i
SKRIPSI
SCREENING AWAL ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI SPESIFIK DARI BAKTERI
Oleh: FENNI RUSLI F24102090
2006 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
ii
INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
SCREENING AWAL ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI SPESIFIK DARI BAKTERI Oleh: FENNI RUSLI F24102090
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Jurusan Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Dilahirkan pada tanggal 1 Februari 1984 Di Jakarta Tanggal lulus:
September 2006
Menyetujui, Bogor,
September 2006
Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Dosen Pembimbing
iii
Fenni Rusli. F24102090. Screening Awal Enzim Endonuklease Restriksi Spesifik dari Bakteri. Di bawah bimbingan: Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono. RINGKASAN Enzim endonuklease restriksi tipe II adalah enzim yang mampu mengenali dan memotong sekuens nukleotida tertentu. Kerja enzim yang spesifik ini berperan penting dalam perkembangan bioteknologi, termasuk di dalamnya bioteknologi pangan yang telah memberikan hasil nyata, seperti varietas pangan yang dimodifikasi secara genetik. Enzim ini dihasilkan oleh setiap bakteri yang tersebar luas di alam, dan dalam penelitian ini isolat bakteri tongkol jagung diteliti potensinya dalam menghasilkan enzim restriksi. Penelitian bertujuan untuk screening keberadaan enzim restriksi yang memiliki situs spesifik. Penelitian dimulai dengan screening bakteri dari tongkol jagung busuk. Dari 16 macam isolat bakteri mesofilik, diambil 10 macam isolat kemudian masing-masing isolat ditumbuhkan untuk kemudian diambil pelet selnya dan diekstrak enzim restriksinya. Selain bakteri isolat tongkol jagung, juga diambil ekstrak enzim dari beberapa bakteri koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, yaitu Bacillus pumillus Y1, B. licheniformis MB2, Pseudomonas syringae, P. fluorescens, dan beberapa strain dari Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag R8, Xag YR58, Xag YR63, dan Xag YR69). Tahap ekstraksi enzim restriksi meliputi pemecahan sel bakteri dan ekstraksi enzim dengan metode sistem dua fase. Pemecahan sel menggunakan metode sonikasi diskontinu (4 dan 6 × 30 detik). Ekstraksi enzim dua fase menggunakan polimer PEG 8000 28,4% dan dekstran T500 7,1% yang akan memisahkan enzim resktriksi dari asam nukleat bakteri. Ekstrak enzim restriksi yang diperoleh diujikan aktivitasnya dengan mereaksikannya dengan substrat DNA plasmid dan DNA fage lambda. Plasmid yang digunakan adalah plasmid pBR322 dan plasmid pRK415 yang diperoleh dari penumbuhan kultur E. coli pembawa plasmid dan isolasi plasmid dari sel dengan metode lisis alkali. Hasil reaksi kemudian ditambahkan blue juice dan diamati dengan elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi 1% dan 0,8%. Pada pengujian dengan DNA plasmid sebagai substrat, ditunjukkan bahwa terdapat beberapa isolat yang memiliki potensi sebagai enzim endonuklease restriksi, yaitu bakteri MBXi K1, MBXi K2, MBXi P1, bakteri A, dan B. pumillus Y1. Namun setelah pengujian lebih lanjut dengan DNA fage lambda sebagai substrat, tidak terbentuk pita DNA dengan ukuran yang lebih kecil. Bakteri A menunjukkan terbentuknya pita dengan ukuran yang lebih kecil, namun masih terdapat kontaminan nuklease non-spesifik yang menimbulkan smear pada gel. Terbentuknya smear juga dihasilkan pada pengujian ekstrak enzim P. fluorescens, Xag R8, Xag YR58, Xag YR63, dan Xag YR69. Ekstrak enzim tersebut perlu dimurnikan lebih lanjut untuk memastikan berpotensi memiliki aktivitas endonuklease spesifik.
iv
KATA PENGANTAR Puji syukur pada Tuhan Yang Maha Pengasih, hanya karena berkat dan perlindungan-Nya kepada penulis, skripsi ini dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada: 1. Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, sebagai dosen pembimbing akademik penulis atas inspirasi, waktu, dukungan, kesabaran, fasilitas dan pengetahuan yang diberikan sejak kuliah hingga penelitian dan penyusunan skripsi ini. 2. Ibu Prof. Dr. Ir. Fransiska Zakaria-Rungkat, MSc., sebagai dosen penguji saat sidang dan moderator saat seminar, atas kesediaannya meluangkan waktu dan masukan-masukan yang membangun. 3. Bapak Dr. Ir. Budiatman Satiawihardja, MSc., sebagai dosen penguji, atas kesediaannya meluangkan waktu dan masukan-masukan yang membangun selama sidang. 4. Keluarga tercinta: Papi, Mami, dan Cici, terima kasih atas kasih sayang, perhatian, doa, dan dukungan yang diberikan kepada penulis. Penulis merasa sangat beruntung dan terberkati memiliki kalian sebagai keluarga terdekat. 5. Teman-teman terdekat: Ledyana, Cecile, Theresia, Sylvia, dan Paul, atas persahabatan, cerita di saat suka dan duka, serta perhatian dan pengertiannya. 6. Teman-teman seperjuangan: Karen dan Steisi, atas segala suka dan duka dalam persahabatan dan perjuangan yang dialami bersama sejak awal kuliah hingga kini, serta doa, dukungan, kritik, dan saran untuk penulis. Juga kepada rekan seperjuangan selama penelitian: Inda, terimakasih atas kerjasama, dukungan, dan canda tawa, hingga penelitian yang diawali bersama dapat diselesaikan bersama pula. 7. Rekan-rekan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia dan Laboratorium lainnya di PPSHB: Bu Sri, Bu Luki, Kak Agnes, Prasna, Bu Ummu, Bu Rika, Pak Wilmar, Bu Ika, Bu Eni, Mas Huda, Mas Firdaus, Mas Mbah, Mas Ade, Bu Pepi, dan Bu Dewi atas segala
v
bimbingan, bantuan, canda tawa, dan dorongan semangat selama penulis melakukan penelitian. 8. Teman-teman TPG 39: Pretty, Inggrid, Shinta, Nanda, Hanna, Ribka, anak-anak Pubi, Randy, Inal, terimakasih atas kebersamaan dan dukungan yang diberikan kepada penulis. Masa kuliah bersama kalian tidak akan terlupakan. 9. Teman-teman Buddhis 39: Nia, Vivi, Lisa, Delly, Robin, Inan, Pocil, Leo, dan Andi, atas kebersamaan dan bimbingan yang sangat berharga untuk penulis. 10. Semua pihak yang telah banyak membantu dan tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan. Penulis berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya. Bogor, September 2006 Penulis
6
DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR ........................................................................................ i DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii DAFTAR TABEL ............................................................................................... v DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... vii I.
PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG .......................................................................... 1 B. TUJUAN ............................................................................................... 2 C. MANFAAT ........................................................................................... 2
II. TINJAUAN PUSTAKA A. DEFINISI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI .......................... 3 B. SUMBER ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI .......................... 4 C. KLASIFIKASI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI .................. 7 D. KARAKTERISTIK ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI........... 12 1. Suhu .................................................................................................. 12 2. pH ...................................................................................................... 12 3. Kekuatan Ionik .................................................................................. 13 4. Kofaktor ............................................................................................ 14 5. Waktu Reaksi .................................................................................... 14 6. Aditif Penstabil ................................................................................. 14 E. DETEKSI AKTIVITAS ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI.... 15 1. Digesti ............................................................................................... 15 a. Plasmid sebagai substrat................................................................ 15 b. DNA fage lambda sebagai substrat ............................................... 16 2. Elektroforesis Agarosa ...................................................................... 17
7
III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT 1. Bahan .............................................................................................. 20 2. Alat .................................................................................................. 21 B. METODE PENELITIAN 1. Isolasi Bakteri dari Tongkol Jagung Busuk .................................... 21 2. Kultivasi Sel .................................................................................... 21 3. Pemecahan Membran Sel ................................................................ 22 4. Ekstraksi Enzim Restriksi ............................................................... 22 5. Isolasi Plasmid ................................................................................ 23 6. Digesti dengan Ekstrak Enzim Endonuklease Restriksi ................. 24 7. Elektroforesis Gel Agarosa ............................................................. 24 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. SCREENING BAKTERI DARI TONGKOL JAGUNG ....................... 25 B. EKSTRAKSI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI..................... 27 1. Pemecahan Membran Sel .................................................................. 27 2. Pemisahan dari Materi Genetik Bakteri ............................................ 30 C. PENGUJIAN AKTIVITAS EKSTRAK ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI ......................................................... 34 a. DNA Plasmid sebagai Substrat ....................................................... 35 b. DNA Fage Lambda sebagai Substrat .............................................. 42 V.
KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN ..................................................................................... 52 B. SARAN ................................................................................................. 52
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 54 LAMPIRAN ........................................................................................................ 58
8
DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Endonuklease restriksi dari berbagai bakteri ...................................... 5 Tabel 2. Klasifikasi endonuklease restriksi ...................................................... 8 Tabel 3. Buffer reaksi optimum enzim restriksi ............................................... 13 Tabel 4. Metode lisis sel dalam ekstraksi enzim endonuklease restriksi ......... 29 Tabel 5. Metode ekstraksi enzim endonuklease pada berbagai penelitian ....... 33
9
DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Mekanisme pemotongan DNA oleh enzim restriksi ....................... 3 Gambar 2. Berbagai hasil pemotongan dengan enzim restriksi ........................ 9 Gambar 3. Struktur enzim PvuI yang mengikat DNA ...................................... 9 Gambar 4. Peta restriksi DNA fage lambda...................................................... 17 Gambar 5. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim K1, K2, dan K7 dengan substrat plasmid pBR322 dan pRK415 ........................................... 36 Gambar 6. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim A, P1, P2, P3, 7B, P.syringae, dan B. licheniformis MB2 dengan substrat plasmid pRK415 ......... 38 Gambar 7. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim P1, P2, P3 dengan substrat plasmid pBR322 dan ekstrak enzim K8, K9, dan B. pumillus Y1 dengan substrat plasmid pRK415 ................................................... 39 Gambar 8. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim K1 dan A dengan substrat plasmid pRK415 ............................................................................. 41 Gambar 9. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim A dengan substrat DNA fage lambda ........................................................................... 42 Gambar 10. Hasil uji aktivitas enzim A yang diekstrak ulang dengan substrat DNA fage lambda ........................................................................... 44 Gambar 11. Hasil uji aktivitas enzim A ekstrak baru dengan substrat DNA fage lambda ........................................................................... 45 Gambar 12. Hasil uji aktivitas enzim P1 ekstrak baru dengan substrat DNA fage lambda ........................................................................... 46 Gambar 13. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim Xag R8, Xag YR58, Xag YR63, Xag YR69, dan P. fluorescens ekstraksi polimer konsentrat 1× ..... 48 Gambar 14. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim Xag R8, Xag YR58, Xag YR63, Xag YR69, dan P. fluorescens ekstraksi polimer konsentrat 2× ..... 49 Gambar 15. Hasil uji aktivitas ekstrak enzim Xag YR58 dan Xag YR69 dengan substrat DNA fage lambda ................................................. 50
10
DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Komposisi media Luria Bertani (LB), Dung et al. (1993), dan Yeast Dextrose Carbonate (YDC).......................................... 58 Lampiran 2. Komposisi dan pembuatan polimer konsentrat ............................. 59 Lampiran 3. Komposisi gel loading buffer dan buffer TAE stok 50×............... 60
