Debreczeni L., Keresztúri J., Marthné Schill J. Nemzeti Élelmiszerlánc – biztonsági Hivatal Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság Takarmányvizsgáló Nemzeti Referencia Laboratórium Budapest
Takarmányokba kevert állatgyógyászati szerek laboratóriumi vizsgálata.
Gyógyszeres takarmányok használata • Állat állományok kezelésére: – Fertőzések (pl. baktériumok, protozoák, paraziták) - megelőzése - gyógykezelése – Hozamfokozóként -antibiotikumok szubterápiás alkalmazása- tiltott (178/2002/EK) [2006-tól kitiltott antibiotikumok] • Gyógyszeres takarmányok laboratóriumi kontrolljának jelentősége: – Nagy tömegű gyógyszer felhasználás – Nem megfelelő felhasználás esetén fokozódó potenciális veszélyforrások: - toxicitás érzékeny állatfajok esetén - megjelenik állati termékekben (hús, tojás, tej stb.) - rezisztancia révén humán és állategészségügyi kockázatot növeli - trágyából átjutva talajba, felszíni vizekbe, növényekre növeli a környezeti terhelést
Gyógyszeres takarmányok előállítása • Csak engedélyezett hatóanyagokat tartalmazó, engedélyezett gyógyszeres premixekből, készíthető gyógyszeres takarmány • Csak engedélyezett keverő üzemben állíthatóak elő • Engedélyezés: – takarmány adalékanyagként (2003/1831/EK): kokcidiosztatikumok és hisztomonosztatikumok. Jelenleg 11 db hatóanyag engedélyezett Szabályozás takarmányokban: - megengedett eltérés - jelölési értékhez képest (767/2009/EK rendelet) - MRL értékek, nemkívánatos anyagokként (2002/32/EK irányelv; 44/2003. (IV. 26.) FVM rendelet) – állatgyógyászati készítményként (128/2009. (X. 6.) FVM rendelet): Szabályozás takarmányokban: - nincs megengedett eltérés deklarált értéktől - nincs számszerű MRL – eltérő szabályozás EU tagállamokban (HU: 65/2012.(VII.4.) VM rendelet –vizsgálati módszer LOD - vitás kérdés)
Laboratóriumi analitikai feladatok gyógyszeres takarmányokkal kapcsolatosan
• Üzem engedélyezéshez kapcsolódó vizsgálatok • Terápiás célú gyógyszeres takarmányok hatóanyag szintjének vizsgálata • Keresztszennyezés (átmosódás) vizsgálata • Tiltott hatóanyagok vizsgálata
Takarmányok rendszere
Néhány specialitás gyógyszerek takarmányokban való analízisével kapcsolatosan •
Néhány takarmány analitikai specialitás gyógyszerek vizsgálatával kapcsolatosan: – a mátrix nagy variabilitása: - azonos fajra, azonos korcsoportra szolgáló táp, de gyártónként eltérő összetétel(alapanyagok, adalékanyagok, premixek) – védett, formulázott (mikrokapszulázott) gyógyszer: - védőanyagba ágyazva - oldhatóság extrakció során? - spikolás std porral vagy oldattal? amoxicillin szabad amoxicillin védett
– granulálás - darálás nagyon fontos (zárványok) - intenzív extrakció
Üzem engedélyezéshez kapcsolódó vizsgálatok • Legkisebb és legnagyobb koncentrációban bekevert gyógyszer hatóanyagok vizsgálata • Homogenizáló képesség vizsgálata – Gyártási (keverési) tételenként a késztermékekből egyenletes elosztásban 10 10 db mintát kell venni laboratóriumi vizsgálatok céljára. - átlag és variációs koefficiens (CV) számítása (takarmánycsoportok maximális CV%- a szabályozott) • Átszennyeződési vizsgálatok – Az átöblítő mosató anyagból meghatározott helyeken maximum 5 db mintát kell venni. – A legyártott új tételből 5- max. 10 db mintát kell venni. – Mintánként meg kell mérni a hatóanyag maradék szintjét (MRL vagy LOD)
Terápiás célú gyógyszeres takamányok hatóanyag szintjének vizsgálata • Cél: a garantált terápiás szint ellenőrzése - magasabb: - mérgező lehet - alacsonyabb: - várható hatás elmaradása - rezisztenciát okozhat - vegyületcsere • Széles koncentráció tartomány vizsgálata - pl. premixeknél OTC 600000 mg/kg diclazuril 20 mg/kg - takarmány keverékben OTC 3000 mg/kg diclazuril 1 mg/kg • Vizsgálati módszerek: - általában egyedi HPLC módszerek UV/VIS, DAD, FLD, MS, MS/MS detektálással [hatósági (152/2009/EK), szabvány, szakirodalmi, házi módszerek]
Keresztszennyezés (átmosódás) vizsgálata nem céltakarmányban •
• •
Honnan származhat keresztszennyezés összetett takarmányok esetén: - Premixek, előkeverékek előállítása során - Alapanyagokból (pl. DDGS, halliszt stb.) - takarmány keverékek előállítása során - szállítás, tárolás, etetőkbe történő kiadagolás stb. során Lehetséges hatások: - nem célzott állatfajoknál toxicitás - mikrobiális rezisztancia - takarmányokból hatóanyag átjuthat állati eredetű élelmiszerbe (pl. befejező táp - nincs állategészségügyi várakozási idő, tojótáp, tejelő takarmány) Ahol nincs MRL- ellentmondás (milyen érzékenységű módszerrel, milyen célérték?szabályozási probléma – EU szabályozás készül Vizsgálati módszerek: - általában egyedi HPLC módszerek, de van HPLC-MS/MS csoportos és multimódszer is. - hatósági módszer nincs, szabványok most készülnek, szakirodalmi és házi módszerek.
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására • Cél : az engedélyezett 11 féle kokcidiosztatikum egymás melletti meghatározása keresztszennyezés szintjén • Az engedélyezett kokcidiosztatikumok hatóanyagai és legkisebb megengedett MRL szintje hatóanyag min. MRL mg/kg (44/2003. (IV. 26.) FVM rendelet): Dekokvinát 0,40 Diklazuril Halofuginon-hidrobromid Lazalocid-A-nátrium Maduramicin-ammóniumalfa Monenzin-nátrium Narazin Nikarbazin Robenidin-hidroklorid Szalinomicin-nátrium Szemduramicin-nátrium
0,01 0,03 1,25 0,05 1,25 0,70 1,25 0,70 0,70 0,25
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására - minta előkészítés
extrakció 5g minta bemérése 50 ml-es centrifugacsőbe
+10 ml 10%- os Na2CO3 átnedvesítés
+15 ml Acn Rázatás 30 perc
3x
5 ml bepárlás 50
oC,
N2
Maradék feloldása 5 ml Acn/H2O=80/20 szűrés
extraktum összegyűjtése 50 ml-es mérőlombikba
1. oldat: szűrlet 2. oldat: szűrlet 50x hígítva - injektálás
centrifugálás 20 perc, 2000 ford/perc, 5 oC
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására – mérési paraméterek HPLC oszlop: oszlop hőmérséklet: áramlás: injektálás: eluens:
Agilent 1200 GROM-Sil 120 ODS-5 ST, 250x4,6 mm, 5 µm o 35 C 0,7 ml/perc 25 ml A: víz+0,1%(v/v) hangyasav
B: metanol+0,1%(v/v) hangyasav gradiens elúció: 0 perc 50% A 50% B 5 perc 50% A 50% B lineáris 15 perc 5% A 95% B 40 perc 5% A 95% B 41 perc 50% A 50% B 48 perc 50% A 50% B MS-MS Agilent 6410 gáz hőmérséklet 300 °C gáz áramlás 7 l/perc porlasztó 35 psi kapilláris 2500 V feszültség
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására – kromatogram
Egy példa: HPLC-MS/MS multimódszer kokcidiosztatikumok keresztszennyezésének meghatározására - kalibrációs egyenesek
2 nagyságrendet átölelő 6 pontos, nullán átmenő kalibrációs egyenesek illeszkedési koefficiense minden komponensre nagyobb 0.995-nél. (R2>0,995)
Jártassági vizsgálat 2014 • Tárgya: a 11 kokcidiosztatikum azonosítása, mennyiségi meghatározása • Szervező: EURL-FEED ADDITIVE-CONTROL • 4 db takarmány minta - 1 db. minta: diclazuril terápiás szint környékén - 3 db minta: lehetséges 11 komponens a keresztszennyezés (MRL) körüli szinteken.
Jártassági vizsgálat 2014 • Eredmények összefoglalása:
Tiltott, nem engedélyezett hatóanyagok vizsgálata • Hatósági ellenőrzési feladat • Honnan származhatnak tiltott antibiotikumok: - harmadik országból származó alapanyagok, adalékanyagok (pl. kloramfenikol vitaminban) - harmadik országba szállító hazai keverőből keresztszennyezéssel (karbadox, avilamicin) - tiltott, szándékos hazai felhasználásból • Néhány egyedi hatósági módszer, szakirodalmi, házi HPLC-MS/MS módszerek • Multi- szűrőmódszerek (HPLC-MS technika) módszerek kifejlesztése a cél - tiltott és engedélyezett komponensek együttes vizsgálata minél nagyobb számban a keresztszennyezés szintjén (a terápiás szint 0,1-1%-a) - jelenlét esetén kvantitálás egyedi módszerrel - jelenleg a szűk műszerkapacitás a gátja a fejlesztéseknek.
Debreczeni L., Keresztúri J., Marthné Schill J. Nemzeti Élelmiszerlánc – biztonsági Hivatal Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság Takarmányvizsgáló Nemzeti Referencia Laboratórium Budapest
Köszönjük figyelmüket
