Technické a teoretické aspekty mikroskopie živé buňky Dalibor Štys Škola komplexních systémů Nové Hrady
Ţivé systémy jsou nejzjevnějším příkladem samoorganizující komplexních systémů a jsou zaloţené na chemo-mechanických jevech. Podobné problémy jsou řešeny při popisu samoorganizujících technických systémů jako jsou sítě, počítačové sémantické struktury apod. Společným problémem při jejich studiu je otázka jak měřit experimentálně pozorovatelnou samoorganizaci ?
Systémová biologie Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Současná systémová biologie se snaží kvantifikovat co nejvíce látek ve studovaném biologickém objektu. Biologické objekty ale nejsou „pytlíky“ s chemikáliemi, mají svou trojrozměrnou strukturu. Struktura biologických objektů je udržována dynamickými ději. Biologické objekty jsou sobě podobné a Ljapunovovsky / asymptoticky (?) stabilní. Cílem mikroskopie ţivé buňky – kvantitativního zobrazování - (z pohledu termodynamiky) je hledání makroskopických proměnných v chemomechanickém prostoru, které buňku nebo její části správně charakterizují. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Urban J., Vaněk J., Soukup J. and Štys D., Expertomica Metabolite Profiling: Getting more information from LCMS using the stochastic systems theory approach, (2009) Bioinformatics 25, 2764-2767 Urban J, Hrouzek P. and Štys D., Time alignmnent in HPLC-MS 2012 Lambert Academic Publishing, ISBN: 9793-659-13020-5
Mikroskopie ţivé buňky Mikroskopie ţivé buňky
Mikroskopie mrtvé buňky
zvětšení 18 století velikost 19 století pozorovaného Airy difrakční disk Popis optického pole Abbe koncept kondenzoru, difrakční chování mikroskopu limit 1942 Nijboer – Zernike integrál Koch barvení buněk 1934 Zernike Mikroskopie s fázovým 1951 Toraldo di Francia – optická kontrastem mikroskopie nemá teoretický limit 1957 - Konfokální mikroskop – rozlišení mechanické omezení budícího svazku Rozlišení 1969 – Reynolds - mikroskopie s 1990 – současnost: teoretický videozesílením popis optické mikroskopie se 1990 – současnost: mnoho druhů superrozlišením mikroskopů se superrozlišením, 2000 – současnost: digitální zejména pro fluorescenčně značené kamery vzorky 2009 – mikroskop jako informační 2012 Sub-mikroskop – nanoskop – pro kanál neznačené ţivé buňky
1590 Jansen 10x 1665 Hook 1820 Mikrotomie 1837 Purkyně 1900 Barvení 1931 Elektronový mikroskop 200000x
zvětšení
Skutečná zobrazovací funkce mikroskopu - point spread function
μm
μm
μm
Mikroskopie živé buňky Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Mikroskopický experiment, konstrukce a funkce „nového“ mikroskopu HeLa buňky – hlavní model pro lidské tkáňové kultury
Skutečný záznam z primární kultury pacienta s rakovinu tlustého střeva
Experimenty jsou dlouhodobé a vznikají tisíce obrázků, které se v současné době zpracovávají ručně. Prvotní motivací bylo automatické zpracování obrazu. Za praxe vyplynula nutnost pochopení vzniku mikroskopického obrazu nad rámec dostupných popisů a pochopení vzniku principiálních zákonistostí vzniku struktur uvnitř živé buňky.
Buněčný cyklus Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Buněčný cyklus je nejzjevnější událost v životě buňky. Během ní se buňka rozdělí na dvě a více buněk. Předpokládá se, že počet dělení odráží stupeň integrace buňky do tkáně. Proto se počet dělení v čase používá, například, v akreditovaných laboratořích pro hodnocení biokompatibility a toxicity. Buněčný cyklus se skládá z fází – stavů.
Software e-cell Dalibor Štys, School of Complex Systems FFPW USB Czech Republic
Software: www.expertomica.eu/ software Manuální vyhodnocení vývoje buněk, anotační nástroj Expertomica Hela Cells 3.03 RC Expertomica Ecell Publikace: Levitner T, Timr S, Stys D., Expertomica Cells: analysis of cell monolayer development, (2010) Bioinformatics, 26, 278-279
Buněčné události – pohled z hlediska obecné teorie systémů Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Analýza dává jen malý počet dokončených buněčných cyklů – je třeba zvětšit zorné pole a automatizovat analýzu.
Levitner T, Timr S, Stys D., Expertomica Cells: analysis of cell monolayer development, (2010) Bioinformatics, 26, 278-279
Buněčné události – pohled z hlediska obecné teorie systémů Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Stochastické chování ţivé buňky není primárně způsobeno fluktuacemi popisovaným rovnováţnou termodynamikou Rozdělení pravděpodobností v chování živých systémů závisí na počtu signálů, které si buňky vymění
Levitner T, Timr S, Stys D., Expertomica Cells: analysis of cell monolayer development, (2010) Bioinformatics, 26, 278-279
Mikroskopický experiment, konstrukce a funkce nového mikroskopu. Technické poţadavky na nový experimentální mikroskop - Snadné a rychlé zahájení experimentu za kontrolovaných podmínek – teplota, vlhkost, CO2 - Nízký celkový světelný výkon dopadající na buňku a odpovídající snímání kamerou - Skenování ve všech třech osách, kontrola pozice s přesností 1 pixel (cca 20 nm při 80x zvětšení) - Řízení založené na počítačové analýze obrazu Vypsali jsme veřejnou soutěţ v níţ zvítězilo konsorcium českých firem Compotech a Optax
Mikroskopie fázového kontrastu poskytuje informaci o celém obsahu buňky
Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Principy mikroskopie s videozesílením
„ Mikroskopie s videozesílením je moderní variantou mikroskopie v temném poli “ Mizushima, Y., (1980)
Mizushima, Y., (1980) Detectivity limit of very small objects by videoenhanced microscopy. Applied Optics, 27, 2587-2594
Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Principy mikroskopie s videozesílením
Výpočet zobrazení pozorovaného objektu (bod, Van Haver S., The extended Nijboer – jednoduchý Zernike Theory and its tvar) v různé Applications, PhD. Thesis vzdálenosti od 2010 ohniska při různých vlastnostech (vadách) čočky Braat, Jansen a spol Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Principy mikroskopie s videozesílením
Lipson S.G., 2003. Why is super-resolution so inefficient? Micron 34, pp. 309-312
Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Při vysoké intenzitě světla – velkém počtu současně dopadajících fotonů - má čočka vysoké teoretické rozlišení za zachování velkého zorného pole Lipson S.G., 2003
Optické schéma nového mikroskopu
Reálné výsledky mikroskopie s videozesílením Závislost tvaru obrazu latexové kuličky o velikosti 0,22 μm v blízkosti ohniska na intenzitě světla. Prokázala se změna zobrazení v závislosti na zvýšení intenzity světla. 200 mA
500 mA
2500 mA
1000 mA
3000 mA
1500 mA
2000 mA
3500 mA
4000 mA
2000 mA
Při zobrazování živé nebarvené buňky nehledáme nejvyšší rozlišení, ale nejlépe zpracovatelnou a reprezentativní informaci o dané buňce v daném čase.
200 mA
Pozorování živé, neznačené, buňky Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Sub-mikroskop - nanoskop Karusel s výměnou metod optického kontrastování
Řízený zdroj světla vysoké intenzity založený na LED technologii
Karusel pro výměnu barevných filtrů Kamera s vysokou rychlostí snímání a ukládání neredukovaných dat (200 f/s, 2000x1100 bodů)
Kamera s velkým počtem bodů na čipu (kinofilmová velikost), 4500x3000 bodů
Optický stůl z kompozitních materiálů
Sejmuta po dobu testování byla plexisklová klimatizovaná skříň Karusel s automatizovanou výměnou objektivů a přesným z-pohybem
Stolek s přesným xy pohybem
Informační příspěvek bodu - point information gain (PIG, ΔIx,y,α ) počítáme pro kaţdý bod v obrazu ve třech barevných kanálech pomocí Rényiho entropie.
Stys D., Urban J., Vanek J., Císar P. Analysis of biological time-lapse microscopic experiment from the point of view of the information theory. Micron. 2011a, 42, 360-365. Epub 2010 Feb 12. Stys, D., Vanek, J., Nahlik, T., Urban, J., Cisar, P.: The cell monolayer trajectory from the system state point of view. Mol. BioSyst. 7, 2824-2833 (2011)
2000mA
2000 mA
Nevyloučili jsme, že jsme schopni rozlišit objekty jejichž velikost je menší než nejmenší objekt, který jsme schopni promítat na kameru
No. of points
No. of points
No. of points
No. of points
Modely PIG pro různá alfa – normální rozdělení
Entropie informačního příspěvku bodu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Existuje unikátní makroskopický (v termodynamickém smyslu) identifikátor obrazu – buňky? Lze pro strukturované systémy zavést něco jako Gibbsova energie pro nestrukturované systémy? Zavedli jsme veličiny entropie informačního příspěvku bodu - point information gain entropy (PIE, ΔIα) a hustota entropie informačního příspěvku bodu point - information gain entropy density (PIE/points, ΔIα.r )
Sada hodnot PIE nebo PIE/points je unikátním identifikátorem obrazu. Rényiho entropie je základem pro zobecněnou dimenzi, která charakterizuje multifraktální objekty jako jsou chaotické atraktory a jiné samoorganizující systémy.
Stys D., Jizba P., Papacek S., Nahlik T., and Cisar P., On measurement of internal variables of komplex self-organized systems and their relation to multifractal spectra, 2012, IWSOS 2012, LCNS 7166, pp. 36-47, Kuipers and Heegaard eds. Springer: Heidelberg Dordrecht London New York, ISBN 978-3-642-28582-0
Stavová trajektorie v prostoru PIE a PIE/points Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
V prostoru 3x13 souřadnic tvořených hodnotami PIE/points pro hodnoty parametru α = 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,3; 1,5; 1,7; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 jsme provedli multivariantní analýzu a analýzu klastrů
Stys D., Jizba P., Papacek S., Nahlik T., and Cisar P., On measurement of internal variables of komplex self-organized systems and their relation to multifractal spectra, 2012, IWSOS 2012, LCNS 7166, pp. 36-47, Kuipers and Heegaard eds. Springer: Heidelberg Dordrecht London New York, ISBN 978-3-642-28582-0
Provedli jsme analýzu hlavní komponenty pro 39 hodnot PIE/point jako stavových proměnných a analýzu klastrů. Byli jsme schopni detekovat další tvary nad rámec expertní klasifikace.
Závislost PIE na alfa pro normální rozdělení 1,60E-02
1,40E-02
1,20E-02
1,00E-02
PIE /points 8,00E-03
6,00E-03
4,00E-03
2,00E-03
PIE 0,00E+00 0,00E+00
1,00E+00
2,00E+00
3,00E+00
α -2,00E-03
-4,00E-03
4,00E+00
A model relevant to cellular metabolism: The Belousov – Zhabotinsky reaction
Sémantická a syntaktická informace v statistice rozdělení bodu v obrazu
Konstrukce stavové trajektorie pomocí PCA – sémantická informace
PC-1
56.91%
PC-2
79.47%
PC-3
88.30%
PC-4
91.68%
PC-5
94.15%
Konstrukce stavové trajektorie s využitím sémantické informace
PC-1
63.67%
PC-2
92.83%
PC-3
97.25%
PC-4
98.09%
PC-5
98.40%
A model relevant to cellular metabolism: The Belousov –Zhabotinsky reaction
Extraction of image statistics: TO BE ADDED – cross statistics
Závislost kovariance jednotlivých PIE pro různá alfa s různými hlavními osami - celá trajektorie 0,31
0,26
PC1-red
PC1-green
PC1-blue
PC2-red
PC2-green
PC2-blue
PC3-red
PC3-green
PC3-blue
0,21
0,16
0,11
0,06
0,01
0
-0,04
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Klastrová analýzy trajektorie
Závislost kovariance PIE pro různá alfa s hlavními osami pro první klastr 0,4 PC1-red PC1-green PC1-blue
0,35
PC2-red PC2-green PC2-blue
0,3
PC3-red PC3-green PC3-blue
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0 0
-0,05
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Typická rozdělení PIG pro různá alfa 0,4 PC1-blue PC2-blue PC3-blue
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Rozdíly mezi syntaktickou a sémantickou informací
1500 mA
Porovnání záznamu z modrého kanálu a přepočtené obrazové entropie při α=1.3
Problémy automatické detekce stavů buňky Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Momentální problémy pouţití PIG pro automatickou klasifikaci stavů buněk z časosběrné mikroskopie: Neexistuje dobrá metoda automatizace oddělení buňky od pozadí
Porovnání záznamu z modrého kanálu a přepočtené obrazové entropie při α=1.5
1500 mA
Porovnání záznamu z modrého kanálu a přepočtené obrazové entropie při α=1.5
1500 mA
Popis stavu buněčné kultury a) definice fenomenologických proměnných pro danou buňku - PIE ( Vi,ϕ ) b) definice informačních vazeb – mezibuněčné interakce a jejich klasifikace ( Ci ) c) nalezení funkce rozdělení pravděpodobností buněčných osudů – událostí ( Pi ) Vytvoření stochastického modelu dynamiky ţivé buňky
i T ,Vi , , Ci
PCS , C, P
Zampa P., The principle of causality and new approach to system theory, In: Cybernetics and Systems, 2004, pp. 3-8, ISBN 3-85206-169-5 Ţampa P. 1996 Habilitační práce, Západočeská univerzita v Plzni
Popis stavu buněčné kultury Teorie stochastických systémů ilustrována pomocí skutečně naměřených hodnot PIE 3 T ,V3 , C3 6 T ,V6 , C6 4 T ,V4 , C4 čas/min α 0,1 0,3 0,5 0,7 1 1,3 1,5 1,7 2 2,5 3 3,5 4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,007784 0,023004 0,046907 0,089456 0,020834 -0,10248 -0,06185 -0,04437 -0,03083 -0,02085 -0,01666 -0,01501 -0,01405
0,008543 0,025658 0,048603 0,088756 0,019427 -0,09349 -0,05592 -0,0398 -0,02774 -0,01828 -0,01417 -0,01179 -0,01005
0,007637 0,023764 0,043681 0,087721 0,020502 -0,1066 -0,06646 -0,05034 -0,03854 -0,02986 -0,02631 -0,02476 -0,02409
0,006309 0,020705 0,040346 0,080975 0,019509 -0,10165 -0,06091 -0,04466 -0,03248 -0,02297 -0,01865 -0,01628 -0,01466
0,006456 0,020699 0,038172 0,078754 0,018838 -0,10081 -0,06161 -0,04667 -0,03538 -0,02655 -0,02203 -0,01969 -0,01818
0,004844 0,016284 0,036042 0,073938 0,019409 -0,10606 -0,07018 -0,05339 -0,04084 -0,03127 -0,02728 -0,02515 -0,02388
0,005356 0,017431 0,033144 0,071601 0,019982 -0,09438 -0,05881 -0,04339 -0,03178 -0,02285 -0,0188 -0,0167 -0,0152
0,005232 0,016951 0,047665 0,071939 0,018267 -0,09285 -0,05577 -0,04115 -0,03028 -0,02187 -0,01793 -0,01548 -0,01416
0,005515 0,01772 0,037972 0,069289 0,019018 -0,09188 -0,05913 -0,04473 -0,03414 -0,02627 -0,02311 -0,02162 -0,02108
0,006024 0,019191 0,032871 0,075715 0,021295 -0,09916 -0,06191 -0,04637 -0,03497 -0,02664 -0,02343 -0,02211 -0,02147
1 T ,V1 , C1
2 T ,V2 , C2
čas/min 11 12 13 14 α 0,1 0,007322 0,004967 0,004871 0,007328 0,3 0,02115 0,015351 0,016073 0,021476 0,5 0,040076 0,034655 0,040219 0,037749 0,7 0,071052 0,062796 0,065873 0,070482 1 0,0192 0,019045 0,020097 0,021095 1,3 -0,08752 -0,07945 -0,08954 -0,08488 1,5 -0,0574 -0,04789 -0,0576 -0,05347 1,7 -0,0446 -0,03537 -0,04268 -0,04114 2 -0,03545 -0,0259 -0,03136 -0,03241 2,5 -0,02893 -0,01836 -0,02257 -0,02625 čas/min 12 13 3 -0,02629 -0,01458 11 -0,01849 -0,02421 α 3,5 -0,02517 -0,01259 -0,01645 -0,0235 0,1 -0,01134 0,005785 0,007466 4 -0,0245 -0,0153 -0,02333 0,006564 0,3 0,016517 0,021546 0,019756 0,5 0,028229 0,037912 0,036982 0,7 0,056585 0,070462 0,073581 1 0,017672 0,02097 0,019865 1,3 -0,06593 -0,07363 -0,08415 1,5 -0,04369 -0,04464 -0,05179 1,7 -0,03216 -0,03235 -0,03766 2 -0,02341 -0,02319 -0,02718 2,5 -0,01649 -0,01592 -0,01916 čas/min 11 3 -0,01308 12 13-0,01244 14 -0,01571 3,5 -0,01166 -0,01066 -0,01385 α -0,01022 0,1 0,00517 4 0,005563 0,00561-0,00941 0,006116 -0,01255
P2
0,3 0,5 0,7 1 1,3 1,5 1,7 2 2,5 3 3,5 4
0,017467 0,032819 0,075559 80,02139 -0,0941 -0,05805 -0,04256 -0,03066 -0,02115 -0,01665 -0,01406 -0,01237
5 T ,V5 , C5 8 T ,V8 , C
PCS , C, P
7 T ,V7 , C7
0,018111 0,034549 0,076319 0,021874 -0,10996 -0,07646 -0,0598 -0,04764 -0,03886 -0,03538 -0,03429 -0,03413
0,017996 0,036328 0,073574 0,02095 -0,08234 -0,04693 -0,03198 -0,02037 -0,01146 -0,00734 -0,00506 -0,00395
0,018702 0,038578 0,069814 0,01915 -0,08504 -0,05246 -0,03886 -0,02877 -0,02113 -0,01776 -0,01613 -0,01503
14 0,007618 0,022243 0,042973 0,078296 0,0209 -0,09213 -0,06215 -0,0463 -0,03452 -0,02546 -0,02116 -0,01908 -0,01794
Má využití hodnoty PIE/points oporu v teorii? Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Existuje unikátní makroskopický (v termodynamickém smyslu) identifikátor obrazu – buňky? Zle pro strukturované systémy zavést něco jako Gibbsova energie pro nestrukturované systémy? Zavedli jsme veličiny entropie informačního bodu - point information gain entropy (PIE) a hustota entropie informačního bodu point information gain entropy density (PIE/points)
Sada hodnot PIE nebo PIE/points je unikátním identifikátorem obrazu. Rényiho entropie je základem pro zobecněnou dimenzi Dα , která charakterizuje multifraktální objekty jako jsou chaotické atraktory a jiné samoorganizující systémy. Jako všechny dimenze, předpokládá se nalezení limity v přiblíţení k nulové délce měřítka r
Chaotický atraktor jako nástroj k diskuzi o vhodném modelu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Model samoorganizujícího systému – Lorenzův atraktor
Ortogonální proměnné v Lorenzově atraktoru jsou vztaženy ke konkrétnímu experimentu – tzv. Bénardově cele.
Jsou to: x – celkový tok hmoty y – rozdíl teplot horní a dolní plochy z – maximální odchylka gradientu teploty od linearity Kaneko K. (2006). Life: An Introduction to Complex Systems Biology. Springer Grassberger,P., Procaccia,P.: Measuring the strangeness of strange attractors. Physica D 9, 189-208 (1983)
Chaotický atraktor jako nástroj k diskuzi o vhodném modelu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Měříme jeden bod, skupinu bodů, celou doménu atraktoru nebo celý atraktor . Jen v posledním případě můţeme rozumně interpretovat fraktální dimenzi.
Jaký by měl být tvar hlavní variety v ortogonálních souřadnicích získaných multivariantní analýzou?
Aktivity školy komplexních systémů ve vztahu k tématu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita
Škola komplexních systémů – Laboratoř aplikované systémové biologie a Laboratoř tkáňových kultur Návrh a konstrukce přístrojů Software pro systémovou biologii Návrh a analýza experimentu Mezinárodní letní školy Jindřichův Hradec České Budějovice
Technologie pro buněčnou biologii: Automatizovaná analýzy signálu LC-MS Analýza 2D gelů pro proteomiku Analýza buněčných osudů na základě teorie stochastických systémů Zesílení obrazu založené na výpočtu entropie a objektivní analýza buněčné trajektorie Sub-mikroskop, nanoskop
Poděkování studentům letních škol, kteří bývají sponzorováni řadou různých projektů strukturálních fondů EU
Děkuji všem spolupracovníkům, zejména Petrovi Císařovi, Petrovi Jizbovi, Vítěžslavu Březinovi, Janu Urbanovi, Jiřímu Soukupovi, Janu Vaňkovi, Tomáši Náhlíkovi, Tomáši Levitnerovi, Jindřichu Soukupovi, Karině Romanové, Anně Zhyrové, Štěpánu Papáčkovi a též Aliaxandru Pautsinovi, technikům z laboratoře Aplikované systémové biologie a Laboratoře tkáňových kultur ŠKS FROV JU a pracovníkům spolupracujících firem. Hlavní granty: Jihočeské centrum akvakultury a biodiverzity hydrocenóz CENAKVA (CZ.1.05/2.1.00/01.0024) EEA funds sub-projekt HTCFOOD (A/CZ0046/1/0008) Innovation 4 Welfare projekt sponzorovaný programem Interreg IVC Programme
Děkuji za laskavou pozornost
