MAKARA, SAINS, VOL. 13, NO. 1, APRIL 2009: 81-86
81
SCREENING BAKTERI PENGHAMBAT UNTUK BAKTERI PENYEBAB PENYAKIT PADA BUDIDAYA IKAN KERAPU DARI PERAIRAN BANTEN DAN LAMPUNG Ariani Hatmanti1*), Ruyitno Nuchsin1, dan Julinasari Dewi2 1. Poklit Biologi Oseanografi, Puslit Oseanografi, LIPI, Jakarta Utara 14430, Indonesia 2. Balai Besar Budidaya Laut DKP, Teluk Hurun, Lampung 35451, Indonesia *)
E-mail:
[email protected]
Abstrak Penelitian mengenai screening bakteri penghambat untuk bakteri patogen pada budidaya ikan kerapu telah dilakukan selama tahun 2005 di Laboratorium Mikrobiologi Laut Puslit Oseanografi LIPI. Pada penelitian ini telah dilakukan uji tantang terhadap satu strain dan dua isolat bakteri patogen yang terdapat pada budidaya ikan kerapu yaitu Vibrio harveyii, 9.2/Luka/TSA dan 8.2/Luka/TSA. Uji tantang dilakukan menggunakan metode kertas cakram. Hasil penelitian menunjukkan dari 39 isolat bakteri penghambat dari Banten dan 27 isolat bakteri penghambat dari Lampung hanya dua isolat yang mampu menekan pertumbuhan 3 isolat bakteri patogen tersebut, yaitu 9L/AL-4/ KNG/BLC/BOKN/BJN (unidentified) dan 5L/AL-4/KNG/BJN (unidentified). Kedua isolat tersebut diisolasi dari perairan Bojonegara, Banten.
Abstract Screening for Inhibitor Bakteri for Pathogenic Bacteria in Groupers Culture in Banten and Lampung Waters. A research about screening of inhibitor bacteria for pathogenic bacteria in grouper culture was done during 2005 in Marine Microbiology Laboratory, Research Center for Oceanography LIPI. Inhibition test was done using paper disc method for three isolates of pathogenic bacteria in his research, they were: Vibrio harveyii, 9.2/Luka/TSA and 8.2/Luka/TSA. The result shows that from 39 isolates of inhibitor bacteria from Banten and 27 isolates of inhibitor bacteria from Lampung only two isolates showed inhibition effect to the growth of three isolates of pathogenic bacteria. found inhibit the three strains of pathogenic bacteria mentioned above. The two isolates of inhibitor bacteria were 9L/AL-4/KNG/BLC/BOKN/BJN and 5L/AL-4/KNG/BJN, which were isolated from Bojonegara, Banten. Keywords: cultured groupers, Banten, Lampung, inhibitor bacteria, pathogenic bacteria, paper disc
Balai Instalasi Perikanan Laut Bojonegara yang kini melebur ke Departemen Pertanian RI.
1. Pendahuluan Ikan kerapu adalah salah satu jenis ikan karang yang sudah berhasil dibudidayakan. Ikan ini mempunyai nilai komersial yang tinggi karena rasa dagingnya yang enak.
Permasalahan yang sering dialami petani budidaya ikan kerapu ini ialah penyakit. Salah satunya adalah penyakit yang disebabkan oleh kehadiran bakteri patogen seperti Vibrio harveyi [1]. Menurut Shickney [2], penyakit yang disebabkan oleh bakteri yang sering menyerang ikan kerapu adalah Vibrio sp., Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Streptococcus sp., Pasteurella sp. dan Mycobacterium sp. [3] menyatakan bahwa cara yang sering dilakukan untuk membasmi bakteri patogen ialah dengan menggunakan antibiotik, namun penggunaan antibiotik ternyata dapat menimbulkan efek samping yaitu dapat menjadikan bakteri patogen menjadi resisten [4]. Oleh karena itu perlu dilakukan pencarian metode lain yang aman bagi biota dan lingkungannya.
Propinsi Lampung sudah dikenal sebagai daerah yang mempunyai banyak lokasi budidaya ikan kerapu. Sehingga daerah ini mampu mensuplai ikan kerapu ke berbagai daerah dan memenuhi permintaan luar negeri. Demikian juga halnya dengan Banten. Namun akhirakhir ini budidaya ikan kerapu di Banten tidak berkembang bahkan menjadi berkurang akibat kualitas perairannya yang semakin menurun. Banyaknya petani budidaya ikan kerapu di kedua daerah tersebut tidak terlepas dari keberadaan Balai Budidaya Laut, Departemen Kelautan dan Perikanan Lampung dan
81
82
MAKARA, SAINS, VOL. 13, NO. 1, APRIL 2009: 81-86
Salah satunya adalah dengan memanfaatkan sifat antagonisme antarbakteri atau antar komunitas bakteri [5]. Terdapat beberapa tahapan untuk mendapatkan bakteri penghambat yang mampu menekan perkembangan bakteri pathogen yang diawali dengan uji tantang antara kandidat bakteri penghambat dengan bakteri patogen hasil isolasi yang diperoleh dari lokasi budidaya ikan kerapu. Selanjutnya dilakukan uji postulat Koch yaitu menguji kembali bakteri patogen hasil isolasi yang berasal dari ikan kerapu yang sakit ke ikan kerapu yang sehat. Tahapan berikutnya ialah adalah mencari formulasi jumlah bakteri penghambat yang mampu menekan pertumbuhan bakeri patogen pada budidaya ikan kerapu dalam skala laboratorium . Tujuan penelitian ini adalah menginventarisasi strainstrain kandidat bakteri penghambat dan strain-strain bakteri patogen yang menyerang budidaya ikan kerapu serta melakukan uji-uji seperti yang telah disebutkan di atas guna mendapatkan isolat-isolat kandidat bakteri penghambat yang mampu menekan atau menghambat pertumbuhan bakteri-bakteri patogen yang umumnya menyerang budidaya ikan kerapu.
2. Metode Penelitian Isolasi bakteri kandidat penghambat pada air tempat budidaya ikan kerapu. Sampel air diambil menggunakan botol sampel volume 300 ml pada bakbak tempat budidaya ikan kerapu sehat dan sakit serta di perairan lokasi tempat pembesaran budidaya ikan kerapu. Segera setelah pengambilan, sampel air diencerkan hingga 10-3 menggunakan air laut steril. Sampel yang telah diencerkan dari 10-1 hingga 10-3, masing-masing diambil 1 ml dan diletakkan dalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan media Marine Agar (MA), selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang selama 6 hari. Koloni yang tumbuh dan berkisar antara 30 hingga 300 koloni dihitung jumlahnya berdasarkan kenampakan (jenis) koloni yang berbeda. Masingmasing jenis koloni yang berbeda kemudian dimurnikan sebagai kandidat bakteri penghambat. Isolasi bakteri kandidat penghambat pada contoh ikan kerapu sehat, kerapu sakit dan sedimen. Bagian ikan kerapu sehat yang dianalisis adalah daging, insang dan isi perutnya, sedangkan pada ikan kerapu sakit adalah bagian tubuh yang terkena penyakit, insang dan isi perutnya. Bagian-bagian tersebut masing-masing diambil lebih kurang 1 gram, kemudian digerus dengan mortar dan dimasukkan ke dalam 9 ml air laut steril dan selanjutnya diencerkan hingga 10-3. Pengerjaan sampel selanjutnya sama dengan yang dilakukan pada sampel air. Dilakukan prosedur yang sama pula untuk sampel sedimen.
Isolasi bakteri pathogen pada air tempat budidaya ikan kerapu. Sampel air diambil menggunakan botol sampel bervolume 300 ml pada bak-bak tempat budidaya ikan kerapu sehat dan sakit serta di perairan lokasi tempat pembesaran budidaya ikan kerapu. Segera setelah pengambilan, contoh air ditanam dalam media TCBS agar sebanyak 0,5 ml untuk golongan bakteri patogen Vibrio [6] dan pre-enrichment cair untuk bakteri patogen non Vibrio. Semua sampel diinkubasikan dalam suhu 35oC selama 24 jam . Koloni yang tumbuh dalam media TCBS kemudian dicatat jumlah dan warna koloninya, selanjutnya dimurnikan untuk diidentifikasi. Sampel pada media preenrichment cair kemudian dipindahkan ke media selenith cair dan diinkubasikan pada suhu 35oC selama 24 jam. Selanjutnya digoreskan ke media XLD agar dan koloni yang tumbuh kemudian dimurnikan dan selanjutnya dilakukan uji kimia [7]. Isolasi bakteri pathogen pada contoh ikan kerapu sehat, kerapu sakit dan sediment. Bagian ikan kerapu sehat yang dianalisis adalah daging, insang dan isi perutnya, sedangkan pada ikan kerapu yang sakit, yang dianalisis adalah bagian tubuh yang terkena penyakit, insang dan isi perutnya. Bagian-bagian tersebut masingmasing diambil lebih kurang 1 gram, kemudian digerus dengan mortar kemudian dimasukan ke dalam 9 ml air laut steril. Pengerjaan selanjutnya sama dengan pada sampel air. Dilakukan prosedur yang sama untuk sampel sedimen. Uji tantang. Uji tantang dilakukan untuk melihat kemampuan penghambatan kandidat bakteri penghambat terhadap pertumbuhan bakteri patogen hasil isolasi. Metoda yang digunakan adalah paper disc [5, 8] (Gambar 1). Biakan bakteri patogen ditumbuhkan dalam media cair dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Kemudian disebarkan pada permukaan media agar menggunakan cotton bud.
Hasil (+) ditunjukkan dengan adanya Zona Hambatan.
Hasil (-) ditunjukkan dengan tidak terdapatnya Zona Hambatan.
Biakan bakteri kandidat penghambat ditumbuhkan dalam media cair dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Kemudian 0,05 ml biakan cair diteteskan pada paper disc dan ditempatkan pada permukaan media agar cawan.
Gambar 1. Uji Tantang Menggunakan Paper Disc
83
MAKARA, SAINS, VOL. 13, NO. 1, APRIL 2009: 81-86
Uji patogenitas (Postulat Koch). Uji patogenisitas digunakan untuk mengkonfirmasi apakah bakteri patogen yang berhasil diisolasi dari ikan kerapu yang sakit mampu menginfeksi kembali kerapu yang sehat dengan gejala yang sama. Uji ini dilakukan dalam stoples kaca. Uji daya hambat. Uji daya hambat dilakukan untuk mengetahui formulasi jumlah bakteri penghambat yang diperlukan agar bakteri patogen tidak mampu lagi menginfeksi benih kerapu sehat. Uji ini dilakukan dalam skala laboratorium menggunakan stoples kaca.
3. Hasil dan Pembahasan Hasil pengambilan sampel di lapangan. Hasil analisis jumlah koloni kandidat bakteri penghambat (bakteri heterotrofik) dan jumlah perbedaan kenampakan koloni kandidat bakteri penghambat pada ikan kerapu, air dan sedimen di tempat budidaya (bak dan keramba jaring apung) ikan kerapu di Lampung dicantumkan dalam Tabel 1. Sedangkan penampakan gejala penyakit pada ikan kerapu dan jenis-jenis bakteri patogen pada ikan kerapu, air dan sedimen dicantumkan pada Tabel 2. Hasil analisis jumlah koloni kandidat bakteri penghambat dan jumlah kenampakan koloni bakteri penghambat pada ikan kerapu, air dan sedimen di sekitar tempat budidaya ikan kerapu di Banten dicantumkan dalam Tabel 3. Sedangkan penampakan gejala penyakit pada ikan kerapu dan jenis-jenis bakteri penyakit pada ikan kerapu, air dan sedimen dicantumkan pada Tabel 4. Uji Patogenisitas (Postulat Koch). Telah dilakukan uji postulat koch terhadap bakteri patogen dari Lampung dan Banten. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa strain bakteri patogen Vibrio harveyi, 8.2/Luka/TSA dan 9.2/Luka/TSA mampu menginfeksi kembali ikan kerapu sehat dengan gejala yang sama. Uji patogenisitas bakteri patogen 8.2/Luka/TSA dan 9.2/Luka/TSA telah dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi BBL Lampung.
Vibrio harveyi, strain 8.2/Luka/TSA dan 9.2/Luka/TSA, dan tidak diperoleh strain yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan ketiga bakteri pathogen Tabel 1. Jumlah Koloni Bakteri Heterotrofik dan Jumlah Kenampakan Koloni yang Berbeda pada Ikan Kerapu, Sedimen dan Air di Lokasi Budidaya Ikan Kerapu Lampung, Mei 2005
Jenis Sampel (x104/gr) Kerapu tikus sehat Kerapu tikus sakit Kerapu macan sehat
Kerapu macan sakit
Air
Hasil Uji Tantang. Uji tantang (inhibition test) dilakukan menggunakan paperdisc method (metode kertas cakram). Hasil positif ditunjukkan dengan adanya zona hambatan (clearzone, halo) di sekeliling kertas cakram. Hasil negatif ditunjukkan dengan tidak terdapatnya zona hambatan di sekeliling kertas cakram. Gambar mengenai uji tantang terdapat pada Gambar 2. Hasil uji tantang dari 27 isolat bakteri heterotrofik yang diperoleh dari perairan Lampung, diperoleh bahwa 9 isolat mampu menghambat pertumbuhan beberapa bakteri patogen. Kemudian dilakukan screening kembali terhadap 3 bakteri patogen yang paling mematikan yaitu
Sedimen
269
Jumlah Jenis koloni 3
14
4
142
2
2
1
33
3
163
1
162
2
238
2
3
1
21
3
3
2
46
2
69
1
3
2
12
3
50
6
241
6
Jumlah Koloni
Tempat sampling KJA BBL Bak kerapu sehat BBL KJA BBL KJA Tanjung Putus Bak pemeliharaan kerapu sehat BBL KJA BBL Bak pemeliharaan kerapu sakit BBL KJA Tanjung Putus KJA BBL Perairan disekitar KJA BBL Bak pemeliharaan kerapu macan BBL Bak pemeliharaan kerapu tikus sakit BBL Bak pemeliharaan kerapu tikus sehat Perairan sekitar KJA Tanjung Putus KJA BBL Perairan disekitar KJA BBL Perairan sekitar KJA Tanjung Putus
Ket. 3 ekor 3 ekor 3 ekor 2 ekor 3 ekor 3 ekor 3 ekor 3 ekor 1 sampel 2 sampel
1 sampel
1 sampel
1 sampel
3 sampel 1 sampel 2 sampel 2 sampel
84
MAKARA, SAINS, VOL. 13, NO. 1, APRIL 2009: 81-86
Tabel 2. Jenis-Jenis Bakteri Patogen yang Diisolasi dari Air, Sedimen dan Ikan Kerapu di Balai Budidaya Laut (BBL) Lampung, Mei 2005
Stasiun
Lokasi Budidaya
KJA BBL
Keramba Jaring Apung di BBL
BBL 1 BBL 2 B/KM
Jenis Bakteri Patogen Ikan kerapu Kerapu Macan Sakit (Citrobacter spp. Pseudomonas spp.) Kerapu Tikus Sehat (Aeromonas spp. Citrobacter spp. Vibrio spp.) Kerapu Tikus Sakit (Citrobacter spp.)
Perairan Teluk Hurun BBL Bak Kerapu Macan
Air
Sedimen
Pseudomonas spp.
Pseudomonas spp. Proteus spp.
-
-
Pseudomonas spp.
-
-
Vibrio alginolyticus
Citrobacter spp.
-
Kerapu Macan Sehat (Pseudo monas spp.) Kerapu Macan Sakit (Citrobacter spp.)
B/KT.SKT Bak Kerapu Tikus Sakit Kerapu Tikus Sakit (Pseudo monas spp.) Pseudo monas spp.
-
B/KT.SHT Bak Kerapu Tikus Sehat
-
KJA 1 KJA 2
Kerapu Macan Sakit (Pseudo monas spp. Shigella spp. Shigella spp. Citrobacter spp.) Vibrio spp. Keramba Jaring Apung di Kerapu Tikus Sakit (Pseudo monas spp.) Pseudo monas spp. Tanjung Putus Proteus spp.
KJA 3
-
A
B
C
Gambar 2. A. Zona Hambatan (hasil +) yang Ditunjukkan oleh Bakteri Penghambat (9L/AL-4/KNG/BLC/ BOKN/BJN) & (5L/AL-4/KNG/BJN) terhadap Bakteri Patogen (9.2/Luka/TSA); B. Zona Hambatan (hasil +) yang ditunjukkan oleh Bakteri Penghambat (9L/AL-4/KNG/BLC/ BOKN/BJN) dan (5L/AL-4/KNG/BJN) terhadap Bakteri Patogen (Vibrio harveyi); C. Zona Hambatan (hasil +) yang Ditunjukkan oleh Bakteri Penghambat (9L/AL-4/KNG/BLC/ BOKN/BJN) & (5L/AL-4/KNG/BJN) terhadap bakteri patogen (8.2/Luka/TSA)
Pseudo monas spp.
Vibrio algino lyticus Pseudomonas spp.
tersebut. Kemudian dilakukan pula uji tantang dari 39 isolat bakteri heterotrofik yang diperoleh dari perairan Banten. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa 14 isolat mampu menghambat pertumbuhan beberapa bakteri pathogen. Kemudian dilakukan screening kembali terhadap 3 bakteri patogen yang paling mematikan yaitu Vibrio harveyi, strain 8.2/Luka/TSA dan 9.2/Luka/TSA, dan diperoleh hanya 2 isolat yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan ketiga bakteri pathogen tersebut, yaitu strain 9L/AL4 /KNG/BLC/BOKN/BJN dan 5L/AL-4/ KNG/BJN. Uji daya hambat. Uji daya hambat telah dilakukan terhadap bakteri penghambat (9L/AL-4/KNG/BLC/ BOKN/BJN) dan (5L/AL-4/KNG/BJN) dengan bakteri patogen V. harveyi, 8.2/Luka/TSA dan 9.2/Luka/TSA dalam stoples kaca. Namun hasilnya belum memuaskan. Uji patogenitas dan uji daya hambat dalam reaktor ditunjukkan oleh Gambar 3. Probiotik dalam akuakultur tidak hanya diaplikasikan sebagai pakan tambahan terutama karena mengingat flora normal mikroba intestinum hewan akuatik terbentuk akibat interaksi konstan dengan lingkungan [9]. Moriarty [10], menambahkan bahwa probiotik juga dapat ditambahkan pada tangki atau kolam dimana hewan akuatik itu berada karena bakteri tersebut akan memodifikasi komposisi bakteri pada air dan sedimen.
85
MAKARA, SAINS, VOL. 13, NO. 1, APRIL 2009: 81-86
Tabel 3. Jumlah Koloni Bakteri Heterotrofik dan Jumlah Kenampakan Koloni yang Berbeda pada Ikan Kerapu, Sedimen dan Air di Lokasi Budidaya Ikan Kerapu Banten, Juni 2005 Jenis Sampel
Jumlah Koloni
Kerapu macan sakit (x104/gr)
228
Air (x104/ ml )
Sedi men (x104/ gr)
Jumlah jenis koloni 4
37
2
2
1
8
3
3
1
17
3
1
1
94
1
3
3
5
2
2
1
1
1
91
2
6 29 20 11 59 13 142 17 25
2 1 3 2 2 2 3 2 3
35
3
Lokasi KJA Banten
Perairan Teluk Banten
Perairan sekitar KJA Banten
Perairan Teluk Banten
Perairan sekitar KJA Banten
Ketr.
6 ekor
9 sampel
2 sampel
8 sampel
2 sampel
Tabel 4. Jenis-Jenis Bakteri Patogen yang Diisolasi dari Air, Sedimen dan Ikan Kerapu di Perairan Teluk Banten, Juni 2005
Sta Lokasi siun Budidaya
Jenis Bakteri Patogen Ikan kerapu
Air
Sedimen
1
T. Banten
-
Pseudo monas spp. Shigella spp.
Pseudo monas spp.
2
T. Banten
-
Hafnia spp. Proteus spp.
Pseudo monas spp. Aeromonas spp.
3
T. Banten
-
Yersinia spp.
-
Pseudo monas spp.
4
T. Banten
-
Pseudo monas spp. Citrobacter spp.
5
T. Banten
-
Yersinia spp. Pseudo monas spp.
Aeromonas spp.
6
T. Banten
-
Yersinia spp. Pseudo monas spp.
Vibrio spp.
Pseudo monas spp. Salmonella spp. Proteus spp. Hafnia spp.
Proteus spp. Yersinia spp.
7
T. Banten
-
8
T. Banten
-
9
T. Banten
-
Fecal coliform
Aeromonas spp. Yersinia spp.
10
T. Banten
-
Hafnia spp. Pseudo monas spp.
Citrobacter spp. Aeromonas spp.
-
Kerapu Macan Sakit (Aeromonas spp. Keramba Pseudo Citrobacter spp. Citrobacter Jaring monas spp. KJA Proteus spp. Apung Citrobacter 1 mirabilis Proteus spp. di spp. Pseudo T. Banten monas spp. Proteus mirabilis)
Gambar 3. Uji Patogenitas dan Uji Daya Hambat Di Laboratorium Mikrobiologi Puslit Oseanografi – LIPI
Kerapu Macan Sakit Keramba (Aeromonas Jaring KJA spp. Apung 2 Citrobacter di spp. T. Banten Pseudomon as spp.)
Pseudo monas spp.
Salmonella spp.
86
MAKARA, SAINS, VOL. 13, NO. 1, APRIL 2009: 81-86
Tabel 5. Hasil Uji Tantang Kandidat Bakteri Penghambat dari Perairan Lampung terhadap Bakteri Pathogen
No
Candidate penghambat
Daya hambat terhadap strain pathogen (diameter, cm) Vibrio 8.2/Luka/ 9.2/Luka/ harveyi TSA TSA
LAMPUNG 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Air/KT/Se/Al-4/ BAK/BKL/Krm BBL1/L/AL-4/ THR/PTH/KRPT / Bsr BBL1/L/AL-4/ ∩/THR/ Krem/ Air/KM/AL-4/m BAK/Cam/Krm /Blt BBL1/L/AL-4/ THR/ Krem/∩ BBL1/L/AL-4/m THR/Krem/ MRT KT/L/AL-4/m BAK/BBL/ Krem/RT/ BBL1/L/AL-4/BLT/ KRPT/ Krem/THR BBL1/L/AL-4/ BLT/LCN/ KNG/THR
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,5
2
1,8
1,2 -
1,8 -
2,5 -
-
-
-
BANTEN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
KJA1/Sed/AL-4/ BJN/OrCok/ BKrg/Ckg KJA2/KM/AL-4/ DLM/Krem/BD KJA1/KM/AL-4/ Brk2/Krem/BD 2/Sed/AL-4/ BJN/Krem/BLC 4A/AL-4/BJN/ PTH/BLC 7A/AL-4/BJN/ KREM/∧ 9L/AL-4/PTH/ BJN 4A/AL-4/BJN/ ORG/BLD KJA1/KM/AL-4/ DLM/ PTH/ TBRTRN/BJN -4 9L/AL /KNG/ BLC/BOKN/BJN 9L/AL-4/X/BJN 5L/AL-4/KNG/ BJN 2/Sed/AL-4/BJN/ KNG/ BLC KJA1/Sed/AL-4/ BJN/ORG/BKrD
4. Kesimpulan Dalam uji patogenitas diperoleh 3 strain bakteri yang mampu menginfeksi kembali ikan kerapu sehat, yaitu bakteri patogen Vibrio harveyi, 8.2/Luka/TSA dan 9.2/Luka/TSA. Dalam uji tantang diperoleh 2 isolat bakteri berpotensi kuat menghambat pertumbuhan bakteri patogen Vibrio harveyi, 8.2/Luka/TSA dan bakteri patogen 9.2/Luka/TSA, yaitu bakteri 9L/AL-4/KNG/BLC/BOKN/BJN dan 5L/AL-4/KNG/BJN. Uji pendahuluan formulasi bakteri penghambat agar dapat mengendalikan perkembangan bakteri penyakit pada ikan kerapu telah dilakukan namun belum memperoleh hasil yang memuaskan.
Daftar Acuan [1] O. Saeed, Aquaculture 136 (1995) 21. [2] Zafran, Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia 11 (1) (2005) p. 16-23. [3] R.R. Shickney, Encyclopedia of Aquaculture, John Wiley and Sons, Inc., New York, 2000, p. 418. [4] M.C.L. Baticados, J.D. Paclibare, in: M. Shariff, R.P. Subasinghe, J.R. Arthur (eds.), Disease in Asian Aquaculture I, Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines, 1992, p. 531. [5] M. Maeda, Bull. Natl. Res. Inst. Aquaculture, Suppl 1 (1994) 71. [6] WHO (World Health Organization), Guidelines for health related monitoring of coastal water quality, Copenhagen, 1977, p.165. [7] G.I. Barrow, .C. Miller, Vibrio parahaemolyticus and seafood, in: Microbiology in agriculture, fisheries and food. Academic Press, London, 1976, p. 181-195. [8] B. Gomez-Gill, Ph.D. Thesis, Institute of Aquaculture, University of Stirling, Stirling, 1998. [9] A. Irianto, Probiotik Akuakultur, UGM Press, Yogyakarta, Indonesia, 2003. [10] D.J.W. Moriarty, Penaeid Aquaculture Ponds 164 (1998) 351-358.
