leukémiák kezelésében [12, 21]. A CdA-t és az araC-t kombinációs terápiában alkalmazó Gandhi és munkatársai azt figyelték meg, hogy ha az araC-kezelésre a CdA-val történő előkezelés után került sor, akkor az aktív intracelluláris intermedier, az araCTP mennyisége közel másfélszeresére emelkedett a kezelt betegek fehérvérsejtjeiben [173]. Ebből az következik, hogy CdA hatására a sejtek araC-foszforilációs kapacitása megnövekedett, vélhetőleg a dCK aktivitásának fokozódása miatt. Ezen megfigyelés nyomán munkacsoportunk kimutatta, hogy a tonzillából és perifériás vérből izolált limfociták primer kultúráinak rövidtávú CdAkezelése a sejtek dezoxicitidin-foszforilációs kapacitásának jelentős emelkedéséhez vezet, amely jelenség hátterében egyértelműen a dCK aktiválódása áll [140]. A CdA-kezelés a másik három dezoxinukleozid-kináz, a citoplazmában található TK1 és a mitokondriális elhelyezkedésű TK2 és dGK aktivitását nem befolyásolta (7. és 8. ábra). Ugyanez mondható el a dCK funkcionális antagonistáiról, az 5’nukleotidázokról,
valamint
a
dezoxipirimidin-nukleotidok
egymásba
történő
átalakulásának első lépését katalizáló dezoxicitidilát-dezaminázról is (3. táblázat). Az a tény, hogy a dCMP-dezamináz aktivitása még a stimulált dCK aktivitását is több mint egy nagyságrenddel meghaladja, a dezoxicitidin-nukleotidok timin-nukleotidokká való átalakulási útvonalának nagy kapacitását támasztja alá. Ez a megfigyelés összhangban van azzal az adattal, hogy a dCK által foszforilált dezoxicitidin 75%-a timinnukleotidok szintézisére fordítódik [15]. Az általunk vizsgált sejtek dCK-aktivitása szinte minden esetben jelentősen meghaladta a TK-izoenzimek összaktivitását (15., 18., 20., 25., 29-31., 38. és 41. ábra), tehát a dCK a „salvage” timidilát-szintézisben legalább akkora szerepet játszik, mint a két timidin-kináz együttesen. Ennek élettani jelentőségét az a kísérleti eredményünk is alátámasztja, hogy a timin-dezoxinukleotidok szintjének csökkenéséhez vezető dT-5’-TS-kezelés a dezoxicitidin-kináz aktivitásának jelentős növekedését eredményezi (19-20. ábrák). A timidin-kináz-1 aktivitása ugyanakkor változatlan maradt, tehát feltételezhetjük, hogy a timin-nukleotidok hiányát is a dCK aktivitásának emelkedése hivatott kompenzálni. A timidin-5’-tioszulfát fiziológiás pH-n
94
egy negatív töltést hordoz, így a sejtbe nem kerülhet be. Az intracelluláris timinnukleotid-hiányt (22/B. ábra) tehát minden valószínűség szerint a membrán timidintranszporterének gátlásán keresztül hozza létre. Eközben a citozin-dezoxinukleotidok mennyisége
viszont
megnövekszik
(21/B.
ábra),
ami
a
dCK
aktivitásának
emelkedésével jól magyarázható. A citidilát – timidilát átalakulás és a dCK aktiválódásának kapcsolatát egy további példával is szeretném illusztrálni. Taub és munkatársai figyeltek fel arra, hogy az akut mieloid leukémiában szenvedő Down-szindrómás gyerekek sokkal jobban reagáltak az araC-kezelésre, mint a nem Down-szindrómás társaik. A fokozott araCérzékenység hátterét kutatva azt találták, hogy a Down-szindrómában és egyidejűleg AML-ban szenvedő betegekből izolált mieloblasztokban a 21-es kromoszómán lokalizált gének közül a cisztationin-β-szintáz mRNS-szintje 12-szer volt magasabb, mint a leukémiás, de nem Down-kóros mieloblasztokban mérhető érték. Érdekes módon a dCK mRNS-szintje is 2-3-szor magasabb volt, pedig a dCK génje nem a 21-es kromoszómán található [24, 174]. További vizsgálataik során a cisztationin-β-szintáz cDNS-ét CCRF-CEM-sejtekbe transzfektálták, aminek hatására a sejtek araCérzékenysége 15-szörösére, a jelzett araC és dFdC metabolizmusa 8,5-szeresére, a dCK aktivitása
pedig
22-szeresére
növekedett,
miközben
a
dCK
mRNS-
fehérjemennyisége lényegében nem változott [175]. Ezek az eredmények egyrészt
metionin SAH
megerősítik arra vonatkozó
homocisztein
saját adatainkat, hogy a dCK aktivitása
az
mennyiségének nélkül
is
N5-CH3-THF szerin
enzimfehérje növekedése
THF
HMT
N5, N10-CH2THF
CBS cisztationin glicin
jelentősen
dUMP
THF DHF
TS
emelkedhet a sejteket érő dTMP
stressz hatására (27., 28., 42/A.
ábra),
másrészt
–
véleményem szerint – újabb bizonyítékát annak,
hogy
szolgáltatják a
timin-
46. 47. ábra. A timidilát-bioszintézis, a folát- és a metilációs ciklus összefüggései Rövidítések: TS, timidilát-szintáz; CBS, cisztationin-β-szintáz; HMT, homocisztein-metiltranszferáz; DHF/THF, dihidro/tetrahidrofólsav; SAH, S-adenozil-homocisztein.
95
és
nukleotid-hiányos állapot a dCK-aktiválódás egyik lényeges faktora lehet. A cisztationin-β-szintáz a cisztein-bioszintézis egyik enzime, a szerin és a homocisztein kondenzációját katalizálja. Az enzim túltermeltetése esetén a homocisztein mennyisége erősen csökken, ennek következtében elakad a metilációs ciklus, mert a homociszteinmetiltranszferáz a szubsztrát hiányában nem tud metionint képezni, illetve a metildonor N5-metil-tetrahidrofólsav felhalmozódik (46. ábra). Ez az állapot a homociszteinmetiltranszferáz-enzim hiányára is jellemző „folátcsapdához” vezet, amikor az N5metil-tetrahidrofólsav nem tud továbbalakulni és feltehetően a többi C1-töredék szállítása is elégtelenné válik. Ilyenkor a timidilát-szintáz sem képes megfelelően működni az N5, N10-metilén-tetrahidrofólsav-kofaktor hiánya miatt, s az ennek nyomán fellépő timidilát-hiány a dNTP-poolok egyensúlyának felborítása révén („pool imbalance”) DNS-károsodást okoz, ami – többek között – a dCK aktivitásának emelkedését eredményezheti. A timin-nukleotid-hiány esetén fellépő DNS-károsodást a timidilát-szintáz működését közvetlenül gátló 5-fluor-dezoxiuridin alkalmazása [176], illetve kísérletesen előidézett foláthiány kapcsán is megfigyelték [177]. Minden bizonnyal a poolok egyensúlyának megzavarásával (21/B. és 22/B. ábra) és a következményes DNS-károsodással magyarázható tehát a dT-5’-TS dCK-aktivitást emelő hatása is. A nukleozid-analógokkal kiváltható dCK-aktiválódást tonzilla limfociták G-, illetve S-fázisú sejtekben feldúsított frakcióin, illetve más eredetű limfocitákon vizsgálva arra a következtetésre jutottunk, hogy a nyugvó sejtek dCK-aktivitása alacsonyabb, ám jóval nagyobb mértékben stimulálható, mint a magasabb osztódási rátát mutató sejtpopulációké (7. és 10. ábra). Elképzelhető, hogy a timuszsejtekre és az S-fázisú tonzilla-limfocitákra jellemző magas dCK-alapaktivitás azt jelzi, hogy az enzim az aktivált konformációjában működik, ami a sejtek CdA-kezelésével tovább már nem, vagy csak kismértékben fokozható. Ugyanakkor nem zárható ki, hogy az osztódó sejtekben működőképes ribonukleotid-reduktáz annyira feltölti a sejt dNTP-készleteit, hogy ezzel a dCK aktiválódását megakadályozza, illetve hátráltatja. Látszólag ez utóbbi mechanizmust támogatják azok a megfigyelések, hogy a dezoxicitidin-kináz által aktivált nukleozid-analógokra rezisztens sejtvonalak némelyikében kiugróan magas ribonukleotid-reduktáz-aktivitások mérhetők [178 – 181]. A ribonukleotid-reduktáz aktivitásának gyógyszeres gátlásával viszont sikerült helyreállítani az araC-re rezisztens
96
HL60-sejtek érzékenységét [182]. A ribonukleotid-reduktáz és a dezoxicitidin-kináz aktivitásainak reciprok szabályzására utal az a megfigyelés is, hogy a ribonukleotidreduktáz-inhibitor hidroxiurea a dCK által foszforilált nukleozid-analógok toxicitását jelentősen fokozza [183]. Az egészséges donorból, illetve a krónikus limfoid leukémiában szenvedő páciensből izolált vérlimfociták dCK-aktivitása jelentős és közel azonos mértékben fokozódott CdA-kezelés hatására, míg az általunk vizsgált transzformált sejtvonalak közül csak a HL60 dCK-aktivitása volt stimulálható (11-12. ábra). Ezek a különbségek a normál sejtekben jól működő aktivációs mechanizmus károsodására utalhatnak, ami összefüggésben lehet az egyes sejttípusok differenciáltságával. Ismert, hogy a CLL egy klonális eredetű, érett B-limfociták felhalmozódásával járó indolens limfoproliferatív betegség, ahol a sejtek morfológiája és biokémiai markerei sem különböznek jelentősen a normál sejtekéitől [184], így kevéssé meglepő, hogy a két sejtpopuláció dCKaktivitása hasonló mértékben fokozható. Az enzim purin- és pirimidin-szubsztrátanalógjainak összehasonlító vizsgálata rávilágított a dezoxiadenozin-származékok kifejezettebb aktiváló képességére a dezoxicitidin-analógokkal szemben (13-14. ábra). Ugyanakkor nem találtunk jelentős eltérést a CdA és a dFdC hatásmechanizmusában a DNS-szintézisre gyakorolt gátló hatásaik között (15. ábra). Régóta ismert tény, hogy a dCTP in vitro a dCK feedback inhibitora [54]. Mivel a CdA, az FaraA és a CAFdA trifoszfátjai a ribonukleotidreduktáz aktivitását erősen gátolják in vitro [85, 185, 186], elképzelhető lenne, hogy a dNTP- (és kimondottan a dCTP-) poolok csökkenése lehet a dCK-aktiválódás kiváltó oka. (In vitro mérések szerint a dCTP a dCK aktivitását már mikromólos koncentrációkban is gátolja [110], a tonzilla limfocitákban mért dCTP-mennyiséggel (3,0 – 5,7 pmol/ 106 sejt; 5. táblázat) számolva pedig 10 μM körüli effektív intracelluláris koncentráció adódik). Azonban több érv is ezen elmélet ellen szól. Egyrészt a csak S-fázisban aktív ribonukleotid-reduktáz gátlásán alapuló modell nem magyarázhatja a CdA nyugvó sejtekre (G-fázisú tonzilla-limfocitákra és perifériás vérlimfocitákra) kifejtett erőteljes dCK-aktiváló hatását, másrészt az általunk alkalmazott in vitro enzimaktivitás-mérés során egy feltételezett allosztérikus modulátor koncentrációja részben a sejtek feltárása, részben a nyerskivonat hígítása során több nagyságrenddel
csökkenne,
így
fiziológiás
97
funkcióját
nem
tudná
betölteni.
Munkacsoportunk az allosztérikus aktiváció lehetőségét a dCK részleges tisztításával is kizárta [154]. Az egyik természetes szubsztráttal, a dezoxiadenozinnal is kiváltható enzimaktiválódás ismételten rámutatott a halogénezett dezoxiadenozin-származékoknak a dCK aktiválódásában játszott kitüntetett szerepére. Kiderült, hogy a hangsúly a szerkezeti hasonlóságon van, hiszen az adenozin-dezamináz dezoxicoformycinnel való gátlásával pontosan az a hatás érhető el, mint az adenozin-dezaminázra rezisztens analógok alkalmazásával. Kísérleteink során a sejtekhez kívülről adott dezoxiadenozin még nagy koncentrációban sem aktiválta az enzimet, amit az adenozin-dezamináz hatásával magyarázhatunk. Annak lehetősége, hogy a dezoxiadenozin esetleg be sem jutott a sejtekbe, azzal zárható ki, hogy az adenozin-dezamináz gátlása önmagában nem fokozta a dCK aktivitását, az egyidejűleg kívülről adott dezoxiadenozin viszont a dCKaktivitás látványos emelkedését eredményezte (18/A. ábra). Ugyanakkor felmerül a kérdés, hogy az önmagában alkalmazott dezoxicoformycin miért nem stimulálta az enzimet. Habár kimutatták, hogy a dezoxicoformycin a limfociták ADA-aktivitását már 10 μM-os koncentrációban is teljesen felfüggeszti [187], a mi kísérleti rendszerünkben még tízszer ekkora koncentrációja sem fokozta a dCK aktivitását (18/A. ábra). Viszont több kutatócsoport is leírta, hogy a mi rendszerünkkel analóg in vitro [188] és in vivo [189] kísérleteik során a várt limfotoxikus hatás eléréséhez a dCF önmagában nem, hanem csak dezoxiadenozinnal kombinálva volt elegendő. A mi esetünkben az ok valószínűleg az lehet, hogy a ribonukleotid-reduktáz aktivitásának hiányában – nyugvó sejtekről lévén szó – a citoplazmában olyan alacsony a dezoxiadenozin és a dATP mennyisége, hogy az még az adenozin-dezamináz gátlása esetén sem emelkedik a dCK aktiválódását kiváltó szintre, legalábbis a kétórás inkubációs periódus során nem. Egy további, meggyőző példa: Ganeshaguru és munkatársai kimutatták, hogy a 10 μM dCF és 100 μM dezoxiadenozin kombinációjával inkubált hajas sejtes leukémia-sejtek és Bsejtes krónikus limfoid leukémia-sejtek dATP-mennyisége már kétórás kezelést követően a 30 – 40-szeresére emelkedett [190]. Régóta ismert, hogy az adenozin-dezamináz hiánya esetén a limfociták citoplazmájában felhalmozódó dATP a toxikus metabolit [87]. Jogosan feltételezhetjük tehát, hogy a dCK aktiválódása közrejátszik az adenozin-dezamináz veleszületett hiányában kialakuló súlyos kombinált immunhiányos tünetegyüttes (SCID) kórtanában is. A felhalmozódó
98
dezoxiadenozin és dATP a DNS károsítása révén a dCK-t aktiválja [84], ennek nyomán egyre több dATP keletkezik, ami a tünetek súlyosbodását vonja maga után. A dATP szintje azonban nemcsak CdA-kezelés, hanem etopozid és aphidicolin hatására is megemelkedik a sejtekben (5. táblázat), ami arra utalhat, hogy ez a toxikus nukleotid a különböző szerekkel kiváltható dCK-aktiválódás közös mediátora. Nem egyértelmű azonban az, hogy a dATP koncentrációjának növekedése a dCK aktiválódásához vezető általános mechanizmus része-e, avagy a dCK aktiválódásának a következménye annak révén, hogy az aktivált enzim preferált szubsztrátja a dezoxiadenozin lesz. A dezoxicitidinnek a CdA-val és araC-vel kiváltható dCK-aktiválódást felfüggesztő hatása jól magyarázható azzal, hogy a dezoxicitidin a nukleozid-analógok foszforilációját kompetitíven gátolja [38]. Dezoxicitidinnel viszont a dT-5’-TS-tal (20. ábra), sőt a tirozin-kináz-inhibitorokkal kiváltható enzimaktiválódás is felfüggeszthető (az adatok nincsenek ábrán bemutatva), ami a fenti mechanizmussal nyilvánvalóan nem indokolható. Már a dCK korai enzimológiai vizsgálata során kiderült, hogy a dezoxicitidin foszforilációja bifázisos kinetikát követ, ennek megfelelően két Michaeliskonstans létezik [54]. Az alacsony KM értékére 1 μM, a magas KM-re sejttípustól függően 15 és 25 μM közötti érték adódott in vivo [191]. (A dCK purin-nukleozidszubsztrátjai viszont monofázisos kinetika szerint foszforilálódnak [192]). Eriksson és munkatársai kimutatták, hogy a magas KM-közeli dezoxicitidin-koncentrációknál a szubsztrát bekötődésének hatására a dCK térszerkezeti változáson megy keresztül, amit cirkuláris dikroizmus-vizsgálatokkal is megerősítettek [193]. Valószínűleg ezzel a konformációs változással magyarázható, hogy a limfociták növekvő koncentrációjú dezoxicitidinnel történő kezelése a dCK-aktivitás fokozatos csökkenéséhez vezet (17. ábra), illetve nagymennyiségű (100 μM) dezoxicitidin jelenlétében az enzim nem aktiválható (20. ábra). Ez a szubsztrát-indukálta konformáció-változás természetesen nem azonos az általunk leírt, natív antitest-kötéssel és proteáz-emésztéssel azonosított térszerkezeti változással, amelyet feltételezésünk szerint a dCK foszforilációja idéz elő (42-45. ábra). Ezek a megfontolások arra utalnak, hogy a dezoxicitidin bekötődése nyomán olyan változás következik be az enzim szerkezetében, ami a dezoxicitidinkináz-fehérje másodlagos módosítását megakadályozza.
99
Az elmondottak értelmében a dezoxicitidin sejtvédő hatást fejt ki adenozindezamináz-hiányos
limfocitákban
a
toxikus
dezoxiadenozin-nukleotidok
felhalmozódásának megakadályozásával [194], illetve CdA-val és egyéb citotoxikus szerekkel kezelt sejtekben a nukleozid-analógok foszforilációjának felfüggesztésével [195, 196], sőt bizonyos hormonok és enzimek szintézisét a transzkripció szintjén is gátolhatja [197].
6.2. A DNS-károsodás és az enzimaktiválódás összefüggéseiI, II, III, V A klasszikus felfogás szerint a nukleozid-analóg típusú citosztatikumok hatásmechanizmusának alapja a DNS-szintézis gátlása, amelyet részben a DNSpolimerázok enzimaktivitásának gátlásával, részben a szintetizálódó láncokba történő beépüléssel és lánctörések előidézésével, illetve láncterminációval váltanak ki [21]. A CdA és a dFdC DNS-szintézist gátló hatása már alacsony koncentrációban és nagyon rövid inkubációs idő után is megnyilvánul, amit jelölt nukleozidok DNS-be való beépülésének követésével mutattunk ki ([140] és 15. ábra). A nukleozid-analógoknak azonban számos más hatása is ismert, a nukleozid-metabolizmus enzimeinek gátlásától kezdve a nukleotid-poolok arányainak megváltoztatásáig, ezért a DNS-szintézis aphidicolinnal történő célzott gátlásán keresztül kívántuk alátámasztani, hogy a DNSszintézis gátlása központi szerepet játszik a dCK aktiválódásában. Az aphidicolin nem nukleozid-típusú anyag és a dCK-nak sem szubsztrátja, viszont a CdA-val összemérhető mértékben emelte a kezelt sejtek dCK-aktivitását egészséges donor és akut mieloid leukémiában szenvedő egyén perifériás vérlimfocitáiban egyaránt. Ezzel megerősítést nyert, hogy a DNS-szintézis gátlásával a dCK aktiválódása előidézhető. Ez az eredmény ugyanakkor magyarázatát adhatja Sargent és munkatársai megfigyelésének, miszerint akut limfoid és mieloid leukémiában szenvedő betegek véréből izolált blasztos sejtek araC iránti érzékenységét az ex vivo aphidicolin-kezelés szignifikánsan növeli [198]. Az aphidicolin-kezelés valószínűleg a sejtek dCK-aktivitásának fokozása révén jóval nagyobb mennyiségű foszforilált araC képződéséhez vezetett. A
topoizomeráz-II-inhibitor
etopoziddal
kiváltható
jelentős
fokú
enzimaktiválódás azt sejteti, hogy az effektus kulcsa nem is magában a DNS-szintézis (és hibajavító aktivitás) gátlásában, hanem a következményes DNS-károsodásban rejlik
100
(23. ábra). A félszintetikus podofillotoxin-származék etopozid dCK-aktiváló hatását egy japán munkacsoport az L1210 egér leukémia-sejtvonalon is leírta, ahol 10 μM etopozid már egyórás kezelés nyomán 70%-kal emelte a dCK aktivitását, s ezt a hatást összefüggésbe hozták a sejtek fokozott araC-inkorporációjával [199]. Van Moorsel és munkatársai kimutatták, hogy az etopozid és a dFdC egymással szinergizmusban gátolja a Lewis egér tüdőrák-sejtvonal és a humán ováriumtumor eredetű A2780-sejtek osztódását, s ez a hatás különösen a rövid időtartamú etopozid-előkezelés nyomán volt megfigyelhető [200]. Utóbbi esetben a dFdC-trifoszfát intracelluláris koncentrációja szignifikánsan megemelkedett, ami összhangban van a dCK aktiválódására utaló saját eredményeinkkel.
A
kombinált
kezelés
a
DNS-lánctörések
gyakoriságát
is
megkétszerezte [200]. A DNS-károsodásnak a dezoxicitidin-kináz aktiválódásában betöltött oki szerepére utal az a tény is, hogy a mitotikus orsót bénító, de a DNS-t közvetlenül nem károsító taxolok kifejezett citotoxikus és proapoptotikus hatásuk ellenére sem befolyásolják a dCK aktivitását [201]. A fenti megfontolások vezettek el a limfociták γ-besugárzásával kapcsolatos kísérleteinkhez, amelyek egyértelműen azt mutatták, hogy a dCK aktiválódását a DNS károsodása váltja ki (24-26. ábra és 4. táblázat). A sejtek γ-besugárzása nyomán jelentősen megnövekedett a jelzett dezoxicitidin és -timidin beépülése a DNS-be (24/A. ábra). Ezzel párhuzamosan a DNS-kettőslánc-törések számának ugrásszerű növekedését észleltük, amelyek viszont a 60 perces utóinkubálás során teljes mértékben kijavítódtak (4. táblázat), és a besugárzást követő 15 – 30. percen belül következett be a dCKaktivitás többszörös emelkedése is (25. ábra). A kívülről adott jelzett dezoxicitidin és -timidin hasznosításában viszont jelentős különbségekre derült fény: míg a timidin nagy része beépült a DNS-be, és kevesebb, mint 10%-a volt megtalálható az etanol-oldékony frakcióban, addig a jelzett citidinnek csak a fele fordítódott DNS-szintézisre, a másik része a nukleotid- és liponukleotid-frakcióba került. Ez a jellegzetes különbség munkacsoportunk korábbi megfigyeléseivel összhangban van, és a dCTP-pool funkcionális megosztottságával jól magyarázható [19]. Reichard és Plunkett szerint a de novo szintézis során keletkezett dCTP döntően a DNS replikációjára fordítódik, összhangban azzal, hogy a ribonukleotid-reduktáz is az S-fázisban aktív, míg a nukleozid-mentő folyamatok szolgáltatta dCTP elsősorban a hibajavító DNS-szintézis
101
és a dezoxiliponukleotidok irányába terelődik [14, 202]. A teljes dezoxicitidin-jelzés mintegy harmada jelent meg a dezoxiliponukleotid-poolban (amelynek döntő hányadát a dCDP-kolin és a dCDP-etanolamin adja [15, 17, 18]), és ez az arány a besugárzási dózis emelésével sem változott lényegesen (24/B. ábra). Mivel a tonzilla-limfociták kb. 90%-a a nyugvó fázisban van [203], dNTP-szükségletük főleg a DNS-hibajavítás igényeit elégíti ki; így a besugárzás nyomán fokozódó timidin- és dezoxicitidininkorporáció az aktiválódott DNS-repair következménye (4. táblázat). Figyelemreméltó, hogy miközben a tríciált dC és dT foszforilációja a dózis függvényében közel párhuzamosan emelkedett, a dezoxipirimidin-mentő enzimek közül kizárólag a dCK aktivitása fokozódott a besugárzásnak kitett sejtekben (25/B. ábra). Habár az előzőekben tárgyaltaknak megfelelően a dCK által foszforilált dC nagy része timin-nukleotidokká alakul, ez a tény a jelen esetben nem nyújthat megfelelő magyarázatot, hiszen az átalakulás során az [5-3H]-jelölés elvész [15]. Kreder és munkatársai ugyanakkor leírták, hogy az SW-1573 humán tüdőkarcinóma-sejtvonal alacsony dózisú besugárzását követő hat órán belül a dCK és mindkét timidin-kináz izoenzim aktivitása a kontroll érték másfél – kétszeresére emelkedett, és csak 24 óra elteltével tért vissza az alapértékre. Az észlelt enzimaktivitás-változásokat a szerzők a besugárzásra adott adaptív válaszként értékelik [204]. További irodalmi adatok is alátámasztják ezt a feltevést. Normál és transzformált fibroblasztok besugárzása nyomán a timidin-kináz a transzkripció szintjén indukálódott, az enzimaktivitás növekedése arányos volt az mRNS-szint változásával, ami a transzformált sejtekben jóval nagyobb mértékben emelkedett [205]. Saját kísérleteinkben viszont a tonzillalimfociták timidin-kinázainak aktivitás-változásait a TK1- és TK2-aktivitás szelektív meghatározásával egyértelműen kizártuk. Hasonló eredményre jutott egy másik munkacsoport is, akik B-sejtes krónikus limfoid leukémia-sejtek UV-C-besugárzása kapcsán a jelzett timidin inkorporációjának erőteljes növekedését és a dCK-aktivitás emelkedését tapasztalták változatlan timidin-kináz-aktivitás mellett [159]. Az a tény, hogy a besugárzott sejteket legalább 15 – 30 percig kell inkubálni a dCK-aktiválódás megjelenéséig, arra utal, hogy a besugárzás az észlelt jelenségnek nem közvetlen oka, hanem valószínűleg több közbülső lépés közvetít a DNS-károsodás és a dCK stimulációja között. Ez a latencia a sejtek CdA- és aphidicolin-kezelése kapcsán is
102
megfigyelhető volt (7. és 39. ábra; [154]); ilyenkor viszont a maximális dCKaktiválódás kiváltásához 1 – 2 órás inkubálásra volt szükség. Wei és munkatársai a HT-29 colontumor-sejtvonal dCK-aktivitásának γbesugárzás nyomán tapasztalható fokozódását vizsgálva az enzimaktivitás két és félszeres növekedésének hátterében a dCK proteinszintjének ötszörös emelkedését észlelték a 24 órás utóinkubálás során. A besugárzás nyomán elsősorban a pirimidinmentő reakcióutak aktiválódtak a purin-metabolizmus enzimeivel szemben [206]. Saját eredményeink a dCK aktiválódásának ettől eltérő mechanizmusára utalnak, hiszen a normál limfociták γ-besugárzása során a dCK fehérjeszintje nem változott (28. ábra) a besugárzást követő 30 – 120 percen belül. E látszólag egymásnak ellentmondó eredmények az eltérő kísérleti paraméterek figyelembevételével értelmezhetők. A mi esetünkben a dCK aktiválódása 1 – 2 órán belül, valószínűleg poszt-transzlációs módosulás révén valósult meg, míg az enzim hosszabb távú aktiválódását a dCK-mRNS és -fehérje szintézisének indukciója okozhatta. Másrészt az enzim aktiválódásához vezető molekuláris történések sem szükségképpen azonosak a normál limfociták és a tumorsejtek között. A transzformált sejtekben tapasztalható génátrendeződések és a szignáltranszdukciós utak egyensúlyának felborulása magyarázatot adhat a dCK aktiválódásában észlelt különbségekre is. Normál limfociták rövidtávú kezelései kapcsán egyébként sohasem tapasztaltuk a dCK-fehérje mennyiségének bármelyik irányba történő megváltozását (27., 28. és 42/A. ábra), s ezt támasztják alá munkacsoportunk korábbi eredményei is, miszerint a limfociták CdA-val történő kezelése során a dCK-aktivitás emelkedését nem kíséri sem a dCK mRNS-ének, sem proteinmennyiségének a növekedése, illetve az aktiválódás folyamatát cikloheximiddel nem lehetett megakadályozni [140]. Erre a következtetésre jutott Bontemps és munkacsoportja is a dezoxicitidin-kináz UV-besugárzással kiváltott aktiválódásának tanulmányozása során [159]. A
különböző
sejtvonalak
sugárérzékenységét
számos
laboratóriumban
vizsgálják, hiszen az ionizáló sugárzás számos rosszindulatú daganat kezelésének egyik talpkövét jelenti. A kombinált kemo- és sugárterápia hatékonyságát több klinikai vizsgálat is alátámasztja [207]; a besugárzott szövetek nukleozid-analógokkal szemben mutatott érzékenységének fokozódása mögött a dezoxicitidin-kináz aktiválódása sejthető.
103
6.3. A dCK aktiválódásának feltételezett mechanizmusa A DNS-károsodás érzékeny szenzorának tekinthető poli(ADP-ribóz)-polimeráz aktiválódása a citotoxikus nukleozidokkal történő sejtkezelés során néhány óra elteltével indul meg [208]. Az általunk vizsgált DNS-károsító anyagokkal kiváltott dCK-aktiválódás viszont már egy órán belül (7. és 39. ábra), sőt γ-besugárzás esetén 15 perc múlva jelentkezett (25/B. ábra), ami ellene szól annak, hogy a PARP esetleg szerepet játszhat a dCK aktiválódásának folyamatában. Ezzel összhangban van az az eredményünk, hogy a CdA stimuláló hatását a PARP gátlószerével nem sikerült felfüggeszteni. Mindez arra utal, hogy a dCK aktiválódása egy korai történés a DNSkárosodás nyomán beinduló kompenzációs mechanizmusok sorában.
6.3.1. A reverzibilis foszforiláció szerepe a dCK aktivitásának szabályozásábanV Az enzimaktiválódás mechanizmusára utaló eddigi megállapításokat annyiban lehetne röviden összegezni, hogy az allosztérikus moduláció (a fehérje – fehérje kölcsönhatást is beleértve [154]) és az enzimindukció lehetőségét nagy valószínűséggel kizártuk. Az aktiválódás relatív gyorsaságát is tekintetbe véve azt a munkahipotézist állítottuk fel, hogy a dCK valamilyen poszt-transzlációs módosításon megy keresztül. A lehetséges kovalens módosítások közül részben széleskörű elterjedtsége, részben pedig a DNS-károsodás nyomán aktiválódó szabályozási körökben betöltött alapvető szerepe miatt [164] a reverzibilis protein-foszforiláció tűnt a legvalószínűbbnek. Az irodalmi bevezetőben említésre került, hogy a dCK kétdimenziós elektroforézise során két eltérő izoelektromos pontú polipeptidet azonosítottak [37, 39]. Ez az érdekes jelenség az enzim foszforilációjával jól magyarázható. Itt említeném meg, hogy a másik citoplazmatikus nukleozid-mentő enzim, a TK1 is egy foszfoprotein, amelynek 13-as helyzetű szerin-oldalláncát a ciklin-dependens-kináz-2 foszforilálhatja [106, 107], és az enzim hiperfoszforilációja az aktivitásának csökkenéséhez vezet [209]. A foszforiláció szerepére tehát a salvage enzimek között is akad precedens, ami szintén munkahipotézisünket támogatta. Munkacsoportunk korábbi megfigyelései, miszerint az általános foszfatázgátló NaF-dal a dCK aktivitása fokozható [155], illetve a részlegesen tisztított dCK-
104
preparátumok λ-protein-foszfatázzal történő kezelése az enzim inaktiválódását eredményezi [154], az enzim foszforilációjának első, ám közvetett bizonyítékait szolgáltatták. A calyculin A és okadainsav foszfoprotein-foszfatáz-inhibitorokkal kapott eredmények tovább árnyalják a képet (29. ábra), azt sugallva, hogy a foszfoproteinfoszfatáz-1 gátlásával az enzim aktivitása indirekt módon fokozható, tehát a dCK valószínűleg szerin/treonin-oldalláncon foszforilálódik és ez az aktív forma. Természetesen az nem állítható, hogy a dCK defoszforilációjáért közvetlenül a foszfoprotein-foszfatáz-1 lenne a felelős; elképzelhető, hogy a foszfatáz a dCK-t foszforiláló kinázt (vagy kináz-kaszkád valamelyik tagját) inaktiválja. A dCK aktivitásának γDNS-károsodás
besugárzás és calyculin A-kezelés, valamint által
hiperozmotikus
történő
ellentétes
stressz irányú
protein-kináz
hiperozmotikus stressz
szabályozásával (29., 30. és 47. ábra)
analóg
mechanizmusnak
tűnik a foszfatidil-inozitol-3-kináz
alacsony aktivitású dCK
aktivált dCK
Pi
közvetítette túlélési jelpálya két effektorának, a riboszómális S6kináznak és a protein-kináz Bαnak
(PKBα/Akt)
aktivitás-
változása. Hiperozmotikus sejtkörnyezetben
mindkét
kináz
protein- foszfatáz
calyculin A
47. 48. ábra. A dezoxicitidin-kináz aktiválódásának modellje V Az enzim aktivitását a DNS-károsítással aktiválható és hiperozmotikus stresszel inaktiválható protein-kináz, valamint a calyculin A-val gátolható protein-foszfatáz aktuális egyensúlya állítja be.
inaktiválódik [156, 157], ami calyculin A-val ellensúlyozható, míg az okadainsavnak nincs ilyen hatása ([157]; vö. a 30. ábrával). Ugyanakkor alacsony dózisú ionizáló sugárzás
hatására
mindkét
kináz
aktivitása
megemelkedett
[210].
Ezek
a
hasonlatosságok sejtetni engedik, hogy a dCK aktiválódása a károsodott sejt túlélését szolgáló válaszreakció lehet, és az enzim foszforilációja valamilyen módon a túlélési jelpálya protein-kinázaihoz kapcsolt folyamat. A dCK-aktivitás foszforilációval történő szabályozásának lehetőségét más munkacsoportok is vizsgálják. Wang és Kucera már 1994-ben leírta, hogy a humán limfoblasztokból
izolált
dezoxicitidin-kináz
protein-kináz
Cα-val
in
vitro
foszforilálható, ami enzimaktivitásának növekedését eredményezi [211]. Habár a dCK-
105
molekulában számos PKC konszenzus foszforilációs hely található [25], ez az eredmény mégis megkérdőjelezhető, mert a dCK monomerjének molekulatömege 30,5 kDa, míg a szerzők által SDS-gélen azonosított foszfoprotein 61 kDa-os volt [211]. Később munkacsoportunk kimutatta, hogy a rekombináns dCK PKC-vel gyakorlatilag nem, protein kináz A-val viszont jól foszforilálható, azonban a dCK foszforilációja az enzim aktivitását és szubsztrátspecificitását nem befolyásolta [212]. Transzformált limfociták hosszútávú kezelése bryostatin-1-gyel, a protein-kináz C aktivátorával a dCK-aktivitás növekedéséhez vezetett [213], azonban ezt a hatást tonzilla-limfociták forbol-észterkezelésével nem tudtuk kiváltani, és a PKC-inhibitor bisz-indolil-maleimid sem csökkentette a dCK aktivitását a limfociták rövidtávú kezelése során. A PKC-nek a dCK aktivitására gyakorolt közvetlen hatása tehát távolról sem egyértelmű. A dezoxicitidinkináz reverzibilis foszforilációval történő szabályozásának bizonyítására az enzim immunaffinitás-kromatográfiával történő tisztítását és tömegspektrometriai elemzését tervezzük. A receptor-tirozin-kinázok és azok jelpályáinak gátlószereivel kiváltott gyors és kifejezett dCK-aktiválódás (31. és 32. ábra) felveti annak lehetőségét, hogy a sejtmembránból induló növekedési faktor-jelpályák a DNS-károsodástól függetlenül hatással lehetnek a dCK aktivitására. Erre a lehetőségre már Van Den Neste és munkatársai is felhívták a figyelmet [159], akik kimutatták, hogy az UV-Cbesugárzással előidézett dCK-aktiválódás az általános növekedési faktor-inhibitor suraminnal teljesen felfüggeszthető (az UV-C-sugárzás a DNS károsításán túl a növekedési faktorok receptorait is aktiválja [214]). A suraminnak viszont egyáltalán nem volt hatása a CdA-val és aphidicolinnal kiváltott enzimaktiválódásra. Ez a tény is azt bizonyítja, hogy a dCK aktiválódásának szignálját legalább két független jelpálya közvetítheti: az egyik a károsodott DNS-ből indul (CdA, aphidicolin), a másik pedig a membránból (UV-fény, tirozin-kináz-inhibitorok). Ugyanakkor egymásnak ellentmond az, hogy a suramin a dCK aktiválódását megakadályozza, míg a szelektív epidermális növekedési faktor-inhibitor tirfosztin A47, valamint a MAPK- és p38-kináz-inhibitorok aktiválják az enzimet. Adatainkból valószínűsíthető, hogy a növekedési faktorok jelpályái folyamatos gátló hatást fejtenek ki a dCK aktivitására, amely DNS-károsodás hatására felfüggesztődik, de ennek tisztázása még további vizsgálatokat igényel. A membránreceptorok és a dCK-aktiválódás kapcsolata különösen érdekes lehet annak
106
ismeretében, hogy a dCK közvetlenül a sejtmembrán belső felszíne alatt található a sejtekben [47], vagyis abban a térrészben, ahol a receptorhoz kapcsolt jeltovábbító fehérjék működnek. A rekombináns enzimhez adott foszfolipid-micellák önmagukban is aktiválják az enzimet [212], tehát az is elképzelhető, hogy a dezoxicitidin-kináz a membránlipidekkel szoros fizikai és funkcionális kapcsolatban van. Erre utal az a megfigyelésünk is, hogy a nukleozid-analógok csak az élő sejtekben fokozzák a dCK aktivitását; a membránmentes sejtkivonatokhoz adva hatástalanok.
6.3.2. A dCK aktiválódása kalciumfüggő folyamatVII A CdA-val kiváltott dCK-aktiválódást az intracelluláris kalcium-koncentráció csökkentése kivédte (38-39. ábra). A hidrofób kalcium-kelátor BAPTA-AM 50 μM-os koncentrációja az aphidicolinnal, az etopoziddal és a növekedési faktor-inhibitorokkal indukált aktiválódást is felfüggesztette (adataink nincsenek ábrán bemutatva). A kalciumion tehát a dCK-aktiválódás mindkét jelpályájának (DNS-károsodás, illetve a MAPK-rendszer gátlása) közös faktora. Az extracelluláris kalcium-kelátorok ugyanakkor nem befolyásolták a dCK aktivitását, és ugyanez mondható el a transzmembrán kalciumfelvétel gátlószereiről – a feszültségfüggő kalciumcsatorna-blokkoló nifedipinről és verapamilról, valamint a gadolínium(III)-kloridról, a mechanikai feszülés-aktiválta kationcsatornák inhibitoráról is (adataink nincsenek ábrán bemutatva). Ez azzal magyarázható, hogy a limfociták kalcium-homeosztázisát a felsorolt szerekkel végzett rövidtávú kezelések nem zavarják meg, vagy a dCK aktivitása nem elég szenzitív az intracelluláris kalciumszint kisebb változásaira.
A
citoplazma
kalcium-koncentrációját
fokozó
szerekkel,
így
a
thapsigarginnal, a strofantinnal, a kalcium-ionofór ionomycinnel és a kálium-klorid depolarizáló koncentrációival a dCK aktiválódását előidézni nem lehetett (az adatok nincsenek ábrán bemutatva), amiből arra következtettünk, hogy a kalcium permisszív szerepet játszik a dCK aktiválódásában, vagyis bizonyos mennyiségben szükséges hozzá, de nagyobb mennyiségben adva a kívánt hatást tovább nem fokozza. A kalcium permisszív szerepe számos sejtfolyamat és enzim működésében megnyilvánul, s a hatást általában kalciumkötő fehérjék közvetítik. Egy klasszikus példa a foszfolipáz C enzim,
107
amelynek aktivitása kalcium-kelátorokkal gátolható, viszont az A23187 kalciumionofórral és depolarizáló kálium-koncentrációkkal nem aktiválható [215]. Egy nemrégiben megjelent közlemény a GLUT1 glukóztranszporter kalciumfüggő modulációját elemzi patkány máj epiteliális sejteken [216], s az ott közölt mechanizmus tulajdonképpen teljesen analóg a dCK-val kapcsolatos megfigyeléseinkkel. Az inzulinnal stimulált glukóztranszporter aktivitását a sejtek BAPTA-AM-kezelése dózisfüggő módon csökkentette; a maximális gátlás 75 μM-nál észlelhető. A hidrofób kalcium-kelátor a GLUT1 nátrium-aziddal, arzenáttal és 2,4-dinitrofenollal kiváltható aktiválódását megakadályozta, míg a citoszol szabad kalcium-koncentrációjának növelése nem fokozta a cukortranszport sebességét. A BAPTA-AM a GLUT1 expressziójára nem volt hatással, és ugyanezt tapasztaltuk a dCK esetében is (42/A. ábra). A kalcium permisszív szerepe a máj Na+/taurokolát-kotranszporterének Ca2+/kalmodulin-függő szabályozásában [217], valamint a MAP-kinázok angiotenzin IIvel történő, PKC-közvetítette aktiválásában is bebizonyosodott [218]. Kimutattuk, hogy a kalcium a dCK-nak nem kofaktora (41. ábra). Az is valószínűtlen, hogy a dCK a Ca2+/kalmodulinnal vagy egyéb kalciumkötő fehérjékkel képzett komplex formájában lenne aktív, hiszen a nyerskivonathoz adott kalciumkelátor jelenlétében a kalciumfüggő komplexek disszociálnának. A kalcium minden valószínűség szerint közvetett szerepet játszik az enzim aktiválásában. A 47. ábrán összefoglalt eredményeink figyelembevételével azt feltételezzük, hogy a kalcium a dCK-t közvetlenül vagy közvetett módon foszforiláló kináz aktiválásában játszhat szerepet. Az, hogy ez a feltételezett kináz közvetlenül kalciumot köt, mint pl. a proteinkináz C klasszikus izoenzimei, netán Ca2+/kalmodulin-komplex szabályozza, mint az a Ca2+/kalmodulin-dependens protein-kinázok esetében megfigyelhető, még nyitott kérdés. A dCK kalciumfüggő foszforilációjára irányuló feltevésünk ugyanakkor összhangban van a 39. ábrán feltüntetett adatokkal, amelyekkel azt bizonyítottuk, hogy a kalcium az enzim aktivált állapotának kialakításán túl annak fenntartásához is szükséges. Amennyiben ugyanis a feltételezett kalciumfüggő kináz-aktivitást a kalcium elvonásával bénítjuk, akkor a foszfoprotein-foszfatázok túlsúlyba jutása révén a dCK defoszforilálódik,
ami
az
enzimaktivitás
csökkenésében
nyilvánul
meg.
(A
foszfoprotein-foszfatázok jelentőségére a calyculin A-kezeléssel nyert adataink utalnak).
108
6.3.3. A dezoxicitidin-kináz aktiválódását konformáció-változás kísériII, VII Korábbi megfigyeléseinkkel összhangban a dCK-fehérje mennyisége a BAPTAAM-mel kezelt sejtek extraktumaiban sem mutatott eltérést a kezeletlen sejtekhez képest (42/A. ábra). A denaturáló western blottal éles ellentétben, a natív körülmények között készített immunfestés során a különböző dCK-preparátumok jelintenzitásában az enzimaktivitással arányos különbségekre derült fény, míg a pozitív kontrollként használt rekombináns enzim egyáltalán nem adott jelet (42/B. ábra). Az utóbbi jelenséget kétféleképpen lehet magyarázni. Elképzelhető, hogy a rekombináns dCK nem vándorolt a gélbe vagy a transzfer során nem került rá a membránra. A másik eshetőség az, hogy jelen volt ugyan a membránon, ám zárt natív konformációja miatt az antitest számára nem volt hozzáférhető. Az első lehetőség valószínűtlennek tűnt, mivel a dCK izoelektromos pontja jóval 7 alatt van [37, 39], így a 8,3-as pH-n végzett elektroforézis és transzfer alatt kellően negatív töltésűnek kellett lennie ahhoz, hogy az anód felé vándoroljon. A „dot”-immunblot módszer is a konformációs különbségekre hívta fel a figyelmet. Az antitestkötés fokozódása elméletileg egy endogén gátlófehérje ledisszociálásának következménye is lehetett; ezt a feltételezést viszont valószínűtlenné teszi az a tény, hogy a rekombináns dCK natív körülmények között nem kötötte az ellenanyagot, márpedig a tiszta rekombináns dCK-preparátumban egy potenciális gátlófehérje jelenléte kizárható. Ezek az eredmények a dezoxicitidin-kináz aktiválódását (47. ábra) az eltérő katalitikus aktivitású enzimformákhoz rendelhető különböző konformációs állapotokkal egészítik ki. A baktériumokban szintetizált rekombináns enzim az eukarióta dCK-ra jellemző másodlagos módosításoktól mentes, specifikus aktivitása alacsony, és natív körülmények között egy annyira zárt konformációt vesz fel, hogy az epitop az antitest számára teljesen hozzáférhetetlen. Az eukarióta enzim konformációja nyitottabb s az antitest számára jobban felismerhető. Véleményem szerint az eukarióta dezoxicitidinkináz legalább két konformációs állapotban létezhet a sejten belül; a „zártabb” állapot a katalitikusan kevésbé aktív, míg a „nyitottabb” térszerkezet az aktívabb formát jellemzi. A két forma aktuális aránya szabja meg az adott sejtkivonatból mérhető dezoxicitidinkináz-aktivitást, valamint az ezzel egyenesen arányos jelintenzitást a natív immunblotton. A kovalensen módosított, azaz aktivált forma relatív aránya a sejtek
109
CdA- és aphidicolin-kezelése során megnövekszik, ami fokozott enzimaktivitásban és erősebb immunreaktivitásban nyilvánul meg, míg BAPTA-AM-kezelés esetén ezzel ellentétes tendenciák érvényesülnek. A konformáció-változás tényét a dCK részleges proteolízisével is alátámasztottuk (44. ábra). A CdA-val aktivált enzim ellenállóbb a tripszines emésztéssel szemben, ami stabilabb térszerkezetének bizonyítéka. Ugyanakkor az időbeli eltolódást leszámítva a kontroll és az aktivált enzim emésztési mintázata nagyon hasonló, ami arra utal, hogy a natív immunblottal azonosított térszerkezeti változás inkább lokális, semmint az egész molekulát érintő globális jelenség. Hasonló eredmények születtek a fenilalaninhidroxiláz aktiválódásának vizsgálata kapcsán. Kimutatták, hogy az enzim PKA-val történő foszforilációja fokozott enzimaktivitást, az N-terminális régió lokális szerkezetváltozását és az enzim proteázzal szemben mutatott rezisztenciájának növekedését eredményezi [219]. A λ-foszfatázzal kezelt sejtkivonatok natív immunfestése alátámasztja, hogy az aktiválódás
során
észlelt
konformáció-változás
a
dCK
foszforilációjának
következménye lehet (45. ábra). Az aktivált enzim foszfatázkezelése tehát az enzimaktivitás és a natív immunreaktivitás párhuzamos csökkenését eredményezi (vö. [154]). Érdemes megfigyelni, hogy foszfatázkezelés hatására a kontroll sejtekből nyert dCK-szignál intenzitása is közel a felére (54%-ára) csökkent, ami arra utal, hogy a nem stimulált enzimpopuláció is heterogén, azaz részben foszforilált. További érdekesség, hogy a dCK egymástól eltérő mértékben foszforilált formái között nincsen akkora elektroforetikus mobilitás-különbség, ami az SDS-western bloton az immunreaktív sáv felhasadását vagy szétválását idézte volna elő, ami egyébként sok más foszfoprotein esetében nagyon jól megfigyelhető. A kísérleteink során használt anti-dCK-ellenanyag a humán dezoxicitidin-kináz C-terminális peptidje (15 aminosav) ellen nyúlban termeltetett antitest volt [47]. A kristályosított rekombináns humán dCK térszerkezetének ismeretében tudjuk, hogy ez a C-terminális epitop a fehérje α10 jelű és 19 aminosavból álló α-hélix-doménjének területére esik, amely a feltekeredett globuláris fehérjeszerkezet felszínéhez közel, az α4-es és α7-es hélixek alkotta dimerizációs doménnel épp ellentétes oldalon található [41]. Az α10-es hélixet a központi elhelyezkedésű β5-ös lemezhez egy rövid „linker” peptid rögzíti. Egy rekombináns fehérje konformációjából az eukarióta enzim
110
térszerkezetére nézve messzemenő következtetéseket levonni ugyan nem lehet, de elképzelhető, hogy ez a flexibilis linker-régió egy molekuláris csuklópántként viselkedve lehetővé teszi, hogy lokális vagy globális konformáció-változás esetén az α10-es hélix „kipattanjon” az enzim felületéből, ami az ellenanyag hozzákötődését nagyban megkönnyítheti. A
mono-
és
poliklonális
antitestek
fehérjeszerkezet-kutatásokban
történő
felhasználásából számos közlemény született, és több példa is alátámasztja, hogy a térszerkezet
megváltozása
az
antitest
epitophoz
való
hozzáférését
nagyban
befolyásolhatja. Példának okáért egy progeszteron-receptor-ellenes antitest csak az antagonista ligandokhoz kötött receptort ismeri fel, a receptor-agonista komplexszel nem reagál [220]. Egy, az inzulinszerű növekedési faktor-receptor-I tirozin-kináz doménje ellen termeltetett antitest natív körülmények között csak a receptor foszforilált formáját képes immunprecipitálni, míg a nem foszforilált alakot egyáltalán nem köti. Denaturáló körülmények között viszont a teljesen kitekeredett receptor mindkét formáját ugyanakkora hatékonysággal azonosítja [221]; megjegyzendő, hogy a dCKellenes antitestet ugyanezek a tulajdonságok jellemzik. További irodalmi adatok is megerősítik, hogy bizonyos antitestek a megfelelő célfehérje foszforilált alakjához sokkal nagyobb affinitással képesek kötődni [222, 223]. A
dCK
konformáció-változásával
kapcsolatos
eredmények
az
enzim
aktiválódásának két további potenciális mechanizmusa ellen szólnak. A dezoxicitidinkináz homodimer formában aktív [37, 41], ami magában hordozza annak lehetőségét, hogy az aktiválódás a monomerek dimerizációján keresztül valósul meg, ami akár foszforiláció hatására is végbemehet [224]. A natív immunfestés viszont azt mutatja, hogy a dCK domináns alakja valamennyi sejtkivonatban a dimer forma volt, és az enzimaktivitásban mérhető jelentős eltéréseket nem kíséri a dimer/monomer arány szembetűnő megváltozása (42/B. ábra). A környezet redoxállapotának megváltozása a diszulfidhidak képződése/felbomlása révén markáns változásokat idézhet elő a fehérjék térszerkezetében és működésében [225]. A dCK molekulájában hat cisztein-aminosav található [25], tehát a redoxreguláció lehetősége biztosított. A rekombináns és a humán tisztított enzim DTTkezelése viszont nem befolyásolta az antitest kötődését a dCK-molekulához (43. ábra),
111
ami közvetett bizonyítéka annak, hogy a dCK térszerkezetében észlelt különbségekért nem a tiolcsoportok redoxállapotának megváltozása lehet a felelős. A sejtet ért stresszhatás és a következményes DNS-károsodás nyomán tehát a dezoxicitidin-kináz minden valószínűség szerint egy kalciumfüggő kináz közvetítésével foszforilálódik, s ennek hatására olyan konformáció-változáson megy keresztül, ami egy katalitikusan aktívabb térszerkezet kialakulását eredményezi.
6.4. A dCK aktiválódásának lehetséges szerepe az apoptózis folyamatábanVI Ha a DNS oly mértékben károsodott, hogy a sejt bizonyos időn belül nem képes a hibák maradéktalan kijavítására, akkor beindul a programozott sejthalál folyamata [226]. Kiderült, hogy primer limfocita-kultúrák kétórás CdA-, illetve aphidicolinkezelése után a sejtkivonatokban már számottevő kaszpáz-3-aktivitás mérhető, ami arra utal, hogy a sejtek bizonyos hányadában aktiválódott az apoptotikus program (34. ábra). Mivel ezzel párhuzamosan a dCK is aktiválódik (23. ábra), önként adódik a kérdés, hogy az emelkedett enzimaktivitásnak a DNS-hibajavításban feltételezett szerepén túl vajon az apoptózis szempontjából is van-e valamilyen jelentősége. A probléma megközelítésében Jullig és Eriksson érdekes felvetésére támaszkodtunk, akik az apoptoszómába beépülő dATP előállítását az apoptózis során a mitokondriumból a citoplazmába kiáramló dezoxiguanozin-kináznak tulajdonítják [116]. A dezoxicitidinkináz eleve a citoplazmában található, a dezoxiadenozint hatékonyan foszforilálja, a sejtekben mérhető aktivitása sokszorosan meghaladja a dezoxiguanozin-kinázét (8. ábra), ráadásul a genom károsodása nyomán tovább aktiválódik, tehát a dATP-termelés szempontjából ideális enzim lehet. Hipotézisünk igazolására meghatároztuk a különböző citotoxikus szerekkel kezelt sejtek dATP-pooljait, és a kontroll sejtekhez képest szelektív és szignifikáns emelkedést tapasztaltunk (5. táblázat). A dCK azonban nemcsak a természetes dezoxiadenozin, hanem annak analógjai foszforilációja miatt is proapoptotikus működésű lehet, hiszen a dATP szubsztituált származékairól (CdATP, araATP, FaraATP) bebizonyosodott, hogy az apoptoszóma képződése során a dATP-t kitűnően helyettesíthetik [90, 165].
112
A kilencvenes évek derekán több kutatócsoport is kimutatta, hogy a p53-fehérje mutációjával vagy deléciójával párosult krónikus limfoid leukémiában szenvedő betegek nagyon rosszul reagálnak a purin-nukleozid-analógokkal végzett kemoterápiára [227, 228]. Ennek nyomán kiderült, hogy a purin-analógok a p53-fehérjét aktiválni képesek timocitákban [229] és CLL-sejtekben egyaránt [230]. A normál limfocitákon alkalmazott p53-inhibitor dCK-aktiválódást gátló hatása, illetve a működőképes p53allél megléte tekintetében különböző Burkitt-limfóma eredetű sejtvonalak elemzése összefüggést sejtet a dCK aktiválhatósága és a funkcionális p53-protein jelenléte között (36. és 37. ábra). Óvatosságra int viszont az a tény, hogy a dCK a p53-hiányos HL60sejtvonalban kitűnően aktiválható (11/B. és 12. ábra). Az is megfontolást igényel, hogy a p53 egy sejtmagban működő transzkripciós faktor, míg a dezoxicitidin-kináz a citoplazmában található [47]. Ráadásul a dCK expressziója sejtciklus-függő változásokat nem mutat, és az enzim aktiválódása nem a transzkripció szintjén érvényesül [140]. Ezek a tények a p53-nak a dCK-aktiválódás szabályozásában betöltött szerepe ellen szólnak. Viszont az is kiderült, hogy a p53 a citoplazmában, közvetlen fehérje-fehérje kölcsönhatások révén, épp a nukleotid-anyagcsere egyik kulcsenzimének működését szabályozhatja. A p53-fehérje citoplazmában található szubpopulációja [231] ugyanis a ribonukleotid-reduktáz p53R2 és R2 jelű alegységeihez kötődik és ezáltal a citoplazmában szekvesztrálja őket, ám UV-besugárzás hatására ez a kölcsönhatás megszűnik és a ribonukleotid-reduktáz alegységei bejuthatnak a sejtmagba, ahol az összeállt holoenzim a DNS-hibajavítás prekurzorait a replitázmodellnek megfelelően in situ megszintetizálhatja [5]. Habár ebből az egy példából messzemenő következtetéseket levonni nem lehet, mégis figyelemreméltó, hogy a dCK a ribonukleotid-reduktázhoz hasonlóan valamennyi dNTP utánpótlását biztosíthatja [134], UV-fény hatására aktiválódik [159], továbbá sejtmagi lokalizációs szignállal rendelkezik [47] és túltermeltetése esetén a sejtmagba is képes belépni [46, 47]. Mivel egy
fehérje
foszforilációja
gyakran
vezet
a
fehérje-fehérje
kölcsönhatások
megváltozásához és a kérdéses protein sejten belüli lokalizációjának megváltozásához, nem lehetetlen, hogy a dCK szabályozásában egy efféle mechanizmus is szerepet játszik.
113
Kísérleti eredményeinket áttekintve leszögezhetjük, hogy a dezoxicitidin-kináz egy olyan Janus-arcú enzim, amelynek aktiválódása a genom integritásának helyreállítását és a sejt aktív pusztulását egyaránt elősegítheti. Érdekes kettősség, hogy a DNS károsodásakor fellépő dCK-aktiválódás a túlélés és a programozott sejthalál szempontjából egyaránt hasznos lehet, hiszen a hibajavító folyamatok számára bona fide dezoxinukleotidokat szolgáltat, míg kijavíthatatlan károsodás esetén a dATP termelésével közreműködik az apoptózisban, így járulván hozzá a malignus transzformáció elkerüléséhez. A citotoxikus nukleozid-analógok viszont progresszív és öngyilkos enzimaktiválódást eredményeznek, hiszen a magasabb katalitikus aktivitású enzim egyre több és több toxikus molekulát aktiválhat, ami előbb-utóbb visszafordíthatatlan sejtkárosodást eredményez. A dCK aktiválódásáról elmondottak összefoglalását a 48. ábra adja.
CdA és egyéb genotoxikus szerek aphidicolin γ-sugárzás DNS-károsodás
mitokondrium
DNS-hibajavítás
citC dATPdGTP
p
p53
dCTP dTTP
Ca2+-függő protein-kinázok
dCK
pifithrin-α
BAPTA-AM
AKTIVÁCIÓ, szabad C-terminális KONFORMÁCIÓ-VÁLTOZÁS
apoptózis 48. ábra. A dezoxicitidin-kináz aktiválódásának feltételezett háttere és mechanizmusa
114
7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönettel tartozom Intézetünk igazgatójának, Mandl József egyetemi tanárnak, a Pathobiokémia doktori program vezetőjének, hogy kutatómunkámat lehetővé tette és támogatta. Hálás köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Staub Mária egyetemi tanárnak azért a támogatásért, tudományos iránymutatásért és megértésért, amelyre kutatómunkám során mindig támaszkodhattam. Köszönöm Sasvári Máriának, hogy ötleteivel, optimizmusával és építő kritikájával segítette munkámat. Szpaszokukockaja Tatjana a kutatási témában való alapos jártasságával és kísérleti tapasztalataival számtalan nehézségen segített át, és a munkám során felmerülő kérdések megvitatásából rengeteget tanultam. Hálás vagyok Csapó Zsoltnak értékes gyakorlati tanácsaiért, beszélgetéseinkért, és Virga Sándornénak a kísérletek kivitelezése során nyújtott segítségéért és tanácsaiért. Valamennyiüknek köszönöm, hogy mindvégig kellemes légkörben dolgozhattam. Szeretném megköszönni munkacsoportunk valamennyi, eddig nem említett tagjának – Király Orsolyának, Nemoda Zsófiának, Szántai Eszternek, Rónai Zsoltnak, Barta Csabának, Boór Krisztinának, Szilágyi Ágnesnek és Kolmann Gabriellának, hogy segítségükre, véleményükre mindig számíthattam, továbbá az Intézetből mindazoknak, akik ötleteikkel, kritikáikkal és konkrét segítségükkel munkám sikeréhez hozzájárultak. Hálás köszönettel tartozom Taljanidisz Jánosnak azért, hogy a laboratóriumában töltött és tudományos szemléletemre döntő befolyást gyakorló két év során számtalan új módszerrel, készséggel és ismerettel, továbbá munkatársai önzetlen barátságával gazdagodhattam. Köszönöm gimnáziumi kémiatanáromnak, Pénzes Ferencnek, hogy szakmai és emberi példájával, támogatásával elmélyítette bennem a kémia szeretetét. Végül és mindenekelőtt szeretném megköszönni Családomnak, hogy céljaim elérésében támogattak, és szeretetükre, megértésükre mindig támaszkodhattam.
115
8. IRODALOMJEGYZÉK
[1] Bjorklund S, Skogman E, Thelander L. An S-phase specific release from a transcriptional block regulates the expression of mouse ribonucleotide reductase M2 subunit. EMBO J. 1992, 11, 4953 – 4959. [2] Eriksson M, Uhlin U, Ramaswamy S, Ekberg M, Regnstrom K, Sjoberg BM, Eklund H. Binding of allosteric effectors to ribonucleotide reductase protein R1: reduction of active-site cysteines promotes substrate binding. Structure 1997, 5, 1077 – 1092. [3] Reichard P. Interactions between deoxyribonucleotide and DNA synthesis. Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 349 – 374. [4] Tanaka H, Arakawa H, Yamaguchi T, Shiraishi K, Fukuda S, Matsui K, Takei Y, Nakamura Y. A ribonucleotide reductase gene involved in a p53-dependent cell-cycle checkpoint for DNA damage. Nature 2000, 404, 42 – 49. [5] Xue L, Zhou B, Liu X, Qiu W, Jin Z, Yen Y. Wild-type p53 regulates human ribonucleotide reductase by protein-protein interaction with p53R2 as well as hRRM2 subunits. Cancer Res. 2003, 63, 980 – 986. [6] Cohen A, Barankiewicz J, Lederman HM, Gelfand EW. Purine and pyrimidine metabolism in human T lymphocytes. Regulation of deoxyribonucleotide metabolism. J. Biol. Chem. 1983, 258, 12334 – 12340. [7] Cass CE, Young JD, Baldwin SA, Cabrita MA, Graham KA, Griffiths M, Jennings LL, Mackey JR, Ng AM, Ritzel MW, Vickers MF, Yao SY. Nucleoside transporters of mammalian cells. Pharm. Biotechnol. 1999, 12, 313 – 352. [8] Gazziola C, Ferraro P, Moras M, Reichard P, Bianchi V. Cytosolic high K(m) 5’nucleotidase and 5’(3’)-deoxyribonucleotidase in substrate cycles involved in nucleotide metabolism. J. Biol. Chem. 2001, 276, 6185 – 6190. [9] Eriksson S, Munch-Petersen B, Johansson K, Eklund H. Structure and function of cellular deoxyribonucleoside kinases. Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59, 1327 – 1346. [10] Wang L, Westberg J, Bolske G, Eriksson S. Novel deoxynucleoside-phosphorylating enzymes in mycoplasmas: evidence for efficient utilization of deoxynucleosides. Mol. Microbiol. 2001, 42, 1065 – 1073. [11] Munch-Petersen B, Piskur J, Sondergaard L. Four deoxynucleoside kinase activities from Drosophila melanogaster are contained within a single monomeric enzyme, a new multifunctional deoxynucleoside kinase. J. Biol. Chem. 1998, 273, 3926 – 3931. [12] Arner ES, Eriksson S. Mammalian deoxyribonucleoside kinases. Pharmacol. Ther. 1995, 67, 155 – 186.
116
[13] Kennedy EP, Borkenhagen LF, Smith SW. Possible metabolic functions of deoxycytidine diphosphate choline and deoxycytidine diphosphate ethanolamine. J. Biol. Chem. 1959, 234, 1998 – 2000. [14] Spyrou G, Reichard P. Compartmentation of dCTP pools. Evidence from deoxyliponucleotide synthesis. J. Biol. Chem. 1987, 262, 16425 – 16432. [15] Spasokoukotskaja T, Spyrou G, Staub M. Deoxycytidine is salvaged not only into DNA but also into phospholipid precursors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 155, 923 – 929. [16] Sasvári-Székely M, Spasokukotskaja T, Soóki-Tóth A, Pogány G, Kopper L, Staub M. Deoxycytidine is salvaged not only into DNA but also into phospholipid precursors. II. Ara-C does not inhibit the latter process in lymphoid cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989, 163, 1158 – 1167. [17] Spasokoukotskaja T, Taljanidisz J, Sasvári-Székely M, Staub M. Deoxycytidine is salvaged not only into DNA but also into phospholipid precursors. III. dCDP-diacylglycerol formation in tonsillar lymphocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 174, 680 – 687. [18] Sasvári-Székely M, Spasokoukotskaja T, Staub M. Deoxyribocytidine is salvaged not only into DNA but also into phospholipid precursors. IV. Exogenous deoxyribocytidine can be used with the same efficacy as (ribo)cytidine for lipid activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 194, 966 – 972. [19] Spasokukotskaja T, Sasvári-Székely M, Taljanidisz J, Staub M. Compartmentation of dCTP pools disappears after hydroxyurea or araC treatment in lymphocytes. FEBS Lett. 1992, 297, 151 – 154. [20] Hrabák A, Spasokukotskaja T, Temesi A, Staub M. The salvage of deoxycytidine into dCDP-diacylglycerol by macrophages and lymphocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 193, 212 – 219. [21] Galmarini CM, Mackey JR, Dumontet C. Nucleoside analogues: mechanisms of drug resistance and reversal strategies. Leukemia 2001, 15, 875 – 890. [22] Zhu C, Johansson M, Permert J, Karlsson A. Enhanced cytotoxicity of nucleoside analogs by overexpression of mitochondrial deoxyguanosine kinase in cancer cell lines. J. Biol. Chem. 1998, 98, 14707 – 14711. [23] Dolce V, Fiermonte G, Runswick MJ, Palmieri F, Walker JE. The human mitochondrial deoxynucleotide carrier and its role in the toxicity of nucleoside antivirals. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2001, 98, 2284 – 2288. [24] Song JJ, Walker S, Chen E, Johnson EE, Spychala J, Gribbin T, Mitchell BS. Genomic structure and chromosomal localization of the human deoxycytidine kinase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1993, 90, 431 – 434. [25] Chottiner EG, Shewach DS, Datta NS, Ashcraft E, Gribbin D, Ginsburg D, Fox IH, Mitchell BS. Cloning and expression of human deoxycytidine kinase cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1991, 88, 1531 – 1535. [26] Eriksson S, Cederlund E, Bergman T, Jornvall H, Bohman C. Characterization of human deoxycytidine kinase. Correlation with cDNA sequences. FEBS Lett. 1991, 280, 363 – 366.
117
[27] Ge Y, Jensen TL, Matherly LH, Taub JW. Physical and functional interactions between USF and SP1 proteins regulate human deoxycytidine kinase promoter activity. J. Biol. Chem. 2003, 278, 49901 - 49910. [28] Chen EH, Johnson EE, Vetter SM, Mitchell BS. Characterization of the deoxycytidine kinase promoter in human lymphoblast cell lines. J. Clin. Invest. 1995, 95, 1660 – 1668. [29] Dou QP, Markell PJ, Pardee AB. Thymidine kinase transcription is regulated at G1/S phase by a complex that contains retinoblastoma-like protein and a cdc2 kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1992, 89, 3256 – 3260. [30] Hengstschlager M, Hengstschlager-Ottnad E, Pusch O, Wawra E. The role of p16 in the E2F-dependent thymidine kinase regulation. Oncogene 1996, 12, 1635 – 1643. [31] Obata T, Endo Y, Tanaka M, Uchida H, Matsuda A, Sasaki T. Deletion mutants of human deoxycytidine kinase mRNA in cells resistant to antitumor cytosine nucleosides. Jpn. J. Cancer Res. 2001, 92, 793 – 798. [32] Al-Madhoun AS, van der Wilt CL, Loves WJ, Padron JM, Eriksson S, Talianidis I, Peters GJ. Detection of an alternatively spliced form of deoxycytidine kinase mRNA in the 2',2'difluorodeoxycytidine (gemcitabine)-resistant human ovarian cancer cell line AG6000. Biochem. Pharmacol. 2004, 68, 601 – 609. [33] Galmarini CM, Clarke ML, Jordheim L, Santos CL, Cros E, Mackey JR, Dumontet C. Resistance to gemcitabine in a human follicular lymphoma cell line is due to partial deletion of the deoxycytidine kinase gene. BMC Pharmacol. 2004, 4, 8. [34] Veuger MJ, Honders MW, Landegent JE, Willemze R, Barge RM. High incidence of alternatively spliced forms of deoxycytidine kinase in patients with resistant acute myeloid leukaemia. Blood 2000, 96, 1517 – 1524. [35] Veuger MJ, Heemskerk MH, Honders MW, Willemze R, Barge RM. Functional role of alternatively spliced deoxycytidine kinase in sensitivity to cytarabine of acute myeloid leukemic cells. Blood 2002, 99, 1373 – 1380. [36] Leegwater PA, De Abreu RA, Albertioni F. Analysis of DNA methylation of the 5’ region of the deoxycytidine kinase gene in CCRF-CEM-sensitive and cladribine (CdA)- and 2-chloro2’-arabino-fluoro-2’-deoxyadenosine (CAFdA)-resistant cells. Cancer Lett. 1998, 130, 169 – 173. [37] Bohman C, Eriksson S. Deoxycytidine kinase from human leukemic spleen: preparation and characteristics of homogeneous enzyme. Biochemistry 1988, 27, 4258 – 4265. [38] Datta NS, Shewach DS, Hurley MC, Mitchell BS, Fox IH. Human T-lymphoblast deoxycytidine kinase: purification and properties. Biochemistry 1989, 28, 114 – 123. [39] Celis JE, Leffers H, Rasmussen HH, Madsen P, Honore B, Gesser B, Dejgaard K, Olsen E, Ratz GP, Lauridsen JB, Basse B, Andersen AH, Walbum E, Brandstrup B, Celis A, Puype M, Van Damme J, Vandekerckhove J. The master two-dimensional gel database of human AMA cell proteins: towards linking protein and genome sequence and mapping information. Electrophoresis 1991, 12, 765 – 801.
118
[40] Kierdaszuk B, Eriksson S. Selective inactivation of the deoxyadenosine phosphorylating activity of pure human deoxycytidine kinase: stabilization of different forms of the enzyme by substrates and biological detergents. Biochemistry 1990, 29, 4109 – 4114. [41] Sabini E, Ort S, Monnerjahn C, Konrad M, Lavie A. Structure of human dCK suggests strategies to improve anticancer and antiviral therapy. Nat. Struct. Biol. 2003, 10, 513 – 519. [42] Johansson K, Ramaswamy S, Ljungcrantz C, Knecht W, Piskur J, Munch-Petersen B, Eriksson S, Eklund H. Structural basis for substrate specificities of cellular deoxyribonucleoside kinases. Nat. Struct. Biol. 2001, 8, 616 – 620. [43] Habteyesus A, Nordenskjold A, Bohman C, Eriksson S. Deoxynucleoside phosphorylating enzymes in monkey and human tissues show great similarities, while mouse deoxycytidine kinase has a different substrate specificity. Biochem. Pharmacol. 1991, 42, 1829 – 1836. [44] Karlsson A, Johansson M, Eriksson S. Cloning and expression of mouse deoxycytidine kinase. Pure recombinant mouse and human enzymes show differences in substrate specificity. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24374 – 24378. [45] Usova EV, Eriksson S. Identification of residues involved in the substrate specificity of human and murine dCK. Biochem. Pharmacol. 2002, 64, 1559 – 1567. [46] Johansson M, Brismar S, Karlsson A. Human deoxycytidine kinase is located in the cell nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1997, 94, 11941 – 11945. [47] Hatzis P, Al-Madhoon AS, Jullig M, Petrakis TG, Eriksson S, Talianidis I. The intracellular localization of deoxycytidine kinase. J. Biol. Chem. 1998, 273, 30239 – 30243. [48] Datta NS, Shewach DS, Mitchell BS, Fox IH. Kinetic properties and inhibition of human T lymphoblast deoxycytidine kinase. J. Biol. Chem. 1989, 264, 9359 – 9364. [49] Wang J, Choudhury D, Chattopadhyaya J, Eriksson S. Stereoisomeric specificity of human deoxyribonucleoside kinases. Biochemistry 1999, 38, 16993 – 16999. [50] Usova EV, Eriksson S. The effects of high salt concentrations on the regulation of the substrate specificity of human recombinant deoxycytidine kinase. Eur. J. Biochem. 1997, 248, 762 – 766. [51] Krawiec K, Kierdaszuk B, Eriksson S, Munch-Petersen B, Shugar D. Nucleoside triphosphate donors for nucleoside kinases: donor properties of UTP with human deoxycytidine kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 216, 42 – 48. [52] Hughes TL, Hahn TM, Reynolds KK, Shewach DS. Kinetic analysis of human deoxycytidine kinase with the true phosphate donor uridine triphosphate. Biochemistry 1997, 36, 7540 – 7547. [53] Turk B, Awad R, Usova EV, Bjork I, Eriksson S. A pre-steady-state kinetic analysis of substrate binding to human recombinant deoxycytidine kinase: a model for nucleoside kinase action. Biochemistry 1999, 38, 8555 – 8561. [54] Ives DH, Durham JP. Deoxycytidine kinase. 3. Kinetics and allosteric regulation of the calf thymus enzyme. J. Biol. Chem. 1970, 245, 2285 – 2294.
119
[55] Jansson O, Eriksson S. Direct photoaffinity-labelling of human deoxycytidine kinase with the feedback inhibitor dCTP. Biochem. J. 1990, 269, 201 – 205. [56] Arner ES, Spasokoukotskaja T, Eriksson S. Selective assay for thymidine kinase 1 and 2 and deoxycytidine kinase and their activities in extracts from human cells and tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, 188, 712 – 718. [57] Spasokoukotskaja T, Arner ES, Brosjo O, Gunven P, Juliusson G, Liliemark J, Eriksson S. Expression of deoxycytidine kinase and phosphorylation of 2-chlorodeoxyadenosine in human normal and tumour cells and tissues. Eur. J. Cancer 1995, 31, 202 – 208. [58] Hengstschlager M, Denk C, Wawra E. Cell cycle regulation of deoxycytidine kinase: evidences for post-transcriptional control. FEBS Lett. 1993, 321, 237 – 240. [59] Mitchell BS, Song JJ, Johnson EE, Chen E, Dayton, DS. Regulation of human deoxycytidine kinase expression. Adv. Enzyme Regul. 1993, 33, 61 – 68. [60] Bierau J, Leen R, Gennip AH, Caron HN, Kuilenburg AB. Determination of the deoxycytidine kinase activity in cell homogenates with a non-radiochemical assay using reversed-phase high performance liquid chromatography; Identification of a novel metabolite of 2-chlorodeoxyadenosine. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004, 805, 339 – 346. [61] Mansson E, Liliemark E, Soderhall S, Gustafsson G, Eriksson S, Albertioni F. Real-time quantitative PCR assays for deoxycytidine kinase, deoxyguanosine kinase and 5’-nucleotidase measurement in cell lines and in patients with leukemia. Leukemia 2002, 16, 386 – 392. [62] Sigmond J, Kroep JR, Loves W, Codacci-Pisanelli G, Peters GJ. Quantitative real time PCR of deoxycytidine kinase mRNA by Light Cycler PCR in relation to enzyme activity and gemcitabine sensitivity. Cancer Lett. 2004, 213, 173 – 179. [63] van der Wilt CL, Kroep JR, Loves WJ, Rots MG, Van Groeningen CJ, Kaspers GJ, Peters GJ. Expression of deoxycytidine kinase in leukaemic cells compared with solid tumour cell lines, liver metastases and normal liver. Eur. J. Cancer 2003, 39, 691 – 697. [64] Kawasaki H, Carrera CJ, Piro LD, Saven A, Kipps TJ, Carson DA. Relationship of deoxycytidine kinase and cytoplasmic 5’-nucleotidase to the chemotherapeutic efficacy of 2chlorodeoxyadenosine. Blood 1993, 81, 597 – 601. [65] Arner ES, Spasokoukotskaja T, Juliusson G, Liliemark J, Eriksson S. Phosphorylation of 2chlorodeoxyadenosine (CdA) in peripheral blood mononuclear cells of leukaemia patients. Br. J. Haematol. 1994, 87, 715 – 718. [66] Stegmann AP, Honders WH, Willemze R, Ruiz van Haperen VW, Landegent JE. Transfection of wild-type deoxycytidine kinase (dck) cDNA into an Ara-C and DAC-resistant rat leukemic cell line of clonal origin fully restore drug sensitivity. Blood 1995, 85, 1188 – 1194. [67] Orr RM, Talbot DC, Aherne GW, Fisher TC, Serafinowsky P, Harrap KR. 2’deoxycytidine kinase deficiency is a major determinant of 2-chloro-2’-deoxyadenosine resistance in lymphoid cell lines. Clin. Cancer Res. 1995, 1, 391 – 398.
120
[68] Ruiz van Haperen VW, Veerman G, Braakhuis BJ, Vermoken JB, Boven E, Leyva A, Peters GJ. Deoxycytidine kinase and deoxycytidine deaminase activities in human tumour xenografts. Eur. J. Cancer 1993, 29, 2132 – 2137. [69] Kroep JR, Loves WJ, van der Wilt CL, Alvarez E, Talianidis I, Boven E, Braakhuis BJ, van Groeningen CJ, Pinedo HM, Peters GJ. Pretreatment deoxycytidine kinase levels predict in vivo gemcitabine sensitivity. Mol. Cancer Ther. 2002, 1, 371 – 376. [70] Galmarini CM, Thomas X, Graham K, El Jafaari A, Cross E, Jordheim L, Mackey JR, Dumontet C. Deoxycytidine kinase and cN-II nucleotidase expression in blast cells predict survival in acute myeloid leukaemia patients treated with cytarabine. Br. J. Haematol. 2003, 122, 53 – 60. [71] Funato T, Satou J, Nishiyama Y, Fujimaki S, Miura T, Kaku M, Sasaki T. In vitro leukemia cell models of Ara-C resistance. Leuk. Res. 2000, 24, 535 – 541. [72] Beausejour CM, Tremblay G, Momparler RL. Potential of ribozymes against deoxycytidine kinase to confer drug resistance to cytosine nucleoside analogs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 278, 569 – 575. [73] Hapke DM, Stegmann AP, Mitchell BS. Retroviral transfer of deoxycytidine kinase into tumor cell lines enhances nucleoside toxicity. Cancer Res. 1996, 56, 2343 – 2347. [74] Manome Y, Wen PY, Dong Y, Tanaka T, Mitchell BS, Kufe DW, Fine HA. Viral vector transduction of the human deoxycytidine kinase cDNA sensitizes glioma cells to the cytotoxic effects of cytosine arabinoside in vitro and in vivo. Nat. Med. 1996, 2, 567 – 573. [75] Kufe D, Spriggs D, Egan EM, Munroe D. Relationships among Ara-CTP pools, formation of (Ara-C)DNA, and cytotoxicity of human leukemic cells. Blood 1984, 64, 54 – 58. [76] Galmarini CM, Clarke ML, Santos CL, Jordheim L, Perigaud C, Gosselin G, Cros E, Mackey JR, Dumontet C. Sensitization of ara-C-resistant lymphoma cells by a pronucleotide analogue. Int. J. Cancer 2003, 107, 149 – 154. [77] Bergman AM, Kuiper CM, Voorn DA, Comijn EM, Myhren F, Sandvold ML, Hendriks HR, Peters GJ. Antiproliferative activity and mechanism of action of fatty acid derivatives of arabinofuranosylcytosine in leukemia and solid tumor cell lines. Biochem. Pharmacol. 2004, 67, 503 – 511. [78] Plunkett W, Huang P, Xu YZ, Heinemann V, Grunewald R, Gandhi V. Gemcitabine: metabolism, mechanisms of action, and self-potentiation. Semin. Oncol. 1995, 22, 3 – 10. [79] Heinemann V, Xu YZ, Chubb S, Sen A, Hertel LW, Grindey GB, Plunkett W. Inhibition of ribonucleotide reductase in CCRF-CEM cells by 2’,2’-difluorodeoxycytidine. Mol. Pharmacol. 1990, 38, 567 – 572. [80] Peters GJ, Ruiz van Haperen VW, Bergman AM, Veerman G, Smitskamp-Wilms E, van Moorsel CJ, Kuiper CM, Braakhuis BJ. Preclinical combination therapy with gemcitabine and mechanisms of resistance. Semin. Oncol. 1996, 23, 16 – 24. [81] Ruiz van Haperen VW, Veerman G, Vermorken JB, Peters GJ. 2’, 2’-Difluorodeoxycytidine (gemcitabine) incorporation into RNA and DNA of tumour cell lines. Biochem. Pharmacol. 1993, 46, 762 – 766.
121
[82] Christensen LF, Broom AD, Robins MJ, Bloch A. Synthesis and biological activity of selected 2,6-disubstituted-(2-deoxy- and -D-erythro-pentofuranosyl)purines. J. Med. Chem. 1972, 15, 735 – 739. [83] Wang L, Karlsson A, Arner ES, Eriksson S. Substrate specificity of mitochondrial 2’deoxyguanosine kinase. Efficient phosphorylation of 2-chlorodeoxyadenosine. J. Biol. Chem. 1993, 268, 22847 – 22852. [84] Carson DA, Kaye J, Seegmiller JE. Lymphospecific toxicity in adenosine deaminase deficiency and purine nucleoside phosphorylase deficiency: possible role of nucleoside kinase(s). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1977, 74, 5677 – 5681. [85] Griffig J, Koob R, Blakley RL. Mechanisms of inhibition of DNA synthesis by 2chlorodeoxyadenosine in human lymphoblastic cells. Cancer Res. 1989, 49, 6923 – 6928. [86] Warzocha K, Fabianowska-Majewska K, Blonski J, Krykowski E, Robak T. 2Chlorodeoxyadenosine inhibits activity of adenosine deaminase and S-adenosylhomocysteine hydrolase in patients with chronic lymphocytic leukaemia. Eur. J. Cancer 1997, 33, 170 – 173. [87] Seto S, Carrera CJ, Kubota M, Wasson DB, Carson DA. Mechanism of deoxyadenosine and 2-chlorodeoxyadenosine toxicity to nondividing human lymphocytes. J. Clin. Invest. 1985, 75, 377 – 383. [88] Robertson LE, Chubb S, Meyn RE, Story M, Ford R, Hittelman WN, Plunkett W. Induction of apoptotic cell death in chronic lymphocytic leukemia by 2-chloro-2’deoxyadenosine and 9-beta-D-arabinosyl-2-fluoroadenine. Blood 1993, 81, 143 – 150. [89] Lassota P, Kazimierczuk Z, Darzynkiewicz Z. Apoptotic death of lymphocytes upon treatment with 2-chloro-2’-deoxyadenosine (2-CdA). Arch. Immunol. Ther. Exp. 1994, 42, 17 – 23. [90] Leoni LM, Chao Q, Cottam HB, Genini D, Rosenbach M, Carrera CJ, Budihardjo I, Wang X, Carson DA. Induction of an apoptotic program in cell-free extracts by 2-chloro-2’deoxyadenosine 5’-triphosphate and cytochrome c. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1998, 95, 9567 – 9571. [91] Genini D, Adachi S, Chao Q, Rose DW, Carrera CJ, Cottam HB, Carson DA, Leoni LM. Deoxyadenosine analogs induce programmed cell death in chronic lymphocytic leukemia cells by damaging the DNA and by directly affecting the mitochondria. Blood 2000, 96, 3537 – 3543. [92] Chandra J, Mansson E, Gogvadze V, Kaufmann SH, Albertioni F, Orrenius S. Resistance of leukemic cells to 2-chlorodeoxyadenosine is due to a lack of calcium-dependent cytochrome c release. Blood 2002, 99, 655 – 663. [93] Huang P, Plunkett W. Induction of apoptosis by gemcitabine. Semin. Oncol. 1995, 22, 19 – 25. [94] Bouffard DY, Momparler RL. Comparison of the induction of apoptosis in human leukemic cell lines by 2’,2’-difluorodeoxycytidine (Gemcitabine) and cytosine arabinoside. Leuk. Res. 1995, 19, 849 – 856. [95] Rai KR. Cladribine for the treatment of hairy cell leukemia and chronic lymphocytic leukemia. Semin. Oncol. 1998, 25, 19 – 22.
122
[96] Beutler E, Sipe J, Romine J, Mcmillan R, Zyroff J, Koziol J. Treatment of multiple sclerosis and other autoimmune diseases with cladribine. Semin. Hematol. 1996, 33, 45 – 52. [97] Pettitt AR. Mechanism of action of purine analogues in chronic lymphocytic leukaemia. Br. J. Haematol. 2003, 121, 692 – 702. [98] Lotfi K, Mansson E, Spasokoukotskaja T, Pettersson B, Liliemark J, Peterson C, Eriksson S, Albertioni F. Biochemical pharmacology and resisitance to 2-chloro-2’-arabino-fluoro-2’deoxyadenosine, a novel analogue of cladribine in human leukemic cells. Clin. Cancer Res. 1999, 5, 2438 – 2444. [99] Kantarjian H, Gandhi V, Cortes J, Verstovsek S, Du M, Garcia-Manero G, Giles F, Faderl S, O’Brien S, Jeha S, Davis J, Shaked Z, Craig A, Keating M, Plunkett W, Freireich EJ. Phase 2 clinical and pharmacologic study of clofarabine in patients with refractory or relapsed acute leukemia. Blood 2003, 102, 2379 – 2386. [100] Bradshaw HD Jr. Molecular cloning and cell cycle-specific regulation of a functional human thymidine kinase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1983, 80, 5588 – 5591. [101] Munch-Petersen B, Tyrsted G, Cloos L. Reversible ATP-dependent transition between two forms of human cytosolic thymidine kinase with different enzymatic properties. J. Biol. Chem. 1993, 268, 15621 – 15625. [102] Eriksson S, Kierdaszuk B, Munch-Petersen B, Oberg B, Johansson NG. Comparison of the substrate specificities of human thymidine kinase 1 and 2 and deoxycytidine kinase toward antiviral and cytostatic nucleoside analogs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 176, 586 – 592. [103] Chang ZF, Huang DY, Hu SF. NF-Y-mediated trans-activation of the human thymidine kinase promoter is closely linked to activation of cyclin-dependent kinase. J. Cell. Biochem. 1999, 75, 300 – 309. [104] Posch M, Hauser C, Seiser C. Substrate binding is a prerequisite for stabilisation of mouse thymidine kinase in proliferating fibroblasts. J. Mol. Biol. 2000, 300, 493 – 502. [105] Kauffman MG, Kelly TJ. Cell cycle regulation of thymidine kinase: residues near the carboxyl terminus are essential for the specific degradation of the enzyme at mitosis. Mol. Cell. Biol. 1991, 11, 2538 – 2546. [106] Chang ZF, Huang DY, Chi LM. Serine 13 is the site of mitotic phosphorylation of human thymidine kinase. J. Biol. Chem. 1998, 273, 12095 – 12100. [107] Ke PY, Yang CC, Tsai IC, Chang ZF. Degradation of human thymidine kinase is dependent on serine-13 phosphorylation: involvement of the SCF-mediated pathway. Biochem. J. 2003, 370, 265 – 273. [108] Huang DY, Chang ZF. Interaction of human thymidine kinase 1 with p21 (Waf1). Biochem. J. 2001, 356, 829 – 834. [109] Dobrovolsky VN, Bucci T, Heflich RH, Desjardins J, Richardson FC. Mice deficient for cytosolic thymidine kinase develop fatal kidney disease. Mol. Genet. Metab. 2003, 78, 1 – 10.
123
[110] Szyfter K, Sasvári-Székely M, Spasokukotskaja T, Antoni F, Staub M. Pyrimidine salvage enzymes in human tonsil lymphocytes: II. Purification and properties of deoxycytidine kinase. Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1985, 20, 173 – 182. [111] Johansson M, Karlsson A. Cloning of the cDNA and chromosome localization of the gene for human thymidine kinase 2. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8454 – 8458. [112] Wang L, Eriksson S. Cloning and characterization of full-length mouse thymidine kinase 2: the N-terminal sequence directs import of the precursor protein into mitochondria. Biochem. J. 2000, 351, 469 – 476. [113] Söderlund JC, Arner ES. Mitochondrial versus cytosolic activities of deoxyribonucleoside salvage enzymes. Adv. Exp. Med. Biol. 1994, 370, 201 - 204. [114] Munch-Petersen B, Cloos L, Tyrszed G, Eriksson S. Diverging substrate specificity of pure human thymidine kinases 1 and 2 against antiviral dideoxynucleosides. J. Biol. Chem. 1991, 266, 9032 – 9038. [115] Johansson M, Karlsson A. Cloning and expression of human deoxyguanosine kinase cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1996, 93, 7258 – 7262. [116] Jullig M, Eriksson S. Apoptosis induces efflux of the mitochondrial matrix enzyme deoxyguanosine kinase. J. Biol. Chem. 2001, 276, 24000 – 24004. [117] Zhu C, Johansson M, Permert J, Karlsson A. Phosphorylation of anticancer nucleoside analogs by human mitochondrial deoxyguanosine kinase. Biochem. Pharmacol. 1998, 56, 1035 – 1040. [118] Zhu C, Johansson M, Karlsson A. Differential incorporation of 1-beta-Darabinofuranosylcytosine and 9-beta-D-arabinofuranosylguanine into nuclear and mitochondrial DNA. FEBS Lett. 2000, 474, 129 – 132. [119] Zhu C, Johansson M, Karlsson A. Incorporation of nucleoside analogs into nuclear or mitochondrial DNA is determined by the intracellular phosphorylation site. J. Biol. Chem. 2000, 275, 26727 – 26731. [120] Lotfi K, Mansson E, Peterson C, Eriksson S, Albertioni F. Low level of the mitochondrial deoxyguanosine kinase is the dominant factor in acquired resistance to 9-beta-Darabinofuranosylguanine cytotoxicity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 293, 1489 – 1496. [121] Mandel H, Szargel R, Labay V, Elpeleg O, Saada A, Shalata A, Anbinder Y, Berkowitz D, Hartman C, Barak M, Eriksson S, Cohen N. The deoxyguanosine kinase gene is mutated in individuals with depleted hepatocerebral mitochondrial DNA. Nat. Genet. 2001, 29, 337 – 341. [122] Saada A, Shaag A, Mandel H, Nevo Y, Eriksson S, Elpeleg O. Mutant mitochondrial thymidine kinase in mitochondrial DNA depletion myopathy. Nat. Genet. 2001, 29, 342 – 344. [123] Rampazzo C, Mazzon C, Reichard P, Bianchi V. 5’-Nucleotidases: specific assays for five different enzymes in cell extracts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 293, 258 – 263. [124] Sunderman FW Jr. The clinical biochemistry of 5’-nucleotidase. Ann. Clin. Lab. Sci. 1990, 20, 123 – 139.
124
[125] Zimmermann H, Braun N, Kegel B, Heine P. New insights into molecular structure and function of ectonucleotidases in the nervous system. Neurochem. Int. 1998, 32, 421 – 425. [126] Galmarini CM, Graham K, Thomas X, Calvo F, Rousselot P, El Jafaari A, Cros E, Mackey JR, Dumontet C. Expression of high Km 5’-nucleotidase in leukemic blasts is an independent prognostic factor in adults with acute myeloid leukemia. Blood 2001, 98, 1922 – 1926. [127] Galmarini CM, Thomas X, Calvo F, Rousselot P, Jafaari AE, Cros E, Dumontet C. Potential mechanisms of resistance to cytarabine in AML patients. Leuk. Res. 2002, 26, 621 – 629. [128] Lofgren C, Hjortsberg L, Blennow M, Lotfi K, Paul C, Eriksson S, Albertioni F. Mechanisms of cross-resistance between nucleoside analogues and vincristine or daunorubicin in leukemic cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 320, 825 - 832. [129] Schirmer M, Stegmann AP, Geisen F, Konwalinka G. Lack of cross-resistance with gemcitabine and cytarabine in cladribine-resistant HL60 cells with elevated 5’-nucleotidase activity. Exp. Hematol. 1998, 26, 1223 – 1228. [130] Dumontet C, Fabianowska-Majewska K, Mantincic D, Callet Bauchu E, Tigaud I, Gandhi V, Lepoivre M, Peters GJ, Rolland MO, Wyczechowska D, Fang X, Gazzo S, Voorn DA, Vanier-Viorney A, MacKey J. Common resistance mechanisms to deoxynucleoside analogues in variants of the human erythroleukaemic line K562. Br. J. Haematol. 1999, 106, 78 – 85. [131] Hunsucker SA, Spychala J, Mitchell BS. Human cytosolic 5’-nucleotidase I: characterization and role in nucleoside analog resistance. J. Biol. Chem. 2001, 276, 10498 – 10504. [132] Kazimierczuk Z, Cottam HB, Revankar GR, Robins RK. Synthesis of 2’deoxytubercidine, 2’-deoxyadenosine and related nucleosides via a novel directly stereospecific sodium salt glycosylation method. J. Am. Chem. Soc. 1989, 106, 6379 – 6382. [133] Orzeszko A, Niedzwiecka-Kornas A, Stolarski R, Kazimierczuk Z. Synthesis and conformation of nucleoside-5’-thiosulphates. Z. Natureforsch. 1998, 536, 1191 – 1196. [134] Staub M, Spasokoukotskaja T, Benczur M, Antoni F. DNA synthesis and nucleoside metabolism in human tonsillar lymphocyte subpopulations. Acta Otolaryngol. Suppl. 1988, 454, 118 – 124. [135] Ives DH, Durham JP, Tucker VS. Rapid determination of nucleoside kinase and nucleotidase activities with tritium-labeled substrates. Anal. Biochem. 1969, 28, 192 – 205. [136] Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 1988, 175, 184 – 191. [137] Sherman PA, Fyfe JA. Enzymatic assay for deoxyribonucleoside triphosphates using synthetic oligonucleotides as template primers. Anal. Biochem. 1989, 180, 222 – 226. [138] Hirt B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 1967, 26, 365 – 369.
125
[139] Moroni M, Veronese S, Schiavo R, Carminati O, Sorensen BS, Gambacorta M, Siena S. Epidermal growth factor receptor expression and activation in nonseminomatous germ cell tumors. Clin. Cancer Res. 2001, 7, 2770 – 2775. [140] Sasvári-Székely M, Spasokoukotskaja T, Szőke M, Csapó Z, Turi Á, Szántó I, Eriksson S, Staub M. Activation of deoxycytidine kinase during inhibition of DNA synthesis by 2-chloro2’-deoxyadenosine (Cladribine) in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 1998, 56, 1175 – 1179. [141] Plunkett W, Saunders PP. Metabolism and action of purine nucleoside analogs. Pharmacol. Ther. 1991, 49, 239 – 268. [142] Ceruti S, Franceschi C, Barbieri D, Malorni W, Camurri A, Giammarioli AM, Ambrosini A, Racagni G, Cattabeni F, Abbracchio MP. Apoptosis induced by 2-chloro-adenosine and 2chloro-2’-deoxyadenosine in a human astrocytoma cell line: differential mechanisms and possible clinical relevance. J. Neurosci. Res. 2000, 60, 388 – 400. [143] Sasvári-Székely M, Piróth Z, Kazimierczuk Z, Staub M. A novel effect of the new antileukemic drug, 2-chloro-2’-deoxyadenosine, in human lymphocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 203, 1378 – 1384. [144] Blackburn MR, Datta SK, Kellems RE. Adenosine deaminase-deficient mice generated using a two-stage genetic engineering strategy exhibit a combined immunodeficiency. J. Biol. Chem. 1998, 273, 5093 – 5100. [145] Cristalli G, Costanzi S, Lambertucci C, Lupidi G, Vittori S, Volpini R, Camaioni E. Adenosine deaminase: functional implications and different classes of inhibitors. Med. Res. Rev. 2001, 21, 105 – 128. [146] Iciek MB, Rokita HB, Wlodek LB. Effects of diallyl disulfide and other donors of sulfane sulfur on the proliferation of human hepatoma cell line. Neoplasma 2001, 48, 307 – 312. [147] Golos B, Dzik JM, Kazimierczuk Z, Ciesla J, Zielinski Z, Jankowska J, Kraszewski A, Stawinski J, Rode W, Shugar D. Interaction of thymidylate synthase with the 5’-thiophosphates, 5’-dithiophosphates, 5’-H-phosphonates and 5’-S-thiosulfates of 2’-deoxyuridine, thymidine and 5-fluoro-2’-deoxyuridine. Biol. Chem. 2001, 382, 1439 – 1445. [148] Fabianowska-Majewska K, Tybor K, Duley J, Simmonds A. The influence of 2-chloro-2’deoxyadenosine on metabolism of deoxyadenosine in human primary CNS lymphoma. Biochem. Pharmacol. 1995, 50, 1379 – 1383. [149] Burden DA, Kingma PS, Froelich-Ammon SJ, Bjornsti MA, Patchan MW, Thompson RB, Osheroff M. Topoisomerase II – etoposide interactions direct the formation of drug-induced enzyme-DNA cleavage complexes. J. Biol. Chem. 1996, 271, 29238 – 29244. [150] Yamada K, Itoh R. Involvement of DNA polymerase delta and/or epsilon in joining UVinduced DNA single strand breaks in human fibroblasts (comparison of effects of butylphenyldeoxyguanosine with aphidicolin). Biochim. Biophys. Acta 1994, 1219, 302 – 306. [151] Myllyperkio MH, Koshi TR, Vilpo LM, Vilpo JA. Gamma-irradiation-induced DNA single- and double-strand breaks and their repair in chronic lymphocytic leukemia cells of variable radiosensitivity. Hematol. Cell. Ther. 1999, 41, 95 – 103.
126
[152] de Murcia G, Menissier de Murcia J. Poly(ADP-ribose) polymerase: a molecular nicksensor. Trends Biochem. Sci. 1994, 19, 172 – 176. [153] Pettitt AR, Sherrington PD, Cawley JC. Role of poly(ADP-ribosyl)ation in the killing of chronic lymphocytic leukemia cells by purine analogues. Cancer Res. 2000, 60, 4187 – 4193. [154] Csapó Z, Sasvári-Székely M, Spasokoukotskaja T, Talianidis I, Eriksson S, Staub M. Inhibition of DNA synthesis by aphidicolin activates deoxycytidine kinase in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2001, 61, 191 – 197. [155] Csapó Z, Sasvári-Székely M, Spasokoukotskaja T, Staub M. Modulation of human deoxycytidine kinase activity as a response to cellular stress induced by NaF. Acta Biochim. Pol. 2001, 48, 251 – 256. [156] Meier R, Thelen M, Hemmings BA. Inactivation and dephosphorylation of protein kinase B alpha (PKB alpha) promoted by hyperosmotic stress. EMBO J. 1998, 17, 7294 – 7303. [157] Parrott LA, Templeton DJ. Osmotic stress inhibits p70/85 S6 kinase through activation of a protein phosphatase. J. Biol. Chem. 1999, 274, 24731 – 24736. [158] Kultz D, Madhany S, Burg MB. Hyperosmolality causes growth arrest of murine kidney cells. Induction of GADD 45 and GADD 153 by osmosensing via stress-activated protein kinase 2. J. Biol. Chem. 1998, 273, 13645 – 13651. [159] Van Den Neste E, Smal C, Cardoen S, Delacauw A, Frankard J, Ferrant A, Van den Berghe G, Bontemps F. Activation of deoxycytidine kinase by UV-C-irradiation in chronic lymphocytic leukemia B-lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 573 – 580. [160] Constantinou A, Kiguchi K, Huberman E. Induction of differentiation and DNA strand breakage in human HL-60 and K-562 leukemia cells by genistein. Cancer Res. 1990, 50, 2618 – 2624. [161] Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, Garrett TP, Ward CW, Burgess AW. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp. Cell Res. 2003, 284, 31 – 53. [162] Uhlik MT, Abell AN, Johnson NL, Sun W, Cuevas BD, Lobel-Rice KE, Horne, EA, Dell’Acqua ML, Johnson GL. Rac-MEKK3-MKK3 scaffolding for p38 MAPK activation during hyperosmotic shock. Nat. Cell Biol. 2003, 5, 1104 – 1110. [163] Mattingly RR, Milstein ML, Mirkin BL. Down-regulation of growth factor-stimulated MAP kinase signaling in cytotoxic drug-resistant human neuroblastoma cells. Cell. Signal. 2001, 13, 499 – 505. [164] Oren M. Decision making by p53: life, death and cancer. Cell Death Differ. 2003, 10, 431 – 442. [165] Genini D, Budihardjo I, Plunkett W, Wang X, Carrera CJ, Cottam HB, Carson DA, Leoni LM. Nucleotide requirements for the in vitro activation of the apoptosis protein-activating factor-1-mediated caspase pathway. J. Biol. Chem. 2000, 275, 29 – 34.
127
[166] Borner MM, Joncourt F, Hotz MA. Similarity of apoptosis induction by 2chlorodeoxyadenosine and cisplatin in human mononuclear blood cells. Br. J. Cancer 1997, 76, 1448 – 1454. [167] Komarov PG, Komarova EA, Kondratov RV, Christov-Tselkov K, Coon JS, Chernov MV, Gudkov AV. A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy. Science 1999, 285, 1733 – 1737. [168] Dieter P, Fitzke E, Duyster J. BAPTA induces a decrease of intracellular free calcium and a translocation and inactivation of protein kinase C in macrophages. Biol. Chem. Hoppe Seyler 1993, 374, 171 – 174. [169] Gouy H, Cefai D, Christensen SB, Debre P, Bismuth G. Ca2+ influx in human T lymphocytes is induced independently of inositol phosphate production by mobilization of intracellular Ca2+ stores. A study with the Ca2+ endoplasmic reticulum-ATPase inhibitor thapsigargin. Eur. J. Immunol. 1990, 20, 2269 – 2275. [170] Geiszt M, Káldi K, Szeberényi J, Ligeti E. Thapsigargin inhibits Ca2+ entry into human neutrophil granulocytes. Biochem. J. 1995, 305, 525 – 528. [171] Anglana M, Apiou F, Bensimon A, Debatisse M. Dynamics of DNA replication in mammalian somatic cells: nucleotide pool modulates origin choice and interorigin spacing. Cell 2003, 114, 385 – 394. [172] Bianchi V, Borella S, Rampazzo C, Ferraro P, Calderazzo F, Bianchi LC, Skog S, Reichard P. Cell cycle-dependent metabolism of pyrimidine deoxynucleoside triphosphates in CEM cells. J. Biol. Chem. 1997, 272, 16118 – 16124. [173] Gandhi V, Estey E, Keating MJ, Chucrallah A, Plunkett W. Chlorodeoxyadenosine and arabinosylcytosine in patients with acute myelogenous leukemia: pharmacokinetic, pharmacodynamic, and molecular interactions. Blood 1996, 87, 256 – 264. [174] Taub JW, Huang X, Matherly LH, Stout ML, Buck SA, Massey GV, Becton DL, Chang MN, Weinstein HJ, Ravindranath Y. Expression of chromosome 21-localized genes in acute myeloid leukemia: differences between Down syndrome and non-Down syndrome blast cells and relationship to in vitro sensitivity to cytosine arabinoside and daunorubicin. Blood 1999, 94, 1393 – 1400. [175] Taub JW, Huang X, Ge Y, Dutcher JA, Stout ML, Mohammad RM, Ravindranath Y, Matherly LH. Cystathione-beta-synthase cDNA transfection alters the sensitivity and metabolism of 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine in CCRF-CEM leukemia cells in vitro and in vivo: a model of leukemia in Down syndrome. Cancer Res. 2000, 60, 6421 – 6426. [176] Yoshioka A, Tanaka S, Hiraoka O, Koyama Y, Hirota Y, Ayusawa D, Seno T, Garrett C, Wataya Y. Deoxyribonucleoside triphosphate imbalance. 5-fluorodeoxyuridine-induced DNA double strand breaks in mouse FM3A cells and the mechanism of cell death. J. Biol. Chem. 1987, 262, 8235 – 8241. [177] Melnyk S, Pogribna M, Miller BJ, Basnakian AG, Pogribny IP, James SJ. Uracil misincorporation, DNA strand breaks, and gene amplification are associated with tumorigenic cell transformation in folate deficient/repleted Chinese hamster ovary cells. Cancer Lett. 1999, 146, 35 – 44.
128
[178] Goan YG, Zhou B, Hu E, Mi S, Yen Y. Overexpression of ribonucleotide reductase as a mechanism of resistance to 2,2-difluorodeoxycytidine in the human KB cancer cell line. Cancer Res. 1999, 59, 4204 – 4207. [179] Mansson E, Flordal E, Liliemark J, Spasokoukotskaja T, Elford H, Lagercrantz S, Eriksson S, Albertioni F. Down-regulation of deoxycytidine kinase in human leukemic cell lines resistant to cladribine and clofarabine and increased ribonucleotide reductase activity contributes to fludarabine resistance. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 237 – 247. [180] Cardoen S, Van Den Neste E, Smal C, Rosier JF, Delacauw A, Ferrant A, Van den Berghe G, Bontemps F. Resistance to 2-chloro-2’-deoxyadenosine of the human B-cell leukemia cell line EHEB. Clin. Cancer Res. 2001, 7, 3559 – 3566. [181] Davidson JD, Ma L, Flagella M, Geeganage S, Gelbert LM, Slapak CA. An increase in the expression of ribonucleotide reductase large subunit 1 is associated with gemcitabine resistance in non-small cell lung cancer cell lines. Cancer Res. 2004, 64, 3761 – 3766. [182] Fritzer-Szekeres M, Salamon A, Grusch M, Horvath Z, Hochtl T, Steinbrugger R, Jager W, Krupitza G, Elford HL, Szekeres T. Trimidox, an inhibitor of ribonucleotide reductase, synergistically enhances the inhibition of colony formation by Ara-C in HL-60 human promyelocytic leukemia cells. Biochem. Pharmacol. 2002, 64, 481 – 485. [183] Zhu C, Johansson M, Karlsson A. The subcellular location of nucleoside analog phosphorylation is a determinant of synergistic effects of hydroxyurea. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 276, 179 – 182. [184] Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, Mattioli M, Cattoretti G, Husson H, Freedman A, Inghirami G, Cro L, Baldini L, Neri A, Califano A, Dalla-Favera R. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J. Exp. Med. 2001, 194, 1625 – 1638. [185] Gandhi V, Plunkett W. Modulation of arabinosylnucleoside metabolism by arabinosylnucleotides in human leukemia cells. Cancer Res. 1988, 48, 329 – 334. [186] Xie KC, Plunkett W. Deoxynucleotide pool depletion and sustained inhibition of ribonucleotide reductase and DNA synthesis after treatment of human lymphoblastoid cells with 2-chloro-9-(2-deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl) adenine. Cancer Res. 1996, 56, 3030 – 3037. [187] Aye MT, Dunne JV. Effect of 2’-deoxycoformycin on erythroid, granulocytic, and Tlymphocyte colony growth. Blood 1981, 58, 1043 – 1046. [188] Hayward AR. Resistance of pokeweed mitogen-stimulated B cells to inhibition by deoxyadenosine. Clin. Exp. Immunol. 1980, 41, 141 – 149. [189] Paine RM, Weston BJ, Clink HM, Kohn J, Neville AM, McGhee KG, Harrap KR. Toxicity and immunosuppressive activity of binary combinations of 2’-deoxycoformycin and 2’-deoxyadenosine. Cancer Treat. Rep. 1981, 65, 259 – 266. [190] Ganeshaguru K, Ho AD, Piga A, Catovsky D, Hoffbrand AV. Biochemical mechanisms of deoxycoformycin toxicity in chronic leukemias. Leuk. Res. 1987, 11, 941 – 945.
129
[191] van Haperen VW, Veerman G, Vermorken JB, Pinedo HM, Peters G. Regulation of phosphorylation of deoxycytidine and 2’, 2’-difluorodeoxycytidine (gemcitabine); effects of cytidine 5’-triphosphate and uridine 5’-triphosphate in relation to chemosensitivity for 2’, 2’difluorodeoxycytidine. Biochem. Pharmacol. 1996, 51, 911 – 918. [192] Bohman C, Kierdaszuk B, Eriksson S. Negative cooperativity and different conformational states of human deoxycytidine kinase. Purification and characterization of human deoxycytidine kinase. Kongl Carolinska Medico Chirurgiska Institutet, Stockholm, 1989. V. fejezet (könyvrészlet). [193] Mani RS, Usova EV, Eriksson S, Cass CE. Hydrodynamic and spectroscopic studies of substrate binding to human recombinant deoxycytidine kinase. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2003, 22, 175 – 192. [194] Carson DA, Kaye J, Seegmiller JE. Lymphospecific toxicity in adenosine deaminase deficiency: possible role of nucleoside kinase(s). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1997, 74, 5677 – 5681. [195] Bilgeri R, Petzer AL, Zilian U, Geisen FH, Schirmer M, Haun M, Konwalinka G. Effect of deoxycytidine on 2-chloro-deoxyadenosine-mediated growth inhibition of normal human erythroid and myeloid progenitor cells. Exp. Hematol. 1993, 21, 432 – 437. [196] Mancini WR, Lin TS. Ribo- and deoxyribonucleoside effect on 3’-amino-2’,3’dideoxycytidine-induced cytotoxicity in cultured L1210 cells. Biochem. Pharmacol. 1983, 32, 2427 – 2432. [197] Tamura RN, Cox GS. Effect of pyrimidine deoxynucleosides and sodium butyrate on expression of the glycoprotein hormone alpha-subunit and placental alkaline phosphatase in HeLa cells. Biochim. Biophys. Acta 1988, 968, 151 – 159. [198] Sargent JM, Williamson CJ, Hubeek I, Elgie AW, Taylor CG, Den Boer ML, Peters GJ, Kaspers GL. Aphidicolin decreases ex vivo resistance to cytosine arabinoside in childhood acute leukaemia. Oncol. Rep. 2003, 10, 2027 – 2031. [199] Ooi K, Ohkubo T, Higashigawa M, Kawasaki H, Sakurai M. Increased deoxycytidine kinase activity by etoposide in L1210 murine leukemic cells. Biol. Pharm. Bull. 1996, 19, 1382 – 1383. [200] van Moorsel CJ, Pinedo HM, Veerman G, Guechev A, Smid K, Loves WJ, Vermorken JB, Postmus PE, Peters GJ. Combination chemotherapy studies with gemcitabine and etoposide in non-small cell lung and ovarian cancer cell lines. Biochem. Pharmacol. 1999, 57, 407 – 415. [201] Kroep JR, Giaccone G, Tolis C, Voorn DA, Loves WJ, Groeningen CJ, Pinedo HM, Peters GJ. Sequence dependent effect of paclitaxel on gemcitabine metabolism in relation to cell cycle and cytotoxicity in non-small-cell lung cancer cell lines. Br. J. Cancer 2000, 83, 1069 – 1076. [202] Xu YZ, Huang P, Plunkett W. Functional compartmentation of salvaged deoxycytidine for DNA repair in human lymphoblasts. J. Biol. Chem. 1995, 270, 631 – 637. [203] Sasvári-Székely M, Szabó G Jr, Staub M, Spasokukotskaja T, Antoni F. Discrepancies between flow cytometric analysis and [3H]thymidine incorporation in stimulated lymphocytes. Biochim. Biophys. Acta 1983, 762, 452 – 457.
130
[204] Kreder NC, van Bree C, Peters GJ, Loves WJ, Haveman J. Enhanced levels of deoxycytidine kinase and thymidine kinase 1 and 2 after pulsed low dose rate irradiation as an adaptive response to radiation. Oncol. Rep. 2002, 9, 141 – 144. [205] Boothman DA, Davis TW, Sahijdak WM. Enhanced expression of thymidine kinase in human cells following ionizing radiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 1994, 30, 391 – 398. [206] Wei S, Ageron-Blanc A, Petridis F, Beaumatin J, Bonnet S, Luccioni C. Radiationinduced changes in nucleotide metabolism of two colon cancer cell lines with different radiosensitivities. Int. J. Radiat. Biol. 1999, 75, 1005 – 1013. [207] Milas L, Fujii T, Hunter N, Elshaikh M, Mason K, Plunkett W, Ang KK, Hittelman W. Enhancement of tumor radioresponse in vivo by gemcitabine. Cancer Res. 1999, 59, 107 – 114. [208] Shimoyama RK, Seto S, Mori C. Protection by various deoxynucleosides against deoxyadenosine-induced DNA damage in adenosine-deaminase inactivated lymphocytes. Mol. Genet. Metab. 1999, 68, 455 – 460. [209] Lin L, Kuroiwa N, Moriyama Y, Fujimura S. Continuous increase in phosphorylation of cytosolic thymidine kinase during proliferation of rat hepatoma JB1 cells. Oncol. Rep. 2003, 10, 665 – 669. [210] Contessa JN, Hampton J, Lammering G, Mikkelsen RB, Dent P, Valerie K, SchmidtUllrich RK. Ionizing radiation activates Erb-B receptor dependent Akt and p70 S6 kinase signaling in carcinoma cells. Oncogene 2002, 21, 4032 – 4041. [211] Wang LM, Kucera GL. Deoxycytidine kinase is phosphorylated in vitro by protein kinase C alpha. Biochim. Biophys. Acta 1994, 1224, 161 – 167. [212] Spasokoukotskaja T, Csapó Z, Sasvári-Székely M, Virga S, Talianidis I, Eriksson S, Staub M. Effect of phosphorylation on deoxycytidine kinase activity. Adv. Exp. Med. Biol. 2000, 486, 281 – 285. [213] Mohammad RM, Beck FW, Katato K, Hamdy N, Wall N, Al-Katib A. Potentiation of 2chlorodeoxyadenosine activity by bryostatin 1 in the resistant chronic lymphocytic leukemia cell line (WSU-CLL): association with increased ratios of dCK/5'-NT and Bax/Bcl-2. Biol. Chem. 1998, 379, 1253 – 1261. [214] Sachsenmaier C, Radler-Pohl A, Zinck R, Nordheim A, Herrlich P, Rahmsdorf HJ. Involvement of growth factor receptors in the mammalian UVC response. Cell 1994, 78, 963 – 972. [215] Ho AK, Chik CL, Klein DC. Permissive role of calcium in alpha 1-adrenergic stimulation of pineal phosphatidylinositol phosphodiesterase (phospholipase C) activity. J. Pineal Res. 1988, 5, 553 – 564. [216] Quintanilla RA, Porras OH, Castro J, Barros LF. Cytosolic [Ca(2+)] modulates basal GLUT1 activity and plays a permissive role in its activation by metabolic stress and insulin in rat epithelial cells. Cell Calcium 2000, 28, 97 – 106. [217] Grune S, Engelking LR, Anwer MS. Role of intracellular calcium and protein kinases in the activation of hepatic Na+/taurocholate cotransport by cyclic AMP. J. Biol. Chem. 1993, 268, 17734 – 17741.
131
[218] Tian Y, Smith RD, Balla T, Catt KJ. Angiotensin II activates mitogen-activated protein kinase via protein kinase C and Ras/Raf-1 kinase in bovine adrenal glomerulosa cells. Endocrinology 1998, 139, 1801 – 1809. [219] Miranda FF, Teigen K, Thorolffson M, Svebak RM, Knappskog PM, Flatmark T, Martinez A. Phosphorylation and mutations of Ser(16) in human phenylalanine hydroxylase. Kinetic and structural effects. J. Biol. Chem. 2002, 277, 40937 – 40943. [220] Weigel NL, Beck CA, Estes PA, Prendergast P, Altmann M, Christensen K, Edwards DP. Ligands induce conformational changes in the carboxyl-terminus of progesterone receptors which are detected by a site-directed antipeptide monoclonal antibody. Mol. Endocrinol. 1992, 6, 1585 – 1597. [221] Gual P, Baron V, Alengrin F, Van Obberghen E. A conformational change in the betasubunit of the insulin-like growth factor I receptor identified by antipeptide antibodies. Endocrinology 1995, 136, 5298 – 5304. [222] Carden MJ, Schlaepfer WW, Lee VM. The structure, biochemical properties, and immunogenicity of neurofilament peripheral regions are determined by phosphorylation state. J. Biol. Chem. 1985, 260, 9805 – 9817. [223] Gomez-Cambronero J, Huang CK, Gomez-Cambronero TM, Waterman WH, Becker EL, Sha’afi RI. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced protein tyrosine phosphorylation of microtubule-associated protein kinase in human neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1992, 89, 7551 – 7555. [224] Amster-Choder O, Wright A. Modulation of the dimerization of a transcriptional antiterminator protein by phosphorylation. Science 1992, 257, 1395 – 1398. [225] Ahn SG, Thiele DJ. Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress. Genes Dev. 2003, 17, 516 – 528. [226] Rich T, Allen RL, Wyllie AH. Defying death after DNA damage. Nature 2000, 407, 777 – 783. [227] Wattel E, Preudhomme C, Hecquet B, Vanrumbeke M, Quesnel B, Dervite E, Morel P, Fenaux P. p53 mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignancies. Blood 1994, 84, 3148 – 3157. [228] Dohner H, Fischer C, Bentz M, Hansen K, Benner A, Cabot G, Diehl D, Schlenk R, Coy J, Stilgenbauer S, Volkmann M, Galle PR, Poustka A, Hunstein W, Lichter P. p53 gene deletion predicts for poor survival and non-response to therapy with purine analogues in chronic B-cell leukaemias. Blood 1995, 85, 1580 – 1589. [229] Szondy Z. The 2-chlorodeoxyadenosine-induced cell death signalling pathway in human thymocytes is different from that induced by 2-chloroadenosine. Biochem. J. 1995, 311, 585 – 588. [230] Gartenhaus RB, Wang P, Hoffman M, Janson D, Rai KR. The induction of p53 and WAF1/CIP1 in chronic lymphocytic leukaemia cells treated with 2-chlorodeoxyadenosine. J. Mol. Med. 1996, 74, 143 – 147.
132
[231] Pezzella F, Micklem K, Turley H, Pulford K, Jones M, Kocialkowski S, Delia D, Aiello A, Bicknell R, Smith K. Antibody for detecting p53 protein by immunohistochemistry in normal tissues. J. Clin. Pathol. 1994, 47, 592 – 596.
133
9.
I.
A DOLGOZAT TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK
Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Keszler G, Albertioni F, Eriksson S, Staub M. Treatment of normal and malignant cells with nucleoside analogues and etoposide enhances deoxycytidine kinase activity. Eur. J. Cancer 1999, 35, 1862 – 1867. (Imp. F.: 2,537)
II.
Keszler G, Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Staub M. Implication of deoxycytidine kinase activation in deoxyadenosine-mediated cytotoxicity. kézirat, közlésre elküldve
III.
Csapó Z, Keszler G, Sasvári-Székely M, Smid K, Noordhuis P, Peters GJ, Staub M. Similar changes were induced by Cladribine and by Gemcitabine, in the deoxypyrimidine salvage, during short-term treatments. Adv. Exp. Med. Biol. 1998, 431, 525 – 529. (Imp. F.: 0,360)
IV.
Keszler G, Szikla K, Kazimierczuk Z, Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Staub M. Selective activation of deoxycytidine kinase by thymidine-5’thiosulphate and release by deoxycytidine in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 563 – 571. (Imp. F.: 2,993)
V.
Csapó Z, Keszler G, Sáfrány G, Spasokoukotskaja T, Talianidis I, Staub M, Sasvári-Székely M. Activation of deoxycytidine kinase by gamma-irradiation and inactivation by hyperosmotic shock in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 2031 – 2039. (Imp. F.: 2,993)
VI.
Keszler G, Spasokoukotskaja T, Csapó Z, Virga S, Staub M, Sasvári-Székely M. Selective increase of dATP pools upon activation of deoxycytidine kinase in lymphocytes: implications in apoptosis. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004, 23, 257 – 264. (Imp. F.: 0,813)
134
VII.
Keszler G, Spasokoukotskaja T, Csapó Z, Talianidis I, Eriksson S, Staub M, Sasvári-Székely M. Activation of deoxycytidine kinase in lymphocytes is calcium dependent and involves a conformational change detectable by native immunostaining. Biochem. Pharmacol. 2004, 67, 947 – 955. (Imp. F.: 2,993)
EGYÉB MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK
1. Keszler G, Csapó Z, Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Virga S, Demeter A, Eriksson S, Staub M. Hyperthermy increases the phosphorylation of deoxycytidine in the membrane phospholipid precursors and decreases its incorporation into DNA. Adv. Exp. Med. Biol. 2000, 486, 333 – 337. (Imp. F.: 0,513) 2. Demeter A, Abonyi M, Look KY, Keszler G, Staub M, Weber G. Differences in thermostability of thymidine kinase isoenzymes in normal ovary and ovarian carcinoma. Anticancer Res. 2001, 21, 353 – 358. (Imp. F.: 1,416) 3. Keszler G, Spasokoukotskaja T, Virga S, Sasvári-Székely M, Staub M. Stimulation of deoxycytidine kinase results in prolonged maintenance of the enzyme activity. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004, 23, 279 – 283. (Imp. F.: 0,813) 4. Rónai Z, Guttman A, Keszler G, Sasvári-Székely M. Capillary electrophoresis study on DNA-protein complex formation in the polymorphic 5’ upstream region of the dopamine D4 receptor (DRD4) gene. Curr. Med. Chem. 2004, 11, 1241 – 1253. (Imp. F.: 4,409)
135
