Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Woord vooraf

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom

Woord vooraf Ik wil graag een aantal mensen bedanken die rechtstreeks of onrechtstreeks bijgedragen hebben tot de realisatie van mijn eindwerk. Eerst en vooral wil ik graag Prof. Dr. Marleen Praet bedanken om het mij mogelijk te maken om mijn stage te volbrengen bij de dienst Pathologie van het Universitair Ziekenhuis te Gent. Speciale dank gaat uit naar Dr. Liesbeth Ferdinande voor de uitstekende begeleiding en voor het kritisch evalueren van mijn eindwerk. In het bijzonder wil ik ook graag Ing. Isabelle Rottiers bedanken voor haar hulpvaardigheid en steun tijdens het tot stand komen van dit eindwerk. Verder wil ik graag de lectoren van de opleiding Biomedische Laboratoriumtechnologie van de Hogeschool West-Vlaanderen campus Simon Stevin bedanken. In het bijzonder wil ik Dr. Nicole Kellner bedanken voor de goede begeleiding en het geven van de nodige tips. Graag wil ik ook al mijn collega s bedanken voor de gezelligheid en de toffe werksfeer. Tenslotte wil ik mijn vriend, Koen, en mijn ouders bedanken voor hun steun en begrip.

1


Samenvatting Bij kankerontwikkeling speelt de interactie tussen het immuunsysteem en de kankercellen een belangrijke rol. Als het immuunsysteem er niet in slaagt om getransformeerde cellen te detecteren en te vernietigen, kan dit leiden tot carcinogenese. Tumoren gebruiken verscheidene mechanismen om te ontsnappen aan immuungemedieerde afstoting. Recente studies suggereren dat indoleamine 2,3dioxygenase (IDO) bijdraagt tot de ontsnapping van de tumorcellen aan het immuunsysteem. IDO is een intracellulair enzyme dat de degradatie van L-tryptofaan katalyseert. Verhoogde IDO-expressie resulteert in een lokale uitputting van tryptofaan en in een accumulatie van katabolische metabolieten. Deze gebeurtenissen veroorzaken inhibitie van T-cel proliferatie en inductie van T-cel apoptose. Dit wordt in de literatuur onder meer beschreven voor colorectale kanker, borstkanker, prostaatkanker, pancreaskanker, enzovoort. Over de expressie van IDO in longcarcinomen en mesotheliomen is echter weinig gekend. Het doel van dit project is om de expressie van IDO te bestuderen aan de hand van immunohistochemie en Western blotting. In een eerste fase van deze studie wordt de expressie van IDO in verschillende longcarcinomen bestudeerd door middel van een immunohistochemische kleuring. Er worden coupes gekleurd van patiënten met adenocarcinoom en spinocellulair carcinoom. Bij beide longcarcinomen wordt er expressie van IDO gezien bij inflammatoire cellen in het peritumoraal stroma en bij tumorcellen. Uit deze resultaten kan besloten worden dat IDO een rol speelt in de tumorbiologie van longcarcinomen. In een tweede fase van dit project wordt onderzocht of de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn IDO tot expressie brengt in basale omstandigheden en na stimulatie met IFN- . IDO-expressie op eiwitniveau wordt nagegaan door middel van Western blotting. Er wordt waargenomen dat cellen die gestimuleerd worden met

2


IFN- na 16u, 24u en 48u een hoge IDO-expressie vertonen. Er is geen expressie van IDO waar te nemen na stimulatie met IFN- na 4u. De cellen die niet met IFN- gestimuleerd worden, vertonen geen IDO-expressie. Deze resultaten tonen aan dat IFN- IDO kan induceren in de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn. Deze cellijn kan dus gebruikt worden bij verder onderzoek naar de functie van IDO in tumoren. In een derde fase van deze studie wordt nagegaan of een immunohistochemische kleuring met een anti-IDO antilichaam diagnostisch kan zijn voor maligne mesothelioom. Het is moeilijk om histologisch een onderscheid te maken tussen subacute pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom. Om na te gaan of het anti-IDO antilichaam bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen sarcomatoïd mesothelioom en pleuritis, wordt de expressie van IDO nagegaan in epithelioïd mesothelioom. Epithelioïd mesothelioom is namelijk het best gedifferentieerde type van mesothelioom. Om de IDO-expressie na te gaan, worden er coupes gekleurd van patiënten met pleuritis en epithelioïd mesothelioom. Bij de coupes van patiënten met pleuritis wordt geen IDO-expressie gezien. Bij de coupes van patiënten met epithelioïd mesothelioom is de expressie van IDO zeer laag. Hieruit kan besloten worden dat het anti-IDO antilichaam waarschijnlijk niet bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom.

3


Lijst met afkortingen en symbolen AEC

3-amino-9-ethylcarbazole

BSA

bovine serum albumin

CEA

carcino-embryonaal antigeen

CK 5/6

cytokeratine 5/6

CT

computertomografie

DAB

3,3 -diaminobenzidine

DMEM

Dulbecco s modified Eagle s medium

EDTA

ethyleendiaminetetra-azijnzuur

EMA

epitheliaal membraan antigeen

FCS

fetal calf serum

HBSS

Hank s buffered salt solution

HIV

human immunodeficiency virus

IDO

indoleamine 2,3-dioxygenase

IL-1

interleukine-1

IL-6

interleukine-6

IL-10

interleukine-10

INF-

interferon-

JAK

Janus kinase

M-CSF

macrophage colony-stimulating factor

MHC klasse I

major histocompatibility complex klasse I

NAD

nicotinamide adenine dinucleotide

NF2

neurofibromatose type 2

NP-40

nonyl phenoxylpolyethoxylethanol-40

PBS

phosphate buffered saline

PDGF

platelet-derived growth factor

PGE2

prostaglandine E2

4


Rb1

retinoblastoom 1

SDS

sodiumdodecylsulfate

SDS-PAGE

sodiumdodecylsulfate

polyacrylamide gel

electrophoresis STAT

signal transducer and activator of transcription

Streptavidine-HRP

streptavidine-horseradish peroxidase

TBS

tris buffered saline

TEMED

tetramethylethyleendiamine

TGF-

transforming growth factor-

TNF

tumor necrosis factor

VEGF

vascular endothelial growth factor

WT1

Wilms tumorsuppressor-gen 1

5


Verklarende woordenlijst (1) A549 cellijn

een humane alveolaire adenocarcinoom epitheelcellijn

Allogeen

betreffende individuen behorend tot dezelfde soort, maar met verschillende erfelijke aanleg

Amfibool

mineraal met een hoge slijtvastheid en bestendigheid

Anaplastisch

verminderde kwaliteit van de celdeling en -groei, waardoor de structuur en de functie van de cellen verloren gaat

Antimycoticum

middel tegen schimmelziekte

Apoptose

geprogrammeerde celdood

-caroteen

de precursor of inactieve vorm van vitamine A

Bifasisch

in twee fasen verlopend

Biotine

vitamine H; bindt aan avidine met hoge affiniteit

Centrale tumor

tumor ligt centraal in het orgaan

Chemiluminescentie

de emissie van licht door een geëxciteerd atoom of molecule

Chromosomen

draadvormige structuren in de celkern die de genen bevatten

Collageen

eiwitbestanddeel

uit

bindweefselvezels

en

(kraak)been Cytokeratine

intermediair keratine gevonden in het intracytoplasmatisch cytoskelet of epitheliaal weefsel

Decidua

de fysiologische groei van het baarmoederslijmvlies onder invloed van zwangerschapshormonen

6


Desmoplastisch

het vormen van adhesies of littekenweefsel in het stroma van een neoplasma (vorming van nieuw weefsel)

Dissolutie

oplossen of ontbinden

EDTA

EDTA bindt de calciumionen die trypsine inhiberen

Endemisch

ziekten komen endemisch voor wanneer ze over een langere tijd in een constante frequentie in een bevolking voorkomen

Endogene peroxidase block

blokkering van het endogene peroxidase

Endotheel

het inwendig epitheel van de bloed- en lymfevaten

Epithelioïd

op epitheelcellen gelijkende cellen

Granulocyt

een witte bloedcel (leukocyt) met korrels (granula) in het cytoplasma

HeLa cellijn

een geïmmortaliseerde cellijn afkomstig van het cervicaal carcinoom van Henrietta Lacks

Hemoptysis

ophoesten van bloed, afkomstig uit de longen of luchtwegen

Idiopathisch

van onbekende oorzaak

Interstitium

tussenruimte; tussenliggend bindweefsel

Ioniserende straling

straling die voldoende energetisch is om een elektron uit de buitenste schil van een atoom weg te slaan; hierdoor krijgt het atoom een positieve lading en wordt het een ion

Isotype controle

antilichaam van hetzelfde isotype als het primair antilichaam; wordt gebruikt als negatieve controle

7


Keratine

hoornstof; komt onder andere voor in nagels, haren en opperhuid

L-glutamine

een aminozuur belangrijk voor de celgroei en -functie

Lupus

een auto-immuunziekte

Mediastinum

ruimte tussen de grote organen (hart, longen en slokdarm) in de borstkas

Mesothelium

eenlagig plaveiselepitheel dat de bekleding vormt van de sereuze vliezen zoals buikvlies, hartzakje en pleurabladen

Metastase

uitzaaiing van de tumor naar andere plaatsen in het lichaam

MHC klasse I

moleculen die zorgen voor de presentatie van antigenen

Mitogenen

zorgen voor het bevorderen van de mitose

Monoclonale antilichamen

antilichamen afkomstig van een enkele cellijn. Eén enkele hybridoma cel, die de juiste V(D)J recombinatie heeft ondergaan om het gewenste antilichaam te produceren, wordt gekloneerd om een grote populatie van identieke cellen te verkrijgen

Mucine

slijmstof

Necrose

het plaatselijk afsterven van weefsel; kan worden veroorzaakt door schadelijke invloeden van buiten af

Nodule

een knobbel; een kleine aggregatie van cellen

Oncofoetaal antigeen

een eiwit dat normaal enkel tot expressie wordt

8


gebracht tijdens de foetale ontwikkeling, maar dat ook tot expressie wordt gebracht bij volwassenen bij bepaalde vormen van kanker Oncogen

cellulair gen die een ongecontroleerde celgroei op gang kan brengen als de sequentie veranderd is of de expressie verkeerd gereguleerd is

Overgangsepitheel

dit komt voor in de blaas en de urinewegen en bestaat uit meerdere cellagen die over mekaar kunnen schuiven, wat nodig is bij sterke oppervlakteveranderingen zoals in de blaas

Papovavirus

DNA-tumorverwekkend virus bij dieren

Pariëtale pleura

deel van de pleura dat de binnenkant van de thoraxwand bekleedt

Perifere tumoren

tumor ligt perifeer in het orgaan

Peritumoraal stroma

steunweefsel dat de tumor omgeeft

Pleurale effusie

doorsijpelen van vloeistof in de pleura

Pleuritis sicca

pleuritis zonder vochtophoping in de pleurale ruimte

Pleuritis exsudativa

pleuritis gepaard gaande met vochtophoping in de pleurale ruimte

Pneumonie

longontsteking

Poliomyelitis

acute virusziekte van het centraal zenuwstelsel (ontsteking van de grijze stof van het ruggenmerg)

Polyclonale antilichamen

antilichamen die afgeleid zijn van verschillende B-cellijnen. Ze zijn een mengsel van immunoglobuline moleculen die gesecreteerd worden tegen een specifiek antigen, maar die elk een verschillende epitoop herkennen 9


Retinoblastoom

kwaadaardig,

dominant-erfelijk

neuro-

epithelioom van het netvlies bij jonge kinderen Retinoïden

klasse van componenten die chemisch verwant zijn aan vitamine A. Retinoïden hebben onder andere een belangrijke rol in regulatie van celproliferatie en -differentiatie, immuunfunctie en de activatie van tumorsuppressor-genen

Reumatoïde artritis

een chronische, systemische auto-immuunziekte

Röntgenstralen

X-stralen; elektromagnetische straling met een zeer korte golflengte en een groot doordringingsvermogen onder andere door weke lichaamsdelen

Sarcomatoïd

sarcoomachtig; sarcoom is een kwaadaardig gezwel van mesenchymaal weefsel

Silicaat

verbinding van silicium en zuurstof

Spinocellulair/squameus

uitgaande van plaveiselepitheel

Streptavidine

eiwit met hoge affiniteit voor biotine

Syncytiotrofoblast

buitenste laagje cellen van het jonge embryo dat contact heeft met de baarmoederwand (meerdere celkernen worden omgeven door één bijbehorend cytoplasma)

Synovium

slijmvliesbekleding van gewrichtsholten, pees scheden en bursae

Tumorsuppressor-gen

gen die een remmende werking heeft op celdeling en -groei

Viscerale pleura

deel van de pleura dat de longen bedekt

Zeoliet

mineraal dat behoort tot de tectosilicaten; het is opgebouwd uit silicium-, aluminium- en zuurstofatomen 10


Lijst van tabellen en figuren Figuren: Figuur 2.1: Röntgenfoto van de thorax (5) ............................................................. 21 Figuur 2.2: Afbeelding van amfibole asbest (9) ...................................................... 23 Figuur 2.3: Aanwezigheid van asbestvezels in de longen (9) ................................ 24 Figuur 2.4: Opbouw van de pleura van de longen (13) ........................................... 29 Figuur 2.5: De kynurenine reactieweg .................................................................. 31 Figuur 2.6: Het principe van de indirecte immunohistochemische kleuring .......... 34 Figuur 2.7: Principe van Western blotting (27) ........................................................ 36 Figuur 2.8: De JAK-STAT-reactieweg (28) ............................................................. 37 Figuur 4.1 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 200x)..................................................................................................................... 51 Figuur 4.2 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 100x)..................................................................................................................... 51 Figuur 4.3 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 100x)..................................................................................................................... 51 Figuur 4.4 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 100x)..................................................................................................................... 52 Figuur 4.5 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 100x)..................................................................................................................... 52 Figuur 4.6 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 100x)..................................................................................................................... 53 Figuur 4.7 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 100x)..................................................................................................................... 53 Figuur 4.8 IDO-immunohistochemische kleuring van spinocellulair carcinoom (vergroting 100x)

........................................................ 54

Figuur 4.9 IDO-immunohistochemische kleuring van spinocellulair carcinoom (vergroting 100x) .................................................................................................. 54 11


Figuur 4.10: Stimulatie van A549 cellijn en HeLa cellijn met INF- na 4u ............. 55 Figuur 4.11: Stimulatie van HeLa cellijn met IFN- na 16u, 24u en 48u ............... 56 Figuur 4.12: Stimulatie van A549 cellijn met IFN- na 16u, 24u en 48u ............... 57 Figuur 4.13: Expressie van IDO bij A549 cellijn en HeLa cellijn na 4u ................. 58 Figuur 4.14: Expressie van IDO bij HeLa cellijn na 16u, 24u en 48u .................... 59 Figuur 4.15: Expressie van IDO bij A549 cellijn na 16u, 24u en 48u .................... 60 Figuur 4.16 IDO-immunohistochemische kleuring van pleuritis (100x) ................. 62 Figuur 4.17 IDO-immunohistochemische kleuring van pleuritis (200x) ................. 62 Figuur 4.18 IDO-immunohistochemische kleuring van epithelioïd mesothelioom (vergroting 200x) .................................................................................................. 64 Figuur 4.19 IDO-immunohistochemische kleuring van epithelioïd mesothelioom (vergroting 200x) .................................................................................................. 64 Figuur 4.20 IDO-immunohistochemische kleuring van epithelioïd mesothelioom (vergroting 100x) .................................................................................................. 65

Tabellen: Tabel 3.1: Aantal gebruikte stalen ........................................................................ 38 Tabel 4.1: Stalen van patiënten met adenocarcinoom .......................................... 50 Tabel 4.2: Stalen van patiënten met spinocellulair carcinoom .............................. 53 Tabel 4.3: Stalen van patiënten met pleuritis ........................................................ 61 Tabel 4.4: Stalen van patiënten met epithelioïd mesothelioom............................. 63

12


Inhoudsopgave WOORD VOORAF ................................................................................................. 1 SAMENVATTING ................................................................................................... 2 LIJST MET AFKORTINGEN EN SYMBOLEN ....................................................... 4 VERKLARENDE WOORDENLIJST (1) ................................................................... 6 LIJST VAN TABELLEN EN FIGUREN ................................................................ 11 INHOUDSOPGAVE .............................................................................................. 13 1

INLEIDING, SITUATIESCHETS EN PROBLEEMSTELLING ....................... 16 1.1 SITUERING ................................................................................................... 16 1.2. INLEIDING ..................................................................................................... 16

2

LITERATUURSTUDIE .................................................................................. 18 2.1 NIET-KLEINCELLIG BRONCHUSCARCINOOM ...................................................... 18 2.1.1 Onderverdeling (2) ............................................................................... 18 2.1.2 Etiologie (2,3) ........................................................................................ 19 2.1.3 Epidemiologie (3) ................................................................................. 19 2.1.4 Symptomen (2) ..................................................................................... 19 2.1.5 Diagnose (4) ......................................................................................... 19 2.2 MESOTHELIOOM ........................................................................................... 21 2.2.1 Onderverdeling (7) ............................................................................... 21 2.2.2 Etiologie (6) .......................................................................................... 22 2.2.2.1 Asbest (8) ...................................................................................... 22 2.2.2.2 Asbestvezels in de longen (6) ....................................................... 23 2.2.2.3 SV 40 (10)...................................................................................... 24 2.2.2.4 Ioniserende straling (7,10) .............................................................. 24 2.2.3 Epidemiologie (6,7) ............................................................................... 24 2.2.4 Chromosomale veranderingen (7) ........................................................ 25 13


2.2.5 Symptomen (8,10) ................................................................................. 26 2.2.6 Diagnose (7) ......................................................................................... 26 2.2.7 Histologische diagnose met behulp van merkers (7,11) ........................ 26 2.2.7.1 Calretinine ................................................................................... 27 2.2.7.2 Cytokeratine 5/6 .......................................................................... 27 2.2.7.3 Wilms tumorsuppressor-gen 1 (WT1) eiwit ................................. 27 2.2.7.4 Epitheliaal membraan antigen (EMA) .......................................... 27 2.2.7.5 Carcino-embryonaal antigeen (CEA) ........................................... 28 2.3 PLEURITIS (12) ............................................................................................... 28 2.3.1 Etiologie .............................................................................................. 29 2.3.2 Symptomen......................................................................................... 29 2.3.3 Diagnose............................................................................................. 29 2.4 INDOLEAMINE 2,3-DIOXYGENASE (IDO) (14) ..................................................... 30 2.4.1 Rol van IDO in tolerantie (16) ............................................................... 32 2.4.2 Rol van IDO in inflammatie (17) ............................................................ 32 2.4.3 IDO-expressie in tumoren (18,19) .......................................................... 32 2.5 PRINCIPE VAN DE GEBRUIKTE TECHNIEKEN ..................................................... 33 2.5.1 Principe van immuunhistochemische kleuring (24) ............................... 33 2.5.2 Principe van Western blotting (26) ........................................................ 34 2.5.3 Stimulatie van cellijnen met IFN- en inductie van STAT-eiwitten (28) . 36 3

MATERIALEN EN METHODEN.................................................................... 38 3.1 IMMUNOHISTOCHEMISCHE DETECTIE VAN IDO OP PARAFFINECOUPES ............... 38 3.1.1 Materiaal ............................................................................................. 38 3.1.2 Methode .............................................................................................. 40 3.2 CELKWEEK EN STIMULATIE VAN DE CELLEN ..................................................... 41 3.2.1 Materiaal ............................................................................................. 41 3.2.2 Methode .............................................................................................. 43 3.3 DETECTIE VAN IDO DOOR MIDDEL VAN WESTERN BLOTTING ............................. 44 3.3.1 Materiaal ............................................................................................. 44 14


3.3.2 Methode .............................................................................................. 47 4

RESULTATEN .............................................................................................. 50 4.1 EXPRESSIE VAN IDO IN LONGCARCINOMEN ..................................................... 50 4.1.1 Adenocarcinoom ................................................................................. 50 4.1.2 Spinocellulair carcinoom ..................................................................... 53 4.2 IN VITRO EXPERIMENT MET A549 CELLIJN ....................................................... 55 4.2.1 Stimulatie met INF-

bevestigen door middel van anti-pSTAT-1

antilichaam .................................................................................................... 55 4.2.2 Expressie van IDO nagaan na 4u, 16u, 24u en 48u door middel van anti-IDO antilichaam ...................................................................................... 58 4.3 EXPRESSIE VAN IDO IN PLEURITIS EN EPITHELIOÏD MESOTHELIOOM................... 61 4.3.1 Pleuritis ............................................................................................... 61 4.3.2 Epithelioïd mesothelioom .................................................................... 63 5

DISCUSSIE ................................................................................................... 66

6

CONCLUSIE ................................................................................................. 69

COLOFON ............................................................................................................ 70 LITERATUURLIJST ............................................................................................. 71 VOOR AKKOORD VERKLARING ....................................................................... 74

15

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Inleiding, situatieschets en probleemstelling

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

1.1

Situering

De stageplaats waar het eindwerk tot stand wordt gebracht, is de dienst Pathologie van het Universitair Ziekenhuis te Gent. Pathologie is het onderdeel van de geneeskunde dat als opdracht heeft een diagnose te stellen en te bevestigen aan de hand van celmateriaal en weefselfragmenten. Kankerdiagnostiek en onderzoek maken een belangrijk aandeel uit van het dagelijks werk op de dienst Pathologie. De dienst coördineert eveneens het nationale mesotheliomenregister, de commissie voor beentumoren en de soft tissue club. Daarnaast draagt de dienst eveneens bij tot de opleiding van studenten geneeskunde en aanverwante disciplines.

1.2. Inleiding Kanker ontstaat wanneer normale, lichaamseigen cellen ontregeld raken en ongecontroleerd beginnen te delen. Het grootste deel van de tumorcellen worden vernietigd door het immuunsysteem. Tumorspecifieke antigenen kunnen opgenomen en verwerkt worden door antigeenpresenterende cellen. De antigeenpresenterende cellen kunnen deze antigenen na intercellulaire afbraak als peptiden aanbieden aan cytotoxische T-cellen in drainerende lymfeknopen. Deze T-cellen kunnen de kankercellen vernietigen. Kankercellen kunnen echter allerlei veranderingen ondergaan waardoor ze aan de immunologische afweerreactie kunnen ontsnappen. Vele tumoren vertonen abnormaliteiten in MHC klasse I expressie waardoor antigeenpresentatie niet kan doorgaan. Tumoren kunnen ook verscheidene cytokines en groeifactoren zoals PDGF, TGF- , enzovoort produceren die het immuunsysteem onderdrukken. Sommige tumorcellen worden resistent tegen de apoptotische mechanismen van het immuunsysteem. Er bestaan nog tal van andere mechanismen via dewelke de tumor het immuunsysteem kan ontwijken.

16

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) katalyseert de degradatie van L-tryptofaan. De daling van tryptofaan en de accumulatie van metabolieten zorgen voor inhibitie van T-cel proliferatie en inductie van T-cel apoptose. Recente studies suggereren dat IDO door de onderdrukking van de T-cel activiteit het immuunsysteem ontwijkt. Over de expressie van IDO in longcarcinomen en mesotheliomen is weinig gekend. Het doel van deze studie is de expressie van IDO na te gaan aan de hand van immunohistochemie en Western blotting. In een eerste fase van dit onderzoek wordt de expressie van IDO in verschillende longcarcinomen nagegaan door middel van een immunohistochemische kleuring. Om deze expressie na te gaan worden er coupes gekleurd van patiënten met adenocarcinoom en spinocellulair carcinoom. Deze coupes worden microscopisch geëvalueerd. In een tweede fase wordt onderzocht of de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn IDO tot expressie brengt in basale omstandigheden en na stimulatie met IFN- . Als positieve controle wordt gebruik gemaakt van de HeLa cervicale carcinoom cellijn. In een derde fase wordt nagegaan of een immunohistochemische kleuring met een anti-IDO antilichaam diagnostisch kan zijn voor maligne mesothelioom. Het is moeilijk om histologisch een onderscheid te maken tussen subacute pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom. Om na te gaan of het anti-IDO antilichaam bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen sarcomatoïd mesothelioom en pleuritis, wordt de expressie van IDO nagegaan in epithelioïd mesothelioom. Epithelioïd mesothelioom is namelijk het best gedifferentieerde type van mesothelioom. Om de IDO-expressie na te gaan, worden er coupes gekleurd van patiënten met pleuritis en epithelioïd mesothelioom. Deze coupes worden microscopisch geëvalueerd.

17

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Literatuurstudie

2

Literatuurstudie

Er bestaan verschillende soorten longkanker. De meest voorkomende kanker is het bronchuscarcinoom. Het bronchuscarcinoom kan onderverdeeld worden in het kleincellige en het niet-kleincellige type. (2)

2.1

Niet-kleincellig bronchuscarcinoom

Het niet-kleincellig bronchuscarcinoom is de meest voorkomende vorm van longkanker (ongeveer 80%). Dit type wordt gekenmerkt door vrij grote cellen. Op basis van een aantal bijkomende kenmerken van de cel, kan de niet-kleincellige tumor nog verder worden onderverdeeld in: het spinocellulair carcinoom, het adenocarcinoom en het grootcellig anaplastisch carcinoom. De bespreking zal echter beperkt worden tot het spinocellulair carcinoom en het adenocarcinoom. (2) 2.1.1

Onderverdeling (2)

Het spinocellulair carcinoom bestaat uit celstrengen die met elkaar versmolten zijn tot een uitgebreid netwerk. De tumorcellen zijn relatief groot, veelhoekig of spoelvormig en zijn steeds met elkaar verbonden door intercellulaire bruggen. De kernen zijn hoekig, onregelmatig en het cytoplasma bevat een wisselende hoeveelheid keratine. Bij verhoorning van een groep cellen ontstaan zogenaamde hoornparels. Spinocellulaire carcinomen ontwikkelen zich meestal in de centrale luchtwegen en minder frequent in de periferie van de long. Adenocarcinomen ontstaan meestal in de periferie van de long. Het adenocarcinoom wordt microscopisch gekenmerkt door tumorale cellen die in klierbuisjes geschikt zijn. Meestal is er ook mucine aantoonbaar in de klierbuisjes. Histologisch zijn adenocarcinomen soms moeilijk te onderscheiden van mesotheliomen.

18


2.1.2

Etiologie (2,3)

Ongeveer 85% van alle gevallen van bronchuscarcinoom worden veroorzaakt door het gebruik van tabak. Passief roken verhoogt ook het risico op longkanker. Naast tabaksgebruik zorgt ook de intensieve blootstelling aan bepaalde chemische stoffen, zoals radon, nikkel, chroom, mosterdgas en arseen voor een verhoging van het risico op bronchuscarcinoom. Er wordt ook gesuggereerd dat het tekort aan bepaalde voedingselementen, zoals

-carotenen en retinoïden, een rol

zou spelen bij de ontwikkeling van longtumoren. 2.1.3

Epidemiologie (3)

Longkanker is de meest frequente en dodelijkste kanker in de geïndustrialiseerde landen. Longkanker komt meer voor bij mannen dan bij vrouwen, maar de incidentie bij vrouwen stijgt wel. De hoogste incidenties worden gezien in Europa (voornamelijk Oost-Europa) en in Noord-Amerika. Longkanker komt voornamelijk voor bij mensen tussen 45 jaar en 65 jaar. 2.1.4

Symptomen (2)

De symptomen zijn afhankelijk van het stadium van de tumor. Klachten in het beginstadium zijn: hoesten (verandering in het hoestpatroon), opgeven van bloed bij het sputum (hemoptysis), kortademigheid met soms piepende ademhaling, aanhoudende heesheid en herhaaldelijk optredende longontstekingen. In een later stadium kunnen door metastasen of door uitbreiding van de tumor nog andere symptomen worden geobserveerd: vergrote lymfeklieren, die zorgen voor slikklachten, pijn in de borstkas door ingroei in de borstwand, botpijn, door uitzaaiingen in het bot en hoofdpijn, door metastasen in de hersenen. 2.1.5

Diagnose (4)

Om de diagnose te stellen van niet-kleincellig bronchuscarcinoom wordt gebruik gemaakt van röntgenradiografie, computertomografie (CT) en bronchoscopie.

19


Bij röntgenradiografie worden door middel van röntgenstralen beelden van het lichaam gemaakt (figuur 2.1). Een röntgenfoto van de thorax wordt ook wel een thoraxfoto genoemd. De afwijkingen die op een thoraxfoto te zien zijn, kunnen heel verschillend zijn: de tumor kan zich presenteren als een pulmonaire nodule of een massa met uitlopers. De detectiegrens van deze techniek ligt op ongeveer 10 mm voor perifere tumoren en op 20 mm voor centrale tumoren. Om een duidelijk beeld van het onderzochte lichaamsdeel te verkrijgen, wordt een CT-scan uitgevoerd. Bij een CT-scan wordt met behulp van röntgenstralen een serie beelden gemaakt van dunne dwarse doorsneden van de longen. De röntgenbuis die in een CT-scan zit, draait 360° rond de patiënt en maakt een driedimensionele weergave van het onderzochte lichaamsdeel mogelijk. Meestal wordt bij een CT-scan intraveneus contrastmiddel geïnjecteerd om de tumor en/of de lymfeklieren beter te kunnen onderscheiden. De CT-scan biedt het voordeel kleinere longnoduli (kleiner dan 5 mm) te kunnen detecteren. Bovendien laat de CTscan beter toe om de anatomische verhouding tussen het letsel en de overige longstructuur te bepalen. Een bronchoscopie is een onderzoek waarbij de arts rechtstreeks in de trachea en de bronchi kan kijken met behulp van een bronchoscoop. Aan de hand van een bronchoscopie kunnen afwijkingen van het slijmvlies worden opgespoord en kunnen er ook weefselbiopsies worden verkregen. Deze weefselbiopsies zijn vereist om de definitieve diagnose te kunnen stellen.

20


Figuur 2.1: Röntgenfoto van de thorax

2.2

(5)

Mesothelioom

Mesotheliomen zijn tumoren die zich ontwikkelen in het mesothelium. Het mesothelium is een dunne laag die de organen omgeeft. De pleura vormt het mesothelium van de longen, het peritoneum van de buikholte en het pericardium van het hart. Pleurale mesotheliomen worden onderverdeeld in vier histologische types, namelijk sarcomatoïd, epithelioïd, bifasisch en desmoplastisch mesothelioom. (6) 2.2.1

Onderverdeling (7)

Het epithelioïd mesothelioom komt het meest voor, namelijk in 50% tot 70% van de gevallen. De individuele cellen van dit type mesothelioom hebben een relatief uniforme vorm met een uniek tubulair patroon. Hun celnucleus kan goed onderscheiden worden van andere celnuclei. Het sarcomatoïd mesothelioom komt het minst voor, namelijk in 10% tot 15% van de gevallen. Dit type mesothelioom tast verschillende weefsels aan zoals been, spieren, kraakbeen en/of vet. De prognose van dit type is veel slechter dan van de andere types. De cellen van dit type hebben een ovale, onregelmatige vorm. Een weinig voorkomende, maar belangrijke variant van sarcomatoïd mesothelioom is het desmoplastisch mesothelioom. Dit subtype omvat 5% van alle ge-

21


vallen van mesothelioom. In de meeste gevallen is het celtype sarcomatoïd, maar het kan ook geïdentificeerd worden als een component van bifasische tumoren. Een nuttige diagnostische eigenschap is collageennecrose. Dit wordt gezien in 70% van de gevallen. 20% tot 40% van de gevallen zijn bifasische mesotheliomen. Het bifasisch mesothelioom is een combinatie van epithelioïd en sarcomatoïd mesothelioom. 2.2.2

Etiologie (6)

De belangrijkste oorzaak voor het ontwikkelen van een mesothelioom is de blootstelling aan asbest. Simian virus 40 (SV 40) wordt ook geassocieerd met de ontwikkeling van kwaadaardige mesotheliomen. In zeldzame gevallen wordt mesothelioom ook geassocieerd met de blootstelling aan ioniserende straling. 2.2.2.1 Asbest (8)

Asbest is de verzamelnaam van een groep van natuurlijk voorkomende silicaten. Asbestvoorraden komen voornamelijk voor in Zuid-Amerika, Rusland en Canada. Asbest is vuurresistent, duurzaam, sterk, flexibel en is een goede elektrische en warmte isolator. Omwille van deze eigenschappen wordt asbest gebruikt in verschillende toepassingen, zoals isolatiematerialen, huishoudproducten, vloertegels, elektrische bedrading, verven en cement. Asbestvezels kunnen opgedeeld worden in twee groepen, namelijk de serpentines of spiraalvormige vezels en de amfibolen of rechte vezels. De belangrijkste serpentinevezel is chrysotiel (witte asbest). Amfibolen zijn scherp en zeer resistent tegen chemische en biologische dissolutie (figuur 2.2). Ze kunnen onderverdeeld worden in vijf groepen, namelijk crocidoliet (blauwe asbest), amosiet (bruine asbest), tremoliet (een veel voorkomende contaminant van chrysotiel), anthophylliet (een veel voorkomende contaminant van industriële talk) en actinoliet.

22


Figuur 2.2: Afbeelding van amfibole asbest

(9)

2.2.2.2 Asbestvezels in de longen (6)

Inhalatie van de asbestpartikels gebeurt voornamelijk door de neus. Asbestvezels met een diameter kleiner dan 3 µm en een lengte kleiner dan 200 µm kunnen diep in de longen doordringen. Vezels met een grotere afmeting worden door trilhaartjes en slijm in de luchtwegen gevangen en teruggevoerd naar de mond. De partikels kunnen ook gefagocyteerd worden door alveolaire macrofagen. De probabiliteit van het vangen van het partikel neemt toe met de lengte. Een uitzondering hierop zijn de rechte vezels met een hoge lengte-tot-breedte ratio. Een voorbeeld hiervan zijn de amfibole vezels. Partikels die niet gevangen worden, kunnen zich verspreiden in de distale luchtwegen. De partikels kunnen een impact hebben op het epitheel of doordringen in het interstitium (figuur 2.3). Uit de distale luchtwegen kunnen de vezels enkel verwijderd worden door translocatie via het lymfatisch systeem, of door fagocytose en dissolutie door lokale macrofagen. Macrofagen internaliseren de partikels en proberen ze te vernietigen door de productie van lytische enzymen en het vormen van een zuur milieu. Bepaalde asbestvezels weerstaan echter de zure aanval in macrofagen en blijven jaren in de longen aanwezig.

23


Figuur 2.3: Aanwezigheid van asbestvezels in de longen

(9)

2.2.2.3 SV 40 (10)

SV 40 is een papovavirus dat endemisch en niet-pathogeen is in resusapen. De vaccins tegen poliomyelitis werden initieel geproduceerd in niercelculturen afkomstig van resusapen. Door vaccinatie is het SV 40 virus in de menselijke populatie terecht gekomen. Er is een associatie tussen SV 40 en sommige humane tumoren, inclusief mesothelioom. Er is echter niet geweten of dit een causale associatie is. 2.2.2.4 Ioniserende straling (7,10)

Ioniserende straling veroorzaakt directe DNA schade. Er zijn een klein aantal gevallen van pleuraal mesothelioom geobserveerd bij patiënten die radiotherapeutisch behandeld werden voor Hodgkin lymfoom. De bijdrage van ioniserende straling aan de ontwikkeling van mesothelioom is wellicht zeer beperkt. 2.2.3

Epidemiologie (6,7)

Amfibole asbest wordt sterk gereguleerd of is gebannen uit het grootste deel van Europa en de Verenigde Staten. Het wordt echter wel nog steeds gebruikt in sommige ontwikkelingslanden. Omdat asbestblootstelling in Europa voorkomt via

24


beroepsblootstelling, is de incidentie van mesothelioom hoger in gebieden met industrieën die asbest gebruiken, zoals in de scheepsbouw. Aangezien voornamelijk mannen in deze industrieën werken, is de man-tot-vrouw ratio bij kwaadaardig mesothelioom hoog, namelijk 3 op 1. Ook sommige geografische gebieden zijn geassocieerd met een hogere mesothelioom-incidentie. Deze omvatten de gebieden waar asbest natuurlijk voorkomt en ontmijnd wordt, onder andere Rusland, Canada, Noord-Italië, West-Australië, Kazakstan en Kaapstad in Zuid-Afrika. In Turkije is de hoge incidentie van mesothelioom geassocieerd met het voorkomen van de zeoliet erioniet. De incidentie van mesotheliomen in de ontwikkelde landen zou moeten dalen door het dalend gebruik van asbest en de betere regulering. De incidentie zal echter wel stijgen in de ontwikkelingslanden, waar het gebruik van asbest slecht of helemaal niet gereguleerd is. Bijgevolg zal het voorkomen van mesotheliomen wereldwijd een groot gezondheidsprobleem blijven. 2.2.4

Chromosomale veranderingen (7)

Analyse van de interacties tussen de asbestvezels en het DNA heeft aangetoond dat de gefagocyteerde vezels de mogelijkheid hebben zich vast te hechten aan chromosomen. Dit contact kan complexe abnormaliteiten veroorzaken. Er worden frequent numerieke en structurele chromosomale abnormaliteiten gezien bij de chromosomen 1, 4, 6, 9, 13 en 17. Er wordt ook vaak monosomie van chromosomen 11 en 21 gezien. Karyotyperingsstudies hebben aangetoond dat de meeste kwaadaardige mesotheliomen meerdere chromosomale abnormaliteiten hebben. De meeste hebben 10 of meer identificeerbare veranderingen. Er worden ook veranderingen gezien in oncogenen en tumorsuppressor-genen, zoals p53, p14, p15, p16, NF2 (neurofibromatose type 2), WT1 (Wilms tumorsuppressor-gen 1) en Rb1 (retinoblastoom 1).

25


2.2.5

Symptomen (8,10)

De meeste patiënten met een pleuraal mesothelioom zijn mannen ouder dan 50 jaar. De eerste klachten zijn: pijn of een onaangenaam gevoel in de borstkas, kortademigheid en hoesten. Constitutionele symptomen zoals moeheid en vermagering kunnen ook optreden, maar deze verschijnen meestal in een later stadium van de ziekte. Pijn treedt vooral op als de tumor ingroeit in de borstwand. Kortademigheid ontstaat door de vochtophoping tussen de longvliezen en door ingroei van de tumor die als het ware een kapsel vormt rond de long. In 40% van de gevallen is er een metastase van de tumor naar de lokale lymfeknopen. 2.2.6

Diagnose (7)

Om de diagnose van een pleuraal mesothelioom te stellen, wordt gebruik gemaakt van röntgenradiografie, computertomografie en thoracoscopie. De röntgenfoto laat meestal een uitgebreide pleuritis zien met soms pleurale verdikking, pleurale effusie en pleurale verkalking. Als de thoraxfoto s abnormaliteiten vertonen in de pleura of in de longen wordt een CT-scan uitgevoerd. Een CT-scan helpt de locatie, de grootte en de uitgebreidheid van de tumor te bepalen. Naast de pleurale effusie en verdikking, kan de CT-scan ook een indicatie geven over abnormaliteiten in de borstkaswand of in de lymfeknopen. Om een histologische diagnose te kunnen stellen, wordt een thoracoscopie uitgevoerd. Een thoracoscopie laat toe om onder visuele controle grote biopsies te nemen van de pariëtale en viscerale pleura. 2.2.7

Histologische diagnose met behulp van merkers (7,11)

Zelfs aan de hand van grote pleurale biopsies is de histologische diagnose van kwaadaardig pleuraal mesothelioom moeilijk te stellen. Om toch een definitieve diagnose te kunnen stellen, wordt gebruik gemaakt van een panel van merkers.

26


De meest gebruikte merkers zijn calretinine, cytokeratine 5/6 (CK 5/6), Wilms tumorsuppressor-gen 1 (WT1) eiwit, epitheliaal membraan antigeen (EMA) en carcino-embryonaal antigeen (CEA). 2.2.7.1 Calretinine

Calretinine is een calciumbindend eiwit dat tot expressie wordt gebracht in het centraal en perifeer zenuwstelsel en in het mesothelium. Calretinine is positief voor alle epithelioïde mesotheliomen en voor de meerderheid van de sarcomatoïde mesotheliomen. 2.2.7.2 Cytokeratine 5/6

Cytokeratine 5 is een basisch type van cytokeratine dat tot expressie komt in de basale en de intermediaire lagen van meerlagig epitheel, overgangsepitheel en mesothelium. Cytokeratine 6 is een basisch cytokeratine dat tot expressie wordt gebracht in proliferend squameus epithelium en in epidermale aanhangsels. CK 5/6 wordt gebruikt om een onderscheid te maken tussen epithelioïd mesothelioom en adenocarcinoom van de long, maar sluit geen metastatisch carcinoom uit. Het is vaak negatief voor sarcomatoïd mesothelioom. 2.2.7.3 Wilms tumorsuppressor-gen 1 (WT1) eiwit

Het WT1 eiwit wordt tot expressie gebracht in de foetale milt, het mesothelium en de nier. Dit genproduct is nuttig om een onderscheid te maken tussen epithelioïd mesothelioom en adenocarcinoom. 2.2.7.4 Epitheliaal membraan antigen (EMA)

Het epitheliaal membraan antigen behoort tot een heterogene groep menselijke melkvetglobule-eiwitten. EMA komt tot expressie bij zowel pulmonair adenocarcinoom als bij mesothelioom, maar het patroon van distributie van de merker verschilt tussen beide tumoren. Bij mesotheliale cellen is het EMA vooral gelokali-

27


seerd op het celoppervlak, terwijl het EMA bij het adenocarcinoom exclusief intracytoplasmatisch voorkomt. 2.2.7.5 Carcino-embryonaal antigeen (CEA)

Het carcino-embryonaal antigeen is een oncofoetaal glycoproteïne. Het komt voornamelijk voor bij adenocarcinomen die ontstaan uit het colon en de long. Mesotheliale cellen bezitten karakteristiek geen CEA-epitopen. Het antilichaam gericht tegen CEA wordt gebruikt om het onderscheid te maken tussen pulmonair adenocarcinoom en epithelioïd mesothelioom.

2.3

Pleuritis (12)

Pleuritis staat voor de ontsteking of de inflammatie van de pleura. De pleura is een sereus membraan van platte mesotheelcellen. De pleura bestaat uit een viscerale en pariëtale membraan (figuur 2.4). De viscerale pleura bekleedt de longen. De pariëtale pleura bedekt de binnenkant van de thoraxwand. Tussen de twee membranen bevindt zich de pleurale ruimte. In de pleurale ruimte is een dunne film pleuravocht aanwezig, die ervoor zorgt dat de membranen over elkaar glijden bij het ademen. Er kan sprake zijn van een zogenaamde droge pleuritis (pleuritis sicca) zonder vochtophoping in de pleurale ruimte of van een natte pleuritis (pleuritis exsudativa) met extra vocht in de pleurale ruimte. Pleuritis kan een acuut, subacuut of chronisch verloop hebben. Een subacute pleuritis ontstaat meestal bij personen die al lijden aan een chronische pleuritis.

28


Figuur 2.4: Opbouw van de pleura van de longen

2.3.1

(13)

Etiologie

Pleuritis treedt op als complicatie van ziekten zoals pneumonie, longembolie, alvleesklierontsteking, acute virale infectie, kanker, lupus, reumatoïde artritis, na een verwonding van de borst of na een hartoperatie. In sommige gevallen is de oorzaak ongekend. Dit wordt aangeduid als idiopathische pleuritis. 2.3.2

Symptomen

Het meest voorkomende symptoom van pleuritis is pijn in de borst of pleuritische borstpijn. Andere symptomen van pleuritis zijn hoesten, rillingen, kortademigheid, gewichtsverlies, pleurale effusie, vermindering van eetlust, snelle en oppervlakkige ademhaling, jeuk aan de rug (op de plaats waar de longen zich bevinden), vermoeidheid en duizeligheid. 2.3.3

Diagnose

Het nemen van een thoraxfoto is de eerste stap in het stellen van de diagnose van pleuritis. Op de thoraxfoto kunnen kleine hoeveelheden vloeistof in de pleurale ruimte worden gevisualiseerd. Om de long en de precieze locatie van de pleurale

29


vloeistof duidelijker in beeld te brengen, wordt een CT-scan gemaakt. Om de precieze oorzaak van pleuritis te achterhalen, dient het pleuravocht geanalyseerd te worden. Het pleuravocht wordt verkregen via een pleurapunctie of een thoracentese. Bij deze procedure wordt met een naald tussen de ribben in de pleurale ruimte geprikt om het pleuravocht te extraheren.

2.4

Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) (14)

Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) is een intracellulair enzyme dat de degradatie van L-tryptofaan tot N-formylkynurenine katalyseert. Dit is de initiële en snelheidsbepalende stap in de kynurenine reactieweg (figuur 2.5). Deze reactieweg leidt tot de biosynthese van nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Doordat het tryptofaan vrij doorheen de plasmamembraan kan migreren, resulteert IDO-expressie in een uitputting van tryptofaan in het extracellulair milieu dat de cel omgeeft. Zowel de uitputting van het tryptofaan als de accumulatie van katabolische metabolieten, onder andere L-kynurenine, 3-hydroxykynurenine en 3-hydroxyanthranilinezuur, inhiberen T-cel proliferatie en induceren T-cel apoptose. Het kritische niveau van de tryptofaanconcentratie voor T-cel proliferatie is 1 à 2 µM. Daling onder dit niveau zorgt ervoor dat de T-cellen niet kunnen overgaan naar de S fase van de celcyclus.

30


Figuur 2.5: De kynurenine reactieweg L-tryptofaan wordt door IDO omgezet in kynurenine. Dit kynurenine wordt door het kynurenine 3hydroxylase omgezet in 3-hydroxykynurenine. 3-hydroxykynurenine wordt via het kynureninase omgezet in het 3-hydroxyanthranilinezuur. Dit laatste wordt omgezet in quinolinezuur. Het quinolinezuur wordt via het quinolinezuur fosforibosyltransferase omgezet tot nicotinamide. Dit laatste wordt dan omgezet tot NAD.

(15)

31


2.4.1

Rol van IDO in tolerantie (16)

IDO speelt een belangrijke rol in de maternale tolerantie tegen de allogenische foetus. Enkele dagen na de implantatie starten syncytiotrofoblastcellen in de placenta en in de maternale decidua met de productie van IDO. De cellen die IDO tot expressie brengen zorgen voor de onderdrukking van de maternale T-cel respons tegen de foetus. IDO wordt ook constitutief of inductief tot expressie gebracht in de placenta, de longen, de darm, het colon, de milt, de lever, de nieren, de maag en de hersenen. Deze IDO-expressie in normaal weefsel zorgt voor endogene tolerantie ten opzichte van antigenen. 2.4.2

Rol van IDO in inflammatie (17)

IDO medieert de immunologische defensiemechanismen. Inflammatoire cellen die IDO-expressie vertonen, zorgen door een uitputting van tryptofaan dat geïnfecteerde cellen in apoptose gaan en dat microörganismen sterven. Er werd reeds aangetoond dat dit mechanisme werkzaam is tegen een groot aantal virale en microbiële intracellulaire pathogenen onder andere HIV, Toxoplasma en Chlamydia. IDO kan in verschillende cellen geïnduceerd worden door inflammatoire cytokines zoals INF- , IL-1, TNF of door mitogenen zoals lipopolysaccharide. 2.4.3

IDO-expressie in tumoren (18,19)

Bij kankerontwikkeling speelt de interactie tussen het immuunsysteem en de tumorcellen een belangrijke rol. Als het immuunsysteem er niet in slaagt om getransformeerde cellen te detecteren en te vernietigen, kan dit leiden tot carcinogenese. Tumoren gebruiken verscheidene mechanismen om te ontsnappen aan immuungemedieerde afstoting. Verscheidene factoren, zoals TGF- , IL-10, VEGF, IL-6, M-CSF en PGE2, worden gesecreteerd door de tumor en zijn belangrijke mediatoren van het tumoraal ontsnappingsmechanisme. Deze tolerantiemechanismen zorgen voor de blokkering van de initiële respons tegen tumorantigenen en inhiberen het doden van de tumorcellen door geactiveerde T-lymfocyten. Er

32


wordt gesuggereerd dat IDO zou bijdragen aan deze processen. Uyttenhove e.a. toonden aan dat transfectie van IDO in de P815 carcinoom cellijn afstoting voorkomt en dat de getransfecteerde tumorcellen kunnen ontsnappen aan het immuunsysteem.

(20)

Expressie van IDO door kankercellen en antigeenpresenteren-

de cellen werd reeds gedetecteerd in de tumor infiltrerende zone, in de peritumorale stroma en in de tumor-drainerende lymfeknopen.

(21,22)

Studies met behulp

van serummerkers tonen aan dat IDO chronisch geactiveerd is in vele patiënten met kanker en dat IDO gecorreleerd is met een meer extensief ziektebeeld.

(21)

Karanikas e.a. toonden aan dat IDO-expressie hoger is in longtumorweefsel dan in gezond longweefsel. (23)

2.5

Principe van de gebruikte technieken

2.5.1

Principe van immuunhistochemische kleuring (24)

Door een immunohistochemische kleuring uit te voeren op cellen of op weefselmonsters, kunnen specifieke antigenen worden aangetoond. Bij de indirecte methode worden er twee antilichamen gebruikt: een primair en een secundair antilichaam (figuur 2.6). In de eerste stap hecht een niet-gelinkt primair antilichaam zich aan het weefselantigeen. Vervolgens bindt een gebiotinyleerd secundair antilichaam op het primair antilichaam. Daarna vindt een incubatie plaats met een complex dat is opgebouwd uit het eiwit streptavidine en het enzyme horseradish peroxidase. Toevoeging van een kleurvormende stof, zoals 3,3 -diaminobenzidine (DAB) of 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) leidt tot een kleurreactie, die de verspreiding van het betreffende antigeen in het weefselmonster nauwkeurig aangeeft. Deze kleurreactie kan worden gevisualiseerd aan de hand van lichtmicroscopie.

33


Figuur 2.6: Het principe van de indirecte immunohistochemische kleuring Het weefselantigeen wordt gebonden door het primair antilichaam. Het primair antilichaam wordt op zijn beurt gebonden door het gebiotinyleerd secundair antilichaam. Daarna is er een incubatie met streptavidine en peroxidase. DAB of AEC zorgen voor de kleurreactie.

2.5.2

(25)

Principe van Western blotting (26)

Bij Western blotting of immunoblotting worden eiwitten gescheiden op basis van hun moleculaire massa. Deze scheiding gebeurt door middel van natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). SDS ontvouwt eiwitten tot lineaire strengen en geeft ze een negatieve lading. Door toevoeging van 2mercapto-ethanol aan het eiwitmengsel neemt het aantal inwendige zwavelbruggen af. Dit draagt eveneens bij tot de ontvouwing van het eiwit. Om de eiwitten te scheiden, worden ze in een polyacrylamidenetwerk gebracht waarover een spanningsverschil wordt aangelegd (figuur 2.7). Polyacrylamide is een poreuze gel die gevormd wordt door de polymerisatie van het acrylamide monomeer in lange ketens. Deze ketens worden kruislings verbonden door methyleenbisacrylamide. De polymerisatie wordt op gang gebracht door vrije radicalen die gevormd worden door ammoniumpersulfaat of TEMED. De grootte van de poriën in de gel kan gevarieerd worden door het percentage acrylamide te wijzigen. Hoe hoger het percentage acrylamide, hoe kleiner de poriën. De grote moleculen kunnen slechts moeizaam doorheen de poriën diffunderen. De kleinste moleculen bewegen sneller, omdat ze in verschillende oriëntaties doorheen de poriën kunnen migreren.

34


Omdat de eiwitten in een polyacrylamidegel niet goed toegankelijk zijn (voor bijvoorbeeld binding met antilichamen om specifieke eiwitten te detecteren), worden de eiwitten overgebracht op een fixerende nitrocellulosemembraan. Dit is de eigenlijke blotting. De uniformiteit en de effectiviteit van de transfer van de eiwitten van de gel naar het membraan, kan worden nagegaan door kleuring van het membraan met Ponceau S. De eiwitten op het membraan kunnen door specifieke antilichamen worden gedetecteerd. Vooraleer de detectie met antilichamen kan plaatsvinden, moet het membraan eerst geblokkeerd worden. Dit is nodig om te voorkomen dat de antilichamen binden aan het membraan in plaats van aan de eiwitten. Dit kan bereikt worden door het membraan te verzadigen met een eiwitoplossing zoals poedermelk of bovine serum albumin (BSA). Bij de eigenlijke immunoblotting wordt het membraan eerst geïncubeerd met een primair antilichaam gericht tegen het doelwiteiwit. Daarna wordt een secundair antilichaam toegevoegd dat gericht is tegen het primair antilichaam. Dit secundair antilichaam is geconjugeerd met het enzyme horseradish peroxidase (HRP). Vervolgens wordt een chemiluminescente stof, namelijk luminol, toegevoegd. In aanwezigheid van waterstofperoxide katalyseert HRP de oxidatie van luminol. Het geëxciteerde reactieproduct zendt licht uit tot het zijn grondtoestand bereikt. De chemiluminescentie wordt opgevangen op een fotografische film.

35


Figuur 2.7: Principe van Western blotting

2.5.3

(27)

Stimulatie van cellijnen met IFN- en inductie van STAT-eiwitten (28)

Cytokines zoals IFN- veroorzaken responsen in doelwitcellen door veranderingen in genexpressie te induceren. Bij IFN- gebeurt dit via receptorgemedieerde activatie van specifieke transcriptiefactoren. Deze transcriptiefactoren migreren naar de nucleus om bepaalde genelementen in de promotors van IFN-induceerbare

36


genen te binden en genexpressie te induceren. Het prototype interferon- induceerbare transcriptiefactoren zijn de signal transducers and activators of transcription (STAT) -eiwitten. IFN- -receptor interacties veroorzaken Janus kinase activatie via fosforylering. De activering van het Janus kinase (JAK) leidt tot de recrutering en de fosforylatie van STAT-eiwitten op tyrosine residuen. Geactiveerde STAT-eiwitten dimeriseren tot STAT-complexen. IFN- / zullen STAT-2, STAT3 en STAT-5 activeren, terwijl IFN- STAT-1 zal activeren. Door de expressie van het gefosforyleerd STAT-1 eiwit na te gaan via Western blotting, kan worden aangetoond dat er stimulatie met IFN- is uitgevoerd. Er zijn twee STAT-1 eiwit subeenheden, namelijk STAT-1

en STAT-1 . Het STAT-1 heeft een moleculair

gewicht van 91 kDa. Het STAT-1 heeft een moleculair gewicht van 84 kDa. Deze eiwitten ontstaan uit één gen door alternatieve splicing.

Figuur 2.8: De JAK-STAT-reactieweg

(28)

37

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Materialen en methoden

3

Materialen en methoden

3.1

Immunohistochemische detectie van IDO op paraffinecoupes

In een eerste fase van het onderzoek wordt de expressie van IDO in verschillende longcarcinomen nagegaan door middel van een immunohistochemische kleuring. Om de expressie na te gaan, worden coupes gekleurd van patiënten met adenocarcinoom en spinocellulair carcinoom. In de derde fase van het onderzoek wordt nagegaan of een immunohistochemische kleuring met een anti-IDO antilichaam diagnostisch kan zijn voor maligne mesothelioom. Om de IDO-expressie na te gaan, worden er coupes gekleurd van patiënten met pleuritis en epithelioïd mesothelioom. Voor beide projecten van deze studie wordt dezelfde methode gebruikt. 3.1.1

Materiaal

Stalen Tabel 3.1: Aantal gebruikte stalen

Aantal stalen* Pleuritis

10

Epithelioïd mesothelioom

7

Adenocarcinoom

8

Spinocellulair carcinoom

6

*Voor de staalnummers zie tabellen bij resultaten

Buffers Citraatbuffer (0,01 M): 1,47 g trinatriumcitraat-2H2O + 400 ml gedestilleerd water Op pH 6 brengen met behulp van pH meter door toevoegen van 5 M HCl Aanlengen met gedestilleerd water tot 500 ml TBS (Tris Buffered Saline): 0,05 M Tris-HCl, 0,85% NaCl pH 7,65 100 ml Tris buffer 10x 38


100 ml NaCl 10x Aanlengen met gedestilleerd water tot 1 l Tris buffer 10x: 60,55 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan + 700 ml gedestilleerd water Op pH 7,65 brengen met behulp van pH meter door toevoegen van 5 M HCl Aanlengen met gedestilleerd water tot 1 l NaCl 10x: 87,66 g NaCl + 800 ml gedestilleerd water Aanlengen met gedestilleerd water tot 1 l Materiaal voor blokkering Endogene peroxidase block (0,3% H2O2 in TBS): 99 ml TBS + 1 ml 30% H2O2 1% BSA in TBS: 1 g BSA oplossen in 100 ml TBS

Antilichamen Primair antilichaam: Polyclonaal schaap anti-humaan IDO (Abcam) Verdunning 1/1000 in 1% BSA/TBS Secundair antilichaam: Rund anti-schaap IgG-biotine gelabeld (Santa Cruz Biotechnology) Verdunning 1/100 in TBS Isotype controle: Normaal schaap IgG (Santa Cruz Biotechnology) Verdunning 1/14 in 1% BSA/TBS

39


Materiaal voor kleurreactie Streptavidine-HRP (Klinipath) Verdunning 1/300 in TBS AEC Substrate Chromogen ready-to-use (Daido Sangyo Co. Ltd) 3.1.2

Methode De paraffinecoupes worden gesneden met een Sliding Mictrotome Slide 2003 Compact microtoom. Daarna worden de coupes op glaasjes 10 minuten gedroogd bij 60° C Deparaffineren 5 keer 5 minuten xyleen 5 minuten 100% ethanol 5 minuten 95% ethanol 5 minuten 75% ethanol 5 minuten stromend kraantjeswater spoelen met gedestilleerd water Citraat-voorbehandeling: De coupes worden in citraatbuffer (pH 6) gebracht en in de microgolfoven geplaatst 5 minuten 750 W 5 minuten afkoelen 5 minuten 375 W 20 minuten afkoelen 3 maal spoelen met gedestilleerd water Weefsel op de coupe omringen met toluolstift 10 minuten 1x TBS 20 minuten blokkeren met endogene peroxidase block 10 minuten 1x TBS 20 minuten blokkeren met 1% BSA in TBS 1 uur incubatie met primair antilichaam in 1% BSA/TBS bij kamertemperatuur 40


10 minuten 1x TBS 30 minuten incubatie met secundair antilichaam in TBS bij kamertemperatuur 10 minuten 1x TBS 30 minuten streptavidine-HRP 1/300 in TBS 10 minuten 1x TBS 5 minuten AEC (ready-to-use) 10 minuten 1x TBS Tegenkleuren: 2 minuten hematoxyline 1 minuut stromend water Monteren met monteermiddel (Aquatex) en dekglaasje

3.2

Celkweek en stimulatie van de cellen

In een tweede fase van de studie wordt onderzocht of de A549 long adenocarcinoom cellijn IDO tot expressie brengt in basale omstandigheden en na stimulatie met IFN- . Als positieve controle cellijn wordt gebruik gemaakt van de HeLa cellijn. In de literatuur wordt beschreven dat bij de HeLa cellijn IDO-expressie wordt geïnduceerd na stimulatie met IFN- . De expressie van IDO wordt nagegaan door middel van Western blotting. 3.2.1

Materiaal

Stalen HeLa cellijn A549 cellijn Deze cellijnen worden bewaard in vloeibare stikstof en moeten dus eerst worden ontdooid. De A549 cellijn wordt overgebracht in een 5% CO2 incubator bij 37° C, de HeLa cellijn in een 10% CO2 incubator bij 37° C. De cellen worden regelmatig gesplitst om ze in celcultuur te houden.

41


Media Medium voor HeLa cellijn: DMEM (Gibco)

+ 4,5 g/l glucose + L-glumatine + pyruvaat

Met toevoeging van 10% FCS (A&E Scientific) en 1% antibiotics/antimycotics (Gibco) Medium voor A549 cellijn: DMEM + GlutaMax (Gibco)

+ 4,5 g/l glucose - pyruvaat

Met toevoeging van 10% FCS (A&E Scientific) en 1% antibiotics/antimycotics (Gibco) Buffers Lysebuffer: protease inhibitor oplossing 1/7 verdunnen in catenine lysebuffer Catenine lysebuffer: 500 µl 1% Triton-X-100 500 µl 1% NP-40 Aanlengen tot 50 ml met PBS Protease inhibitor oplossing: 1 tablet Complete Mini (Roche) in 1,5 ml gedestilleerd water PBS: 80 g NaCl + 2 g KCl + 2,4 g KH2PO4 + 14,40 g Na2HPO4 Oplossen in 1 l gedestilleerd water

Falcons 25 cm2 en 75 cm2 Tissue Culture Flask (Greiner Bio-One) 42


Materiaal voor stimulatie IFN- (Sigma Aldrich): 1/100 verdunning van de stockoplossing 1 µl stock + 99 µl medium zonder FCS 1000 units/ml IFN- oplossing: 70 l 1/100 verdunning + 13930 l medium zonder FCS Trypsine: 0,05% Trypsine-EDTA (Gibco) 3.2.2

Methode

Celculturen ontdooien Het buisje met de ingevroren cellijn wordt van het bewaarvat met vloeibare stikstof overgebracht naar een warmwaterbad van 37° C Als de inhoud van het buisje ontdooid is, wordt deze gesuspendeerd in 5 ml medium (37° C) De cellen worden 5 minuten afgecentrifugeerd aan 362g Het supernatans wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in 5 ml vers medium De celsuspensie wordt overgebracht naar een 25 cm2 falcon De falcon wordt in de incubator geplaatst bij 37° C en 5% CO2 (voor de HeLa cellijn) of bij 37° C en 10% CO2 (voor de A549 cellijn) Cellen splitsen Verwijder het medium uit de falcon Was twee keer met PBS Trypsine-EDTA toevoegen Falcon in incubator op 37° C plaatsen tot cellen niet meer aan de bodem hechten Voeg 5 ml medium toe Verdunning toepassen en uitverdelen in nieuwe falcon 43


Stimulatie van de cellen Put de cellen uit gedurende 5 uur: Verwijder het medium uit de falcon Was twee keer met PBS Voeg 5 ml medium zonder FCS toe Stimuleer de cellen met 1000 units/ml IFN- : Verwijder het medium uit de falcon Breng 3 ml medium zonder FCS met IFN- in 4 falcons Breng 3 ml medium zonder FCS en IFN- in 4 andere falcons (de negatieve controle)

Bereiding van eiwitlysaten 4 uren na de stimulatie met IFN- : Was de cellen twee keer met koude PBS (4° C) Voeg per falcon 500 l lysebuffer toe Zet de falcon 10 minuten op ijs Maak de cellen los met behulp van een cell scraper Pipetteer het lysaat in een epje 5 seconden vortexen 10 minuten afcentrifugeren bij 30000g bij 4° C Neem het supernatans af en bewaar dit bij -20° C Herhaal deze laatste procedure 16 uren, 24 uren en 48 uren na de stimulatie met IFN-

3.3

Detectie van IDO door middel van Western blotting

3.3.1

Materiaal

Buffers Outer buffer: 950 ml gedestilleerd water + 50 ml 20x MOPS running buffer 44


Inner buffer: 200 ml outer buffer + 500 l NuPAGE sample antioxidant Transfer buffer: 749 ml gedemineraliseerd water voor twee gels 50 ml 20x NuPAGE transfer buffer 200 ml voor 2 gels 1 ml NuPAGE sample antioxidant PBS/ 0,1% Triton-X-100: 1 l PBS + 1 ml Triton-X-100 10% blotto 15 g melkpoeder in 150 ml PBS/ 0,1% Triton-X-100 TBS/ 0,1% Tween-20: 1 l TBS + 1 ml Tween-20 Blocking buffer TBS/ 0,1% Tween-20 + 5% melk 50 ml TBS/ 0,1% Tween-20 + 2,5 g melkpoeder TBS/ 0,1% Tween-20 + 5% BSA 10 ml TBS/ 0,1% Tween-20 + 0,5 g BSA

Gel 4-12% Bis-Tris Gel w/MOPS running buffer

Materiaal voor de blotting Blotting pads Twee filtreerpapiertjes 1 nitrocellulosemembraan

45


Materiaal voor chemiluminescentie Chemiluminescentie-oplossing (Roche): 5 ml Luminescence Substrate A (diacylhydrazide) + 50 l Starting Solution B (4-iodofenol) Filmcassette (Amersham Life Science) Ontwikkelaar: 200 ml Ilford multigrade + 1,8 l kraantjeswater Fixatief: 200 ml gedestilleerd water 500 g natriumthiosulfaat-pentahydraat > 99% kristallen (fixeernatron) 50 g kaliummetabisulfiet of disulfiet 20 g natriumsulfiet (H2O vrij) Antilichamen gericht tegen IDO Primair antilichaam: Konijn anti-IDO antilichaam (Santa Cruz Biotechnology) Verdunning: 1/200 in 10% blotto (Triton-methode) of TBS/ 0,1% Tween-20 + 5% BSA (Tween-methode) Secundair antilichaam: Geit anti-konijn IgG

HRP (Santa Cruz Biotechnology)

Verdunning: 1/6000 in 10% blotto (Triton-methode) of blocking buffer (Tween-methode)

Antilichamen gericht tegen pSTAT-1 Primair antilichaam: Geit anti-pSTAT-1 (Santa Cruz Biotechnology) Verdunning: 1/200 in TBS/ 0,1% Tween-20 + 5% BSA Secundair antilichaam: Ezel anti-geit IgG

HRP (Santa Cruz Biotechnology) 46


Verdunning: 1/8000 in blocking buffer

Merker SeeBlue plus merker (Invitrogen) 3.3.2

Methode

Dag 1: De stalen worden onverdund geladen Aan de stalen worden nog toegevoegd: 4/1 NuPAGE LDS sample buffer 10/1 NuPAGE reducing agent De stalen worden tijdens de bereiding op ijs gehouden Stalen 3 minuten koken bij 95° C Stalen kort afcentrifugeren Inner en outer buffer bereiden Gel uitpakken Gel spoelen met gedestilleerd water Kam uit gel verwijderen Slotjes 3 maal spoelen met inner buffer Slotjes vullen met inner buffer Gel monteren in het XCell II Mini-Cell elektroforesetoestel Gel laden met: 20 l staal per laantje 7 l merker in één laantje XCell II Mini-Cell elektroforesetoestel koppelen aan de Consort E381 Electrophoresis stroombron (300V-1000 mA) Binnenste compartiment vullen met inner buffer Buitenste compartiment vullen met outer buffer Consort E381 Electrophoresis stroombron programmeren: Voor 2 gels: 47


Spanning: 200 V Stroom: 230 mA Tijd: 50 minuten Gelelektroforese starten Transfer buffer bereiden Blotting pads, filterpapiertjes en een nitrocellulosemembraan weken in de transfer buffer Einde van gelelektroforese : Consort E381 Electrophoresis stroombron uitschakelen Gel uit het toestel halen en afspoelen met gedestilleerd water Gel tussen twee natte filtreerpapiertjes en nitrocellulosemembraan plaatsen. Pakketje tussen blotting pads leggen. Geheel in de blotmodule brengen zodanig dat de gel onderaan ligt De blotmodule vullen met transfer buffer zodat de blotmodule onder staat De blotmodule koppelen aan de Consort E831 Electrophoresis stroombron Consort E381 Electrophoresis stroombron programmeren: Voor 2 gels: Spanning: 200 V Stroom: 340 mA Tijd: 1 uur Blot starten Na het blotten: Membraan 5 minuten in Ponceau S oplossing leggen Membraan 5 minuten ontkleuren in gedestilleerd water Triton-methode: Membraan blokkeren in 10% blotto gedurende 2 à 3 uren op schudder bij kamertemperatuur Tween-methode: Membraan blokkeren in blocking buffer gedurende 1 uur op schudder bij kamertemperatuur. Membraan 3 maal 5 minuten wassen met TBS/ 0,1% Tween-20 48


Triton-methode: Membraan overnacht incuberen met primair antilichaam verdund in 10% blotto bij 4° C op schudder Tween-methode: Membraan overnacht incuberen met primair antilichaam verdund in TBS/ 0,1% Tween-20 + 5% BSA bij 4° C op schudder

Dag 2: 2 keer spoelen met PBS/ 0.1% Triton-X-100 5 keer 5 minuten wassen met PBS/ 0.1% Triton-X-100 Triton-methode: 1 uur incuberen met secundair antilichaam verdund in 10% blotto bij kamertemperatuur op schudder Tween-methode: 1 uur incuberen met secundair antilichaam verdund in blocking buffer bij kamertemperatuur op schudder 2 keer spoelen met PBS/ 0.1% Triton-X-100 5 keer 5 minuten wassen met PBS/ 0.1% Triton-X-100 Chemiluminescentie-oplossing bereiden en toevoegen aan membraan in plastiek zakje (1 minuut incubatie) Chemiluminescentie-oplossing uit het zakje verwijderen en zakje dichtmaken Plastiek zakje met membraan in filmcassette plaatsen Film ontwikkelen in donkere kamer: Film op membraan leggen in filmcassette gedurende 10 minuten Film in bad met ontwikkelaar leggen Film spoelen in bad met kraantjeswater Film in bad met fixatief leggen Film spoelen in bad met kraantjeswater

Dag 2: Bij de Tween-methode wordt hetzelfde protocol gevolgd, maar wordt PBS/ 0.1% Triton-X-100 vervangen door TBS/ 0,1% Tween-20.

49

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Resultaten

4

Resultaten

4.1

Expressie van IDO in longcarcinomen

Via een immunohistochemische kleuring wordt het expressiepatroon van IDO nagegaan op coupes van patiënten met adenocarcinoom en spinocellulair carcinoom. Als positieve controle wordt een coupe van placenta gekleurd. 4.1.1

Adenocarcinoom

Tabel 4.1: Stalen van patiënten met adenocarcinoom

Nummer pa-

Aankleuring

raffineblokje 08B01061-3

negatief

08B14437-8

negatief; endotheel bloedvaten pos.

08B08324-5

focaal sterke aankleuring (stroma en tumor)

08B11549-5


07B16280-9

focaal positieve zones (stroma en tumor)

07B03780-7

negatief

07B10046-5

aankleuring van het stroma

07B12817-9

focaal sterk positieve zones; tumorcellen nabij granulocyten kleuren aan

Bij 4 van de 8 coupes wordt aankleuring van inflammatoire cellen in het stroma gezien. Deze inflammatoire cellen zijn macrofagen (dendritische cellen). Bij 2 van de 4 aangekleurde coupes is er ook aankleuring van de tumorcellen. Bij één coupe is er een sterke aankleuring van de tumorcellen in de omgeving van granulocyten.

50


Figuur 4.1 IDO-immunohistochemische kleuring van adenocarcinoom (vergroting 200x)


Figuur 4.1 toont een IDO-immunohistochemische kleuring op een coupe van een adenocarcinoom. De rode kleur die te zien is, is ook te zien bij de isotype controle (figuur 4.2). Deze kleuring moet beschouwd worden als aspecifieke achtergrondkleuring.


Figuur 4.3 toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van een adenocarcinoom. Er is een diffuse sterke aankleuring te zien van de tumorcellen. Het endotheel van de bloedvaatjes kleurt ook aan (interne controle).

51



De bovenstaande foto (figuur 4.4) toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van een adenocarcinoom. Er is een sterke aankleuring te zien van de inflammatoire cellen in het stroma.


De bovenstaande figuur (figuur 4.5) toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van een adenocarcinoom. De tumor vertoont focaal sterk positieve zones op plaatsen van acute inflammatie (granulocyten).

52




Figuur 4.6 toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van een adenocarcinoom. Er wordt geen aankleuring van de tumor gezien. Het endotheel van de bloedvaatjes kleurt echter wel aan. Bij de isotype controle (figuur 4.7) is er geen aankleuring van het endotheel van de bloedvaatjes te zien. Dit toont aan dat de kleuring van het endotheel specifiek is. 4.1.2

Spinocellulair carcinoom

Tabel 4.2: Stalen van patiënten met spinocellulair carcinoom

Nummer pa-

Aankleuring


negatief

08B07569-4

negatief

08B08901-1

negatief

07B14648-7

focaal zwak positieve zones (stroma en tumor); endotheel bloedvaten pos.

07B14902-2

cellen in lymfoïd weefsel pos.

07B01937-1 diffuse en focaal sterke aankleuring (tumor en stroma)

53


Bij 2 van de 6 coupes wordt aankleuring van de inflammatoire cellen in het stroma en van de tumorcellen gezien. Bij één coupe zijn de cellen in het lymfoïd weefsel positief. De cellen die aankleuren in het peritumoraal stroma zijn dendritische cellen.

Figuur 4.8 IDO-immunohistochemische

kleuring van spinocellulair carcinoom (vergroting 100x)

Figuur 4.9 IDO-immunohistochemische kleuring van spinocellulair carcinoom (vergroting 100x)

Figuren 4.8 en 4.9 vertonen een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van een spinocellulair carcinoom. Op beide figuren is er focaal zwakke aankleuring van zowel de stromale cellen als de tumorcellen te zien.

54

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase 2,3 dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Resultaten

4.2

In vitro experiment met A549 cellijn

Er wordt bestudeerd of de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn IDO tot expresexpre sie brengt in basale omstandigheden en na stimulatie met IFN- . De IDOexpressie op eiwitniveau wordt nagegaan door middel van Western blotting. 4.2.1

Stimul Stimulatie met INFINF bevestigen door middel van anti-pSTAT-1 anti 1 antiliantil chaam

1

2

3

4

5

6 191 kDa 97 kDa

64 kDa 51 kDa 39 kDa 28 kDa 19 kDa 14 kDa Figuur 4.10: 4.1 : Stimulatie van A549 cellijn en HeLa cellijn met INF- na 4 4u

Figuur 4.10 4.1 toont de Western blot waarbij de HeLa cellen en de A549 cellen geg stimuleerd werden w rden met INFINF na 4u. Laantje 1 en laantje 3 geven respectievelijk de A549 A549 cellen en de HeLa cellen weer die niet gestimuleerd werden met INFINF . Deze laantjes vertonen geen bandjes. Laan 2 en laan 4 tonen respectievelijk de A549 cellen en de HeLa cellen die gestimuleerd werden met INFINF na 4 uren. DeD ze laantjes vertonen twee bandjes ter hoogte van 84 kDa en 91 kDa. Deze cellen brengen dus het gefosforyle foryleerd erd STAT-1 STAT (pSTAT pSTAT-1) eiwit tot expressie. Laantje 5 toont de positieve controle. De positieve controle wordt toegevoegd om er zeker van te zijn dat de Western blot goed is uitgevoerd. De positieve controle vertoont 55


twee bandjes bij 84 kDa en 91 kDa en en is dus positief. Laantje 6 geeft de merker weer. Er wordt ook een negatieve controle uitgevoerd. Hierbij wordt er geen primair antilichaam toegevoegd. Er worden geen bandjes gevisualiseerd. De neg negatieve controle is dus negatief.

1

2

3

4

5

6

7 78 191 kDa 97 kDa 64 kDa 51 kDa 39 kDa 28 kDa 19 kDa 14 kDa

Figuur 4.11: 4.1 : Stimulatie Stimulatie van HeLa cellijn met IFNIFN na 16u, 24u en 48u

Figuur 4.11 laat de Western blot zien waarbij de HeLa cellen gestimuleerd werden met IFNIFN na 16u (laan 2), 2) 24u (laan 4) en 48u (laan 6) 6). Laantje 1, laantje 3 en laantje 5 tonen de cellen die niet gestimuleerd werden met IFN IFN- . Deze laantjes vertonen geen bandjes. Laan 2, laan 4 en laan 6 vertonen twee bandjes ter hoogte van 84 kDa en 91 kDa. Deze cellen brengen dus het pSTAT pSTAT-1 eiwit tot expressie. Laan Laantje 7 geeft de positieve controle weer.. De positieve controle wordt toeg toegevoegd om er zeker van te zijn dat de Western blot goed is uitgevoerd. De positiev positieve controle vertoont twee bandjes bandje bij 84 kDa en 91 kDa en is dus positief. Laantje Laan 8 geeft de merker weer. Er wordt ook een negatieve controle uitgevoerd. uitgevoerd Er worden geen bandjes gezien. De e negatieve negatieve controle is dus negatief.

56


1

2

3

4

5

6

7

8 191 kDa 97 kDa

64 kDa 51 kDa Da 39 kDa 28 kDa 19 kDa 14 kDa Figuur 4.12: 4.1 Stimulatie van A549 cellijn met IFNIFN na 16u, 24u en 48u

Figuur 4.12 toont de Western blot waarbij de A549 cellen gestimuleerd werden met IFNIFN na 16u (laan 2), 2) 24u (laan 4) en 48u (laan 6) 6). Laantje 1, laantje 3 en laantje 5 geven de cellen weer die niet gestimuleerd werden met IFN IFN- . Deze laantjes tjes vertonen geen bandjes ter ter hoogte van 84 kDa en 91 kDa. Laan 2, laan 4 en laan 6 vertonen twee bandjes bandjes ter hoogte van 84 kDa en 91 kDa. Deze cellen brengen dus het pSTATpSTAT-1 1 eiwit tot expressie. Laantje 7 duidt de positieve controle aan.. De positieve controle controle vertoont twee bandjes bij bij 84 kDa en 91 kDa en is dus positief. Laantje 8 geeft de merker weer. Er wordt ook een negatieve controle ui uitgevoerd. Er worden geen bandjes gevisualiseerd. gevisuali De e negatieve controle is dus negatief. De andere bandjes die te zien zijn op de gel, zijn banden die veroorzaakt worden door aspecifieke binding binding van het secundair antilichaam antilichaam. Bij de experimenexperime ten worden w rden polyclonale antilichamen gebruikt. Polyclonale antilichamen geven meer aspecifieke bandjes dan monoclonale antilichamen.

57


4.2.2

Expressie van IDO nagaan na 4u, 16u, 24u en 48u door middel van anti-IDO antilichaam

1

2

3

4

5

6 97 kDa

64 kDa 51 kDa

39 kDa 28 kDa 19 kDa 14 kDa Figuur 4.13: Expressie van IDO bij A549 cellijn en HeLa cellijn na 4u

De bovenstaande figuur geeft de Western blot weer waarbij de HeLa cellen en de A549 cellen gestimuleerd werden met IFN- na 4u. Laantje 1 en laantje 3 tonen respectievelijk de A549 cellen en de HeLa cellen die niet gestimuleerd werden met IFN- . Deze laantjes vertonen geen bandjes ter hoogte van 42 kDa. Laan 2 en laan 4 geven respectievelijk de A549 cellen en de HeLa cellen weer die gestimuleerd werden met IFN- na 4 uren. Deze laantjes vertonen geen bandje ter hoogte van 42 kDa. Laantje 5 toont de positieve controle. De positieve controle vertoont een bandje bij 42 kDa en is dus positief. Laantje 6 geeft de merker weer. Er wordt ook een negatieve controle uitgevoerd. Er worden geen bandjes gevisualiseerd. De negatieve controle is dus negatief. De andere bandjes die te zien zijn op de gel, zijn banden die veroorzaakt worden door aspecifieke binding.

58


1

2

3

4

5

6

7 8 191 kDa 97 kDa

64 kDa 51 kDa 39 kDa 28 kDa 19 kDa 14 kDa Figuur 4.14: Expressie van IDO bij HeLa cellijn na 16u, 24u en 48u

Figuur 4.14 toont de Western blot waarbij de HeLa cellen gestimuleerd werden met IFN- na 16u (laan 2), 24u (laan 4) en 48u (laan 6). Laantje 1, laantje 3 en laantje 5 geven de cellen weer die niet gestimuleerd werden met IFN- . Deze laantjes vertonen geen bandjes ter hoogte van 42 kDa. Laan 2, laan 4 en laan 6 vertonen een bandje ter hoogte van 42 kDa. De HeLa cellijn fungeert als positieve controle en brengt IDO tot expressie. Laantje 7 toont de positieve controle. De positieve controle vertoont een bandje bij 42 kDa en is dus positief. Laantje 8 geeft de merker weer. Er wordt ook een negatieve controle uitgevoerd. Er worden geen bandjes gevisualiseerd, de negatieve controle is dus negatief. De andere bandjes die te zien zijn op de gel, zijn banden die veroorzaakt worden door aspecifieke binding.

59


1

2

3

4

5

6

7

8 97 kDa

64 kDa 51 kDa

39 kDa 28 kDa 19 kDa 14 kDa Figuur 4.15: Expressie van IDO bij A549 cellijn na 16u, 24u en 48u

Deze figuur laat de Western blot zien waarbij de A549 cellen gestimuleerd werden met IFN- na 16u (laan 2), 24u (laan 4) en 48u (laan 6). Laan1, laan 3 en laan 5 tonen de cellen die niet gestimuleerd werden met IFN- . Deze laantjes vertonen geen bandjes ter hoogte van 42 kDa. Laantje 2, laantje 4 en laantje 6 vertonen een bandje ter hoogte van 42 kDa. Deze cellen brengen dus IDO tot expressie. Laantje 7 geeft de positieve controle weer. De positieve controle vertoont een bandje bij 42 kDa en is dus positief. Laantje 8 geeft de merker weer. Er wordt ook een negatieve controle uitgevoerd. Er worden geen bandjes gevisualiseerd, de negatieve controle is dus negatief. De andere bandjes die te zien zijn op de gel, zijn banden die veroorzaakt worden door aspecifieke binding.

60


4.3

Expressie van IDO in pleuritis en epithelioïd mesothelioom

Via een immunohistochemische kleuring met een anti-IDO antilichaam wordt bestudeerd of IDO-expressie diagnostisch kan zijn voor maligne mesothelioom. Het is moeilijk om histologisch een onderscheid te maken tussen subacute pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom. Om na te gaan of het anti-IDO antilichaam bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen sarcomatoïd mesothelioom en pleuritis, wordt de expressie van IDO nagegaan in epithelioïd mesothelioom. Epithelioïd mesothelioom is namelijk het best gedifferentieerde type van mesothelioom. Om de IDO-expressie na te gaan, worden er coupes gekleurd van patiënten met pleuritis en epithelioïd mesothelioom. 4.3.1

Pleuritis

Tabel 4.3: Stalen van patiënten met pleuritis

Nummer pa-

Aankleuring


negatief

07B16034-1

negatief

07B04468-1


07B08947-2

negatief

08B04331-3

negatief

07B01235-1

negatief

08B06091-2

negatief

07B05156-1

negatief

07B09089-1

negatief

07B13866-1

negatief

Op geen enkele van de coupes wordt specifieke aankleuring gezien. Het endotheel van de bloedvaten kleurt wel aan bij één coupe. Er werd ook aankleuring

61


gezien bij de positieve controle (placenta). Dit geeft aan dat de kleuring goed is gelukt.

Figuur 4.16 IDO-immunohistochemische kleuring van pleuritis (100x)

Figuur 4.16 toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van pleuritis. Er wordt geen aankleuring van cellen gezien.

Figuur 4.17 IDO-immunohistochemische kleuring van pleuritis (200x)

Figuur 4.17 toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van pleuritis. Op deze figuur wordt er aankleuring van het endotheel van de bloedvaten geobserveerd.

62


4.3.2

Epithelioïd mesothelioom

Tabel 4.4: Stalen van patiënten met epithelioïd mesothelioom

Nummer pa-

Aankleuring


negatief

08B15237-6

zeer lichte aankleuring in een beperkt gebied van de tumor

08B5950-1

negatief

05B8883-33

negatief

08B17674-39

zeer lichte aankleuring in een beperkt gebied van de tumor, endotheel bloedvaten positief

99B13908-1

negatief

08B11276-27

negatief

Bij 2 van de 7 coupes wordt een zeer lichte aankleuring van de tumorcellen gezien. Het endotheel van de bloedvaten kleurt aan bij één coupe. Dit bewijst dat de kleuring goed is gelukt.

63


Figuur 4.18 IDO-immunohistochemische kleuring van epithelioïd mesothelioom (vergroting 200x)


Figuren 4.18 en 4.19 tonen een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van een epithelioïd mesothelioom. Er is een zeer lichte aankleuring van de tumorcellen te zien.

64



Figuur 4.20 toont een immunohistochemische kleuring van IDO op een coupe van epithelioïd mesothelioom. Er is geen expressie van IDO in de tumor waar te nemen. Het endotheel van de bloedvaten kleurt wel aan. Dit bewijst dat de kleuring goed gelukt is.

65

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Discussie

5

Discussie

In een eerste fase van dit onderzoek wordt een immunohistochemische kleuring uitgevoerd op paraffinecoupes van patiënten met adenocarcinoom en spinocellulair carcinoom om de expressie van IDO na te gaan. Om zeker te zijn dat de kleuringen goed worden uitgevoerd, wordt bij iedere kleuring een positief controleweefsel gekleurd. Het weefsel dat hiervoor wordt gebruikt, is placentaweefsel. Dit weefsel vertoont immers steeds een hoge IDO-expressie

(16)

. Bij elke kleuring

wordt ook een isotype controle uitgevoerd om eventuele aspecifieke kleuring te kunnen opsporen. Op basis van de reeds verschenen literatuur wordt een verhoogde expressie van IDO verwacht bij de coupes van longtumoren. Bij de coupes van de patiënten met adenocarcinoom wordt in 4 van de 8 gevallen aankleuring van de cellen in het peritumoraal stroma gezien. De aangekleurde cellen in het stroma zijn macrofagen (dendritische cellen). Bij één coupe is er aankleuring van de tumorcellen in de buurt van granulocyten. Granulocyten zijn aanwezig bij actieve inflammatie. Ferdinande e.a. observeerden ook aankleuring van cellen in de buurt van actieve inflammatie

(29)

. In 2 van de 8 gevallen wordt er ook

focale aankleuring van het tumorweefsel geobserveerd. Bij 3 van de 6 coupes van de patiënten met spinocellulair carcinoom wordt er aankleuring van de inflammatoire cellen in het peritumoraal stroma en de tumorcellen gevisualiseerd. De aangekleurde cellen in het stroma zijn macrofagen (dendritische cellen). Bij één coupe is er aankleuring van de cellen in het lymfoïd weefsel. Deze resultaten suggereren dat IDO een rol speelt in de tumorbiologie van longcarcinomen. De resultaten van onze studie komen overeen met de resultaten uit andere onderzoeken omtrent de expressie van IDO in tumorweefsel. Uyttenhove e.a. toonden aan dat IDO variabel tot expressie wordt gebracht bij onder andere longkanker, prostaatkanker, pancreaskanker, enzovoort

(20)

. Andere onderzoekers toonden

66


een verhoogde expressie van IDO aan in borstkanker

(30)

, colonkanker

(21)

, enzo-

voort. Recente studies hebben aangetoond dat IDO niet alleen tot expressie wordt gebracht in de tumorcellen, maar ook in dendritische cellen (22). Dendritische cellen presenteren antigenen aan T-cellen en zorgen op deze manier voor de activatie van deze cellen. De aankleuring van dendritische cellen wordt ook gezien in onze studie. Een mogelijke verklaring is dat IDO-positieve dendritische cellen de initiatie van immuunresponsen tegen tumorantigenen helpen onderdrukken en een systemische tolerantie tegen deze antigenen helpen creëren. Al deze bevindingen suggereren dat IDO bijdraagt tot de ontsnapping van tumorcellen aan het immuunsysteem. Als dit effectief zo is, dan representeert IDO een aantrekkelijk nieuw doelwit voor kankertherapie. In een tweede fase van deze studie wordt de expressie van IDO in de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn bestudeerd in basale omstandigheden en na de stimulatie met IFN- . Cellen die gestimuleerd worden met 1000 units/ml IFN- na 16u, 24u en 48u vertonen een hoge IDO-expressie. De cellen die gestimuleerd worden na 4u vertonen geen IDO-expressie. De cellen die niet met IFN- gestimuleerd worden, vertonen geen IDO-expressie. Deze resultaten tonen aan dat IFNIDO kan induceren in de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn. Deze cellijn kan dus gebruikt worden bij verder onderzoek naar de functie van IDO in tumoren. In een derde fase van dit project wordt onderzocht of een immunohistochemische kleuring met een anti-IDO antilichaam diagnostisch kan zijn voor maligne mesothelioom. Het is moeilijk om een onderscheid te maken tussen subacute pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom. Om te onderzoeken of het anti-IDO antilichaam bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen sarcomatoïd mesothelioom en pleuritis, wordt de expressie van IDO nagegaan in epithelioïd mesothelioom. Epithelioïd mesothelioom is het best gedifferentieerde type van mesothelioom. Sarcomatoïd mesothelioom is een weinig gedifferentieerd type van mesothelioom. Om de IDO-expressie na te gaan, worden er coupes gekleurd van patiënten met

67


pleuritis en epithelioïd mesothelioom. Zoals in het eerste deel van de studie wordt ook hier een positief controleweefsel gekleurd en een isotype controle uitgevoerd. Er wordt geen expressie van IDO waargenomen na kleuring van de coupes van de patiënten met pleuritis. Het endotheel van de bloedvaten kleurt aan op één coupe. Deze interne positieve controle bewijst dat de kleuring goed werd uitgevoerd. Er wordt een zeer lichte aankleuring van de tumorcellen gezien bij 2 van de 7 coupes van de patiënten met epithelioïd mesothelioom. Uit deze bevindingen kan besloten worden dat het anti-IDO antilichaam waarschijnlijk niet bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom.

68

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Conclusie

6

Conclusie

In het eerste deel van dit project wordt de expressie van IDO in longcarcinomen bestudeerd door middel van immunohistochemie. Bij beide bronchuscarcinomen wordt er expressie van IDO gezien bij inflammatoire cellen in het peritumoraal stroma en bij tumorcellen. Uit deze resultaten kan besloten worden dat IDO een rol speelt in de tumorbiologie van longcarcinomen. De bekomen resultaten komen overeen met de reeds beschreven literatuur. Verder onderzoek met een grotere hoeveelheid stalen is nodig om de precieze rol van IDO in longcarcinomen te achterhalen. In het tweede deel van deze studie wordt de expressie van IDO in de A549 alveolaire adenocarcinoom cellijn onderzocht in basale omstandigheden en na de stimulatie met IFN- . Via Western blotting kon worden aangetoond dat IDO tot expressie wordt gebracht na stimulatie met 1000 units/ml IFN- na 16u, 24u en 48u. Deze cellijn kan dus gebruikt worden bij verder onderzoek naar de functie van IDO in tumoren. In een derde luik van dit onderzoek wordt nagegaan of een immunohistochemische kleuring met een anti-IDO antilichaam diagnostisch kan zijn voor maligne mesothelioom. Het is moeilijk om een onderscheid te maken tussen subacute pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom. Om te onderzoeken of het anti-IDO antilichaam bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen sarcomatoïd mesothelioom en pleuritis, wordt de expressie van IDO nagegaan in epithelioïd mesothelioom. Bij de coupes van patiënten met pleuritis wordt er geen aankleuring gevisualiseerd. De expressie van IDO bij epithelioïd mesothelioom is zeer laag. Uit deze bevindingen kan besloten worden dat het anti-IDO antilichaam waarschijnlijk niet bruikbaar is om de differentiaaldiagnose te stellen tussen pleuritis en sarcomatoïd mesothelioom.

69


Colofon Het sjabloon van dit eindwerk kwam tot stand met: ACER ® TravelMate 4670 notebook Hewlett-Packard Deskjet D2360 printer Windows XP Professional Microsoft Office Word 2003 Kop zonder nummer: Arial, lettergrootte 14, vet, zwarte achtergrond Kop 1: Arial, lettergrootte 14, vet, zwarte achtergrond Kop 2: Arial, lettergrootte 13, vet Kop 3: Arial, lettergrootte 12, vet Kop 4: Arial, lettergrootte 11 Bijschrift: Arial, lettergrootte 9, vet Standaard tekst: Arial, lettergrootte 12 Datum van voltooiing: 20/01/2009

70

Literatuurlijst 1. Jochems, A.A.F., Joosten, F.W.M.G. (2000). Zakwoordenboek der geneeskunde. Arnhem: A. Huson. 2. Molina, J.R., Yang, P., Cassivi, S.D., Schild, S.E., Adjei, A.A. (2008). Nonsmall cell lung cancer: epidemiology, risk factors, treatment, and survivorship. Mayo Clin Proc, 83(5), 584-594. 3. Meriggi, F., Zaniboni, A. (2006). Non-small-cell lung cancer in the elderly. Crit Rev Oncol Hematol, 57(2), 183-190. 4. Rossi, A., Maione, P., Colantuoni, G., Gaizo, F.D., Guerriero, C., Nicolella, D., Ferrara, C., Gridelli, C. (2005). Screening for lung cancer: New horizons? Crit Rev Oncol Hematol, 56(3), 311-320. 5. Daniels, H., Longdoc [www], 2007. URL: http://www.longdoc.nl/longhili.htm Gezien 12 december 2008 6. O Byrne, K., Rusch, V.W. (2006). Malignant pleural mesothelioma. Oxford University Press. 7. Greillier, L., Astoul, P. (2008). Mesothelioma and asbestos-related pleural diseases. Respiration, 76(1), 1-15. 8. Bianchi, C., Bianchi, T. (2007). Malignant mesothelioma: global incidence and relationship with asbestos. Ind Health, 45(3), 379-387. 9. The University of Montana, Asbestos and Libby Health [www], 2003, Spectral Fusion. URL: http://www.umt.edu/libbyhealth/health_resources/info_patients_ families/atsdr_self_care_guide.htm Gezien 22 december 2008 10. Robinson, B.W., Musk, A.W., Lake, R.A. (2005). Malignant mesothelioma. Lancet, 366(9483), 397-408. 11. Marchevsky, A.M. (2008). Application of immunohistochemistry to the diagnosis of malignant mesothelioma. Arch Pathol Lab Med, 132(3), 397401. 71

12. Kass, S.M., Williams, P.M., Reamy, B.V. (2007). Pleurisy. Am Fam Physician, 75(9), 1357-1364. 13. Merck Manual Sharp & Dohme B.V., Merck Manual

Medisch handbook

[www], 2002-2003, Merck. URL: http://www.merckmanual.nl/content.html?pid=2&hid=44&redirect next =1&redirect=1 Gezien 6 januari 2009 14. Zamanakou, M., Germenis, A.E., Karanikas, V. (2007). Tumor immune escape mediated by indoleamine 2,3-dioxygenase. Immunol Lett, 111(2), 69-75. 15. Stone, T.W., Darlington, L.G. (2002). Endogenous kynurenines as targets for drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov, 1(8), 609-620. 16. Sedlmayr, P., Blaschitz, A., Wintersteiger, R., Semlitsch, M., Hammer, A., MacKenzie, C.R., Walcher, W., Reich, O., Takikawa, O., Dohr, G. (2002). Localization of indoleamine 2,3-dioxygenase in human female reproductive organs and the placenta. Mol Hum Reprod, 8(4), 385-391. 17. Mellor, A. (2005). Indoleamine 2,3-dioxygenase and regulation of T cell immunity. Biochem Biophys Res Commun, 338(1), 20-24. 18. Taylor, M.W., Feng, G.S. (1991). Relationship between interferon- , indoleamine 2,3-dioxygenase, and tryptophan catabolism. Faseb J, 5(11), 2516-2522. 19. Munn, D.H., Mellor, A.L. (2007). Indoleamine 2,3-dioxygenase and tumorinduced tolerance. J Clin Invest, 117(5), 1147-1154. 20. Uyttenhove, C., Pilotte, L., Théate, I., Stroobant, V., Colau, D., Parmentier, N., Boon, T., Van den Eynde, B.J. (2003). Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase. Nat Med, 9(10), 1269-1274. 21. Brandacher, G., Perathoner, A., Ladurner, R., Schneeberger, S., Obrist, P., Winkler, C., Werner, E.R., Werner-Felmayer, G., Weiss, H.G., Göbel, G., Margreiter, R., Königsrainer, A., Fuchs, D., Amberger, A. (2006). Prognostic value of indoleamine 2,3-dioxygenase expression in colorectal 72

cancer: effect on tumor-infiltrating T cells. Clin Cancer Res 12(4), 11441151. 22. Mellor, A., Munn, D. (2004). IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat Rev Immunol 4, 762-774. 23. Karanikas, V., Zamanakou, M., Kerenidi, T., Dahabreh, J., Hevas, A., Nakou, M., Gourgoulianis, K.I., Germenis, A.E. (2007). Indoleamine 2,3dioxygenase (IDO) expression in lung cancer. Cancer Biol Ther, 6(8), 1258-1262. 24. Burmester, G.R., Pezzutto, A. (2005). Atlas van de immunologie. Baarn: Sesam. 25. The University of Georgia College of Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine [www], 2003-2008, The University of Georgia. URL: http://www.vet.uga.edu/VPP/Undergrad/Smith/index.php Gezien 6 januari 2009 26. Vancompernolle, K. (2006). Cursus Moleculaire Biologie II, Faculteit Wetenschappen, Universiteit Gent. 27. BSE Inquiry U.K., The BSE Inquiry [www], 2000. URL: http://www.bseinquiry.gov.uk/report/volume2/fig1_8.htm Gezien 6 januari 2009 28. Shuai, K., Lui, B. (2003). Regulation of the JAK-STAT signalling in the immune system. Nat Rev Immunol, 3(11), 900-911. 29. Ferdinande, L., Demetter, P., Perez-Novo, C., Waeytens, A., Taildeman, J., Rottiers, I., Rottiers, P., De Vos, M., Cuvelier, C.A. (2008). Inflamed intestinal mucose features a specific epithelial expression pattern of indoleamine 2,3-dioxygenase. Int J Immunopathol Pharmacol 21(2), 289-295. 30. Travers, M.T., Gow, I.F., Barber, M.C., Thomson, J., Shennan, D.B. (2004). Indoleamine 2,3-dioxygenase activity and L-tryptophan transport in human breast cancer cells. Biochim Biophys Acta, 1661(1), 106-112.

73

Voor akkoord verklaring

Dr. Liesbeth Ferdinande

Prof. Dr. Marleen Praet

Stagementor

Stagegever

Mevr. Nicole Kellner Promotor

74

This document was created with Win2PDF available at http://www.win2pdf.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only. This page will not be added after purchasing Win2PDF.

Studie van de expressie van indoleamine 2,3-dioxygenase in longcarcinoom en mesothelioom Woord vooraf

Recommend Documents