Regulace imunitní reakce, Protilátky T subpopulace
• Typy antigenů vyvolávajících imunitní odpověď • Tvorba protilátek, příčiny diverzity a odlišné funkce, jejich regulace • Funkce protilátek za fyziologického a patologického stavu • Navození protektivní imunitní odpovědi (protilátkové i buněčné) – principy protiinfekční vakcinace
Lokalizace imunitní odpovědi • Imunitní odpověď proti antigenům lokalizovaným v krvi obvykle začíná ve slezině • Odpověď proti mikroorganizmům v tkáních je tvořena v lokálních lymfatických uzlinách • Většina patogenů vstupuje po inhalaci nebo ingesci – vstupem přes mukózní povrchy aktivují buňky MALT (Mucosa-associated lymphoid tissues)
Lymfocyty a jejich cestování • Získaná imunitní odpověď vyžaduje specializované mikroprostředí, ve kterém relevantní buňky mohou efektivně spolupracovat • Protože málo lymfocytů je specifických pro daný antigen, T a B lymfocyty musí migrovat v těle pro zvýšení pravděpodobnosti, že se s tímto antigenem setkají (lymfocyty stráví pouze asi 30 min v krvi během cyklu v těle)
Rozeznání antigenu • Antigen je rozeznáván na základě svého tvaru: tvar epitopu doplňuje tvar protilátky • Complementarity-determining regions (CDR) protilátek se nekovalentně vážou ke strukturám, které rozpoznávají • Pro malé antigeny, vazebné místo protilátky může být tvořeno kapsou, nebo rýhou, ale ve většině se podobná zvlněnému povrchu
Požadavky pro imunogenicitu - Ag • Cizorodost – pouze cizí molekuly jsou imunogenní • Molekulární velikost – Extrémně malé molekuly nejsou imunogenní (AA, msacharidy) – Molekuly menší než 10 kD jsou slabě imunogenní, nebo neimunogenní – Nejsilnější antigeny jsou těžší než 100 kD
• Chemická komplexita – Immunogenicita roste s chemickou komplexitou – Jednoduché syntetické peptidy jsou slabé imunogeny, aromatické AA jsou imunogenní více
• Stabilita
Dávka a aplikace imunogenu • Dávka a způsob aplikace jsou podstatné – Vysoká dávka jednorázově– může vést k imunoparalýze (anergie) – Nízká dávka jednorázově– může být příliš rychle destruována – Optimum – malá až středně velká, opakované dávky antigenu
Chování epitopů • CpG motivy mohou stimulovat B lymfocyty přímo (též vlastnosti adjuvancia) • Epitope spreading – Imunitní systém je stimulován jedním epitopem, další epitopy antigenu mohou být zavzaty do odpovědi – např. tvorba autoprotilátek
• Kryptické epitopy – Prezentovány pouze po stimulaci APC prozánětlivými cytokiny– MBP – Antigenní driftt – kontinuální mutace mikroorganizmů, kdy je tvořeno velmi málo paměťových buněk
Antigenní drift a shift • Kontinuální mutace mikroorganizmů způsobují jev zvaný antigenic drift. • Mutace způsobí problém pro paměťové buňky imunitního systému • Velmi málo (pokud nějaké) paměťové buňky umí při přirozené expozici rozpoznat novou antigenní variantu • Antigenní shift je specifický příklad reassortment nebo virového shiftu, který hpůsobí fenotypovou změnu. Příkladem závažného efektu antigenního shiftu je pandenmie viru influenzy
Epitopy B lymfocytů • Protilátky, ať jsou v sekreční formě nebo působí jako receptor, vyjímečně rozeznávají kontinuální epitopovou sekvenci
• Obvykle však rozeznávají diskontinuální epitopy, složené z aminokyselin, složených k sobě, když je protein skládán do své nativní struktury
Trojrozměrná konfigurace globulárního proteinu - lysozym • Protilátky proti celé molekule nereagují po zrušení vazeb • Lineární peptidy ztratí antigenní konfiguraci
Antigen B lymfocytů • Antigen globulárního proteinu – mozaika determinant (epitopový cluster) • Individuální protilátky v polyklonálním séru • Monoklonální protilátka se za normálních okolností v organizmu nevyskytuje
Protilátková molekula, znázorněny struktury těžkého a lehkého řetězce, s volnými řetězci κ a λ
Permission obtained from The Binding Site © Bradwell, A.R. Serum free light chain analysis. 4th edn, page 12 (2006)
Hutchison, C. A. et al. (2009) Serum free light chain assessment in monoclonal gammopathy and kidney disease Nat. Rev. Nephrol. doi:10.1038/nrneph.2009.151
Polyklonální proliferace plazmatických buněk
Infekce
Autoimmunita
Monoklonální proliferace plazmatických buněk
Tumory plazmatických buněk
Zvýšená produkce obou FLC
Zvýšená produkce jednoho FLC
Normální poměr
Poměr
zůstává zachován
je abnormální
Mnohočetný myelom • A 66-letý muž pociťoval konstantní ostrou bolest v bederní krajině, trvající od pádu ze žebříku před 6 týdny. • Normální červený, bílý KO, sedimentace 98mm/h. Celková bílkovina zvýšena 98g/l (NR 65-75g/l) Sérový albumin, kreatinin a urea byly normální. Měl zvýšenou hodnotu Ca (3.2 mmol/l), ale normální alkalickou fosfatazu. • Elektroforéza sérových proteinů ukázala monoklonální pás v obl. gama globulinu • Pás byl typován pomocí imunoelectroforezy jako IgG, kappa typ. • Kvantitace sérových Ig ukázalo zvýšenou hodnotu IgG 67g/l (NR 7.2-19.0g/l), nízké IgA 0.3g/l (NR 0.8-5.0g/l), nízké IgM 0.2g/l (NR 0.5-2.0g/l). Elektroforeza moče nalezla monoklonální pás, IELFO -free kappa lehké řetězce. • RTG pánve ukázalo malé, ostře ohraničené leze v L páteři, a destrukci symfysis pubis • Biopsie k.dřeně – zvýš. počet atypických plazmocytů
Aktivace B lymfocytů 1. Přímo vazbou antigenu 2. S pomocí T lymfocytů – buněčný kontakt nebo vlivem cytokinů buňky jsou aktivovány, proliferují (s identickou nebo velmi podobnou specificitou), diferencují v plazmatické buňky – charakteristikou je vysoká produkce solubilních receptorů
Antigeny B lymfocytů nezávislé na T lymfocytech: TI-1 • Protilátková reakce na TI antigeny – TI-1 antigen – např. bakteriální lipopolysacharid- polyklonální BCR aktivace/ nespecifická (v případě vysoké koncentrace LPS) – Nízkoafinitní, protilátky izotypu IgM • Podobné rostlinným lektinům nebo bakteriálním superantigenům – aktivátory T lymfocytů
B antigeny nezávislé na T lymfocytech: TI-2 • TI-2 - polymery, repetitivní struktury typické po buněčnou stěnu opouzdřených bakterií (Pneumokoky) nebo polymérní proteiny (flagellin - několik podjednotek bakterií) • Repetitivní struktury reagují s mnohočetnými BCR, intenzívně BCR agregují a aktivují B lymfocyty(zralé) – signály pro proliferaci bez pomoci T lymfocytů
Antigeny nezávislé na T lymfocytech - souhrn • první linie obrany proti povrchovým polymerům mikroorganizmů • mají mnohokráte opakované epitopy (např. polysacharid) • intenzívní „prokřížení“ membránových Ig nahradí pomocné signály. Není nezbytný kontakt Th lymfo, postačují cytokiny od T, NK buněk • nedochází k afinitní maturaci • není imunologická paměť
Limitace TI antigenů • Pouze zralé B lymfocyty jsou schopny reagovat s TI antigeny • Nezralé B lymfocyty jsou anergizovány (novorozenci mají vysoké procento nezralých B lymfocytů). Splenektomie je riziko pro ID – TI2 Ag • Je stále potřeba slabé cytokinové pomoci (IL2, IL-3, IFN gama), původem zřejmě z NK buněk, T lymfocytů?
T dependentní antigeny • Charakteristiky: Primární a sekundární imunitní reakce • Dvě fáze mohou být odděleny (nízká dávka antigenu, intervaly mezi dávkami) nebo mohou být kontinuální (přirozená infekce) • Výsledek – paměťové buňky, vysokoafinitní protilátky
Populace B lymfocytů – B1 lymfocyty • B lymfocyty, které vzniknou nejdříve během ontogeneze se nazývají B1. Většina exprimuje CD5 znak, adhezívní a signální membránové molekuly • Jsou zdrojem takzvaných přirozených IgM protilátek • Často jsou polyreaktivní (např. rozpoznávají několik různých antigenů, často včetně běžných patogenů a autoantigenů – obdoba mitogenů) • Přirozené protilátky mají relativně velmi nízkou afinitu
B2 lymfocyty • Většinová populace – B2, nemají CD5 • Před kontaktem s antigenem zralé B2 buňky exprimují současně IgM and IgD protilátky • Po aktivaci se stanou buňkami paměťovými, obvykle se přepínají k použití IgG, IgA, nebo IgE jako jejich antigenního receptoru • Když se B2 buňky v germinálních centrech setkají s antigenem, dojde k izotypovému přesmyku a začínají tvořit IgG, IgA, nebo IgE, a dojde k somatické hypermutaci, finálně plazmat.bb. v sek. lymf. tkáni • Obecně žijí krátce, poločas mají asi jen několik dní, pouze některé plazmatické buňky přežívají týdny (BM)
Vlastnosti Ig IgG
IgA
IgM
IgD
IgE
Fixace C Placentární transfer
+ +
-
+++ -
-
-
Distribuce Krev Intersticium Zevní sekrety
+++ +++ +-
++ ++ +++
+++ + ++
+++-
+++-
Poločas v séru (dny)
21
6
3-5
4
2
Buněčná vazba PMN Makrofágy Bazofily Mastocyty
+ + ++-
+-
-
-
+ +
Klonální selekce • Protože každý B lymfocyt je programován tvořit pouze jednu z mnoha protilátek, všechny antigenní receptory na jednom B lymfo mají stejnou specifitu • Tyto klony lymfocytů jsou vybrány k účasti v imunitní reakci, pokud nesou receptor, který se může vázat na relevantní antigen, proces zvaný klonální selekce • Buňky vybrané antigenem proliferují, což vede k rychlému vzestupu počtu B a T lymfocytů, které mohou rozpoznat antigen
Souhrn vývoje B lymfocytů – „kritické kroky“ 1. Přeskupení genů pro H řetězec a povrchová exprese pre-BCR (+L) 2. Úspěšné přeskupení genů pro L- řetězec a povrchová exprese IgM (BCR) 3. Nezralé B lymfocyty – testování pro potenciální autoreaktivitu (apoptot.sign.) 4. Somatické mutace a afinitní maturace přežijí pouze buňky s nejvyšší afinitou pro antigen
Primární protilátková odpověď 1.
Stimulace B lymfocytů prostřednictvím
BCR ( B cell receptor) 2. Stimulace Th (→Th2) pomocí APC (MHC+protein). Výsledkem aktivace je tvorba nízkoafinitních IgM protilátek. Imunokomplexy IgM a antigen jsou uchovávány na povrchu folikulárních dendritických buněk (FDC).
Primární protilátková odpověď (pokrač.) 1. Pohlcení antigenů profesionálními fagocyty (APC – především dendritické buňky). Prezentace MHC II + Ag Th lymfocytům – klony Ag specifických Th2 lymfocytů 2. Th2 rozpoznávají aktivované B lymfocyty (přítomnost MHC II +Ag) a pomáhají jim pomocí cytokinů – přísun, proliferace a diferenciace –tvorba plazmatických buněk s tvorbou protilátek 3. Paměťové buňky – část B lymfocytů. Spouštějí sekundární protilátkovou odpověď
Primární protilátková odpověďsouhrn • 3-4 dny po imunizaci • Lokalizace – sekundární lymfatické orgány • Typ odpovědi – IgM izotyp, nízká afinita k antigenu, účinné v blokádě „Ag spreading“ • Imunokomplexy Ab+Ag uchovávané v lymfatických uzlinách na FDC (velmi dlouho, možná roky!) – primární lymfoidní folikuly. • FDC opět stimulují B lymfocyty (klonální expanze buněk primárně stimulovaných Ag)
Sekundární odpověď B lymfocytů
• Podmínky:
– Rozpoznání antigenů na FDC v primárních lymfatických folikulech – Signály z Th lymfocytů
• Nové dělení a diferenciace B lymfocytů. Mutace V genového segmentu pro H, L řetězce • Mutantní klony B lymfocytů s odlišnými vazebnými místy (ve srovnání se vstupujícími buňkami) • Pouze B lymfocyty s velmi silnou afinitou přežijí, buňky s afinitou slabou (ne-produktivní mutace) zahynou
Somatická hypermutace Geny kodující receptory B lymfocytů projdou procesem zvaným somatická hypermutace - během proliferace B lymfocytů v germinálních centrech sekundárních lymfatických orgánů. Změny v AMK vyladí rozpoznávání antigenu a určí sílu vazby (afinitu) protilátky Výsledek klonální selekce je populace B lymfocytů s vysokou afinitou a výlučnou antigenní specifitou pro imunizující antigen, a populace paměťových buněk pro tento antigen
Selekce B lymfocytů s protilátkovými mutantami o vysoké afinitě
Izotypový přesmyk těžkého řetězce • Aby byl exprimován izotyp jiný než nebo , v lokusu H řetězce proběhne přeskupení, které umístí novou CH sekvenci k exonu V/D/J • Delece skupiny exonu enzymatickou cestou, odlišnou od V/D/J přeskupení • V obrázku je gen přepojen na C1 izotyp
Isotypový přesmyk řetězce Ig • Cíl: Výměna konstantní oblasti protilátky • Ireverzibilní delece oblastí genového komplexu pro H řetězec, beze změn v genové oblasti VDJ • C a C jsou odstraněny. Rekombinázy rozpoznávají „switch sequences“ umístěné u C segmentů (pouze nejsou přítomny mezi C and C )
Regulace izotypového přesmyku Cytokiny IL-4 IFN - γ TGF IL-10
Přesmyk na: IgE, IgG1, inhibiční IgG2 IgG2a, IgG3 IgG2b, IgA IgA
Sekundární odpověď B lymfocytů (pokračování) • Rostoucí výběr a soutěž buněk, protože klesá množství antigenu (na FDC) • Intenzívní proliferace a hynutí • Lokalizováno v sekundárních lymfoidních folikulech v germinálních centrech (mikroskopicky) • Výsledek afinitní maturace: Afinita 4-6 řády vyšší než u IgM primární odpovědi
Indukce protilátkové odpovědi souhrn • antigenní stimulace probíhá v sekundárních lymfatických orgánech • odpověď na většinu antigenů vyžaduje kooperaci s T lymfocyty • aktivace a klonální expanze antigen specifických B lymfocytů • izotypové přepnutí, somatické mutace • diferenciace do stádia plazmatických buněk • primární a sekundární protilátková odpověď
Primární a sekundární protilátková produkce
Výsledný efekt sekundární protilákové odpovědi 1. Protilátky s vysokou afinitou 2. Protilátky s odlišnou efektorovou funkcí (aktivace komplementu, FcR funkce) 3. Paměťové buňky
Imunitní ochrana protilátkami • Neutralizace • Opsonizace • Aktivace komplementu • Tkáňové poškození díky tvorbě Ab
Neutralizace • Protilátky mohou neutralizovat aktivitu – toxinů – virů – jiných mikroorganismů
• Mechanizmy: vazba na kritické epitopy – prevence adheze na buňky nebo vstupu do buněk
Aktivace komplementu, opsonizace • Klasická cesta aktivace komplementu – vázán C1q, s Fc fragmentem IgM nebo IgG na povrchu buňky – tvorba C3b a dalších biologicky aktivních složek komplementu, které podporují fagocytózu
• Pokud není přítomen komplement, mikroorganizmy jsou obaleny protilátkami IgG, IgA, nebo IgE, které se váží na příslušný receptor
Cytotoxicita způsobená protilátkami • NK buňky mohou způsobit: – IgG zprostředkovanou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC)
• Cytotoxicita závislá na protilátkách IgE • Makrofágy, eosinofily a destičky se účastní cytotoxických mechanizmů, pokud je cílová buňka příliš velká pro fagocytózu. Používány perforiny, granzymy, nebo někdy reaktivní metabolity kyslíku
Regulace funkce imunitního systému • Účinná imunitní odpověď eliminuje antigen a odpověď se vrací na bazální úroveň • Některé další mechanismy zpočátku vylaďují aktivitu, posléze aktivitu tlumí • IgG samo může vypnout odpověď k patřičnému antigenu (negativní zpětná vazba) • FcR a BCR na stejné buňce jsou spojeny imunokomplexy obsahujícími relevantní antigen. Výsledkem je předání inhibičního signálu do jádra B lymfocytů
Regulace imunitního systému • Antigenem – – – –
•
Udržuje paměťové buňky Startuje afinitní maturaci Antigenová kompetice – silnější vazba epitopu potlačuje slabší Prahová denzita Ag na APC – vyšší na Th2 než Th1
Antagonistickým peptidem –
TCR může reagovat s MHC+peptid variabilně – negativní nebo pozitivní signál
Regulace imunitního systému protilátkami • Kompetice volných Ab s BCR • Imunokomplexy IgG +Ag – agregují BCR a CD32b (Fcγ R). • Protein-kinázy a protein-fosfatázy reagují navzájem a blokují aktivaci B lymfocytů
Složky idiotypové sítě • Ag receptor na jednom lymfocytu (Ab), rozeznává idiotyp na receptoru jiného lymfo • B a T lymfocyty reagují prostřednictví idiotypové a antiidiotypové reakce – výsledkem je stimulace nebo suprese
Regulace imunitní odpovědi – mezibuněčný kontakt • Adhezívní molekuly– Ig superfamily (CD40CD40L) • Inhibiční receptory– CTLA-4 (CD152) (strukturálně podobné CD28), váží CTLA-4 ligand – silný negativní signál T lymfo • Inhibiční receptory NK buněk, T lymfo CD86 KIR - ligand NKG2, Fas-FAsL • Interakce Fas s FasL na povrchu aktivovaných T lymfo
T lymfocyty - subpopulace
T lymfocyty – centrální buněčná populace imunity • regulaci uskutečňují prostřednictvím cytokinů a membránových interakcí
• regulují B lymfocyty a protilátkovou imunitu • regulují specifickou T lymfocytární cytotoxicitu • regulují přirozenou cytotoxicitu
• složky obranného i poškozujícího zánětu (granulomu)
Rozpoznání Ag T lymfocytem na APC Antigen
Endocytosis
CD4+
T cell T Cell Receptor
APC
Peptide MHC II
Aktivace T lymfocytu aktivovanou APC IL-1 IL-6
IL-12 IL-12 Receptor
CD28
“Signal 3”
B7
CD4+
T cell LPS
T Cell Receptor
“Signal 2”
TLR4
“Signal 1”
Peptide
MHC II
Signal 1: Specificity Signal 2: Activation Signal 3: Differentiation
Antigen Presenting Cell (APC)
Populace T lymfocytů • T lymfo – T-helpers (CD4+) • Th1 • Th2
– Cytotoxické T lymfo (CD8+) – Regulační T lymfo (CD4+CD25+ ?) – NKT buňky
• T lymfo • Plasticita T lymfocytů
Subpopulace T lymfocytů Zralé TCR + lymfocyty se fenotypově skládají ze více populací - CD4+ (pomocné) nebo CD8+ (cytotoxické) Přibližně 5% až 10% periferni populace T lymfocytů je CD4CD8-. (gama/delta). Pravěpodobné ligandy jsou neklasické MHC molekuly T lymfocyty - IL-2, IFN- a TNF- - TH 1 lymfocyty T lymfocyty - IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, a IL-13 - TH 2 lymfocyty T lymfocyty s regulační/potlačující funkcí jsou Treg (IL-10, TGF-β), Th3 cells (TGF-β, IL-4, IL-10), Tr1 (IL-10)
Th1 lymfocyty • Prozánětlivé buňky • Pomoc makrofágům – Aktivace a stimulace jejich cytotoxických funkcí – Eliminace intracelulárních mikroorganizmů
• Pomoc T lymfocytům – Proliferace, Th1 diferenciace
• Sekrece cytokinů (IFN-,TNF-,IL-2) • Protiinfekční, pozdní přecitlivělost, autoimunita
Th2 lymfocyty • Pomoc B lymfocytům – Vývoj – Sekrece protilátek
• Regulační funkce • Sekrece cytokinů (IL-4,IL-5,IL-6,IL-13) • Obrana proti extracelulárním mikroorganizmům • Participace v alergických reakcích
Fenotypové rozdíly a odlišné funkce TH1 a TH2 buněk
Regulační T lymfocyty • • • • •
CD8+ T lymfocyty nejsou supresoři !!! CD4+CD25+ FoxP3+ T lymfocyty Th3 T lymfocyty NKT lymfocyty T lymfocyty
Funkce regulačních T lymfocytů • Inhibice imunitních reakcí • Udržování immunologické tolerance • Regulace přehnané imunitní reakce proti infekci, alergenům • Suprese protinádorové imunitní odpovědi • Mechanizmy: – Závislý na přímých mezibuněčných kontaktech – Sekrece cytokinů (IL-4, IL-10, TGF-) – Zabíjení efektorových buněk
Clinické aplikace Treg cells
Th17 • • • • •
Vývoj v prostředí bohatém na TGF- a IL-6, IL-21, IL-23 Sekrece IL-17, IL-21, IL-22 Prozánětlivé cytokiny Role v imunitní odpovědi proti Klebsielle a citrobacteru Pravděpodobně se podílí na rozvoji některých orgánspecifických autoimunitních onemocnění v experimentálním modelu Th3
Cytotoxické CD8+ T lymfocyty • Eliminace of nebezpečných buněk vlastního organismu • Eliminace buněk napadených intracelulárními antigeny • Eliminace poškozených buněk
NK buňky (přirození zabíječi) • Natural killer buňky destruují infikované (virem) a maligní buňky – Mají Fc receptory které váží IgG: FcR - vazba na cílové buňky s navázaným IgG (proces zvaný antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) – Receptory aktivující zabíječe rozpoznávají mnoho různých molekul, inhibiční molekuly pro zabíječe rozpoznávají MHC I. třídy
Funkce NK buněk • Antigen – nespecifické • Rozpoznání dosud neznámých antigenů na povrchu cílových struktur
Funkce NK buněk • Aktivace a funkce NK buněk je závislá na interakci aktivačních a inhibičních receptorů na povrchu NK buněk • Aktivace: Fc receptor CD16 • ADCC – antibody-dependent cellular cytotoxicity • Inhibice – killer inhibitory receptors – KIR (Ly49, CD94-NKG2)
NKT buňky • Natural Killer T cells • Fenotyp a funkce obou - NK buněk a T lymfocytů • Restrikčním elementem NKT buněk je molekula CD1d prezentující glykolipidy a lipidy
Fenotyp NKT buněk • Exprese TCR, CD3, CD4 • Exprese povrchových znaků typických pro NK buňky • Omezený TCR repertoár • Rozpoznání konzervovaných struktur na bázi lipidů a glykolipidů
Funkce NKT buněk • • • • •
Sekrece Th1 i Th2 cytokinů Role v Th1/Th2 diferenciaci naivních T lymfocytů Activace B lymfocytů Activace NK buněk Activace dendritických a dalších antigen prezentujících buněk • Cytotoxické funkce • Regulační funkce
