Sejtalkotók a 2008. évi kémiai Nobel-díj fényében
Szabad János Szegedi Tudományegyetem Orvosi Biológiai Intézet 6720 Szeged, Somogyi utca 4. Tel: (62) 545-109 Evél:
[email protected]
- Ellenanyagokkal - a fehérje ellen - fúziós partner ellen
- Kivilágításukkal - A Shimomura, Chalfie és Tsien történet - Lumineszcencia - Fluoreszcencia - GFP (green fluorescent protein) - FRET (elektronikus gerjesztési energia átadása) - A fluoreszcens fehérjék jellemz i
- Riporter (transz)gének; típusok és hasznuk - Sejtbiológiai példák m helyünkb l
Gáspár Imre és Szabad János Kivilágított fehérjék. Sejtalkotók a kémiai Nobel-díj fényében Élet és Tudomány 63 (47. hét), 1487-1481, 2008.
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien
Osamu Shimomura izolálta (1961) az AEQUORIN fehérjét amely lumineszkál: egy kémiai reakció energiáját sugározza ki kékszín Aequorea victoria felvillanások formájában
Az aequorin izolálásának melléktermékeként bukkant fel a GFP (green fluorescent protein), a zöld fluoreszcens fehérje
A fluoreszencia képz désének elve
g
A GFP-molekula szerkezete
A GFP 238 aminosavból áll. Tömege 27 kDa, átmér je 4 nm. A fluorofor rész a 65-67. (Ser-Thr-Gly) aminosavakból áll
http://www.tsienlab.ucsd.edu/HTML/images
A fluoreszcens fehérjék jellemz i 1,0
GFP BFP
CFP EGFP YFP
DsRed Abszorpciós spektrumok
0,5
Hullámhossz (nm)
BFP CFP
1,0
GFP: Ser-Thr-Gly EGFP: Thr-Thr-Gly
YFP DsRed Fluoreszcencia spektrumok
0,5
Hullámhossz (nm)
lumineszencia
ATP aequorin
ADP + Pi
lumineszencia
ATP Aequorea victoria
aequorin
fluoreszcencia
ADP + Pi
ATP aequorin
GFP
ADP + Pi Az elektrongerjesztési energia átadása (FRET, fluoreszcencia rezonancia energia transzfer)
Az aequorin izolálásának melléktermékeként bukkant fel a GFP (green fluorescent protein), a zöld fluoreszcens fehérje
Használható riportergénként a GFP?
A GFP gént Douglas Prasher klónozta 1992-ben
- Ellenanyagokkal - a fehérje ellen - fúziós partner ellen
- Kivilágításukkal - A Shimomura, Chalfie és Tsien történet - Lumineszcencia - Fluoreszcencia - GFP (green fluorescent protein) - FRET (elektronikus gerjesztési energia átadása) - A fluoreszcens fehérjék jellemz i
- Riporter (transz)gének; típusok és hasznuk - Sejtbiológiai példák m helyünkb l
Riportergén típusok DNS
Promóter
Gén Átíródó rész
mRNS Fehérje
DNS
Riporter gén Promóter Riporter DNS
mRNS Riporter fehérje
Promóter DNS mRNS Kiméra fehérje
Riporter gén Átíródó rész
Ketel
Az E. coli LacZ génje, valamint az X-gal
Villányi et al. Mech Dev 125, 822, 2008.
A luciferáz, mint riportergén Transzgénikus Arabidopsis thaliana (lúdf ), amely luciferáz riporter transzgént hordoz
www.biology.ed.ac.uk/.../A_Millar_staffpage.htm
Luciferin A fotociták belsejében a luciferin luciferáz hatására luciferin-adenilil köztitermékké alakul, és amennyiben oxigén is jelen van, a köztitermék gerjesztett peroxiluciferinné alakul, amelyb l foton kibocsátásával oxiluciferin lesz. luciferin + ATP luciferyl adenylate + O2
luciferyl-adenylate + PPi
luciferáz
oxiluciferin + AMP + FÉNY
Nagy szentjánosbogár (Lampyris noctiluca) Firefrly, Photuris pennsylvanica
Riportergén típusok DNS
Promóter
Gén Átíródó rész
mRNS Fehérje
DNS
Riporter gén Promóter Riporter DNS
mRNS Riporter fehérje
Promóter DNS mRNS Kiméra fehérje
Riporter gén Átíródó rész
Martin Chalfie (1994). Transzgén a Caenorhabditis elegans fonálféreg idegsejtjeiben
Tulle Hazelrigg (1994). Transzgén a Drosophila melanogaster exuparentia génjével.
A riporter gének expressziója - Tranziens (traszfekciót követ en) - Permanens (transzgén alapján) Transzgének készítése muslicában
DNS oldat Sejtmag
Csírapalzma
sivarsejt Sejt, benne transzgén
A Drosophila engrailed (en) génjének promótere által szabályozott EGFPexpresszió. Az en a testszelvények hátulsó felében fejez dik ki. (http://genetik.fu-berlin.de/institut/flychip_06.html)
Az ssejtterápia hatékonyságát bizonyítandó, az itt a zölden világító egerek apját sterilizálták, majd sejtkultúrában tenyésztett ssejtek beültetésével ismét fertilissé tették. Az ssejtek, csakúgy, mint a bel lük származó utódok, termelik a GFP-t. (http://www.upenn.edu/pennnews/article.php?id=704)
A fluoreszcens fehérjék jellemz i 1,0
GFP BFP
CFP EGFP YFP
DsRed Abszorpciós spektrumok
0,5
Hullámhossz (nm)
BFP CFP
1,0
GFP: Ser-Thr-Gly EGFP: Thr-Thr-Gly
YFP DsRed Fluoreszcencia spektrumok
0,5
Hullámhossz (nm)
Discosoma lágykorall a Ds-Red forrása
- Ellenanyagokkal - a fehérje ellen - fúziós partner ellen
- Kivilágításukkal - A Shimomura, Chalfie és Tsien történet - Lumineszcencia - Fluoreszcencia - GFP (green fluorescent protein) - FRET (elektronikus gerjesztési energia átadása) - A fluoreszcens fehérjék jellemz i
- Riporter (transz)gének; típusok és hasznuk - Sejtbiológiai példák m helyünkb l
Mikrotubulusok muslica embrióban
Kromatin muslica embrióban
Mikrotubulusok és kromatin muslica embrióban
A Lodestar fehérje helye muslica embrióban tubulin
hiszton
lodestar
összevont
telofázis
metafázis profázis anafázis 5 m
Petekezdemények egy muslica petecs ben
Stg 7
Stg 6 Stg 4 Stg 2 Stg 9 50 m
Stg 6
Stg 7
Stg 8
Stg 9
5 m
A kolhicin leállítja a sejtmagok mocorgását Kolhicinnel kezelt
A sejtmagok mocorgása véletlenszer elfordulások sorozata
Importin- és kromatin
Mikrotubulusok bökögetik a sejtmagot
Az endoplazmatikus retikulum mozgása
A + végükön kivilágított mikrotubulusok follikuláris sejtekben
A + végükön kivilágított mikrotubulusok neuroblasztokban
A + végükön kivilágított mikrotubulusok dajkasejtekben
Sejtmag pozicionálás bököget mikrotubulusokkal
