REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS • Fage/virus Æ memanfaatkan perangkat sel inang untuk sintesis DNA/protein • Strategi memanfaatkan sel inang Æ mensintesis 4 makromolekul: 1. RNA polimerase baru Æ khusus mentranskripsi kromosom virus 2. Subunit RNA pol baru Æ berasosiasi dengan polimerase sel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus 3. Protein represor Æ menghambat fungsi sel inang 4. Protein aktivator Æ mengatur ekspresi gen virus

Suharsono.2005. BTK505. IPB

Regulasi pada fage T7 2 kategori gen: Gen awal (early genes): Klas I Æ diekspresikan pertama Gen lambat (late genes): Klas II dan Klas III Æ diekspresikan bila produk gen awal tersedia


Regulasi pada fage T7 3 kelompok gen 1.Produk gen awal Æ menghambat sintesis RNA inang 2.Produk gen metabolisme DNA (enzim untuk replikasi kromosom virus & nuklease untuk degradasi kromosom sel inang Æ nt bebas) 3.Produk gen akhir (mantel, ekor & protein pembungkus kromosom virus). Produk terakhir: lisozim Æ lisis sel inang Æ + 250 fage Suharsono.2005. BTK505. IPB

Ekspresi T7 1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inang Æ transkrip panjang Æ dipotong oleh RNaseIII dari sel inang Æ 5 mol mRNA Æ translasi oleh ribosom dari sel inang Produk: • antirestriksi (0.3) Æ melindungi kromosom virus dari degradasi oleh enzim restriksi sel inang • protein kinase (0.7) Æ modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresi gen klas II dan III • RNA polimerase T7 (1) Æ transkripsi klas II dan III (80% genom virus T7) • Ligase (1.3) Æ menyambung fragmen DNA 2. Gen-gen klas II diekspresikan oleh RNA pol T7 -replikasi DNA virus 3. Gen-gen klas III -morfogenesis fage, pengemasan DNA, lisis sel inang Suharsono.2005. BTK505. IPB

Siklus fage T7


Regulasi pada SPO1 • SPO1: virus besar, menginfeksi Bacillus subtilis • 3 kelompok gen: early, middle, late 1. Gen awal Æ RNA pol sel inang (menghasilkan produk gen 28) 2. Gen tengah Æ RNA pol sel Inang yang mengandung produk gen 28 pada posisi faktor σ –Faktor σ mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT pada gen awal SPO1 –Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah SPO1 –Menghasilkan produk gen 33 dan 34 3. Gen akhir Æ RNA pol sel inang yang mengandung produk gen 33 dan 34 Suharsono.2005. BTK505. IPB

Regulasi pada SPO1 (lanjutan) Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gen tengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya, yaitu posisi faktor σ)


Regulasi pada λ Setelah menginfeksi E.coli, λ menempuh: 1. Siklus litik Æ sel inang lisis Æ 100 fage 2. Siklus lisogenik Æ kromosom fage menyisip kedalam kromosom E.coli


Siklus litik atau lisogenik? Protein-protein regulator yang disandi λ


Regulasi selama siklus litik λ Fase litik meliputi 3 fase: • Fase Immediate-early • Fase Delayed-early • Fase Late Fase Immediate-early Kromosom λ masuk, transkripsi oleh RNA pol sel inang. Inisiasi transkripsi dimulai dari PR (transkripsi ke kanan) Æ gen cro dan PL (transkripsi ke kiri) Æ gen N. Protein N diperlukan untuk transisi dari immediate-early ke delayed early (seperti produk gen 28 pada SPO1) Suharsono.2005. BTK505. IPB

Regulasi selama siklus litik λ Fase Delayed-early Dimulai saat protein N menstimulasi transkripsi gen-gen delayed- early, mengekspresikan gen cII dan cIII (relevan untuk siklus lisogenik), gen O, P (untuk replikasi kromosom λ) dan Q (untuk transisi dari delayed-early ke late, seperti produk gen 33 dan 34 dari SPO1) Fase Late Dimulai saat protein Q menstimulasi transkripsi gen-gen late spt gen penyandi kepala, ekor dan faktor-faktor litik Suharsono.2005. BTK505. IPB

Transkripsi gen-gen immediate-early

RNA polimerase sel inang: Kanan: PR Æ cro Kiri: PL Æ N Suharsono.2005. BTK505. IPB

Transkripsi delayed-early

RNA polimerase sel inang (faktor δ diganti protein N) Kanan: PR Æ cII, O, P, Q Kiri: PL Æ CIII Suharsono.2005. BTK505. IPB

Keadaan lisogeni • Siklus lisogeni memerlukan: 1. Protein represor λ Æ menghambat ekspresi gen-gen untuk siklus lisis – Disandi oleh gen cI di bawah kontrol PRE (promoter for repressor establishment) 2. Protein Int λ Æ integrasi ke kromosom E. coli – Disandi oleh gen Int di bawah promoter PINT 3. PRE dan PINT: sekuensi mirip, memerlukan protein cII dan cIII supaya RNA polimerase mengenalinya Æ cII dan cIII diperlukan untuk siklus lisogeni


Keadaan lisogeni


Protein cII dan cIII • Protein cII Æ protein regulator (aktivator) seperti CAP Æ mengikat daerah –35 dari PRE dan PINT Æ menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan • Protein cIII Æ menonaktifkan protease yang dapat mendegradasi protein cII (Æ menjaga stabilitas cII) • CII dan cIII memerlukan protein N


Mekanisme Lisogeni • Represor λ Æ mengikat operator (OL dan OR), mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol PR dan PL yaitu: gen N dan cro • N dan CRO tidak stabil Æ konsentrasi di dalam sel turun (rendah) • N rendah Æ menghambat transkripsi gen-gen delayedearly yang tergantung N, yaitu: O, P, Q • Q rendah/tidak ada Æ mencegah ekspresi gen-gen dan late Æ tidak terjadi siklus lisis • Protein Int Æ perantara rekombinasi situs spesifik antara attP dan attB sehingga kromosom λ terintegrasi kedalam kromosom E. coli


Strategi λ dalam memilih siklus 1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhi pembacaan terminator Æ lisis 2. Menghasilkan protein aktivator cII yang mengikat daerah promoter dan memudahkan RNA pol menempel pada promoter Æ lisogeni 3. Menghasilkan represor Æ mengikat operator Æ lisogeni


Interaksi represor-operator • Mutasi gen cI Æ plak jernih (WTÆ plak keruh: lisis & lisogeni) • Mutasi cII- dan cIII- Æ plak jernih • Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator sebagai dimer • Mutan operator (OL- dan OR-) Æ virulen (represor normal tapi tidak dapat mengikat operator Æ tidak dapat menempuh siklus lisogeni Æ plak jernih (~lacOc)


Operator • Operator mempunyai 3 situs penempelan (OL1, 2, 3; OR1, 2, 3) • Operator tumpang tindih dengan promoter • Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan yang lain oleh daerah kaya AT • Setiap mutasi pada situs penempelan Æ virulen

= mutasi Æ virulen


Lisis-Lisogeni • Lisis/lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cII, cIII, cI, dan cro • Protein cro (control of repressor and other things) – paling menentukan terjadinya siklus lisis atau lisogeni – diekspresikan segera setelah infeksi λ – tidak memerlukan protein N – ada sebelum produk cI (represor), cII dan cIII ada di dalam sel – represor, dapat mengikat OR dan OL seperti represor cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) Æ tidak dapat menghambat secara penuh ekspresi gen-gen N dan cIII (dibawah PL) dan cro, cII, O, P, dan Q (di bawah PR) Suharsono.2005. BTK505. IPB

Mekanisme Lisis-Lisogeni • Lisogeni memerlukan ekspresi gen cI Æ perlu cII dan cIII untuk mengaktifkan PRE • Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen Æ perlu antiterminator N dan Q • Transkripsi cI lebih sensitif terhadap penurunan cII/cIII daripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalam siklus lisis terhadap penurunan N dan Q Æ jika cro banyak Æ menempel pada OR dan OL Æ cII dan cIII rendah Æ cI tidak diekspresikan Æ ekspresi seluruh gen λ Æ siklus lisis Æ jika cro sedikit Æ tidak kuat menempel pada OR dan OL Æ ekspresi cII dan cIII normal Æ cI diekspresikan Æ siklus lisogeni – tingkat produksi cro Æ temperatur, keadaan metabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipe fage Suharsono.2005. BTK505. IPB

Keadaan E. coli lisogeni • Bakteri lisogenik untuk λ (E. coli (λ)) kebal terhadap superinfeksi (+λ) • E. coli (λ) + λ Æ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisis pada bakteri • Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendah Æ menempel pada PROR dan PLOL pada profage (menjaga kondisi lisogeni) dan PROR dan PLOL pada λ yang masuk (mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom E. coli krn situs attB sudah ditempati) Æ kromosom λ berada di sitosol Æ jumlahnya berkurang (hilang) bila E. coli mengalami pembelahan sel


• Transkripsi represor pada tingkat rendah di E. coli (λ) dikontrol oleh PRM (promoter for repressor maintenance) yang tidak memerlukan cII dan cIII (beda dengan PRE) • Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI: Jika represor cI rendah Æ PRM dirangsang Æ transkripsi cI Jika represor cI tinggi Æ transkripsi dari PRM dihambat oleh represor cI (Æ regulasi autogenous)


Induksi lisis dari keadaan profage • Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapat menghambat ekspresi operon dari profage λ • Kehilangan secara spontan profage λ dari kromosom E. coli jarang terjadi


1. Induksi zigotik • Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik – Jika kromosom yang mengandung profage masuk ke sel resipien Æ tidak menemui protein represor Æ transkripsi dari PROR dan PLOL Æ siklus lisis – Tidak terjadi lisis jika sel resipien adalah E. coli (λ)


2. Mutasi pada cI • Mutan cI857 Æ sintesis protein represor thermolabil (stabil pada 30oC, tidak aktif pada 42oC) • E. coli (cI857) Æ dipanaskan Æ E. coli lisis


3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapat merusak DNA (dengan irradiasi UV, mitomisin, sinar X) • Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS • Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan replikasi, E. coli mensintesis protein RecA Æ memudahkan sintesis enzim SOS termasuk untuk replikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzim sistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam E. coli (λ). • Jika DNA rusak Æ sinyal untuk mensintesis protein RecA Æ merusak represor λ Æ profage terinduksi untuk mengalami lisis Suharsono.2005. BTK505. IPB

Regulasi SV40 Produk gen early • Antigen t (15kD) • Antigen T (96 kD) Æ Transkrip sama, beda

splicing

Produk gen late • Protein kapsid (VP1, VP2, VP3) Æ beda splicing – mRNA late Æ splicing: • 16S mRNA Æ VP1 • 19S mRNA: • VP2 • VP3 Arah transkripsi gen-gen early Æ Krn 2 kodon AUG berbeda dengan gen-gen late Suharsono.2005. BTK505. IPB

Regulasi sintesis protein SV40 • Infeksi (8-10 jam) Æ gen early (gen A penyandi antigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol dan ditranslasikan oleh ribosom sel inang • Mutan tsA (antigen T thermolabile) Æ tidak dapat memulai replikasi kromosom virus & tidak dapat memulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virus Antigen T Æ protein pengatur early yang esensial (~ protein N pada λ)


Mekanisme Promoter early (EI dan EII) dekat dengan ORI dan gen early A Situs penempelan antigen T (I, II, III) bebas Æ transkripsi oleh RNA pol dari EI

Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Æ Inisiasi transkripsi dari situs EII

Penempelan antigen T pada situs II Æ transkripsi gen A berhenti Æ ekspresi gen-gen late Suharsono.2005. BTK505. IPB

Regulasi SV40 Kromosom SV40 menginfeksi sel inang: • RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsi genA Æ sintesis antigen T • Akumulasi antigen T (tetramer) Æ mengikat situs I Æ inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA pol menempel pada promoter EII untuk melakukan transkripsi antigen T Æ jumlah antigen T banyak Æ mengikat semua situs I, dan II Æ transkripsi gen early berhenti, dan replikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen late dimulai


Kenapa terjadi early/late? • Promoter EI dan EII jauh lebih kuat daripada promoter pada gen-gen late sehingga transkripsi oleh RNA pol pada gen A sangat intensif Æ produk antigen T banyak • Antigen T menghambat ekspresi gen-gen early, sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen late Sintesis antigen T Æ regulasi autogenous (~ represor λ ~ trp) Mutan tsA Æ antigen T thermolabile didegradasi (situs I dan II bebas) Æ stimulasi 15x transkripsi gen early Æ overproduksi protein mutan T


REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

Recommend Documents