SKRIPSI
SCREENING ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI DARI BAKTERI ASAL INDONESIA
Oleh: RIKA SANDI F24103013
2007 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
SCREENING ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI DARI BAKTERI ASAL INDONESIA
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor
Oleh: RIKA SANDI F24103013
2007 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN SCREENING ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI DARI BAKTERI ASAL INDONESIA
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh: RIKA SANDI F24103013 Dilahirkan pada tanggal 28 April 1986 Di Bekasi, Jawa Barat Tanggal lulus: 27 Juni 2007 Menyetujui, Bogor,
Juni 2007
Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono Dosen Pembimbing Mengetahui,
Dr. Ir. Dahrul Syah Ketua Departemen ITP
Rika Sandi. F24103013. Screening Enzim Endonuklease Restriksi dari Bakteri Asal Indonesia. Di bawah bimbingan: Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono. RINGKASAN Enzim endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat mengenali dan memotong kedua utas DNA (Deoxy Ribonucleic Acid) pada urutan basa tertentu. Enzim ini memiliki peranan penting dalam berbagai teknik molekuler dan genetika, misalnya untuk analisis gen dan kloning gen yang bermanfaat. Bidang ilmu dan teknologi pangan memanfaatkan enzim ini, misalnya dalam mendeteksi patogen pangan secara molekuler. Enzim ini juga bermanfaat untuk pengembangan produk-produk pertanian, seperti varietas kedelai tahan hama, kentang tahan virus, analisis gen, dan konstruksi pangan transgenik. Enzim endonuklease restriksi dihasilkan oleh bakteri yang tersebar di alam dan penelitian ini bertujuan memilah enzim endonuklease restriksi dari bakteri-bakteri isolat koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Penelitian dimulai dengan pemilihan isolat bakteri sebanyak 11 isolat yang dianggap berpotensi menghasilkan enzim restriksi berdasarkan referensi yang diperoleh dari penelitian sebelumnya. Sebelas isolat tersebut berasal dari genus Rhodobacter, Pseudomonas, Bacillus dan beberapa isolat bakteri asal tongkol jagung. Isolat tersebut ditumbuhkan sehingga diperoleh pelet sel yang akan digunakan untuk ekstraksi enzim. Selain produksi enzim, isolasi DNA plasmid pUC 19 dilakukan untuk memperoleh substrat bagi enzim. Plasmid pUC 19 diperoleh dari E.coli carrier plasmid pUC 19. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid adalah metode lisis alkali. Tahap ekstraksi enzim meliputi pemecahan membran sel bakteri dan ekstraksi enzim dengan pemisahan sistem dua fase. Pemecahan sel dilakukan secara fisik dengan cara sonikasi diskontinu pada suhu di bawah 10oC (4 x 30 detik dan diselingi istirahat 2 menit antara setiap ulangan). Ekstraksi enzim dilakukan dengan metode pemisahan sistem dua fase, yaitu dengan menggunakan polimer konsentrat yang terdiri dari polietilen glikol 6000 (PEG 6000) 28.4 % dan dekstran T 500 7.1% dalam air. Prinsip dasar dari pemisahan sistem dua fase ini adalah interaksi protein dengan salah satu fase yang bersifat sedikit polar karena terbentuknya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan ionik dalam sistem fase. Ekstraksi dengan polimer konsentrat dilakukan untuk memisahkan enzim restriksi dari materi genetik bakteri. Ekstrak enzim restriksi diujikan aktivitasnya dengan cara mereaksikan enzim dengan substrat DNA plasmid pUC 19 dan DNA fage lambda dalam buffer reaksi (Tris HCl pH 7.5, β-merkaptoetanol, MgCl2) selama semalam pada suhu 37oC. Reaksi digesti DNA oleh ekstrak enzim restriksi dihentikan dengan cara memasukkan hasil reaksi ke freezer dan menambahkan blue juice. Hasil reaksi diamati dengan elektroforesis gel agarosa. Konsentrasi gel yang digunakan adalah 1 %. Gel hasil elektroforesis diamati dengan menggunakan UV-Transilluminator. Pengujian ekstrak enzim dengan DNA plasmid pUC 19 menunjukkan ekstrak enzim yang memiliki aktivitas enzim endonuklease restriksi adalah ekstrak enzim dari Bacillus pumilus Y1. Penambahan 50 mM NaCl dan 50 mM KCl dapat meningkatkan aktivitas restriksi enzim. Pengujian kondisi reaksi
optimum dengan DNA fage lambda menunjukkan buffer reaksi optimum ekstrak enzim dari Bacillus pumilus Y1 sesuai dengan buffer reaksi BamHI (100 mM NaCl). Perlakuan double digest ekstrak enzim dari Bacillus pumilus Y1 dan HindIII pada plasmid pUC 19 menunjukkan bahwa ekstrak enzim dari Bacillus pumilus Y1 memiliki situs pemotongan yang terletak berdekatan dengan HindIII. Namun, pengujian dengan DNA fage lambda masih menghasilkan smear yang menunjukkan DNA masih terpotong secara acak. Kontrol negatif yang digunakan adalah DNA fage lambda utuh, sedangkan kontrol positif adalah hasil digesti DNA fage lambda oleh enzim komersial, BamHI.
RIWAYAT PENULIS Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 28 April 1986 dan merupakan anak pertama dari pasangan Tjio Nang Kim dan Liu Kim Fa. Pendidikan formal penulis dimulai di TK Kuntum Melati I, SD Negeri Rawa Roko I, SLTP Negeri 3 Bekasi, dan SMU Negeri 1 Bekasi. Penulis juga menempuh pendidikan non formal di Lembaga Bahasa LIA untuk program General English (Basic and Intermediate Level). Penulis melanjutkan pendidikannya di Institut Pertanian Bogor dengan jalur masuk USMI pada tahun 2003. Selama kuliah, penulis aktif di organisasi kampus dan luar kampus, yaitu HIMITEPA (Himpunan Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan), KMBA (Keluarga Mahasiswa Buddhis Adhitthana), dan fgW Student Forum. Selain itu, penulis juga aktif di beberapa kepanitiaan kampus dan luar kampus, yaitu Studi Banding Himitepa 2005, fgW Student Forum 2005, Lomba Cepat Tepat Ilmu Pangan XIII (LCTIP XIII), International Conference of Milk and Dairy Product 2005, International Conference of Butcher and Retail Product 2006, Kongres I Himpunan Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan (HMPPI), National Student’s Paper Competition, Field Trip ITP 40, dan Archeology Goes To Mall 2007. Penulis juga berkesempatan mengikuti Pelatihan Auditor HACCP M-BRIO pada tahun 2005 dan memperoleh sertifikat Auditor HACCP. Dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Teknologi Pertanian IPB, penulis melakukan penelitian selama 6 bulan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB dengan judul “Screening Enzim Endonuklease Restriksi dari Bakteri Asal Indonesia”, di bawah bimbingan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono.
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa dan Triratna sehingga penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir ini. Tak lupa penulis menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penulis dalam penyusunan Tugas Akhir ini, khususnya Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB dan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Pada lembaran ini, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada: 1. Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono selaku pembimbing akademik dan skripsi yang telah memberikan motivasi, bimbingan, dan semangat untuk melaksanakan penelitian, ujian sidang hingga penyusunan skripsi ini. 2. Dr. Ir. Dahrul Syah selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan yang berharga bagi penulis. 3. Dr. Ir. Budiatman S selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan yang berharga bagi penulis. 4. Keluargaku: Papa dan Mama, atas kasih, cinta, dan kesabarannya mendampingi penulis sejak penulis dilahirkan sampai saat ini. Kedua adikku, Rian dan Iyus. 5. Rudy Gunawan, S.T, atas kasih sayang, cinta, dan kesabarannya menemani penulis. 6. Rekan-rekan Lab BIORIN: Mas Firdaus (terima kasih untuk metode isolasi plasmidnya), Mba Pepy, Pak Muzuni, Mbah, Mba Popy, Mba Budi, Mba Amay, Mas Jaya, Mas Yasir, Mas Hakim, Pak Hadi, Bu Srilis, Pak Mulya, Nindya, dkk yang telah memberikan pengetahuan dasar tentang Genetika, memotivasi, dan ikut menemani penulis selama melakukan penelitian. Pak Soni dan Bu Utut yang telah memberikan izin untuk membeli bahan-bahan penelitian dan menggunakan fasilitas laboratorium BIORIN.
ii
7. Warga Lab MB PPSHB IPB : Bu Ika, Bu Eni, Bu Sri, Mba Rika, Bu Ummu, Mba Indah, Bu Emma, Bu Dewi, dan Mba Emi, yang telah banyak membantu dan membimbing penulis selama penelitian. 8. Kedua Ciciku : Fenni dan Karen yang telah memberikan motivasi dan bimbingan sebelum penelitian ini dimulai. Kakak kelasku : Sidarta (Ank.38), Prasna, Woro, Herold, dan teman-teman ITP angkatan 39. 9. Rekan-rekan seperjuangan: Evanda, Dian, dan Usman. 10. Sahabatku: Tya (roommate ku), Aji, Fena, Agnes, dan Anas yang telah memberikan motivasi dan dukungan bagi penulis. 11. Sahabat-sahabatku : Ria (teman TK hingga saat ini), Tari, Anto, Japray (SMUN 1 Bekasi), Rika, Tika, Rikki (Asrama A3328). 12. Teman segolonganku, Golongan A mulai dari NRP 001 sampai 033. 13. Bebe, Chusni, Teddy, Agus, Eko, Andreas, Titin, JSMP Crews (Nana, Dey, Pau2, dkk), Steph, Andal, Iin, Udjo, Reza, Yoga, Dhea, Erick, Mitoel, dan seluruh teman-teman ITP angkatan 40. 14. Teman-teman KMBA semua angkatan yang telah banyak memotivasi penulis untuk terus belajar Buddhisme dan menyelesaikan Tugas Akhir ini. Terima kasih atas komunitas yang berharga selama 4 tahun ini. 15. Seluruh penghuni Perwira 9 (Pink House) dan Pak Hatta. 16. Teman-teman Buddhis angkatan 40: Beny, Hudar, Mega, Linda, Herni, Hendry, Hansen, Anton, dan Yolanda. Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penelitian maupun penyusunan tugas akhir ini. Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Penulis berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya.
Bogor, Juni 2007 Penulis
iii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................. i DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii DAFTAR TABEL ................................................................................................... v DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. vi DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii I.
PENDAHULUAN ......................................................................................... 1 A.
LATAR BELAKANG ................................................................................ 1
B.
TUJUAN ..................................................................................................... 2
C.
MANFAAT ................................................................................................. 2
II.
TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 3 A.
DEFINISI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI ................................ 3
B.
SUMBER ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI ................................ 4
C.
KLASIFIKASI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI ........................ 6
D.
KARAKTERISTIK ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI............... 10 1.
Suhu ...................................................................................................... 10
2.
pH .......................................................................................................... 11
3.
Kekuatan Ionik ...................................................................................... 11
4.
Pengaruh Kation .................................................................................... 11
5.
Waktu Reaksi ........................................................................................ 12
6.
Aditif Penstabil ..................................................................................... 12
E.
DETEKSI AKTIVITAS ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI........ 13 1.
Digesti ................................................................................................... 13
2.
Elektroforesis Agarosa .......................................................................... 17
III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................................... 19 A.
BAHAN .................................................................................................... 19
B.
ALAT ........................................................................................................ 20
C.
METODE PENELITIAN .......................................................................... 20 1.
Penumbuhan Kultur Bakteri.................................................................. 20
2.
Kultivasi Sel .......................................................................................... 20
3.
Pemecahan Membran Sel (Rusli, 2006) ................................................ 20
iv
4.
Ekstraksi Enzim Restriksi (Rusli, 2006) ............................................... 21
5.
Isolasi Plasmid (Sambrook et al., 1989 yang telah dimodifikasi) ........ 21
6.
Digesti Substrat DNA dan Plasmid ....................................................... 22
7.
Elektroforesis Gel Agarosa (Rusli, 2006) ............................................. 23
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................... 24 A.
EKSTRAKSI ENZIM RESTRIKSI .......................................................... 24
B.
PEMISAHAN MATERI GENETIK BAKTERI ...................................... 28
C.
PENGUJIAN AKTIVITAS EKSTRAK ENZIM RESTRIKSI ................ 31
V.
1.
Plasmid sebagai Substrat .................................................................... 31
2.
DNA Fage Lambda sebagai Substrat .................................................... 44
KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 48 A.
KESIMPULAN ......................................................................................... 48
B.
SARAN ..................................................................................................... 49
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 50 LAMPIRAN .......................................................................................................... 55
