PURIFIKASI DAN PENCIRIAN ERITROPOIETIN REKOMBINAN HASIL EKSPRESI PADA SISTEM KHAMIR Pichia pastoris
ANDRI WARDIANA
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK ANDRI WARDIANA. Purifikasi dan Pencirian Eritropoietin Rekombinan Hasil Ekspresi pada Sistem Khamir Pichia pastoris. Dibimbing oleh SUMINAR S. ACHMADI dan ADI SANTOSO. Untuk keperluan klinis diperlukan protein yang murni dan diketahuinya struktur gula dari eritropoietin (EPO) rekombinan. Purifikasi dilakukan dengan metode histrap dan dilanjutkan dengan kolom kromatografi filtrasi gel untuk mendapatkan protein yang lebih murni. Protein murni yang didapat kemudian dicirikan gugus gulanya dengan menggunakan N- dan O-glikosidase serta dibandingkan dengan EPO rekombinan dari sel mamalia. Hasilnya menunjukkan adanya kesamaan pola penurunan bobot molekul protein yang dapat dilihat dengan metode blot Western. Oligosakarida murni dihidrolisis untuk menghasilkan berbagai monosakarida dengan cara inkubasi dengan HCl 4 N pada suhu 100 ºC selama 6 jam dan hasilnya diaplikasikan pada kolom kromatografi cair kinerja tinggi untuk mengetahui komposisi monosakaridanya. Akan tetapi data yang didapatkan belum dapat menunjukkan jenis monosakarida apa yang terkandung didalamya.
ABSTRACT ANDRI WARDIANA. Purification and Characterization of Recombinant Human Erythropoietin Expressed in Yeast System Pichia pastoris. Under direction of SUMINAR S. ACHMADI and ADI SANTOSO. For the clinical purposes needed a purified protein and the carbohydrates contains of recombinant erythropoietin (EPO) should be known. Purification was done by histrap method and then applied to column chromatography gel filtration to make more purified. Carbohydrates groups which is oligosaccharide on purified protein then was characterized by N- and O- glycosidase and the pattern compared with recombinant EPO by CHO cells. The result show has a similar molecular mass which visualized by Western blot method. The purified oligosaccharide were hydrolysed to monosaccharides by incubation in 4 N HCl at 100 ºC for 6 h in evacuated sealed tube. Monosaccharides were separated by high performance liquid chromatography instrument, but unfortunately, the results cannot be shown the kind of monosaccharides.
PURIFIKASI DAN PENCIRIAN ERITROPOIETIN REKOMBINAN HASIL EKSPRESI PADA SISTEM KHAMIR Pichia pastoris
ANDRI WARDIANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi : Purifikasi dan Pencirian Eritropoietin Rekombinan Hasil Ekspresi pada Sistem Khamir Pichia pastoris Nama : Andri Wardiana NIM : G44076002
Menyetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Dr. Ir. Suminar S. Achmadi NIP 194804271974122001
Dr. Adi Santoso NIP 196012171986031004
Mengetahui: Ketua Departemen,
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS. NIP 195012271976032002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kepada ALLAH SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Shalawat dan salam penulis juga haturkan untuk Nabi besar Muhammad SAW yang telah membimbing umatnya ke dalam jalan kebenaran. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2009 ini ialah mengenai protein rekombinan, dengan judul Purifikasi dan Pencirian Eritropoietin Rekombinan Hasil Ekspresi pada Sistem Khamir Pichia pastoris. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Suminar S. Achmadi dan Bapak Dr. Adi Santoso selaku pembimbing, serta staf peneliti Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, terutama staf laboratorium Biologi Molekuler tempat penulis melakukan penelitian. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Buana Girisuta selaku Kepala jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Katolik Parahyangan Bandung beserta stafnya yang telah mengizinkan penulis untuk menggunakan alat KCKT untuk keperluan penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan untuk ayah, ibu, keluarga besar, serta seluruh sahabat, atas segala doa dan dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2009 Andri Wardiana
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 15 Oktober 1983 dari ayah Eman dan ibu Nyimas Setyawati. Penulis merupakan putra ke tujuh dari tujuh bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMA Negeri 15 Bandung dan pada tahun yang sama masuk Universitas Padjadjaran Bandung Program Diploma III jurusan Analis Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2007 penulis masuk IPB memilih Program Penyelenggaraan Khusus S1 Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Sejak tahun 2006, penulis tercatat sebagai pegawai Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dan sampai saat ini masih aktif dalam kegiatan penelitian di laboratorium biologi molekuler, khususnya dalam bidang rekayasa protein.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................... vii PENDAHULUAN .......................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Eritropoietin.............................................................................................................. Pichia pastoris .......................................................................................................... Glikoprotein.............................................................................................................. IMAC Histidin-Tagged Fusi Protein ........................................................................
1 2 2 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ......................................................................................................... 3 Tahapan Penelitian ................................................................................................... 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Kemurnian EPO Rekombinan ................................................................................. 5 Kandungan Gugus Gula dari EPO Rekombinan ....................................................... 6 Kandungan Monosakarida Gugus Gula EPO Rekombinan ...................................... 7 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................................ 8 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................... 8 LAMPIRAN ....................................................................................................................12
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Rantai asam amino protein EPO ................................................................................. 2 2 Hasil analisis blot Western EPO rekombinan yang telah dipurifikasi pada kolom Histrap.................................................................................. 5 3 Fraksinasi eluat hasil histrap dengan mengunakan kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex LH-20 volume 40 ml ........................................... 6 4 Analisis blot Western protein hasil fraksinasi dengan kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex LH-20 .................................................................. 6 5 Pewarnaan dengan perak hasil purifikasi dengan histrap dan kromatografi filtrasi gel ........................................................................................ 6 6 Pencirian gugus gula glikoprotein............................................................................... 7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 Komposisi reagen SDS-PAGE, blot Western, dan pewarnaan perak ......................... 11 2 Kromatogram hasil analisis monosakarida dengan KCKT ....................................... 13
1
PENDAHULUAN Eritropoietin (EPO) adalah suatu glikoprotein hormon yang mengatur proses eritropoiesis, yaitu proses proliferasi dan diferensiasi sel progenitor eritroid menjadi eritrosit pada manusia. Menurunnya kandungan EPO dalam tubuh dapat menyebabkan anemia karena rendahnya proses eritropoiesis. EPO adalah sitokin yang diketahui dapat menstimulasi proses angiogenesis, vaskulogenesis, dan proliferasi sel endotelial (Ashley et al. 2002). Gen EPO manusia diekspresikan sebagian besar pada jaringan ginjal dan hati sebagai respons pada hipoksia (Yin & Blanchard 2000). EPO rekombinan telah tersedia dan digunakan untuk pengobatan klinis pada penderita anemia yang disebabkan oleh kanker, infeksi human immunodeficiency virus (HIV), sindrom meilodisplastik, gagal ginjal, dan transplantasi sumsum tulang (Park et al. 2000). Untuk kebutuhan klinis rekombinan EPO ini tersedia dalam jumlah besar hasil ekspresi pada sel mamalia, yaitu pada sel CHO (chinese hamster ovary) (Egrie 1990). Yang menjadi kendala penggunaan kultur sel mamalia untuk produksi EPO rekombinan adalah efisiensi dan biaya produksi yang tinggi (Fernandez & Hoefler 1999). Oleh karena itu sangat dibutuhkan sistem alternatif yang lebih efisien dengan biaya produksi yang lebih murah. Pichia pastoris merupakan khamir metilotropik yang menawarkan suatu sistem ekspresi yang sangat menguntungkan untuk produksi protein rekombinan. Dibandingkan dengan sistem ekspresi dari jenis eukariot lainnya, P. pastoris memiliki keuntungan lebih, yaitu sistem ekspresi dengan efisiensi yang tinggi karena menggunakan promotor dan vektor gen alkohol oksidase terinduksi metanol (AOX1) yang terintegrasi pada genom Pichia. Selain itu, khamir tersebut memiliki level sekresi yang tinggi pada media bebas protein dengan proses fermentasi yang mudah. Keuntungan lainnya ialah terbatasnya atau tidak terjadinya glikosilasi berlebih dan tidak adanya gugus antigenik, yaitu ikatan α1,3-manosa pada ujung gugus gula (Skoko et al. 2003). P. pastoris juga menunjukkan glikosilasi yang sangat mirip dengan sel mamalia (Cregg et al. 1993). Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI telah berhasil mengekspresikan EPO rekombinan dalam sistem ragi P. pastoris dan telah berhasil membuktikan bahwa supernatan hasil fermentasi mengandung EPO dengan teknik
blot Western. Untuk tahap selanjutnya diperlukan teknik pemurnian yang tepat untuk mendapatkan protein murni dan pencirian lebih lanjut tentang struktur kimia EPO rekombinan yang telah dihasilkan. Maka dari itu, pada penelitian ini dilakukan proses purifikasi dan pencirian gugus gula dalam EPO rekombinan untuk keperluan klinis.
TINJAUAN PUSTAKA Eritropoietin Eritropoietin manusia atau yang lebih dikenal dengan EPO merupakan glikoprotein hormon yang telah dipurifikasi sejak 3 dasawarsa yang lalu. Penelitian tentang EPO telah berkembang dan menjadi topik penelitian utama para peneliti yang bertujuan sebagai bahan terapeutik. Kloning dan ekspresi gen eritropoietin telah mengembangkan eritropoietin rekombinan sebagai obat. Sejak tahun 1980 eritropoietin rekombinan menjadi komoditas utama dalam industri bioteknologi karena penjualannya meningkat dari tahun ke tahun hingga mencapai miliaran dolar (Sytkowsky 2004). Dalam situs resmi Glythera melaporkan bahwa penjualan protein terapeutik pada tahun 2008 berdasarkan kategori menunjukkan bahwa hematopoietik menduduki urutan pertama, yaitu sebesar 23%. EPO adalah golongan hematopoietik faktor pertumbuhan pertama yang telah diklon (Jacobs et al. 1985; Lin et al. 1985). EPO rekombinan dapat menstimulasi produksi sel darah merah, mengobati anemia yang disebabkan oleh gagal ginjal pada pasien hemodialisis, dan mereduksi durasi terkena anemia pada pasien yang menjalani kemoterapi. Terapi dengan EPO rekombinan dapat menurunkan kebutuhan transfusi darah pasien sehingga dapat mengurangi risiko penularan penyakit seperti hepatitis atau HIV (Sorisio & StrØm 2006). EPO rekombinan digunakan juga sebagai doping bagi para atlet. Pada 10 November 1999 yang bertempat di Swis, Agen Anti-doping Dunia (WADA) memutuskan untuk mengendalikan penggunaan doping bagi para atlit termasuk EPO, setelah beberapa bulan mengadakan pertemuan yang membahas skandal doping EPO pada perhelatan Tour de France 1998 (Sytkowsky 2004). EPO merupakan sialoglikoprotein yang diproduksi terutama di ginjal saat dewasa dan di hati saat dalam janin yang memegang peranan penting dalam proses proliferasi dan diferensiasi sel progenitor eritroid menjadi
2
eritrosit (Higuchi 1992). EPO mempunyai untai tunggal 165 asam amino yang mengandung 40% karbohidrat berupa 3 posisi N-glikosilasi yang menempel pada Asn24, Asn38, dan Asn83, serta 1 posisi O-glikosilasi yang menempel pada Ser126 seperti terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Rantai asam amino protein EPO dengan 2 jembatan disulfida dan 4 oligosakarida yang menempel pada N24, N38, N83, dan S126 (Sytkowsky 2004). Glikosilasi sangat penting bagi fungsi hayati EPO. Glikosilasi yang tidak tepat atau modifikasi pada rantai glikan EPO dapat mengakibatkan perubahan aktivitas secara in vitro maupun in vivo. Jumlah residu asam sialat dan pola percabangan Nglikosilasi dari rantai oligosakarida akan menentukan farmakodinamik, kecepatan katabolisme dan aktivitas hayati EPO (Fukuda et al. 1989). Pichia pastoris P. pastoris merupakan jenis khamir (yeast) metilotropik yang telah dikembangkan untuk keperluan sistem ekspresi protein heterologous Pichia secara luas digunakan untuk ekspresi protein menggunakan teknologi DNA rekombinan (Invitrogen 2009). Klasifikasi dari P. pastoris sebagai berikut, dunia Fungi, filum Ascomycota, kelas Saccharomycetes, orde Saccharomycetales, famili Saccharomycetaceae, genus Pichia, dan spesies P. pastoris (Paff 1956 dalam mycobank 2009). Sebagai khamir, P. pastoris merupakan mikroorganisme uniseluler seperti bakteria yang relatif dapat berkembang biak dengan cepat dan tidak memerlukan biaya yang tinggi untuk dimanipulasi di dalam kultur. Walaupun demikian, tidak seperti bakteri, khamir merupakan eukariot yang memiliki lingkungan intraseluler yang sama dan memiliki kemampuan yang sama seperti eukariot lainnya termasuk manusia dalam proses pascatranslasional protein. Maka dari
itu, protein dari eukariot dapat dikembangkan, diproses, dan disusun menjadi molekul yang berguna ketika disintesis dalam khamir (Cregg 2007). Dibandingkan dengan Saccharomyces cerevisiae, protein rekombinan yang dihasilkan dari P. pastoris menghasilkan sedikit atau tidak terjadi glikosilasi berlebih dan tidak terdapat gugus imunogenik, yaitu ikatan α-1,3-manosa yang terdapat pada ujung gugus gula (Skoko et al. 2003). Dalam P. pastoris terdapat 2 enzim metabolik, yaitu alkohol oksidase (AOX) dan dihidroksiaseton sintase (DHAS) yang akan menghasilkan sekitar 30% total protein dalam sel dengan adanya metanol sebagai satu-satunya sumber karbon. Vektor untuk P. pastoris yang paling populer ialah pPICZ yang tahan terhadap Zeocin. Vektor lain yang diketahui ialah PEP4 yang memiliki level ekspresi yang rendah dan penanganannya cukup sulit (Cregg 2007). Semua galur dari P. pastoris merupakan turunan galur tipe liar Y-11340 dari Northern Regional Research Laboratories. Galur X-33 yang juga merupakan tipe liar dan GS115 (HIS4) yang ditransformasi dari gen tipe liar P. pastoris HIS 4 tidak memerlukan suplemen dalam media kultur minimum (Lin-Cereghino 2007). Glikoprotein Glikoprotein merupakan protein yang terikat dengan karbohidrat secara kovalen melalui ikatan glikosida (Spiro 1973 dalam Beeley 1985). Glikoprotein memiliki karbohidrat dengan beragam ukuran mulai dari monosakarida sampai polisakarida yang mungkin berasal dari ratusan unit karbohidrat yang melekat pada 1 rantai polipeptida. Residu monosakarida dari glikoprotein kebanyakan membawa gugus substituen. Beberapa dari glikoprotein ditemukan memiliki residu manosa yang teresterifikasi dengan O-fosfat (atau β-N-asetilglukosaminilO-fosfat). Asam sialat dapat membawa beberapa substituen. N-asetil atau N-glikolil merupakan turunan asam neuraminat bisa terdapat dalam glikoprotein dan kemungkinan merupakan ragam dari gugus O-asetil dan atau O-glikolil (Beeley 1985). Pencirian dari glikoprotein dengan sedikit karbohidrat (<5% dari total bobot molekul) dapat dilakukan dengan pendekatan yang sama untuk pencirian protein nonglikosilasi. Bagaimanapun, tingginya kandungan karbohidrat akan mempersulit pencirian karena adanya polidispersitas, banyaknya
3
bentuk asimetris, adanya interaksi molekular, dan tingginya muatan bobot jenis. Protein murni bersifat monodispersitas dan memiliki bobot molekul yang tetap (Beeley 1985). Gugus gula dari glikoprotein dapat dipisahkan secara enzimatik maupun kimia. Enzim untuk melakukan depolimerisasi polisakarida sudah banyak tersedia di pasaran. Produk hasil dari pemotongan enzim bukan merupakan 1 tipe dari pengulangan unit karena adanya ragam dalam lokasi dan jumlah sulfasi yang berpengaruh pada aktivitas enzim. Fragmentasi poli- atau oligosakarida secara kimia memiliki keuntungan dan juga kerugian bila dibandingkan dengan fragmentasi enzim. Spesifisitas pemotongan secara kimia tidak setinggi enzim, tetapi ada beberapa yang mendekati (Rassi 2002). Untuk memotong ikatan oligosakarida terhubung-N dan -O secara kimia paling baik dengan metode hidrazinolisis atau dalam kondisi alkali (Hounsell 1993). Setiap unit karbohidrat pada glikoprotein satu residu gula terikat secara glikosidasi dengan rantai samping asam amino. Nglikosida terikat melalui gugus amida pada residu asparagina sedangkan ikatan Oglikosida terikat melalui gugus hidroksil dari serina, treonina, hidroksilisina, atau hidroksiprolina (Beeley 1985). IMAC Histidin-Tagged Fusi Protein Kromatografi afinitas ion logam terimobilisasi (IMAC) merupakan teknik purifikasi protein yang relatif baru yang memanfaatkan hubungan spesifik antara sisi rantai asam amino, terutama dengan borderline Lewis dari ion logam (seperti Cu2+, Ni2+, dan Zn2+), dan histidina sebagai asam amino yang selama ini paling banyak dimanfaatkan dalam ikatan tersebut. Imobilisasi ion logam dicapai melalui zat pengkelat yang ditempelkan ke dalam pendukung stasioner. Zat pengkelat yang paling banyak digunakan untuk aplikasi ini, yaitu asam iminodiasetat (IDA) dan asam nitrilotriasetat (NTA). Ikatan histidina dari sisi rantai asam amino ke dalam IMAC dengan cara menyumbangkan elektron dari gugus imidazol yang terdapat dalam struktur histidina kepada 2 atau 3 tapak koordinasi yang tersedia dari ion logam. Aplikasi terbaru dari IMAC yang dibuat ialah menggunakan permukaan histidina yang secara alami terbentuk dalam proses translasi protein. Konsep yang digunakan ialah memasukkan atau ‘tag’ heksahistidin (6xHis)
pada protein target. IMAC dengan penanda His telah secara luas digunakan dalam teknologi ekspresi dan purifikasi protein rekombinan. Secara komersial vektor yang memiliki penanda His fusi protein telah banyak tersedia. Jumlah His yang sedikit dimaksudkan agar tidak mengganggu tapak aktif protein target pada fungsi hayati. Dengan penjelasan dari berbagai pustaka, IMAC merupakan teknik purifikasi terpopuler dalam purifikasi protein rekombinan dari mulai skala penapisan proteomik sampai skala produksi biofarmasetikal (Charlton & Zachariou 2008).
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah supernatan hasil fermentasi transforman P. pastoris galur X-33 yang mengandung gen hEPO, larutan 8X bufer fosfat pH 7.4 (Lampiran 1), 2M imidazol, membran nitroselulosa (Hybond), matriks Sephadex LH-20 (GE healthcare), poliakrilamida 40%, SDS 10 %, TEMED, 10% amonium persulfat, bufer AP (alkaline phosphatase) pH 7.5 (Lampiran 1), antibodi primer EPO (Calbiochem), antibodi sekunder (anti-rabbit phosphate conjugate), NBT, BCIP (Promega), EPO rekombinan dari sel mamalia (sel CHO) (Merck), enzim Nglikosidase F (Roche), O-glikosidase (Roche), 200 mM bufer natrium fosfat, serta larutan standar manosa dan xilosa. Alat yang digunakan adalah kolom Histrap (GE Healthcare), kolom kromatografi diameter 16 mm; tinggi 20 cm (GE Healthcare), perangkat KCKT Hitachi L-2000 autosampler, kolom Purospher® STAR NH2(Merck), detektor RI Hitachi L-2490, filter kolom vivaspin cut off 10 kDa (GE Healthcare), alat elektoforesis gel poliakrilamida 1 dimensi, dan filter 0.2 mikron. Metode Penelitian ini terdiri atas 3 tahap. Tahap pertama adalah purifikasi supernatan hasil fermentasi transforman P. pastoris X-33 yang mengandung gen hEPO menggunakan metode Histrap yang dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel. Tahap kedua adalah memotong gugus gula yang melekat pada glikoprotein EPO rekombinan dengan N-glikosidase F dan O-glikosidase. Tahap ketiga adalah hidrolisis asam dari glikoprotein EPO rekombinan dan
4
mencirikan gugus gula dengan KCKT lalu dibandingkan dengan kontrol. Purifikasi dengan Histrap Isolasi EPO rekombinan menggunakan kromatografi kolom afinitas dengan matriks agen pengkelat nikel. Purifikasi dilakukan dengan menggunakan kolom histrap. Pada proses ini, matriks yang terdapat pada kolom disetimbangkan dalam bufer binding (bufer fosfat pH 7.4) yang mengandung 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl, dan 20 mM imidazol. Sampel supernatan yang mengandung eritropoietin rekombinan hasil ekspresi pada P. pastosris galur X-33 (20 ml) diaplikasikan pada kolom yang telah diekuilibrasi. Selanjutnya kolom dicuci dengan menggunakan bufer binding. Elusi dilakukan dengan bufer elusi yang mengandung 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl dan 500 mM imidazol. Hasil elusi difraksionasi masing-masing 1 ml dan ditampung dalam tabung polipropilena 1.5 ml (GE Healthcare 2009). Selanjutnya analisis blot Western dilakukan untuk mencari fraksi yang mengandung EPO rekombinan paling tinggi. Purifikasi Eluat Hasil Histrap dengan Kromatografi Filtrasi Gel Sephadex LH-20 Eluat hasil histrap yang mengandung EPO rekombinan diaplikasikan ke dalam kolom Sephadex LH-20 dengan volume 40 ml untuk mendapatkan protein yang lebih murni dan menghilangkan imidazol yang terdapat dalam eluat hasil histrap. Kolom Sephadex LH-20 yang telah dipak diekuilibrasi dengan bufer fosfat yang mengandung 50 mM natrium fosfat pH 6.7 dengan 125 mM NaCl sebanyak 80 ml. Kemudian sebanyak 4 ml eluat hasil histrap diaplikasikan kedalam kolom dan dilanjutkan dengan elusi sebanyak 60 ml bufer fosfat dengan laju air 1 ml/menit. Hasil elusi difraksionasi masing-masing 1 ml dan ditampung dalam tabung propilena 1.5 ml. Pencirian Gugus Gula dari EPO Rekombinan dengan Enzim N- dan Oglikosidase EPO rekombinan murni akan dicirikan gugus gulanya dengan menggunakan enzim N- dan O-glikosidase. Sebanyak 5 µl EPO rekombinan dimasukkan ke dalam tabung propilena 0.6 ml. Kemudian ditambahkan 1.25 µl 200 mM bufer natrium fosfat pH 7.2, masing-masing 2 unit enzim N- dan Oglikosidase dan ditambahkan air suling sampai volume 12.5 µl. Campuran reaksi diinkubasi
dalam penangas air dengan suhu 37 ºC selama 120 menit. Dilakukan juga reaksi seperti sebelumya tanpa salah 1 enzim (N- atau Oglikosidase saja) (Higuchi et al. 1992). Sebagai kontrol positif, dilakukan juga perlakuan yang sama dengan sampel protein EPO rekombinan dari sel mamalia (Merck). Selanjutnya analisis blot Western dilakukan untuk mengetahui bobot molekul setelah pemotongan gugus gula secara enzimatik. Analisis Elektroforesis Gel Poliakrilamida Natrium Dodesil Sulfat (SDS PAGE) dengan Pewarnaan Perak Sampel protein yang akan dianalisis dengan metode SDS PAGE menggunakan konsentrasi poliakrilamida 12% (Lampiran 1). 15 µl sampel protein, 2 µl EPO rekombinan dari sel CHO dan 5 µl marka protein ditambahkan 15 µl bufer sampel (Lampiran 1) lalu masing-masing dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel. Elektroforesis dilakukan dalam bufer running dengan tegangan 90 V selama 120 menit. Gel hasil elektroforesis divisualisasi dengan menggunakan metode pewarnaan perak (Lampiran 1). Analisis Blot Western Sampel yang akan dianalisis dengan blot Western, terlebih dahulu dielektroforesis menggunakan metode SDS PAGE. Gel hasil elektroforesis ditransfer ke dalam membran nitroselulosa yang sebelumya telah dibasahi bufer elektrotransfer. Gel ditempatkan dalam sisi katode yang sebelumnya dilapisi kertas saring dan busa kemudian membran nitroselulosa diletakkan di atasnya dalam posisi sejajar. Dipastikan tidak terdapat gelembung. Membran ditutup dengan kertas saring dan busa (membran nitroselulosa berada di sisi anode). Sandwich yang terbentuk dimasukkan ke dalam tangki electroblotting. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan tegangan konstan 90 Volt selama 90 menit dalam kondisi dingin (balok es ditempatkan di dalam tangki dan di luar tangki). Membran yang sudah ditransfer direndam dan digoyang dalam larutan blocking (Lampiran 1) selama 60 menit. Kemudian membran dicuci dengan larutan pencuci (Lampiran 1) sebanyak 3 kali (15 menit; 5 menit; 5 menit). Selanjutnya membran direndam dan digoyang dalam antibodi primer (Ab-EPO) yang dimasukkan ke dalam larutan blocking dengan nisbah 1:500 selama 60 menit dan dicuci seperti sebelumya. Setelah itu, membran direndam
5
dan digoyang dalam antibodi sekunder yang dimasukkan ke dalam larutan blocking dengan nisbah 1:3000 selama 60 menit yang dilanjutkan dengan pencucian seperti sebelumnya. Pita protein divisualisasi dengan merendam membran dalam reagen NBT-BCIP yang dimasukkan ke dalam larutan bufer AP pH 7.5 dengan nisbah 2:1:300 (Ausubel et al. 1992). Analisis Oligosakarida dengan KCKT Sebanyak 0.5 mL EPO rekombinan hasil ekspresi pada P. pastoris galur X-33 hasil purifikasi yang telah dipekatkan dengan filter kolom vivaspin cut off 10 kDa ditambahkan 25 unit N-glikosidase, 7.5 unit O-glikosidase dan 50 µl bufer natrium fosfat 200 mM pH 7.2 diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Setelah itu ditambahkan 80% aseton dan diendapkan pada suhu -20 ºC. Oligosakarida yang telah terpisah dari protein dilarutkan kembali dengan larutan dingin 60% metanol (Verostek et al. 2000 dalam Mort & Pierce 2002). Setelah disentrifugasi, pelarut dihilangkan dengan cara dikeringanginkan untuk mendapatkan oligosakarida murni. Untuk mendapatkan monosakarida, oligosakarida murni dihidrolisis asam dengan cara diinkubasi dalam HCl 4 N pada suhu 100 ºC selama 6 jam dalam keadaan vakum (oksigen dihilangkan dengan cara dialirkan gas nitrogen lalu tabung ditutup rapat). Sampel yang telah dinetralkan siap dimasukkan ke dalam kolom KCKT. Sebanyak 10 µl sampel dengan pengenceran 30× dan masing-masing 10 µl larutan standar manosa 259 ppm dan xilosa 525.5 ppm diaplikasikan pada kolom KCKT dengan laju alir 0.6 ml/menit dan suhu detektor 40 ºC. Hasil pemisahan sampel dibandingkan dengan standar.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kemurnian EPO Rekombinan Hasil purifikasi supernatan P. pastoris galur X-33 yang mengandung EPO dengan metode Histrap menunjukkan dua fraksi yang mengandung EPO rekombinan dengan konsentrasi tinggi, yaitu terdapat pada fraksi 1 (Lajur 3) dan 2 (Lajur 4). Untuk fraksi 3 (Lajur 5) didapatkan pita tipis yang menandakan di dalam fraksi tersebut hanya mengandung sedikit protein EPO. Hal tersebut dapat dilihat dari hasil analisis blot Western seperti terlihat pada Gambar 2. Lajur 1 adalah standar EPO berupa EPO rekombinan yang
dihasilkan dari sel mamalia (sel CHO). Lajur 2 berupa marka protein yang sudah diketahui bobot molekulnya. Pita protein EPO rekombinan hasil purifikasi memiliki ukuran yang sama dengan standar EPO rekombinan, yaitu sekitar 37 kDa.
kDa 117
1
2
3
4
5
87 49 37 34 25 19 Gambar 2 Hasil analisis blot Western EPO rekombinan yang telah dipurifikasi pada kolom Histrap. Lajur 1: standar EPO rekombinan dari sel mamalia, Lajur 2: marka protein, Lajur 3: EPO rekombinan dari P. pastoris galur X-33 pada fraksi 1, Lajur 4 pada fraksi 2, Lajur 5 pada fraksi 3. Untuk mendapatkan protein yang lebih murni dan untuk menghilangkan sisa imidazol yang terdapat dalam eluat hasil histrap digunakan metode kromatografi kolom filtrasi gel dengan menggunakan matriks Sephadex LH-20 dengan volume 40 mL. Data hasil fraksionasi kromatografi kolom filtrasi gel Sephadex LH-20 ditunjukkan oleh Gambar 3. Adanya beberapa fraksi yang memiliki absorbans yang tinggi pada panjang gelombang 280 nm yang berarti dalam eluat protein hasil purifikasi dengan metode histrap masih berupa campuran protein dan metode ini diperlukan untuk mendapatkan protein murni.
6
kDa 117 87
4
0,08
1
0,07
3
0,06
1
2
A 280 nm
0,05 0,04
45
2
0,03 0,02
37 34
0,01 0 0
10
20
30
40
50
60
70
-0,01
25
mL elusi
Gambar 3 Fraksionasi eluat hasil histrap dengan mengunakan kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex LH-20 volume 40 mL. Terdapat 4 fraksi protein yang terukur pada absorbans 280 nm. Untuk mengetahui fraksi mana yang mengandung EPO rekombinan maka dilakukan analisis dengan menggunakan blot Western dan hasilnya ditunjukkan oleh Gambar 4.
1
2
3
4
Gambar 4 Analisis western blot protein hasil fraksionasi dengan kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex LH-20. Lajur 1 fraksi 4; Lajur 2 fraksi 3; Lajur 3 fraksi 2; Lajur 4 fraksi 1. EPO rekombinan terdapat dalam fraksi 1 dan 2 terlihat dengan adanya pita protein pada Lajur 3 dan 4. Untuk mengetahui kemurnian protein hasil purifikasi dengan metode histrap dan kromatografi filtrasi gel dilakukan analisis SDS PAGE dan divisualisasi dengan pewarnaan perak seperti yang ditunjukkan oleh Gambar 5.
19
Gambar 5 Pewarnaan dengan perak hasil purifikasi dengan histrap dan kromatografi filtrasi gel. Lajur 1: protein hasil purifikasi dengan kolom histrap dan kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex LH-20; Lajur 2: protein hasil purifikasi hanya dengan kolom histrap. Kandungan Gugus Gula dari EPO Rekombinan Untuk mengetahui adanya gugus gula pada protein EPO yang menunjukkan bahwa EPO merupakan glikoprotein telah dilakukan pemotongan gugus gula glikoprotein secara enzimatis dengan menggunakan N- dan Oglikosidase dan hasilnya disajikan dalam Gambar 6. Glikosilasi terhubung-N terlihat sangat dominan dalam kontribusinya terhadap bobot molekul dari EPO rekombinan. Sebaliknya pengaruh glikosilasi terhubung-O terhadap bobot molekul EPO rekombian hampir sama sekali tidak signifikan. Pada lajur 1 dan 2 Gambar 6 (EPO rekombinan P. pastoris galur X-33) dan lajur 8 dan 9 (EPO rekombinan sel CHO) terlihat bahwa pemotongan dengan enzim O-glikosidase seperti tidak memiliki perbedaan bobot molekul. Sementara itu lajur 3 (EPO rekombinan P. pastoris) dan lajur 7 (EPO rekombinan sel CHO) menunjukkan dengan jelas bahwa pemotongan dengan enzim Nglikosidase menurunkan bobot molekul EPO sebesar 40% (dari sekitar 37 kDa menjadi 22 kDa). Dengan demikian, molekul yang sama seperti pada pemotongan hanya dengan enzim N-glikosidase, seperti terlihat pada lajur 4 (EPO rekombinan P. pastoris) dan lajur 6 (EPO rekombinan sel CHO). Adanya perbedaan bobot molekul antara EPO rekombinan hasil ekspresi pada P. pastoris dan EPO rekombinan dari sel CHO pada pemotongan dengan kedua enzim N- dan Oglikosidase disebabkan oleh sistem ekspresi
7
pada P. pastoris yang digunakan dalam penelitian ini memiliki tambahan rantai asam amino pada vektor ekspresi (pPICZαB) untuk keperluan purifikasi, yaitu adanya cymic epitope dan 6X histidina (Santoso 2008) sehingga bobot molekulnya lebih besar dibandingkan EPO rekombinan hasil ekspresi pada sel CHO. kDa
1 2
3
4
5 6 7
8 9
117 85 49 37 34 25 19
Gambar 6 Pencirian gugus gula glikoprotein. Lajur 1 EPO P. pastoris, Lajur 2 EPO P. pastoris dipotong dengan enzim Oglikosidase, Lajur 3 EPO P. pastoris diipotong dengan enzim N-glikosidase, Lajur 4 EPO P. pastoris dipotong dengan enzim N- dan Oglikosidase, Lajur 5 Marka protein, Lajur 6 EPO sel CHO dipotong dengan enzim N- dan O-glikosidase. Lajur 7 EPO sel CHO dipotong dengan enzim N-glikosidase, Lajur 8 EPO sel CHO dipotong dengan enzim O-glikosidase, Lajur 9 EPO sel CHO.
Kandungan Monosakarida Gugus Gula EPO Rekombinan Untuk mengetahui komposisi monosakarida yang terkandung dalam gugus oligosakarida dari N- dan O-glikan yang telah diisolasi dari glikoprotein telah dilakukan hidrolisis asam dengan menggunakan HCl 4N. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan instrumen KCKT dengan menggunakan sistem fase normal dengan pemisahan dilakukan pada kolom Purospher® STAR NH2 yang bersifat polar dan asetonitril:air (75:25) sebagai fase gerak. Detektor yang digunakan ialah indeks refraksi (RI) karena gugus monosakarida hanya memiliki sedikit gugus kromofor yang dapat dideteksi oleh sinar UV
pada panjang gelombang 180−220 nm. Dari hasil analisis dengan KCKT disajikan pada Tabel 1 dan kromatogram dapat dilihat pada Gambar 7, 8, dan 9 dalam Lampiran 2. Tabel 1 Analisis monosakarida dengan metode KCKT Nama Waktu Luas Area Retensi (menit) Standar xilosa 7.023 165 977 252.5 ppm Standar manosa 8.273 225 805 259 ppm Sampel pengenceran 30× 6.630 82 713 Puncak 1 9.227 422 988 Puncak 2 10.187 2 966 770 Puncak 3 Dalam analisis senyawa dengan KCKT, data waktu retensi menunjukkan keunikan suatu senyawa, sehingga masing-masing memiliki nilai yang berbeda. Dari data yang dihasilkan, kompoen dalam sampel tidak ada yang memiliki nilai waktu retensi yang sama dengan standar yang digunakan, sehingga belum dapat diambil kesimpulan. Data luas area merupakan kuantitas dari senyawa yang dianalisis. Pada komponen sampel hanya puncak 3 yang terukur sangat tinggi, berarti kemungkinan merupakan komponen utama dari sampel. Sebagai perbandingan, data disertasi SjÖblom (2008) mengenai ekspresi protein dan vaksin rekombinan hasil ekspresi pada P. pastoris serta Hamilton et al. (2006) menyatakan monosakarida yang akan terkandung dalam struktur glikan dari glikoprotein hasil ekspresi pada P. pastoris untuk galur tipe liar berupa manosa dan Nasetil glukosamina, serta dari hasil penelitian yang dilakukan Higuchi et al. (1991) mengenai kandungan monosakarida dari struktur glikan EPO rekombinan hasil ekspresi pada sel mamalia menyatakan bahwa monosakarida yang terkandung berupa manosa, fukosa, galaktosa, Nasetilgalaktosamina, N-asetilglukosamina, dan asam sialat. Kakehi dan Honda (1993) menyatakan hanya gula amina seperti golongan glukosamina dan galaktosamina yang akan terhidrolisis dengan HCl 4 N dalam kondisi atmosfer nitrogen, sedangkan untuk gula netral seperti galaktosa, fukosa, dan manosa mudah terdegradasi apabila
8
menggunakan HCl 4 N. Untuk hidrolisis asam sialat diperlukan kondisi asam yang lebih ringan seperti asam sulfat atau asam asetat dan pada suhu lebih rendah, karena asam sialat sangat labil terhadap asam. Dari data yang dihasilkan belum dapat diambil kesimpulan jenis gula apa saja yang membentuk struktur glikan dari EPO rekombinan hasil ekspresi pada P. patoris galur X-33. Namun apabila merujuk pada penelitian sebelumnya yang telah disebutkan di atas, maka kemungkinan puncak yang paling tinggi hasil pemisahan dengan KCKT merupakan gula amina, yaitu N-asetil glukosamina sedangkan manosa tidak terdeteksi kemungkinan karena terdestruksi pada saat hidrolisis dengan HCl 4 N. Dan untuk membuktikan hal tersebut diperlukan penelitian selanjutnya.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Dari hasil purifikasi EPO rekombinan dari supernatan transforman P. pastoris X-33 yang mengandung gen EPO dengan menggunakan metode histrap belum dapat dihasilkan protein murni sehingga metode kromatografi filtrasi gel diperlukan dalam tahap purifikasi selanjutnya. Hasil pemotongan dengan enzim N- dan O-glikosidase diketahui bahwa EPO rekombinan hasil ekspresi pada sel mamalia dan EPO rekombinan hasil ekspresi pada P. pastoris X-33 memiliki kandungan glikan atau gugus gula yang sama, yaitu sekitar 40% dari total bobot molekul protein. Hasil hidrolisis glikan atau gugus gula hasil isolasi dari EPO rekombinan dengan HCl 4 N selama 6 jam pada suhu 100 ºC dengan metode KCKT belum dapat diambil kesimpulan jenis monosakarida apa saja yang terkandung di dalamnya. Saran Perlu dilakukan penggunaan jenis asam selain HCl 4 N dan berbagai kondisi reaksi yang lain dalam proses hidrolisis gugus gula dari glikoprotein untuk mengetahui kandungan monosakarida dari glikoprotein. Hal tersebut merupakan salah satu syarat layaknya rekombinan protein dapat digunakan sebagai obat terapi.
DAFTAR PUSTAKA Ashley RA et al. 2002. Erythropoietin stimulates vasculogenesis in neonatal rat mesenteric microvascular endothelial cells. Pediatric Research 51:472-478. Ausubel FM et al. 1992. Short Protocols in Molecular Biology. Ed ke-2. New York: J Wiley. Beeley GJ. 1985. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Volume ke-16. Burdon RH, Knippenber PH van, editor. New York: Elsevier. Cregg MJ, Vedvick TS, Raschke W. 1993. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Bio/Technology 11:905-910. Cregg MJ. 2007. Distinctions between Pichia pastoris and Other Expression Systems. Di dalam: Cregg MJ, editor. Methods in Molecular Biology: Pichia protocols. Volume ke-389. Ed ke-2. Totowa: Humana. Charlton A, Zachariou M. 2008. Immobilezed metal ion affinity chromatography of histidine-tagged fusion proteins. Di dalam: Zachariou M, editor. Methods in Molecular Biology, Affinity Chromatography: Methods and Protocols. Volume ke-421. Ed ke-2. Totowa: Humana. Egrie J. 1999. The cloning and production of recombinant human erythropoietin. Pharmacotherapy 10:3s-8s. Fernandez JM, Hoeffer JP. 1999. Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression. San Diego: Academic. Fukuda MN, Sasaki H, Lopez L, Fukuda M. 1989. Survival of recombinant erythropoietin in the circulation: The role of carbohydrates. Blood 73:84-89. [GE
Healthcare] 2009. His trap kit. http://www.gelifesciences.co.jp/tech_sup port/manual/ pdf/71502043.pdf. [21 April 2009]
9
[Glythera] 2009. The protein biotherapeutics market. http://www.glythera.com/proteinbiotherapeutics-market.htm. [21 April 2009] Hamilton SR et al. 2006. Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins. Science 313:1441-1443. Higuchi M et al. 1992. Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin. Journal of Biological Chemistry 267(11):7703-7709. Hounsell EF. 1993. A general strategy for glycoprotein oligosaccharide analysis. Di dalam: Hounsell EF, editor. Methods in Molecular Biology, Glycoprotein Analysis in Biomedicine. Volume ke-14. Totowa: Humana. [Invitrogen] 2009. Pichia pastoris expression. http://www.invitrogen.com/ site/ us/ en/ home/Products-and Services/ Services/ DiscoveryResearch/ CustomProteinsfor ResearchandDiscovery/ProteinProduction /Pichia-Pastoris.html. [21 April 2009] Jacobs K et al. 1985. Isolation and characterization of genomic and cDNA clones of human erythropoietin. Nature 313:806-810. Kakehi K, Honda S. 1993. Analysis of carbohydrates in glycoproteins by highperformance liquid chromatoraphy and high-performance capillary electrophoresis. Di dalam: Hounsell EF, editor. Methods in Molecular Biology: Glycoprotein Analysis in Biomedicine. Volume ke-14. Totowa: Humana. Lin-Cereghino J, Lin-Cereghino PG. 2007. Vectors and strain for expression. Di dalam: Cregg MJ, editor. Methods in Molecular Biology: Pichia protocols. Volume ke-389. Ed ke-2. Totowa: Humana. Lin FK et al. 1985. Cloning and expression of the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA 82:7580-7584. Magnus SjÖblom. 2008. Pichia pastoris as a platform for the production of therapeutic glycoproteins. 2008: 27׀ISSN: 14021757׀ISRN: LTU-LIC--08/27--SE.
Mort AJ, Pierce ML. 2002. Preparation of carbohydrate for analysis by modern chromatography and electrophoresis. Di dalam: Rassi El Z, editor. Journal of Chromatography Library: Carbohydrate Analysis by Modern Chromatography and Electhrophoresis. Volume ke-66. New York: Elsevier. [Mycobank] 2009. Pichia pastoris (Guillierm). Phaff 1956. http://www.mycobank.org/ Myco Taxo.aspx?Link=T&Rec=303634. [21 April 2009] Park JH et al. 2000. Efficiency of promoter and cell line in high-level expression of erythropoietin. Biotechnol Appl Biochem 32:162-172. Rassi El Z 2002. Reversed-phase and hydrophobic interaction chromatography of carbohydrates and glycoconjugate. Di dalam: Rassi El Z, editor. Journal of Chromatography Library: Carbohydrate Analysis by Modern Chromatography and Electhrophoresis. Volume ke-66. New York: Elsevier. Santoso A et al. 2008. Heterologous expression and production of recombinant human erythropoietin in Pichia pastoris. Di dalam: Ermayanti TM, editor. The 4th Indonesian Biotechnology Conference “Biotechnology for better food, health and environment”, Bogor, 5-7 Aug 2008. Indonesian Biotechnology Consortium, hlm 203-209. Skoko N et al. 2003. Ekspression and characterization of human interferon-βI in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechnol Appl Biochem 38:257-265. Sytkowsky AJ. 2004. Erythropoietin: Blood, Brain and Beyond. Weinheim: J WileyVCH. Sorisio E, StrØm S. 2006. Inovation and market dynamic in the EPO market. Oslo: Hero. Yin
H, Blanchard KL. 2000. DNA methylation represses the expression of the human erythropoietin gene by two different mechanisms. Blood 95(1):111119.
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Reagen yang digunakan dalam SDS-PAGE, western blot, dan pewarnaan perak Komposisi gel separating 12% Komponen 40% akril-bisakril Tris-HCl 1 M pH 8.8 Air suling 10% SDS TEMED APS 10%
Volume 4 ml 2.5 ml 3.5 ml 0.1 ml 0.006 ml 0.1 ml
Komposisi gel steking 3% Komponen 40% akril-bisakril 1M Tris-HCl pH 6.8 Air suling 10% SDS TEMED APS 10%
Volume 1.3 ml 1.3 ml 7 ml 0.1 ml 0.012 ml 0.1 ml
Gel separating dibuat dengan mencampur semua bahan terlebih dahulu, APS dan TEMED ditambahkan paling akhir secra berurutan. Setelah semua bahan tercampur larutan tersebut dituang ke dalam lempeng pembuat gel, ditambhakan air suling hingga lempeng penuh dan ditunggu hinga gel memadat (sekitar 30 menit). Air suling diserap denga tisu, dan larutan gel steking dituang di atas gel separating yang telah memadat, sisir pembentuk sumuran segera di pasang. Penjejak warna mencapai 0,5 cm di atas dasar gel. Komposisi bufer running Komponen Tris Glisina SDS Air suling
Jumlah 3.03 g 14.4 g 1.0 g Sampai 1 liter
Komposisi bufer transfer Komponen Tris Glisina Metanol absolut Air suling
Jumlah 3.03 g 14.4 g 200 ml Sampai 1 liter
Komposisi larutan blocking Komponen Susu bebas lemak Bufer Tris salin
Jumlah 10 g 100 ml
12
Komposisi larutan pencuci Komponen Tween 20 Bufer Tris salin (TBS)
Volume 0,1 ml 100 ml
Komposisi TBS Komponen Tris NaCl Air suling HCl pekat
Jumlah 8.70 g 1.21 g Sampai 1 liter Hingga pH 7.6
Komposisi larutan fixing Komponen Etanol absolut Asam asetat glasial Air suling
Jumlah 37.5 ml 12.5 ml Sampai 125 ml
Komposisi larutan sensitizing Komponen Etanol absolut Natrium tiosulfat 5% Natrium asetat Air suling Glutardialdehid 25%
37.5 ml 5 ml 8.5 g Sampai 125 ml 0.625 ml saat akan digunakan
Komposisi larutan perak Komponen Perak Nitrat 2.5% Air suling Formaldehida 37%
Jumlah 12.5 ml Sampai 125 ml 0.05 ml saat akan digunakan
Komposisi larutan developing Komponen Natrium karbonat Air suling Formaldehida 37%
Jumlah
Jumlah 3.125 g Sampai 125 ml 0.1 ml saat akan digunakan
Komposisi larutan stop Komponen Na-EDTA·2H2O Air suling
Jumlah 1.825 g Sampai 125 ml
Tahapan visualisasi gel dengan pewarnaan perak: Sampel protein yang telah dipisahkan dengan metode SDS-PAGE, disimpan dalam wadah yang diisi larutan fixing, biarkan selama 1 jam sambil digoyang. Larutan dibuang dan diganti dengan larutan sensitizing, biarkan selama 1 jam sambil digoyang. Larutan dibuang dan dilakukan pencucian dengan air suling 4×15 menit sambil digoyang. Ganti air suling dengan larutan perak, biarkan selama 1 jam sambil digoyang. Lalu dilakukan pencucian kembali dengan air suling 2×1 menit. Ganti air suling dengan larutan developing, biarkan selama 4−6 menit sampai pita-pita protein berwarna perak muncul. Apabila telah cukup terwarnai ganti larutan dengan larutan stop. Gel siap diamati.
0
0.0 2.5 2
5.0
4
4
7.5 10.0
uRIU
xilosa 7.023
0
6 8
6
12.5
10
8
15.0
12
4
2
10 12
10
17.5 20.0 22.5
uRIU
9.593
4.663
4
2 2
0.190 0.760 1.073
uRIU
4
5 uRIU
9.707
2
manosa 8.273
2
15.263 15.430 15.600 16.080 16.243 16.320 16.567 16.650 16.733 17.217 17.293 17.843 18.187 18.263 18.493 18.813 19.063 19.150 19.300 19.717 19.873 19.953 20.110 20.267 20.447 20.760 21.407 21.577 22.227 22.773 22.937 23.030 23.347 23.983 24.143 24.320 24.620 24.780
0
4.677
-2
10.187
5
6.630 (xilosa) 7.937 8.103 manosa (glukosa)8.283 9.227
0
2.640
1.957
uRIU
0
4.647
0.177 0.480 0.647 0.807 0.873 1.037 1.120 1.200 1.283 1.510 1.603 1.753 1.840 2.167 2.407 2.480 2.650 2.807 3.060 3.127 3.287 3.607 3.850 3.933
uRIU
13
Lampiran 2 Kromatogram hasil analisis monosakarida dengan KCKT
0
-2
Minutes
14
Gambar 7 Hasil KCKT standar xilosa 252.5 ppm dengan tR 7.023 menit
4
14 0
Minutes
Gambar 8 Hasil KCKT standar manosa 259 ppm dengan tR 8.273 menit.
10
0
Minutes
25.0
Gambar 9 Hasil pemisahan sampel gula dengan menggunakan KCKT pengenceran 30. Terdapat 3 puncak tinggi dengan tR 6.630 menit, 9.227 menit, dan 10.187 menit.
