UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
Sublinguale immunisatie als een mogelijke immunotherapie
Door Katrien DE NYS
Promotor: Dierenarts Elisa Maina Promotor: Prof. Dr. Eric Cox
Onderzoek in het kader van de Masterproef
© 2014 Katrien De Nys
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van deze masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2013-2014
Sublinguale immunisatie als een mogelijke immunotherapie
Door Katrien DE NYS
Promotor: Dierenarts Elisa Maina Promotor: Prof. Dr. Eric Cox
Onderzoek in het kader van de Masterproef
© 2014 Katrien De Nys
VOORWOORD Met een tevreden en voldaan gevoel wil ik graag mijn waardering betuigen aan een aantal mensen zonder wie ik deze masterproef niet tot een goed einde had kunnen brengen. Om te beginnen wil ik een welgemeende ‘dank u’ zeggen tegen mijn beide promotoren: prof. Dr. Eric Cox en dierenarts Elisa Maina. Dankzij jullie heb ik kunnen proeven van het onderzoeksleven en is mijn interesse in het onderzoek toegenomen. Jullie inzicht en deskundige kennis gaven mij een gepast totaalbeeld. Dank u wel, Elisa, voor alle tijd, energie, uitleg en begeleiding bij dit onderzoek. Het was een zeer aangename samenwerking waaruit ik veel heb geleerd. Bovendien werkte je enthousiasme aanstekelijk, wat deze studie nog boeiender maakte. Dank u wel, prof. Cox, voor het nalezen en duiden van deze masterproef. Ook bedank ik graag alle mensen uit de vakgroep immunologie met wie ik op een of andere manier in contact ben gekomen. De goede sfeer zorgde ervoor dat ik me moeiteloos kon ontplooien. Een extra woord van dank gaat naar mijn ouders. Hun onvoorwaardelijke steun en hun luisterende oor betekenen zeer veel voor mij. Ik heb de mogelijkheid gekregen om diergeneeskunde te studeren en bovendien te mogen genieten van een geweldig studentenleven. Zonder hun al dan niet financiële hulp was dit alles me niet gelukt. Een goede student zijn en productief werken, zijn vaardigheden die niet tot uiting kunnen komen zonder de nodige afwisseling, ontspanning en afleiding. Voor deze verpozingen dank ik graag mijn zussen, vriendinnen en mijn vriend. Alle mooie momenten die we samen hebben beleefd, dragen bij aan mijn persoonlijke vaardigheden, waardoor ik ben kunnen uitgroeien tot de persoon die ik nu ben.
Een oprechte dank u wel, Katrien De Nys
INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING EN TREFWOORDEN ..................................................................................................................................... 1 INLEIDING .................................................................................................................................................................................. 2 LITERATUURSTUDIE................................................................................................................................................................. 3 1.
Voedselallergie .............................................................................................................................................................. 3
2.
Orale tolerantie en desensibilisatie ................................................................................................................................. 5
3.
Immunologische respons bij voedselallergie .................................................................................................................. 7
4.
3.1
Type I gemedieerde overgevoeligheid: vroege fase respons ............................................................................... 7
3.2
Type III en IV gemedieerde overgevoeligheid: late fase respons ......................................................................... 8
Allergeen-specifieke Immunotherapie ............................................................................................................................ 9 4.1
Algemeen............................................................................................................................................................ 9
4.2
Soorten immunotherapie ..................................................................................................................................... 9
5.
Sublinguale immunotherapie (SLIT) ............................................................................................................................. 10
6.
Immunologische respons na allergeen-specifieke sublinguale immunotherapie ........................................................... 11 6.1
Algemeen.......................................................................................................................................................... 11
6.2
Specifiek ........................................................................................................................................................... 13
6.2.1
Mastcellen en basofiele granulocyten ........................................................................................................... 13
6.2.2
Allergeen-specifiek IgE................................................................................................................................. 13
6.2.3
Allergeen-specifiek IgG1 en IgG4 ................................................................................................................. 14
6.2.4
IgA ............................................................................................................................................................... 14
6.2.5
T cel respons ............................................................................................................................................... 14
6.2.6
Cytokines ..................................................................................................................................................... 16
6.2.7
Intradermale huidtest.................................................................................................................................... 16
7.
Voor- en nadelen van SLIT .......................................................................................................................................... 16
8.
Immunotherapie verbeteren ......................................................................................................................................... 18 8.1
Antigeen-structuur en biologische functie .......................................................................................................... 18
8.2
Hypoallergene bereiding ................................................................................................................................... 18
8.2.1 8.2.1.1
Recombinante technologie ........................................................................................................................... 18 Tolerogene peptiden ........................................................................................................................... 19
8.2.1.2
Recombinante allergenen ................................................................................................................... 19
8.2.1.3
Fusie-eiwitten ..................................................................................................................................... 20
8.2.2
9.
Allergoïd: chemisch gemodificeerde allergenen ............................................................................................ 21
8.3
Mogelijk gebruik van adjuvantia en vector systemen bij SLIT ............................................................................ 21
8.4
Anti-IgE therapie ............................................................................................................................................... 23
Bespreking ................................................................................................................................................................... 24
ONDERZOEK ........................................................................................................................................................................... 27 1.
Inleiding ....................................................................................................................................................................... 27
2.
Materialen en methoden .............................................................................................................................................. 27
3.
2.1
Selectie van de dieren ....................................................................................................................................... 27
2.2
Randomisatie .................................................................................................................................................... 28
2.3
Studieprotocol ................................................................................................................................................... 28
2.4
Druppels met pindanotenextract en placebo ..................................................................................................... 29
2.5
Klinische evaluatie ............................................................................................................................................ 32
2.6
Immunologische testen ..................................................................................................................................... 32
2.6.1
³H-thymidine test: lymfocyten isolatie, proliferatie en restimulatie ................................................................. 32
2.6.2
Flowcytometrie: lymfocyten typering, proliferatie en restimulatie ................................................................... 35
2.6.3
ELISA voor pindanoten-specifiek IgE in het serum ....................................................................................... 36
2.6.4
ELISA voor pindanoten-specifiek IgE in het speeksel ................................................................................... 39
2.6.5
ELISA voor IL-10 .......................................................................................................................................... 39
Resultaten.................................................................................................................................................................... 41 3.1
Studie populatie ................................................................................................................................................ 41
3.2
Klinische evaluatie ............................................................................................................................................ 41
3.3
Studieprotocol ................................................................................................................................................... 41
3.4
Immunologische studies .................................................................................................................................... 41
3.4.1
³H-thymidine test: lymfocyten isolatie, proliferatie en restimulatie ................................................................. 41
3.4.2
Flowcytometrie: lymfocyten typering, proliferatie en restimulatie ................................................................... 43
3.4.3
Pindanoten-specifiek serum IgE ................................................................................................................... 50
3.4.4
Pindanoten-specifiek speeksel IgE ............................................................................................................... 51
3.4.5
IL-10 concentratie na in vivo immunisatie en na in vitro restimulatie van bloedlymfocyten met
pindanotenallergeen..................................................................................................................................................... 51 4.
Bespreking ................................................................................................................................................................... 52
REFERENTIELIJST .................................................................................................................................................................. 57 LIJST MET AFKORTINGEN...................................................................................................................................................... 61 LIJST MET FIGUREN ............................................................................................................................................................... 62 LIJST MET TABELLEN ............................................................................................................................................................. 63 BIJLAGEN................................................................................................................................................................................. 64
SAMENVATTING EN TREFWOORDEN Achtergrond: De exacte immunologische mechanismen die zorgen voor een succesvolle desensibilisatie bij sublinguale immunotherapie (SLIT) met voedselantigenen zijn nog onvoldoende grondig
gekend
bij
honden.
Doel van de studie: Het opzet van dit onderzoek was om het immuunsysteem verder te doorgronden en de immunomechanismen op te sporen die zorgen voor bescherming na een SLIT met pindanotenextract bij gezonde Beagles. Er werd geprobeerd om de sublinguale inductie van de orale tolerantie
te
ontcijferen.
Methode: In deze enkelblinde placebo-gecontroleerde studie werden 4 gezonde Beagles gedurende 7 weken dagelijks sublinguaal geïmmuniseerd met een opbouwende dosis pindanotenextract. De dosis allergeen bedroeg uiteindelijk
2000 µg. Immunologische parameters
werden geëvalueerd.
Resultaat: Alle vier de Beagles tussen de 3 en 9 jaar voltooiden zonder problemen de sublinguale toediening van pindanotenextract gedurende 7 weken. Immunologische testen toonden aan dat het percentage CD8+ CD4- lymfocyten steeg in de controlegroep, evenals hun proliferatiecapaciteit. De CD4+ CD8- lymfocyten daalden zowel in de controle groep als in de SLIT groep, maar het percentage bleef het hoogst in de SLIT groep, waar ze ook beter prolifereerden in vivo. Er kon geen pindanotenspecifiek IgE worden aangetoond in het serum of het speeksel gedurende de studie, evenals geen pindanoten-specifiek
IL-10
in
het
celcultuursupernatans.
Conclusie: Pindanoten-geïnduceerde SLIT bij gezonde honden toont weinig immunologische veranderingen na een 7 weken durende behandeling. De cellulaire immuunrespons vertoont een systemische daling van de CD4+ CD8- lymfocyten. Uitbreiding van de onderzochte immunologische parameters, evenals een langere therapieduur zijn vereist voor een meer uitgebreide opvolging van de sublinguale inductie van de orale tolerantie bij gezonde honden.
Trefwoorden: IgE, IL-10, lymfocyten, orale tolerantie, pindanoten, SLIT
INLEIDING Immunotherapie is een allergeen-specifieke behandeling die wordt toegepast bij IgE gemedieerde allergische aandoeningen, zoals atopie, astma, rhinitis en voedselallergie (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Door veelvuldig contact met het specifieke allergeen, vertrekkende van een lage dosis die gradueel wordt opgebouwd, wordt een wijziging van de immunologische respons bekomen. Hierdoor stijgt de drempelwaarde waarbij klinische symptomen optreden (1, 2, 3, 12, 13, 14). Hoe de immuunresponsverandering exact tot stand komt, is nog niet geheel opgehelderd (15). Voedselallergie is een relatief zeldzaam, maar progressief probleem (12, 15, 16, 17, 18) dat bovendien erge anafylactische reacties kan uitlokken (3, 16, 17). De behandeling bestaat uit het strikt vermijden van allergeenopname, gecombineerd met symptomatische therapie (3, 15, 16, 17, 18). Onderzoek heeft uitgewezen dat allergeen-specifieke immunotherapie een potentieel curatieve behandelingsoptie van voedselallergie kan zijn (5, 12, 13, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26). Subcutane immunotherapie wordt beschouwd als de conventionele therapie, maar vertoont frequent hevige nevenreacties. Er worden alternatieve routes gezocht en sublinguale immunotherapie (SLIT) is hier één van (10, 24, 27, 25). Deze veelbelovende therapie bevindt zich voor voedselallergie nog in een experimentele fase en aanwending in de praktijk is nog niet mogelijk (3, 12, 13, 14, 15, 23).
2
LITERATUURSTUDIE 1. Voedselallergie Voedselallergie is een significant probleem dat aan belangrijkheid wint, zowel bij de humane bevolking als bij de dieren (12, 15, 16, 17, 18). Voedselallergie treedt op wanneer de vorming van de orale tolerantie faalt of wanneer een bestaande tolerantie wordt doorbroken (28, 29). Hierdoor treed een incorrecte T helper 2 (Th2) respons op, waardoor allergeen-specifiek immunoglobuline (Ig) E en het aantal Th2 lymfocyten gaan stijgen (23). De ziekte kan primair zijn, maar kan ook een uiting zijn van atopie waarbij voedselbestanddelen de uitlokkende allergenen zijn (30). De prevalentie bij honden en katten is onbekend, maar de ziekte is eerder zeldzaam. Er is geen ras- en geslachtspredispositie (17, 30). De symptomen kunnen voorkomen op elke leeftijd, maar bij de helft van de patiënten worden klinische problemen opgemerkt voor de leeftijd van 1 jaar (17, 30). Gevoeligheid voor voedseleiwitten kan worden ingedeeld in twee categorieën: immunologische reacties en niet-immunologische reacties (Tabel 1). Voedselallergie wordt in de eerste categorie geclassificeerd (17, 18). Tabel 1: Gevoeligheid aan voedseleiwitten: classificatie (naar 17, 18).
Immunologische reactie
Niet-immunologische reactie
= voedselallergie (VA)
= voedselintolerantie (VI)
= voedselovergevoeligheid Type I
Voedsel idiosyncrasie (een kwantitatieve abnormale respons, kan aanwezig zijn bij een
IgE-gemedieerd Onmiddellijke overgevoeligheid Type III Immuuncomplex gemedieerd
eerste contact) Voedselintoxicatie en voedselvergiftiging Farmacologische en metabole voedselreacties ( v.b. deficiëntie van verteringsenzymen, ziektestatus, aangeboren
Intermediaire overgevoeligheid
problemen van het metabolisme)
Type IV Celgemedieerde Uitgestelde overgevoeligheid
3
De symptomen die gepaard gaan met voedselallergie kunnen van dermatologische of gastrointestinale aard zijn (17, 18, 30). De grote meerderheid van de patiënten vertonen huidproblemen (85 – 90 %) of darmproblemen (10 – 15 %). Een combinatie van beiden is eerder uitzonderlijk (30). De gastro-intestinale symptomen die kunnen ontstaan zijn braken, diarree, abdominale pijn en verhoogde defecatie frequentie (17, 18, 30). Bij huidproblemen is uitgesproken pruritus een belangrijke klinische parameter. Deze ontstaat plots, is constant aanwezig, is onafhankelijk van de opgenomen hoeveelheid allergeen, is niet seizoensgebonden en kan gegeneraliseerd of gelokaliseerd zijn op gezicht, oren, poten, oksels, inguinale of perianale regio. Otitis kan als enige symptoom aanwezig zijn (17, 18, 30). Belangrijk is ook dat de uiting van voedselallergie de indruk kan geven van andere huidaandoeningen (17, 18, 30). Als primaire huidletsels zijn urticaria aanwezig. Door de jeuk zal het dier automutilatie vertonen waarbij alopecie, eytheem, lichenificatie en hyperpigmentatie kunnen optreden. Secundaire bacteriële infecties of Malassezia dermatitis kunnen het geheel compliceren. Bij katten kan een typisch klinisch beeld optreden, waarbij lokale pruritus kan zorgen voor automutilatie aan de kop en hals, wat de meest voorkomende presentatie is. Daarnaast is zelftraumatische alopecie en het voorkomen van het eosinofiel granuloom complex ook mogelijk (17, 18, 30). De klinische symptomen kunnen aanhouden gedurende 6 tot 12 weken bij honden en katten (30). Differentiaal diagnostisch zullen andere ziekten die pruritus geven eerst moeten worden uitgesloten. Hierbij zijn behandeling tegen secundaire huidinfecties en vlooienpreventie van groot belang. Voedselallergie is slechts de laatste ziekte die aan bod komt op de lijst van differentiaaldiagnosen. Een conform jeukprofiel kan suggestief zijn: een acuut verloop van intense constante jeuk op jonge leeftijd die niet reageert op een behandeling met corticosteroïden zijn aanwijzingen dat het over voedselallergie kan gaan (30). De diagnose kan enkel met zekerheid worden gesteld op basis van een eliminatiedieet, gevolgd door een provocatiedieet. Aangezien de gastro-intestinale symptomen sneller verdwijnen dan de dermatologische symptomen, zal het dieet 2 – 4 weken respectievelijk 8 – 12 weken strikt moeten worden gevolgd. Wanneer de klinische symptomen verdwenen zijn, zal een positieve respons op het provocatiedieet voedselallergie kunnen bevestigen (17, 18, 30). De behandeling bestaat uit het zorgvuldig vermijden van allergeenopname (3, 15, 16, 17, 18). Een symptomatische behandeling kan ingesteld worden door het geven van medicatie zoals antihistaminica.
Antibiotica
kan
worden toegediend
bij
secundaire
bacteriële
infecties
en
levensbedreigende anafylactische shock kan enkel worden behandeld met epinefrine (3, 16, 17). Voedselallergie reageert weinig of niet op corticosteroïden behandeling. Er is onderzoek gedaan naar het gebruik van allergeen-specifieke immunotherapie bij voedselallergie. Deze immunotherapie is nog een vrij recente behandelingsoptie bij voedselallergie en klinische studies, zowel in vitro als in vivo, zijn nodig om meer duidelijkheid te bekomen (3, 13, 15, 21, 30). De studies lijken alvast veelbelovend en stellen dat immunotherapie de enige behandelingsoptie is die de oorzaak kan aanpakken. Sublinguale immunotherapie (SLIT) is een zeer goede therapeutische optie bij overgevoeligheid aan voedselallergenen (12, 13, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25).
4
2. Orale tolerantie en desensibilisatie Orale tolerantie kan worden gedefinieerd als een fenomeen waarbij een primaire blootstelling aan een antigeen via de enterische route zorgt voor een actieve onderdrukking van de immuunrespons, zowel lokaal als systemisch, zowel cellulair als humoraal. Herhaald contact met het specifieke antigeen (AG) heeft geen reactie van het lichaam tot gevolg (3, 17, 18, 28, 29). Bij normaal gezonde individuen wordt geen reactie gezien na inname van voedseleiwitten per os omdat de orale tolerantie gestimuleerd wordt. Wanneer voedingseiwitten worden opgenomen, zullen het maagzuur en verteringsenzymen zodanig inwerken op deze antigenen, dat de conformationele epitopen bij het grootste deel van de eiwitten worden vernietigd voordat ze in de darm terechtkomen. Echter iets minder dan 10 % van onze voedselantigenen bereikt intact of als immunogene epitopen het intestinaal mucosaal immuunsysteem. Het darm-geassocieerde mucosaal immuunsysteem is de basis voor de tolerantie-inductie door zowel een cellulaire als humorale immuunresponsen te initiëren. De inductieve plaatsen voor de mucosale afweer bestaan uit georganiseerd mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel (MALT) en lokale en regionale lymfeknopen. De M cellen in de Peyerse platen nemen AG’en op en leveren deze aan antigeen presenterende cellen (APC’en), zoals de dendritische cellen. De epitheliale cellen kunnen eveneens fungeren als niet-specifieke APC’en wanneer ze major histocompatibiliteitsmolecule klasse II (MHC II) aan hun celoppervlak presenteren. Oplosbare AG’en kunnen trans- of paracellulair het epitheel doorkruisen en rechtstreeks aan macrofagen of T cellen binden. Via de APC’en wordt het AG aangeboden aan naïeve T cellen die hierdoor worden geactiveerd en cytokines secreteren die de immuunrespons verder sturen (24, 29, 31). Bij individuen die niet gevoelig zijn aan bepaalde allergenen zal de immuunrespons zo verlopen dat er een T helper 1 (Th1) respons plaatsvindt na het activeren van naïeve T cellen. Hierbij wordt IL-2 en voornamelijk interferon gamma (IFN-γ) gesecreteerd (3). Verder worden eveneens regulatorische T cellen (Treg) geactiveerd die normaliter een suppressie van de immuunrespons veroorzaken. Naïeve B-cellen zullen ook in contact komen met het antigeen en in aanwezigheid van de cytokines (IL-2 en IFN-γ) verder differentiëren tot antistof secreterende plasmacellen die onder andere IgG, IgA en secretorisch IgA (sIgA) produceren. De geactiveerde B en T cellen zullen respectievelijk als plasmacellen en effector T-cellen naar de effectorplaatsen migreren, waar ze extravaseren en de immuunrespons verder versterken. De effectorplaatsen worden gevormd door verschillende compartimenten, zoals de lamina propria van de mucosae, exocriene klieren en het oppervlakte epitheel (3, 24, 29, 31). Voedselallergie treedt op wanneer er een doorbraak is in de orale tolerantie of wanneer er een probleem is met het ontwikkelen van orale tolerantie (29). Overgevoeligheid van een individu wordt beïnvloed door verschillende factoren: het genotype en de leeftijd van het individu, het antigeen, de antigeenconcentratie en het cytokine milieu (3, 29). Belangrijk om orale tolerantie te verkrijgen is 1) een intacte gastro-intestinale barrière: dit gaat gewoonlijk gepaard met afwezigheid van ontsteking en dus gevaarsignalen en 2) de dosis antigeen die in contact komt met het immuunsysteem. Een lage dosis allergeen kan het immuunsysteem aansturen naar protectieve immuniteit. De Treg cellen migreren naar lymfoïde organen en zorgen voor een hoge productie aan niet-antigeen specifieke onderdrukkende cytokines: interleukine (IL)-4, IL-10 5
en vooral transforming growth factor β (TGF-β). Hierdoor wordt de productie van IgA gestimuleerd, dat wordt vrijgelaten op de mucosale oppervlakken. Dit sIgA bindt de AG’en en verhindert verdere interactie. Bij een hoge dosis AG treedt een hoge dosis tolerantie op, die resulteert in lymfocyten anergie of klonale deletie (17, 18, 28, 29, 32, 33, 34). Anergie is een mechanisme dat postembryonaal ontstaat. Hierbij verkeren de allergeen-specifieke lymfocyten in een rusttoestand, waarbij ze niet reageren op de aanwezigheid van AG’en. Dit wordt veroorzaakt doordat de APC’en niet geactiveerd zijn en geen costimulatorische signalen geven. Deze reactie van de T cellen vindt plaats buiten de thymus. Bij de B lymfocyten kan anergie plaatsvinden zowel in het beenmerg als in de periferie. De B cellen rijpen niet verder en de expressie van IgM receptoren daalt. Klonale deletie is een reactie van het immuunsysteem die voorkomt onder de vorm van Fas-gemedieerde apoptose. Hierbij bindt de Fas-ligand, die zich bevindt op een CD8+ cytotoxische T cel, met Fas op de doelwitcel. Na een reeks reacties wordt het DNA van de doelwitcel verknipt, waardoor apoptose optreedt. Hoge en lage dosis tolerantie kunnen echter ook overlappen. Orale tolerantie is een proces dat niet is aangeboren, maar dat zich ontwikkelt op jonge leeftijd wanneer mens en dier voeding beginnen op te nemen (3, 29, 32, 35). Het ultieme doel van immunotherapie is permanent klinische tolerantie bekomen. Dit houdt in dat de behandeling zorgt voor verandering van de immuunrespons (immunomodulatie). Hierdoor kan het individu het allergeen opnemen zonder er een schadelijke reactie op te vertonen, zelfs indien de immunotherapie wordt gestopt. Er vindt een reactie van de regulatorische T cellen (Treg), ook wel suppressie T cellen, plaats en een verschuiving in het voordeel van de T helper 1 cellen (Th1) in plaats van de proallergene T helper 2 cellen (Th2). Allergeen-specifieke T cellen kunnen tevens anergie ondergaan. Het is nog onzeker of het gaat over natuurlijke orale tolerantie, wat een spontaan proces is dat ervoor zorgt dat mens en dier niet reageren op elke stof die peroraal wordt opgenomen, of therapeutische tolerantie. Meestal echter wordt desensibilisatie bekomen in plaats van tolerantie. Hierbij wordt de drempelwaarde verhoogd en zal de patiënt geen klinische symptomen vertonen bij bepaalde lagere dosissen van het allergeen, maar wel bij hogere dosissen. Om dit te bereiken zijn een regelmatig gecontroleerde opnamen van het allergeen nodig, waardoor het immuunsysteem continu wordt getriggerd. Stoppen met de immunotherapie staat gelijk aan hervallen van de klinische symptomen bij contact met het allergeen (13, 15, 21).
6
3. Immunologische respons bij voedselallergie 3.1
Type I gemedieerde overgevoeligheid: vroege fase respons
Figuur 1: Vroege (type I) fase respons bij allergeen contact (3)
Figuur 2: Mechanisme van voedselallergie (13)
7
Voedselallergie kenmerkt zich door een onmiddellijke overgevoeligheid ten opzichte van bepaalde allergenen, een type I IgE gemedieerde overgevoeligheid. Deze is voor meer dan 60% verantwoordelijk voor de symptomen en de reactie op voedselantigenen (13). Wanneer een individu voedsel opneemt, zullen de proteïnen de intestinale barrière doorkruisen. Ze worden opgenomen door antigeen presenterende cellen (APC) die de exogene AG’en als peptiden samen met MHC II op hun oppervlak presenteren aan T-cellen. De T cel receptor (TCR) interageert met het specifieke MHC II/peptide complex en er is co-stimulatie van CD28 op de T cel met B7 (CD80 of CD86) op de APC. Wanneer hier bijkomend interleukine 4 (IL-4) aanwezig is, zal de naïeve T cel differentiëren in een proallergene T helper 2 lymfocyt (Th2 cel). Deze Th2 cel produceert IL-4, IL-5 en IL-13 die zorgen voor een isotype omschakeling van IgM naar IgE bij rustende B cellen. De B cellen worden plasmacellen en gaan allergeen-specifieke IgE produceren dat direct gaat binden aan de hoge affiniteitsreceptor Fcε (FcεRI) op mastcellen in de weefsels en basofielen in het bloed. Het individu is nu overgevoelig aan het allergeen. Wanneer het specifieke antigeen wederom wordt opgenomen, zal het direct binden aan twee naburige allergeen-specifieke membraangebonden IgE moleculen op mastcellen. Deze kruisverbinding is essentieel om de mastcellen te activeren. Er vindt een bifasische respons plaats met een vroege en een late reactie. De onmiddellijke degranulatie van de mastcellen staat in voor de vroege fase respons (Figuur 1): hierdoor wordt de type I overgevoeligheidsreactie ingezet, waarbij ontstekingsmediatoren zoals histamine, leukotriënen en prostaglandinen worden vrijgesteld (1, 3, 13, 17, 23, 36). Dit alles gebeurt binnen enkele minuten tot enkele uren na opname van het allergeen. Als symptomen worden urticaria, angio-oedeem, braken en diarree gezien, zelfs fatale anafylaxie kan optreden (1, 13, 17, 36) (Figuur 2). Meer recent is er een nieuwe T helper cel geïdentificeerd: IL-17 producerende Th17 cel. Deze cel komt voor bij autoimmune ziekten, zoals arthritis en encefalomyelitis, en Th2 gemedieerde allergieën, zoals asthma, allergische rhinitis, conjunctivitis, allergische dermatitis en voedselallergie (37). 3.2
Type III en IV gemedieerde overgevoeligheid: late fase respons
Bij de bifasische respons, die optreedt na contact met het specifieke allergeen bij gevoelige individuen, treedt er naast de onmiddellijke overgevoeligheidsreactie tevens een late fase respons op (3, 23). Deze intermediaire tot uitgestelde inflammatiereactie wordt veroorzaakt door een type III en type IV overgevoeligheidsreactie op de voedingseiwitten. Frequent vertonen honden en katten slechts symptomen enkele uren tot dagen nadat de specifieke allergenen opgenomen werden (17, 23, 30). De type III overgevoeligheid is van systemische aard. Antistoffen vormen immuuncomplexen met AG’en in de circulatie. In het kader van voedselallergie is er bijkomend bijdrage van mastcellen, basofielen en eosinofielen die zorgen voor het loslaten van vasoactieve aminen. Deze vasodilatorische stoffen doen de
vasculaire
permeabiliteit
stijgen,
waardoor
de
immuuncomplexen
zich
opstapelen
in
bloedvatwanden en weefsels. De immuuncomplexen kunnen ontstekingscellen, voornamelijk polymorfonucleaire leukocyten (neutrofielen, eosinofielen en basofielen), aantrekken en complement activeren, wat inflammatie en weefselschade veroorzaakt. Drie tot acht uur na AG opname, treden verschillende symptomen op: zwelling, jeuk, erytheem en warmte in de huid, braken en diarree door aantasting van de intestinale permeabiliteit (3, 17, 23, 26, 30). De type IV overgevoeligheidsreactie is 8
maximaal na vierentwintig tot achtenveertig uur. Deze topische reactie ontstaat na presentatie van AG door APC’en aan T lymfocyten. Er wordt een perivasculaire inflammatiereactie gezien met voornamelijk monomorfonucleaire cellen (lymfocyten en monocyten). De symptomen zijn erytheem en lichenificatie (3, 17, 23, 30) (Figuur 2).
4. Allergeen-specifieke Immunotherapie 4.1
Algemeen
Immunotherapie is een behandelingsprocedure die in het bijzonder kan worden gebruikt bij IgE gemedieerde allergische aandoeningen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11). Het betreft een allergeenspecifieke benadering. Er wordt gestreefd naar een verhoging van de drempelwaarde waarbij klinische symptomen optreden na opname van het voedselallergeen. Door herhaald contact met een stijgende dosis van het specifieke antigeen, wordt een wijziging in de immunologische respons bekomen. Hierdoor ontstaat een reductie van de klinische symptomen die optreden na al dan niet accidentele opname van het allergeen. Bovendien dient een minder strikt dieet te worden gevolgd en wordt gestreefd naar een reductie van het medicatiegebruik (1, 2, 3, 12, 13, 14). Immunotherapie is op dit moment de enige behandelingsoptie die de oorzaak aanpakt en die bovendien potentieel curatief kan zijn. Deze veelbelovende therapie bevindt zich voor voedselallergie nog in een experimentele fase en aanwending in de praktijk is nog niet mogelijk (3, 12, 13, 14, 15, 23). 4.2
Soorten immunotherapie
Allergeen-specifieke methoden voor immunisatie zijn momenteel veelbelovende therapieën, maar staan nog in hun kinderschoenen voor voedselallergie. Reeds kunnen vier handelswijzen worden gevolgd (13, 15). Als eerste is er de subcutane immunotherapie (SCIT). Deze wordt beschouwd als de standaard procedure, in het bijzonder bij overgevoeligheid aan bijengif en respiratoire allergie (13, 38). Patiënten worden regelmatig subcutaan geïnjecteerd met een stijgende concentratie allergeen extracten. Na deze fase wordt de maximum verdraagbare dosis regelmatig heringespoten, zodat de immuunrespons onderhouden blijft (3, 12, 15). Als tweede therapie is er de orale immunotherapie (OIT). Er wordt gewerkt volgens een bepaald protocol waarbij voedselproteïnen onder de vorm van een poeder peroraal moeten worden ingenomen. Het antigeen komt in contact met de gastro-intestinale mucosa die de immuunrespons regelt. De hoeveelheid die dagelijks moet worden ingenomen ligt tussen een aantal milligram tot enkele grammen van het allergeen. De opbouw van de dosis antigeen kan geleidelijk gebeuren, over weken tot maanden of abrupt over het verloop van enkele dagen onder monitoring en goede supervisie. Hierna moeten de patiënten thuis dagelijks een bepaalde dosis allergeen consumeren (1, 12, 13, 15, 16, 21).
9
Sublinguale immunisatie (SLIT) kan worden gebruikt als therapie bij onder andere atopische dermatitis (39, 40, 41, bijlage 1), respiratoire allergieën (38, 42) en voedselallergie (12, 15, 39). Er worden kleine hoeveelheden (van microgrammen tot milligrammen) allergeen-oplossing gemaakt onder de vorm van vloeistoffen, gels, crèmes, tabletten of sprays (13, 43). Deze allergeenextracten worden gedurende enkele minuten onder de tong geplaatst alvorens het geheel in te slikken of uit te spuwen (12, 13, 20, 44). Ook hier kan er worden gesproken over een opbouwfase onder kliniekomstandigheden, gevolgd door dagelijkse opname thuis, de onderhoudsfase (13). Als laatste maatregel is er nog de epicutane immunotherapie (EPIT). Hierbij wordt een patch op de huid gekleefd waarop allergeen is aangebracht. Het stratum corneum zal deze oplossing absorberen. De epidermis heeft eigenschappen die zeer interessant zijn voor antigeenopname en immuunrespons. Het epitheel is niet gevasculariseerd, meerlagig en heeft een opmerkelijke weerklank in het immuunsysteem, waarbij Langerhanscellen zorgen voor AG opname en de activiteit van de T-cellen stimuleren (13).
5.
Sublinguale immunotherapie (SLIT)
In de humane geneeskunde worden reeds sublinguale oplossingen of tabletten met inhalatie allergenen commercieel gebruikt. Er is onderzoek gedaan naar het gebruik van SLIT bij voedselallergie. Interessante resultaten zijn bekomen met extracten van kiwi, hazelnoten, perzik, koeienmelk en pindanoten (13). Sublinguale immunotherapie verloopt in twee fasen: de opbouwfase en de onderhoudsfase. Tijdens de opbouwfase zal de patiënt een oplossing of tablet krijgen waarin een bepaalde concentratie allergeen verwerkt zit. Dit wordt gedurende enkele minuten onder de tong geplaatst, waarna het wordt ingeslikt of uitgespuwd. De allergeenconcentratie wordt gedurende de eerste fase geleidelijk aan opgedreven tot een bepaalde doeldosis bereikt is. Bij elke dosiswijziging wordt de patiënt nauwgezet gemonitord op nevenreacties. Wanneer een reactie op de verhoogde dosis uitblijft, moet deze allergeendosis thuis gedurende enkele weken dagelijks worden ingenomen. Dit proces kan geleidelijk verlopen, over verschillende weken tot maanden, maar er kan ook een versnelde procedure plaatsgrijpen. Hierbij vindt de dosisverhoging en het bereiken van de doeldosis plaats in enkele dagen tijd. Tijdens de opbouwfase moeten de patiënt en zijn omgeving op hun hoede zijn voor ongunstige reacties als gevolg van de therapie (12, 13, 20, 44). De symptomen die dan optreden zijn voornamelijk van lokale aard: zwelling en jeuk van de lippen, het gebied onder de tong en de orofarynx. Systemische reacties, zoals urticaria, angio-oedeem en astma, komen slechts zeer zelden voor. Erge anafylactische shock kan worden behandeld met een injectie epinefrine. Het optreden van neveneffecten is voornamelijk allergeen- en dosis-afhankelijk. Wanneer erge anafylactische reacties worden verwacht of wanneer een rush protocol wordt toegepast, vindt het proces plaats in een gecontroleerde omgeving, zoals een ziekenhuis
(3, 13, 25). De onderhoudsfase gaat van start
wanneer de patiënt de inname van een bepaalde doeldosis van het AG heeft bereikt. Deze dosis dient dagelijks ingenomen te worden gedurende enkele maanden of jaren (12, 13, 20, 44). 10
Sommige studies gebruiken de combinatie van SLIT en OIT. Het allergeenextract wordt gedurende een bepaalde tijd onder de tong geplaatst, waarna het wordt ingeslikt. Deze combinatie lijkt zeer effectief te zijn. De efficaciteit is hoger, maar er treden vaker nevenreacties op dan bij het gebruik van SLIT alleen (13). 6. Immunologische respons na allergeen-specifieke sublinguale immunotherapie 6.1
Algemeen
Figuur 3: De werking van het immuunsysteem ter hoogte van de orale mucosa na sublinguale immunotherapie (38).
11
Hoe de immuunresponsverandering exact tot stand komt bij SLIT, is nog niet geheel opgehelderd (19, 45). Het mucosaal immuunsysteem vormt een eerste hindernis bij de verdediging van het lichaam tegen vreemde antigenen (Ag). Hierdoor wint het aan belangstelling als een route voor allergeenspecifieke immunotherapie of vaccinatie (27, 31, 46). De mucosa onder de tong heeft specifieke eigenschappen. De orale mucosa zelf maakt deel uit van het geavanceerd netwerk van mucosale immuniteit. Het bevat zowel inductieve plaatsen (MALT, lokale en regionale lymfeknopen) als effector plaatsen (oppervlakte epitheel, mucosa van de lamina propria en het stroma van de exocriene klieren) (24). Bij sublinguale immunotherapie worden antigenen, waarop het individu aanvankelijk reageert, onder de tong geplaatst. Deze kleine moleculen worden opgenomen door APC’en binnen de 15 – 30 minuten en aan hun celoppervlak gepresenteerd. In muizen zijn deze cellen in kaart gebracht. Er zijn drie soorten antigeen presenterende orale dendritische cellen aanwezig: 1) de Langerhanscellen zijn aanwezig in de mucosa zelf, 2) myeloïde dendritische cellen bevinden zich in de lamina propria, 3) plasmacytoïde dendritische cellen verblijven in de submucosa. Bij de mens zijn de myeloïde en plasmacytoïde dendritische cellen schaarser. Deze drie soorten zijn allen tolerogeen. Hiermee wordt bedoeld dat ze ook IL-10 en IL-12 produceren en zo naïeve T cellen aansturen tot vorming van Th1 cellen en Tregs (1, 12, 23, 31, 38, 42, 46, 47, 48, bijlage 1). Hierdoor worden allergische reacties en ontstekingen snel in de kiem gesmoord. Dendritische cellen worden gezien als de primaire doelcellen bij SLIT. Ze migreren naar de lamina basalis en lamina propria waar AG wordt gepresenteerd aan effector T-cellen, waarna een directe reactie volgt. Ook worden ze via de afferente lymfevaten getransporteerd naar de drainerende lymfeknopen, waar ze zullen aankomen na 12-24 uur. Naïeve Tcellen zullen worden omgevormd tot T-helper 1 cellen en Tregs, dankzij hun tolerogene eigenschappen. Deze omvorming gebeurt zowel door direct cel-contact als door cytokines: IL-10 en transforming growth factor β (TGF-β). In het spierweefsel van de mondholte zijn ook mastcellen en eosinofielen aanwezig, maar slechts in beperkte mate (1, 12, 23, 31, 38, 42, 46, 47, bijlage 1) (Figuur 3). Aangeboren en verworven immuniteit maken gebruik van Toll-like receptoren (TLR). Deze zorgen voor de downregulatie en modulatie van de immuunrespons. Orale DC’s vertonen hoge concentraties van TLR op hun celoppervlak, vnl. TLR-2 en TLR-4. Wanneer pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) hierop binden, zal een productie van inflammatoire cytokines, INF type I en chemokines plaatsvinden. Eveneens zal door de interactie een versterking optreden van de costimulatorische signalen op de APC’en, hier de dendritische cellen, wat essentieel is voor de inductie van een verworven immuunrespons (10, 27, 29). Bij immunotherapie is er een gecontroleerd contact met een stijgende concentratie allergeen, waardoor de immuunrespons wordt gemoduleerd (2, 13). Dit uit zich door een aantal immunologische veranderingen, zoals een suppressie van de activiteit van mastcellen, basofiele en eosinofiele granulocyten in het bloed, reductie van het allergeen-specifiek IgE en een stijging van de allergeenspecifieke IgG1 en IgG4 in het serum (3, 10, 12, 13, 21, 23, 45). Er is productie van allergeenspecifiek IgA in de weefsels en het bloed en van secretorisch IgA (sIgA) op mucosale oppervlakken (3, 10, 23, 36, 38, bijlage 1). Ook is er stimulatie van de regulatorische T cellen (Treg) en een omzetting van T helper 2 cellen (Th2) naar T helper 1 cellen (Th1) in het bloed en de orale mucosa (3, 10, 12, 13, 15, 21, 23, 36, 45). Allergeen-specifieke Th cellen kunnen anergie ondergaan en apoptose van 12
Th2 cellen kan plaatsvinden (3, 23). De resultaten na immunotherapie zijn voornamelijk te wijten aan de reductie van IL-4, IL-5 en IL-13, door een daling van de Th2 cellen, en de toename van IL-10 en TGF-β door Tregs (12, 19) (Figuur 4). De immunologische veranderingen gezien na SLIT zijn gelijkaardig aan deze na SCIT (12, 24, 38, 45), behalve wat de lokale veranderingen in de orale mucosa betreft die enkel worden gezien na SLIT, o.a. sIgA, mastcellen en nTreg cellen (3, 10, 13, 24, 27, 38, 42, 45). Deze immunologische veranderingen zijn allen opgemerkt na SLIT onderzoeken bij mensen.
Figuur 4: Celspecifieke aanpassingen na immunotherapie en de gevolgen hiervan (naar 3).
6.2
Specifiek 6.2.1 Mastcellen en basofiele granulocyten
Er vindt een significante daling plaats van de rekrutering en reactiviteit van inflammatoire cellen, zoals mastcellen in de orale mucosa en basofielen in het bloed enkele maanden na het gebruik van SLIT (12, 13, 15, 23, 24, 38, 45). Een aantal artikels vernoemen een tijdsspanne van 12 maanden waarna de reductie significant is (12, 13). 6.2.2 Allergeen-specifiek IgE Allergeen-specifiek IgE is belangrijk om allergie te evalueren. Initieel vindt er een stijging plaats gedurende enkele maanden, 4 maanden volgens bepaalde artikels (12, 13, 15), gevolgd door een significante daling van het allergeen-specifiek IgE in het bloed. De IgE daling hangt niet altijd samen met een daling van de klinische symptomen (3, 12, 13, 23, 24, 38), wat ook wordt waargenomen bij muizen (50). Bij deze diersoort wordt na een 9 wekend durende SLIT behandeling voor rhinitis niet
13
alleen een daling van het allergeen-specifiek IgE vastgesteld in het bloed (24, 49, 50), maar ook lokaal (50). 6.2.3 Allergeen-specifiek IgG1 en IgG4 De concentratie van beide antistoffen stijgt opmerkelijk (3, 12, 13, 15, 23, 24, 38, 45, bijlage 1) binnen de 4 (44) à 12 maanden (12, 15) na SLIT. IgG wordt gezien als een blokkerende antistof die antigenen zal binden en afschermen, waardoor de allergenen niet worden opgenomen door dendritische cellen. Eveneens zal het allergeen-specifieke IgE, dat reeds op de mastcellen en basofielen aanwezig is, het antigeen niet kunnen binden, waardoor er wordt behoed voor degranulatie en vrijlating van ontstekingscellen (3, 12, 13, 15, 23, 24, 38, bijlage 1). Ook bij muizen is vastgesteld dat er een inductie van IgG1 en IgG4 ontstond als reactie op een SLIT (49, 50). De effectiviteit van allergeenspecifiek IgG hangt af van de IgE/IgG4 ratio. De daling van deze verhouding bij immunotherapie is te wijten aan de stijging van IL-10. Dit cytokine zorgt voor een stijging van de IL-4 geïnduceerd IgG4 productie langs de ene kant en een daling van de isotype omzetting van IgM naar IgE ook mede door IL-4 aan de andere kant (23) (Figuur 4). 6.2.4 IgA Een bijkomend voordeel van het gebruik van SLIT is dat allergeen-specifiek IgA zal stijgen in het serum. Het secretorisch IgA (sIgA) zorgt speciaal voor bescherming ter hoogte van mucosale oppervlakken, waar het interfereert met de AG penetratie doorheen de mucosae (3, 24, 36, 38, bijlage 1). Dezelfde bevindingen zijn geconstateerd na SLIT bij muizen (49), waar tevens een stijging is opgemerkt van het allergeen-specifiek IgA en sIgA gehalte in het speeksel (23, 51). 6.2.5 T cel respons Sublinguale immunisatie zorgt voor perifere tolerantie van de effector T cellen op twee manieren: 1) door inductie van antigeen-specifieke Tregs cellen als reactie op lage dosissen AG; zowel de vermenigvuldiging van de effector T cellen als hun cytokineproductie wordt tegengegaan, en 2) door anergie en klonale deletie te initiëren bij de effector T cellen na contact met hoge dosissen AG (17, 18, 28, 29, 32, 33, 34). Tregs, ook wel suppressor T cellen genoemd, spelen een hoofdrol bij de homeostase van de immuunrespons. Dit wordt bereikt door productie van anti-inflammatoire cytokines zoals IL-10 en TGFβ. Hierdoor wordt tolerantie bekomen in allergeen-specifieke T cellen. Er wordt een daling gezien van het aantal effector T cellen in de perifere lymfeknopen. De acties van Tregs worden voornamelijk geïnitieerd na apoptose van CD4+ T effectorcellen bij gebrek aan IL-2 dat normaal wordt geproduceerd door de Th1 lymfocyten (3, 23, 24, 28, 33, 38, 52, 53). Binnen de CD4+ T cel subpopulatie worden drie soorten Tregs onderkend. De eerste subpopulatie zijn de natuurlijk voorkomend Tregs (nTregs). Deze nTregs worden gekenmerkt door typische oppervlakte moleculen: CD4+, CD25+ en ze overleven tevens selectie in de thymus. Een anergeen fenotype, een hoge expressie van de IL-2 receptor en de expressie van een bepaalde transcriptiefactor (forkhead box p3: FoxP3) typeren deze CD4+ CD25+ regulatorische T cel. De transcriptiefactor staat in voor de
14
ontwikkeling en suppressieve functie van de nTregs, waardoor de reactie van Th1 en Th2 cellen kan belet worden. Er wordt tolerantie gecreëerd tegen vreemde AG’en door suppressie van de T-helper cellen, APC, B cellen en monocyten. NTregs zijn niet-antigeen specifiek en hun activatie hangt, net zoals de effector T cellen, af van het TCR/CD3 complex. Individuen die mutant zijn aan nTregs ontwikkelen een erge inflammatierespons over verschillende organen, waardoor dysregulatie van Th1 en Th2 cellen optreedt en een meer uitgesproken IgE productie. Dit uit zich onder andere in verschillende voedselallergieën, atopische dermatitis en astma (3, 23, 24, 28, 32, 33, 38, 52, 53). De tweede en derde populatie van Tregs zijn de Th3-cel en type 1 Treg (TR1). Het zijn beiden antigeenspecifieke of geïnduceerde Tregs die zich ontplooien als reactie op herhaalde stimulatie van een exogeen AG via een APC en cytokine vrijstelling. Ze worden geïnduceerd in de periferie. Deze cellen produceren respectievelijk TGF-β en IL-10. TGF- β is verantwoordelijk voor de suppressie van mastcellen, basofielen, eosinofielen en dendritische cellen, de onderdrukking van de Th2 cellen en de inductie van de IgA productie. IL-10 regelt de inductie van IgG4. Wanneer er een deficiëntie is opgetreden in deze beide lymfocytensoorten, ontwikkelen de individuen hevige Th2 pathologieën in de longen en gastro-intestinaal (3, 23, 24, 28, 32, 38, 52, 53, 54) (zie punt 2: Orale tolerantie en desensibilisatie) (Figuur 4). Verschillende artikels zijn het erover eens dat TGF-β onontbeerlijk is voor de tolerantie-inductie via de orale mucosa bij muizen en ratten. De rol van IL-10 daarentegen in nog niet volledig uitgeklaard (54). Ook T cel anergie wordt bekomen na immunotherapie. Dit houdt in dat allergeen-specifieke T cellen geen gevolg gaan geven aan contact met AG’en, nadat ze daarvoor eerst in aanraking geweest zijn met hoge dosissen van dit specifiek AG. Dit AG-geïnduceerde antwoord van de T cellen wordt opvallender naarmate de proliferatie van de T cellen na allergeen-specifieke immunotherapie vermindert. De reden voor de anergie is de afwezigheid van costimulatorische signalen die normaliter worden geleverd door IL-2 of door signalen die ontstaan tussen receptoren van de T cellen en de APC’en. Herhaalde hoge dosissen van AG kunnen eveneens apoptose induceren, voornamelijk bij de Th2 cellen. Deze geprogrammeerde celdood is te wijten aan een gebrek van IL-2 en andere overlevingsfactoren (3, 23, 29, 34, 35) (Figuur 4). Algemeen kan worden gesteld dat door de immunotherapie een stimulatie van de Treg cellen plaatsvindt, zowel in het bloed als in de orale mucosa en een downregulatie van de proallergene Th2 respons. Er speelt zich een verschuiving af in het voordeel van de Th1 cellen in plaats van de Th2 cellen, waardoor de productie van IFN-γ zal stijgen en van IL-4, IL-5 en IL-13 zal dalen. Hierdoor komt de klinische en immunologische tolerantie dichterbij. Deze veranderde T cel activiteit correleert meestal goed met klinische verbetering (1, 3, 12, 13, 15, 32, 36, 38). Studies op muizen bevestigen de beweging van de Th2 naar de Th1 respons en de inductie van IL-10 producerende Treg cellen (48). De downregulatie van de Th2 cellen wordt bij muizen eveneens geconstateerd in de lokaal drainerende cervicale lymfeknopen, maar niet in de milt. Deze vaststelling suggereert dat de T cel respons bij muizen zich overwegend lokaal bevindt (50). Ook bij mensen is een lokale stijging van de nTreg cellen aan het licht gekomen na het nemen en onderzoeken van sublinguale biopten voor en na een SLIT (45).
15
6.2.6 Cytokines Na immunotherapie wordt een systemische daling waargenomen van allergeen-specifieke T cellen en tevens van de IL-4, IL-5 en IL-13 productie (Th2 cellen). Aan de andere kant wordt een stijging van de IL-10 en TGF-β productie vastgesteld, o.a. door de regulatorische T cellen (3, 12, 13, 15, 44). Bij muizen wordt eveneens een daling van de systemische Th2 cytokines vastgesteld (49) en een stijging van IL-10, geproduceerd door Treg cellen (48). Sommige artikels vermelden een significante daling van IL-5 na 12 maanden (12, 13) en een stijging IL-10 na 4 maanden SLIT (44). Andere artikels konden geen significante veranderingen aantonen bij IL-13, IL-10, IFN-γ tussen de behandelde groep en de controle groep na 12 maanden therapie (12). 6.2.7 Intradermale huidtest De intradermale huidtest geeft een idee over de mastcelactivatie in de huid. Deze toont dat de reactiviteit van de huid daalt en de oedeemvorming duidelijk vermindert 12 maanden (15, 23) na een SLIT behandeling (12, 13, 15).
7. Voor- en nadelen van SLIT Immunotherapie brengt een aantal risico’s met zich mee, waaronder het gevaar voor anafylactische reacties. Dit neveneffect komt voornamelijk voor bij SCIT en af en toe bij OIT (3, 13). Studies hebben uitgewezen dat het risico hierop kleiner is en eventuele reacties zeer mild tot onbestaande zijn bij het gebruik van SLIT. Bijgevolg is de toepassing van SLIT veiliger (3, 12, 13, 20, 38, 42, 55, bijlage 1). Dit kan worden verklaard door het immunologisch mechanisme ter hoogte van de orale mucosa. AG’en worden sublinguaal opgenomen door APC’en in de bovenste lagen van de mucosa. Aangezien de allergenen de bloedbaan niet bereiken, veroorzaken ze minder systemische effecten. Verder zijn er in de mondholte slechts een klein aantal mastcellen en eosinofielen aanwezig, waardoor anafylactische reacties minder frequent voorkomen. De APC’en bezitten bovendien tolerogene eigenschappen, waardoor er mogelijkheid is tot tolerantie-inductie. Deze karakteristieken zorgen voor een goed klinisch effect en zijn mede een verklaring voor de grotere veiligheid (3, 13, 24, 27, 38, 42). Wanneer de efficaciteit wordt vergeleken tussen verschillende immunotherapieën, wordt deze van SCIT en SLIT gelijkgesteld. Wel dient de opmerking te worden gemaakt dat de gebruikte allergeendosis bij SLIT 50 tot 100 keer hoger moet zijn dan deze gebruikt bij SCIT om een gelijkaardige efficaciteit te vertonen (3, 10, 38, 42). Van SCIT wordt gezegd dat de efficaciteit 67 – 100% bedraagt, dat de immuunrespons goed wordt gemoduleerd en de symptomen duidelijk dalen (13). Hiertegenover staat dat de effectiviteit van OIT ten opzichte van SLIT hoger is (13, 25, 38). Dit komt mede doordat de allergeendosis bij SLIT 1000 keer lager is dan bij OIT (21). De lagere dosis die kan worden gebruikt bij SLIT heeft te maken met het kleine volume dat sublinguaal kan worden gegeven. Dit heeft als voordeel dat er minder snel nevenreacties optreden, maar als nadeel dat de maximale dosis gelimiteerd is (23).
16
SLIT is een niet-invasieve methode die pijnloos is (24) en de sublinguale oplossingen, druppels of tabletten zijn eenvoudig toe te dienen (3, 24). Een bijkomend voordeel is dat sIgA wordt gesecreteerd ter hoogte van de mucosa, wat niet gebeurt na SCIT (3, 13, 24, 27, 38, 42). Na langdurig gebruik van OIT kunnen echter hogere drempelwaarden worden bereikt dan bij SLIT. De immunologische veranderingen zijn ook groter na OIT. Zo wordt een grotere daling van specifiek IgE vastgesteld, de IgE/IgG4 ratio is kleiner en basofielen en mastcellen zijn inactiever (13). Voor de behandeling van voedselallergie wordt tegenwoordig het meeste onderzoek gedaan naar het gebruik van OIT (13). Algemeen kan worden gesteld dat SLIT wordt aanvaard als een waardig alternatief voor de conventionele SCIT (10, 24, 25, 27).
Tabel 2: Samenvatting van de voor- en nadelen van verschillende immunologische technieken (naar 12, 13, 23, 24, 25, 38, bijlage 1)
SCIT
VOORDELEN
NADELEN
Hoge efficaciteit
Frequent voorkomen van hevige nevenreacties die anafylactische shock kunnen induceren
OIT
Hoge efficaciteit
Reacties op het AG’en komen voor en
Kan leiden tot tijdelijke tolerantie
kunnen fel zijn
Relatief veilige methode
Dagelijkse toediening nodig
Niet-invasief en pijnloos Eenvoudig toe te dienen Grote immunologische veranderingen sIgA SLIT
Veilige therapie
Onzekerheden over therapie op langere
Niet-invasief en pijnloos
termijn meer onderzoek nodig
Eenvoudig toe te dienen
Onzekerheden over het ontstaan van
sIgA
tolerantie meer onderzoek nodig Maximale dosis gelimiteerd Dagelijkse toediening vereist
EPIT
Nog weinig over geweten
17
8. Immunotherapie verbeteren Het voorkomen van ongewenste nevenreacties maakt dat immunotherapie niet zonder gevaar is voor routine behandeling. Om deze ongewilde responsen beter te controleren, worden er allerhande technieken voorgesteld waardoor de immunotherapie verbetert, veiliger wordt en de efficaciteit stijgt, ondanks dat er een lagere concentratie allergeen nodig is (3, 5, 6, 13). 8.1
Antigeen-structuur en biologische functie
Allergenen op zich bestaan uit een complex mengsel van chemische componenten, zoals lipiden, proteïnen, glycoproteïnen en polysacchariden. Wanneer een allergeen wordt gekloond en gesorteerd voor immunotherapie, moet worden nagegaan welke van deze componenten specifiek binden op de receptoren van APC’en, Tregs of Toll-like receptoren en zo de immuunrespons activeren. Deze moleculen kunnen worden gezuiverd en gebruikt voor immunotherapie (3). De biologische functie van een allergeen wordt ook best in overweging genomen bij het selecteren en opzuiveren van AG’en. Enzymen die de immuunreactie sturen in het voordeel van de Th2 respons worden best geweerd uit het AG mengsel (3). Sommige epitopen die worden herkend door IgE kunnen een denaturatie ondergaan bij verwarmen. Hierdoor worden ze niet meer gebonden door IgE en wordt een daling van de allergeniciteit bekomen. Dit is een verklaring waarom sommige patiënten bepaalde allergenen wel verdragen wanneer deze worden opgenomen na bakken of verhitten, b.v. rauwe eieren worden niet verdragen, maar gebakken eieren wel. Door voedselallergenen bij immunotherapie behandeling te verhitten, kan dit in bepaalde gevallen leiden tot minder neveneffecten tijdens de behandelingsprocedure (21). 8.2
Hypoallergene bereiding 8.2.1 Recombinante technologie
Tabel 3: Recombinante technieken voor immunotherapie (naar 5, 6). Recombinante
IgE reactiviteit
T-cel reactiviteit
IgG reactiviteit
Gereduceerd tot
Positief
Negatief
technologie Tolerogene peptiden
kleine afmeting
negatief
laag immunogeen Recombinante
Gereduceerd
allergenen
tot negatief
Positief
Positief grote afmeting sterk immunogeen
(fragmenten, oligomeren, mutanten, denaturatie
van
het 18
wild type, mozaïek) Fusie eiwitten
Negatief
Negatief
Positief
8.2.1.1 Tolerogene peptiden Tolerogene peptiden zijn korte, lineaire, synthetische peptiden waarbij, i.p.v. de volledige allergenen, alleen de fracties van het allergeen worden behouden die T cel epitopen bevatten en dus de immunoreactiviteit promoten (Figuur 5). Bijgevolg kunnen de peptiden nog steeds een verschuiving in de T cel respons induceren, waardoor de immunologische en klinische efficaciteit behouden blijft, maar veroorzaken ze weinig tot geen IgE gemedieerde overgevoeligheidssymptomen (3, 6, 13). Opdat de kruisreactiviteit tussen IgE op de effectorcellen niet zou doorgaan, moeten peptiden worden gebruikt die minder dan 30 aminozuren bevatten. Deze peptiden zijn gemiddeld 12 tot 15 aminozuren lang, kleiner dan de gemiddelde afstand (8 tot 24 nm) die er is tussen twee FcεRI moleculen (3, 13). Er worden geen allergeen-specifieke IgG antistoffen gevormd tegenover de tolerogene peptiden, aangezien hun afmeting hiervoor te klein is en ze laag immunogeen zijn (6) (Tabel 3). Het gebruik van tolerogene peptiden vertoont een positief therapeutisch effect in klinische studies. Wel worden in vivo nog af en toe late fase nevenreacties gezien. Bovendien is een complexe mengeling van peptiden nodig om alle T cel epitopen in overweging te nemen (5). Een recente studie heeft T cel epitopen geselecteerd op basis van vermeerdering en cytokine respons (IL-10, IL-13 en IFN-γ). Toediening van deze peptiden wordt beter getolereerd, maar verder onderzoek is nodig om veiligheid op lange termijn te garanderen (5). 8.2.1.2 Recombinante allergenen Het DNA van de meeste allergenen is reeds ontcijferd en dit opent deuren voor de immunotherapie. Concreet wilt dit zeggen dat, in plaats van enkel het ruwe allergeen aan te duiden, de ziekteverwekkende molecule kan worden gespecificeerd. Aan de hand van moleculaire biologische technieken worden de complementaire allergeen-coderende DNA-strengen (c-DNA) uit de allergenen geïsoleerd. Hiermee worden recombinante allergenen gemaakt. De meeste IgE epitopen binden enkel AG met een bepaald gevouwen tertiaire eiwit-structuur, daarom worden ze ook conformationele IgE epitopen genoemd. Om de neveneffecten van immunotherapie te verminderen, dient de originele eiwitconformatie en zo ook de originele conformatie van de IgE epitopen te worden veranderd of verbroken, waardoor de IgE bindingscapaciteit verloren gaat. Dit gebeurt door aminozuren of peptiden die worden gebruikt in de IgE epitopen te verwijderen of door de aminozuurfrequentie te veranderen waardoor de eiwitstructuur wordt gewijzigd. Hierdoor daalt de allergeen activiteit en is het gebruik van recombinante allergenen bijgevolg veiliger. De T cel epitopen zijn wel nog aanwezig waardoor immuniteitsopbouw kan worden bekomen. Dit alles kan worden bereikt op vijf manieren: door productie van recombinante fragmenten, oligomeren, mutanten, denaturatie van het wild type allergeen of door de allergeenfragmenten samen te voegen in de vorm van een mozaïek (Figuur 5). Recombinante allergenen hebben een bijkomend voordeel: door hun relatief grote afmetingen en hun
19
sterke immunogeniciteit induceren ze eveneens de vorming van allergeen-specifieke IgG antistoffen (Tabel 3). Recombinante allergenen kunnen worden gebruikt in drie situaties: 1) als diagnostische test kan een individueel reactieprofiel worden aangeduid op moleculaire basis, dit wordt de componentoplossende diagnose genoemd, 2) behandelen van type I allergieën door immunotherapie op basis van recombinante allergenen, 3) monitoren van patiënten die worden behandeld met immunotherapie door de IgE en IgG antistoffen te bepalen en zo het succes van de immunotherapie na te gaan (3, 4, 5, 6).
Figuur 5: Recombinante technologieën voor de vorming van hypoallergene allergenen. In het midden is het eiwit te zien, gevouwen in zijn driedimensionale vorm. De peptiden die instaan voor de vorming van de IgE epitopen zijn roze en rood gekleurd. De peptiden die worden herkend door de T cellen zijn geel, groen en blauw gekleurd (5).
8.2.1.3 Fusie-eiwitten Een derde strategie in de recombinante technologie is het vormen van recombinante peptide-carrier fusie-eiwitten. Deze proteïnen bestaan uit twee delen: 1) peptiden die deel uitmaken van de IgE epitopen afkomstig van het allergeen, maar geen IgE reactiviteit veroorzaken door het gebrek aan de originele eiwitconformatie en 2) een carrier proteïne dat niet afkomstig is van het allergeen b.v. een viraal proteïne. Deze fusie-eiwitten hebben als doel om de neveneffecten van zowel IgE als de T cel gemedieerde nevenreacties te elimineren en bovendien IgG antistoffen te produceren tegen de IgE bindingsplaatsen (Tabel 3). Dankzij de blokkerende IgG antistoffen zullen er minder IgE antistoffen worden geactiveerd, waardoor de degranulatie daalt en de T cel reactiviteit daalt. De peptide
20
specifieke IgG antistoffen kunnen worden gemaakt dankzij de hulp van T cellen die reageren op de epitopen van het carrier eiwit (3, 5, 6). 8.2.2 Allergoïd: chemisch gemodificeerde allergenen Om de mogelijke neveneffecten van immunotherapie te beperken en de immunologische eigenschappen te verbeteren, wordt er steeds gezocht naar alternatieven. Met dit in gedachten, hebben chemische gemodificeerde allergenen, kortweg allergoïden genoemd, hun intrede gemaakt. Bij SCIT wordt gebruik gemaakt van allergeenextracten die chemisch worden behandeld met glutaaraldehyde of formaldehyde. Aminozuren in de polypeptide keten, voornamelijk lysines, worden hierdoor hervormd, waardoor specifieke conformationele receptoren voor binding van IgE antistoffen worden gemodificeerd. Er ontstaat sterische hinder bij deze polymere allergoïden, de receptoren worden niet herkend en er zal een gereduceerde IgE binding plaatsvinden. Door de chemische reactie worden er zowel intra- als intermoleculaire kruisverbindingen gevormd, waardoor het allergoïd een complex wordt met een hoog moleculair gewicht. Doordat de molecule vergroot, stimuleert dit de specifieke immuunrespons. Kortom: allergoïden worden geproduceerd met als doel een waardig, zelfs een beter alternatief te zijn dan intacte allergenen bij specifieke immunotherapie bij SCIT met een gereduceerde allergeniciteit en een evenwaardige of zelfs sterkere immunogeniciteit tot gevolg. Er is nog geen eensgezindheid over de invloed van de allergoïden op de T cel respons. Volgens een aantal onderzoeken vindt er een duidelijke daling plaats van de T cel stimulatie en dus een slechtere immunogeniciteit omdat ook de lineaire T cel epitopen veranderen. Het type antigeen presenterende cel speelt hierbij ook een belangrijke rol: dendritische cellen en macrofagen vertonen een betere antigeen presentatie dan B cellen en mononucleaire cellen (3, 7, 8, 55). Het gebruik van chemisch gemodificeerde allergenen lijkt veelbelovend bij SCIT. Dit heeft de interesse voor het gebruik van deze allergoïden bij SLIT aangewakkerd. Voor SLIT zijn monomere allergoïden nodig,
aangezien
een
laag
moleculair
gewicht
vereist
is
voor
de
mucosale
absorptie.
Gecarbamyleerde allergoïden worden gevormd door kaliumcyanaatbehandeling bij neutrale tot alkalische pH, waardoor substitutie van lysineresiduen plaatsvindt. Hierdoor wordt de structurele conformatie behouden, maar daalt toch de IgE reactiviteit. Zo blijft de mogelijkheid bestaan om beschermende allergeen-specifieke IgG antistoffen te induceren en een daling van de allergeniciteit te bekomen (3, 25, 55). 8.3
Mogelijk gebruik van adjuvantia en vector systemen bij SLIT
Bij sublinguale therapie zit het toevoegen van immunomodulatorische substanties nog in de onderzoeksfase. Hierdoor berust de huidige werking bij SLIT voorlopig enkel op een hoge dosis wateroplosbaar allergeen (9, 10, 11, 38). Dit in tegenstelling tot SCIT waar aluminium hydroxide en calcium fosfaat doorgaans worden gebruikt om de immunotherapie te versterken. Adjuvantia kunnen zowel synthetisch als biologisch zijn. Ze zorgen voor extra co-signalen bij APC’en, waardoor de allergeen-specifieke Th1 en de Treg responsen worden versterkt. Vector systemen behoeden de AG’en tegen degradatie door locale proteasen. Ze bevorderen de adhesie van allergenen aan tolerogene APC’en en verbeteren de opname van de allergenen door APC’en en macrofagen. Beiden 21
kunnen ze er ook voor zorgen dat de hoeveelheid allergeen, nodig om een positieve immunotherapie te bekomen, verkleint, waardoor ze bijdragen tot een betere veiligheid (9, 10, 11). Mogelijke adjuvantia: Componenten van de bacteriële celwand vertonen immunomodulatorische effecten, waardoor ze interessant zijn als adjuvans. Een niet-toxisch lipopolysaccharide (LPS) afkomstig van Salmonella minnesota is monofosforyl lipid A (MPL). MPL werkt direct op Toll-like receptor 4 (TLR4) waardoor de aangeboren afweer extra wordt geactiveerd. TLR2 en TLR4 komen in grote aantallen voor op orale mucosale Langerhans cellen. Bij stimulatie van deze APC worden grote aantallen naïeve T cellen omgevormd tot mature T cellen die IL-10 en TGF-β produceren (Treg) en bovendien stijgt het aantal natuurlijk voorkomend Tregs (nTregs). Er vindt een opwaardering van de Th1 respons plaats en een onderdrukking van de allergeen-geïnduceerde Th2 respons. Klinisch en immunologisch lijkt MPL effectief als adjuvans en de veiligheid van de immunotherapie wordt er niet door benadeeld (3, 9, 10, 11, 19, 27, 38). Bacteriële toxinen zijn eveneens goede adjuvantia, zowel de toxische als de niet-toxische varianten b.v. cholera toxine en Escherichia coli hitte-labiel enterotoxine. Ze leveren gemakkelijk AG’en aan de major histocompatibiliteitsmoleculen (MHC) (10, 11, 27). Probiotica induceren een sterke IL-10 en IL-12 productie bij de protolerogene dendritische cellen. Ook de allergeen-specifieke Th1 en Treg respons worden gestimuleerd. Lactobacillus plantarum en Bifidobacterium bifidum kunnen in combinatie met AG’en zorgen voor een sterke immunomodulatie. Hierdoor vindt een stijging plaats van de synthese van het allergeen-specifiek IgG, IgA , IFN-γ en IL-10 en een suppressie van TNF-α (10, 11, 15, 27, 38). CpG
rijk
bacterieel
DNA
kan
in
niet-gemethyleerde
vorm
worden
gebruikt
als
immunostimulator. Er bestaan eveneens synthetische oligodeoxynucleotide-analogen die CpG motieven bevatten. Beiden zijn het liganden voor TLR9, waar ze als pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen worden herkend. TLR9 bevindt zich voornamelijk intracellulair in het endoplasmatisch reticulum in B cellen en plasmacytoïde dendritische cellen. Door activatie van de receptor wordt zowel een mucosale als een systemische Th1 respons gestimuleerd. Bovendien onderdrukken ze anafylactische symptomen en wordt een daling van IgE, IL-4 en IL-5 gezien (6, 10, 11, 15, 19). Glucocorticoïden en 1,25 dihydroxyvitamine D3 zorgen voor een gestegen Treg respons. Het zijn sterke inductoren van de IL-10 productie door dendritische cellen en CD4+ T cellen en zorgen voor expressie van de transcriptiefactor FoxP3. De combinatie van beide adjuvantia werkt synergistisch (3, 6, 10, 11, 38). Mogelijke vector systemen: Het gebruik van positief geladen mucoadhesieve nanopartikels zorgt voor een sterke adhesie van de AG’en aan de negatief geladen orale dendritische cellen, waardoor het antigeencontact verlengt. 22
De opnametijd van de allergenen door de dendritische cellen wordt hierdoor verlengd, waardoor een sterkere Th1 respons wordt veroorzaakt dan wanneer het AG alleen zou worden gebruikt. Deze partikels zijn een combinatie van allergenen, gekoppeld aan maltodextrine of chitosane polymeren (10, 11, 21, 38). Plasmide DNA heeft als doel om de allergeendosis te verhogen, terwijl de IgE reactiviteit wordt verlaagd, waardoor het risico op neveneffecten daalt. Het codeert voor een specifiek AG en kan zowel een humorale als cellulaire Th1 immuunrespons uitlokken. Hierbij nemen de specifieke Th1 lymfocyten toe, evenals het specifiek cytokine milieu met o.a. IFN-γ. De immunogeniciteit en efficaciteit kunnen worden geoptimaliseerd door daarbij immunostimulatorische sequenties in het bacterieel plasmide DNA in te bouwen, namelijk CpG motieven. Ook de adsorptie aan nanopartikels draagt bij tot een betere werking. Belangrijk is om het DNA vaccin hypoallergeen te maken, zodat geen Th2 respons wordt uitgelokt. Door slechts een zwakke IgE reactiviteit op te wekken, door b.v. mutaties in te brengen, kan dit probleem worden omzeild. Deze vector kan zowel profylactisch als therapeutisch worden gebruikt (10, 11, 15, 25, 27, 56). Allergeensequenties kunnen ook worden gekoppeld aan virus-like partikels. Deze partikels worden gevormd door het spontaan samenvoegen van kapsied eiwitten van virussen. Ze bevatten echter geen viraal genoom. Op het oppervlak bevinden zich repetitieve antigenen die zorgen voor een efficiënte kruisverbinding op de B cel receptoren. Wanneer allergenen in grote hoeveelheid, in een steeds weerkerend motief, worden gekoppeld op het oppervlak van de virus-like partikels zal bijgevolg een sterke allergeen-specifieke IgG respons worden geïnduceerd. De immunotherapie zal zorgen voor een uitstekende humorale immuunrespons, evenals een verbeterde systemische afweer. Potentiële virussen die kunnen worden gebruikt voor de vorming van virus-like partikels zijn het porcien parvovirus, het Norwalkvirus en het humaan papillomavirus (10, 11, 15, 27, 38). 8.4
Anti-IgE therapie
Monoclonale anti-IgE IgG antistoffen kunnen worden gebruikt als eerste behandeling voordat de effectieve immunotherapie wordt gestart, zodat mogelijke IgE gemedieerde neveneffecten minder snel zullen optreden. In het bijzonder wordt getracht om acute tegenreacties van het lichaam bij de inductie onder controle te houden. Als gevolg hiervan kan de dosis AG tijdens de opbouwfase sneller worden opgedreven, waardoor de onderhoudsdosis sneller wordt bereikt zonder erge nevenreacties. IgG bindt op het constant domein van IgE antistoffen, waardoor IgE niet meer kan binden op de Fcε receptoren op mastcellen, basofielen, B cellen en dendritische cellen. Hierdoor kan de IgE gemedieerde signaaltransductie niet doorgaan. De concentratie vrije IgE moleculen stijgt, er volgt een downregulatie van
de
Fcε
receptoren
en
er
is
een
gedaalde
activatie
van
histamine
vrijlating
en
ontstekingsmediatoren. Bovendien verhindert anti-IgE dat AG’en worden opgenomen door APC’en en B cellen, waardoor de synthese van IgE antistoffen daalt. Een voorbeeld van een humane monoklonale anti-IgE IgG antistof is omalizumab (Xolair (Novartis Pharma)) (3, 15, 21, 23).
23
9. Bespreking Immunotherapie wordt in het bijzonder gebruikt als behandeling bij IgE gemedieerde allergische aandoeningen. Verschillende studies met SLIT zijn reeds gedaan met behulp van aeroallergenen voor de behandeling van respiratoire allergieën zoals rhinitis en astma. Verschillende onderzoeken suggereren dat SLIT ook kan worden aangewend bij andere IgE gemedieerde allergieën zoals atopische dermatitis, voedselallergie en allergie op bijengif. SLIT als behandeling bij voedselallergie wordt experimenteel onderzocht, maar is nog niet beschikbaar voor de kliniek (8, 13, 15, 26, 27). Er is reeds veel vooruitgang geboekt bij het gebruik van SLIT. Er zijn echter nog een aantal onzekerheden en werkpunten. Door de grote variatie aan klinische responsen en immunologische veranderingen bij de individuele patiënt is de selectie van individuen die het meeste baat zullen hebben bij een SLIT behandeling een eerste werkpunt. De meeste studies nemen geen individuen met een verleden van erge anafylaxie op in het onderzoek. Deze patiënten hebben hoogst waarschijnlijk een meer voorzichtige benadering nodig met een aangepast protocol: een tragere opbouwfase en een langere onderhoudsfase. Bovendien hebben zij waarschijnlijk baat bij een bijkomende therapie zoals anti-IgE. Wanneer een effectieve therapie tegen voedselallergie op de markt zou komen, gaan ook patiënten met een verleden van levensbedreigende neveneffecten de immunotherapie willen gebruiken. Zodoende is het belangrijk dat in klinische studies eveneens deze gevallen worden opgenomen (2, 20, 23). Er zijn nog geen preventieve biomerkers voor handen die de efficaciteit van de SLIT therapie bij een bepaalde patiënt kunnen voorspellen of nagaan (23, 25, 27). Recent onderzoek heeft moleculaire veranderingen opgemerkt bij de dendritische cellen die een indicatie geven voor de veranderende adaptieve immuniteit. De expressie van complement component 1 en Stabilin-1 zouden hier als merker kunnen worden gebruikt (25). Bovendien zouden diagnostische testen die het onderscheid maken tussen transiënte en persisterende vormen van voedselallergie handig zijn, zodat de therapeutische strategie kan worden aangepast per patiënt. Transiënte patiënten zullen een betere respons vertonen op de immunotherapie in vergelijking met persisterende gevallen. Bovendien zullen ze een minder lange en minder intensieve behandeling nodig hebben waarbij waarschijnlijk minder nevenreacties zullen optreden. De discussie die hier opduikt is of deze individuen wel een therapie nodig hebben, aangezien de allergie vanzelf ook zal overgaan. Persisterende patiënten hebben het meest baat bij een immunotherapie (14, 15). Ten tweede is het belangrijk
dat de optimale allergeendosis
wordt vastgelegd en de
toedieningsprotocollen worden geharmoniseerd, zodoende het gebruik voor de praktijk mogelijk te maken (13, 25). De maximale dosis is gelimiteerd door het kleine volume dat sublinguaal kan worden toegediend (23). Mede hierdoor is de effectiviteit bij OIT hoger dan bij SLIT (13, 25, 38). Bovendien moeten allergeen-extracten op een gestandaardiseerde manier worden bereidt en gecontroleerd. Op deze manier kunnen de verschillende proeven en producten adequaat worden vergeleken (25). Als derde punt dient opgemerkt te worden dat er tevens verschillende strategieën zijn die de therapie kunnen verbeteren. Hierbij is het belang van allergeenstructuur en allergeenfunctie niet te onderschatten. Verder onderzoek is vereist om na te gaan of het zuiveren van AG’en en selecteren van bepaalde moleculaire componenten een voordeel heeft in de immunotherapie behandeling (3). Het modeleren van immunologische eigenschappen van allergenen is eveneens zeer waardevol. De 24
moleculaire structuur van de allergenen kan zodanig worden gewijzigd dat het immunotherapeutisch effect behouden blijft, maar de allergeniciteit daalt. Deze hypoallergene bereiding zorgt voor minder neveneffecten en een meer doeltreffende therapie. Dit kan worden bereikt op verschillende werkwijzen: tolerogene peptiden, recombinante allergeentherapie, fusie-eiwitten of door chemisch gemodificeerde allergenen (allergoïden) (3, 27). Het therapeutisch effect bij gebruik van tolerogene peptiden is optimistisch, maar er is nog ongerustheid over de optredende nevenreacties. De interesse is wel gestimuleerd door het feit dat één T cel epitoop kan zorgen dat er tolerantie optreedt naar andere T cel epitopen van hetzelfde eiwit (13). Het is mogelijk dat vaccins gebaseerd op fusie-eiwitten ook bijkomende voordelen hebben wanneer virale eiwitten als carrier worden gebruikt. Hierbij kan het zijn dat deze niet alleen anti-allergeen werken, maar ook de anti-virale immuniteit stimuleren. Het gebruik van fusie-eiwitten is een technologie die bijzondere aandacht krijgt. Het is een algemeen toepasbare methode die kan worden gebruikt bij verschillende allergenen. Ook hier is verder onderzoek nodig (6). Of allergoïden een waardig alternatief zijn voor intacte allergenen is een onderwerp voor verder klinisch onderzoek, waarbij beiden zowel klinisch als immunologisch moeten worden vergeleken. Momenteel is er nog onenigheid over de specifieke werking ervan, o.a. over de allergeniciteit en de T cel stimulatie (3, 7, 8, 55). De methoden voor deze hypoallergene bereidingen, o.a. voor de allergoïden en de tolerogene peptiden, zijn nog niet gestandaardiseerd, waardoor het vergelijken niet eenvoudig verloopt (3, 21). Bijkomend kunnen immunomodulatorische substanties worden gebruikt, zoals adjuvans en vectorsystemen. Deze zorgen dat de immunotherapie beter aanslaat, de efficaciteit stijgt en de neveneffecten, zowel lokaal als systemisch, minimaal worden. Dit is
een
werkgebied
waarbij
actief
onderzoek
plaatsvindt
(3,
6,
27).
De toedieningsroutes zijn een vierde punt van discussie. Er zijn verschillende alternatieve toedieningsroutes getest voor een allergeen-specifieke immunotherapie naast de subcutane route: oraal, nasaal, bronchiaal, epicutaan en mucosaal. Toediening van allergenen via de orale mucosa, sublinguaal, bleek het meest effectieve alternatief (3, 6, 13, 15, 27). Verder onderzoek kan informatie leveren over andere regio’s in de mondholte die evenveel of zelfs meer potent zijn dan de sublinguale mucosa. De verhouding van orale Langerhanscellen tot mastcellen is hoger in andere regio’s, zoals het vestibulum bij de mens (24, 48). Onderzoek bij muizen toonde deze verschillen in distributie niet aan (48). Verdere analyse naar de interactie van lokale dendritische cellen en T cellen in de verschillende
regio’s
van
de
mondholte
kunnen
meer
duidelijkheid
brengen
(24).
Als vijfde werkpunt wordt de opbouwfase bij immunotherapie besproken. Dankzij het veilige karakter van SLIT, is er mogelijkheid om de opbouwfase te verkorten. Er kan sneller worden overgegaan tot het toedienen van een hoge dosis allergeen, zonder dat er nevenreacties optreden. Het toepassen van een rush protocol is meer verantwoord bij een sublinguale toediening dan b.v. bij een subcutane behandeling
(55).
De onderhoudsdosissen en de duur van de onderhoudstherapie dienen ook nader bepaald te worden; dit is het zesde item op de lijst. De onderhoudstherapie zal vermoedelijk gedurende jaren moeten worden aangehouden, voordat permanente tolerantie zich kan voordoen en alzo genezing kan optreden. De onzekerheden die bestaan over de efficaciteit op lange termijn en over het ontstaan van tolerantie, dan wel desensibilisatie, is een duik in het ongewisse bij SLIT. Dit alles wordt allicht ook
25
beïnvloed door de ergheid van de voedselallergie en de voedselantigeen-specifieke IgE concentratie. Zoals bij veel van deze werkpunten is ook hier verder onderzoek nodig (13, 21, 23, 25, 29, 44). De zevende aantekening wordt gemaakt over de rol van de Th17 cellen. Recent is er ontdekt dat Th17 en de productie van IL-17 een rol kunnen spelen bij Th2 gemedieerde allergie. Verder onderzoek naar de specifieke invloed in het immuunsysteem is vereist. IL-17 zou een merker kunnen zijn of een nieuw doelwit
voor
therapie
(37,
54).
De achtste opmerking handelt over het preventief gebruik van SLIT. Immunotherapie zorgt voor grondige veranderingen in de immuunrespons. Op lange termijn zou de progressie van de ziekte kunnen worden gewijzigd. Met deze onderliggende gedachte zou SLIT niet alleen als therapeutische behandeling kunnen worden ingezet, maar ook als profylactische vaccinatie. Dit is in verschillende proeven
aangetoond
en
kan
worden
overwogen
bij
jonge
individuen
(25,
27,
55).
Een laatste, maar zeker niet onbelangrijk punt, is het type immuunrespons die verantwoordelijk is voor de klinische verbetering. Wanneer ervan uitgegaan wordt dat de type I gemedieerde overgevoeligheid de belangrijkste oorzaak is van ziekte bij voedselallergie, zou een daling van antigeen-specifiek IgE de grootste klinische verbetering moeten geven. Verschillende studies tonen aan dat deze correlatie niet altijd klopt, terwijl de alteratie van de T-lymfocytenrespons wel beter strookt met klinische genezing (3, 23). Symptomen van voedselallergie bij honden en katten treden vaak slechts op enkele uren tot enkele dagen na de opname, wat beter overeenkomt met een uitgestelde overgevoeligheid (17). De hypothese die zich stelt door deze argumenten doet vermoeden dat voedselallergie eerder een type IV overgevoeligheid betreft, dan een type I overgevoeligheid. Wanneer deze hekelpunten opgehelderd zijn, bestaat de kans dat SLIT ook kan worden gebruikt in de praktijk (29). Verschillende studies hebben het gebruik van allergeen-specifieke immunotherapie als behandeling voor voedselallergie getest. De algemene conclusie hierbij luidt dat de immunologische reactie van het lichaam wordt gewijzigd, de ziekte-expressie aldus verandert en orale tolerantie of desensibilisatie wordt geïnduceerd. De grootste onzekerheid hierbij is de reactie op lange termijn. Gerandomiseerde, placebo gecontroleerde studies hieromtrent en in het bijzonder bij SLIT zijn nodig om meer zekerheid te krijgen over de veiligheid, de effectiviteit en het bereikte resultaat: tolerantie of desensibilisatie na langdurige SLIT behandeling (13, 21, 25, 29, 44). Er is geweten welke cellen en cytokines veranderen na SLIT, maar de exacte immunologische mechanismen die zorgen voor een succesvolle desensibilisatie bij immunotherapie met voedselantigenen zijn nog onvoldoende grondig onderzocht. Daarom is een verdere ontrafeling van het immuunsysteem eveneens essentieel (3, 14, 15, 19, 23, 44). Wel is er overeenstemming over het feit dat immunotherapie de enige therapeutische optie is bij voedselallergie die potentieel curatief kan zijn en de oorzaak ook daadwerkelijk zal aanpakken (5, 12, 13, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26).
26
ONDERZOEK 1. Inleiding Pindanoten zijn een veel voorkomende oorzaak van voedselallergie die acuut levensbedreigend kan zijn (1, 23). Het is een voedselallergie met een erge en zeer persisterende vorm (23, 28). Slechts bij 20% van de patiënten zal allergie op pindanoten spontaan verdwijnen (1, 13, 23). De behandeling is gelimiteerd en bestaat uit het schrappen van pindanoten uit het dieet (1, 2) en gebruik van epinefrine en/of antihistaminica bij reactie na al dan niet toevallige inname (2, 12). Zelfs het kleinste residu kan zorgen voor anafylactische shock (3, 12, 13, 16, 17, 23, 24, 25, 38, bijlage 1). Door de hevige reacties op het allergeen en de continue waakzaamheid die geboden is bij deze ziekte, is er nood een betere behandelingsstrategie. Bovendien kan deze allergie leiden tot een minderwaardige levenskwaliteit door de angst en de sociale isolatie (2, 14). Immunotherapie is een mogelijke therapeutische optie die potentieel curatief kan zijn bij patiënten met allergie voor pindanoten (3, 12, 13, 14, 15, 20, 23). Traditioneel wordt gebruik gemaakt van subcutane immunotherapie (SCIT). De resultaten zijn gunstig, maar door het optreden van systemische nevenreacties wordt er gezocht naar alternatieve routes (2, 3, 6, 10, 13, 14, 15, 24, 25, 27). Sublinguale immunotherapie (SLIT) is een keuzemogelijkheid die het mogelijk maakt om klinische desensibilisatie te bereiken en waarbij weinig tot geen nevenreacties worden
gezien
(1,
2,
3,
12,
13,
14).
Het
is
belangrijk
om
het
systeem
van
de
immuunresponsverandering na te gaan en te onderzoeken welke cellen en cytokines hiervoor verantwoordelijk zijn. Het beschermingsmechanisme dient beter ontrafeld te worden (3, 14, 15, 19, 23, 44). Deze studie voerde een onderzoek naar de alteratie van de immuunrespons na een sublinguale behandeling met pindanotenextract bij gezonde honden die nog nooit in contact waren geweest met pindanoten. De sublinguale tolerantie-inductie werd nagegaan. De evolutie van verschillende immunologische parameters en de reactie van het afweersysteem bij deze gezonde honden werd onderzocht, nadat ze dagelijks sublinguaal in contact kwamen met een potentieel voedselallergeen: pindanoten. De testen die in acht werden genomen, waren 1) isolatie, proliferatie en restimulatie van de lymfocyten met behulp van een ³H thymidine test, 2) differentiatie, proliferatie en restimulatie van de lymfocyten met behulp van flowcytometrie, 3) pindanoten-specifiek IgE ELISA op serum en op speeksel en 4) IL-10 ELISA op celcultuursupernatans.
2. Materialen en methoden 2.1
Selectie van de dieren
In dit onderzoek werden zes Beagles gebruikt tussen de leeftijd van drie en negen jaar (Tabel 4). Ze zijn geselecteerd uit de vakgroep diervoeding en farmacologie van de campus Diergeneeskunde aan de Universiteit Gent. Deze dieren hebben nog nooit pindanoten genuttigd.
27
Tabel 4: Karakteristieken van de geselecteerde honden SLIT groep (n = 4)
Placebo groep (n = 2)
Leeftijd
3 – 9 jaar (gemiddeld 5,5 jaar)
3 jaar (gemiddeld 3 jaar)
Geslacht
2 vrouwelijk, 2 mannelijk
1 vrouwelijk, 1 mannelijk
Gesteriliseerd/gecastreerd
1 gesteriliseerd, 2 gecastreerd
1 gesteriliseerd, 0 gecastreerd
Ras
Beagle
Beagle
2.2
Randomisatie
Deze studie is een placebo-gecontroleerde studie, waarbij twee honden, één mannelijke en één vrouwelijke hond, ad random geselecteerd werden als controle uit een populatie van 6 gezonde honden. Er werd een enkelblind onderzoek gevoerd, waarbij de verzorgers van de honden niet op de hoogte waren van welke honden specifiek het placebo toegediend kregen en welke het pindanotenextract. De onderzoekers waren hiervan wel op de hoogte. 2.3
Studieprotocol
De druppels met pindanotenextract of placebo werden dagelijks via een microliter pipet sublinguaal toegediend en vervolgens werd de mond 30 seconden toegehouden. Nadien konden de honden alles doorslikken. Opbouwfase: De allergeendosis werd gradueel opgebouwd over een periode van 7 weken. Op de eerste dag van de studie werd een dosis van 0.25 µg pindanotenextract (1:1000 verdunning) of placebo gegeven. De honden werden gedurende 30 minuten geobserveerd, waarna ze nog 1.25 µg (1:1000 verdunning) toegediend kregen. De tweede dag werden 2.5 µg (1:100 verdunning) en 30 minuten later nog 5 µg (1:100 verdunning) pindanotenextract en placebo verschaft. Vanaf de derde dag werd deze laatste dosis dagelijks toegediend gedurende een aantal dagen, zoals weergegeven in Figuur 6. Nadien werd de dosis regelmatig verhoogd tot: 10 µg, 20 µg, 25 µg, 50 µg, 100 µg, 200 µg, 500 µg, 1000 µg en tenslotte 2000 µg. De toegediende hoeveelheid placebo was telkens dezelfde als het volume pindanotenproteïnen. Onderhoudsfase: In dit proefopzet werden de honden niet verder opgevolgd na de 7 weken durende studie. Er werd eveneens geen pindanotenextract meer toegediend.
28
Figuur 6: Het schema met de dosisaanpassingen tijdens de opbouwfase van de sublinguale immunotherapie.
2.4
Druppels met pindanotenextract en placebo
Het toegediende pindanotenextract bevatte een poeder, bestaande uit ruwe ontvette pindanoten. Dit poeder werd aangekocht bij Greer Laboratorium (Peanut arachis hypogaea, RMF 171P, Lenoir, North Carolina, USA). Voor de bereiding van het allergeenextract werd 1g poeder gemengd met 10 ml NaCl 0,9%. Dit mengsel werd 10 min gevortext, waarna het 2 uur in de incubator bij 4°C werd geplaatst. De eventuele vetlaag die zou ontstaan, moest worden verwijderd. Dit mengsel werd één uur gecentrifugeerd bij 5250 g bij 4°C. ’s Nachts werd de oplossing gedialyseerd in aqua destillata. Na dit proces kon alles gefilterd worden door filters van 0,22 µm in een steriele flow. Om de eiwitconcentratie te berekenen werd een BCA-eiwitbepaling gedaan. Het principe van de BCA reactie was tweeledig: 1) In alkalisch milieu zouden de eiwitten Cu2+ denatureren tot Cu+. De hoeveelheid Cu2+ die werd gereduceerd, was evenredig aan de concentratie eiwit die in de oplossing zat. 2) BCA (Bicinchoninic acid) was een specifiek reagens voor Cu+ en vormde hiermee een complex dat paars kleurde en licht absorbeerde bij een golflengte van 562 nm. Door het absorptiespectrum te meten en dit nadien te vergelijken met een standaard verdunde reeks kon de eiwitconcentratie worden bepaald. De BCAeiwitbepaling gebeurde in drie stappen.
29
Stap 1: Bereiden van de verdunningen voor de standaardreeks. In de standaardreeks werd een gekende concentratie Bovien Serum Albumine (BSA) (Sigma-Aldrich, Diegem, België) gebruikt. Er werd gestart van een concentratie van 1mg/ml. Verder werden verdunningsreeksen gemaakt, zoals aangegeven in Tabel 5.
Tabel 5: Verdunningen voor de standaardreeks 1 mg BSA
Standaardreeks
PBS
Totaal
+ 1 ml PBS Start
1 mg/ml
25 µl
0 µl
25 µl
Verdunning 1
0,8 mg/ml
20 µl
5 µl
25 µl
Verdunning 2
0,5 mg/ml
12.5 µl
12.5 µl
25 µl
Verdunning 3
0,2 mg/ml
10 µl
40 µl
50 µl – 25 µl voor verdunning 4 = 25 µl
Verdunning 4
0,1 mg/ml
25 µl van
25 µl
50 µl – 25 µl voor verdunning 5
verdunning 3
= 25 µl Verdunning 5
0,05 mg/ml
25 µl van
25 µl
50 µl hiervan nog 25 µl
verdunning 4
wegnemen = 25 µl Controle
/
/
25 µl
25 µl
30
Stap 2: Bereiden van een verdunningsreeks van het pindanotenextract, zoals aangegeven in Tabel 6.
Tabel 6: verdunningsreeks pindanotenextract Verdunningsreeks
Pindanotenextract
PBS
Totaal
Start
25 µl
0 µl
25 µl
Verdunning ½
12,5 µl
12,5 µl
25 µl
Verdunning ¼
12,5 µl
37,5 µl
50 µl - 25 µl voor
pindanotenextract
verdunning 1/8 = 25 µl Verdunning 1/8
25 µl van verdunning ¼
25 µl
50 µl - 25 µl voor verdunning 1/16 = 25 µl
Verdunning 1/16
25 µl van verdunning 1/8
25 µl
50 µl hiervan nog 25 µl wegnemen = 25 µl
Stap 3: BCA-kit. In deze derde stap moesten aan beide verdunningsreeksen reagentia worden toegevoegd die zich bevonden in deze BCA-kit (Sigma-Aldrich, Diegem, België). Reagens A bestond uit Bicinchoninic zuur (BCA) oplossing, reagens B was CuSO4 x 5 H2O. Het BCA reagens werd samengesteld in volgende verhouding: 50 volumes van oplossing A + 1 volume van oplossing B. Bij elke verdunning van het pindanotenextract en van de standaardreeks (allen 25 µl), moest 0,5 ml van het BCA-reagens worden toegevoegd. Dit alles werd 30 minuten geïncubeerd bij 37°C, waarna het werd afgekoeld tot kamertemperatuur. Van elke reeks werd in drievoud 100 µl per cupje aangebracht op een 96-cupjes microtiterplaat voor celcultuur (Cellstar®, Greiner bio-one, Frickenhausen, Duitsland). De optische densiteit werd met een spectrofotometer gemeten bij een golflengte van 562 nm. Omdat het eiwit het Cu2+ denatureerde tot Cu+, dat een bepaald absorptiespectrum vertoonde, kon de eiwitconcentratie worden bepaald. Er werd een kalibratielijn opgesteld van de verdunningen van de standaardreeks met de concentratie (mg/ml) in functie van de optische densiteit bij 562 nm. De best passende regressielijn werd bepaald, evenals de vergelijking van de rechte. Aan de hand van deze vergelijking kon de eiwitconcentratie van het pindanotenextract worden bepaald. Het bekomen resultaat werd vermenigvuldigd met de verdunning van het pindanotenextract om de exacte eiwitconcentratie te krijgen. De controledieren kregen enkel NaCl 0,9% toegediend als placebo in dezelfde hoeveelheid als het pindanotenmengsel. 31
2.5
Klinische evaluatie
Bij elke dosistoename werden de honden gedurende twee uur gemonitord door een dierenarts op lokale en systemische neveneffecten. Zes uur later werden ze nogmaals gecontroleerd. Bovendien werden ze dagelijks nagekeken op lokale bijwerkingen: zwelling en jeuk van de lippen en het gebied onder de tong. 2.6
Immunologische testen
Er werd op aseptische wijze bloed genomen uit de vena jugularis op dag 1, 12, 20, 27, 34, 41 en 48. Het bloed (10 ml) werd verzameld in een spuit waarin 10 ml oplossing zat die bestond uit PBS, 1% penicilline (100 IU/ml) / streptomycine (100 µg/ml) (Gibco®, Life Technologies, Gent, België) en heparine 200 IU/ml (Heparin Rorer 5000 UI/ml, Aventis, Belgium), kortweg heparine-oplossing. Voor 100 ml heparine-oplossing werd 95 ml PBS gemengd met 1 ml penicilline/streptomycine en 4 ml heparine. Dit bloed kon gebruikt worden voor de ³H-thymidine test en de flowcytometrische analyse. Het celcultuursupernatans werd gebruikt voor bepaling van de IL-10 concentratie via een ELISA. Er werd bovendien nog 5 ml bloed genomen, waarvan het serum werd ingevroren tot min 80°C en waarmee nadien de pindanoten-specifieke IgE ELISA kon worden uitgevoerd. Op dag 48 werd eveneens speeksel verzameld van de honden om te testen of hierin ook antigeen-specifiek IgE kon worden gevonden. 2.6.1 ³H-thymidine test: lymfocyten isolatie, proliferatie en restimulatie Isolatie van de lymfocyten. Gelijke hoeveelheden van een oplossing van 1 g carbonylijzer (SigmaAldrich, Diegem, België) + 1% penicilline/streptomycine en 1g Arabische gom (Sigma-Aldrich, Diegem, België), beiden apart opgelost in 10 ml PBS (Phosphate buffered saline), werden samengevoegd. Het getrokken bloed, gemengd met de heparine-oplossing, werd vermengd met 10% van deze oplossing. Door het bloed te mengen met de Arabische gom en het carbonylijzer, werden de fagocyten verwijderd uit het bloed. Dit mengsel werd één uur geïncubeerd bij 37 – 38 °C in een 5% atmosfeer. Elke 10 minuten werd deze suspensie gezwenkt met de hand. Voorzichtig werd 20 ml oplossing toegevoegd op 15 ml densiteitgradiënt in een 50 ml falcon buis. Om de densiteitgradiënt te maken, werd 7,1 g Ficoll 400 (Sigma-Aldrich, Diegem, België) en 9 g natriumdiatrizoaat (Applichem, Darmstadt, Germany) opgelost in 100 ml aqua destillata. Ficoll is een hoog polymeer suiker dat een geringe osmotische activiteit heeft, niet toxisch is voor de cellen en het medium visceus maakt (48). Bovendien zorgt het ervoor dat de erythrocyten agglutineren en daardoor naar de bodem van de buis zakken (48). Natriumdiatrizoaat daarentegen bepaalt voornamelijk de osmolaliteit (48). Dit medium werd gesteriliseerd door het te filteren doorheen een 0,22 µm filter met een cellulose acetaat membraan. De densiteit moest 1.078 g/ml bedragen, de osmolariteit 256 mOsmol. De buis werd 30 minuten gecentrifugeerd bij 400 g en 18 °C. Hierdoor werd een scheiding bekomen van de verschillende cellen in het bloed: onderaan in de buis zaten de rode bloedcellen, hierboven bevond zich de densiteitsgradiënt van het medium, daarboven een band van lymfocyten en ten slotte het plasma bovenaan. De lymfocytenband werd vervolgens zeer voorzichtig geaspireerd met behulp van een pipet. Dit was een cruciale stap in dit protocol, aangezien er veel cellen konden verloren gaan als 32
dit niet nauwkeurig werd uitgevoerd. De lymfocyten-suspensie werden in een falcon buis gebracht en verdund met één zelfde hoeveelheid wasvloeistof, die bestond uit Alsever’s oplossing, een isotone antistollingsoplossing die gesupplementeerd werd met 1% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS) en 1% penicilline/streptomycine (Alsever’s oplossing werd zelf samengesteld in het laboratorium: Dextrose (AnalaR Normapur®, VWR, Leuven, België), Natriumcitraat (AnalaR Normapur®, VWR, Leuven, België), Citroenzuur (UCB Pharma, Brussel, België), NaCl (AnalaR Normapur®, VWR, Leuven, België) en ultrapuur H2O). De buis werd 15 minuten gecentrifugeerd bij 550 g bij kamertemperatuur, waarna de lymfocyten zich onderaan in de buis bevonden. De Alsever’s oplossing en het supernatans die zich ook in de falcon buis bevonden, werden voorzichtig weggegoten en aan de pellet werd vervolgens 5 ml lyse buffer (9 volumes NH4CL 0,83% + 1 volume Tris 2,06%, pH 7,65) toegevoegd. Deze zorgde ervoor dat de resterende rode bloedcellen in de pellet werden gelyseerd. Er werd wederom 5 ml wasvloeistof toegevoegd en de tube werd 10 minuten gecentrifugeerd bij 550 g en 4°C. De vloeistof werd weggegoten en de pellet werd gewassen in 10 ml incompleet medium RPMI-1640 (samengesteld in het laboratorium: RPMI 1640 poeder (Gibco®, Life Technologies, Gent, België), NaHCO3 (AnalaR Normapur®, VWR, Leuven, België) en aqua destillata, pH van 7,1 – 7,2), gesupplementeerd met 1% penicilline/streptomycine om bloedplaatsjes verder te verwijderen en klontervorming te voorkomen. Vervolgens werd de celpellet gesuspendeerd in 1 ml compleet medium (samengesteld uit RPMI 1640, gesupplementeerd met 10% FCS, 1% penicilline/streptomycine, 1% MEM (minimum essentieel medium), 1% glutamine, 1% Na Pyruvaat, 1% kanamycine, 0.1% mercaptoethanol en 0.5% gentamycine). Er werd een 1 op 100 verdunning in nigrosine oplossing gemaakt om de concentratie en vitaliteit van de cellen te bepalen. De nigrosine zorgt ervoor dat dode cellen zwart kleuren en de levende cellen helder blijven. In de Burker telkamer werd vervolgens het aantal levende cellen, voornamelijk lymfocyten, geteld en hieruit werd de concentratie lymfocyten per milliliter compleet medium berekend. De concentratie werd tot 5,0 x 106 cellen/ml medium gebracht door te verdunnen indien nodig. Proliferatie en restimulatie van de lymfocyten. Vervolgens werd per hond in elk cupje van één rij van twee 96-cupjes celcultuurmicrotiterplaten (Cellstar®, Greiner bio-one, Frickenhausen, Duitsland), 100 µl celsuspensie gebracht. Als positieve controle werd gebruik gemaakt van een Concanavaline A (ConA) oplossing. ConA is een sterk mitogeen dat T lymfocyten doet prolifereren. Wanneer er onvoldoende proliferatie is, betekent dit dat de kwaliteit van de cellen onvoldoende goed is en dat de test niet kan worden beoordeeld. Om de ConA oplossing te maken, werd 20 µl ConA (5 µg/ml) opgelost in 980 µl compleet medium. Er diende 100 µl van deze oplossing in elk cupje te worden gebracht (positieve controle voorgesteld door de groene hokjes in Figuur 7). Het compleet medium werd gebruikt als negatieve controle, daar de lymfocyten hierin enkel spontane proliferaties vertoonden. Er werd 100 µl per cupje toegevoegd (de blauwe cupjes in figuur 7). De lymfocyten werden getest op herkenning van pindanoten door 100 µl van een oplossing van compleet medium met pindanotenextract, 20 µg/ml, in de cupjes te doen (de gele hokjes in Figuur 7). In de cupjes die dienden als positieve en negatieve controle bevond zich bijgevolg geen pindanotenextract. De microtiterplaten werden geïncubeerd bij 5% CO2 en 37°C.
33
³H-thymidine test
3H-thymidine
test
Hond 1 Hond 2 Hond 3 Hond 4 Hond 5 Hond 6
Figuur 7: Lymfocyten proliferatie protocol: vullen van de microtiterplaten voor de ³H-thymidine test. In de cupjes die groen gekleurd zijn, bevond zich ConA, de positieve controle. De blauwe gekleurde cupjes waren gevuld met het medium, de negatieve controle. Geel staat symbool voor de cupjes waarin pindanotenextract vertoefde. Alle cellen in een rij waren eveneens gevuld met de lymfocytenoplossing van de desbetreffende hond.
De plaat die later zou worden gebruikt voor de ³H-thymidine test en waarin zich ConA bevond, werd na 30 uur incuberen, gepulst met [³H]-thymidine (1µCi/cupje) (Amersham Biosciences, Roosendaal, Nederland) door een oplossing te maken waarbij het ³H-thymidine 1/25 verdund werd in compleet medium. Hiervan werd 25 µl toegevoegd aan elk cupje. Door de metabole incorporatie van ³Hthymidine in het DNA van de cellen te meten, kon de DNA synthese en celproliferatie worden weergegeven (57, 58). De plaat werden nadien verder geïncubeerd gedurende 18 uur bij 5% CO2 in 37°C. Aangezien ConA sterk mitogeen is, hebben de lymfocyten na 72 uur alle nutriënten geconsumeerd, waarna ze afsterven. Daarom werd de microtiterplaat waarin zich ConA bevond, binnen de 3 dagen afgelezen. De cellen werden 2 dagen na de lymfocytenisolatie geoogst op glasvezelfilters (Filter Mat, Wallac, Turku, Finland). Tijdens dit proces worden de cellen gelyseerd met water en zal het vrijgekomen DNA aan de glasvezels binden. Op deze glazvezel wordt daarna een scintillator aangebracht die in respons op de aanwezigheid van de β-emissie van ³H-thymidine zal luminesceren. Deze luminescentie kan gemeten worden met een β-scintillatie teller (Perkin Elmer, Brussel, België) als tellingen per minuuut (counts per minute, CPM). De geïncorporeerde radioactiviteit in het DNA van de cellen werd gemeten en de resultaten werden verwerkt via een Microbeta Windows workstation, zodat de stimulatie-index (SI) werd verkregen. Deze index was de verhouding van de gemiddelde CPM van de gestimuleerde cellen (met ConA of het pindanotenextract) tot de niet-
34
gestimuleerde cellen (het medium). Wanneer de SI waarde groter of gelijk was aan 3 à 5, kon besloten worden dat zich een significante vermeerdering van de cellen had voorgedaan. Vijf dagen na de lymfocytenisolatie werd de microtiterplaat die pindanotenextract bevatte in plaats van ConA, gepulst met ³H-thymidine op dezelfde wijze zoals hiervoor beschreven. Deze plaat werd nadien eveneens verder geïncubeerd gedurende 18 uur bij 5% CO 2 en 37°C, waarna de geïncorporeerde radioactiviteit werd gemeten op dag 6. 2.6.2 Flowcytometrie: lymfocyten typering, proliferatie en restimulatie De flowcytometer wordt gebruikt om de aanwezigheid van bepaalde eiwitten en oppervlakte antigenen van cellen te bestuderen. Monoklonale antistoffen die vooraf gemerkt zijn met een fluorescerende molecule en gericht zijn tegen oppervlakte antigenen in de membraan van de lymfocyten worden gebruikt om de cellen te merken. Wanneer de cellen de laserstraal passeren, wordt het laserlicht naar alle richtingen weerkaatst, wat informatie geeft over verschillende parameters, zoals celgrootte en granulariteit. Zo wordt het weerkaatste licht dat gemeten wordt onder een kleine hoek (<2°) of de voorwaartse lichtverstrooiing (Forward Scatter, FSC) als parameter voor de celgrootte beschouwd. De zijwaartse lichtverstrooiing (Sideward Scatter, SSC), die gemeten wordt onder een hoek van 90°, is een parameter voor de granulariteit van de cellen. Indien de cellen aangekleurd worden met fluorochromen, zal het laserlicht deze exciteren, waardoor de fluorochromen op hun beurt fotonen zullen uitzenden. Afhankelijk van de lasers en de opgestelde detectoren in de flowcytometer kunnen meerdere fluorochromen simultaan gedetecteerd worden. De fotonen worden gemeten, omgezet in elektrische signalen en de bekomen resultaten worden onder andere weergegeven in dot plots (57). Isolatie van de lymfocyten. Om te beginnen dienden de lymfocyten eveneens geïsoleerd te worden, net zoals bij de ³H- thymidine test. CellTrace toevoegen: Het aantal geïsoleerde lymfocyten werd geteld in een Burker telkamer. Indien nodig werden de lymfocyten verdund in PBS tot de gewenste concentratie van 1,0 x 10 6 cellen/ml. Vervolgens werd 5 mM CellTrace™ Violet (CellTrace™ Violet Cell Proliferation Kit for flow cytometry, life technologies, Gent, België) bereid door het CellTrace reagens op te lossen in 20 µl dimethylsulfoxide. Per ml celsuspensie werd 1 µl van deze oplossing toegevoegd om een uiteindelijke concentratie van 5 µM te bekomen. De cellen werden 20 minuten geïncubeerd bij 37°C. Er werd 5 ml cultuur medium aan de cellen toegevoegd, waarna deze 5 minuten geïncubeerd werden in een donkere omgeving, zodat alle vrije kleurstof werd verwijderd. Door middel van centrifugatie werd er opnieuw een pellet bekomen. Het supernatans werd verwijderd en de cellen werden geresuspendeerd in 1 ml vers opgewarmd compleet medium. De cellen werden opnieuw geteld om te controleren of er nog steeds 1,0 x 106 cellen/ml aanwezig waren. Vervolgens kon de proliferatie en restimulatie stap plaatsvinden, analoog aan deze stap bij de ³Hthymidine test. Na toevoegen van ConA, pindanotenextract en medium, werden de cellen geïncubeerd bij 5% CO2 en 37°C gedurende 2 dagen (ConA stimulatie) en 6 dagen (extra stimulatie door pindanotenextract).
35
De cellen werden verzameld en aangekleurd met specifieke merkers om zowel proliferatie als fenotypering van de proliferende cellen via de flowcytometer te analyseren. Om te beginnen werd een buffer bereid, bestaande uit DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), waaraan 1% foetaal kalfserum (FCS) werd toegevoegd. De tweede buffer was samengesteld uit steriele PBS + 5% FCS. De cellen werden verzameld, overgebracht naar 15 ml falcon buizen, gefilterd doorheen een 75 µm filter en 10 minuten gecentrifugeerd bij 350 g in 4°C. Het celcultuursupernatans werd in aparte buizen gebracht en bewaard bij -80°C, zodat het later kon worden gebruikt voor de pindanoten-specifieke IL10 ELISA. De celpellet werd geresuspendeerd in medium en het aantal cellen werd geteld zoals hierboven beschreven. Vervolgens werden 1,0 x 106 cellen overgebracht naar een 96-cupjes microtiterplaat met cupjes met een conische bodem (NUNC-immuno plate, Roskilde, Denemarken). De cellen werden 3 minuten gepelleteerd bij 350 g in 4°C en het supernatans werd verwijderd. De celpellet werd geresuspendeerd in 50 µl CD3-CD4-CD8 antilichamenoplossing (CD3/CD4/CD8 triple color reagent, 1/5 verdund in DMEM, host: dog, AbD Serotec, Oxford, UK). Als controle op aspecifieke binding van de monoklonale antistoffen aan de cellen, werden deze eveneens aangekleurd met isotype controles (IgG1, IgG2a, IgG2b; 1/100 verdund in DMEM, Invitrogen™, Life Technologies, Gent, België). Bovendien werden de cellen afzonderlijk aangekleurd met 50 µl anti-CD3 monoklonale antistoffen (mAbs) (1/2 verdunning in DMEM) om compensaties te kunnen berekenen. De cellen werden vervolgens 20 minuten met deze mAbs geïncubeerd op ijs en afgeschermd van licht. Na deze incubatie stap werden de cellen opnieuw 3 minuten gecentrifugeerd bij 350 g in 4°C. Het supernatans werd verwijderd en de cellen werd gewassen met PBS. Deze wasstap werd één keer herhaald. Vervolgens werden de cellen aangekleurd met secundaire fluoroscent gemerkte antilichamen. Voor de isotype controle werden de cellen aangekleurd met 50 µl anti-IgG1-FITC (1/100), anti-IgG2a-PE (1/100) en anti-IgG2b-AlexaFluor647 (1/100). Voor de compensaties werden de cellen afzonderlijk aangekleurd met 50 µl FITC-geconjugeerd secundair mAb, 50 µl PE-geconjugeerd secundair mAb en 50 µl AF647-geconjugeerd secundair mAb. De cellen werden opnieuw geïncubeerd gedurende 20 minuten op ijs in een donkere omgeving. Na deze incubatie stap werden de cellen wedermaal 3 minuten gecentrifugeerd bij 350 g in 4°C. Het supernatans werd verwijderd en de cellen werden twee maal gewassen met PBS. De cellen die gebruikt zullen worden voor de compensatie berekeningen werden geresuspendeerd in 150 µl PBS en overgebracht naar een FACS buis. De overige cellen werden geresuspendeerd in 150 µl DMEM + 7-AAD (1/250, 7-aminoactinomycin D) en overgebracht naar een FACS buis. De 7-AAD kleuring laat toe om levende en dode cellen van elkaar te onderscheiden. Deze cellen werden geanalyseerd met een BD FACSaria III flowcytometer. Volgende gegevens werden nagegaan: aantal levende cellen, CD3+ cellen, de subpopulaties van de T lymfocyten en welke celpopulaties prolifereerden en welke niet. 2.6.3 ELISA voor pindanoten-specifiek IgE in het serum Het serum van de honden werd gedurende het experiment gestockeerd bij -80 °C. Dit serum werd nu gebruikt voor de pindanoten-specifieke IgE directe ELISA (Figuur 8). Er werd gebruik gemaakt van 96cupjes maxisorp platen (NUNC-immuno plate, Thermo-scientific, Roskilde, Denemarken) die gecoat werden met 100 µl pindanotenextract (50 µg/ml), gedilueerd met een natrium carbonaat bicarbonaat buffer, 0,05 M bij pH 9,4. De plaat werd overnacht geïncubeerd bij 4°C. De volgende dag werden de 36
platen driemaal gewassen met PBST (PBS met 0.05% Tween®20 (TW20, polysorbaat 20), een detergens). Per cupje werd 200 µl van een commercieel bereide blokvloeistof (ELISA Blocking buffer, Bethyl Laboratories, Montgomery, USA; bestaande uit 50 mM Tris, 0,14 M NaCl en 0,05% TW20; pH 8) toegevoegd die gedurende twee uur bij kamertemperatuur de onbezette plaatsen op de plaat kon bezetten. Na tweemaal wassen van de platen met PBST, werd per cupje 50 µl serum aangebracht. Er werd gebruik gemaakt van serum afkomstig van de honden voordat de eerste sublinguale immunisatie had plaatsgevonden, dag 1, en serum van dag 48, een dag nadat de studie afgelopen was. Het serum werd verdund met PBST en de platen werden gevuld zoals aangegeven in Figuur 9. De gevormde antistoffen, pindanoten-specifiek IgE, aanwezig in het serum van de honden konden nu binden aan de antigenen die gebonden waren op de plaat. Er werd ook serum gebruikt van een hond die bewezen voedselallergie had voor kippenvlees als positieve controle. Voor de coating van de cupjes van deze hond werd uiteraard kippeneiwit gebruikt in plaats van pindanotenextract (de oranje vakjes in Figuur 9). De negatieve controle werd uitgevoerd door niet-gecoate cupjes die gevuld werden met serum van een controlehond (de gele vakjes in Figuur 9), waardoor de achtergrondkleuring kon beoordeeld worden. De platen werden opnieuw 2 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur en vervolgens vijfmaal gewassen met PBST om niet gebonden antistoffen weg te wassen. Vervolgens werd 100 µl polyklonaal antiserum van geiten, specifiek gericht tegen IgE van honden en waaraan een enzym, horseradish peroxydase, gebonden was (Goat anti-Canine IgE Antibody (HRP), Novus Biologicals, Europe) als conjugaat toegevoegd, gedurende één uur. Het conjugaat was 1 op 2000 verdund met PBST gesupplementeerd met 0,02% BSA. De platen werden opnieuw vijfmaal gewassen om het niet gebonden conjugaat te verwijderen en tenslotte werd 50 µl ABTS oplossing toegevoegd per cupje. De ABTS oplossing bevat een chromogeen, ABTS, en een substraat voor peroxydase, nl H2O2. De antigeen-antistof-conjugaat-complexen, aanwezig in de cupjes, bevatten het enzym dat reageert met het substraat waardoor het chromogeen oxideert van kleurloos naar een groen gekleurd eindproduct. Dit alles werd een half uur tot een uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. Een subjectieve beoordeling kon gebeuren door de kleur van de cupjes te bekijken: wanneer de cupjes groen kleurden, betekende dit een positieve reactie en dus aanwezigheid van pindanoten-specifiek IgE in het serum van de honden. De platen konden ook objectief door een spectrofotometer worden geanalyseerd bij een optische densiteit van 450 nm.
37
Figuur 8: Directe ELISA voor pindanoten-specifiek IgE.
Hond 1 Dag 1
Dag 48
Hond 2 Dag 1
Dag 48
Hond 3 Dag 1
Dag 48
1/5 1/10 1/20 1/40
Geen coating Voedselallergie Figuur 9: pindanoten-specifieke IgE ELISA Van elke hond werd serum gebruikt van dag 1 en dag 48. Het desbetreffende serum werd verdund zoals aangegeven op de figuur. Er werden telkens 2 cupjes gevuld met hetzelfde serum in dezelfde 38
concentratie. Deze figuur geeft de situatie weer voor hond 1, 2 en 3. Bovendien waren in elke plaat cupjes aanwezig die niet gecoat werden, maar wel gevuld werden met serum van een controlehond (geel) en cupjes die gecoat werden met kippenextract waarbij serum van een hond met voedselallergie werd gevoegd in dezelfde verdunningen als de andere honden (oranje). 2.6.4 ELISA voor pindanoten-specifiek IgE in het speeksel Op dag 48 werd van alle honden speeksel verzameld. Hierin werd ook het pindanoten-specifiek IgE gehalte bepaald. Het ELISA protocol dat gebruikt werd, was hetzelfde als reeds beschreven, met het verschil dat speeksel werd gebruikt in plaats van serum. 2.6.5 ELISA voor IL-10 Het supernatans afkomstig van de lymfocyten werd gebruikt voor de IL-10 ELISA. Deze test was een sandwich ELISA (Figuur 10) die werd uitgevoerd met behulp van de Canine IL-10 DuoSet® ELISA (Development System, Minneapolis, USA). Er werden vier 96-cupjes maxisorp platen (NUNC-immuno plate, Thermo-scientific, Roskilde, Denemarken) gecoat met 100 µl muis anti-hond IL-10 monoklonale antilichamen, afkomstig uit de DuoSet® aan een werkconcentratie van 2 µg/ml, aangelengd met PBS. De platen werden geïncubeerd gedurende de nacht. Nadien werden ze driemaal gewassen met een wasbuffer (PBS, waarbij 0,05% Tween20 werd toegevoegd, pH 7,2 – 7,4 (PBST)) om de niet gebonden captatieantilichamen te verwijderen uit de cupjes. In elk cupje werd gedurende één uur 300 µl blokvloeistof (1% BSA in PBS, pH 7,2 – 7,4) toegevoegd bij kamertemperatuur. Na driemaal de wasstap te hebben uitgevoerd, waren de platen klaar voor de eigenlijke IL-10 ELISA. In de eerste rij cupjes van de eerste plaat werd in tweevoud 100 µl celcultuursupernatans aangebracht van perifere bloedmonomorfonucleaire cellen van dag 11 die in vitro niet gerestimuleerd waren. In de daarop volgende rijen werd dit supernatans 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50 verdund in dezelfde buffer als de blokbuffer. Op elke plaat werden ook zeven opeenvolgende tweevoudige verdunningen van een oplossing van recombinant canine IL-10 getest met een beginconcentratie van 2000 pg/ml (Figuur 11). In de andere platen werd exact hetzelfde protocol uitgevoerd, maar met celcultuursupernatans van bloedmonomorfonucleaire cellen van dag 48, niet gerestimuleerd en celcultuursupernatans van dag 11 en dag 48, maar nu wel gerestimuleerd met pindanotenextract. Indien IL-10 aanwezig zou zijn in het supernatans, zou dit binden aan de captatieantilichamen. De platen werden 2 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur,
waarna
ze
driemaal
werden
gewassen
en
waar
per
cupje
100
µl
detectieantilichamen (200 ng/ml diluens, gebiotinyleerd muis anti-hond IL-10) werden toegevoegd. Opnieuw werden de platen geïncubeerd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, waarna de wasstap uitgevoerd werd. Vervolgens werd 100 µl Streptavidine-HRP (horseradish-peroxidase) aan elk cupje toegevoegd. Streptavidine was geconjugeerd aan HRP, een enzym dat na toevoegen van een substraat met chromogeen een kleurverandering geeft. Het streptavidine bindt met zeer hoge affiniteit aan het biotine van de detectieantilichamen. Het biotine/streptavidine-HRP vermeerderingssysteem zorgde ervoor dat de kleurreactie die bekomen werd twee- tot driemaal sterker was dan wanneer HRP direct aan het antilichaam zou gebonden zijn (33, 36). De platen werden vervolgens 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een donkere omgeving. Na de wasstap werd 100 µl substraat/chromogeen-oplossing in elk cupje gebracht; het substraat van HRP is H2O2, het 39
chromogeen was in deze reactie tetramethylbenzidine (TMB). Beiden waren in de oplossing in een verhouding van 1:1 aanwezig. Het enzym horseradish-peroxydase zette het substraat H2O2 om tot een geoxideerd tussenproduct dat het TMB oxideert tot een blauwe kleur (36). Na een incubatie van 20 minuten en afgezonderd van het licht werd 50 µl stop-oplossing (2NH2SO4) aan de cupjes toegevoegd, zodat de reactie niet ongebreideld zou verder gaan. Hierdoor veranderde de kleur van blauw naar geel. Uiteindelijk kon de plaat worden afgelezen onder een spectrofotometer met een golflengte van 450 nm.
Figuur 10: Sandwich ELISA voor IL-10 bepaling, met het streptavidine-biotine vermeerderingssysteem.
Figuur 11: 96-cupjes microtiterplaat voor de IL-10 ELISA. Legende: oranje: de cupjes waarin standaard oplossing kwam; licht blauw: celcultuursupernatans van hond 1; donker blauw: celcultuursupernatans van hond 2; geel: celcultuursupernatans van hond 3; 40
licht groen: celcultuursupernatans van hond 5; rood: celcultuursupernatans van hond 6; donker groen: celcultuursupernatans van hond 4. Er werden vier platen gemaakt waarin zich telkens celcultuursupernatans van dag 11 of dag 48 bevond, dat al dan niet gerestimuleerd was met pindanotenextract.
3. Resultaten 3.1
Studie populatie
Alle zes de honden voltooiden de zeven weken durende studie. Zowel in de controle groep als de SLIT groep zaten mannelijke en vrouwelijke honden in dezelfde verhouding. De gemiddelde leeftijd van de controle groep was echter lager (gemiddeld 3 jaar) dan de SLIT groep (gemiddeld 5,5 jaar), maar geen enkele hond was reeds eerder in contact gekomen met pindanoten. Vier honden kregen pindanotenextract sublinguaal toegediend, terwijl slechts twee honden dienden als controlegroep en NaCl 0.9% verkregen. Geen enkele hond had allergieën. De zes Beagles verbleven van jongs af aan op de vakgroep diervoeding en farmacologie van de campus Diergeneeskunde van de Universiteit Gent. Dit impliceerde dat ze in exact hetzelfde milieu vertoefden gedurende het onderzoek. 3.2
Klinische evaluatie
Geen enkele hond heeft nevenreacties vertoond op de sublinguale toediening van het pindanotenextract of het placebo. 3.3
Studieprotocol
In deze studie is de opbouwfase zonder problemen voltooid. De honden hebben dagelijks de juiste hoeveelheid pindanotenextract gekregen en ze lieten de sublinguale toediening relatief goed toe. Er is echter geen echte onderhoudsfase ingesteld daar de tijd ontoereikend was. 3.4
Immunologische studies 3.4.1 ³H-thymidine test: lymfocyten isolatie, proliferatie en restimulatie
De pindanoten-specifieke respons van de lymfocyten werd nagegaan in vitro op basis van de ³Hthymidine test. Per hond werden de SI-waarden uitgezet in functie van de tijd. De SI-waarden, verkregen door stimulatie van de lymfocyten met ConA, golden als positieve controle. Dezen werden vergeleken met de SI-waarden, verkregen na stimulatie door pindanotenextract. De resultaten zijn terug te vinden in Figuur 12. Bij de evaluatie van de resultaten werd vooral aandacht besteed aan vier punten: 1) de vergelijking van de verhouding ConA/medium bij elke hond op verschillende tijdstippen, 2) de vergelijking van de verhouding ConA/medium tussen de SLIT groep de controle groep, 3) de vergelijking van de verhouding pindanotenextract/medium bij elke hond op verschillende tijdstippen, 4) de vergelijking van de verhouding pindanotenextract/medium tussen de SLIT groep en de controle groep. 41
Wanneer de SI-waarde groter of gelijk was aan 3 à 5, kon gezegd worden dat de lymfocyten vermeerderden. De resultaten van deze ³H-thymidine test toonden aan dat de lymfocyten van alle zes de honden gedurende de hele studie reageerden onder invloed van ConA. De SI-indexen varieerden van 10,000 tot 325,167 met een gemiddelde SI-index van 95,478. Er was een groot individueel verschil op te merken bij elke hond op verschillende tijdstippen. Het achtergrondsignaal was soms zeer hoog. De proliferatie na restimulatie van de lymfocyten met pindanotenextract was zeer laag bij alle honden. De SI-waarden hadden een gemiddelde van 3,607, met een marge van 0,780 tot 15,983. Dit deed vermoeden dat de lymfocyten amper repliceerden onder invloed van het pindanotenextract. Bovendien was er geen daling of stijging zichtbaar van de SI-waarden, naarmate de honden langere tijd sublinguaal pindanotenextract toegediend kregen. De SI-waarden bekomen na ConA waren veel hoger dan dezen bekomen na stimulatie met pindanotenextract, wat wel normaal is, aangezien ConA alle T-lymfocyten kan activeren terwijl een antigeen enkel het lage aantal antigeen-specifieke cellen kan restimuleren. Vergelijken van de SI-waarden tussen de controle groep en de SLIT groep kon geen effect van de sublinguale immunisatie aantonen.
42
Figuur 12: Resultaten van de ³H-thymidine test. Kinetiek van de SI-waarden van de lymfocyten bekomen na stimulatie met ConA en na stimulatie met pindanoten-extract.
3.4.2 Flowcytometrie: lymfocyten typering, proliferatie en restimulatie Flowcytometrie werd gebruikt om de lymfocyten te typeren of met andere woorden om na te gaan welke lymfocytenpopulaties zich bevonden in het bloed van de sublinguaal geïmmuniseerde Beagles. Om te beginnen werden de dode cellen via negatieve selectie verwijderd, waardoor de levende cellen overbleven en hiermee kon worden verder gewerkt. Hieruit werden de CD3+ cellen, de T lymfocyten, weerhouden. De evolutie van de B lymfocyten (CD78+) werd niet onderzocht. In de populatie van T lymfocyten werd gekeken naar de subpopulaties, hun verhouding tot elkaar en de evolutie van deze cellen in de tijd. Nadien werd gekeken welke cellen deelden en welke niet via CellTrace Violet. Dit alles werd bestudeerd tussen de controle groep en de SLIT groep, evenals de evolutie in de tijd bij elke hond apart. Eerst werd gekeken naar de reactie van de T lymfocyten in het medium. Dit gaf de situatie weer zoals zich in vivo afspeelde. Nadien werd in vitro pindanotenextract toegevoegd en werden de cellen gerestimuleerd. De resultaten van de flowcytometrie werden naast elkaar gelegd en vergeleken op drie tijdstippen, namelijk op dag 17, dag 27 en één dag na het stoppen van de sublinguale toediening, dag 48. In dit onderzoek werden vier subpopulaties van de T cellen (CD3+) onderscheiden: 1) CD8+ CD4-: de cytotoxische T cellen, 2) CD8+ CD4+: deze celsoort is niet beschreven bij de mens of bij de hond, wel bij het varken; het is een geheugen T-helper cel die zal prolifereren wanneer het antigeen gepresenteerd wordt, waartegen het geheugen gericht is (33, 50), 3) CD8- CD4-: deze T cellen spelen een rol bij inflammatie en auto-immuniteit; ze zijn onontbeerlijk in het onderhouden van de immuniteitshomeostase en zelf-tolerantie (51), 4) CD8- CD4+: de T-helper cellen. De belangrijkste subpopulaties in deze studie waren de T-helper cellen (CD4+) en de cytotoxische T cellen (CD8+). De T lymfocyten, CD3+ cellen, werden weergegeven als een percentage cellen binnen de levende lymfocytenpopulatie (Figuur 13). Procentueel gezien vertoonde het aantal T lymfocyten initieel een stijging (dag 27), waarbij de controledieren gemiddeld gezien het hoogste percentage en tevens de hoogste toename in CD3+ cellen vertoonden. Na verloop van tijd (dag 48) was er een afname van
43
deze cellen in het bloed, waarbij de concentratie op het einde van de studie lager was dan in het begin. Dit gold zowel voor de controles als de SLIT groep, doch de daling was meer uitgesproken voor de SLIT dieren, dan voor de controledieren. Op dag 27 gaf de flowcytometer een globale daling weer van het percentage CD4+ CD8- cellen (Figuur 14). Bij sommige honden vertoonde de CD4+ cellen een milde stijging naar dag 48 toe, maar het globale percentage was gedaald ten opzichte van dag 17. Deze bevindingen golden zowel voor de cellen in het medium als na restimulatie door pindanotenextract. Toch was de daling meer uitgesproken bij de honden met de pindanoten immunisatie die geherstimuleerd waren in vitro. Het percentage CD8+ CD4- T lymfocyten in het bloed (Figuur 14) vertoonde initieel eveneens voor beide groepen een zeer lichte daling op dag 27, zowel met als zonder restimulatie met pindanotenextract, waarna bij beide groepen terug een lichte stijging op te merken was op dag 48, zodat het percentage op dag 48 bij alle honden hoger was dan op dag 17. De verhouding van de CD4+ cellen ten opzichte van de CD8+ cellen werd berekend (CD4+/CD8+, Figuur 15). De gemiddelde verhouding van de CD4+/CD8+ cellen op het einde van de behandelingsprocedure was bij beide groepen lager dan in het begin. Bovendien beschikten de beide controlehonden over een lagere verhouding dan de SLIT honden en dit zowel met als zonder restimulatie met pindanotenextract. Dit impliceerde dat het percentage van de CD8+ cellen tot de CD4+ cellen hoger was bij de controlehonden, dus dat de cytotoxische T lymfocyten stegen naarmate deze studie vorderde. Hond 6, een hond uit de SLIT groep, liet echter eveneens een lage verhouding van CD4+/CD8+ zien. In de literatuur werden de CD8+ T cellen amper onderzocht bij allergie of na immunisatie. Van de weinige studies waarin de CD8+ cellen wel werden betrokken, konden de bevindingen en resultaten niet geëxtrapoleerd worden naar dit onderzoek. Één opzet handelde over sublinguale vaccinatie als bescherming tegen longtumoren, waarbij een progressieve stijging van de cytotoxische T cellen optrad (52). Een andere studie toonde aan dat CD8+ T cellen zorgden voor een inhibitie van de late fase respons bij respiratoire allergieën en chronisch astma. Dit werd voornamelijk bewerkstelligd door IFNɣ, geproduceerd door de CD8+ cellen (53). Een derde studie ging het effect na van een anti-IgE therapie bij voedselallergie en constateerde dat de CD8+ T cellen niet prolifereerden (54). De cytotoxische T cellen spelen een grote rol bij het herkennen van virus-geïnfecteerde cellen of cellen die besmet zijn door intracellulaire bacteriën. Ze herkennen cellen waarbij endogene antigenen door middel van peptiden op het celoppervlak worden gepresenteerd met behulp van MHC klasse I moleculen. Hierdoor stellen de CD8+ T cellen cytotoxische granules vrij, granzymen en perforines, en cytotoxines waardoor de geïnfecteerde cel afsterft of apoptose ondergaat. Ook de Fas-ligand op de cytotoxische T cel kan apoptose induceren door te binden met Fas op de doelwitcel (33, 56).
44
Figuur 13: Kinetiek van het percentage CD3+ cellen in het bloed van sublinguaal met pindanotenallergeen geïmmuniseerde en niet-geïmmuniseerde honden, in vitro niet-gerestimuleerd met pindanoten-allergeen. Hond 1 en Hond 3 zijn de niet-gerestimuleerde controle dieren (flowcytometrie).
Figuur 14: Kinetiek van subpopulaties T lymfocyten bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). Links de CD4+ CD8- cellen, rechts de CD8+ CD4- cellen.
45
Figuur 15: Kinetiek van de verhouding van CD4+/CD8+ cellen bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie).
Via flowcytometrie en in het bijzonder via CellTrace™ Violet werd de proliferatie van de CD3+ cellen, de T lymfocyten, opgevolgd. Het was duidelijk dat naarmate de behandeling via sublinguale toediening vorderde, de verhouding van prolifererende/niet-prolifererende T lymfocyten steeg, zowel in de controle als de SLIT groep. In het begin van de studie was deze ratio echter niet verschillend tussen beide groepen (Figuur 16). De lymfocyten kregen steeds meer de capaciteit om te prolifereren. Dit was zichtbaar zowel bij de cellen in het medium, die bijgevolg niet werden gerestimuleerd, als bij de cellen die wel werden gerestimuleerd door het pindanotenextract (Figuur 17). Op dag 17 vertoonden de lymfocyten van beide groepen een gelijkaardige capaciteit, maar op het einde van de studie, dag 48, was de proliferatiecapaciteit van de lymfocyten van de controlehonden de laagste, zelfs na restimulatie. Echter, bij de gerestimuleerde cellen van de SLIT dieren was er een veel sterkere toename. Wanneer het percentage proliferende T lymfocyten van de verschillende subpopulaties werd vergeleken tussen de groepen, maar ook binnen de groepen met en zonder in vitro herstimulatie, was het percentage prolifererende CD8+ CD4- cellen (Figuur 18) initieel gelijk bij alle honden; zowel zonder als met restimulatie schommelden de resultaten rond 13%. Naar het einde van de studie toe steeg het percentage bij alle honden, maar de stijging was het hoogst bij de controlehonden. Opmerkelijk was dat er bij de controle groep minder prolifererende cellen waren na restimulatie dan zonder restimulatie. Het percentage vermenigvuldigende CD8+ CD4- lymfocyten op het totaal aantal
46
CD8+ CD4- lymfocyten was op dag 17 bij benadering gelijk. Nadien steeg dit bij beide groepen en het meest bij de controle groep (Figuur 19). Ook het percentage prolifererende CD4+ CD8- T cellen (Figuur 18) was aan het begin van de studie ongeveer gelijk voor beide groepen honden en daalde gelijkaardig op dag 27. Bij de controlegroep bleef de waarde ongeveer dezelfde op dag 48. In de SLIT groep trad er een stijging op, zodat het percentage prolifererende CD4+ CD8- T cellen in deze groep terug vergelijkbaar was aan het percentage op dag 17. Op het einde van de studie, was dit percentage het laagst bij de controle honden. Na in vitro restimulatie lag dit percentage iets hoger en was te vergelijken met deze van de SLIT en in vitro gerestimuleerde honden. De ratio prolifererende CD4+ lymfocyten op totaal aantal CD4+ lymfocyten was initieel vergelijkbaar tussen de SLIT en de controle groep, maar naargelang de studie vorderde daalde deze ratio bij de controle groep, maar steeg bij de SLIT groep (Figuur 19). De verhouding CD4+/CD8+ prolifererende cellen (Figuur 20) was op dag 17 duidelijk groter bij de groep honden die pindanotenextract toegediend kreeg dan bij de controle dieren (5 t.o.v. 4). Na verloop van tijd daalde deze ratio in beide groepen, maar de SLIT groep vertoonde nog steeds de hoogste verhouding. Zij bezaten bijgevolg een groter percentage vermenigvuldigende CD4+ cellen en een kleiner aandeel CD8+ cellen dan de placebo groep. In vitro restimulatie veranderde dit beeld helemaal en beide groepen vertoonden dan dezelfde verhouding CD4+/CD8+ prolifererende cellen en dezelfde evolutie van deze verhouding. Kort samengevat was het percentage in vivo vermenigvuldigende CD4+ T lymfocyten het hoogst bij de SLIT groep, terwijl het percentage vermenigvuldigende CD8+ T cellen het laagst was in deze groep naar het einde van het experiment toe.
Figuur 16: Verhouding van prolifererende/niet-prolifererende CD3+ cellen (flowcytometrie). De verhouding zonder lymfocytenstimulatie en na stimulatie door pindanotenextract bij zowel de controle groep als de geïmmuniseerde groep.
47
Figuur 17: De evolutie van de prolifererende CD3+ cellen (flowcytometrie).
Figuur 18: Kinetiek van subpopulaties prolifererende T lymfocyten bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). Links de prolifererende CD8+ cellen, rechts de prolifererende CD4+ cellen.
48
Figuur 19: Kinetiek van de verhouding van de prolifererende lymfocyten van een subpopulatie op het totaal aantal lymfocyten van deze populatie bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). Links de verhouding van de CD8+ cellen, rechts de verhouding van de CD4+ cellen.
Figuur 20: Kinetiek van de verhouding van de prolifererende CD4+/CD8+ cellen (flowcytometrie) bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie).
49
3.4.3 Pindanoten-specifiek serum IgE In deze ELISA werden de IgE waarden in serum van honden op dag 1 vergeleken met dezen op dag 48. Er werd nagegaan of de SLIT groep op het einde van de studie (dag 48) pindanoten-specifiek IgE produceerde in het bloed. Initieel, op dag 1, waren de IgE concentraties gelijk bij alle honden; op dag 48 waren deze gehalten amper gestegen. Ze evenaarden de hoge IgE gehalten van de hond met bewezen voedselallergie niet en schommelden eerder rond de waarden van de negatieve controle (Figuur 21, 22).
Figuur 21: Foto’s van de IgE ELISA op serum van honden (D1 en D3 zijn controlehonden). De plaat op de linker foto bevatte serum van hond 1, 2 en 3; de plaat op de rechter foto bevatte serum van hond 4, 5 en 6. Elke plaat telde ook cupjes die niet gecoat waren (N), die dienden als negatieve controle. Hiernaast was er ook een positieve controle (FA: Food allergy) aanwezig door cupjes, gecoat met kippeneiwit waarna serum van een hond met kippenallergie werd toegevoegd.
Figuur 22: Resultaten van de pindanoten-specifieke IgE ELISA op het serum van niet-SLIT (controle) en met pindanotenextract sublinguaal geïmmuniseerde honden.
50
3.4.4 Pindanoten-specifiek speeksel IgE Het IgE gehalte in het speeksel was ongeveer even hoog in beide populaties (Figuur 23). Er kon niet vergeleken worden met een positieve of negatieve controle. Ook was er geen speeksel verzameld voordat het onderzoek van start ging.
Figuur 23: Resultaten van de pindanoten-specifieke IgE ELISA op het speeksel, enkele dagen na het beëindigen van de sublinguale toediening. 3.4.5 IL-10 concentratie na in vivo immunisatie en na in vitro restimulatie van bloedlymfocyten met pindanotenallergeen Er was geen IL-10 aan te tonen in het lymfocytencultuursupernatans. Er was geen verschil tussen de controle, de SLIT en de blanco cupjes. Deze bevindingen golden voor het IL-10 op dag 11 en op dag 48 en dit zowel voor gerestimuleerde als het niet-gerestimuleerde lymfocyten-supernatans. De standaard oplossing was duidelijk positief in alle platen, wat erop duidde dat de ELISA goed was uitgevoerd (Figuur 24, 25).
Figuur 24: Foto’s van de ELISA voor IL-10 supernatans, niet met pindanoten gerestimuleerde lymfocyten. De foto links geeft het IL-10 gehalte op dag 11 weer en de foto rechts geeft het IL-10 gehalte op dag 48 weer.
51
Figuur 25: Resultaten van de pindanoten-specifieke IL-10 ELISA
4. Bespreking Dit was het eerste onderzoek dat de immuunrespons naging bij gezonde honden die sublinguale geïmmuniseerd werden met pindanotenextract. Klinisch vertoonden de honden geen symptomen na de toediening van het pindanotenantigeen. Dit was echter niet verwonderlijk om verschillende redenen: 1) voedselallergie komt zelden voor (17, 30), 2) deze honden waren nog nooit in contact gekomen met pindanoten, 3) de concentratie aan pindanotenextract was laag. Aangezien 240 mg pindanoteneiwit ongeveer overeenkomt met 1 pindanoot (2, 16), hadden deze honden bij de maximaal gekregen sublinguale dosis (2000 µg) slechts 1/120 van een pindanoot genuttigd. De laagste concentratie aan pinda-antigenen waarbij klinische symptomen verwacht worden na orale opname bij mensen met pindanotenallergie, is gemiddeld 6 mg (met een marge van 0.1 tot 50 mg) (16). Andere studies vermelden ongeveer dezelfde resultaten met nevenreacties vanaf 1.5 mg (2) en 21 mg (12) pindanotenextract. Met de ³H-thymidine test kon geen proliferatie aangetoond worden na in vitro restimulatie van lymfocyten na de sublinguale toediening van het pindanotenallergeen. Dit was niet te wijten aan een onvermogen van de cellen om te prolifereren, ConA was immers instaat de cellen sterk te doen vermeerderen. Er zijn verschillende verklaringen voor afwezigheid van vermeerdering: 1) de 52
lymfocyten zijn niet gestimuleerd in vivo, 2) de sublinguale immunisatie onderdrukt proliferatie en dan verwachten we een negatieve test, 3) er is een beperkte (sub)populatie die vermeerdert en er is sterke achtergrondproliferatie waardoor de proliferatie van deze (sub)populatie niet
kan worden
gedetecteerd. Er is in ieder geval veel achtergrondsignaal waargenomen. Het is dus mogelijk dat de frequentie van allergeen-specifieke T cellen in het bloed te laag was om daarboven te komen. Met deze techniek kan immers niet gekeken worden naar proliferatie van bepaalde celpopulaties. Een gelijkaardige beeld werd bekomen in een studie van Veenhof E. Z. et al. (2012) (58). Ook hier werden lymfocyten geïsoleerd bij gezonde honden en werd de proliferatierespons nagegaan via een ³Hthymidine test. Er werd geconstateerd dat de lymfocytenpopulatie duidelijk vermenigvuldigde in het bijzijn van ConA, met zeer variërende SI-indexen. Wanneer de lymfocyten gerestimuleerd werden met het specifieke allergeen, werden zeer lage SI waarden bekomen bij de gezonde honden en was er geen verschil te zien met de SI waarden van honden met voedselallergie (58). De flowcytometrie laat wel toe naar de proliferatie van bepaalde celpopulaties te kijken. De analyse liet een aantal interessante bevindingen zien. Om te beginnen steeg in beide groepen de proliferatie van de CD3+ cellen naarmate de studie vorderde. In de placebogroep kon restimulatie het percentage prolifererende CD3+ cellen niet veranderen. De lymfocyten reageerden niet op het pindanotenextract. Dit in tegenstelling tot de lymfocyten van de SLIT groep honden: hier was het percentage vermenigvuldigende cellen hoger en reageerden de lymfocyten op het einde van de studie duidelijk op het antigeen waarmee ze reeds in contact waren gekomen; de T lymfocyten vertoonden een pindanoten-specifieke reactie. Zelfs ondanks deze verhoogde proliferatie was het percentage T lymfocyten binnen de totale populatie monomorfonucleaire cellen lager op het einde van de studie dan in het begin. Het gemiddelde percentage op dag 48 bedroeg 52% bij de SLIT groep en 68.2% bij de controle groep, in tegenstelling tot een gemiddelde van 79% in beide groepen op dag 17. In de perifere circulatie zouden 80% van de lymfocyten T cellen zijn bij honden, wat hier echter niet opging (33). Hieruit kon worden afgeleid dat het aantal B lymfocyten merkelijk gestegen was in verloop van de studie en/of dat het aantal T lymfocyten gedaald was. Gezien het verhoogd percentage prolifererende CD3+ T cellen is dit laatste onwaarschijnlijker. Als tweede punt werden de CD8+ CD4- cellen geëvalueerd. De percentages waren in beide groepen hoger op het einde dan in het begin, waarbij de controle groep de grootste stijging van CD8+ T lymfocyten vertoonde (in vivo, zonder restimulatie), terwijl het gehalte ongeveer hetzelfde bleef bij de SLIT groep. De lymfocyten van de SLIT groep vermenigvuldigden duidelijk na restimulatie met het allergeen en dezen van de placebo groep reageerden niet op het pindanotenextract. Er werd geconstateerd dat de het percentage prolifererende CD8+ T cellen in beide groepen gestegen was, maar op het einde van de studie was het resultaat dubbel zo hoog bij de controlehonden (in vivo, zonder restimulatie). De grote stijging van dit celtype bij de controlehonden had niets te maken met het pindanotenextract, aangezien deze honden er niet mee in contact gekomen waren. Aangezien er een toename in beide groepen werd gezien, kon dit erop wijzen dat er meer endogene antigenen aanwezig waarop de cytotoxische T lymfocyten reageerden. Echter, geen enkele hond was ziek geworden en alle honden verbleven tijdens de studie in dezelfde ruimte, waardoor de infectiegraad zo 53
goed als gelijk was. Hierdoor leek het voorkomen van endogene antigenen minder waarschijnlijk. Cytotoxische T-lymfocyten kunnen betrokken zijn in tolerantie-inductie door apoptose te induceren. Dit lijkt hier echter onwaarschijnlijk, omdat de placebo-groep niet in contact was gekomen met de pindanotenantigenen. Het gehalte CD4+ CD8- cellen was op het einde van de studie lager dan in het begin en schommelde rond 60% bij de SLIT groep en rond 50% bij de controle groep. Het percentage prolifererende CD4+ T lymfocyten overheerste op het einde van het onderzoek duidelijk bij de SLIT groep ten opzichte van de controle honden, maar waren bij deze eersten opnieuw gelijk aan de beginwaarden, terwijl er een duidelijke afname te zien was in de placebo groep. CD4+ T lymfocyten, onder de vorm van CD4+CD25+ Tregs, spelen onder andere een rol in orale tolerantie waar ze na herhaalde stimulatie met een lage dosis antigeen, een immuunrespons drukken. Het is niet onmogelijk dat de toename van CD4+ T lymfocyten in de SLIT groep wijst op een gestegen aantal Treg cellen zijn, die de proliferatie van andere lymfocyten kunnen onderdrukken. Een interessante aanvulling in deze studie zou de differentiatie zijn geweest tussen Th1, Th2 en Treg cellen. Inderdaad, de meeste onderzoeken suggereren een shift van de Th2 cellen naar de Th1 cellen na sublinguale immunisatie en een stimulatie van de Treg cellen zowel bij mensen als bij muizen (1, 3, 12, 13, 16, 33, 43, 60, 63), maar deze hypothese kan hier enkel worden gestaafd met verder onderzoek. Uiteindelijk werd de gemiddelde verhouding van CD4+/CD8+ cellen beoordeeld. In een gezond menselijk individu zou de populatie circulerende T lymfocyten voor 2/3 bestaan uit CD4+ cellen en voor 1/3 uit CD8+ cellen (36, 66). Bij beide groepen was de verhouding op dag 48 lager dan op dag 17. Dit impliceerde dat het percentage CD8+ cellen gestegen was tijdens de behandelingsprocedure bij alle honden in verhouding tot het percentage CD4+ cellen, dat gedaald was. Deze vaststellingen waren ook frappant aanwezig wanneer beide celtypen apart bekeken werden. Bij de SLIT groep was de verhouding in vivo op dag 27 en dag 48 hoger zonder dan na restimulatie. Dit kan verklaard worden door een in vivo reactie, waarbij het aantal CD4+ T cellen steeg en/of de CD8+ T cellen daalde. Ook na het evalueren van de verhouding CD4+/CD8+ prolifererende T cellen, was gebleken dat de controlehonden een procentueel hoger aandeel aan vermenigvuldigende CD8+ cellen vertoonden in vivo, zelfs na het in rekening brengen van de globaal lagere verhouding in de controle groep. Wanneer de resultaten van de flowcytometrie worden vergeleken met deze van de 3H-thymidine test, is het duidelijk dat de resultaten afkomstig van de flowcytometrie veel specifieker en gevoeliger zijn. In deze studie kon geen pindanoten-specifiek IgE worden aangetoond in het serum en het speeksel. Hieruit kon worden afgeleid dat er ook geen pindanoten-specifieke plasmacellen aanwezig waren die deze antistoffen zouden kunnen produceren. Aangezien dit onderzoek eerder gaat over de inductie van tolerantie dan over klinische verbetering van voedselallergie, werd ook geen stijging van het pindanoten-specifiek IgE verwacht, aangezien nog geen differentiatie is gebeurd naar Th2 cellen die zorgen voor de isotype omschakeling naar IgE bij B lymfocyten. Verschillende onderzoeken tonen eveneens aan dat er minstens 4 maand sublinguaal moet worden behandeld, voordat een stijging van 54
allergeen-specifiek IgE plaats grijpt bij mensen (12, 13, 15) en minimum 9 weken bij muizen (49) met allergie. Na een initiële stijging, treedt vervolgens een daling op (3, 12, 13, 23, 24, 38). Indien er IL-10 kon worden aangetoond met de ELISA, werd gesuggereerd dat de honden Treg cellen produceerden in het bloed die IL-10 secreteerden. Bij muizen is bewezen dat Treg cellen IL-10 produceren als reactie op sublinguale immunotherapie (49). In zowel niet-gerestimuleerd als met pindanoten gerestimuleerd lymfocyten-supernatans kon geen worden IL-10 worden gedetecteerd. Dit kan erop wijzen dat geen IL-10 werd gesecreteerd in het bloed en dat er bijgevolg geen pindanotenspecifieke Treg cellen aanwezig waren in het bloed. De korte tijd van de SLIT therapie, 7 weken, zou hierin een rol kunnen spelen, want een stijging van IL-10 bij de mens werd slechts verwacht na 4 maanden SLIT behandeling (44). Een andere denkpiste zou kunnen zijn dat bij honden de stimulatie van de Treg cellen voornamelijk lokaal tot uiting komt, zoals bij muizen wordt vermoed (50). Ook bij de mens is de productie van IL-10 of de aanwezigheid van Treg cellen reeds aangetoond in de orale mucosa en sublinguale biopten (45). Deze studie heeft haar beperkingen. Om te beginnen was onze hondenpopulatie beperkt. Een totaal van zes honden, waarvan twee controle honden, is zeer weinig om te kunnen gebruiken in statistische berekeningen. Om statische verschillen te zien moeten de effecten zeer duidelijk zijn en deze waren hier niet uitgesproken genoeg. Daarnaast werd eerder het mechanisme van tolerantie-inductie nagegaan, aangezien dit onderzoek uitgevoerd werd bij gezonde honden. Om de effectiviteit hiervan te beoordelen, kunnen verschillende immunologische parameters opgevolgd worden: 1) de inductie van de CD4+ lymfocyten en in het bijzonder de Treg cellen die dankzij producerende cytokinen, vnl. IL-10 en TGF-β, zorgen voor een protectieve immuniteit, 2) het optreden van anergie bij allergeenspecifieke T cellen en 3) het voorkomen van klonale deletie bij Th2 cellen door Fas-gemedieerde apoptose via CD8+ T lymfocyten. In de literatuur wordt veel geschreven over verschillende celtypes, antistoffen en cytokines die beïnvloed worden na een SLIT, zoals onder andere: de B lymfocyten (IgE), de subpopulaties van de CD4+ T lymfocyten: Th1 (IFN-ɣ), Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) en Treg cellen (IL-10 en TGF-β). Buiten IgE en IL-10 werden deze parameters niet geëvalueerd in de studie. Ook de korte onderzoeksperiode speelde parten in het begrijpen van de evolutie van de resultaten. In dit onderzoek werd de opbouwfase gespreid over 7 weken, waarna geen onderhoudsfase werd ingesteld. Een normaal SLIT onderzoek zou 6 tot 12 maanden moeten kunnen duren waar na de opbouwfase best een onderhoudsfase zou plaatsvinden. Wanneer verder wordt gekeken naar het gebruikte allergeen, kan de vraag worden gesteld of honden wel degelijk zo gevoelig zijn aan pindanoten als mensen, hoewel dit voor het beoordelen van de immuunrespons na SLIT geen beperking hoeft te zijn. Er kan overwogen worden of het toevoegen van een adjuvans geen beter resultaat zou hebben opgeleverd. Sun J.B. en zijn collega’s (2007) toonden aan dat sublinguale toediening van het antigeen geconjugeerd met cholera toxine B als adjuvans in muizen een sterke immuunrespons teweeg bracht. Dit uitte zich in tolerantie van de perifere T effector cellen en dus in een lagere reactie van de antigeen-specifieke T cellen. Een inductie van de antigeen-specifieke Treg cellen in de drainerende lymfeknopen, een stijging van TGF-β in het serum, apoptose en klonale deletie van de T effector
55
cellen waren hiervan het resultaat (33). Echter het gebruik van dit adjuvans is niet mogelijk bij mensen, wegens neurotoxiciteit en daarom ook niet aangeraden bij honden. Het begrijpen en doorgronden van de orale tolerantie-inductie is cruciaal om de ontwikkeling van voedselallergie op te helderen en om gerichtere behandelingsmethoden in te kunnen stellen. Onderzoeken naar het gebruik van SLIT zijn gaande bij mensen en muizen met voedselallergie om de immunologische mechanismen van orale tolerantie en voedselallergie beter te ontcijferen. Studies hieromtrent bij honden zijn echter zeldzaam tot onbestaande. Door deze studie zijn de beginselen gelegd voor de evolutie van de immuunrespons en een beter inzicht in de sublinguale inductie van orale tolerantie bij gezonde honden. Het is aangewezen om deze testen nogmaals te herhalen bij gezonde honden voor langere tijd en met hogere doseringen, zodat een hoge dosis tolerantie zou kunnen optreden. Nadien kan dergelijk onderzoek dienen als basis voor een gelijkaardige studie bij honden met voedselallergie. De resultaten kunnen worden vergeleken en onopgeloste vragen zouden eventueel kunnen worden beantwoord. Als volgende stap zou dit alles kunnen worden herhaald bij muizen en mensen, zowel bij gezonde individuen als dezen met pindanotenallergie of andere voedselallergieën. Er zijn een aantal conclusies die genomen kunnen worden na het uitvoeren van dit onderzoek. Er kon worden afgeleid dat door de sublinguale behandeling met pindanotenextract bij gezonde Beagles een shift plaatsvond in de subpopulaties van de T lymfocyten: het aantal CD8+ CD4- cellen steeg voornamelijk in de controle groep, waarbij ook de proliferatiecapaciteit opmerkelijk steeg, terwijl de CD4+ CD8- lymfocyten evenredig daalden in beide groepen, maar wel het hoogste bleven in de SLIT groep, waar ze ook duidelijk beter prolifereerden in vivo. Er kon bovendien geen pindanoten-specifiek IgE worden aangetoond in het serum of in het speeksel en geen IL-10 in het celcultuursupernatans na de 7 weken durende therapie.
56
REFERENTIELIJST 1.
Nurmatov U., Venderbosch I., Devereux G., Simons F.E., Sheikh A. (2012). Allergen-specific oral immunotherapy for peanut allergy. Cochrane Database of Systematic Reviews 9, CD009014
2.
Varshney P., Jones S.M., Scurlock A.M., Perry T.T., Kemper A., Steele P., Hiegel A., Kamilaris J., Carlisle S., Yue X., Kulis M., Pons L., Vickery B., Burks A.W. (2011). A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy and Clinical Immunology 127(3), 654-660
3.
Rolland J.M., Gardner L.M., O’Hehir R.E. (2009). Allergen-related approaches to immunotherapy. Pharmacology and Therapeutics 121(3), 273-284
4.
Mothes N., Valenta R., Spitzauer S. (2006). Allergy testing: the role of recombinant allergens. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 44(2), 125-132
5.
Valenta R., Linhart B., Swoboda I., Niederberger V. (2011). Recombinant allergens for allergen-specific immunotherapy: 10 years anniversary of immunotherapy with recombinant allergens. Allergy 66(6), 775-783
6.
Focke-Tejkl M., Valenta R. (2012). Safety of engineered allergen-specific immunotherapy vaccines. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 12(5), 555-563
7.
Heydenreich B., Bellinghausen I., Lorenz S., Henmar H., Strand D., Würtzen P.A., Saloga J. (2012). Reduced in vitro T-cell responses induced by glutaraldehyde-modified allergen extracts are caused mainly by retarded internalization of dendritic cells. Immunology 136(2), 208-217
8.
Lund L., Henmar H., Würtzen P.A., Lund G., Hjortskov N., Larsen J.N. (2007). Comparison of allergenicity and immunogenicity of an intact allergen vaccine and commercially available allergoid products for birch pollen immunotherapy. Clinical and Experimental Allergy 37(4), 564-571
9.
Pfaar O., Barth C., Jaschke C., Hörmann K., Klimek L. (2011). Sublingual allergen-specific immunotherapy adjuvanted with monophosphoryl lipid A: a phase I/IIa study. International Archives of Allergy and Immunology 154(4), 336-344
10. Moingeon P., Lombardi V., Saint-Lu N., Tourdot S., Bodo V., Mascarell L. (2011). Adjuvants and vector systems for allergy vaccines. Immunology And Allergy Clinics of North America 31(2), 407-419 11. Moingeon P. (2012). Adjuvants for allergy vaccines (abstract). Human Vaccines & Immunotherapeutics 8(10), 14921498 12. Kim E.H., Bird J.A., Kulis M., Laubach S., Pons L., Shreffler W., Steele P., Kamilaris J., Vickery B., Burks A.W. (2011) Sublingual immunotherapy for peanut allergy: Clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy and Clinical Immunology 127(3), 640-646 13. Kostadinova A.I., Willemsen L.E., Knippels L.M., Garssen J. (2013). Immunotherapy- risk/benefit in food allergy. Pediatric Allergy and immunology 24(7), 633-644 14. Zuidmeer-Jongejan L., Fernandez-Rivas M., Poulsen L.K., Neubauer A., Asturias J., Blom L., Boye J., BindslevJensen C., Clausen M., Ferrara R., Garosi P., Huber H., Jensen B.M., Koppelman S., Kowalski M.L., LewandowskaPolak A., Linhart B., Maillere B., Mari A., Martinez A., Mills C.E., Nicoletti C., Opstelten D.J., Papadopoulos N.G., Portoles A., Rigby N., Scala E., Schnoor H.J., Sigursdottir S., Stavroulakis G., Stolz F., Swoboda I., Valenta R., van den Hout R., Versteeg S.A., Witten M., van Ree R. (2012). FAST: Towards safe and effective subcutaneous immunotherapy of persistent life-threatening food allergies. Clinical and Translational Allergy 2(1), 5
57
15. Nowak-Wegrzyn A., Sampson H.A. (2011). Future therapies for food allergies. Journal of Allergy and Clinical Immunology 127(3), 558-573 16. Jones S.M., Pons L., Roberts J.L., Scurlock A.M., Perry T.T., Kulis M., Shreffler W.G., Steele P., Henry K.A., Adair M., Francis J.M., Durham S., Vickery B.P., Zhong X., Burks A.W. (2009). Clinical efficacy and immune regulation with peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology 124(2), 29-300 17. Verlinden A., Hesta M., Millet S., Janssens G.P.J. (2006). Food allergy in dogs and cats: a review. Critical reviews in food science and nutrition 46(3), 259-273 18. Gaschen F.P., Merchant S.R. (2011). Adverse food reactions in dogs and cats. Veterinary clinics of North America: small animal practice 41(2), 361-379 19. Klimek L., Pfaar O. (2013). A comparison of immunotherapy delivery methods for allergen immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology 9(5), 465-474 20. Fleischer D.M., Burks A.W., Vickery B.P., Scurlock A.M., Wood R.A., Jones S.M., Sicherer S.H., Liu A.H., Stablein D., Henning A.K., Mayer L., Lindblad R., Plaut M., Sampson H.A. (2013). Sublingual immunotherapy for peanut allergy: a randomized, double-blind, placebo-controlled multicenter trial. Journal of Allergy and Clinnical Immunology 131(1), 119-127 21. Moran T.P., Vickery B.P., Burks A.W. (2013). Oral and sublingual immunotherapy for food allergy: current progress and future directions. Current Opinion in Immunology 25, 1-7 22. Negri D.R.M., Riccomi A., Pinto D., Vendetti S., Rossi A., Cicconi R., Ruggiero P., Del Giudice G., De Magistris M.T. (2010). Persistence of mucosal and systemic immune responses following sublingual immunization. Vaccine 28(25), 4175-4180 23. Rachid R., Umetsu D.T. (2012). Immunological mechanisms for desensitization and tolerance in food allergy. Seminars in Immunopathology 34(5), 689-702 24. Allam J.P., Novak N. (2011). Local immunological mechanisms of sublingual immunotherapy. Current Opinion in Allergy and CLinical Immunology 11(6), 571-578 25. Compalati E., Braido F., Walter Canonica G. (2013). Sublingual immunotherapy: recent advances. Allergology International 62(4), 415-423 26. Jacobsen L., Wahn U., Bilo M.B. (2012). Allergen-specific immunotherapy provides immediate, long-term and preventive clinical effects in children and adults: the effects of immunotherapy can be categorised by level of benefit the centenary of allergen specific subcutaneous immunotherapy. Clinical and Translational Allergy 2, 8 27. Novak N., Bieber T., Allam J.P. (2011). Immunological mechanisms of sublingual allergen-specific immunotherapy. Allergy 66(6), 733-739 28. van Wijk F., Wehrens E.J., Nierkens S., Boon L., Kasran A., Pieters R., Knippels L.M. (2007). CD4+CD25+ T cells regulate the intensity of hypersensitivity responses to peanut, but are not decisive in the induction of oral sensitization. Clinical & Experimental Allergy 37(4), 572-581 29. Burks A.W., Laubach S., Jones S.M. (2008). Oral tolerance, food allergy, and immunotherapy: Implications for future treatment. Journal of Allergy and Clinical Immunology 161(6), 1344-1350 30. Declercq J. (2012-2013). Aanvullingen in de geneeskundige ziekteleer van de gezelschapsdieren. Deel 2: dermatologie. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, 63-65
58
31. Brandtzaeg P., Pabst R. (2005). Let's go mucosal: communication on slippery ground. Trends in Immunology 25(11), 570-577 32. Weiner H.L., da Cunha A.P., Quintana F., Wu H. (2011). Oral tolerance. Immunological reviews, 241(1), 241-259 33. Sun J.B., Czerkinsky C., Holmgren J. (2007). Sublingual ‘oral tolerance’ induction with antigen conjugated to cholera toxin B subunit generates regulatory T cells that induce apoptosis and depletion of effector T cells. Scandinavian Journal of Immunology, 66, 278–286. 34. Vickery B.P., Burks A.W. (2009). Immunotherapy in the treatment of food allergy: focus on oral tolerance. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 9, 364–370. 35. Goddeeris B.M., Cox E. (2009–2010). Nota’s bij de cursus immunopathologie der huisdieren. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, I/1-I/58, II/1-II/2 36. Goddeeris B.M. (2009-2010). Immunologie der Huisdieren, nota’s. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, I-13/62 – I-15/62; I-38/62 – I-53/62; II-1/55 – II-55/55 37. Oboki K., Ohno T., Saito H., Nakae S. (2008). Th17 and allergy. Allergology International 57(2), 121-134 38. Moingeon P., Mascarell L. (2012). Induction of Tolerance via the Sublingual Route: Mechanisms and Applications. Clinical and Developmental Immunology 623474 39. Sicherer S.H., Leung D.Y. (2008). Advances in allergic skin disease, anaphylaxis, and hypersensitivity reactions to foods, drugs, and insects in 2007. Journal of Allergy and Clinical Immunology 121(6), 1351-1358 40. DeBoer D.J., Verbrugge M., Morris M. (2010). Pilot trial of sublingual immunotherapy in mite-sensitive atopic dogs (abstract). Proceedings, North American Veterinary Dermatology Forum, Portland, OR 41. DeBoer D., Verbrugge M., Morris M. (2010). Changes in mite-specific IgE and IgG levels during sublingual immunotherapy (SLIT) in dust mite-sensitive dogs with atopic dermatitis (abstract). Proceedings, European Society of Veterinary Dermatology/European College of Veterinary Dermatology Meeting, Firenze, Italy 42. Calderon M.A., Simons F.E.R., Malling H.J., Lockey R.F., Moingeon P., Demoly P. (2012). Sublingual allergen immunotherapy: mode of action and its relationship with the safety profile. Allergy 67(3), 302-311 43. Patel V., Liu F., Brown M. (2012). Modeling the oral cavity: In vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. Journal of Controlled Release 161(3), 746-756 44. Enrique E., Pineda F., Malek T., Bartra J., Basagana M., Tella R., Castello J.V., Alonso R., de Mateo J.A., CerdaTrias T., Miguel-Moncin M.D.M., Monzon S., Garcia M., Palacios R., Cistero-Bahima A. (2005). Sublingual immunotherapy for hazelnut food allergy: A randomized, double-blind, placebo-controlled study with a standardized hazelnut extract. Journal of Allergy and Clinical Immunology 116(5), 1073-1079 45. Scadding G.W., Shamji M.H., Jacobson M.R., Lee D.I., Wilson D., Lima M.T., Pitkin L., Pilette C., Nouri-Aria K., Durham S.R. (2010). Sublingual grass pollen immunotherapy is associated with increases in sublingual Foxp3expressing cells and elevated allergen-specific immunoglobulin G4, immunoglobulin A and serum inhibitory activity for immunoglobulin E-facilitated allergen binding to B cells. Clinical and Experimental Allergy, 40(4), 598-606 46. Song J.H., Kim J.I., Kwon H.J., Shim D.H., Parajuli N., Cuburu N., Czerkinsky C. (2009). CCR7-CCL19/CCL21regulated dendritic cells are responsible for effectiveness of sublingual vaccination. Journal of Immunology 182(11), 6851-6860 47. McGhee J.R., Fujihashi K. (2012). Inside the Mucosal Immune System. PLOS Biology 10(9), e1001397
59
48. Mascarell L., Lombardi V., Zimmer A. Louise A., Tourdot S., Van Overtvelt L., Moingeon P. (2009). Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4þ T cells. Clinical and Experimental Allergy, 39(12), 1910–1919. 49. Rask C., Brimnes J., Lund K. (2010). Shorter dosing intervals of sublingual immunotherapy lead to more efficacious treatment in a mouse model of allergic inflammation. Scandinavian Journal of Immunology, 71(6), 403–412. 50. Brimnes J., Kildsgaard J., Jacobi H., Lund K. (2007). Sublingual immunotherapy reduces allergic symptoms in a mouse model of rhinitis. Clinical and Experimental Allergy, 37(4), 488–497. 51. Kulis M., Saba K., Kim E.H., Bird J.A., Kamilaris N., Vickery B.P., Staats H., Burks A.W. (2012). Increased peanutspecific IgA levels in saliva correlate with food challenge outcomes after peanut sublingual immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 129(4), 1159-1162 52. Marcondes Rezende M., Hassing I., Bol-Schoenmakers M., Bleumink R., Boon L., van Bilsen J., Pieters R. (2011). CD4(+) CD25(+) T regulatory cells do not transfer oral tolerance to peanut allergens in a mouse model of peanut allergy. Clinical & Experimental Allergy 41(9), 1324-1333 53. Schmetterer K.G., Neunkirchner A., Pickl W.F. (2012). Naturally occurring regulatory T cells: markers, mechanisms, and manipulation. Faseb Journal 26(6), 2253-2276 54. Berin M.C., Mayer L. (2013). Can we produce true tolerance in patients with food allergy? Journal of Allergy and Clinical Immunology, 131(1), 14-22 55. Passali D., Mösges R., Passali G.C., Passali F.M., Ayoko G., Bellussi L. (2010). Safety, tolerability and efficacy of sublingual allergoid immunotherapy with three different shortened up-dosing administration schedules. Acta Otorhinolaryngologica Italica 30(3), 131-137 56. Pulsawat P., Piboonpocanun S., Sirivichayakul S., Buranapraditkun S., Jacquet A., Shimada M., Okuda K., Ruxrungtham K. (2010). Production and immunogenicity of hypoallergenic codon-optimized DNA vaccine encoding mature Der p 1 allergen. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology 20(7), 582-590 57. Goddeeris B., Cox E., Stuyven E., Jennes M. (2010 – 2011). Aanvullende nota’s bij de practica immunologie. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, 37 – 52 58. Hu V.W., Black G.E., Torres-Duarte A., Abramson F.P. (2002). ³H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA syntheses. Faseb Journal 16(11), 1456-1457 59. Goddeeris B., Cox E., Stuyven E., Jennes M. (2010 – 2011). Aanvullende nota’s bij de practica immunologie. Cursus Faculteit Diergeneeskunde, Gent, 37 – 52 60. Lu X., Liu J.F., Gong Y.F., Wang Z.P., Liu Y., Zhang Q. (2011). Mapping quantitative trait loci for T lymphocyte subpopulations in peripheral blood in swine. BMC Medical Genetics 12, 79 61. D'Acquisto F., Crompton T. (2011). CD3+CD4-CD8- (double negative) T cells: saviours or villains of the immune response? Biochemical Pharmacology 82(4), 333-340 62. Singh S., Yang G., Schluns K.S., Anthony S.M., Sastry K.J. (2014). Sublingual Vaccination Induces Mucosal and Systemic Adaptive Immunity for Protection against Lung Tumor Challenge. Public Library of Science one 9(3), e90001 63. Isogai S., Athiviraham A., Fraser R.S., Taha R., Hamid Q., Martin J.G. (2007). Interferon-gamma-dependent inhibition of late allergic airway responses and eosinophilia by CD8+ gammadelta T cells. Immunology 122(2), 230-238 64. Parham P. (2009). The immune system. Third edition. Garland Science, taylor & Francis Group, LLC, New York, USA, 81, 236, 237
60
65. Veenhof E. Z., Rutten V. P., Knol E. F., Willemse T. (2012). Immune responses in dogs with cutaneous adverse food reactions. Chapter 5: Peripheral blood mononuclear cells of dogs with cutaneous adverse food reactions show a diminishd Th1 response after a provocative diet. Not published, 79-91 66. Foster B., Foroughi S., Yin Y., Prussin C. (2011). Effect of anti-IgE therapy on food allergen specific T cell responses in eosinophil associated gastrointestinal disorders. Clinical and Molecular Allergy 9(1), 7
LIJST MET AFKORTINGEN AG: antigeen APC: antigeen presenterende cel BCA: Bicinchoninic acid CCPM: celtellingen per minuut CD: cluster of differentiation C-DNA: complementaire DNA streng ConA: concanavaline A DC: dendritische cel DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium EPIT: epicutane immunotherapie FCS: hitte-geïnactiveerd foetaal kalfserum FcεR: affiniteit receptor Fcε FoxP3: forkhead box p3 = transcriptiefactor in natuurlijk voorkomend CD4+ CD25+ FSC: Forward Scatter HRP: horseradish-peroxidase IFN-γ: interferon gamma Ig: immunoglobuline = antistof IL: interleukine LPS: lipopolysaccharide mAbs: monoklonale antistoffen MALT: mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel MEM: minimum essentieel medium MHC: major histocompatibiliteitsmolecule MPL: monofosforyl lipid A nTreg: natuurlijk voorkomend CD4+ CD25+ regulatorische T cel OIT: orale immunotherapie PAMP: pathogeen geassocieerd moleculair patroon PBS: Phosphate buffered saline PBST: Phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20 regulatorische T cel RPMI medium: Roswell Park Memorial Instituut medium SCIT: subcutane immunotherapie SI: stimulatie-index sIgA: secretorisch immunoglobuline A SLIT: sublinguale immunotherapie SSC: Sideward Scatter TCR: T cel receptor TGF- β: transforming growth factor β Th1 cel: T helper 1 cel = CD4+ ontstekings T lymfocyt Th2 cel: T helper 2 cel = CD4+ helper T lymfocyt TLR: Toll-like receptor TMB: tetramethylbenzidine TR1: type 1 regulatorische T cel Treg: regulatorische T cel = suppressie T cel Tween: polysorbaat 20 VA: voedselallergie VI: voedselintolerantie
61
LIJST MET FIGUREN Figuur 1: Vroege (type I) fase respons bij allergeen contact (3) ................................................................................................... 7 Figuur 2: Mechanisme van voedselallergie (13)........................................................................................................................... 7 Figuur 3: De werking van het immuunsysteem ter hoogte van de orale mucosa na sublinguale immunotherapie (38). .............. 11 Figuur 4: Celspecifieke aanpassingen na immunotherapie en de gevolgen hiervan (naar 3). .................................................... 13 Figuur 5: Recombinante technologieën voor de vorming van hypoallergene allergenen. In het midden is het eiwit te zien, gevouwen in zijn driedimensionale vorm. De peptiden die instaan voor de vorming van de IgE epitopen zijn roze en rood gekleurd. De peptiden die worden herkend door de T cellen zijn geel, groen en blauw gekleurd (5). ......................................... 20 Figuur 6: Het schema met de dosisaanpassingen tijdens de opbouwfase van de sublinguale immunotherapie. ........................ 29 Figuur 7: Lymfocyten proliferatie protocol: vullen van de microtiterplaten voor de ³H-thymidine test. In de cupjes die groen gekleurd zijn, bevond zich ConA, de positieve controle. De blauwe gekleurde cupjes waren gevuld met het medium, de negatieve controle. Geel staat symbool voor de cupjes waarin pindanotenextract vertoefde. Alle cellen in een rij waren eveneens gevuld met de lymfocytenoplossing van de desbetreffende hond. ............................................................................. 34 Figuur 8: Directe ELISA voor pindanoten-specifiek IgE. ............................................................................................................ 38 Figuur 9: pindanoten-specifieke IgE ELISA Van elke hond werd serum gebruikt van dag 1 en dag 48. Het desbetreffende serum werd verdund zoals aangegeven op de figuur. Er werden telkens 2 cupjes gevuld met hetzelfde serum in dezelfde concentratie. Deze figuur geeft de situatie weer voor hond 1, 2 en 3. Bovendien waren in elke plaat cupjes aanwezig die niet gecoat werden, maar wel gevuld werden met serum van een controlehond (geel) en cupjes die gecoat werden met kippenextract waarbij serum van een hond met voedselallergie werd gevoegd in dezelfde verdunningen als de andere honden (oranje). ............................. 38 Figuur 10: Sandwich ELISA voor IL-10 bepaling, met het streptavidine-biotine vermeerderingssysteem. .................................. 40 Figuur 11: 96-cupjes microtiterplaat voor de IL-10 ELISA. Legende: oranje: de cupjes waarin standaard oplossing kwam; licht blauw: celcultuursupernatans van hond 1; donker blauw: celcultuursupernatans van hond 2; geel: celcultuursupernatans van hond 3; licht groen: celcultuursupernatans van hond 5; rood: celcultuursupernatans van hond 6; donker groen: celcultuursupernatans van hond 4. Er werden vier platen gemaakt waarin zich telkens celcultuursupernatans van dag 11 of dag 48 bevond, dat al dan niet gerestimuleerd was met pindanotenextract. ..................................................................................... 40 Figuur 12: Resultaten van de ³H-thymidine test. Kinetiek van de SI-waarden van de lymfocyten bekomen na stimulatie met ConA en na stimulatie met pindanoten-extract. ......................................................................................................................... 43 Figuur 13: Kinetiek van het percentage CD3+ cellen in het bloed van sublinguaal met pindanotenallergeen geïmmuniseerde en niet-geïmmuniseerde honden, in vitro niet-gerestimuleerd met pindanoten-allergeen. Hond 1 en Hond 3 zijn de nietgerestimuleerde controle dieren (flowcytometrie). ..................................................................................................................... 45 Figuur 14: Kinetiek van subpopulaties T lymfocyten bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). Links de CD4+ CD8cellen, rechts de CD8+ CD4- cellen........................................................................................................................................... 45 Figuur 15: Kinetiek van de verhouding van CD4+/CD8+ cellen bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). ...................................... 46 Figuur 16: Verhouding van prolifererende/niet-prolifererende CD3+ cellen (flowcytometrie). De verhouding zonder lymfocytenstimulatie en na stimulatie door pindanotenextract bij zowel de controle groep als de geïmmuniseerde groep. ........ 47 Figuur 17: De evolutie van de prolifererende CD3+ cellen (flowcytometrie). .............................................................................. 48
62
Figuur 18: Kinetiek van subpopulaties prolifererende T lymfocyten bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). Links de prolifererende CD8+ cellen, rechts de prolifererende CD4+ cellen. .................................................................................................................. 48 Figuur 19: Kinetiek van de verhouding van de prolifererende lymfocyten van een subpopulatie op het totaal aantal lymfocyten van deze populatie bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). Links de verhouding van de CD8+ cellen, rechts de verhouding van de CD4+ cellen. ............................................................................................................................................................................. 49 Figuur 20: Kinetiek van de verhouding van de prolifererende CD4+/CD8+ cellen (flowcytometrie) bij niet (controle) en wel met pindanotenallergeen sublinguaal geïmmuniseerde honden, met en zonder in vitro restimulatie met pindanotenextract (flowcytometrie). ........................................................................................................................................................................ 49 Figuur 21: Foto’s van de IgE ELISA op serum van honden (D1 en D3 zijn controlehonden). De plaat op de linker foto bevatte serum van hond 1, 2 en 3; de plaat op de rechter foto bevatte serum van hond 4, 5 en 6. Elke plaat telde ook cupjes die niet gecoat waren (N), die dienden als negatieve controle. Hiernaast was er ook een positieve controle (FA: Food allergy) aanwezig door cupjes, gecoat met kippeneiwit waarna serum van een hond met kippenallergie werd toegevoegd. .................................. 50 Figuur 22: Resultaten van de pindanoten-specifieke IgE ELISA op het serum van niet-SLIT (controle) en met pindanotenextract sublinguaal geïmmuniseerde honden. ....................................................................................................................................... 50 Figuur 23: Resultaten van de pindanoten-specifieke IgE ELISA op het speeksel, enkele dagen na het beëindigen van de sublinguale toediening............................................................................................................................................................... 51 Figuur 24: Foto’s van de ELISA voor IL-10 supernatans, niet met pindanoten gerestimuleerde lymfocyten. De foto links geeft het IL-10 gehalte op dag 11 weer en de foto rechts geeft het IL-10 gehalte op dag 48 weer. .......................................................... 51 Figuur 25: Resultaten van de pindanoten-specifieke IL-10 ELISA ............................................................................................. 52
LIJST MET TABELLEN Tabel 1: Gevoeligheid aan voedseleiwitten: classificatie (naar 17, 18). ........................................................................................ 3 Tabel 2: Samenvatting van de voor- en nadelen van verschillende immunologische technieken (naar 12, 13, 23, 24, 25, 38, bijlage 1) ................................................................................................................................................................................... 17 Tabel 3: Recombinante technieken voor immunotherapie (naar 5, 6). ....................................................................................... 18 Tabel 4: Karakteristieken van de geselecteerde honden ........................................................................................................... 28 Tabel 5: Verdunningen voor de standaardreeks ........................................................................................................................ 30 Tabel 6: verdunningsreeks pindanotenextract ........................................................................................................................... 31
63
BIJLAGEN Bijlage 1: Marris M., DeBoer D.J. (2012). Sublingual immunotherapy for pets: a guide for veterinary dermatologists.
64
65
66
67
68
69
70
