Kétirányú transzplacentáris DNS transzport Új lehetőségek a nem-invazív praenatális diagnosztikában
doktori értekezés Dr. Lázár Levente
Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Hivatalos bírálók:
Dr. László Zsuzsanna tudományos főmunkatárs Dr. Prohászka Zoltán tudományos munkatárs
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Fekete György egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Hajdú Júlia egyetemi docens Dr. Nagy Gyula osztályvezető főorvos Dr. Tiba János osztályvezető főorvos
Budapest 2007
TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés….………………………………………………………………
5. oldal
1. 1. A sejttől független szabad DNS………………………………….
5. oldal
1. 2. Az anyai vérben fellelhető szabad magzati DNS………………...
7. oldal
1. 2. 1. A méhlepény szerkezete…………………………………...
7. oldal
1. 2. 2. A transzplacentáris transzport……………………………..
8. oldal
1. 2. 3. Magzati DNS az anyai keringésben……………………….
8. oldal
1. 2. 3. 1. A szabad magzati DNS eredete……………………
8. oldal
1. 2. 3. 1. 1. Haematopoeticus eredet………………….
9. oldal
1. 2. 3. 1. 2. Méhlepényi eredet………………………..
10.oldal
1. 2. 3. 1. 3. Direkt feto-maternális transzfer………….
11.oldal
1. 2. 3. 2. A szabad magzati DNS mennyisége és minősége szövődménymentes terhesség esetén………………………...
11. oldal
1. 2. 3. 3. A szabad magzati DNS mennyiségi és minőségi változása kóros terhesség esetén…………………………….
13. oldal
1. 2. 3. 4. A feto-maternalis sejt és DNS transzport immunológiai konzekvenciái………………………………..
15. oldal
1. 3. Anyai sejtek és anyai DNS a köldökzsinórvérben, valamint a magzati keringésben…………………………………………………..
16. oldal
2. Célkitűzések…….………………………………………………………..
18. oldal
3. Anyag és módszer.……………………………………………………….
20. oldal
3. 1. Magzatvízminták…………………………………………………
20. oldal
3. 2. Vérminták………………………………………………………...
20. oldal
3. 2. 1. Vérminták magzati nem meghatározására és szabad magzati DNS quantitatív vizsgálatához…………………………...
20. oldal
3. 2. 2. Vérminták magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározásához………………………………………………..
20. oldal
3. 2. 3. Vérminták anyai DNS kimutatására újszülöttek perifériás véréből…………………………………………………………….
20. oldal
3. 2. 4. Vérminták újszülöttek szerológiai vizsgálatához…………
21. oldal
3. 2. 5. Vérminták szabad magzati DNS kimutatására méhen 21. oldal
2
kívüli terhesség és kontroll csoport esetén……………………….. 3. 2. 6. Vérminták β-hCG meghatározásához……………………..
21. oldal
3. 3. Műszerek…………………………………………………………
21. oldal
3. 4. Reagensek………………………………………………………..
22. oldal
3. 5. Oligonucleotid primerek és jelölt próbák……………………….
24. oldal
3. 6. Felhasznált számítógépes programok……………………………
24. oldal
3. 7. Módszerek………………………………………………………..
24. oldal
3. 7. 1. Cytogenetikai vizsgálat……………………………………
24. oldal
3. 7. 2. Valósidejű (real-time) PCR vizsgálat……………………..
25. oldal
3. 7. 2. 1. DNS izolálás magzati nem, magzati Rh(D) status meghatározására, valamint magzati DNS kimutatására méhen kívüli terhesség és kontroll csoport esetén…………...
27. oldal
3. 7. 2. 2. DNS izolálás anyai DNS meghatározása céljából...
27. oldal
3. 7. 2. 3. DNS izolálás magzatvízmintából………………….
28. oldal
3. 7. 2. 4. Polimeráz láncreakció……………………………..
28. oldal
3. 7. 2. 5. A PCR termékek detektálása………………………
29. oldal
3. 7. 2. 6. β-hCG meghatározása……………………………..
30. oldal
3. 7. 2. 7. Ellenanyagszűrés…………………………………..
30. oldal
3. 7. 3. Statisztikai értékelés……………………………………….
30. oldal
4. Eredmények….…………………………………………………………...
32. oldal
4. 1. A szabad magzati DNS jelenléte az anyai vérben………………..
32. oldal
4. 1. 1. A magzati nem nem-invazív meghatározása………………
32. oldal
4. 1. 2. A szabad magzati DNS mennyisége az SRY-pozitív esetekben…………………………………………………………..
36. oldal
4. 2. A magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározása anyai vérplazmából………………………………………………..
39. oldal
4. 3. Az anyai eredetű DNS kimutatása újszülöttek véréből………….
40. oldal
4. 4. Szabad magzati DNS meghatározása méhen kívüli terhesség esetén…………………………………………
44. oldal
5. Megbeszélés..……………………………………………………………..
46. oldal
6. Következtetések …………………………………………………………
54. oldal
7. Összefoglalás..…………………………………………………………….
56. oldal
8. Rövidítések…..……………………………………………………………
60. oldal
3
9. Köszönetnyilvánítás …………………………………………………….
62. oldal
10. Irodalomjegyzék………………………………………………………...
63. oldal
11. Saját irodalom jegyzéke………………………………………………... 79. oldal 11. 1. Az értekezés során felhasznált saját irodalom………………….
79. oldal
11. 1. 1. Lektorált közlemények…………………………………..
79. oldal
11. 1. 2. Idézhető absztraktok…………………………………….
79. oldal
11. 2. Egyéb, nem az értekezés témájában megjelent saját közlemények…………………………………………………………..
80. oldal
11. 2. 1. Lektorált közlemények………………………………….
80. oldal
11. 2. 2. Idézhető absztraktok……………………………………..
81. oldal
4
I. BEVEZETÉS
1. Bevezetés 1. 1. A sejttől független szabad DNS Több mint 59 éve azelőtt, hogy Watson és Crick a DNS kettős spirál szerkezetére fényt derített,
Mandel
és
Métais
emberi
vérplazmából
sejttől
független
szabad
dezoxiribonuleinsavat (DNS) izolált [98]. Perklórsavval végzett kicsapással mind az egészséges, mind a különböző betegségekben szenvedő páciensek véréből szabad RNS-t és DNS-t mutattak ki változó mennyiségben. Ezt az úttörő munkát azonban az elkövetkező években nem követte intenzív kutatás. Az 1960-as években a kutatások főként autoimmun betegségek vizsgálatára korlátozódtak. Számos vizsgálattal igazolták Systemas Lupus Erythematosus
(SLE)
[154],
rheumatoid
arthritis,
glomerulonephritis,
pancreatitis,
cholelithiasis, hepatopathia, oesophagitis esetében a szabad DNS jelenlétét [59,80,124,148]. Egészséges felnőttek keringésében Steinman és munkatársai az izolált szabad DNS mennyiségét 10-30 ng/ml-nek becsülte [148]. Leon és munkatársai 1977-ben radioimmunessay-vel végzett vizsgálatuk eredményeként 173 tumoros beteg és 55 egészséges kontroll esetében elsőként számoltak be malignus betegekség esetén a szabad DNS jelenlétéről a perifériás vérben, megjegyezvén, hogy a szabad DNS mennyisége, ezen betegeknél (180 ng/ml) eltér az egészséges kontrolloknál (13 ng/ml) mért szabad DNS mennyiségétől [71,72]. Az elvégzett vizsgálatok a tumor lokalizációját és kiterjedését tekintve nem találtak összefüggést a szabad DNS mennyisége, valamint a tumor helye és mérete között. Távoli metasztázissal rendelkező betegek esetében azonban többnek bizonyult a szabad magzati DNS mennyisége, mint nem metasztatizált tumoros betegek esetében. A malignus betegségek kialakulása folyamán zajló tumorneogenezis számos genetikai és epigenetikai változást von maga után: pontmutáció, kromoszóma újrarendeződés, mikroszatellita instabilitás, promóter hypermetiláció. Ezen genetikai változások számos esetben a tumor szöveten kívül, a plazmában keringő DNS-ben, is kimutathatóak. Ezáltal a plazmában fellelhető szabad DNS kimutatása, mennyiségi és minőségi meghatározása nem csupán a malignus betegség kimutatására, hanem a betegség prognózisának meghatározására és a terápia hatékonyságának monitorizálására is alkalmasnak bizonyult. Az 1. táblázatban azok a tumoros betegségek és „gén markereik” szerepelnek, amelyek a tumorszöveten kívül a plazmában keringő szabad DNS-ben is kimutathatóak [4,20,27,40,49,50,60,96,100,103,125, 126,138,145,163,171,173].
5
I. BEVEZETÉS
1. táblázat: A plazma DNS-ben talált változások különböző malignus betegségek esetében. (MDS-myelodysplasias syndroma, AML-akut myeloid leukaemia, MA-mikrosatellita változások, SCLC-kissejtes tüdőrák, NSCLC-nem kissejtes tüdőrák).
Tumor típusa
Vizsgált gén
Plazma DNS-mutáció %
MDS/AML Pancreas Fej, nyak SCLC
N-ras K-ras MA MA P53 K-ras P53 MA Ig nehéz lánc MA MA Hypermetiláció Hypermetiláció P53
50 100 29 71 10 43 23 23 86 63 28 73 73 13
Colorectalis
Lymphoma Vese NSCLC Máj Emlő
Mindamellett, hogy a szabad DNS jelenléte egészséges és különböző betegségben szenvedő személyek esetében nyilvánvaló; a folyamat, ahogyan a DNS a keringésbe kerül korántsem tisztázott. A szabad DNS forrása nem beteg egyénekben nagy valószínűséggel a keringő lymphocyták és más magvas vérsejtek. Tumoros betegek esetében ennek megfelelően a szabad DNS egy része szintén a lymphocytákból származik –erre utal a szabad DNS-ben kimutatható vad allél jelenléte– nagyobb része azonban, a tumorsejtekből származik. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a tumor progressziója esetén a szabad DNS mennyisége megnövekszik, hatékony terápia esetén pedig csökken [37,72], illetve a szabad DNS-ben fellelhető, a tumorsejt DNS-ére jellemző genetikai változások (pl: heterozigótaság elvesztése (LOH)) jelenléte is. A DNS-nek a sejtből a plazmába jutását illetően három lehetséges mechanizmus jön szóba: a tumor necrosisa, a tumorsejtek apoptózisa és a DNS tumorsejtek által történő aktív kibocsátása. A nekrózis ellen szól, hogy a malignus betegségek terápiája kapcsán alkalmazott sugárkezelést követően a szabad DNS mennysiége a tumorsejtek nagyszámú pusztulása ellenére csökken. A szabad DNS-fragmentumok gélelektroforézissel, valamint elektron mikroszkóppal történő vizsgálata arra utal, hogy a szabad DNS főként a neoplasticus sejtek apoptózisával kerül a keringésbe. Harmadik lehetőségként merül fel a sejtek aktív DNS
6
I. BEVEZETÉS „ürítése”. Számos tanulmány bizonyította, hogy in vitro körülmények között a lymphocytákból, vagy egész szervekből spontán szabadulnak ki nucleoprotein komplexek. Phytohaemagglutinin aktivációt követően a lymphocyták szelektíven szintetizálják genomjuk bizonyos szakaszait, és azt kiválasztják a tenyésztési közegbe [121]. Hasonló jelenség figyelhető meg in vivo egerekben, ahol bakteriális lipopolysaccharidok adását követően szintén észlelhető volt a plazma DNS koncentrációjának növekedése [38]. 1. 2. Az anyai vérben fellelhető szabad magzati DNS 1. 2. 1. A méhlepény szerkezete A humán placenta szerkezetét tekintve a haemochorioendothelialis típusú méhlepények közé sorolandó. Kialakulása a megtermékenyülést követő 7-12. napon, a beágyazódással veszi kezdetét. A zygota osztódása során a 6. napig blastulává, majd blastocystává alakul. A blastocysta falát alkotó trophoblast sejtek a beágyazódás során intenzíven szaporodnak, ennek következtében a blastocysta falán trophoblast bimbók jelennek meg. A trophoblast bolyhokat (primaer bolyhok) alkotó sejtek differenciálódnak. A felszínen syncytiotrophoblast, alatta a Langhans-féle cytotrophoblast réteg alakul ki. A sejtoszlopokká alakult trophoblast bimbók tengelyébe belenő a pete extraembrionalis mesenchimája (secunder bolyhok). A megtermékenyülést követő huszadik napon a secunder bolyhok tengelyében megjelennek az erek, a sejtoszlopok oldalágakat fejlesztenek, melynek eredményeként kialakul a petekamra. A 12. terhességi héten már csak a decidua baslisnak megfelelően észlelhető boholyrendszer, a 16. hétre a bolyhok szerkezetének kialakulása befejeződik. A boholyrendszer fejlődése, növekedése a 28. terhességi hétig tart. A bolyhok közötti üregrendszert (intervillosus űr) anyai vér tölti ki. Az anyai és magzati vért 2-5µm vastagságú membrán választja el. Ezt a membránt a syncytiotrophoblast, cytotrophoblast, a bolyhok mesenchymája valamint a boholykapillárisok endotheliuma alkotja. Az uteroplacentaris ereken az intervillosus térbe jutó anyai vér a chorionlemeznek ütközve visszafordul, és az uteroplacentáris vénákon és széli sinusokon keresztül áramlik vissza az anyai keringésbe. A magzati vér a köldökzsinórban futó két artérián jut a lepénybe, amelyek az amnion alatt ágakra oszolva a chorionlemezen áthatolva juttatják a magzati vért a másod és harmadrendű bolyhokhoz. A lepény véráramlását az anyai oldalon az arteriovenosus nyomáskülönbség, a méhizomzat contractiója valamint a placentaris bolyhok pulzálása tarja fenn, a magzati oldal keringéséért a magzati szívműködés felelős.
7
I. BEVEZETÉS 1. 2. 2. A transzplacentáris transzport A méhlepénynek a gázcserében, a magzat táplálásában, valamint a kóros anyagcseretermékek kiválasztásában betöltött szerepét az anyai és a magzati keringést elválasztó „membrán” tulajdonságai határozzák meg. A transzplacentáris transzport, jelenlegi tudásunk szerint négyféle módon zajlik. Az oxigén, a szén-dioxid és az egy vegyértékű ionok egyszerű diffúzióval, a koncentrációgrádiensnek megfelelően jutnak át a lepényen. A két vegyértékű ionok és a glükóz, facilitált diffúzióval, transzportanyagok segítségével, a jelentős energiát igénylő aminosvak, vitaminok aktív transzporttal, az ennél nagyobb molekulák, sejtek pinocytosis útján kerülnek az anyai oldalról a magzati, illetve a magzati oldalról az anyai oldalra. 1. 2. 3. Magzati DNS az anyai keringésben Mandel és Métais felfedezését követően több évtizednek kellett eltelnie ahhoz, hogy a szabad DNS jelenléte ismét felébressze a tudományos és a klinikai érdeklődést [98]. Az anyai vérben keringő szabad magzati DNS kimutatására és a kutatások eredményének közlésére elsőként 1997-ben került sor. A szabad magzati DNS meghatározása Y kromoszóma specifikus DYS14 próba felhasználásával történt Lo és munkacsoportja által, 43 terhes esetében a terhesség 12. és 40. hete között [82]. Az elvégzett vizsgálatok 70%-ban igazolták a magzati DNS jelenlétét (Y kromoszóma) az anyai szérumban. Ugyanazon terhesek esetében, a szeparált sejtes elemek vizsgálata során mindössze 17%-ban sikerült igazolni az Y kromoszóma jelenlétét. Ez a vizsgálati eredmény lendületet adott a szabad magzati DNS további vizsgálatához lévén, hogy a szabad magzati DNS jelenléte az anyai vérben, szérumban és plazmában, mennyiségét tekintve jelentősebbnek bizonyult, mint az addig vizsgált magzati sejtek. 1. 2. 3. 1. A szabad magzati DNS eredete A lepény mikroszkopikus szerkezete, amelyet az előző fejezetben tárgyaltam, nem teszi lehetővé a DNS-molekulák ilyen mértékű transzportját a feto-maternalis barrieren keresztül. A szabad DNS anyai keringésbe történő bejutása ezért vélhetően nem a „szokásos” transzportmechanizmusokkal történik. Számos spekuláció látott napvilágot a szabad magzati DNS eredetére és transzportjára vonatkozóan. Az elvégzett vizsgálatok három lehetőséget vetettek fel: magzati haematopoetikus, lepényi eredet és direkt magzati transzplacentáris DNS-transzfer.
8
I. BEVEZETÉS 1. 2. 3. 1. 1. Haematopoeticus eredet A kezdeti kutatások azt sugallták, hogy az anyai vérben fellelhető magzati DNS jelenlététért az anyai keringésbe bekerülő magzati haematopoetikus sejtek felelősek. Az anyai vérben töb magzati sejttípus jelenléte is igazolódott: magzati magvas vörösvértestek, lymphocyták, trophoblastsejtek [10]. Figyelembe véve azt a tényt, hogy a plazma szabad DNS tartalma a keringésben lezajló sejthalál érzékeny markere [39], feltételezhető, hogy a magzati szabad DNS eredete a keringésbe bekerülő magzati sejtek elhalásával hozható összefüggésbe. A magzati sejtek apoptózisának igazolására a monoclonalisan jelölt és szeparált magzati magvas vörösvérsejtek terminális uridine dinucleotid triphosphat (UdTP) jelölését végezték (terminális uridine dinucleotide labelling, TUNEL). A magzati eredetet fluorescens in situ hybridizációs próbával (FISH) igazolva, a magzati vörösvértestek mintegy 40-43%-ában igazolódott az apoptosis [132]. Ezen kutatási eredményekre alapozva a szabad magzati DNS eredetére vonatkozóan az anyai immunrendszer és az apoptotikus magzati sejtek interakciója merült fel. Hasonló eredményre jutott Hristoskova és munkatársai köldökzsinór vérből nyert magzati erythroblastok TUNEL assay-vel végzett vizsgálata kapcsán [53]. Sűrűséggrádiens centrifugálás során Wijk és munkacsoportja nagyszámú apoptotikus magzati sejt- maradványt igazolt, a plazma frakcióban [161]. Az anyai vér sejtes frakcióján végzett qantitatív PCR vizsgálatok tanulsága szerint, egy milliliter anyai vérben egy magzati haemopoetikus sejt van, szövődménymentes terhesség esetén [9]. A szabad DNS mennyiségére vonatkozóan Lo és munkacsoportja által tett megállapítás, miszerint azonos mennyiségű plazmában mintegy 25ször akkora mennyiségű szabad magzati DNS lelhető fel, mint amit a jelenlévő sejtek mennyisége alapján feltételezhetünk, elsőként cáfolta a szabad magzati DNS kizárólag haemopoetikus erdetét [82,87]. Annak eldöntésére, hogy a szabad magzati DNS eredetéért felelőssé tehető-e kizárólag a magzati erythroblastok apoptózisa, Zhong és munkatársai bizonyítottan fiú magzatot viselő, szövődménymentes és kóros terhességekben végeztek vizsgálatokat. Azonos betegtől származó mintákban X és Y kromoszóma specifikus FISH próbákat használva a teljes vérminta anyai és magzati sejtjeinek arányát, valamint a szabad magzati DNS mennyiségét határozták meg. A magzati eredetű sejtek száma valamint a szabad magzati DNS mennyisége között nem találtak összefüggést sem szövődménymentes, sem pedig kóros terhesség esetén [176]. Arra vonatkozóan, hogy a magzati eredetű erythroblastok nem tehetőek kizárólag felelőssé a keringő szabad DNS eredetéért a legmeggyőzőbb adat a koraszülések esetén észlelt emelkedett szabad DNS és változatlan magvas vörösvértest szám.
9
I. BEVEZETÉS A kutatások során felvetődött az a lehetőség is, hogy a magzati szabad DNS eredete az anyai vérvétel során keletkezett műtermék, amely a vérvételt követően a vérvételi csőben zajló magzati eredetű haemopoetikus sejtek szétesésének eredménye. A vérvételt követően azonnal, illetve 24 órával később végzett szabad magzati és összes DNS meghatározások nem igazolták ezt a feltevést [2]. A fenti eredmények összegzéseként megállapítható, hogy a lepényen átjutó magzati haemopoetikus sejtek és azok apoptotikus elváltozása, a sejtek szétesésének következtében nagyban hozzájárul a terhes nők vérében fellelhető szabad magzati DNS frakció kialakításában. Ugyanakkor az anyai keringésben fellelhető magzati eredetű intakt haemopoetikus sejtek alacsony száma nem magyarázza a plazma szabad magzati DNS tartalmát. 1. 2. 3. 1. 2. Méhlepényi eredet A placentáció folyamatát, a kialakult lepény méretét, valamint a trophoblast aktivitását, alapul véve joggal feltételezhetjük a szabad magzati DNS potenciális forrásának. Ezt látszik alátámasztani az a tény is, hogy a terhesség előrehaladtával, a lepény méretének növekedésével a szabad DNS mennyisége növekszik [36,52,87]. A lepényi keringés a 28-30. post-conceptionalis napra alakul ki. In vitro fertilizáció útján fogant, legalább egy fiú magzatot hordozó ikerterhesek esetén végzett vizsgálatok során, a beültetést követő 18. napon, egy magzat esetén a 22. napon, az összes terhest nézve legkésőbb a 37. napon kimutatható volt a szabad magzati DNS. Összességében a 28. napon a terhesek 80%-ában volt kimutatható a magzati DNS [45]. A lepényi eredetet támasztja alá a szabad magzati DNS mennyisége és a hCG emelkedése között talált összefüggés [139,164], valamint a hasi traumát (vélhetően a méhlepényt is érintő) elszenvedett terhesek vérében megjelenő emelkedett szabad DNS szint. A szabad magzati DNS mennyiségi változásának, a terhesség megszűnését követően tapasztalt kinetikája szintén a lepényi eredetet támasztja alá. A szülést követően két órával a szabad magzati eredetű DNS eltűnik a plazmából [88]. Első trimeszterben végzett, nem orvosi indok alapján történő terhességmegszakítással végződő terhesség esetében szabad magzati DNS a megszakítást követően 11. napig volt kimutatható a keringésben, vélhetően az uterus üregben persistáló trophoblastok szétesésének következtében [165]. Ikerterhességben végzett vizsgálatok, a magzati nem arányoknak megfelelően több fiúmagzat esetében magasabb, kevesebb fiúmagzat esetén alacsonyabb szabad DNS mennyiségről számoltak be (Y specifikus markereket használva). Két fiúmagzatot viselő terhesek esetében mono- és dichorialis placentáció esetében nem találtak különbséget a szabad magzati DNS mennyiségében [142]. 10
I. BEVEZETÉS Sekizawa és munkatársai a szabad DNS eredetének vizsgálata során 15 terhes esetében vizsgálták a szabad DNS mennyiségét közvetlenül a császármetszést megelőzően nyert vérplazmából, illetve a köldökzsinórvérből. Az anyai vérplazmában mért szabad magzati DNS átlagkoncentrációja az anyai vérplazmában az összes DNS-koncentráció 14,3%-nak a köldökzsinórvérben 0,9%-nak adódott. A két érték között a különbség szignifikáns volt. Ennek alapján a szerzők az intervillózus térrel közvetlen kapcsolatban álló trophoblast sejtek apoptosisával magyarázták a szabad DNS jelenlétét [134]. 1. 2. 3. 1. 3. Direkt feto-maternális transzfer Mindenképpen említést érdemelnek azok a feltételezések, miszerint a magzati DNS a méhlepény sejtjeinek apoptózistól független aktív transzportjával is átjuthat az anyai keringésbe. A magzatvízben mért szabad magzati DNS, a plazmában kimutatható mennyiség mintegy 200-szorosa, ami felveti a szabad magzati DNS koncentráció grádiensnek megfelelő transplacentális áramlását. E feltételezés alapját az képezi, hogy az anyai vérplazmán kívül más folyadékterekben is kimutatható a magzati eredetű DNS; magzatvízben [8], vizeletben [12], agy-gerincvelői folyadékban [3] és peritonealis folyadékban [22]. Említést érdemel a szabad magzati DNS aktív kiválasztódásának elmélete. A sejttől független szabad DNS eredetére vonatkozóan elsősorban onkológiai vonatkozásban látott napvilágot a tumorsejtek aktív DNS kiválasztásának elmélete. A DNS-fragmentumok a sejt nuclealis DNS-ének részleges replikálódása során keletkező fragmentumok, melyek „lipidcsomagolásban”, aktív transzport útján választódnak ki a sejt környezetébe [112]. In vitro kísérletben igazolódott, hogy hasonló jelenség figyelhető meg az optimálisnál alacsonyabb oxigenizáció mellett in vitro trophoblast sejtkultúrákban is [112,157]. 1. 2. 3. 2. A szabad magzati DNS mennyisége és minősége szövődménymentes terhesség esetén A szabad magzati DNS mennyisége, eredetétől függetlenül, a terhesség előrehaladtával növekszik, a terhesség megszűnésével eliminálódik a keringésből. A változás dinamikája számos tényező függvénye. Mind anyai, mind magzati szempontból szövődménymentes terhesség esetén, mint azt korábban tárgyaltuk, a szabad magzati DNS legkorábban a vérzéskimaradást követően 18-37. nappal mutatható ki. Nagy esetszámú vizsgálatok alapján koraterhességben a szabad magzati DNS mennyisége az összes szabad plazma DNS mintegy 3,4%-a [87]. A későbbiekben a szabad magzati DNS mennyiségének növekedését 4,2 genom equivalnes (GE)/hét-re becsülték [165]. Terminusközelben a szabad magzati DNS mintegy 6,2%-át teszi ki a plazmában fellehető összes szabad DNS mennyiségének [87]. A terhesség 11
I. BEVEZETÉS megszűnését követően a szabad magzati DNS gyorsan eliminálódik a vérből. Átlagos felezési ideje 16,3 GE/perc, minek következtében két órával a szülést követően a szabad magzati DNS-t nem lehet a megszült nő vérplazmájából kimutatni [88,89]. A szabad magzati DNS eliminálásáért főként az anyai vese és máj felelős [159]. A praenatalis diagnosztika szempontjából fontos kérdésként merül fel, hogy melyek azok a tényezők, amelyek szövődménymentes terhesség esetén a szabad magzati DNS mennyiségét befolyásolják. Az elvégzett vizsgálatok az etnikai hovatartozás, az anyai testsúly, valamint a lepény 3D ultrahang vizsgálattal mért térfogata és a DNS mennyisége közötti összefüggéseket vizsgálták [167]. Az etnikai hovatartozás tekintetében, a különböző etnikumok között lényeges eltérés nem figyelhető meg, amennyiben azok azonos geográfiai körülmények között élnek. Eltérő földrajzi viszonyok között élő etnikum esetén a szabad DNS mennyisége eltérő azonos terhességi korban lévő várandósok esetén. A tengerszinthez viszonyítva magasabban élők esetében nagyobb mennyiségű szabad magzati DNS volt kimutatható a keringésben [180]. A terhesség második trimeszterében az anyai testsúly, illetve a szabad magzati DNS mennyisége összefüggésében fordított arányosságot figyeltek meg [168]. Ugyanezen tanulmány során az anyai életkor, dohányzás és etnikai hovatartozás tekintetében nem találtak eltérést. A lepény 3D ultrahang segítségével mért térfogata és a szabad magzati DNS mennyisége között, a várakozásokkal ellentétben, nem fedezhető fel összefüggés [167]. A magzati és anyai eredetű DNS elkülönítésének alapfeltételei a két DNS közti minőségi, „qualitatív” különbségek. A várandós plazmájában fellelhető magzati eredetű, valamint anyai eredetű, illetve nem terhes nőtől származó DNS-fragmentumok közti különbségek kiderítése, a vizsgálati markerek meghatározása miatt, a szabad magzati DNS kutatás egyik központi kérdése. A polymeráz láncreakcióval (PCR) amplifikált DNS-fragmentumok Southern blot, analízise során a magzati eredetű DNS fragmentumok hossza <300 bp-nak, míg az anyaiaké >1000 bp-nak bizonyult [78,79,102]. Tehát a magzati eredetű DNS fragmentumok rövidebbek az anyai DNS fragmentumoknál, ami lehetőséget kínál a DNS-szakaszok méret alapján történő szeparálásra. Az anyai és magzati DNS elkülönítésének másik lehetőségeként merült fel a méhlepényből izolált epigenetikai markerek vizsgálata. A méhlepényből kimutatott epigenetikai markereket a 2. táblázat foglalja össze.
12
I. BEVEZETÉS 2. tálázat: Méhlepényből izolált, epigenetikai markerek. chorionic gonadotropin, beta polypeptide placental lactogen growth hormone 1 chorionic somatomammotropin hormone 2 placental lactogen (clone MGC:14518) chorionic somatomammotropin hormonelike 1 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 1 fibronectin 1
pregnancy specific beta-1-glycoprotein 4 pregnancy specific beta-1-glycoprotein 2 pregnancy specific beta-1-glycoprotein KiSS-1 metastasis-suppressor pregnancy specific beta-1-glycoprotein 5 growth hormone 2 S100 calcium binding protein P pregnancy specific beta-1-glycoprotein 6 delta-like 1 homolog (Drosophila)
Az epigenetikai markerek között említést érdemel az onkológiai kutatások során ismertté vált maspin gén. Terhességben végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a hypometilált maspin gén a szabad magzati DNS eliminálódásának megfelelően a szülést követően eltűnik a keringésből [90,158]. Hasonlóan a maspin génhez más epigenetikai markerek esetében, mint példáúl a RASSF1A gén esetében is megfigyelhető hasonló eltérés [18]. 1. 2. 3. 3. A szabad magzati DNS mennyiségi és minőségi változása kóros terhesség esetén A szabad magzati DNS mennyisége nem csak szövődménymentes terhesség során változó. Kóros terhesség esetén eltérést mutat a szövődménymentes terhességben mért értékektől. Az azonos terhességi korban mért értékek közti különbség hátterében álló folyamatok még nem tisztázottak. A
szövődménymentes
terhességgel
kapcsolatos
kutatásokkal
párhuzamosan
egyre
gyarapszanak ismereteink a szabad magzati DNS, és a kóros terhesség összefüggéseinek tekintetében is. Néhány kórkép, a terhespatológiában játszott kiemelkedő fontossága miatt e téren is fokozott érdeklődésre tart számot. A terhesség és magas vérnyomás összefüggésében a praeeclampsia és HELLP syndroma területén végzett vizsgálatok kiemelkedőek. Hasonlóképpen a magzati aneuploidiák is kutatás tárgyát képezik. Meg kell ezen kívül említeni a méhen belüli növekedési retardációval, méhen belüli elhalással foglalkozó közleményeket is. A magas vérnyomással szövődött terhességi kórképek, terhességi hypertónia, praeeclampsia, HELLP syndróma kialakulásának pontos patomechanizmusa jelenleg ismeretlen. A betegségek fokozatos megismerése során, azonban egyre inkább bizonyosságot nyert a méhlepény, a placentáció központi szerepe a betegség és következményeinek kialakulásában [137,143]. Joggal feltételezhető ezért, hogy ezek a betegségek befolyásolják az anyai vérbe 13
I. BEVEZETÉS bekerülő szabad magzati DNS mennyiségét is. Azonos terhességi korú várandósok vérplazmájának vizsgálata során a szabad magzati DNS szintjének emelkedését észlelték praeeclampsia és HELLP syndróma esetén egyaránt [85,153]. A szabad magzati DNS mennyisége mintegy ötszörösének bizonyult praeeclampsiás esetekben a terhesség harmadik trimeszterében a normotenzív panasz- és tünetmentes várandósok értékeihez viszonyítva. Nem csupán az adott terhességi korban mért szabad DNS abszolút koncentrációja eltérő, hanem a szabad DNS mennyiség növekedésének és a terhesség megszűnését követő csökkenésének dinamikája is eltérő praeeclampsiával szövődött terhességek esetében [64]. A szabad magzati DNS szövődménymentes terhesség esetén, a szülést követően két órával már nem mutatható ki a keringésből. Praeeclampsia esetében a szülést követően hat órával 200 GE/mL mennyiségben még fellelhető a szabad magzati DNS a gyermekágyas vérplazmájában [76]. A betegség kialakulásával és súlyosbodásával a szabad magzati DNS mennyisége fokozott mértékben növekszik, míg a szülést/terhesség befejeződését követően kisebb mértékben csökken normotenzív szövődménymentes terhességekhez viszonyítva. Emelkedett májenzim szinttel, csökkent vérlemezke számmal, magas vérnyomással járó (HELLP) syndróma esetén ez a különbség még markánsabb. Különbség mutatkozott a terhesség alatt, illetve a szülést követően kialakuló HELLP syndrómás esetek között is. A szabad DNS mennyiségének csökkenése a szülést követően kialakuló HELLP syndrómás esetekben lassúbb volt [153]. Az emelkedett szabad DNS koncentrációért mind a praeeclampsiás, mind pedig a HELLP syndrómás esetekben a lepényi funkció zavarát, az oxigenizáció csökkenését feltételezik. A beszűkült lepényi funkció következtében kialakuló hypoxiás állapot eredményeként felgyorsul a trophoblast sejtek apoptotikus átalakulása, megnövekszik az apoptotikus testek száma, és vélhetően ez vezet a szabad DNS mennyiségének emelkedéséhez [157]. Chromosoma-rendellenességek, aneuploidiák esetén a szabad DNS mennyiségi eltérései
ellentmondásosak.
A
chromosoma-rendellenességek
és
a
szabad
DNS
összefüggésének hátterében a chromosoma-rendellenességek esetében talált számos, a lepényt érintő, szövettani eltérés feltételezhető [42,56]. A 21-es triszómia esetén három tanulmány számol be a szabad magzati DNS koncentrációjának emelkedéséről [70,84], míg másik négy tanulmány tanulsága szerint nincs különbség a normál karyotypusú magzatot viselő, illetve a Down-syndrómás magzatot viselő várandósok vérében fellelhető szabad magzati DNS koncentráció között [43,54,111,146]. 13-as triszómia esetén csökkent, a 18-as triszómia esetén nem változott szignifikánsan a szabad DNS mennyisége [81,110,173]. Az ellentmondásos eredmények azt sugallják, hogy a szabad magzati DNS quantitatív meghatározása nem mutat egyértelmű összefüggést a magzati aneuploidiákkal. A 21-es 14
I. BEVEZETÉS triszómia esetében a mennyiségi meghatározás mellett érvelő közlemények esetszáma kevés, ugyanakkor a különböző etnikumú populációban mért, azonos értékek a módszer létjogosultságát támasztják alá [84]. A mennyiségi meghatározás mellett a magzati eredetű DNS minőségi vizsgálata hasonlóképpen ellentmondásos, de reménykeltő lehetőségeket hordoz magában. A placentális, magzat-specifikus nem metilált maspin promoter sequencia (SERPINB5) a 18-as kromoszómán helyezkedik el. A szabad magzati DNS-fragmentumuk metiláltsága eltér az anyai eredetű DNS-fragmentumok metiláltáságától [90]. Euploidia és 18-as triszómia esetén összehasonlítva a metilált és nem metilált allélek közti arányt, szignifikáns különbséget találtak [158]. Ez a felismerés további katalizátora lehet az aneuploidiák nem-invazív módszerrel történő vizsgálatának. Méhen belüli sorvadás (IUGR) esetén néhány, többnyire kis esetszámon végzett kutatás a szabad magzati DNS mennyiségének emelkedéséről számol be [17,143]. Nagy esetszámú tanulmányok során azonban nem tapasztaltak szignifikáns kölönbséget a szövődménymentes és az intrauterin retardátióval járó esetek között [130]. Intrauterin elhalással szövődött súlyos praeeclampsiás esetben az azonos terhességi korban mért szabad magzati DNS mennyiségnek többszörösét mutatták ki, ami felveti a szabad magzati DNS mennyiségi meghatározásának a praeeclamsia, valamint terápiájának monitorizálásában történő felhasználásának reális esélyét [181]. A szabad magzati DNS mennyiségének emelkedéséről számoltak be hyperemesis gravidarum [133], fenyegető koraszülés esetében is [75]. 1. 2. 3. 4. A feto-maternalis sejt- és DNS-transzport immunológiai konzekvenciái A lepényen keresztül történő kétirányú sejt- és DNS-transzport érdekes kérdéseket vet fel az autoimmun betegségek pathogenezisének tekintetében is. A csontvelőből származó őssejt transzplantáció során tapasztalt krónikus graft-versus-host betegség (cGvHD) számos hasonlóságot mutat néhány autoimmun betegséggel [61]. Systemás sclerosis (SSc), primaer biliaris cirrhosis (PBC), Sjögren syndróma, systemas lupus erythematosus (SLE), myositis, autoimmun thyreoditis egyaránt számos vizsgálat tárgyát képezték [23,58,123,155]. A krónikus graft-versus-host betegség kialakulása a donor és a recipiens HLA haplotípusának függvénye. Ennek megfelelően a magzati sejtek, a DNS anyai vérbe történő átjutása microchimerismus, host-nonhost HLA különbség kialakulásához vezethet autoimmun betegek esetében [105]. A betegség kialakulásának körülményei ismeretlenek, ezt támasztja alá az a jelenség is, hogy microchimerismus egészséges felnőttek esetében is kimutatható [28]. A magzati microchimerismus szempontjából legtöbbet vizsgált betegségek közé a sytemas
15
I. BEVEZETÉS sclerosis, primaer biliaris cirrhosis, terhességi pruritus, Sjögren syndróma tartoznak [105]. A legtöbb adat az SSc- ről áll rendelkezére. A vizsgálatok nagy többsége a beteg vérében keringő fiú magzattól származó DNS kimutatására koncentrál. A fiú magzattól származó DNS kimutatását bőrbiopsziás anyagból, illetve a betegtől származó perifériás vérből FISH, valamint PCR módszerrel végezték [6,62,127]. A fiú magzattól származó DNS mindkét módszerrel nagyobb mennyiségben volt kimutatható SSc-ben szenvedő betegek mintájában, mint kontroll esetekben. A betegség kialakulásának szempontjából, mint azt korábban megemlítettük, rendkívül fontos az anya és magzat közötti HLA különbség. Amennyiben az anya és magzata között a HLA-DRB1 gén tekintetében nem volt összeférhetetlenség, a betegség előfordulásának gyakorisága kilencszer kisebb volt, mint a gén szempontjából összeférhetetlen anya-magzat esetében [156]. A betegség előfordulásának gyakorisága már abban az esetben is növekedést mutatott, ha a magzat az adott génre nézve heterozygotának bizonyult [97]. A HLA I. csoportba tartozó gének és a betegség kialakulása között nem találtak összefüggést. A microchimerismus autoimmun betegségek patogenezisében betöltött szerepét néhány tény megkérdőjelezi. Egyik ilyen az immunológiai szempontból felelős magzati fehérvérsejtek alacsony koncentrációja, 500 000 anyai lymphocytára esik egy magzati lymphocyta [106]. Az anyai sejtek magas aránya a magzati eredetű sejt gyors eliminálását eredményezheti. Ellene szól az a tény is, hogy egészséges egyénekben is kimutatható microchimerismus [92]. Az első ellenérv magyarázatául szolgálhat a non-host sejtek által a host sejtekre kifejtett dysregulációs hatás, mely a host sejt cytokin-mediált autoreaktív elpusztulását eredményezi [152]. A non-host sejt peptidjeinek, a host sejtek által történő, felszíni prezentációja szintén immunválasz kialakulásához vezethet [128]. A második ellenérvet a Christiner és munkatársai által végzett kísérleti modell cáfolja, melynek során vinil-chloriddal kezelt microchimerismust mutató egerek estében nagyobb gyakorisággal alakult ki SSc, mint azoknál az egyedeknél, ahol microchimerismus nem volt kimutatható [21]. A magzati microchimerismus szerepe jelenleg tisztázatlan. Nagy valószínűséggel mind az autoimmun betegségek patogenezisében, mind pedig az egészséges egyedek reparatív folyamataiban szerepet játszik. 1. 3. Anyai sejtek és anyai DNS a köldökzsinórvérben valamint a magzati keringésben Számos kutatás eredményét figyelembe véve az anya és a magzat között kétirányú sejt- és DNS-„áramlás” történik [107,165]. A magzati sejtek kimutatása az anyai szövetekben több mint egy évszázados múltra tekint vissza [161]. Az anyai eredetű sejtek jelenlétét a 16
I. BEVEZETÉS köldökzsinór vérében néhány kutatócsoport szintén leírta [38,60,176]. Az anyai sejtek a második és harmadik trimeszterben jelennek meg a köldökzsinórvérben. Ezen sejtek pontos szerepe nem ismert. A sejtek mennyiségét illetően, terminusban a köldőkzsinórvérben fellelhető sejtek körülbelűl 6%-a anyai eredetű. A közelmúltban néhány kutatócsoportnak miniszatellita régió amplifikációjával sejttől független szabad anyai DNS-t is sikerült a köldökzsinórvérben kimutatni. Ezen sejtek, illetve szabad DNS szerepe jelenleg még nem tisztázott, azonban néhány tanulmány arról számol be, hogy bizonyos autoimmun betegségek esetén, mint például veleszületett neonatalis lupus, az anyai eredetű sejtek nagy száma volt megfigyelhető az elhalt újszülött szöveteiben [94,150]. Az anyai eredetű sejtek és DNS jelenléte az újszülöttek vérében érdekes kérdéseket vet fel. Rh-negatív nulligravidák esetében, az első terhesség alkalmával jelentkező immunológiai reakció, valamint a legsúlyosabb esetekben kialakuló magzati hydrops hátterében feltételezhetően az áll, hogy az Rh(D)-negatív terhes korábban, még az intrauterin életben szenzibilizálódott az Rh(D)-pozitív anya antigénjei által. Ezt a jelenséget „grandmother effect”-nek nevezték el. Mindezidáig azonban nem sikerült ezt bizonyítani. Az anyai sejtek, a DNS bejutása a magzati keringésbe egy lehetséges magyarázat erre a jelenségre [66,68]. A klinikai gyakorlat szempontjából fontos megemlíteni a köldökzsinór vérből nyert magzati őssejtek anyai őssejtekkel történő kontaminációját. Köldökzsinór vérből nyert őssejtekkel történő transzplantáció esetén, tekintettel az anyai sejteken jelenlévő nem öröklődő anyai antigénekre (NIMAs), a kontamináció graft-versus- host reakció kialakulásához vezethet [55,156]. Számos kutatási eredmény van arra vonatkozóan, hogy honnan származnak az anyai keringésben jelenlévő magzati sejtek és szabad magzati DNS. A magzat, valamint az újszülött keringésébe bekerülő sejtek, illetve DNS eredetére vonatkozóan kevés ismeretünk van. Az anyai sejtek számát és DNS mennyiségét tekintve a köldökzsinór-, és a magzati keringésben lényegesen alacsonyabb mennyiséggel állunk szemben; mint azonos gestatiós korban mért magzati eredetű sejtek és DNS tekintetében az anya keringésében. Ezek a sejtek vélhetően többségükben fehérvérsejtek illetve anyai őssejtek. A legutóbbi kutatások a magzati eredetű DNS gyors lebomlásáról számolnak be a magzat megszületését követően [89]. Az anyai DNSre vonatkozóan nem állnak rendelkezésre ilyen adatok.
17
II. CÉLKITŰZÉSEK
2. Célkitűzések A terhesség során a magzati és anyai oldal között mindkét irányban sejt- és DNS-„transzport” zajlik. Ennek következtében mind az anyai, mind pedig a magzati oldalon olyan genetikai állomány van jelen, amely az adott egyed számára genetikai és immunológiai szempontból „idegen”. Ez a jelenség azon túlmenően, hogy különböző autoimmun kórképek pathogenezisében szerepet játszik, számos diagnosztikai lehetőséget rejt magában. Az általam végzett vizsgálatok célja a kétirányú transzplacentáris DNS-„áramlás” vizsgálata volt. Részben már ismert vizsgálati módszerek reprodukálhatóságát, megbízhatóságát vizsgálam, másrészt új szempontok figyelembe vételével a klinikai alkalmazás további lehetőségeit kerestem. Céljaimat az alábbiakban foglaltam össze: I. A magzati nem nem-invazív meghatározása Vizsgáltam: 1. A módszer megbízhatóságát és reprodukálhatóságát, különös tekintettel a: a. a terhességi korra b. az anya paritására c. az előző szülésekből származó gyermek nemére d. spontán és művi vetélésekre e. korábbi transzfúziókra 3. Bizonyítottan fiú magzatok esetén meghatároztam a szabad magzati DNS és anyai összes szabad DNS arányát. A szabad magzati DNS arányának változását a terhességi kor függvényében. II. A magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározása Az általam végzett munka célja a magzati vércsoport Rh(D) anyai vérplazmából történő neminvazív meghatározása, a módszer érzékenységének és reprodukálhatóságának vizsgálata volt. III. Anyai DNS kimutatása az újszülöttek véréből Az általam végzett vizsgálat során a következő kérdésekre kerestem a választ: 1. A megszületést követő 35-120 perc között kimutatható-e anyai eredetű DNS az újszülött keringésében?
18
II. CÉLKITŰZÉSEK 2. Milyen mennyiségben, illetve arányban van jelen az anyai DNS az újszülöttek vérkeringésében? 3. Befolyásolja-e a megszületéskori terhességi kor, valamint a vérvétel időpontja az anyai DNS mennyiségét? IV. Szabad magzati DNS jelenléte méhen kívüli terhesség esetén Az elvégzett vizsgálat során az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Kimutatható-e a szabad magzati DNS szövettanilag igazolt méhen kívüli terhességet hordozó betegek perifériás keringésében? 2. Van-e összefüggés a szabad magzati DNS mennyisége és a vérzéskimaradás időtartama között? 3. Hogyan viszonyul egymáshoz a szabad magzati DNS mennyisége azonos „korú” méhen belüli és méhen kívüli terhesség esetén? 4. Van-e összefüggés a szabad magzati DNS abszolút mennyisége, és az azonos időben vett vérminta β-hCG értékei között? 5. Használható-e a szabad magzati DNS meghatározás a méhen kívüli és méhen belüli terhesség differenciáldiagnosztikájában?
19
III. ANYAG ÉS MÓDSZER
3. Anyag és módszer 3. 1. Magzatvízminták A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Genetikai Tanácsadásán 2003. januárjától 2006. júliusáig 86 random módon kiválasztott terhesnél végzett genetikai amniocentesis során nyert magzatvízmintból nyert DNS valósidejű (real-time) PCR vizsgálatát végeztem. Ugyanazen esetekben rutin cytogenetikai vizsgálat kapcsán karyotypus meghatározás történt. A magzati RhD status meghatározása során 1 ml magzatvízből a szükséges DNS-t szilárd fázisú DNS-izoláló kit segítségével (High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) szeparáltuk. A terhesek átlagéletkora az amniocentesis időpontjában 36,1 ± 2,5 év, az átlagos terhességi kor 18,2 ± 2,7 hét volt. A magzati nem-meghatározáshoz 56 terhes mintáját használtuk fel. A magzati Rh(D) status meghatározásához 30 Rh(D)-negatív terhes mintáját használtuk.
3. 2. Vérminták 3. 2. 1. Vérminták magzati nem meghatározására és szabad magzati DNS quantitatív vizsgálatához A magzati nem meghatározás és a szabad magzati DNS quantitatív vizsgálata során Klinikánkon magzatvíz-mintavételt kérő 56 terhes esetében, a kért genetikai amniocentézist megelőzően, rutin vérvétel keretében 6 ml vérmintát gyűjtöttem etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA) tartalmazó vérvételi csőbe. A vérmintákat 4°C-on tároltam, és 2 órán belül a DNS-t izoláltam. 3. 2. 2. Vérminták magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározására A magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározása során, Klinikánkon magzatvízmintavételt kérő 30 Rh(D)-negatív vércsoportú terhes esetében, a kért genetikai amniocentézist megelőzően, rutin vérvétel keretében 6 ml vérmintát gyűjtöttem etilén-diamintetraacetátot (EDTA) tartalmazó vérvételi csőbe. A vérmintákat 4°C-on tároltam, és 2 órán belül a DNS-t izoláltam. 3. 2. 3. Vérminták anyai DNS kimutatására újszülöttek perifériás véréből Rh(D)-pozitív anyák újszülöttjeinek véréből szerológiai módszerrel vércsoport-meghatározás történt a megszületést követő két órán belül. Az Rh(D)-negatívnak bizonyult tíz újszülött
20
III. ANYAG ÉS MÓDSZER esetében, a megszületést követő 35-120 percben, rutin vérvétel keretében 400µl vénás vért gyűjtöttem EDTA tartalmú csövekbe. A terhességi kor a megszületéskor 23-40 hét között volt. A vénás vért -20 °C-on tároltam a DNS izolálásáig. 3. 2 .4. Vérminták az újszülöttek szerológiai vizsgálatához A vizsgálatban részt vevő 10 Rh(D)-negatív újszülött esetén a rutin vérvétel keretében 200µl vért gyűjtöttem Rh(D) vércsoport-ellenanyag meghatározás céljából. 3. 2. 5. Vérminták szabad magzati DNS kimutatására méhen kívüli terhesség és kontrollcsoport esetén A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján méhen kívüli terhességre utaló ultrahang, β-hCG eredménnyel és panaszokkal jelentkező, a méhen kívüli terhesség klinikai tüneteit mutató 58 betegtől, valamint klinikánkon terhességmegszakítást kérő 45 betegektől gyűjtöttem a fentiekkel azonos módon vérmintát. Az vérzéskimaradás időtartama a méhen kívüli terhesség gyanújával jelentkező betegek esetében 49,3 ± 12,9 nap, a terhesség megszakításra jelentkezők esetében 52,9 ± 10,3 nap volt. A vérmintákat 4°C-on tároltuk, és 2 órán belül a DNS-t izoláltam. 3. 2. 6. Vérminták β-hCG meghatározásához A méhen kívüli terhesség gyanújával, valamint a kontrollcsoportot képező, terhességmegszakításra jelentkező terhesek esetében 6 ml vért gyűjtöttem natív csőben. A terhesek a beavatkozás és a vizsgálat előtt, részletes tájékoztatást követően a beavatkozásra vonatkozó “Kérelem és beleegyező nyilatkozat”-ot írtak alá. A vizsgált újszülöttek esetében a szülők részletes felvilágosításban részesültek a vizsgálat módszerét és céljait illetően, és “Beleegyező nyilatkozat”-ot írtak alá. Az elvégzett vizsgálatokhoz Kutatás Etikai Bizottsági engedély bírtokában történtek.
3. 3. Műszerek Molekuláris genetikai vizsgálat: LightCycler 1.0
Roche, Mannheim, Germany
Real-Time PCR System Light Cycler Carousel Centrifuga 1.0
Roche, Mannheim, Germany 21
III. ANYAG ÉS MÓDSZER Light Cycler kapilláris 20 µl
Roche, Mannheim, Germany
Laminar Airflow Series 3
Nuaire Plymouth, MN. USA
Mikrocentrifuga Microfuge E
Beckman Instruments, Providence, RI. USA
Mikrocentrifuga Z 160 M
Hermle, Gosheim, Germany
Pipetták Proline 10, 50, 200, 1000
Biohit, Helsinki, Finland
Rázógép REAX 2000
Heidolph, Schwabach, Germany
Cytogenetikai vizsgálat: IG150 CO2 Inkubátor
Jouan, Winchester, VA. USA
MSC 9 Laminar Airflow
Jouan, Winchester, VA. USA
4-15 Centrifuga
Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA
Wilovert S invert mikroszkóp
Hund Wetzlar, Wetzlar, Germany
Leica DMLB mikroszkóp
Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany
Chantal Chromosome Karyotype Software Leica Imaging AG, Wetzlar, Germany β-hCG meghatározás: Axsym System
Abbott GmbH, Wiesbaden, Germany
3. 4. Reagensek Molekuláris genetikai vizsgálat: LightCycler FastStart DNA Master HybProbe
Roche, Mannheim, Germany
1. LightCycler FastStart Enzyme 2. LightCycler FastStart Reaction Mix HybProbe 3. MgCl2 Stock Solution, 25 mM 4. H2O, PCR-grade LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche, Mannheim, Germany 1. LightCycler FastStart Enzyme 2. LightCycler FastStart Reaction Mix SYBR Green 3. MgCl2 Stock Solution, 25 mM 4. H2O, PCR-grade
22
III. ANYAG ÉS MÓDSZER LightCycler Control Kit DNA
Roche, Mannheim, Germany
1. Human Genomic DNA, (15 ng/µl) 2. ß-Globin Primer Mix, 10 conc 3. ß-Globin HybProbe Mix, LightCycler Red 640-labeled, 10x conc. 4. ß-Globin HybProbe Mix, LightCycler Red 705-labeled, 10x conc. 5. H2O, PCR-grade High Pure PCR Template Isolation Kit
Roche, Mannheim, Germany
Cytogenetikai vizsgálat: Chang Medium
Irvine Scientific, Santa Ana, CA. USA
KCl (0,075 M, GIBCO)
Invitrogene, Carlsbad, CA, USA
Colchicin
Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA
Methanol (analitikai tisztaságú)
Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Ecetsav (99-100%)
Acidum-2 Kft, Debrecen, Hungary
Tripszin
Difco Laboratories, Detroit, Mi. USA
Giemsa festék
Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA
Entellan
Merck KGaA, Darmstadt, Germany
β-hCG meghatározás: Total β-hCG Kit
Abbott GmbH, Wiesbaden, Germany
Monoclonalis anti-D meghatározás: DiaMed-ID Micro Typing System
DiaMed, Cressier sur Morat, Switzerland
23
III. ANYAG ÉS MÓDSZER
3. 5. Oligonukleotid primerek és jelölt próbák (TIB MolBiol, Coralville, IA. USA) Primerek SRY F, oligo, 22-mer
5’-ggc aac gtc cag gat aga gtg a-3’
SRY R , oligo, 23-mer
5’-tgc tga tct ctg agt ttc gca tt-3’
RhD7b F, oligo, 18-mer
5’-ctc cat cat ggg cta caa- 3’
RhD7b R, oligo, 17-mer
5’-ccg gct ccg acg gta tc-3’
β –globin F, oligo, 20-mer
5’-aca caa ctg tgt tca cta gc-3’
β –globin R, oligo, 20 mer
5’-caa ctt cat cca cgt tca cc-3’
Próbák SRY P1, oligo, 27-mer
5’-cca tga acg cat tca tcg tgt ggt ctc-fluorescein-3’
SRY P2, oligo, 24-mer
5’-Lcred 640-cga tca gag gcg caa gat ggc tct-3’
D7b P1, oligo, 11-mer
5’-tga tct ctc ca-TAMRA-3’
D7b P2, oligo, 16-mer
5’-FAM-agc agc aca atg tag a-3’
3. 6. Felhasznált számítógépes programok Excel 2002 Software
– Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA
SPSS for Windows v. 11.0.0.
– SPSS Corporation, USA
LightCycler Software 1.0
– Roche, Mannhei, Germany
3. 7. Módszerek 3. 7. 1. Cytogenetikai vizsgálat Klinikánk cytogenetikai laboratóriumában a cytogenetikai vizsgálatokat a magzatvízsejtek in situ eljárással történő tenyésztését követően történt. A 10 ml magzatvízmintát 1000 G fordulatszámon 10 percig
történő centrifugálását követően az üledéket Chang B+C
tápfolyadékban reszuszpenziójára került sor. A sejtszuszpenziót petricsészékbe pipettáztuk, amelyek alján 22X22 mm-es fedőlemezek vannak. A petricsészéket 37°C-on, 5%-os CO2koncentráció mellett inkubáljuk 6 napig, majd a tápfolyadék cseréje következik. Ezt követően a tápfolyadék kétnaponta történő cseréjével további inkubálás következik mindaddig, amíg invert-mikroszkóppal vizsgálva megfelelő mitózisok nem láthatóak. A metafázisokra 0,1 mg/ml colchicint cseppentve, majd 37°C-on 1,5 óráig inkubálva a sejtosztódást metafázisban
24
III. ANYAG ÉS MÓDSZER blokkoljuk. A sejteket 0,075 mmol-os KCl-oldattal 37°C-on 12-20 percig inkubálva hypotonizáljuk, majd methanol-ecetsav 3:1 arányú keverékével fixáljuk. 24 órás száradást követően ASG sávozást végzünk 5%-os tripszines emésztést követő Giemsa festéssel. A fedőlemezeket entellánnal tárgylemezre montírozzuk, majd fénymikroszkóppal 100X-os nagyítással értékeljük. A kiértékelés során 15-20, más-más kolóniából származó metafázis vizsgálata történt. 3. 7. 2. Valósidejű (real-time) PCR vizsgálat A valósidejű (real-time) PCR módszerrel a 3.5. pontban felsorolt géneket, szekvenciákat vizsgáltam. A vizsgálathoz LightCycler 1.0 System berendezést használtam. A nemmeghatározás az Y kromoszóma jelenlétének kimutatásával történt. A vizsgálatot minden minta esetében két egymástól független (egy férfi és egy nő) vizsgáló személy is elvégezte. Amennyiben a két vizsgáló azonos eredményt kapott az eredményt informatívnak fogadtam el. Minden minta esetében Az Y kromoszóma kimutatására a kromoszóma rövid karján elhelyezkedő SRY régióra (Yp11.31-Yp11.32) (5. táblázat) specifikus primer és hibridizációs próbapárokat használtam. Amennyiben a polimeráz láncreakció során termékképződést észleltünk, és annak olvadásgörbéje megfelelt a termék specifikusságának, a magzat nemét fiúnak, amennyiben nem észleltünk termékképződést, a magzat nemét leányként regisztráltam. A magzati nem meghatározása során a cytogenetikai és a molekuláris genetikai meghatározást végző személyek különbözőek voltak, a két meghatározás eredményeit csak az összes vizsgálat lezárását követően vettem össze. 26 fiú magzat esetében az SRY régió mennyiségi vizsgálatát is elvégeztem. A plazmában fellelhető összes szabad DNS meghatározása a β-globin gén (11p15.5) (5. táblázat) meghatározásával történt. A fiú magzatok esetében a szabad magzati DNS és összes szabad DNS mennyiségét SYBR Green I -módszerrel határoztam meg, belső standard segítségével. A standard görbe kialakításához standard humán DNS (15ng/µl, LightCycler Control Kit DNA, Roche, Mannheim, Germany) hígítási sorát (10, 100, 1000, 10 000 szeres) használtam (2. ábra) A méhen kívüli terhesség és kontroll csoportja során, a szabad DNS kimutatása
és
mennyiségi meghatározása során az SRY régióra specifikus primer párokat és SYBR Green I. módszert használtam. Az anyai szabad DNS az újszülöttek véréből való, illetve a magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározása során az 1. kromoszóma rövid karján elhelyezkedő RhD gén 7. exonjának (1p34.3-1p36.1) (3. táblázat) meghatározását végeztem SYBR Green, illetve hibridizációs 25
III. ANYAG ÉS MÓDSZER próba módszerével. Az anyai szabad DNS jelenlétét pozitívként regisztráltam, amennyiben olvadásgörbe-analízissel ellenőrzött specifikus termék keletkezett. A magzati Rh(D) status meghatározása során mind a magzatvízből mind pedig a plazmából izolált DNS valósidejű (real-time) PCR vizsgálatát elvégeztem. Rh(D)-negatív anyák esetében Rh(D)-pozitívként regisztráltam a magzatot amennyiben olvadásgörbe-analízissel ellenőrzött specifikus termék keletkezett. A termék mennyiségét belső standard segítségével határoztam meg. A standard görbe kialakításához standard humán DNS (15ng/µl, LightCycler Control Kit DNA, Roche, Mannheim, Germany) hígítási sorát (10, 100, 1000, 10 000 szeres) használtam. A magati Rh(D) status meghatározása során a DNS-izolálás kapcsán mind a magzatvízből, mind a vérplazmából izolált DNS-t a valósidejű (real-time) PCR-tól, valamint annak kiértékelésétől független személy sorszámozta, a sorszámok párosítása az összes minta vizsgálatát követően történt meg. 3. táblázat: A vizsgált szekvenciák chromosomalis lokalizációja Marker
Chromosomalis lokalizáció
SRY
Yp11.31-Yp11.32
RhD 7. exon
1p34.3-1p36.1
β globin
11p15.5
26
III. ANYAG ÉS MÓDSZER Minden vizsgált esetben pozitív és negatív kontroll mintákat használtam. (4. táblázat.) 4. táblázat: A vizsgálatok során használt negatív és pozitív kontrol minták Vizsgálat
Negatív kontroll
Pozitív kontroll
Magzati nem meghatározása
1. víz
1. Férfi DNS
2. nullipara női DNS Magzati Rh(D) status meghatározása
1. víz
Anyai DNS kimutatása újszülöttek vérében
1. víz
Magzati DNS méhen kívüli terhesség esetén
1. víz
1 Rh(D)-pozitív DNS
2. Rh(D)-negatív DNS 1. Rh(D)-pozitív DNS
2. Rh(D)-negatív DNS 1. Férfi DNS
2. nullipara női DNS
3. 7. 2. 1. DNS-izolálás magzati nem, magzati Rh(D) status meghatározására, valamint magzati DNS kimutatására méhen kívüli terhesség és kontrollcsoport esetén A DNS vérplazmából, valamint magzatvízből történő izolálásához High Pure PCR Template Isolation Kit-et használtam. A maximum két óráig tárolt EDTA-s vérmintát 10 percig 1600 rpm fordulatszámon lecentrifugáltam. Centrifugálást követően a plazmát eltávolítottam. Az így nyert plazmát -20°C-on tároltuk a további feldolgozásig. A vizsgálathoz 800 µl (méhen kívüli terhesség és a kontroll csoport esetén 200 µl) vérplazmát használtam, a DNS-t szilárd fázisú DNS-izoláló kit segítségével (High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), a használati útmutató szerint szeparáltuk. Az izolált DNSt 60 µl pufferben oldottam fel. 3. 7. 2. 2. DNS-izolálás anyai DNS meghatározása céljából Az újszülöttek esetében a DNS izolálását 200 µl vérből szilárd fázisú adszorpciós oszlop felhasználásával (HighPure DNA Sample Preparation Kit, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) végeztem, 1-10 órával a vérvételt követően. Az izolált DNS-t 60µl pufferben oldottam fel.
27
III. ANYAG ÉS MÓDSZER 3. 7. 2. 3. DNS izolálás magzatvízmintából A DNS izoláláshoz a magzatvízmintákból High Pure PCR Template Isolation Kit-et alkalmaztam a használati útmutató szerint, módosításokkal. Az amniocentesis során nyert 1012 ml minta 1 ml-es alliquotját Eppendorf csőbe pipettáztam, majd éjszakára 200 µl lízis puffer és 40 µl proteináz K oldattal 55 °C-on inkubáltam. A további lépések a használati útmutató szerint történtek, a DNS-t 60 µl pufferben oldottam fel. 3. 7. 2. 4. Polimeráz láncreakció Az összes szabad DNS meghatározáshoz β-globin specifikus primereket, az Y kromoszómán elhelyezkedő SRY régióra specifikus SRY F, SRY R primereket, valamint fluoresceinnel és LCred 640-el jelölt próbákat használtam. Az 1-es chromosomán elhelyezkedő RhD 7. exon meghatározásához RhDb F, RhDb R primereket, és FAM, TAMRA jelölésű próbákat használtam. A valósidejű (real-time) PCR végtérfogatát, az elegyek összetételét, a PCR ciklusszámot és a jelöléseket (hibridizációs próba vagy SYBR Green) a 5. táblázatban tüntettem fel. A reakcióelegyen a következő PCR ciklusokat hajtottam végre: 95 °C
8 perc
Kezdeti denaturáció
95 °C
5 mp
Denaturáció
60 °C
10 mp
Annealing
72 °C
15 mp
Extenzió
kivételig
Tárolás
4 °C
28
III. ANYAG ÉS MÓDSZER
5. táblázat: A vizsgálatok során használt PCR reakcióelegy, végtérfogat és ciklusszám. Vizsgálat Magzati nem meghatározása
Végtérfogat Ciklusszám 20
60
Reakcióelegy 8 µl nukleázmetes víz, 1,5 mmol MgCl2, 5 pmolt mindkét primerből, 1pmol próbából, 3µl LC-Fast Start reakciómix (TaqPolymerase, reakció puffer, dNTP mix, FastStart enzim, Roche Diagnostics), DNS-t (2 µl).
Magzati DNS méhen kívüli terhesség esetén
10
45
6 µl nukleázmentes víz, mindkét primer 2.5 pmol mennyiségben 1 µl DNA Master SYBR Green I mix (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit: Taq polymerase, dNTP, MgCl2, ), 1 µl DNS
Magzati Rh(D) status meghatározása
10
45
6 µl nukleázmentes víz, mindkét primer 2.5 pmol mennyiségben, 1 µl DNA Master SYBR Green I mix (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit: Taq polymerase, dNTP, MgCl2), 1 µl DNS-t
Anyai eredetű DNS kimutatása újszülöttek vérében
21
60
8 µl nukleázmentes víz, 5.25 µl 25 mmol-os MgCl2, 5 pmolt mindkét primer, 1 pmol a próbából, 2 µl LC-Fast Start reakciómix (TaqPolymerase, reakció puffer, dNTP mix, FastStart enzim, Roche Diagnostics), 3 µl DNS-t
Magzati DNS mennyiségi meghatározása SRY pozitivitás esetén
10
45
6 µl nukleázmentes víz, mindkét primer 2.5 pmol mennyiségben1 µl DNA Master SYBR Green I mix (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit: Taq polymerase, dNTP, MgCl2, ), 1 µl DNS
3. 7. 2. 5. A PCR termékek detektálása és kiértékelése A valósidejű (real-time) PCR vizsgálat során, a módszer érzékenységéből adódóan a termék képződésének időbeli dinamikáját figyelhetjük meg. A termék specifikusságát a termék olvadásgörbéjének analízisével végeztem el. A termék detektálása a módszertől függően (hybridizációs próba, SYBR Green I.) 530 és 640 nm hullámhosszon történt. A mennyiségi meghatározások során a 3.7.2. pontban leírtaknak megfelelően hígítási sort használtam. A DNS kimutatását, mennyiségének meghatározását LightCycler 1.0 készülékkel, az adatok kiértékelését, a mennyiségi adatok meghatározásához szükséges standard görbe (1. ábra) elkészítését a LightCycler 1.0 készülék szoftverjével végeztem.
29
III. ANYAG ÉS MÓDSZER
1. ábra: A DNS quantitatív meghatározása során használt belső standard görbe. A standard görbe kialakításához standard humán DNS (15ng/µl, LightCycler Control Kit DNA, Roche, Mannheim, Germany) hígítási sorát (10, 100, 1000, 10 000-szeres) használtam. 3. 7. 2. 6. β-hCG meghatározása Méhen kívüli terhesség gyanúja és a terhességmegszakításra jelentkező terhesek esetében enzim immunoassay módszerrel β-hCG szint meghatározása történt (Total β-HCG Kit, Abbott GmbH, Wiesbaden, Germany). 3. 7. 2. 7. Ellenanyagszűrés A vizsgált újszülöttek esetében ellenanyag-meghatározás történt gél matrix agglutinációs módszerrel a gyártó utasításai szerint (DiaMed, Cressier sur Morat, Switzerland). 3. 7. 3. Statisztikai értékelés A termékek méretének és mennyiségi arányainak kiértékelését Microsoft® Excel programmal (Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA), a statisztikai számítást SPSS for Windows v. 11.0.0 (SPSS Corporation, USA) programmal végeztük. A cytogenetikai vizsgálatok az I . Sz Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika cytogenetikai laboratóriumában, a méhen kívüli terhesség, és kontroll csoportja esetén végzett β-hCG meghatározás a klinika hormonvizsgálatokat végző labortatóriumában történt. Az újszülöttek
30
III. ANYAG ÉS MÓDSZER esetén végzett ellenanyag meghatározást a Heim Pál Gyermekkórház hematológiai laboratóriuma végezte el.
31
IV. EREDMÉNYEK
4. Eredmények 4. 1. A szabad magzati DNS jelenléte az anyai vérben 4. 1. 1. A magzati nem nem-invazív meghatározása Az anyai vérplazmából történő SRY szekvencia kimutatásával végzett magzati nemmeghatározást 56 terhes esetében végeztem el. A vizsgált 56 esetből 6 minta esetében a két vizsgáló által kapott eredmény nem egyezett meg, ezeket az eseteket nem fogadtam el, tehát 50 esetben (89%) jutottam eredményhez. A magzati nem ellenőrzése standard karyotypizálással történt. Az azonos vizsgálati személyhez tartozó minták eredményeinek összevetésére csak az összes minta feldolgozását követően került sor. Az anyai átlagéletkor 31,5 ± ,3 év, a terhességi kor átlaga, a magzatvíz-mintavételkor 16,9 ± 2,9 hétnek adódott. A magzatvíz mintavétel indikációit, az általunk vizsgált esetekben, a 6. táblázatban foglaltam össze. 6. táblázat: A magzatvíz mintavétel indikációinak megoszlása a vizsgált esetekben. Magzatvíz mintavétel indikációja
Esetszám
Anyai életkor
30
Biokémiai eltérés (AFP, β-hCG)
4
Ultrahang vizsgálat során észlelt eltérés
3
Ultrahang vizsgálat során észlelt eltérés és
11
biokémiai eltérés (AFP, β-hCG) IVF-ICSI
2
A terhesek 48%-a először terhes először szülő, 16%-a többedszer terhes, először szülő, 36%-a többedszer terhes, többedszer szülő volt, az előző terhességekből származó fiúmagzatokat tekintve a vizsgálat várandósok 9,5%-nak született előző terhességből fiú gyermeke, a vizsgált 50 várandós esetén 4 esetben fordult elő transzfúzió a kórtörténetben. Az anyai paritásra és transzfúziós anamnézisre vonatkozó adatokat a 7. táblázatban foglaltam össze.
32
IV. EREDMÉNYEK 7. táblázat: A magzati karyotypus, valamint valósidejű (real-time) PCR eredmény a vizsgált esetekben. Esetszám 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
Előző terhességből származó fiú + 0 0 + 0 + + + 0 0 + 0 0 + 0 0 + 0 0 + + 0 0 0 0 + + + 0 0 0 0 0 0 + 0 + 0 0 + 0 + + + 0 0 0 0 0 0
Vetélés
Transzfúzió
Karyotypus
SRY pozitivitás
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 + 0 + 0 + 0 + 0 + +
0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 + 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0
46,XX 47,XY 46,XY 46,XX 46,XX 46,XX 46,XY 46,XX 46,XX 46,XY 46,XX 46,XY 46,XY 46,XX 46,XX 46,XY 46,XY 46,XX 46,XX 46,XY 46,XY 46,XY 46.XX 46,XX 46,XX 46,XY 46,XY 46,XY 46,XX 46,XY 46,XY 46,XY 46,XY 46,XX 46,XX 46,XY 46,XY 46,XX 46,XX 46,XX 46,XX 46,XX 46,XY 46,XX 46,XY 46,XY 46,XX 46,XY 47,XY 46,XX
0 + + 0 0 0 + 0 0 + 0 + + 0 + + + 0 0 + + + 0 0 0 + + + + + 0 + + 0 0 + + 0 0 0 0 0 + + + + 0 + + 0
33
IV. EREDMÉNYEK Az 50 vizsgált esetből 27 esetben találtunk SRY-pozitivitást (2. ábra), 23 esetben a PCR során nem amplifikálódott az SRY régióra specifikus PCR termék (3. ábra).
2. ábra: SRY-pozitív, anyai vérplazmából izolált DNS minta valósidejű (real-time) PCR görbéje.
3. ábra: SRY-negatív, anyai vérplazmából izolált DNS minta valósidejű (real-time) PCR görbéje.
34
IV. EREDMÉNYEK A magzatvíz tenyésztése során nyert magzati sejtek standard karyotypizálása során 26 esetben találtunk 46 XY karyotypust (4. ábra), azaz „fiú” magzatot, 24 esetben 46 XX karyotypust (5. ábra).
4. ábra: Fiú (46,XY) magzat képe tenyésztett magzatvízsejtek standard karyotypizálása során.
5. ábra: Leány (46,XX) magzat képe tenyészett magzatvízsejtek standard karyotypizálása során.
35
IV. EREDMÉNYEK A valósidejű (real-time) PCR vizsgálat eredményét és a standard karyotypizálás eredményét összevetve 47 esetben a magzati nemet azonosnak találtam. Az eseteket a 7. táblázatban foglaltuk össze. Két SRY pozitív esetben a magzatvízmintából nyert, tenyésztett magzati sejtek standard karyotypizálása során nem találtam Y kromoszómát (ál-pozitív). Egy SRYnegatív minta esetén Y kromoszómát találtam a karyotypizálás során (ál-negatív). Minden vizsgált esetben a PCR termékek specifikusságát olvadáspont analízissel is alátámasztottam (6. ábra).
6. ábra: Specifikus és negatív minta olvadásgörbéje. A módszer érzékenysége 92,3%-osnak, specificitása 96,29%-osnak adódott. A két ál pozitív esetben megvizsgálva a várandósok paritását és az elvégzett transzfúziók esetleges hatását nem találtam összefüggést a fenti szempontok és az ál-pozitivitás között. Az egy ál-negatív esetben a vizsgált minták DNS tartalmát β-globin meghatározással ellenőriztem. 4. 1. 2. A szabad magzati DNS mennyisége az SRY-pozitív esetekben A 26 „fiú” magzat esetében a minták összes szabad DNS, valamint szabad magzati DNS mennyiségi meghatározását is elvégeztem β-globin, valamint SRY régióra specifikus primerek felhasználásával. A 26 eset kiértékelése során figyelembe vettem a várandós paritását és egy esetben a várandós kórtörténetében szereplő transzfúziót. Az összes szabad
36
IV. EREDMÉNYEK DNS és a szabad magzati DNS mennyiségét terhességi hétre átlagolva vizsgáltam, a kapott átlagértékeket a táblázatban foglaltam össze (8. táblázat). 8. táblázat: Az összes magzati DNS és szabad magzati DNS átlag mennyisége. Terhességi kor
Összes magzati DNS (globin)
Szabad magzati DNS
(hét)
átlagmennyisége GE/mL
(SRY) átlagmennyisége
(átlag ± SD)
GE/mL (átlag ± SD)
16
358,4 ± 9,27
10,5 ± 2,45
17
1672,2 ± 32,52
52,4 ± 2,24
18
1525,2 ± 68,17
41,6 ± 2,08
19
2205,5 ± 89,65
42,7 ± 3,89
20
3340,20 ± 199,5
45,6 ± 1,41
21
4010,1 ± 106,2
43 ± 2,11
22
3665,22 ± 200,59
65,2 ± 4,66
A terhességi kor előrehaladásával, mind az összes szabad DNS (7. ábra), mind a szabad magzati DNS koncentrációja emelkedést mutat (8. ábra).
7. ábra. Az összes szabad DNS (globin) mennyiségének változása.
37
IV. EREDMÉNYEK
8. ábra. A szabad magzati DNS (SRY) mennyiségének változása. A terhesség 16. és 22. hete között a szabad magzati DNS aránya 2,23 ± 0,7%-nak adódott (9. ábra). Azonos terhességi korban nem találtam eltérést a szabad magzati DNS mennyiségében az először terhes, először szülő, és többedszer terhes, többedszer szülő terhesek között. Hasonlóképpen a transzfúzión átesett beteg esetében sem találtam emelkedett összes, illetve szabad magzati DNS-szintet.
38
IV. EREDMÉNYEK
9. ábra: Az összes szabad DNS, valamint a szabad magzati DNS aránya a terhességi kor előrehaladásával. 4. 2. A magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározása anyai vérplazmából A magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározása az anyai vérplazmából és magzatvízmintavétel során nyert magzatvízből izolált DNS felhasználásával az RhD gén 7 exonjának meghatározásával történt. Az RhD exon7 szekvencia kimutatásával végzett magzati Rh(D)meghatározást, 30 szerológiai módszerrel igazolt Rh(D)-negatív terhes esetében végeztem el. Az anyai átlagéletkor 32,65 ± 1,2 év, a terhességi kor átlaga 17,8 ± 2,1 hétnek adódott. A vizsgált 30 esetből, a plazmából izolált DNS esetében, 25 esetben amplifikálódott a RhD 7-es exonjának megfelelő termék, 5 esetben a PCR során nem amplifikálódott specifikus PCR termék. A magzatvízből és anyai plazmából nyert DNS vizsgálata során 24 gravida esetében találtam azonos eredményt. Hat esetben a magzatvízből kimutatható volt D allél 7 exonja, a plazma vizsgálata során azonban nem keletkezett specifikus termék (ál-negatív). Azonos terhestől származó D allél pozitív plazma és negatív magzatvíz minta nem fordult elő a vizsgálat során (ál-pozitív). A vizsgált várandósok között nem volt transzfúzión átesett beteg. A kapott eredményeket a 9. táblázat foglalja össze.
39
IV. EREDMÉNYEK 9. táblázat: A magzat Rh(D) statusának nem-invazív meghatározása során kapott eredmények Magzatvíz 30 25 5
Összes minta száma RhD 7. exon pozitív RhD 7. exon negatív
Plazma 30 19 11
Minden vizsgált esetben a PCR termékek olvadáspont-analízisével is alátámasztottam a keletkezett termékek specifikusságát (10. ábra).
10. ábra: A valósidejű (real-time) PCR vizsgálat során keletkezett RhD exon 7 termékek olvadásgörbéje. Az általunk elvégzett vizsgálat során a magzatvízből meghatározott magzati Rh(D), illetve az anyai plazmából izolált szabad magzati DNS vizsgálatával meghatározott Rh(D) status a vizsgált esetek 80%-ban bizonyult azonosnak. Az azonos eredményt adó esetek 20,8%-a Rh(D) negatívnak 79,2%-a Rh(D) pozitívnak bizonyult. A fenti adatok birtokában a módszer specifikussága 100%-nak, érzékenysége 76%-nak bizonyult, a pozitív prediktív érték szintén 100%. 4. 3. Az anyai eredetű DNS kimutatása újszülöttek véréből A vizsgálat során érett- és koraszülötteket vizsgáltam a megszületést követően 35-120 perccel. A terhesség befejezésének módja hüvelyi szülés, valamint császármetszés volt. Megszületést
követően
az
újszülöttek
vércsoportját
szerológiai
módszerrel
került
meghatározásra. Tíz Rh(D)-negatív újszülött és Rh(D)-pozitív anya esetében az újszülöttől 40
IV. EREDMÉNYEK rutin vérvétel keretében nyert perifériás vér vizsgálatát végeztem el. Az anyai eredetű DNS kimutatása az RhD gén 7 exonjára specifikus primerekkel történt. Mind a tíz Rh(D)-negatív újszülött esetében az RhD allél hetes exonja kimutatható volt a perifériás vérben (11. ábra).
11. ábra: RhD gén 7 exonjának amplifikációs képe valósidejű (real-time) PCR során. A vizsgálatokhoz használt pozitív és negatív kontrolt figyelembe véve álpozitív valamint álnegatív esetet nem találtam. Az anyai DNS számolt koncentrációja 74,34 ± 48,67 GE/mL értéknek adódot. Az újszülöttek gestatiós korát és a hozzájuk tartozó anyai eredetű DNS mennyiségét vizsgálva megállapíthatjuk, hogy a gestatiós kor előrehaladtával, a vizsgált esetekben az anyai eredetű DNS mennyisége emelkedett (12. ábra).
41
IV. EREDMÉNYEK
12. ábra: Az anyai DNS mennyiségének változása a terhességi kor előrehaladtával Az terhességi hét és a vérvétel időpontjának hányadosa, valamint az anyai eredetű DNS mennyisége között nem állítható fel egyértelmű összefüggés (13. ábra). Minden vizsgált esetben az újszülöttek ellenanyagszűrését is elvégeztem.
42
IV. EREDMÉNYEK
13. ábra: Az anyai DNS mennyisége a terhességi hét/vérvételi időpont hányados függvényében. Az elvégzett immunszerológiai vizsgálat során nem volt kimutatható ellenanyag az újszülöttek vérében (10. táblázat). 10. táblázat: Az anyai DNS mennyisége az újszülöttek vérében. Minta
Terhességi
Vérvétel időpontja a
Újszülött Rh(D)
kor
szüléstől számítva
statusa
(hét)
(perc)
RhD allél
DNS koncentráció
Ellenanyag
(GE/mL)
1
38
100
Rh(D)-negatív
Pozitív
108,66
negatív
2
39
90
Rh(D)-negatív
Pozitív
171,33
negatív
3
35
60
Rh(D)-negatív
Pozitív
68,80
negatív
4
23
35
Rh(D)-negatív
Pozitív
4,88
negatív
5
40
35
Rh(D)-negatív
Pozitív
147,33
negatív
6
33
120
Rh(D)-negatív
Pozitív
5,06
negatív
7
38
100
Rh(D)-negatív
Pozitív
55,0
negatív
8
33
80
Rh(D)-negatív
Pozitív
7,83
negatív
9
32
100
Rh(D)-negatív
Pozitív
2,08
negatív
10
30
40
Rh(D)-negatív
Pozitív
2,74
negatív
43
IV. EREDMÉNYEK 4. 4. Szabad magzati DNS meghatározása méhen kívüli terhesség esetén A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján, méhen kívüli terhesség klinikai és laboratóriumi jeleivel jelentkező 58 beteg közül 36 esetben igazolódott a méhen kívüli terhesség gyanúja. A szabad magzati DNS kimutatása az SRY régióra sepcifikus primerek segítségével történt. Valósidejű (real-time) PCR vizsgálat során a 36 esetből 15 esetben találtam SRY-pozitivitást. A kontroll csoportba tartozó 45 betegek között 14 esetben amplifikálódott az SRY régióra specfikus PCR termék. Az SRY-pozitív esetekben a szabad magzati eredetű DNS mennyiségi meghatározása történt. A két vizsgált csoport esetében a vérzéskimaradást tekintve (52,1 ± 4; 55,3 ± 0,6 nap) nem volt szignifikáns különbség. Független T próbát használva az átlag plazma DNS mennyisége a méhen kívüli, valamint méhen belüli terhesség (kontroll csoport) esetén 565,41 ± 136,06; 71,7 ± 18,19 GE/mL adódott. A két csoport közt szignifikáns különbség mutatható ki (P<0.005). A méhen kívüli terhesek esetén a szabad magzati DNS mennyisége szignifikánsan magasabb, mint méhen belüli terhesség esetében (P<0.001) (14. ábra).
14. ábra. A szabad magzati DNS mennyisége méhen kívüli (EUG) és méhen belüli (IUP) terhesség esetében. Pearson korrelációs teszet alkalmazva, a vizsgált időintervallumban a vérzéskimaradás és a mért szabad DNS mennyisége között nem mutatható ki összefüggés méhen kívüli terhesség esetén.
44
IV. EREDMÉNYEK A serum β-hCG mennyisége, méhen kívüli terhesek esetében 4778,206 ± 1759,1, méhen belüli terhesség esetén 132399,797 ± 11488,56 U/L átlagértéknek adódott. A két csoport közötti különbség szignifikánsak mutatkozott (P<0.0001). Méhen belüli terhesség esetében a serum β-hCG értéke szignifikánasn magasabbnak bizonyult, mint méhen belüli terhesség estén (P<0.0001) (15. ábra).
15. ábra: A β-hCG mennyisége (U/L) méhen kívüli (EUG) és méhen belüli (IUP) terhesség esetén. Pearson-féle korrelációs teszet használva nem találtam szignifikáns összefüggést a szabad magzati DNS és szérum β-hCG változása között (P=0.05). Az SRY/β-hCG hányados átlagértékeit vizsgálva az átlagértékhez viszonyított standard deviáció méhen kívüli terhesség esetén magasabbnak bizonyult, mint méhen kívüli terhesség esetén. Az adatok elemzése során azt találtuk, hogy >80 GE/mL szabad magzati DNS mennyiség felett a módszer alkalmasnak bizonyult a méhen belüli és méhen kívüli terhesség elkülönítésére.
45
V. MEGBESZÉLÉS
5. Megbeszélés A prenatális diagnosztika a klinikai genetika azon területe, amely magába foglalja mindazokat a módszereket és eljárásokat, amelyek segítségével az embryo, illetve a magzat genetikai állományáról információt nyerhetünk. A módszerek segítségével felismerhetjük azokat a magzati rendellenességeket, amelyek méhen belüli, esetleg korai újszülöttkori kezelést tesznek szükségessé, vagy gyógyíthatatlan esetekben a terhesség befejezését indokolhatják. A praenatális diagnosztika egyrészt lehetővé teszi, hogy magas genetikai kockázattal bíró szülők számára is megelőzhető legyen a beteg utód születése, másrészt negatív diagnosztikus eredmény esetén elősegíti az utód vállalását ezekben a családokban. A praenatális genetikai diagnosztika kezdete az 1950-es évekre vezethető vissza. Elsőként Fuchs és munkatársai az X-chromatin vizsgálatával magzatvízből történő nem-meghatározást végeztek haemophilia A emelkedett magzati kockázata miatt, majd 1966-ban Steele és Bregg [147], valamint Lussier és munkatársai [93] nevéhez fűződik az első magzati karyotypusmeghatározás. Magyarországon az első praenatális nem-meghatározást Papp és munkatársai végezték 1970-ben [115], majd az első magzatvízsejt-vizsgálatokról 1972-ben számoltak be [116]. A praenatális vizsgálati módszerek invazív és nem-invazív csoportba oszthatók. Napjainkban az egyetlen, a klinikumban rutinszerűen használt nem-invazív diagnosztikai módszer az ultrahang vizsgálat. Az invazív vizsgálatokat tekintve, a praenatális genetikai diagnosztika egyik legfontosabb területe a magzati chromosoma-rendellenességek vizsgálata. A genetikai diagnosztikus vizsgálatra alkalmas magzati mintavétel módjai a chorionboholymintavétel (CVS), a genetikai amniocentézis (GAC) és a vérvétel a magzati köldökzsinórból (PUBS) [16,31]. A CVS a terhesség mindhárom trimeszterében, legkorábban a 10-12. hét között alkalmazható magzati mintavételi technika. 10-20 mg szövetminta nyerhető a méhlepényből, amely cytogenetikai vizsgálatra, enzimaktivitás mérésére, illetve DNS-vizsgálatokra alkalmas [107,138]. Elsőként Kazy és munkatársai alkalmazták az 1980-as évek elején [56]. A transcervicalis és transabdominális behatolási lehetőségek közül napjainkban szinte kizárólag a transabdominális mintavételt alkalmazzák biztonságosabb volta miatt [1,113,114]. A módszer előnye, hogy az első trimeszterben is elvégezhető, és a nyert minta direkt cytogenetikai vizsgálatával az eredmény a mintavételt követő 24 órán belül elkészül, így kóros esetben a terhesség megszakítása már az első trimeszterben elvégezhető. A módszer
46
V. MEGBESZÉLÉS hátránya, hogy alkalmazása során a magzati veszteség mintegy kétszerese az amniocentesis során észleltnek (≈2%), valamint sem a direkt, sem a tenyésztéses módszer során vizsgálható mitózisok minősége és sávozhatósága nem éri el a magzatvíz-preparátumokét [91]. Az első magzatvízből végzett cytogenetikai vizsgálatokat az 1960-as években írták le [93,147,161]. A „klasszikus” (a terhesség 16-18. hete között végzett) genetikai amniocentesis azóta a magzati chromosoma-vizsgálatok standard módszerévé vált [101]. Az eljárás során ultrahangellenőrzés mellett az amnionűrből 10-20 ml magzatvizet veszünk, amely magzati eredetű sejteket tartalmaz. A minta cytogenetikai vizsgálatra, enzimaktivitás mérésére, illetve DNSvizsgálatokra alkalmas. Mivel a magzatvízsejtek tenyésztése és cytogenetikai vizsgálata igen megbízható [120], valamint a beavatkozás szövődményeinek kockázata is alacsony (<1%), cytogenetikai vizsgálathoz elsősorban ezt a módszert alkalmazzuk [118]. A méhlepény magzatot és anyát összekötő és elválasztó szerepe mindig a kutatások középpontjában állt. A tápanyagellátásban, oxigenizációban, endocrin és immunológiai folyamatokban betöltött szerepe biztosítja a magzat zavartalan fejlődését és növekedését. Az elmúlt évtized kutatásai a méhlepényen keresztül zajló, kétirányú sejt és DNS-transzportra derítettek fényt [86]. Az anyai perifériás keringésben megjelenő magzati sejtek, valamint magzati DNS új perspektívát nyitottak a preanatális diagnosztika számára. A nem-invazív magzati mintavétel lehetősége nagy lendületet adott az ezen a területen végzett kutatásoknak. A magzati eredetű sejtek, valamint a szabad magzati DNS kutatásának lehetőségét a molekuláris genetikai módszerek gyors fejlődése teremtett meg azáltal, hogy a vizsgálatok során leggyakrabban alkalmazott egy sejt FISH, valósidejű (real-time) PCR, microarray technikák lehetővé teszik a kis mennyiségű DNS minták vizsgálatát. A nem-invazív mintavételi módszer, valamint az invazív mintavételi módszerek előnyeit és hátrányait az alábbi, 11. táblázatban foglaltam össze.
47
V. MEGBESZÉLÉS 11. táblázat: Az invazív és nem-invazív mintavételi módszerek összehasonlítása Előny
Invazív mintavétel
Nem-invazív mintavétel
Megfelelő mennyiségű minta.
Magzati veszteség kockázatának hiánya.
Mind molekuláris, mind cytogenetikai Fizikai és pszichés megterhelés Hátrány
vizsgálatra alkalmas.
hiánya.
Magzati veszteség kockázata
Kevés minta. Többnyire molekuláris biológiai vizsgálatra alkalmas.
Pszichés megterhelés.
Markerek limitált száma.
A klinikánkon végzett vizsgálat során a méhlepényen keresztül zajló kétirányú DNS„transzportot” vizsgáltuk. Az elvégzett vizsgálatok négy témakör köré csoportosultak: •
A szabad magzati DNS kimutatása az anyai keringésből és a magzati nem neminvazív
meghatározásának
lehetősége.
A
szabad
magazti
DNS
quantitatív
meghatározása. •
A magzati Rh(D) nem-invazív meghatározása
•
Az újszülöttek keringésében fellelhető anyai DNS kimutatása a megszületést követően.
•
A szabad magzati DNS quantitatív meghatározása és szerepe méhen kívüli terhesség differenciáldiagnosztikájában.
Mind az öt esetben valósidejű (real-time) PCR módszert használtam. A valósidejű (real-time) PCR vizsgálat előnye a hagyományos PCR reakcióval összehasonlítva, hogy nyomon követhető a PCR reakció időbeli lefutása, lehetővé teszi a reakciótermék gyors mennyiségi meghatározását és a rendszer felépítéséből adódóan csökkenti a kontamináció lehetőségét. A magzati, valamint anyai DNS kimutatása egyaránt az anyai és magzati DNS közti különbségen alapult. A magzati nem meghatározása, a szabad magzati DNS quantitatív vizsgálata, valamint a méhen kívüli terhesség esetében a szabad magzati DNS mennyiségi meghatározása az Y kromoszómán elhelyezkedő SRY régió kimutatásával és mennyiségi mérésével történt. A magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározását és az anyai eredetű DNS újszülöttek véréből történő kimutatását az RhD gén 7 exonjának kimutatásával végeztem.
48
V. MEGBESZÉLÉS A magzati nem meghatározásának jelentőségét a nemhez kötötten öröklődő betegségek adják (Duchenne muscularis dystrophia, haemophilia A stb.) A nemhez kötötten öröklődő betegségek esetében gyakran az egyetlen lehetőség, a praenatális diagnosztikára, a magzati nem
meghatározása,
és
ezáltal
a
betegség
előfordulási
kockázatának
pontosabb
meghatározása. A klinikai gyakorlatban a magzati nem meghatározásának egyetlen biztos módszere a chorionboholy, vagy a magzatvíz-mintavétel során nyert magzati eredetű sejtek, DNS vizsgálata. A mintavétel során, függetlenül a magzat nemétől, a terhesnek számolnia kell a magzati veszteség kockázatával. A magzati nem nem-invazív, anyai vérből nyert magzati sejtek valamint szabad magzati DNS vizsgálatával történő, meghatározása során ez a kockázat kiküszöbölhető. Az általam elvégzett vizsgálat során az esetek 89,28%-ában jutottam eredményhez. A vizsgált esetekben a szabad magzati DNS-ből történő nem valamint a karyotypizálás során meghatározott magzati nem 94%-ban azonosnak bizonyult. Az általam kapott eredmény megfelel a nemzetközi irodalomban fellelhető adatoknak. A szabad magzati DNS átlagmennyisége a 16. és 22. terhességi hét között 43 GE/mL adódott, ami az anyai plazmában jelenlévő összes szabad DNS 2,23%-a. A szabad DNS koncentrációjának nagyságrendje megfelel a Lo és munkacsoportja által mért szabad DNS mennyiségnek [83]. Az összes szabad DNS és szabad magzati DNS arány esetünkben kevesebbnek bizonyult a fent említett tanulmány során mért értékeknek. A magzati Rh(D) status meghatározásának klinikai jelentőségét a mindennapi klinikai gyakorlatban tapasztalhatjuk. A magzati vörösvérsejtek 0,01 ml-e az első, második és harmadik trimeszterben járó terhesek 3%-ában, 12%-ában és 46%-ában lelhető fel [95]. A terhességek nagy részében a bejutó magzati vörösvérsejteket az anyai reticuloendothelialis rendszer eliminálja, ezért az anya immunizációja nem alakul ki. Amennyiben nagy mennyiségű magzati vörösvérsejt jut az anyai keringésbe, stimulálódik az anyai immunrendszer, aktiválva az RhD antigént felismerő B lymphocyta klónokat, ami korai IgM, majd IgG termelődését eredményezi. Az IgM-mel ellentétben az IgG gyorsan átjut a méhlepényen és magzati vörösvérsejtek elpusztításával anaemia kialakulásához vezet. A kialakuló Rh szenzitizációk mintegy 18-27%-áért, az első terhességben végzett, nem megfelelő prophylaxis, adminisztratív tévedés vagy transzfúzió a felelős. Amennyiben az immunizáció létrejött, a magzati anaemia veszélye a terhesség előrehaladásával és az anyai keringésbe bejutott magzati sejtek mennyiségének emelkedésével növekszik. 15 IU/ml anti-D érték felett invazív monitorizálás szükséges. A nem-invazív 49
V. MEGBESZÉLÉS monitorizálás napjainkban jórészt a magzati anaemia jeleinek korai felismerését jelenti ultrahang-diagnosztikai módszerekkel. Előrehaladott magzati érintettség esetén a hydrops következtében a magzati koponya kettős kontúrú, a has átmérője, a hepatosplenomegalia és ascites miatt meghaladja a koponya átmérőjét, a magzat „Buddha”-tartásban helyezkedik el, a placenta vastag, polyhydramnion figyelhető meg [108]. A magzati arteria cerebri media áramlásának vizsgálata során, amennyiben a csúcs systolés áramlás az adott terhességi korban mért átlagérték 1,5 –szöröse vagy annál magasabb, az magzati aemiara utal. A szakirodalom tanulsága szerint a módszer érzékenysége 100%, a fals pozitív esetek aránya 12%. Hátrányaként említhető, hogy jó hatásfokkal csak a harmadik trimeszterben alkalmazható [15,95]. A betegség előfordulási gyakoriságát és a kezelési nehézségeit, valamint a prophylaxis jó hatásfokát is figyelembe véve a legnagyobb figyelmet a megelőzésre kell fordítani. Anti-D IgG adása kötelező Rh(D)-negatív, terhességmegszakításon, vetélésen, méhen kívüli tehességen átesett betegek, chorionboholy mintavétel, amniocenesis, az anya hasi contusioval járó sérülése esetén. Számos irodalmi ajánlás szerint a 28. terhességi hetet követően minden Rh(D)-negatív anya prophylaxisban részesítendő [13]. A preventio szempontjából éppen ezért igen fontos a magzati Rh(D) status intrauterin meghatározása. Ahhoz, hogy az anyai és magzati eredetű DNS-t el tudjuk különíteni, olyan markert kell választanunk, amely szempontjából az anyai és magzati DNS eltérő. Rh(D)negatív anya esetén két d alléllal állunk szemben. Amennyiben a magzat Rh(D)-pozitív dD vagy DD genotípus feltételezhető. Mindkét esetben a D allél jelenléte biztosítja a lehetőséget a non-invazív praenatalis diagnosztikára. A molekuláris genetikai vizsgálóeljárások fejlődése lehetővé teszi, hogy kis mennyiségű DNS felhasználásával diagnosztikai eredményhez jussunk [11,81]. Az általam elvégzett vizsgálat során a magzatvízből meghatározott magzati Rh(D), illetve az anyai plazmából izolált szabad magzati DNS vizsgálatával meghatározott Rh(D) status a vizsgált esetek 80%-ában bizonyult azonosnak. A módszer specifikussága 100%-nak szenzitivitása 76%-nak adódott, a pozitív prediktiv érték szintén 100%-nak adódott. Eredményeink azonosak a nemzetközi szakirodalomban fellelhető vizsgálati eredményekkel. Néhány tanulmány tanulsága szerint a markerek számának növelésével a módszer szenzitivitása tovább (99%) növelhető [36,174]. A magzati Rh(D) in utero non-invazív meghatározása mind klinikai, mind pedig gazdasági jelentőséggel bír. A módszer non-invazivitásából adódóan kockázat nélkül választható ki azon Rh(D) negatív terheseknek a csoportja, ahol valóban fennáll az Rh-összeférhetetlenség. Ezzel az alkalmazott anti-D IgG mintegy 30%-ban válik fölöslegessé. Egyes becslések szerint ez a 50
V. MEGBESZÉLÉS diagnosztika, a prophylaxis költségeit is figyelembe véve, nem utolsó sorban anyagi megtakarítást jelent. Számos kutatás tanúbizonysága szerint az anya és a magzat között sejt- és DNS- „áramlás” kétirányú [83,86]. Ezen sejtek, illetve szabad DNS szerepe jelenleg még nem tisztázott, azonban néhány tanulmány arról számol be, hogy bizonyos autoimmun betegségek esetén mint például a scleroderma, autoimmun thyreoiditis- a magzati eredetű sejtek száma az érintett szervben, szövetben jóval nagyobb, mint a nem érintett egyénekben [6,104,106]. Hasonlóképpen veleszületett systemás lupus erythematosus esetében az anyai eredetű sejtek nagy száma volt megfigyelhető az elhalt újszülöttben. Az anyai eredetű sejtek és DNS jelenléte az újszülöttek vérében érdekes kérdéseket vet fel, és lehetséges magyarázattal szolgál az Rh(D)-negatív nulligravid nők Rh(D)-szenzitizációjának jelenségére („grandmother effect”). Vizsgálataim során minden esetben sikerült kimutatni az anyai DNS jelenlétét az újszülöttek vérében. Az anyai DNS átlagmennyisége 74,34 ± 48,67 GE/mL adódott. Az irodalmi adatok szerint a harmadik trimeszterben az anya vérében keringő magzati DNS mennyisége 291,2 GE/mL-re tehető [87]. Ennek alapján megállapítható, hogy az anyai eredetű DNS jóval kisebb mennyiségben jut át a magzati keringésbe. A magzati vérbe kerülő anyai sejtek és DNS nagy valószínűséggel szerepet játszanak congenitalis autoimmun betegségek kialakulásában [150]. A koraszülöttek és érett újszülöttek vérében perzisztáló anyai sejtek és DNS az újszülött immunrendszerének
fejlődésével
hozzájárulhat
az
Rh(D)-negatív
újszülött
későbbi
szenzitizációjához. A szabad magzati DNS-nek a klinikai gyakorlatban történő felhasználása minden kutató számára rendkívül izgalmas kihívás. A méhen kívüli és méhen belüli terhesség diferenciáldiagnosztikájában rutinszerűen a hüvelyi ultrahang vizsgálatot és a szérum β-hCG szintjének meghatározását végezzük. Nagyszámú betegcsoporton végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a β-hCG egyszeri meghatározása nem megfelelő módszer a méhen belüli (IUP) és méhen kívüli (EUG) terhesség elkülönítésére. Megbízható, egyszeri nem-invazív diagnosztikai eszköz hiányában a differenciáldiagnózis a méhen kívüli terhesség diagnózisa, a méhen belüli terhesség kizárására korlátozódik. A perifériás keringésből számos olyan méhlepény-specifikus fehérje, valamint lepénytől független marker mutatható ki, amelynek mennyisége a méhen belüli és méhen kívüli terhesség esetén eltérő. A 12. táblázatban felsorolt markerek vizsgálata során azonban számos kétség merült fel.
51
V. MEGBESZÉLÉS 12. táblázat: Placentáris és nem placentáris markerek változása méhen belüli és méhen kívüli terhesség esetén. Méhen belüli terhesség (IUP)
Méhen kívüli terhesség (EUG)
Placentáris hCG
↑↑↑
↑
PAPP-A
↑↑↑
↑
HPL
↑↑↑
↑
SP1
↑↑↑
↑
LIF
↑↑↑
↑
progesteron
↑↑↑
↑
glycodein
↑↑↑
↑
VEGF
↑
↑↑↑
Nem placentáris
A szérum progeszteron szint esetében nem találtak szignifikáns eltérést a méhen kívüli terhesség és méhen belüli elhalás esetében [26]. A magzati fibronektin mennyisége ugyan alacsonyabb méhen kívüli terhesség esetén, de a módszer érzékenysége és specificitása nem kielégítő [109]. Ugyanez mondható el a szérum leukemia ihibitoring factor (LIF), illetve a vascularis endothelialis növekedési factor (VEGF) esetében is, ahol a szenzitivitás mindössze 60% [24,25,169]. A vizsgálat elvégzésére az a jelenség sarkallt, hogy kóros placentáció esetén a szabad magati DNS mennyisége eltér az azonos korú, de szövődménymentes terhesek perifériás keringésében mérhető mennyiségtől [131]. Méhen kívüli terhesség esetén a trophoblast invázió, az anyai erek destrukciója lényegesen különbözik a méhen belüli terhességben tapasztalható placentációtól. Az általunk azonos vérzéskimaradás esetében mért szabad magzati DNS koncentráció, méhen belüli és méhen kívüli terhesség esetében jelentősen eltért egymástól. Méhen kívüli terhesség esetén a szabad DNS mennyisége egy nagyságrenddel mutatkozott többnek, mint azonos terhességi korú méhen belüli terhességek esetében. Amennyiben a szabad magzati DNS “cut-off“ értékét 80GE/mL választjuk a módszer érzékenysége 83,7%-nak, specificitása 76,5%-nak, pozitív prediktív értéke 78%-nak bizonyult. A szérumban mért β-hCG értékek és a szabad DNS mennyiségi változása között azonban nem vonható egyértelmű összefüggés. Összességében elmondható, hogy a szakirodalomban fellelhető és általam végzett vizsgálatok is alátámasztják a szabad magzati DNS-nek a nem invazív diagnosztikában betöltött jelentős
52
V. MEGBESZÉLÉS szerepét. Szabad magzati DNS esetén a megfelelő magzati DNS-re specifikus „marker” használatával elkülöníthetjük a magzati DNS-t. Az 1.2 fejezetben tárgyalt, méretbeli és más qualitatív (pl. metiláltság) különbségek, valamint más epigenetikai eltérések vizsgálata a közeljövőben a napi klinikai gyakorlat számára is elérhetővé válik. A magzati eredetű DNS vizsgálatára többnyire QF-PCR, illetve valósidejű (real-time) PCR és microarray technika használható. A szabad magzati DNS nem-invazív praenatális diagnosztikai felhasználási lehetőségeit, az irodalom és az általunk végzett vizsgálatok alapján a 13. táblázatban foglaltam össze. 13. táblázat: A szabad magzati DNS nem-invazív praenatális diagnosztikában történő felhasználása. Vizsgálat
Markerek
Jelentősége
Magzati nem nem-invazív
SRY, DYS14,
Nemhez kötötten öröklődő
meghatározása
DYZ3
betegségek praenatális
Irodalom 52,65,82
diagnosztikája Magzati Rh(D) status nem-
RhD 7. exon,
invazív meghatározása
10. exon
122,160
Quantitatív mérések
SRY, β-globin Koraszülés
75,136
β-thalassemia nem-invazív diagnosztikája
Rh(D)-constellatió kizárása
33,36,41,68,
21. kromoszóma triszómiája
84,174
18. kromoszóma triszómiája
174,166
13. kromoszóma triszómiája
174,166
Praeeclampszia Méhen belűli sorvadás
64,74,84, 179,177,131 136 130
Feto-maternális transzfúzió
63
Polyhydramnion
178
Invazív placenta
131
Méhen kívüli terhesség
67
4 -globin gén β-thalassemia endémiás
77
területeken történő vizsgálata
53
VI. KÖVETKEZTETÉSEK
6. Következtetések Az intrauterin életben a méhlepényen keresztül biológiailag jelentős sejt- és DNS-transzport zajlik. Az anyai vérkeringésbe bekerülő magzati sejtek magzati magvas vörösvérsejtek, magzati lymphocyták és trophoblastsejtek. A szabad magzati eredetű DNS ezen sejtek necrosisával, apoptosisával és aktív DNS kiválasztásával kerül az anya vérplazmájába. A szabad magzati DNS a vérzéskimaradást követő 16-22. héten kimutatható az anya vérkeringéséből, mennyisége a terhesség előrehaladásával növekszik. A magzati sejtekhez hasonlóan anyai sejtek és DNS „vándorol” a magzat irányába. A magzat, újszülött vérébe bekerülő anyai a sejtekről és DNS-ről jóval kevesebb információ áll rendelkezésre. Vélhetően anyai fehérvérsejtek, őssejtek, valamint a belőlük származó DNS képezi a fellelhető sejtek és DNS zömét. Az általam végzett vizsgálatokból az alábbi következtetések vonhatóak le: •
A szabad magzati DNS mennyisége az első trimeszter határán, valamint a második trimeszter elején elegendő a magzati nem biztonságos nem-invazív meghatározására.
•
Az előző terhességek száma és az előző terhességekből származó gyermekek neme nem befolyásolja a magzati nem nem-invazív meghatározásának biztonságát.
•
A terhességet megelőző két évben kapott transzfúzió nem befolyásolja a nem-invazív nem-meghatározást.
•
A szabad magzati DNS mennyisége és az összes szabad DNS mennyisége egyaránt növekszik a terhességi kor előrehaladásával.
•
A terhesség 16-22. hete között a szabad magzati DNS aránya az összes szabad DNS mennyiségnek mintegy 2,3%-a.
•
A terhesség 16-22. hete között az anyai vérplazmából izolált szabad magzati DNS jól használható a magzati Rh(D) status nem-invazív meghatározására.
Az újszülöttek esetében végzett vizsgálat során a szakirodalomban elsőként írtam le a megszületést követően 35-120 perccel az anyai DNS jelenlétét, és vizsgáltam az adott időintervallumban a felmerülő immunológiai konzekvenciákat. Eredményeim alapján megállapítható: •
A megszületést követően 35-120 perccel az anyai DNS kimutatható az újszülöttek perifériás keringésében.
•
Az anyai DNS mennyisége összefügg a megszületéskori terhességi korral, és nem mutat egyértelmű összefüggést a vérvétel időpontjával. 54
VI. KÖVETKEZTETÉSEK •
Az anyai DNS mennyisége egy nagyságrenddel kisebb, mint a szakirodalomban az azonos terhességi korban, az anyai vérplazmában mért szabad magzati DNS mennyisége.
•
A megszületést követő 35-120 percben az Rh(D)-negatív újszülöttek keringésében ellenanyag nem mutatható ki.
A méhen belüli és méhen kívüli terhesség differenciáldiagnózisa, tekintettel a betegség mortalitási adataira, rendkívül fontos a napi klinikai gyakorlatban. •
A klinikánkon elvégzett vizsgálat során elsőként mutattam ki a szabad magzati DNS jelenlétét a perifériás keringésben méhen kívüli terhesség esetén.
•
Méhen kívüli terhesség esetén a szabad magzati DNS mennyisége szignifikánsan különbözik az azonos korú, méhen belüli terhességet viselő terhesek vérében mérhető mennyiségtől.
•
A szabad magzati DNS mennyisége nem mutat összefüggést a mért szérum β-hCG értékkel.
•
Megfelelő „cut-off” érték esetén a szabad magzati DNS meghatározása alkalmas lehet a méhen belüli és méhen kívüli terhességek elkülönítésére.
A szabad magzati DNS diagnosztikai célra történő felhasználása számos lehetőséget, ugyanakkor még több kérdést rejt magában. A nem-invazív praenatális diagnosztika lehetősége a kutatások mind szélesebb körű kiterjedését eredményezte az elmúlt években. A módszer korlátai, az általunk végzett tanulmányokat is beleértve, a magzati eredetű DNS anyaitól történő biztonságos elkülönítéséből és a specifikus markerek limitált számából adódik. Az anyai és magzati DNS-fragmentumok méretbeli és minőségi különbségei, az epigenetikai markerek növekedő száma azonban kecsegtető a jövőbeli kutatások tekintetében.
55
VII. ÖSSZEFOGLALÁS
7. Összefoglalás Kétirányú transzplacentáris DNS-transzport. Új lehetőségek a nem-invazív praenatális diagnosztikában. Az anya és magzata közti sejt- és DNS- áramlás jelenségének vizsgálata új lendületet kapott az elmúlt évtizedben. Schmorl által 1893-ban praeeclampsia szövődményeként elhunyt terhesek tüdejében leírt trophoblastok klinikai jelentősége és diagnosztikai alkalmazhatósága számos kutatócsoport munkájának központi témájává vált. A jelenség praenatális diagnosztikai kutatását és alkalmazhatóságát a rohamosan fejlődő molekuláris biológiai technikák tették lehetővé. A szabad magzati DNS vizsgálata és praenatális diagnosztikai alkalmazhatósága már nem csak a kutatás számára, hanem a klinikum számára is elérhető. A szerző a lepényen keresztül zajló kétirányú DNS-áramlást vizsgálta 100 terhes, 10 újszülött, valamint 15 szövettanilag igazolt méhen kívüli terhesség esetében. Vizsgálta a magzat nemét, Rh(D)-vércsoportját, a szabad magzati DNS mennyiségét, annak összefüggését a terhességi korral, a korábbi terhességekből született gyermek nemével és a kórtörténetben szereplő transzfúziókkal. Elsőként végzett vizsgálatot az újszülöttek vérében jelenlévő anyai DNS kimutatására és a szabad magzati DNS jelenlétére vonatkozóan méhen kívüli terhesség esetében. A magzati nem nem-invazív meghatározása során a vizsgált esetek 89%-ban jutott informatív eredményhez. A magzat nemének nem-invazív, anyai vérplazmából történő, meghatározása során 97%-ban a karyotypizálás során igazolt nemmel azonos eredmény adódott. A magzat nemét a korábbi terhességekből született gyermek neme, valamint a transzfúziók nem befolyásolták. A quantitatív vizsgálatok során az összes szabad és szabad magzati DNS mennyisége emelkedést mutatott a terhességi kor előrehaladásával. A magzati Rh(D) nem-invazív meghatározása során a magzatvízből és a vérplazmából igazolt magzati Rh 80%-ban bizonyult azonosnak. A vizsgált újszülöttek esetében az anyai DNS jelenlét minden esetben igazolható volt a perifériás keringésben, mennyisége az azonos terhességi korban mért, anyai plazmában fellelhető, szabad magzati DNS töredéke. Méhen kívüli terhesség esetén 10-45. napos vérzéskimaradás esetén a szabad magzati DNS kimutatható volt a betegek vérplazmájából, mennyisége nagyságrenddel nagyobb, mint azonos korú intrauterin terhesség esetében. A szabad magzati DNS mennyiségének változása összefüggést mutatott a vérzéskimaradás idejével, de nem mutatott összefüggést az adott terhességi korban mért β-hCG értékkel.
56
VII. ÖSSZEFOGLALÁS Az eredmények alapján a szerző megállapítja, hogy a terhesség folyamán a méhlepény két oldala között DNS-transzport zajlik. Az anyai plazmába kerülő szabad magzati DNS mennyisége a terhesség 30. napjától elegendő a magzati nem-, valamint az Rh(D) status anyai vérplazmából történő, nem-invazív meghatározására. Az újszülöttek vérébe bekerülő anyai sejtek és DNS lehetséges magyarázata az Rh(D)-negatív nulligravid nők esetében előforduló „grandmother” jelenségnek. A szabad magzati DNS emelkedett mennyisége alkalmas módszernek bizonyult a méhen belüli és méhen kívüli terhességek elkülönítésére.
57
VII. ÖSSZEFOGLALÁS Bidirectional transplacental DNA traffic between fetus and mother. New perspectives in non-invasive prenatal diagnosis. The discovery of fetal cells and cell-free fetal DNA in the peripheral circulation of pregnant women opened new perspectives in non-invasive prenatal diagnosis. The importance of noninvasive prenatal diagnosis is justified by the fact that it enables to avoid the risk of fetal loss, which is present in the case of invasive sample taking methods. The possibilities of noninvasive diagnosis are further enhanced by the rapid development of molecular biological methods. The aims of this study were to detect the transplacental, two-way DNA traffic between mother and fetus; to determine fetal gender and Rh(D) status using cell-free fetal DNA isolated from maternal plasma, with consideration to the gender of previous child(ren) and transfusion history; and, in the case of male fetuses, to determine the quantity of cell-free fetal DNA.. Another aim of the study was to detect the presence of maternal origin DNA in newborns peripheral circulation 30-120 minutes after delivery.
The usefulness of detection and
measuremet of the quantity of cell free fetal DNA in case of ectopic pregnancy cases compared with intrauterine case was an other aim of the study. In the case of gender determination 89% of the results were informative. Non-invasive fetal gender determination from maternal plasma gave identical results with karyotype gender analysis in 97% of the cases. The quantity of total cell-free and cell-free fetal DNA rises with the gestation weeks. As for fetal Rh(D) satus determination, Rh(D) status determined from maternal plasma and Rh(D) status determined from amniotic fluid were the same in 80% of the cases. The maternal DNA was detectable in each of the 10 newborn cases examined as late as 30-120 minutes upon delivery and the quantity of DNA was found to grow with gestational age. Cell-free fetal DNA was detectable in ectopic pregnancy cases as well, but the quantity of DNA was ten times higher than in patients with normal, intrauterine gravidity. This quantity increased with gestational age, but there was no correlation with the HCG level measured at the same gestational age. The results of the studies allow us to draw the following conclusions: Cell-free fetal DNA can be detected in maternal plasma between the 16. and 22. weeks of gestation. The quantity of DNA is enough to determine fetal gender and Rh(D) status. The gender of previous child(ren) and previous transfusions do not affect the reliability of the method. Maternal DNA is present in fetal circulation and the quantity of DNA increases with
58
VII. ÖSSZEFOGLALÁS gestational age. The persistence of maternal cells and DNA could be a possible explanation for the ’grandmother effect’ observed in Rh(D) negative nulligravid women. The measurement of cell-free fetal DNA level in ectopic pregnancy could also provide important information in the differential diagnosis of intrauterine and ectopic pregnancy cases.
59
VIII. RÖVIDÍTÉSEK
8. Rövidítések 3D ultrahang vizsgálat
háromdimenziós ultrahang vizsgálat
AML
acut myeloid leukaemia
bp
bázispár
CD14
cluster differentiation protein 14
CD45
cluster differentiation protein 15
cGvHD
chronic graft versus host disease
CVS
chorionboholy-mintavétel (chorionic villus sampling)
DNS
dezoxiribonukleinsav
dNTP
dezoxiribonukleotid-triphosphate
EDTA
ethylenediaminetetraacetic acid
EUG
extrauterine gravidity
FAM
carboxyfluorescein
FISH
fluorescent in situ hybridizáció
GAC
genetikai amniocentesis
GE
genome equivalens
hCG
humán chorion gonadotropin
HELLP
hypertension elevated liver enzimes low platlet
HLA
humán leukocyta antigén
IUGR
intrauterine growth restriction
IUP
intrauterine pregnancy
LOH
loss of heterozigosity
MDS
myelodysplasias syndróma
NIMAs
non inherited maternal antigens
NSCLC
non smal cell lug cancer
NT
nuchal translucency
PBC
primaer billiaris cirrhosis
PCR
polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)
PUBS
magzati köldökzsinórvér-mintavétel (percutaneous umbilical blood sampling)
QF-PCR
quantitatív fluoreszcens polimeráz láncreakció
Rh vércsoport
Rhesus-vércsoport
rpm
percenkénti fordulatszám 60
VIII. RÖVIDÍTÉSEK SCLC
small cell lug cancer
SD
standard deviáció
SLE
systemás lupus erythematosus
SRY
sex-determining region of the Y chromosome
SSc
systémás sclerosis
TAMRA
N,N,N,N-tetrametyl-6-carboxyrhodamine
TUNEL
terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling
U
egység (unit)
61
IX. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
9. Köszönetnyilvánítás Munkámat teljes egészében a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján végeztem 2001-2007 között. Hálás köszönetemet fejezem ki Dr. Papp Zoltán professzor úrnak, a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika igazgatójának, program- és témavezetőmnek, aki mind klinikai, mind tudományos munkámat maximálisan támogatta és segítette. Köszönöm Dr. Nagy Bálint tudományos főmunkatárs úrnak, és Dr. Bán Zoltán egyetemi tanársegéd úrnak hogy a molekuláris genetikai módszerekbe bevezettek és munkámat barátilag, önzetlenül segítettek. Köszönöm a genetikai tanácsadás dolgozóinak, elsősorban Dr. Papp Csaba egyetemi docens úrnak, Dr. Tóth-Pál Ernő egyetemi docens úrnak és Dr. Beke Artúr egyetemi adjunktus úrnak a klinikai genetikai tevékenység során nyújtott segítséget és baráti támogatást. Köszönöm Dr. Semberyné Hertelendy Katalin valamint a klinikai laboratórium munkatársainak a vérvételek során nyújtott segítséget. Köszönöm a klinika neonatális intenzív centrum dolgozóinak, elsősorban Dr. Harmath Ágnes egyetemi adjunktusnak és Dr. Hajdú Júlia valamint Dr. Görbe Éva docens asszonyoknak az újszülöttek vizsgálata során nyújtott segítséget. Köszönöm Dr. Csapó Zsolt egyetemi docens és Dr. Szirmai Katalin főorvos asszonynak, valamint a szövettani labor munkatársainak, a méhenkívüli terhesség vizsgálata során nyújtott segítséget. Köszönet illeti a Genetikai Laboratórium minden jelenlegi és volt munkatársát, elsősorban Oroszné Nagy Judit vezető asszisztenst, Tóth Anikó, Gnotek Edit és Kamasz Jánosné asszisztenseket, akik odaadóan segítettek és támogattak munkám során. Végül köszönöm a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika valamennyi dolgozójának az elmúlt hat évben nyújtott segítségét.
62
X. IRODALOMJEGYZÉK
10. Irodalomjegyzék 1.
Alfirevic Z, Sundberg K, Brigham S. Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis. Cochrane Database Syst Rev 2003; 3: CD003252.
2.
Angert RM, LeShane ES, Lo YM, Chan LY, Delli-Bovi LC, Bianchi DW. Fetal cell-free plasma DNA concentrations in maternal blood are stable 24 hours after collection: analysis of first- and third-trimester samples. Clin Chem 2003; 49: 195– 198.
3.
Angert RM, Leshane ES, Yarnell RW, Johnson KL, Bianchi DW. Cell-free fetal DNA in the cerebrospinal fluid of peripartum women. Am J Obstet Gynecol 2004; 4: 1087-1090.
4.
Anker P, Lefort F, Vasyoukhin V, Lyautey J, Lederrey C, Chen Xq, Stroun M, Mulcahy HE, Farthing MJG. K-ras gene mutations in the plasma of colorectal cancer patients. Gastroenterology 1997; 112: 1114–1120.
5.
Aractingi S, Berkane N, Bertheau P, Le Goue C, Dausset J, Uzan S, Carosella ED. Fetal DNA in skin of polymorphic eruptions of pregnancy. Lancet 1999; 52: 1898– 1901.
6.
Artlett CM, Smith B, Jimenez SA. Identification of fetal DNA and cells in skin lesions from women with systemic sclerosis. N Engl J Med 1998; 338: 1186-1191.
7.
Beke A, Papp C, Tóth-Pál E, Mezei G, Oroszné Nagy J, Joó JG, Csaba Á, Papp Z. Cytogenetic exploration of fetal ultrasound anomalies. Orv Hetil 2004; 145: 21232133.
8.
Bianchi DW, LeShane ES, Cowan JM. Large amounts of cell-free fetal DNA are present in amniotic fluid. Clin Chem 2001; 47: 1867–1869.
9.
Bianchi DW, Williams JM, Sullivan LM, Hanson FW, Klinger KW, Shuber AP. PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Am J Hum Genet 1997; 61: 822–829.
10. Bianchi DW. Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis. Br J Haematol 1999; 105: 574–583. 11. Bianci DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci 1996; 93: 705-708.
63
X. IRODALOMJEGYZÉK 12. Botezatu, O. Serdyuk, G. Potapova, V. Shelepov, R. Alechina, Y. Molyaka et al., Genetic analysis of DNA extracted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism. Clin Chem 2000; 46: 1078–1084. 13. Bowman JM. The prevention of Rh immunization. Transfus Med Rev 1988; 2: 129-150. 14. Bruyère H, Rupps R, Kuchinka BD, Friedman JM, Robinson WP. Recurrent trisomy 21 in a couple with a child presenting trisomy 21 mosaicism and maternal uniparental disomy for chromosome 21 in the euploid cell line. Am J Med Genet 2000; 94: 35-41. 15. Bullock R, Martin WL, Coomarasamy A, Kilby MD. Prediction of fetal anemia in pregnancies with red-cell alloimmunization: comparison of middle cerebral artery peak systolic velocity and amniotic fluid OD450. Ultras Obstet Gynecol 2005; 25: 331-334. 16. Buscaglia M, Ghisoni L, Bellotti M, Ferrazzi E, Levi-Setti P, Marconi AM, Taglioretti A, Zamperini P, Pardi G. Percutaneous umbilical blood sampling: indication changes and procedure loss rate in a nine years' experience. Fetal Diagn Ther 1996; 11: 106-113. 17. Caramelli E, Rizzo N, Concu M, Simonazzi G, Carinci P, Bondavalli C, Bovicelli L, Farina A. Cell-free fetal DNA concentration in plasma of patients with abnormal uterine artery Doppler waveform and intrauterine growth restriction--a pilot study. Prenat Diagn 2003; 5: 367-371. 18. Chan KCA, Ding C, Gerovassili A, Yeung SW, Chiu WK, T. Leung N, Lau TK, Chim SC, G. Chung TY, Nicolaides KH, Lo YM. Hypermethylated RASSF1A in Maternal Plasma: A Universal Fetal DNA Marker that Improves the Reliability of Noninvasive Prenatal Diagnosis. Clin Chem 2006; 12: 2211-2218. 19. Chan LY, Leung TN, Chan KC, Tai HL, Lau TK, Wong EM, Lo YM. Serial analysis of fetal DNA concentrations in maternal plasma in late pregnancy. Clin Chem 2003; 49: 678–680. 20. Chen X, Stroun M, Magnenat JL, Nicod LP, Kurt AM, Lyautey J, Lederrey C, Anker P: Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nature Med 1996; 2: 1033–1035.
64
X. IRODALOMJEGYZÉK 21. Christner PJ, Artlett CM, Conway RF, Jimenez SA. Increased numbers of microchimeric cells of fetal origin are associated with dermal fibrosis in mice following injection of vinyl chloride. Arthritis Rheum 2000; 43: 2598–2605. 22. Cioni R, Bussani C, Scarselli B, Mello G, Mecacci F, Scarselli G. Detection of fetal DNA in the peritoneal cavity during pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2003; 107: 210–211. 23. Corpechot C, Barbu V, Chazouilleres O, Poupon R. Fetal microchimerism in primary biliary cirrhosis. J Hepatol 2000; 33: 696–700. 24. Daniel Y, Geva E, Lerner-Geva L, Eshed-Englender T, Gamzu R, Lessing JB et al. Levels of vascular endothelial growth factor are elevated in patients with ectopic pregnancy: is this a novel marker? Fertil Steril 1999; 72; 1013–1017. 25. Daponte A, Pournaras S, Zintzaras E, Kallitsaris A, Lialios G, Maniatis AN, Messinis IE. The value of a single combined measurement of VEGF, glycodelin, progesterone, PAPP-A, HPL and LIF for differentiating between ectopic and abnormal intrauterine pregnancy. Hum Reprod 2005; 20; 3163-3166. 26. Dart R, Ramanujam P, Dart L. Progesterone as a predictor of ectopic pregnancy when the ultrasound is indeterminate. Am J Emerg Med 2002; 20: 575-579. 27. de Kok JB, van Solinge WW, Ruers TJ, Roelofs RW, van Muijen GN,Willems JL, SwinkelsDW: Detection of tumour DNA in serum of colorectal cancer patients. Scand J Clin Lab Invest 1997; 57: 601–604. 28. De Moor G, De Bock G, Noens L, De Bie S. A new case of human chimerism detected after pregnancy: 46,XY karyotype in the lymphocytes of a woman. Acta Clin Belg 1988; 43: 231–235. 29. Desai RG, Cregel WP. Maternofetal passage of leukocytes and platelets in man. Blood 1963; 21: 665-669. 30. Douglas GWL, Thomas M, Carr NM, Cullen N, Morris R. Trophoblast in the circulating blood during pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1959; 78: 960-973. 31. Dugoff L, Hobbins JC. Invasive procedures to evaluate the fetus. Clin Obstet Gynecol 2002; 45: 1039-1053. 32. Emlen W, Mannik M. Effect of DNA size and strandedness on the in vivo clearance and organ localization of DNA. Clin Exp Immunol 1984; 56: 185-192. 33. Faas BH, Beuling EA, Christiaens GC, von dem Borne AE, van der Schoot CE. Detection of fetal RhD specific sequences in maternal plasma, Lancet 1998; 352: 1196. 65
X. IRODALOMJEGYZÉK 34. Findlay I, Quirke P, Hall J, Rutherford A. Fluorescent PCR: a new technique for PGD of sex and single-gene defects. J Assist Reprod Genet 1996; 13: 96-103. 35. Finning K, Martin P, Daniels G. A clinical service in the UK to predict fetal Rh (Rh) D blood group using free fetal DNA in maternal plasma. Ann NY Acad Sci 2004; 1022: 119–123. 36. Finning KM, Martin PG, Soothill PW, Avent ND. Prediction of fetal D status from maternal plasma: introduction of a new noninvasive fetal RHD genotyping service. Transfusion 2002; 42: 1079-1085. 37. Fournié GJ, Courtin JP, Laval F. Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigation in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumor. Cancer Let 1995; 2: 221-227. 38. Fournie GJ, Lambert PH, Meischer PA. Release of DNA in circulating blood and induction of anti-DNA antibodies after injection of bacterial lipopolysaccharides. J Exp Med 1974; 5:1189-1206. 39. Fournié GJ, Martres F, Pourrat JP, Alary C, Rumeau M. Plasma DNA as cell death marker in elderly patients. Gerontology 1993; 39: 215–221. 40. Frickhofen N, Muller E, Sandherr M, Binder T, Bangerter M, Wiest C, Enz M, Heimper H: Rearranged IG heavy chain DNAis detectable in cell free blood samples of patients with B-cell neoplasia. Blood 1997; 90: 4953–4960. 41. Gautier E, Benachi A, Giovangrandi Y, Ernault P, Olivi M, Gaillon, Costa JM. T Fetal RhD genotyping by maternal serum analysis: a two-year experience. Am J Obstet Gynecol 2005; 192: 666–669. 42. Genest DR, Roberts D, Boyd T, Bieber FR. Fetoplacental histology as a predictor of karyotype: a controlled study of spontaneous first trimester abortions. Hum Pathol 1995; 26: 201-209. 43. Gerovassili A, Garner C, Nicolaides KH, Thein SL, Rees DC. Free fetal DNA in maternal
circulation:
a
potential
prognostic
marker
for
chromosomal
abnormalities? Prenat Diagn 2006.(közlésre elfogadva). 44. Goessl C, Heicappel R, Munker R, Anker P, Stroun M, Krause H, Muller M, Miller K: Microsatellite analysis of plasma DNA from patients with clear cell renal carcinoma. Cancer Res 1988; 58: 4728–4732. 45. Guibert J, Benachi A, Grebille AG, Ernault P, Zorn JR, Costa JM. Kinetics of SRY gene appearance in maternal serum: detection by real time PCR in early
66
X. IRODALOMJEGYZÉK pregnancy after assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003; 18: 17331736. 46. Hall JM, Lingenfelter P, Adams SL, Lasser D, Hansen JA, Bean MA. Detection of maternal cells in human umbilical cord blood using fluorescent in situ hybridization. Blood 1995; 86: 2829-2832. 47. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RML. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature1990; 344: 768-770. 48. Heckerling PS, Verp MS. Amniocentesis or chorionic villus sampling for prenatal genetic testing: a decision analysis. J Clin Epidemiol 1991; 44: 657-670. 49. Herzenberg LA, Bianchi DW, Schroder J, Cann HM, Iverson GM. Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fuorescence-activated cell sorting. Proc Natl Acad Sci 1979; 76: 1453-1455. 50. Hibi K, Robinson CR, Booker S, Wu L, Hamilton SR, Sidransky D, Jen J: Molecular detection of genetic alterations in the serum of colorectal cancer patients. Cancer Res 1998; 58: 1405–1407. 51. Holzgreve W, Garritsen HS, Ganshirt-Ahlert D. Fetal cells in the maternal circulation. J Reprod Med 1992; 37: 410-418. 52. Honda H, Miharu N, Ohashi Y, Samura O, Kinutani M, Hara T, Ohama K. Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum. Hum Genet 2002; 110: 75–79. 53. Hristoskova S, Holzgreve W, Hahn S. More than one-half of the erythroblasts in the fetal circulation and cord blood are TUNEL positive. Clin Chem 2001; 47: 1870–1871. 54. Hromadnikova I, Houbova B, Hridelova D, Voslarova S, Calda P, Nekolarova K, Kofer J, Stejskal D, Doucha J, Cinek O, Vavrirec J. Quantitative analysis of DNA levels in maternal plasma in normal and Down syndrome pregnancies. BMC Pregnancy Childbirth 2002; 2: 4. 55. Ichinohe T, Teshima T, Matsuoka K, Maruya E, Saji H. Fetal-maternal microchimerism: impact on hematopoietic stem cell transplantation. Curr Opin Immunol 2005; 5: 546-552. 56. Jauniaux E, Hustin J. Chromosomally abnormal early ongoing pregnancies: correlation of ultrasound and placental histological findings. Hum Pathol 1998; 29: 1195-1199. 67
X. IRODALOMJEGYZÉK 57. Kazy Z, Rozovsky IS, Bacharev VA. Chorion biopsy in early pregnancy: A method of early prenatal diagnosis for inherited disorders. Prenat Diagn 1982; 2: 39-41. 58. Klintschar M, Immel UD, Kehlen A, Schwaiger P, Mustafa T, Mannweiler S, Regauer S, Kleiber M, Hoang-Vu C. Fetal microchimerism in Hashimoto's thyroiditis: a quantitative approach. Eur J Endocrinol 2006; 154: 237-241. 59. Koffler D, Angello V, Winchester R, Kunkel HG: The occurence of single-standed DNA in the serum of patents with systemic lupus erythematosus and other disseases. J Clin Invest 1973; 52: 198-204. 60. Kopreski MS, Benko FA, Kwee C, Leitzel K, Eskander E, Lipton A, Gocke CD. Detection of mutant K-ras DNA in plasma or serum of patients with colorectal cancer. Br J Cancer 1997; 76: 1293–1299. 61. Lambert N, Nelson JL. Microchimerism in autoimmune disease: more questions than answers? Autoimmun Rev 2003; 3: 133-139. 62. Lambert N, Erickson TD, Yan Z, Pang JM, Guthrie KA, Furst DE, Nelson JL. Quantification of maternal microchimerism by HLA-specific real-time polymerase chain reaction: studies of healthy women and women with scleroderma. Arthritis Rheum 2004; 3: 906-914. 63. Lau TK, Lo KW, Chan LY, Leung T, Lo YM. Cell-free fetal deoxyribonucleic acid in maternal circulation as a marker of fetal–maternal hemorrhage in patients undergoing external cephalic version near term. Am J Obstet Gynecol 2000; 183: 712–716. 64. Lau TW, Leung T, Chan LY, Lau TK, Chan KC, Tam WH, Lo YM. Fetal DNA clearance from maternal plasma is impaired in preeclampsia. Clin Chem 2002; 12: 2141-2146.
65. Lázár L, Bán Z, Szakács O, Nagy B, Beke A, Oroszné NJ, Rigó J Jr, Papp Z. Szabad magzati DNS kimutatása a magzati Y-kromoszóma igazolásával anyai vérplazmából. Orv Hetil 2003; 49: 2405-2409. 66. Lázár L, Harmath Á, Bán Z, Nagy B, Papp C, Rigó J Jr, Papp Z. Detection of maternal deoxyribonucleic acid in peripheral blood of premature and mature newborn infants. Prenat Diagn 2006; 2: 168-170. 67. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Presence of cell-free fetal DNA in plasma of women with ectopic pregnancies. Clin Chem 2006; 8: 1599-601.
68
X. IRODALOMJEGYZÉK 68. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Non-invazív magzati Rh meghatározás real-time PCR-módszerrel. Orv Hetil 2007. (közlésre elfogadva) 69. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Anyai eredetű DNS kimutatása koraés érett újszülöttek perifériás keringésében. Magyar Nőorvosok Lapja 2007. (közlésre elfogadva) 70. Lee T, LeShane ES, Messerlian GM, Canick JA, Farina A, Heber WW, Bianchi DW. Down syndrome and cell-free fetal DNA in archived maternal serum. Am J Obstet Gynecol 2002; 187: 1217-1221. 71. Leon SA, Green A, Yaros MJ, Shapiro B. Radioimmunoassay for nanogram quantities of DNA. J Immuno Methods 1975; 9: 157-164. 72. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977; 37: 646-650. 73. Leung TN, Zhang J, Lau TK, Chan LY, Lo YM. Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21. Clin Chem 1999; 45: 1747-1751. 74. Leung TN, Zhang J, Lau TK, Chan LY, Lo YM. Increased maternal plasma fetal DNA concentrations in women who eventually develop preeclampsia. Clin Chem 2001; 47: 137–139. 75. Leung TN, Zhang J, Lau TK, Hjelm NM, Lo YM. Maternal plasma fetal DNA as a marker for preterm labour. Lancet 1998; 352: 1904–1905. 76. Levine RJ, Qian C, Leshane ES, Yu KF, England LJ, Schisterman EF, Wataganara T, Romero R, Bianchi DW. Two-stage elevation of cell-free fetal DNA in maternal sera before onset of preeclampsia. Am J Obstet Gynecol 2004; 190: 707-713. 77. Li Y, Di Naro E, Vitucci A, Zimmermann B, Holzgreve W, Hahn S. Detection of paternally inherited fetal point mutations for beta-thalassemia. JAMA 2005; 7: 849849. 78. Li Y, Holzgreve W, DI Naro E, Vitucci A, Hahn S. Cell-free DNA in maternal plasma: is it all a question of size? Ann N Y Acad Sci 2006; 1075: 81-87. 79. Li Y, Zimmermann B, Rusterholz C, Kang A, Holzgreve W, Hahn S. Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms. Clin Chem 2004; 6: 1002-1011. 80. Li ZJ, Steinman CR: Plasma DNA in systemic lupus erythematosus: Characterization of cloned base sequences. Arthritis Rheum 1989; 32: 726-733.
69
X. IRODALOMJEGYZÉK 81. Lo YM, Bowell PJ, Selinger M, Mackenzie IZ, Chamberlain P, Gillmer MD, Elliott P, Pratt G, Littlewood TJ, Fleming KA. Prenatal determination of fetal rhesus D status by DNA amplification of peripheral blood of rhesus-negative mothers. Ann NY Acad Sci 1994; 731: 229-233. 82. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350: 485– 487. 83. Lo YM, Lau TK, Chan LYS, Leung TN, Chang AMZ. Quantitative analysis of the bidirectional fetomaternal transfer of nucleated cells and plasma DNA. Clin Chem 2000; 46: 1301-1309. 84. Lo YM, Lau TK, Zhang J, Leung TN, Chang AM, Hjelm NM, Elmes RS, Bianchi DW. Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21. Clin Chem 1999; 45: 1747–1751. 85. Lo YM, Leung TN, Tein MS, Sargent IL, Zhang J, Lau TK, Haines CJ, Redman CW. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia. Clin Chem 1999; 45: 184-188. 86. Lo YM, Lo ES, Watson N, Noakes L, Sargent IL, Thilaganathan B, Wainscoat JS. Two-way traffic between mother and fetus: biologic and clinical implications. Blood 1996; 11: 4390-4395. 87. Lo YM, Tein MS, Lau TK, Haines CJ, Leung TN, Poon PM, Wainscoat JS, Johnson PJ, Chang AM, Hjelm NM. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet 1998; 62: 768–775. 88. Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM, Hjelm NM. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999; 64: 218–224. 89. Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AMZ, Hjelm NM. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Obstet Gynecol 1994; 170: 1188-1193. 90. Lo YM. Fetal DNA in maternal plasma: progress through epigenetics. Ann N Y Acad Sci 2006; 1075: 74-80. 91. Los FJ, van Den Berg C, Wildschut HI, Brandenburg H, den Hollander NS, Schoonderwaldt EM, Pijpers L, Jan H, Galjaard R, Van Opstal D. The diagnostic performance of cytogenetic investigation in amniotic fluid cells and chorionic villi. Prenat Diagn 2001; 21: 1150-1158.
70
X. IRODALOMJEGYZÉK 92. Loubiere LS, Lambert NC, Flinn LJ, Erickson TD, Yan Z, Guthrie KA, Vickers KT, Nelson JL. Maternal microchimerism in healthy adults in lymphocytes, monocyte/macrophages and NK cells. Lab Invest. 2006; 11: 1185-1192. 93. Lussier G, Chagnon A, Pavilanis V. Study of the karyotype of a fetal human cell strain. Rev Can Biol 1966; 25: 57-61. 94. Maloney S, Smith A, Furst DE, Myerson D, Rupert K, Evans PC, Nelson JL. Microchimerism of maternal origin persists into adult life. J Clin Invest 1999; 1: 41-47. 95. Mari G, Deter RL, Carpenter RL, Rahman F, Zimmerman R, Moise KJ Jr, Dorman KF, Ludomirsky A, Gonzalez R, Gomez R, Oz U, Detti L, Copel JA, BahadoSingh R, Berry S, Martinez-Poyer J, Blackwell SC. Noninvasive diagnosis by Doppler
ultrasonography
of
fetal
anemia
due
to
maternal
red-cell
alloimmunization. Collaborative Group for Doppler Assessment of the Blood Velocity in Anemic Fetuses. N Engl J Med 2000; 342: 9-14. 96. Mayall F, Jacobson G, Wilkins R, Chang B: Mutations of p53 gene can be detected in the plasm of patients with large bowel carcinoma. J Clin Pathol 1998; 51: 611–613. 97. McMilin KD, Johnson RL. HLA homozygosity and the risk of related-donor transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfus Med Rev 1993; 7: 37– 41. 98. Mendel P, Métais P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’Homme. CR Acad Sci Paris 1948; 142: 241-243. 99. Monni G, Zoppi MA, Ibba RM. Absence of nasal bone and detection of trisomy 21. Lancet 2002; 359: 1343. 100. Mulcahy H, Anker P, Lyautey J, Chen Xq, Lederrey C, Farthing M, Stroun M: Kras gene mutations in the plasma of pancreatic patients. Clin Cancer Res 1998; 4: 271–275. 101. Nadler HL, Gerbie AB. Role of amniocentesis in the intrauterine detection of genetic disorders. N Engl J Med 1970; 282: 596-599. 102. Nagy B, Tarja L, Ban Z, Andrasofszky Z, Papp G, Lazar L, Nekam K, Papp Z, Rethy LA. Molekuláris genetikai vizsgálatokra alkalmas ,,szabad'' DNS izolálása archivált vérsavómintákból. Orv Hetil 2004; 47: 2375-2378. 103. Nawroz H, Koch W, Anker P, Stroun M, Sidransky D. Microsatellite alterations in plasma DNA of head and neck cancer patients. Nature Med 1996; 2: 1035–1037. 71
X. IRODALOMJEGYZÉK 104. Nelson JL, Furst DE, Maloney S, Gooley T, Evans PC, Smith A, Bean MA, Ober C, Bianchi DW. Microchimerism and HLA-compatible relationships of pregnancy in SSc. Lancet 1998; 351: 559–562. 105. Nelson JL. Maternal-fetal immunology and autoimmune disease. Is some autoimmune disease auto-alloimmune or allo-autoimmune? Arthritis Rheum 1996; 39: 191–194. 106. Nelson JL. Microchimerism and autoimmune disease. N Engl J Med 1998; 338: 1224–1225. 107. Niazi M, Coleman DV, Loeffler FE. Trophoblast sampling in early pregnancy. Culture of rapidly dividing cells from immature placental villi. Br J Obstet Gynaecol 1981; 88: 1081-1085. 108. Nicolaides KH, Rodeck CH. Maternal serum anti-D antibody concentration and assessment of rhesus isoimmunisation. BMJ 1992; 304: 1155-1156. 109. Nowacek GE, Meyer WR, McMahon MJ, Thorp JR, Wells SR. Diagnostic value of cervical fetal fibronectin in detecting extrauterine pregnancy. Fertil Steril 1999; 72: 302-304. 110. Ohashi Y, Miharu N, Honda H, Samura O, Ohama K. Correlation of fetal DNA and human chorionic gonadotropin concentrations in second-trimester maternal serum. Clin Chem 2002; 48: 386–388. 111. Ohashi Y, Miharu N, Honda H, Samura O, Ohama K. Quantitation of fetal DNA in maternal serum in normal and aneuploid pregnancies. Hum Genet 2001; 108: 123127. 112. Orozco AF, Bishoff FZ, Horne C, Popek E, Simpson JL, Lewis DE. HypoxiaInduced Membrane-Bound Apoptotic DNA Particles: Potential Mechanism of Fetal DNA in Maternal Plasma. Ann NY Acad Sci 2006; 1075: 57 - 62. 113. Papp C, Papp Z. Chorionic villus sampling and amniocentesis: what are the risks in current practice? Curr Opin Obstet Gynecol 2003; 15: 159-165. 114. Papp C. Chorionic villus sampling. Ultrasound Rev Obstet Gynecol 2003; 3: 279284. 115. Papp Z, Gardó S, Herpay G, Árvai A. Prenatal sex determination by amniocentesis. Obstet Gynecol 1970; 36: 429-431. 116. Papp Z, Gardó S, Herpay G, Méhes K. G-G translocatio méhen belüli kimutatása. Orv Hetil 1972; 113: 68-70.
72
X. IRODALOMJEGYZÉK 117. Pattison NS, Roberts AB, Mantell N.: Intrauterine fetal transfusion. Ultrasound Obstet Gynecol 1992; 2: 329-332. 118. Poutamo J, Keski-Nisula L, Kuopio T, Heinonen S. Amniocentesis-a routine procedure, but invasive. Prenat Diagn 2003; 23: 767-769. 119. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science 2005; 308: 1592-1594. 120. Robinson WP, McFadden DE, Barrett IJ, Kuchinka B, Penaherrera MS, Bruyere H, Best RG, Pedreira DA, Langlois S, Kalousek DK. Origin of amnion and implications for evaluation of the fetal genotype in cases of mosaicism. Prenat Diagn 2002; 22: 1076-1085. 121. Rogers JC, Kerstiens JW. Capping of DNA on phytohemagglutinin-stimulated human lymphoblasts. J Immunol 1981; 2: 703-705. 122. Rouillac-LeSciellour C, Puillandre P, Gillot R, Baulard C, Métral S, LeVan Kim C. Large-scale prediagnosis study of fetal RhD genotyping by PCR on plasma DNA from RhD-negative pregnant women. Mol Diagn 2004; 8: 23–31. 123. Rouquette-Gally AM, Boyeldieu D, Gluckman E, Abuaf N, Combrisson A. Autoimmunity in 28 patients after allogeneic bone marrow transplantation: comparison with Sjögren syndrome and scleroderma. Br J Haematol 1987; 66: 45– 47. 124. Runore M, Steinman CR: Endogenous circulating DNA in systemic lupus erythematosus, occurencce as multimeric complexes bound to histone. J Clin Invest 1990; 86: 69-74. 125. Sanchez-Cespedes M, Rosell M, Sidransky D, Baylin SB, Herman JG. Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumour suppressor genes in serum DNA from non-smell cell lung cancer patients. Cancer Res 1999; 59: 67–70. 126. Sanchez-Cespedes M, Monzo M, Rosell R, Pifarr´e A, Calvo R, Lopez-Cabrerizo MP, Astudillo J. Detection of chromosome 3p alterations in serum DNA of nonsmall-cell lung cancer patients. Ann Oncol 1998; 9: 113–116. 127. Sawaya HH, Jimenez SA, Artlett CM. Quantification of fetal microchimeric cells in clinically affected and unaffected skin of patients with systemic sclerosis. Rheumatology 2004; 8: 965-968. 128. Sayegh MH, Carpenter CB. Role of indirect allorecognition in allograft rejection. Intern Rev Immunol 1996; 6: 221–229.
73
X. IRODALOMJEGYZÉK 129. Schmorl G. Pathologisch-anatomische Untersuchungen ueber Pubereklampsie. 1893, Vogel, Leipzig. 130. Sekizawa A, Jimbo M, Saito H, Iwasaki M, Matsuoka R, Okai T, Farina A. Cellfree fetal DNA in the plasma of pregnant women with severe fetal growth restriction. Am J Obstet Gynecol 2003; 2: 480-484. 131. Sekizawa A, Jimbo M, Saito H, Iwasaki M, Sugito Y, Yukimoto Y, Otsuka J, Okai T. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta. Clin Chem 2002; 48: 353–354. 132. Sekizawa A, Samura O, Zhen DK, Falco V, Farina A, Bianchi DW. Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood. Prenat Diagn 2000; 20: 886–889. 133. Sekizawa A, Sugito Y, Iwasaki M, Watanabe A, Jimbo M, Hoshi S. Cell-free fetal DNA is increased in plasma of women with hyperemesis gravidarum. Clin Chem 2001; 40: 2164–2165. 134. Sekizawa A, Yokokawa K, Sugito Y, Iwasaki M, Yukimoto Y, Ichizuka K. Evaluation of bidirectional transfer of plasma DNA through placenta. Hum Genet 2003; 113: 307–310. 135. Sermon K, DeRijcke M, Lissens W, DeVos A, Platteau P, Bonduelle M. Preimplantation genetic diagnosis for Huntington’s disease with exclusion testing. Eur J Hum Genet 2002; 10: 591–598. 136. Shimada K, Murakami K, Shozu M, Segawa T, Sumitani H, Inoue M. Sexdetermining region Y levels in maternal plasma: evaluation in abnormal pregnancy. J Obstet Gynaecol Res 2004; 30: 148–154. 137. Sibai B, Dekker G, Kupferminc M. Pre-eclampsia. Lancet 2005; 365: 785-799. 138. Silva JM, Gonzalez R, Dominguez G, Garcia JM, Espana P, Bonilla F. TP53 gene mutations in plasma DNA of cancer patients. Genes Chromosomes Cancer 1999; 24: 160–161. 139. Simoni G, Brambati B, Danesino C, Terzoli GL, Romitti L, Rossella F, Fraccaro M. Diagnostic application of first trimester trophoblast sampling in 100 pregnancies. Hum Genet 1984; 66: 252-259. 140. Slunga-Tallberg A, el Rifai W, Keinanen M, Ylinen K, Kurki T, Klinger K, Ylikorkala O, Knuutila S. Maternal origin of nucleated erythrocytes in peripheral venous blood of pregnant women. Hum. Genet 1995; 96: 53-57.
74
X. IRODALOMJEGYZÉK 141. Slunga-Tallberg A, el Rifai W, Keinanen M, Ylinen K, Kurki T, Klinger K, Ylikorkala O, Larramendy ML, Knuutila S. Maternal origin of transferrin receptor positive cells in venous blood of pregnant women. Clin Genet 1996; 49: 196-199. 142. Smid M, Galbiati S, Vassallo A, Gambini D, Ferrari A, Restagno G, Viora E, Pagliano M, Calza S, Ferrari M, Cremonesi L. Fetal DNA in maternal plasma in twin pregnancies. Clin Chem 2003; 49: 1526–1528. 143. Smid M, Vassallo A, Lagona F, Valsecchi L, Maniscalco L, Danti L, Lojacono A, Ferrari A, Ferrari M, Cremonesi L. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma in pathological conditions associated with placental abnormalities. Ann N Y Acad Sci 2001; 945: 132-137. 144. Socie G, Gluckman E, Carosella E, Brossard Y, Lafon C, Brison O. Search for maternal cells in human umbilical cord blood by polymerase chain reaction amplification of two minisatellite sequences. Blood 1994, 83: 340-344. 145. Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, Yao SL. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood. Cancer Epid Biomarkers Prevention 1994; 3: 67–71. 146. Spencer K, de Kok JB, Swinkels DW. Increased total cell-free DNA in the serum of pregnant women carrying a fetus affected by trisomy 21. Prenat Diagn 2003; 23: 580-583. 147. Steele MW, Breg WR. Chromosome analysis of human amniotic fluid cells. Lancet 1966; 1: 383. 148. Steinman CR. Free DNA in serum and plasma from normal adults. J Clin Invest 1975; 56: 512-515. 149. Stene J, Stene E, Mikkelsen M. Risk for chromosome abnormality at amniocentesis following a child with a non-inherited chromosome aberration. Prenat Diagn 1984; 4: 81. 150. Stevens AM, Hermes HM, Rutledge JC, Buyon JP, Nelson JL. Myocardial-tissuespecific phenotype of maternal microchimerism in neonatal lupus congenital heart block. Lancet 2003; 362: 1617-1623. 151. Stevens AM, Tsao BP, Hahn BH, Guthrie K, Lambert NC, Porter AJ, Tylee TS, Nelson JL. Maternal HLA class II compatibility in men with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 2005; 9: 2768-2773. 152. Suzuki K, Narita T, Yui R, Asakura H, Fujiwara M. Mechanism of the induction of autoimmune disease by graft-versus-host reaction. Role of CD8+ cells in the 75
X. IRODALOMJEGYZÉK development of hepatic and ductal lesions induced by CD4+ cells in MHC class I plus II different host. Lab Invest 1994; 70: 609–619. 153. Swinkels DW, de Kok JB, Hendriks JC, Wiegerinck E, Zusterzeel PL, Steegers EA. Hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelet count (HELLP) syndrome as a complication of preeclampsia in pregnant women increases the amount of cell-free fetal and maternal DNA in maternal plasma and serum. Clin Chem 2002; 4: 650-653. 154. Tan EM, Schur PH, Carr RI, Kunkel HG. Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest 1966; 45: 1732-1740. 155. Tanaka A, Lindor K, Gish R, Batts K, Shiratori Y, Omata M, Nelson JL, Ansari A, Coppel R, Newsome M, Gershwin ME. Fetal microchimerism alone does not contribute to the induction of primary biliary cirrhosis. Hepatol 1999; 30: 833– 838. 156. Teshima T, Matsuoka K, Ichinohe T. Impact of fetal-maternal tolerance in hematopoietic stem cell transplantation. Arch Immunol Ther Exp 2006; 3: 165-172. 157. Tjoa ML, Cindrova-Davies T, Spasic-Boskovic O, Bianchi DW, Burton GJ. Trophoblastic oxidative stress and the release of cell-free feto-placental DNA. Am J Pathol 2006; 2: 400-404. 158. Tong YK, Ding C, Chiu RW, Gerovassili A, Chim SS, Leung TY, Leung TN, Lau TK, Nicolaides KH, Lo YM. Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma: theoretical and empirical considerations. Clin Chem 2006; 12: 2194-2202. 159. Tsumita T, Iwanaga M. Fate of injected deoxyribonucleic acid in mice. Nature 1963; 198: 1088-1089. 160. Van der Schoot CE, Ait Soussan A, Dee R, Bonsel GJ, de Haas M. Screening for foetal RhD-genotype by plasma PCR in all D-negative pregnant women is feasible. Vox Sang 2004; 87: 9. 161. Van Leeuwen L, Jacoby H, Charles D. Exfoliative cytology of amniotic fluid. Acta Cytol 1965; 9: 442-445. 162. Van Wijk IJ, de Hoon AC, Jurhawan R, Tjoa ML, Griffioen S, Mulders MA, van Vugt JM, Oudejans CB. Detection of apoptotic fetal cells in plasma of pregnant women. Clin Chem 2000; 46: 729–731.
76
X. IRODALOMJEGYZÉK 163. Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, Stroun M. Point mutations of the N-ras in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. Brit J Haemat 1994; 86: 774–779. 164. Warburton D. De novo balanced chromosome rearrangements and extra marker chromosomes identified at prenatal diagnosis: clinical significance and distribution of breakpoints. Am J Hum Genet 1991; 49: 995-1013. 165. Wataganara T, Chen AY, LeShane ES, Sullivan LM, Borgatta L, Bianchi DW, Johnson KL. Cell-free fetal DNA levels in maternal plasma after elective first trimester termination of pregnancy. Fertil Steril 2004; 3: 638-644. 166. Wataganara T, LeShane ES, Farina A, Messerlian GM, Lee T, Canick JA, Bianchi DW. Maternal serum cell-free fetal DNA levels are increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18. Hum Genet 2003; 112: 204–208. 167. Wataganara T, Metzenbauer M, Peter I, Johnson KL, Bianchi DW. Placental volume, as measured by 3-dimensional sonography and levels of maternal plasma cell-free fetal DNA. Am J Obstet Gynecol 2005; 93: 496-500. 168. Wataganara T, Peter I, Messerlian GM, Borgatta L, Bianchi DW. Inverse correlation between maternal weight and second trimester circulating cell-free fetal DNA levels. Obstet Gynecol 2004; 3: 545-550. 169. Wegner NT, Mershon JL. Evaluation of leukemia inhibitory factor as a marker of ectopic pregnancy. Am J Obstet Gynecol 2001; 184; 1074–1076. 170. Werlin L, Rodi I, DeCherney A, Marello E, Hill D, Munne S. Preimplantation genetic diagnosis as both a therapeutic and diagnostic tool in assisted reproductive technology, Fertil Steril 2003; 80: 467–468. 171. Wong IH, Lo YM, Zhang J, Liew CT, Ng MH, Wong N, Lai PB, Lau WY, Hjelm NM, Johnson PJ. Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients. Cancer Res 1999; 59: 71–73. 172. Yaegashi N, Uehara S, Maeda T, Fujimori K, Okamura K, Yajima A. Observed versus expected rates of unbalanced fetal karyotype at second trimester amniocentesis when one parent carries a balanced translocation. Gynecol Obstet Invest 2001; 51: 85-91. 173. Yamada T, Nakamori S, Ohzato H, Oshima S, Aoki T, Higaki N, Sugimoto K, Agaki K, Fujiwara Y, Nishisho I, Sakon M, Gotoh M, Monder M: Circulating DNA K-ras mutation in pancreatic adenocarcinoma. Clin Cancer Res 1998; 4: 1527–1532. 77
X. IRODALOMJEGYZÉK 174. Zhong XY, Burk MR, Troeger C, Jackson LR, Holzgreve W, Hahn S. Fetal DNA in maternal plasma is elevated in pregnancies with aneuploid fetuses. Prenat Diagn 2000; 20: 795–798. 175. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S. Cell-free fetal DNA in the maternal circulation does not stem from the transplacental passage of fetal erythroblasts. Mol Hum Reprod 2002; 8: 864–870. 176. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S. Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell free fetal DNA in maternal plasma. Swiss Med Wkly 2001; 131: 70–74. 177. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S. The levels of circulatory cell free fetal DNA in maternal plasma are elevated prior to the onset of preeclampsia. Hypertens Pregnancy 2002; 21: 77–83. 178. Zhong XY, Holzgreve W, Li JC, Aydinli K, Hahn S. High levels of fetal erythroblasts and fetal extracellular DNA in the peripheral blood of a pregnant woman with idiopathic polyhydramnios: case report. Prenat Diagn 2000; 20: 838– 841. 179. Zhong XY, Laivuori H, Livingston JC, Ylikorkala O, Sibai BM, Holzgreve W, Hahn S. Elevation of both maternal and fetal extracellular circulating deoxyribonucleic acid concentrations in the plasma of pregnant women with preeclampsia. Am J Obstet Gynecol 2001; 184: 414–419. 180. Zhong
XY,
Wang
Y,
Chen
S,
Labu,
Pubuzhuoma,
Gesangzhuogab,
Ouzhuwangmu, Hahn C, Holzgreve W, Hahn S. Can circulatory fetal DNA be used to study placentation at high altitude? Ann N Y Acad Sci 2004; 1022: 124128. 181. Zhong YX, Steinborn A, Sohn C, Holzgreve W, Hahn S. High levels of circulatory erythroblasts and cell-free DNA prior to intrauterine fetal death. Prenat Diagn 2006; 13: 1272-1273.
78
XI. SAJÁT IRODALOM JEGYZÉKE
11. Saját irodalom jegyzéke 11. 1. Az értekezés készítése során felhasznált saját irodalom 11. 1. 1. Lektorált közlemények: I. Lázár L, Bán Z, Szakács O, Nagy B, Beke A, Oroszné NJ, Rigó J Jr, Papp Z. Szabad magzati DNS kimutatása a magzati Y-kromoszóma igazolásával anyai vérplazmából. Orv Hetil 2003; 49: 2405-2409. II. Nagy B, Tarja L, Bán Z, Andrasofszky Z, Papp G, Lázár L, Nekam K, Papp Z, Réthy LA. Molekuláris genetikai vizsgálatokra alkalmas ,,szabad'' DNS izolálása archivált vérsavómintákból. Orv Hetil 2004; 47: 2375-2378. III. Lázár L, Bán Z, Harmath Á, Papp Z. The presence of maternal DNA in peripheral blood of newborn infants. In: Charles R, Papp Z. (szerk.), Recent advances in prenatal genetic diagnosis. Medimond 2004: 43-46. IV. Lázár L, Bán Z, Nagy B, Beke A, Rigó J, Papp Z. Sex determination by the detection of SRY region with real-time PCR in maternal plasma. In: Charles R, Papp Z. (szerk.), Recent advances in prenatal genetic diagnosis. Medimond 2004: 51-54. V. Lázár L, Harmath A, Bán Z, Nagy B, Papp C, Rigó J Jr, Papp Z. Detection of maternal deoxyribonucleic acid in peripheral blood of premature and mature newborn infants. Prenat Diagn 2006; 2: 168-170. VI. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Presence of cell-free fetal DNA in plasma of women with ectopic pregnancies. Clin Chem 2006; 8: 1599-601. VII. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Nonivazív praenatális genetikai diagnosztika. Háziorvosi Továbbképző Szemle 2006. (közlésre elfogadva) VIII. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Non-invazív magzati Rh meghatározás real-time PCR-módszerrel. Orv Hetil 2007. (közlésre elfogadva) IX. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Papp Z. Anyai eredetű DNS kimutatása koraés érett újszülöttek perifériás keringésében. Magyar Nőorvosok Lapja 2007. (közlésre elfogadva) 11. 1. 2. Idézhető absztraktok I. Lázár L, Bán Z., Papp C., Tóth-Pál E., Beke A., Papp Z. Fetal sex determination with real time PCR from fetal DNA in maternal plasma. Eur J Hum Gen 2003; 11(S1): 68.
79
XI. SAJÁT IRODALOM JEGYZÉKE II. Lázár L, Nagy B, Ban Z, Oroszne NJ, Papp C, Papp Z. The effect of previous pregnancies and maternal transfusion on sex determination using the SRY region detection with real-time PCR in maternal plasma. Eur J Hum Gen 2004; 12(S1): 161. III. Lázár L, Nagy B, Bán Z, Nagy GR, Tóth-Pál E, Papp C, Papp Z. Presence of cell free fetal DNA in peripherial blood of patients with ectopic pregnancy. Eur J Hum Gen 2005; 13(S1): 177. IV. Lázár L, Nagy B, Ban Z, Nagy GR, Papp Z. Presence of fetal DNA in ectopic pregnancy cases: histological and molecular biological evidence. Archiv Perin Med 2006; 12(1): 50. V. Bán Z, Nagy B, Lázár L, Nagy G, Papp Z. Detection of fetal aneuploidies by quantitative fluorescent polymerase reaction. Archiv Perin Med 2006; 12(S1): 41.
11. 2. A szerző egyéb, nem az értekezés témájában megjelent közleményei 11. 2. 1. Lektorált közlemények I. Csaba Á, Papp C, Bán Z, Joó JG, Lázár L, Papp Z: How painful is amniocenetsis? In: Charles R, Papp Z. (szerk.), Recent advances in prenatal genetic diagnosis. Medimond 2004: 167-170. II. Oroszné J, Bán Z, Nagy G, Lázár L, Papp Z. Recurrent Trisomy 21 and Uniparental Disomy 21: A Report on a Family. In: Charles R, Papp Z. (szerk.), Recent advances in prenatal genetic diagnosi. Medimond 2004: 133-137. III. Nagy B, Ban Z, Lazar L, Nagy RG, Papp C, Toth-Pal E, Papp Z. Rapid determination of trisomy 21 from amniotic fluid cells using single-nucleotide polymorphic loci. Prenat Diagn 2005; 25: 1138-1141. IV. Rigó J, Derzy Z, Bőze T, Krasznai I, Lázár L, Than NG, Nagy B. Cardiovascularis megbetegedések előfordulása súlyos praeeclampsiás nők szüleiben 50 éves kor alatt. Magyar Nőorvosok Lapja 2005; 4: 265-269. V. Skriba E, Bőze T, Köves K, Lázár L, Rigó J. Súlyos hypertóniás beteg arteria cerebri media occlusioja utáni sikeres terhessége. Magyar Nőorvosok Lapja 2005; 3, 157-220. VI. Nagy B, Bán Z, Lázár L, Nagy GYR, Papp Cs, Tóth-Pál E, Papp Z. A 21-es chromosoma trisomiájának kimutatása egynukleotidos polymorphysmus (SNP) merker felhasználásával. Magyar Nőorvosok Lapja 2005; 5: 315-318.
80
XI. SAJÁT IRODALOM JEGYZÉKE VII. Nagy B, Bán Z, Beke A, Nagy GR, Lázár L, Papp C, Tóth-Pál E, Papp Z. Detection of Toxoplasma gondii from amniotic fluid, a comparison of four different molecular biological methods. Clin Chim Acta 2006; 368: 131-137. VIII. Rigó J Jr, Bőze T, Derzsy Z, Derzbach L, Treszl A, Lázár L, Sobel G, Vásárhelyi B. Family history of early-onset cardiovascular disorders is associated with a higher risk of severe preeclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006; 128: 148-151. IX. Nagy B, Bán Z, Lázár L, Nagy GR, Papp Z. A cystás fibrosist okozó F508 deléció kimutatása kvantitatív real-time PCR-módszerrel. Orv Hetil 2006;147: 1119-1122. X. Nagy B, Nagy GR, Lázár L, Bán Z, Papp Z. Detection of DeltaF508del using quantitative real-time PCR, comparison of the results obtained by fluorescent PCR. Fetal Diagn Ther 2007; 1: 63-7. XI. Papp C, Bán Z, Szigeti Z, Csaba A, Lázár L, Nagy GR, Papp Z. Prenatal sonographic findings in 207 fetuses with trisomy 21. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006; (közlésre elfogadva) XII. Nagy GR, Largainer CR, Nuoffer JM, Nagy B, Lázár L, Papp Z. Novel mutation in OTC gene causes neonatal death in twin brothers. J Perinatol 2007; 2: 123-124. XIII. Nagy B, Lázár L, Nagy GR, Bán Z, Papp Z. Toxoplasma gondii kimutatása magzatvízből valósidejű PCR módszerrel. Orvosi Hetil 2007; (közlésre elfogadva)
81
