Thesisvoorstellen 2010-2011-Dienst FABI (prof. Vander Heyden) 1) Generic Strategies for Chiral Separation in Reversed Phase Liquid Chromatography Using New Chiral Selectors (Ahmed Younes, Debby Mangelings) (1 student) Nowadays, drug manufactures often try to synthesize enantiomerically pure compounds. In drug development, analytical methods are required to evaluate the enantiomeric purity of starting materials, reagents and catalysts, because the quality of these compounds limits the enantiomeric purity of the resulting products. Therefore, the goal of the analytical lab in the pharmaceutical industry is to develop as much separations as possible in a minimum of time. To avoid time-consuming trial-anderror approaches, generic strategies have been defined using different techniques (NPLC, RPLC, POSC, SFC, CE, CEC) to help the analyst with chiral method development [1–6]. In this context, it is useful to have general screening strategies based on, for instance, chromatographic techniques [7–9]. After evaluating the resolution (Rs), which is the most important response for chiral separations, some optimization steps can be considered when for example only a partial separation is obtained [6,10]. This subject studied the applicability of an existing strategy in NPLC that use polysaccharide-based chiral stationary phases on four recently commercialized chlorine-containing polysaccharide-based chiral stationary phases. 2) Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) of poliovirus proteins (Iulia Oita, Bieke Dejaegher) (2 studenten)
Poliovirus particles and sub-viral particles were separated using a capillary electrophoretic (CE) method. For a successful separation, sodium dodecylsulphate (SDS) was required in the background electrolyte (BGE). The separation was attributed to a combination between differential migration in an electrical field and analytes‟ interactions with SDS from BGE. This effect was even more obvious in case of sub-viral proteins. Since reference materials are not available for the performed CE tests, an analytical technique with a different separation mechanism might bring supplementary data that will confirm or infirm our hypothesis. Reversed-phase chromatography (RPLC) was selected as alternative technique since it is a powerful tool for the separation of very heterogeneous samples. Choosing the proper chromatographic system, solely the differences in hydrophobicity of molecules might be exploited for their separation. Moreover, there are literature reports on the preparative use of the RP-HPLC separation of poliovirus proteins [2,6]. The student will be involved in developing an RP-HPLC method for poliovirus subviral proteins. 3) Uniform designs in methode optimalisatie (Bieke Dejaegher) (2 studenten) Experimenteel design is een set-up waarbij de factoren tegelijkertijd gevariëerd worden, in tegenstelling tot de situatie waarbij telkens één factor afzonderlijk gevariëerd wordt [1,2]. Een experimenteel design wordt bovendien gekenmerkt door het feit dat een welbepaald aantal factoren in een welbepaald aantal experimenten onderzocht wordt. In methode optimalisatie worden eerst met “screening designs” de
factoren met de grootste invloed op de onderzochte respons(en) bepaald, waarna deze belangrijkste factoren verder onderzocht worden met “response surface designs”, zoals three-level full factorial designs [3], central composite designs [4], BoxBehnken designs [5], Doehlert designs [6,7] of uniform designs [8-12]. De design resultaten laten vervolgens toe de respons als functie van de factoren te modelleren [1,2]. Het doel is verschillende response surface designs in optimalisatie te vergelijken. Om 3 factoren te optimaliseren, worden een verschillend aantal experimenten vereist voor elk soort design. In three-level full factorial designs worden 27 experimenten uitgevoerd, in central composite designs 15, in Box-Behnken en Doehlert designs 13, en in uniform designs 6 experimenten. De gebruikte toepassing is een optimalisatie van een scheiding met HPLC of CE, of een optimalisatie van een derivatisatiereactie. De invloed van het verminderen van het aantal experimenten op het voorspelde optimum en op het responsoppervlak zal worden nagegaan. De voorspelde optima van de verschillende designs zullen worden vergeleken met de experimenteel bepaalde waarden bij de gevonden optima, om na te gaan welke voorspelde optima, en dus welke experimentele designs, praktisch aanvaardbare resultaten opleveren. 4) Scheiding van chirale geneesmiddelen door middel van nieuwe stationaire fasen in capillaire electrochromatografie en capillaire vloeistof chromatografie (Ans Hendrickx) (2 studenten) Het bestaan van chiraliteit heeft gevolgen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen omdat beide enantiomeren in het lichaam verschillende farmacodynamische en farmacokinetische eigenschappen kunnen vertonen. Bijgevolg dienen, tijdens de geneesmiddelenontwikkeling, beide enantiomeren gescheiden te worden. Er bestaan reeds verschillende analytische technieken die gebruikt kunnen worden voor de scheiding van deze moleculen namelijk, high-performance liquid chromatography (HPLC), capillaire electroforese (CE), gaschromatografie (GC), super-kritische vloeistofchromatografie (SFC), capillaire vloeistofchromatografie (CLC) en capillaire electrochromatografie (CEC). CEC is een hybride techniek van HPLC en CE en bezit hierdoor eigenschappen van beide technieken waaronder chromatografische partitie en electroforetische migratie. Miniaturisatie is de laatste jaren een trend, mede daarom wint CEC aan populariteit. Maar CEC wordt momenteel nog gekenmerkt door een aantal experimentele nadelen, zoals de noodzaak aan frits, gebrek aan stationaire fasen speciaal ontwikkeld voor CEC en het gebrek aan commerciële kolommen. Diezelfde trend voor miniaturisatie was ook één van de redenen voor de introductie van CLC, als een alternatief voor HPLC. Het gebruik van een kleinere kolom diameter verhoogt immers de kolom efficiëntie. Vaak worden voor de CEC en CLC capillairen HPLC polysaccharide stationaire fasen gebruikt in geval van chirale scheidingen. Deze hebben echter niet noodzakelijk de geschikte dimensies en zijn vaak niet echt ontwikkeld om, zoals bij CEC, een elektrisch veld over aan te leggen waardoor de performantie van de kolom daalt in functie van de tijd. In deze thesis zal onderzoek gevoerd worden naar een eventuele verbetering van bestaande stationaire fasen voor CEC en CLC analyses. Partikel gebaseerde en monolitische stationaire fasen, beiden met gechloreerde polysaccharide selectoren, zullen worden getest op analysetijd, enantioselectiviteit en resolutie. Bovendien wordt er ook een vergelijking gemaakt op basis van efficiëntie, enantioselectiviteit en
analysetijd tussen de electrochromatografische chromatografische techniek, CLC
techniek,
CEC,
en
de
5) Theoretische moleculaire descriptoren in kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties (QSAR) (Tessy Geerts) (2 studenten) De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen heeft een enorme evolutie gekend. Daar waar er decennia geleden op goed geluk geëxperimenteerd werd, geniet momenteel de rationele aanpak de voorkeur. Bij het ontwikkelingsproces vallen echter heel wat moleculen uit de boot omwille van oninteressante ADME-eigenschappen. Experimenteel onderzoek en de synthese van deze nieuwe moleculen zijn vaak tijd-en geldrovend zodat het theoretisch onderzoeken van potentiële geneesmiddelen de voorkeur geniet. Op basis van een dataset aanwezig in de literatuur zullen we trachten een kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie op te stellen. Algemeen wordt in QSAR een model gebouwd tussen de activiteit (bv. inhiberende concentratie) van moleculen en moleculaire descriptoren die gebaseerd zijn op een symbolische voorstelling van de moleculen (bv. molecuulformule, ruimtelijke structuur). Om het model te bouwen worden multivariate calibratietechnieken gebruikt, zoals multipele lineaire regressie (MLR), principale componenten regressie (PCR) en partial least squares (PLS). De bekomen modellen worden geëvalueerd op basis van hun voorspellend vermogen. Daar het onderzoek louter theoretisch is, zal er tijdens het thesisonderzoek geen experimenteel werk aan bod komen. In plaats daarvan worden er computerprogramma‟s gebruikt. Hyperchem® laat toe om de 3D-structuur van de moleculen aanwezig in de dataset te tekenen. Deze structuren worden overgebracht naar Dragon® software, een programma dat het mogelijk maakt om de moleculaire descriptoren te berekenen. Deze informatie wordt vervolgens naar Matlab® overgebracht. Dit laatste programma wordt aangewend om de geschikte descriptoren te selecteren, modellen op te stellen en deze vervolgens te evalueren. 6) Ontwikkeling en validatie van chromatografische fingerprint analyses van chinese materia medica met behulp van HPLC-DAD (Christophe Tistaert) (2 studenten) In de Oosterse traditionele geneeskunde wordt een breed gamma kruiden en planten gebruikt voor therapeutische indicaties gaande van pijnbestrijding tot behandeling van cholera, verlichting van oedemen.... Identificatie en kwaliteitscontrole van deze traditionele geneesmiddelen is vaak onvoldoende gecontroleerd. De complexe samenstelling van vele kruiden bemoeilijkt identificatie en bovendien is de bepaling van slechts enkele componenten niet representatief voor de totale intrinsieke waarde van het kruid. De WHO aanvaardt het gebruik van chromatografische methodes zoals high-pressure liquid chromatography (HPLC) als techniek voor de identificatie en kwaliteitscontrole van kruiden. Hierbij wordt in eerste instantie een fingerprint („vingerafdruk‟) van een kruid ontwikkeld om identificatie en kwaliteitscontrole mogelijk te maken. De thesis zal zich toespitsen op het ontwikkelen en valideren van fingerprints van een kruid uit de Chinese Materia Medica. Hierbij wordt gebruikt gemaakt van high-
performance liquid chromatography gekoppeld aan een diode array detector (HPLCDAD). 7) NIR spectroscopie als analytische technologie om de kwaliteit van geneesmiddelen te voorspellen (Sigrid Pieters) (1 student) Het gebruik van nieuwe analytische technologiën om de kwaliteitsbewaking van geneesmiddelen te onderbouwen wordt sterk aangemoedigd door de autoriteiten. Gezien NIR spectroscopie karakteristieke spectra van het staal op een zeer snelle en niet-destructieve manier genereert, heeft de techniek potentieel voor zowel het monitoren van farmaceutische productieprocessen (als een process analytical technology tool) als voor het bepalen van bepaalde eindproduct specificaties. In de plaats van een tijdrovende, destructieve en/of dure methode, die slechts kan uitgevoerd worden op een aantal representatieve stalen van het lot, kan NIR spectroscopie veel meer items van het lot (on-line) controleren en kan er dus op vrij eenvoudige en snelle wijze nuttige informatie gewonnen worden over de kwaliteit van het proces en geneesmiddel. De NIR calibratiemodellen worden gegenereerd door spectra van representatieve stalen (calibratie stalen) te meten en vervolgens te modelleren met de resultaten bekomen met de referentiemethode. Er zijn echter een aantal uitdagingen om een predictiemodel op te stellen dat toelaat adequaat te beslissen over de kwaliteit van het geneesmiddel. De keuze van de stalen (objecten) en de golflengten (variabelen) zal immers een cruciale rol spelen, gezien er (meet)fouten zitten op zowel de referentiewaarden als op de NIR spectra. Een adequate manier om zowel outliers te detecteren als de juiste golflengte range te vinden is dus van belang om een betrouwbaar model te maken. Om uiteindelijk operatief te kunnen zijn in een farmaceutische productie, zal de NIR methode ook moeten gevalideerd worden. De huidige ICH richtlijn Q2 omtrent validatie voldoet echter niet voor een on-line NIR methode, vooral wat betreft range en lineariteit. Ook hier zal er naar innovatieve oplossingen gezocht worden. In de bovenstaande context zal de student voor een bepaalde case studie (bv. content uniformity op tabletten) NIR en HPLC (referentiemethode farmacopee) metingen uitvoeren en verschillende chemometrische technieken toepassen op de bekomen data. 8) Gebruik van gechloreerde polysaccharide chirale stationaire fasen in superkritische vloeistofchromatografie (Debby Mangelings) (1 student) Het scheiden van chirale geneesmiddelen kent reeds vele jaren zijn toepassing in de farmaceutische industrie. De reden hiervoor is het bestaan van verschillende activiteiten tussen eutomeer – het therapeutisch actieve enantiomeer - en het distomeer wanneer zij blootgesteld worden aan een chirale omgeving, zoals het menselijk lichaam. In de vroege fasen van geneesmiddelenontwikkeling prefereert de industrie echter de synthese van racematen door de hoge kostprijs van enantiomerisch zuivere reagentia. In deze stadia wordt een snelle screening uitgevoerd van de racematen, enerzijds om het actieve enantiomeer af te zonderen, anderzijds om de methodeontwikkeling voor de bepaling van enantiomerische onzuiverheid in een staal te versnellen in latere stadia van de ontwikkeling van het geneesmiddel. Daarom zijn generische scheidingsstrategiëen, die toepasbaar zijn op een groot aantal moleculen, zeer interessant voor de industrie. Allerhande technieken werden reeds gebruikt door het departement om zo een strategieën op te stellen, waaronder HPLC, capillaire electroforese en capillaire electrochromatografie. In samenwerking met de
farmaceutische industrie werd hetzelfde gedaan in superkritische vloeistofchromatografie. Echter, het aantal gecommercialiseerde CSP neemt toe en er zijn een aantal recent gecommercialiseerde CSP die potentieel vertonen om een of meerdere CSP in de eerder gedefinieerde strategieën te vervangen. Zij gebruiken een gechloreerde polysaccharide gebaseerde selector, en er werd reeds gezien in HPLC dat zij een betere enantioselectiviteit bezitten dan de klassieke polysaccharidegebaseerde selectoren. Het doel van dit werk is om enerzijds na te gaan of deze nieuwere CSP kunnen gebruikt worden in superkritische vloeistofchromatografie, en of zij een betere enantioselectiviteit bezitten. 9) Reductie van het aantal testcomponenten bij de evaluatie van de enantioselectiviteit van chirale scheidingssystemen beschreven via moleculaire descriptoren (Hasret Ates) (1 student) Wanneer chirale moleculen het potentieel vertonen om als geneesmiddel gebruikt te worden, is er tijdens de ontwikkelingsfase van deze moleculen onderzoek op de enantiomeren vereist. De reden hiervoor is dat de enantiomeren van eenzelfde chirale molecule kunnen verschillen in hun farmacologische activiteit. Bij toediening van het racemaat kan dit zware gevolgen hebben voor de patiënt. Het is dus van belang om te weten welke effecten worden veroorzaakt door de individuele enantiomeren. Om uitgaande van een racemisch mengsel enantiomeren te bekomen, wordt er gebruik gemaakt van verschillende analytische of preparatieve scheidingstechnieken. Directe scheidingsmethoden scheiden de enantiomeren via de vorming van diastereomere complexen met een chirale selector. Een techniek waar directe scheiding toegepast wordt, is hoge druk vloeistofchromatografie waarbij de stationaire fase de chirale selector bevat. Dergelijke systemen maken snelle scheidingen mogelijk, wat in een industriële context van belang is, zowel in de eerste fasen van de geneesmiddelenontwikkeling (analytisch) als tijdens de productie (preparatief). De chirale scheiding is niet altijd volledig opgehelderd en dus moeilijk te voorspellen. Vandaar dat er verschillende scheidingsstrategieën ontwikkeld zijn. Deze strategieën bundelen per techniek de meest generische analysevoorwaarden die toegepast kunnen worden om chirale stoffen te scheiden. Dergelijke voorwaarden worden gedefinieerd door een grote groep testmoleculen te analyseren (bvb. meer dan 60 in ons onderzoek). Door de continue toename aan selectoren moeten deze strategieën uiteraard ook ge-update worden. Om niet iedere keer opnieuw een grote testset te moeten gebruiken (tijdrovend), zullen we nagaan of een strategie ook gedefinieerd kan worden met een beperkt aantal chirale stoffen met behoud van de selectiviteitsinschatting voor een bepaald systeem. Hiervoor zullen we gebruik maken van moleculaire descriptoren om de structuur van moleculen te beschrijven en van het „Kennard and Stone‟ algoritme om de meest diverse te selecteren. 10) Reductie van het aantal testcomponenten gekarakteriseerd aan de hand van chromatografische retentie, bij de evaluatie van de enantioselectiviteit van chirale scheidingssystemen (Hasret Ates) (1 student) Wanneer chirale moleculen het potentieel vertonen om als geneesmiddel gebruikt te worden, is er tijdens de ontwikkelingsfase van deze moleculen onderzoek op de enantiomeren vereist. De reden hiervoor is dat de enantiomeren van eenzelfde chirale molecule kunnen verschillen in hun farmacologische activiteit. Bij toediening van het
racemaat kan dit zware gevolgen hebben voor de patiënt. Het is dus van belang om te weten welke effecten worden veroorzaakt door de individuele enantiomeren. Om uitgaande van een racemisch mengsel enantiomeren te bekomen, wordt er gebruik gemaakt van verschillende analytische of preparatieve scheidingstechnieken. Directe scheidingsmethoden scheiden de enantiomeren via de vorming van diastereomere complexen met een chirale selector. Een techniek waar directe scheiding toegepast wordt, is hoge druk vloeistofchromatografie waarbij de stationaire fase de chirale selector bevat. Dergelijke systemen maken snelle scheidingen mogelijk, wat in een industriële context van belang is, zowel in de eerste fasen van de geneesmiddelenontwikkeling (analytisch) als tijdens de productie (preparatief). De chirale scheiding is niet altijd volledig opgehelderd en dus moeilijk te voorspellen. Vandaar dat er verschillende scheidingsstrategieën ontwikkeld zijn. Deze strategieën bundelen per techniek de meest generische analysevoorwaarden die toegepast kunnen worden om chirale stoffen te scheiden. Dergelijke voorwaarden worden gedefinieerd door een grote groep testmoleculen te analyseren (bvb. meer dan 60 in ons onderzoek). Door de continue toename aan selectoren moeten deze strategieën uiteraard ook ge-update worden. Om niet iedere keer opnieuw een grote testset te moeten gebruiken (tijdrovend), zullen we nagaan of een strategie ook gedefinieerd kan worden met een beperkt aantal chirale stoffen met behoud van de selectiviteitsinschatting voor een bepaald systeem. Hiervoor zullen we gebruik maken van experimentele chromatografische gegevens (bvb. resoluties) op verschillende chromatografische systemen om de moleculen uit de testset te karakteriseren. Daarna zullen deze met de meest diverse enantioselectiviteit bvb. met het „Kennard and Stone‟ algoritme geselecteerd worden.
