SKRIPSI KARAKTERISASI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI DARI BAKTERI FOTOSINTETIK ANOKSIGENIK MW5
Oleh: BENNY SETIAWAN
F 30.1333
1998 JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI FAKUL TAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOG OR BOGOR
Benny Setiawan. F 30.1333. Karakterisasi Enzim Endonuldease Restriksi dari Bakteri Fotosintctik Anoksigenik MW5. Di bawah bimbingan Dr. Ir. Maggy T. Suhartono. RINGKASAN
Enzim endonuklease restriksi adalah enzim yang dapat mengenal urutan (sekuen) tertentu pada DNA utas ganda dan memotong kedua utas tersebut. Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan umumnya bersifat spesifik untuk setiap bakteri penghasilnya. Indonesia yang kaya akan plasma nutfah berpotensi menghasilkan berbagai jenis enzim restriksi baru maupun isoschizomer dari enzim restriksi komersial yang telah ada. Salah satu contohnya adalah bakteri fotosintetik anoksigenik MW5 mengandung enzim restriksi yang diduga merupakan isoschizomer dari enzim komersial Pstl (Juliana, 1996). Bakteri fotosintetik anoksigenik MW5 yang diisolasi dari Muara Karang, Jakarta, mengandung enzim endonuklease restriksi yang dapat diekstrak dengan menggunakan metode yang dilakukan oleh Juliana (1996). Bakteri tersebut ditumbuhkan pada media Sistrom-Luria Bertani (I: 1) dalam keadaan anaerobik di dekat cahaya pijar. Pemanenan sel dilakukan dengan cara sentriiLlgasi sehingga diperoleh pelet sel basah. Isolasi enzim restriksi dilakukan dengan membuka sel secara sonikasi di clalam butfer Tris-HCl 10 mM pH 7,5, Na2EDTA 1 mM, dan ~ merkaptoetanol 7 n1IvI. Setelah disentrifugasi, enzim clalam sup ern at an diekstrak dengan polimer konsentrat yang terdiri clari PEG 6000 28,4% (w/w) dan dektran T500 7,1% (w/w); serta NaCI 75 mM. Ekstraksi diulangi lagi dengan polimer konsentrat tanpa penambahan NaC!. Aktivitas enzim restriksi diuji dengan menambahkannya pada substrat DNA fage lambda. [-Iasil uji aktivitas dianalisis dengan cara elektroforesis pada gel agarosa. Karakterisasi umum enzim restriksi dari isolat MW5 meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, dan penambahan beberapa kation untuk mengganti Mg 2' sebagai kofaktor. Dalam penentuan suhu optimum, enzim restriksi dan DNA fage lambda direaksikan dalam buffer (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, MgCl 2 7 mM, dan ~ merkaptoetanol 7 mM) pada suhu 28°C, 37°C, 45°C, 55°C, 65°C, dan 75°C. Suhu 28°C dan 3TC merupakan suhu aktivitas bagi enzim restriksi dari isolat MW5. Pacla kedua suhu ini, enzim menunjukkan aktivitas pemotongan yang bail<. Penentuan pH optimum dilakukan dengan mengatur buffer reaksi yang mengandung Tris-HCl 10 mM, MgCh 7 mM, dan ~-merkaptoetanol 7 mM sehingga memberikan variasi pH 5, 6, 7, 7,5, 8, dan 9. Enzim restriksi hasil ekstraksi dapat aktif pad a kisaran pH yang luas, yaitu pH 5-9, karen a dapat memotong DNA fage lambda dengan baik pada semua kondisi pH tersebut tanpa terjadi star activity. Dalam pengujian pengaruh ion logam, MgCl 2 dalam buffer (Tris-HCl 10 mM, MgC!, 7 mM, dan l3-merkaptoetanol 7 mM) diganti dengan MnC!, 7 mM, ZnC!, 7 111M, dan CoC!, 7 111M. Penggantian
kofaktor Mg2+ dengan kation divalen lain ternyata menghambat aktivitas enZllTI restriksi. Pengujian stabilitas enzim restriksi selama penyimpanan dilakukan dengan menyimpan ekstrak enzim pada suhu _20°C selama 4 minggu. Selama penyimpanan, enzim restriksi dari isolat MW5 menunjukkan stabilitas yang baik. Sampai minggu ke4 enzim masih dapat memo tong DNA fage lambda dengan baik tanpa mengalami perubahan spesifitas.
INSTITUT PI;:RTANIAN BOG OR FAKUL TAS TEKNOLOGI PERTANIAN
KARAKTERISASI ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI DARI BAKTERI FOTOSINTETIK ANOKSIGENIK MW5
Oleh: BENNY SETIAWAN F 30.1333
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor
Dilahirkan pada tanggal 22 Oktober 1974 di Sidoarjo
Tanggallulus: 12 Januari 1998
Dosen Pembimbing
/
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Pengasih dan Penyayang atas kasih dan karuniaNya kepada penulis sehingga skripsi ini dapat diselesaikan. Pada kesempatan ini penulis lllgill menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Ibu Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku dosen pembimbing akademik yang telah memberikan pengarahan, bimbingan, fasilitas, dan dorongan moril mulai dari pelaksanaan penelitian sampai penyusunan skripsi ini. 2. Bapak Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc. yang telah bersedia meluangkan waktu untuk menguji penulis dan memberikan banyak bimbingan serta membuka wawasan penulis selama pelaksanaan sidang. 3. Bapak Ir. Sutrisno Koswara yang telah bersedia meluangkan waktu untuk menguji penulis dan memberikan bimbingan selama pelaksanaan sidang. 4. Keluarga tercinta: Papa, Mama, Cie-Cie, Ko Budhi, dan Suk Mei atas kasih, perhatian, dan dorongan semangat kepada penulis. 5. Rekan-rekan seperjuangan: Gunawan, Wina, Oentari, dan Lily atas bantuan, kerj a sama, dan dorongan semangatnya. 6. Relean-rekan di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia: Pale Wibowo, Bu Yusminah, Bu Amarila, Bu Benika, Bu Armini, Kang Yaya, Mbak Novi, Mbak Nurul, Ci Elizabeth, Pak Giyanto, Bang Wenu, Mbak Yun, Irawan,
II
Firly, Edwin, Irma, Bu Ika, dan Bu Eni atas segala bimbingan, bantllan, dan dorongan s'el11angat selama penulis melakukan penelitian. 7. Rekan-rekan TPG-30:
Andy,
Kindly, Bora, Maryati, Edwin,
SlItejo,
McQueen, Farida, Shinta, dan rekan-rekan lain atas segala bantuan dan dorongan sel11angat kepada penulis. 8. Om Slikiyat dan Ai Mei Chu atas bantllan dan dorongan sel11angat kepada penulis. 9. Sel11ua pihak yang telah banyak l11embantu dan tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalal11 pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi
Ill!.
Oleh karena itu kritik dan saran yang
l11el11bangun sangat diharapkan. Akhirnya penulis berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya.
Bogor, Februari 1998 Penulis
III
DAFTARISI
Halaman KAT A PENGANT AR ................................................................................ .. DAFTAR lSI................................................................................................
III
DAFT AR T ABEL........................................................................................
v
DAFT AR GAMBAR....................................................................................
Vl
DAFT AR LAMPIRAN.................................................................................
Vll
I.
PENDAHUL UAN ............................................................................... ..
II.
TINJAUAN PUST AKA........................................................................
3
A. ENDONUKLEASE RESTRIKSI.....................................................
3
B. PENGARUH SUHU........................................................................
6
C. PENGARUH pH..............................................................................
8
D. PENGARUH ION LOGAM.............................................................
9
E. ST ABILIT AS SELAMA PENYIMP ANAN.....................................
10
F. BAKTERI FOTOSINTETIK ANOKSIGENIK................................
10
G. ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS DNA.............................
13
III. METODOLOGI PENELITIAN.............................................................
16
A. BAHAN DAN ALAT .....................................................................
16
1. Bahan..........................................................................................
16
2. Alat.............................................................................................
17
B. MET ODE PENELITIAN.................................................................
18
1. Penumbuhan Kultur Bakteri .........................................................
18
2. Pemecahan Membran Sel .............................................................
18
3. Ekstraksi Enzim Restriksi ............................................................
19
4. Pengaruh Suhu.............................................................................
20
5. Pengaruh pH................................................................................
20
6. Pengaruh Ion Logam ...................................................................
21
IV
7. Stabilitas Selama Penyimpanan ..................... :........... :...................
22
8. Elektroforesis .............. ... ... ... ... ... ................................ ...... ...... .....
22
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .. ... ... ... ... ... ........ ... ... ... ... ...... ...................
24
A. PENUNIBUHAN KULTURBAKTERl...........................................
24
B. PEMECAHAN MEMBRAN SEL....................................................
26
C. EKSTRAKSI ENZIM RESTRlKSI............................ ...... ................
28
un AKTIVITAS ENZIM RESTRlKSI............................................
30
E. PENGARUH SUHU........................................................................
38
F. PENGARUH pH..............................................................................
41
G. PENGARUH ION LOGAM.............................................................
41
H. ST ABILIT AS SELAMA PENYIMP ANAN.....................................
43
V. KESIMPULAN DAN SARAN ........ ......................................................
44
A. KESIMPULAN................................................................................
44
B. SARAN ...........................................................................................
45
DAFT AR PUSTAKA ...................................................................................
46
LAMPIRAN .................................................................................................
49
D.
v
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1.
Klasifikasi endonuklease restriksi ...................................... ....... .....
4
Tabel 2.
Endonuklease restriksi dari berbagai bakteri ............................ ......
5
VI
DAFTAR GAMBAR
Halaman' Gambar 1. Peta DNA fage lambda ..............................................................
32
Gambar 2. Hasil elektroforesis reaksi antara DNA fage lambda dengan enzim restriksi dari isolat MW5 pada berbagai suhu.............................................................................
33
Gambar 3. Hasil elektroforesis reaksi antara DNA fage lambda dengan enzim restriksi dari isolat MW 5 pada
berbagai pH ......................... ,.......................... "."."...................
34
Gambar 4. Hasil elektroforesis reaksi antara DNA fage lambda dengan enzim restriksi dari isolat MW 5 yang diberi kation pad a suhu 28°e .....................................................
35
Gambar 5. Hasil elektroforesis reaksi antara DNA fage lambda dengan enzim restriksi dari isolat MW5 yang diberi kation pada suhu 37°e .....................................................
36
Gambar 6. Hasil elektroforesis reaksi antara DNA fage lambda dengan enzim restriksi yang disimpan pada suhu -20 o e ..............
37
