ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 STRATEGI KLONING DAN EKSPRESI GEN var2csa PADA SISTEM Escherichia coli SEBAGAI LANGKAH PENDAHULUAN UNTUK EKSPRESI GEN PADA SISTEM EUKARIOT TANAMAN Cloning and Expression Strategy of var2csa Gene in Escherichia coli System as Initial Step for Gene Expression in Plant Eukaryotic System Oleh: Sapto Nugroho Hadi1 dan Rintis Noviyanti2 1 Program Studi Agroteknologi, Fakultas Pertanian Unsoed, Jl. Dr. Soeparno Purwokerto 2 Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jl. Diponegoro 69 Jakarta Alamat korespondensi: Sapto Nugroho Hadi (
[email protected]) ABSTRAK Penelitian ini bertujuan mengetahui apakah strategi yang digunakan dapat berhasil mengkloning dan mengekspresikan sekuen DNA target (daerah DBL3x gen var2csa) pada inang E.coli. Strategi kloning dilakukan melalui tahapan: perbanyakan sekuen DNA target melalui teknik PCR menggunakan primer yang didesain sendiri, peligasian sekuen DNA target pada vektor kloning pCR2.1-TOPO, dan memperbanyaknya pada inang E.coli TOP10. Strategi ekspresi dilakukan melalui tahapan: perbanyakan sekuen DNA target melalui teknik PCR menggunakan primer yang mengandung situs pengenalan enzim restriksi endonuklease tipe II: NcoI dan XhoI, pemotongan dengan enzim NcoI dan XhoI, peligasian pada vektor ekspresi pET-28a (+), dan pengekspresian pada inang E. coli BL21 (DE3) dengan induser isopropyl-1-thio-ß-D-galactoside (IPTG) 1 mM. Strategi kloning berhasil mendapatkan sekuen daerah DBL3x gen var2csa berukuran 948 pb. Strategi ekspresi berhasil mendapatkan protein DBL3x berukuran 38 kDa. Kata kunci: kloning, ekspresi, DBL3x, var2csa, Escherichia coli
ABSTRACT The objective of this study is to see are the strategies approach that used successfully clone and express DBL3x region of var2csa gene in E.coli host. The cloning strategies are amplifying DNA target through PCR technique using self design oligonucleotide primer, inserting into cloning vector pCR2.1-TOPO, copying in E.coli TOP10 host. The expression strategies are amplifying DNA target through PCR using self design primer with specific site for restriction enzyme NcoI and XhoI, digesting with NcoI and XhoI, inserting into pET-28a (+) expression vector, and expressing in E. coli BL21 (DE3) host by adding isopropyl-1-thio-ß-D-galactoside (IPTG) 1 mM as a inducer. This study successfully cloned DBL3x region of var2csa gene with 948 pb in size and successfully expressed protein DBL3x with 38 kDa in size in E.coli system. Keywords: cloning, expression, DBL3x, var2csa, Escherichia coli
gen yang bersumber dari sel prokariot
PENDAHULUAN Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri
banyak
(Nausch et.al., 2013; Peng et al., 2013).
dimanfaatkan untuk berbagai kepentingan.
Umumnya sel E.coli digunakan digunakan
Salah
penggunaannya
sebagai inang (host) pendahuluan sebelum
sebagai tempat diproduksinya protein asing
ekspresi lebih lanjut protein heterologous
(heterologous) (Kuchenreuther et al., 2010;
pada inang yang lebih kompleks, misalnya
Natarajan et al., 2011). Protein asing yang
sel eukariot tanaman. Ekspresi protein
diproduksi pada E.coli dapat berasal dari
heterologous pada inang eukariot dipilih
52
gram
satunya
negatif
adalah
yang
(Šnajder et al., 2015) ataupun sel eukariot
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 pada tahap lanjutan karena kelebihannya
heterologous pada skala praktek menjadi
dibanding
inang
prokariot,
yaitu
berkurang atau bahkan gagal (Rosano &
keberadaan
sistem
modifikasi
pasca
Eduardo, 2014). Pada penelitian ini gen
translasi protein yang dimiliki sehingga
var2csa bersumber dari protozoa (sel
protein heterologous yang dihasilkannya
eukariot) diklon dan diekspresikan pada
dapat berbentuk seperti aslinya, baik
inang
struktur
secara
diekspresikan pada inang sel eukariot.
biologi (Badosa et.al., 2013). Ekspresi
Strategi yang digunakan dalam penelitian
tingkat lanjut pada inang eukariot memiliki
ini terbagi menjadi dua, yaitu strategi
tingkat kerumitan yang tinggi (Ivashuta et
kloning dan strategi ekspresi. Strategi
al., 2011), oleh karena itu sel prokariot
kloning dilakukan dengan pengisolasian
seperti bakteri E.coli dipilih sebagai inang
DNA protozoa, perbanyakan sekuen DNA
pendahuluan.
target menggunakan teknik Polymerase
maupun
Bakteri
keaktifannya
E.coli
dijadikan
sel
prokariot
E.coli
sebelum
pilihan
Chain Reaction (PCR) dengan primer yang
pertama dan utama untuk kloning dan
didesain sendiri, ligasi pada vektor kloning,
ekspresi pendahuluan gen heterologous
perbanyakan pada inang E.coli, dan seleksi
dikarenakan
E.coli yang sudah mengandung sekuen
beberapa
kelebihan
yang
dimilikinya. Bakteri E.coli mudah dan cepat
DNA
target
menggunakan
ditumbuhkan, biaya relatif tidak mahal,
penanda
mudah ditoleransi oleh sebagian besar
dilakukan dengan perbanyakan sekuen
protein asing, memiliki tingkat ekspresi
DNA target melalui PCR dengan primer
yang tinggi (Sambrook & Russel, 2001),
yang didesain sendiri sehingga memiliki
dan secara genetik sudah dikarakterisasi
daerah pemutusan enzim restriksi, ligasi
dengan baik (Baneyx, 1999).
pada vektor ekspresi, perbanyakan, seleksi,
molekuler.
beberapa
Strategi
ekspresi
Meskipun inang E.coli memiliki
dan ekspresi pada inang E.coli. Rumusan
beberapa kelebihan untuk mengkloning dan
dalam penelitian ini adalah apakah strategi
mengekspresikan
yang
protein
heterologous
digunakan
dapat
berhasil
terutama yang bersumber dari sel eukariot,
mengkloning dan mengekspresikan sekuen
namun keberhasilannya ditentukan banyak
DNA target pada inang E.coli?
faktor. Salah satunya adalah ketepatan penggunaan
strategi
Ketidaktepatan ekspresi
yang
yang
strategi dipilih
diterapkan.
kloning
dan
menyebabkan
keberhasilan kloning dan ekspresi gen
Tujuan
penelitian
ini
adalah
mengetahui apakah strategi yang digunakan dapat
berhasil
mengekspresikan
mengkloning sekuen
DNA
dan target
(daerah DBL3x gen var2csa) pada inang
53
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 E.coli.
Penelitian
ini
diharapkan
memberikan informasi penting untuk dapat dijadikan
bahan
pertimbangan
dalam
mengkloning dan mengekspresikan gen heterologus
eukariot
pada
sel
inang
prokariot E. coli.
2006).
Sekuen
target
yang
murni ®
diligasikan pada vektor kloning pCR 2.1®
TOPO (Invitrogen) menghasilkan molekul rekombinan. Molekul rekombinan lalu ditranformasikan ke dalam sel inang E.coli TOP 10 (Invitrogen) melalui metode kejutpanas. Seleksi sel inang yang mengandung
METODE PENELITIAN
sekuen
Untuk strategi kloning, sekuen DNA target, yaitu daerah DBL3x gen var2csa P. falciparum
dengan
panjang
948
pb
diamplifikasi (diperbanyak) dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) sesuai metode Saiki et al. (1988) yang telah dimodifikasi.
Program
PCR
yang
digunakan adalah tahap pre-denaturasi: 94oC (5 menit), 48oC (30 detik), 72oC (2 menit), tahap denaturasi: 94oC (1 menit),
menit), 72oC (5 menit). PCR berlangsung dalam 35 siklus. Primer untuk teknik PCR didesain spesifik target memanfaatkan beberapa software seperti BioEdit Sequence Alignment Editor (http://www.mbio.ncsu. edu/bioedit/bioedit.html) dan PerlPrimer v1.1.21 (http://perlprimer.sourceforge.net/ download.html).
Sekuen
primer
hasil
desain adalah F3x-3D7 (5’-ACCAATAAT AAAATGAAATCAA-3’) dan R3x-3D7 (5’-TCCTACATATTTATTTTCATAT3’). Sekuen target hasil amplifikasi PCR dimurnikan
menggunakan
metode
QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen,
54
dilakukan
dengan
penumbuhan bakteri pada media LB agar yang mengandung antibiotik ampisilin (konsentrasi akhir 100 µg/mL) dan teknik blue-white screening. Konfirmasi terakhir keberadaan sekuen target pada sel inang E.coli dilakukan dengan metode PCR colony menggunakan primer universal M13F
TOPO
(5’-GTAAAACGACGG
CCAG-3’) dan M13R TOPO (5’-CAG GAAACAGCTATGAC-3’).
tahap annealing primer: 48oC (1 menit), dan tahap pemanjangan (sintesis): 72oC (1
target
Untuk strategi ekspresi, sekuen DNA target yang berhasil diklon pada sel inang E.coli
dicek
nukleotidanya
kebenaran menggunakan
susunan teknik
sekuensing berdasarkan metode Sanger et al. (1977) dimodifikasi melalui perangkat Automatic DNA Sequencer ABIPrism 377 (Perkin Elmer). Sekuen DNA target yang telah
dicek
kebenaran
susunan
nukleotidanya diamplifikasi dengan teknik PCR menggunakan primer yang didesain spesifik
sehingga
memiliki
situs
pengenalan pemotongan enzim restriksi endonuklease NcoI dan XhoI. Primer hasil desain yang digunakan adalah F3x-Nco (5’-
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 GCATccatggGAACCAATAATAAAATG
HASIL DAN PEMBAHASAN
AAATCAAGT-3’) dan
Strategi Kloning
R3x-Xho (5’-
GCCCctcgagTCCTACATATTTATTTTC ATATTTTG-3’).
target
daerah DBL3x gen var2csa melalui teknik
dipotong dengan enzim NcoI dan XhoI (10
PCR menggunakan primer F3x-3D7 dan
unit/μl) dan diligasi pada vektor ekspresi
R3x-3D7 disajikan pada Gambar 1. Hasil
pET28a
menghasilkan
ini menunjukkan primer F3x-3D7 dan R3x-
molekul rekombinan. Molekul rekombinan
3D7, pada kondisi PCR yang sesuai berhasil
ditransformasi melalui metode kejut-panas
secara spesifik mendeteksi sekuen target.
ke dalam sel inang E.coli BL21 (DE3).
Primer
Seleksi keberadaan sekuen target pada sel
komplemen pada sekuen DNA cetakan
inang E.coli BL21 (DE3) dilakukan dengan
sehingga proses perbanyakan sekuen DNA
penumbuhan sel E.coli pada media LB agar
baru dapat dilakukan oleh enzim DNA
yang mengandung antibiotik kanamisin
polimerase. Keberadaan DNA target yang
(konsentrasi akhir 25 µg/ml) dan metode
berhasil diperbanyak secara in vitro (PCR)
PCR colony. Sel inang E.coli yang
dibuktikan dengan adanya pita DNA target
mengandung molekul rekombinan dengan
pada posisi yang sesuai (Sambrook &
sekuen target terdapat di dalamnya dikultur
Russell, 2001; Lodge et al., 2007). Hasil ini
pada media LB cair yang mengandung
juga membuktikan bahwa strategi desain
0,2% glukosa dan 25 µg/ml kanamisin
primer F3x-3D7 dan
(+)
Sekuen
(Novagen)
DNA
Hasil amplifikasi sekuen DNA target,
o
semalam (37 C, 300 rpm). Setelah OD600
ini
dapat
mengikat
secara
R3x-3D7
yang
digunakan berjalan dengan tepat.
kultur sel mencapai kisaran 0.6-0.8, sel
Untuk sekuen DNA target dengan
E.coli dicuci menggunakan media LB cair
kandungan basa A+T yang kaya, seperti
yang baru untuk menghilangkan kandungan
pada daerah DBL3x gen var2csa yang
glukosa di dalamnya. Sel E.coli yang telah
mencapai 80,6% (Hyman et al., 2002),
dicuci dikultur kembali pada media LB cair
desain primer harus dilakukan dengan hati-
yang
hati.
mengandung
galactosidase diinduksi
isopropyl-
(IPTG)
ekspresi
1
protein
β-thio-
Untuk
mengatasi
permasalahan
untuk
lemahnya ikatan hidrogen yang terbentuk
targetnya.
antara basa A dan T, maka primer didesain
mM
Induksi ekspresi dilakukan beberapa jam
melalui
bantuan
beberapa
untuk memonitor keberadaan protein hasil
bioinformatika
ekspresi.
PerlPrimer. Pada penelitian ini, software
seperti
software
BioEdit
dan
BioEdit digunakan untuk mensejajarkan
55
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015
1517 pb 1000 pb 700 pb 500 pb 300 pb 200 pb 100 pb
Gambar 1. DBL3x gen var2csa hasil amplifikasi PCR. M: 100 pb DNA Ladder sebagai pita DNA standard, 1: Pita DNA daerah DBL3x 948 pb, 2: Kontrol Negatif. 4 µl produk PCR + 3 µl beberapa sekuen DNA target dari berbagai
mengkalkulasi nilai melting temperature
sumber untuk mencari daerah conserve
(Tm) yang dibutuhkan dalam mengestimasi
(tetap)
target
suhu annealing (penempelan) primer pada
amplifikasi (perbanyakan) dengan PCR,
DNA cetakan untuk perbanyakan melalui
sedangkan software PerlPrimer digunakan
PCR dan dapat memprediksi kemungkinan
untuk mengetahui karakteristik primer yang
terbentuknya dimer primer (antarprimer
didesain agar menempel pada sekuen target
saling menempel sendiri) yang dapat
secara optimum. Menurut Hall (1999),
mengurangi tingkat spesifitas primer. Hasil
program
dengan
karakterisasi primer hasil desain dengan
program bioinformatika lainnya seperti
software PerlPrimer disajikan pada Gambar
ClustalW, BLAST yang memungkinkan
2. Berdasarkan hasil pada Gambar 2 dapat
peneliti dapat mensejajarkan banyak sekuen
diketahui bahwa primer F3x-3D7 dan R3x-
DNA secara bersamaan dan mencari
3D7 memiliki Tm 50,44 oC dan 48,22oC,
kedekatannya dengan data yang tersedia di
panjang primer 22 basa, kandungan basa
gene
mudah
GC 18%, dan tidak diketemukannya
dioperasikan, bersifat open source (tidak
kemungkinan terjadinya penempelan yang
berbayar), dan yang terpenting memiliki
kuat
tingkat ketepatan yang tinggi. Sementara
Karakteristik
itu, program PerlPrimer menurut Marshall
sesuai dengan parameter optimal desain
(2004) memiliki beberapa keunggulan
primer untuk PCR (Remm et al., 2004),
dalam mengkarakterisasi suatu primer,
kecuali karakter kandungan GC yang lebih
yaitu
rendah (<50%) karena ada penyesuaian
56
yang
akan
BioEdit
bank
dijadikan
terintegrasi
secara
ketepatan
yang
akurat,
tinggi
dalam
antarprimer primer
(dimer yang
primer). didapatkan
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 dengan kandungan GC pada DNA cetakan
cepat, dan efektif (Shuman, 1991; Shuman,
yang kurang dari 20%.
1994). Keberhasilan strategi kloning dapat
Sekuen DNA target yang telah
dilihat
dari
keberadaan
molekul
pCR®2.1-TOPO®-DBL3x
diperbanyak dengan teknik PCR dan
rekombinan
dimurnikan disisipkan pada vektor kloning
(gabungan dari vektor pCR® 2.1-TOPO®
pCR® 2.1-TOPO®.
Strategi pemilihan
dan daerah DBL3x gen var2csa) pada inang
vektor
didasarkan
pada
yang digunakan, yaitu E.coli TOP10.
karakteristik yang dimiliki vektor seperti
Keberadaan molekul rekombinan ditandai
kemampuan disisipi sekuen DNA target
oleh adanya perbedaan warna pada koloni
pada ukuran sesuai, memiliki marka genetik
E.coli TOP 10 (Gambar 3). Perbedaan ini
untuk keperluan seleksi, dan jumlah copy
dapat dimungkinkan karena vektor plasmid
yang tinggi (Lodge et al., 2007). Alasan lain
yang digunakan mengandung gen lacZα
pemilihan vektor kloning pCR® 2.1-
(suatu marka genetik) yang apabila disisipi
TOPO®
DNA
kloning
adalah
penyambungan
adanya sekuen
mekanisme
DNA
dengan
target
kehilangan
akan
menyebabkannya
kemampuan
menghasilkan
bantuan katalisis dari enzim topoisomerase
enzim β-galaktosidase sehingga koloni
sehingga proses ligasi sekuen DNA target
bakteri akan berwarna putih meskipun
dan
media ditambahkan senyawa X-gal sebagai
DNA
vektor
menjadi
molekul
rekombinan dapat terjadi lebih sederhana,
substrat dari enzim (Lodge et al., 2007).
Gambar 2. Karakteristisk primer forward F3x-3D7 dan Reverse R3x-3D7 dilihat menggunakan software PerlPrimer v1.1.21.
57
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 Koloni E.coli TOP10 berwarna biru --> diduga tidak mengandung molekul rekombinan pCR®2.1TOPO®-DBL3x.
Koloni E.coli TOP10 berwarna putih --> diduga mengandung molekul rekombinan pCR®2.1TOPO®-DBL3x.
Gambar 3. Koloni E.coli TOP10 hasil kloning di dalam media LB agar mengandung ampisilin dan X-gal. Koloni berwarna putih dilabel dengan penomoran 1-10.
1517 pb 1200 pb
500 pb 300 pb
Gambar 4. Hasil PCR terhadap koloni E.coli TOP10 warna putih untuk identifikasi sekuen DNA target. M: 100 pb DNA Ladder sebagai pita DNA standard. No. 1-10 : koloni E.coli yang diduga mengandung daerah DBL3x, - : Kontrol negatif. 7 µl produk PCR + 3 µl bufer loading dianalisis pada elektroforesis gel agarosa 1%, 90 Volt, 40 menit. Koloni No. 1, 3, 5, 6, 7, 8, dan 10 menunjukkan hasil positif dengan adanya pita DNA berukuran 1150 pb (hasil penjumlahan 948 pb daerah DBL3x + 202 pb sekuen vektor pCR®2.1-TOPO® yang diamplikasi primer M13F TOPO dan M13R TOPO). Untuk
memastikan
keberadaan
pCR®2.1-TOPO®-DBL3x
maka
akan
molekul rekombinan pCR®2.1-TOPO®-
dihasilkan pita DNA pada posisi yang
DBL3x
TOP10
diinginkan. Hasil analisisi PCR colony
berwarna putih, strategi yang dilakukan
disajikan pada Gambar 4. Beberapa koloni
adalah melakukan analisis PCR colony.
E.coli
Pada teknik PCR colony, primer yang
menunjukkan keberadaan pita DNA pada
digunakan
panjang
dalam
koloni
memiliki
E.coli
kemampuan kuat
TOP
10
sekitar
1150
pb.
menempel (komplemen) dengan sekuen
menandakan
DNA vektor, sehingga jika di dalam koloni
dilakukan berhasil dengan baik.
bakteri
58
terdapat
molekul
rekombinan
strategi
berwarna
Hasil
kloning
putih
ini yang
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015
Gambar 5. Hasil analisis sekuen DBL3x gen var2csa produk kloning dengan program blast-n. Gen target DBL3x memiliki kedekatan 92-99% dengan data base DNA yang tersedia (lingkaran). Sekuen DNA target yang berhasil diklon
pada
dikonfirmasi melalui
inang
E.coli
susunan
teknik
TOP10
nukleotidanya
sekuensing
dan
(penyambungan) sekuen DNA target ke dalam
vektor plasmid ekspresi
digunakan. Strategi desain primer serupa dengan
tahap
dibandingkan dengan susunan nukleotida
software
yang
Perbedaannya
terdapat
memanfaatkan
pada program
gene
bank
yang
kloning
BioEdit di
memanfaatkan
dan
PerlPrimer.
dalam
primer
bioinformatika
ditambahkan situs pengenalan NcoI dan
blast-n (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
XhoI. Karakteristik primer yang didesain
cgi) (Zheng et al., 2000). Hasil yang
disajikan pada Gambar 6. Dari Gambar 6
disajikan pada Gambar 5 menunjukkan
diketahui nilai Tm primer 66,82oC dan
sekuen DNA target yang berhasil diklon
66,19oC, panjang 36 basa, kandungan GC
memiliki tingkat kemiripan 92-99% dengan
33%, dan tidak diketemukan kemungkinan
data base DNA yang tersedia (Morgulis et
terjadinya
al., 2008).
antarprimer. Karakteristik primer yang
Strategi Ekspresi
didesain sesuai dengan parameter optimal
penempelan
yang
kuat
Strategi ekspresi sekuen DNA target
desain primer untuk PCR (Remm et al.,
diawali dengan didesain primer. Primer
2004), kecuali pada kandungan GC yang
dirancang mengandung situs pengenalan
lebih rendah dari 50% dan panjang primer
enzim restriksi endonuklease tipe II, yaitu
melebihi 24 basa nukleotida. Menurut
NcoI dan XhoI. Keberadaan kedua daerah
Judelson (2006), primer bekerja dengan
ini diharapkan memudahkan proses ligasi
baik (menempel pada sekuen DNA cetakan)
59
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015
Gambar 6. Karakteristisk primer forward F3x-Nco dan Reverse R3x-Xho dilihat menggunakan software PerlPrimer v1.1.21. umumnya memiliki panjang 20-24 basa.
dahulu diligasikan pada vektor pCR®2.1-
Untuk mengatisipasi turunnya spesifitas
TOPO®.
primer, primer didesain memiliki basa
didapatkan lalu dipotong dengan enzim
nukleotida G atau C pada ujing 3’
NcoI dan XhoI. Hasil pemotongan enzim
sekuennya. Keberadaan nukleotida G atau
NcoI dan XhoI melalui strategi kedua
C pada ujung 3’ primer dapat meningkatkan
disajikan pada Gambar 8. Dari kedua
hasil amplifikasi PCR (Judelson, 2006).
strategi ini, strategi kedua menjadi pilihan
Sekuen DNA target yang berhasil diperbanyak
dengan
teknik
PCR
Molekul
rekombinan
yang
terbaik karena enzim dapat memotong sekuen DNA dengan baik dan dihasilkan
menggunakan primer F3x-Nco dan R3x-
produk
Xho, selanjutnya dipotong dengan enzim
(sekuen
restriksi endonuklease tipe II. Terdapat dua
sedangkan pada strategi pertama, enzim
strategi yang digunakan. Strategi pertama,
tidak berhasil memotong DNA. Ketidak
DNA produk PCR langsung dipotong
berhasilan pemotongan enzim pada strategi
dengan enzim NcoI dan XhoI. Hasil
pertama diduga karena enzim tidak mampu
pemotongan enzim NcoI dan XhoI melalui
menempel pada situs pengenalannya secara
strategi pertama disajikan pada Gambar 7.
tepat karena terlalu pendeknya jarak situs
Strategi
tersebut dari ujung sekuen DNA target
kedua,
sebelum
dilakukan
pemotongan dengan enzim NcoI dan XhoI, sekuen DNA target dari hasil PCR terlebih
60
pemotongan DNA
yang
berukuran
diinginkan 960
produk PCR (hanya 5 basa nukleotida).
pb),
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 Pada penelitian ini digunakan enzim
menghasilkan ujung tumpul (blunt end)
restriksi NcoI dan XhoI. Kedua enzim ini
(Pingoud & Albert, 2001). Selain itu,
akan menghasilkan ujung lengket (sticky
penggunaan dua enzim restriksi ini secara
end) pada sekuen DNA target yang
bersamaan akan menghindari kekeliruan
dipotong. Ujung lengket akan memperbesar
arah penempelan sekuen DNA target pada
peluang penempelan sekuen DNA target
DNA
kepada
DNA
digunakan,
vektor
dibandingkan
vektor
ekspresi kesalahan
yang
dapat
ekspresi
yang
mengakibatkan
pembacaan
enzim
yang
dalam proses ekspresi gen menjadi protein.
1517 pb 1000 pb
500 pb
100 pb
Gambar 7. Produk PCR DNA target yang dipotong secara langsung dengan enzim NcoI dan XhoI (lajur 1). Pita DNA Standard (M). Enzim tidak berhasil memotong sekuen DNA target.
10,0 kb 3,0 kb 1,5 kb 1,0 kb
1517 pb 1000 pb 700 pb
0,5 kb 300 pb 100 pb
Gambar 8.
Hasil pemotongan molekul rekombinan pCR®2.1-TOPO®- DBL3x dengan enzim NcoI dan XhoI. M1: 1 kb DNA Ladder dan M2: 100 pb DNA Ladder sebagai pita DNA standard. Lajur 1: pCR®2.1-TOPO®-DBL3x dan 2: kontrol positif tanpa pemotongan enzim. 3: pCR®2.1-TOPO®-DBL3x dan 4: kontrol positif setelah pemotongan enzim. Tanda panah menunjukkan adanya pita DNA target dengan panjang 960 pb (DBL3x) dan 741 pb (kontrol positif). Deteksi dilakukan dalam gel agarosa 1%, 90 volt, 40 menit.
61
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 200,0 kDa 116,3 kDa 97,4 kDa 66,2 kDa 45,0 kDa 31,0 kDa
Gambar 9. Hasil ekspresi daerah DBL3x pada E.coli BL21 (DE3). M : Pita Protein Standard Broad range, T=0 : waktu induksi jam ke-0, T=1 : jam ke-1, T=2 : jam ke-2, T=3 : jam ke-3, T=4 : jam ke-4. Tanda panah menunjukkan adanya pita protein target yang semakin tebal seiring lamanya waktu induksi. Protein DBL3x diperkirakan berukuran 38 kDa. 10 µl suspensi pellet dan 2x RSB SDS buffer diloading dalam gel poliakrilamida 10%, 2 jam, 60-100 volt. Untuk keperluan ekspresi sekuen DNA
paling
target menjadi protein, sekuen DNA target
mengekspresikan
yang telah dipotong enzim NcoI dan XhoI
(Sorensen & Mortensen, 2005; Wang et al.,
diligasikan pada vektor ekspresi pET28a
2014). Menurut Sorensen & Mortensen
(+). Strategi penggunaan sistem pET untuk
(2005), latar belakang galur dan genetik
ekspresi gen disebabkan oleh beberapa
dari inang ekspresi sangat penting. Inang
karakter unggul yang dimiliki vektor
E.coli BL21 (DE3) memiliki keunggulan,
ekspresi
seperti defisiensi enzim protease yang dapat
tersebut
seperti
keberadaan
banyak
digunakan protein
protein
untuk
rekombinan
promoter T7 yang dikenal kuat dan baik
mendegradasi
target,
dapat
dalam mengekspresikan gen pada inang
memelihara vektor ekspresi secara stabil,
E.coli, adanya daerah pengenalan NcoI dan
dan memiliki kesesuaian genetik dengen
XhoI sebagai tempat penyisipan sekuen
sistem ekspresi yang ada.
DNA target yang sudah mengandung
Strategi ekspresi sekuen DNA target
daerah pengenalan yang sama, terdapat
diawali dengan pemberian glukosa 0,2%
penanda genetik untuk keperluan seleksi,
pada media pertumbuhan inang E.coli
dan keberadaan sekuen 6x His untuk
BL21 (DE3) yang sudah mengandung
kemudahan
yang
sekuen DNA target. Glukosa dijadikan
diekspresikan. Pada penelitian ini, ekspresi
sebagai sumber energi untuk pertumbuhan
sekuen DNA target dilakukan pada inang
dan pemeliharaan level ekspresi basal
E.coli BL21 (DE3). Inang ini popular dan
rendah oleh sel bakteri (Novagen, 2010).
62
pemurnian
protein
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 Setelah sel E.coli BL21 (DE3) tumbuh
KESIMPULAN
dengan baik, senyawa glukosa dihilangkan
Strategi
kloning
berhasil
dari media LB cair yang digunakan.
mendapatkan sekuen DNA target, daerah
Sebagai
media
DBL3x gen var2csa dengan panjang 948
dengan
pb. Strategi ekspresi berhasil mendapatkan
konsentrasi 1 mM. Senyawa ini berperan
pita protein target, protein DBL3x dengan
menginduksi ekspresi gen pada inang
ukuran sekitar 38 kDA. Dengan demikian,
E.coli. Menurut Einsfeldt et al. (2011),
strategi yang ditempuh dalam penelitian ini
konsentrasi IPTG memiliki pengaruh yang
berhasil baik dalam mengkloning dan
signifikan secara statistik terhadap ekspresi
mengekspresikan
suatu protein heterologous. Proses induksi
DBL3x gen var2csa yang bersumber dari
dilakukan dalam beberapa jam untuk
sel eukariot pada sistem inang prokariot
memonitor
E.coli.
pengganti,
ditambahkan
ke
senyawa
keberadaan
dalam IPTG
protein
target
sekuen
DNA
target
sebagai hasil ekspresi. Hasil ekspresi
DAFTAR PUSTAKA
sekuen DNA target menghasilkan protein
Badosa E., Moiset G., Montesinos L., Talleda M., Bardají E., Feliu L., Planas M., Montesinos E. 2013. Derivatives of the Antimicrobial Peptide BP100 for Expression in Plant Systems. PLoS ONE, 8(12): e85515. doi:10.1371/journal. pone. 0085515
target disajikan pada Gambar 9. Dari hasil yang disajikan pada Gambar 9, sekuen DNA target (DBL3x) berhasil
diekspresikan
menghasilkan
protein DBL3x yang berukuran sekitar 38 kDa (dibandingkan dengan pita protein standard). Waktu induksi empat jam (T=4) menghasilkan pita protein paling tebal dibandingkan waktu ekspresi satu jam (T=1), dua jam (T=2), dan tiga jam (T=3). Dari hasil ini dapat diketahui jumlah protein yang diekspresikan sebanding dengan waktu ekspresi. Semakin lama waktu induksi, semakin banyak protein yang diekspresikan oleh sel inang E.coli BL21 (DE3).
Baneyx. 1999. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology, 10: 411-421. Einsfeldt K., Joao B.S.J., Ana P.C.A., Marco A.M., Tito L.M.A., Rodrigo V.A., Ariane L.L. 2011. Cloning and Expression of Protease ClpP from Streptococcus pneumoniae in Escherichia coli: Study of the influence of kanamycin and IPTG concentration on cell growth, recombinant protein production and plasmid stability. Vaccine, 29: 7136– 7143 Hall T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acid Symposium Series, 41: 95-98.
63
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 Hyman, R.M., Fung, E., Conway, A., Kurdi, O., Mao, J., Miranda, M., Nakao, B., Rowley, D., Tamaki, T., Wang, F., & Davis, R.W. 2002. Sequence of Plasmodium falciparum chromosome 12. Nature, 419: 534537. ®
®
Invitrogen. TOPO TA Cloning Kit, Fiveminute cloning of Taq polymeraseamplified PCR products. Life Technologies Corporation. Ivashuta S., Banks I.R., Wiggins B.E., Zhang Y., Ziegler T.E., Roberts J.K., Heck G.R. 2011. Regulation of Gene Expression in Plants through miRNA Inactivation. PLoS ONE 6(6): e21330. doi:10.1371/journal.pone. 0021330 Judelson. 2006. Guidelines for Designing Primers. Diakses pada 22 Mei 2015. Kuchenreuther J.M., Grady-Smith C.S., Bingham A.S., George S.J., Cramer S.P., Swartz J.R. 2010. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. PLoS ONE 5(11): e15491. doi:10.1371/journal.pone.0015491 Lodge J., Lund, P., and Minchin, S. 2007. Gene Cloning Principle and Applications. Taylor & Francis, Birmingham. Marshall. 2004. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphate, and real-time PCR. Bioinformatics, 20 (15): 2471-2472 Morgulis A., George C., Yan R., Thomas L.M., Richa A., Alejandro A.S. 2008. Databese Indexing for Production MegaBLAST Search. Bioinformatics, 24:1757-1764 Natarajan C., Jiang X., Fago A., Weber R.E., Moriyama H., Jay F.S. 2011. Expression and Purification of Recombinant Hemoglobin in Escherichia coli. PLoS ONE 6(5): e20176. doi:10.1371/journal.pone. 0020176
64
Nausch H., Huckauf J., Koslowski R., Meyer U., Broer I., Mikscofsky H. 2013. Recombinant Production of Human Interleukin 6 in Escherichia coli. PLoS ONE 8(1):e54933. doi:10.1371/journal.pone.0054933 Novagen. 2010. pET System Manual 11th Edition. EMD Chemicals, Inc., Darmstadt. Peng Z, Li L, Yang L, Zhang B, Chen G, Bi Y. 2013. Overexpression of Peanut Diacylglycerol Acyltransferase 2 in Escherichia coli. PLoS ONE 8(4): e61363. doi:10.1371/journal.pone. 0061363 Pingoud A. & Albert J. 2001. Structure and Function of Type II Restriction Endonuclease. Nucleic Acids Research, 29 (18):3705-3727 Qiagen. 2006. QIAquick Spin Handbook. Clifton Hill: Qiagen. Remm M., Ants K., & Andres M. 2004. Primer Design for Large-Scale Multiplex PCR and Arrayed Primer Extension (APEX) dalam Weissensteiner T., Hugh G.G., & Annette G. (Ed.) PCR Technology Curren Innovation. CRC Press, Boka Raton (Hal. 131-140). Rosano H.L. & Eduardo A.C. 2014. Recombinant Protein Expression in Escherichia coli: advance and challenges. Frontiers in Microbiology, 5: 1-17. Saiki R.K., David H.G., Susanne S, Stephen J.S, Russel H, Glenn T.H., Kary B.M., and Henry A.E. 1988. Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239: 487-491. Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Shuman S. 1991. Recombination mediated by vaccinia virus DNA topoisomerase
ISSN: 1410-0029 Agrin Vol. 19, No. 1, April 2015 I in Escherichia coli is sequence specific. Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10104-10108.
Recombinan Protein Expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 115: 113-128.
Shuman S. 1994. Novel Approach to Molecular Cloning and Polynucleotide Synthesis Using Vaccinia DNA Topoisomerase. The Journal of Biological Chemistry, 269 (51): 32678-32684.
Wang H., Wang F., Wang W., Yao X., Wei D., Cheng H., & Deng Z. 2014.Improving the Expression of Recombinant Proteins in E. coli BL21 (DE3) under Acetate Stress: An Alkaline pH Shift Approach. PLoS ONE 9(11): e112777. doi:10.1371/ journal.pone.0112777
Sanger F, S Nicklen, AR Coulson. 1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74: 5463-5467. Šnajder M., Mihelič M., Turk D., Ulrih N.P. 2015. Codon Optimisation Is Key for Pernisine Expression in Escherichia coli. PLoS ONE 10(4): e0123288. doi:10.1371/journal.pone.0123288 Sorensen H.P. & Mortensen K.K. 2005. Advanced Genetic Strategies for
Weissensteiner T., Hugh G.F., & Annette G. 2004. PCR Technology Current Innovations. 2nd.Ed. CRC Press, Boka Raton. Zheng Z., Scott S., Lukas W., & Webb M. 2000. A Greedy algorithm for aligning DNA sequences. J. Comput. Biol., 7 (1-2):203-214
65
