EKSPRESI GEN-GEN RESPONSIF TERHADAP Corynespora cassiicola PADA TANAMAN KARET (Hevea brasiliensis Muell.Arg.) NURHAIMI

EKSPRESI GEN-GEN RESPONSIF TERHADAP Corynespora cassiicola PADA TANAMAN KARET (Hevea brasiliensis Muell.Arg.)

NURHAIMI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006

ABSTRAK NURHAIMI. Ekspresi gen-gen responsif terhadap Corynespora cassiicola pada tanaman karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.). HAJRIAL ASWIDINNOOR, MAGGY T. SUHARTONO, ANTONIUS SUWANTO, NURITA TORUANMATHIUS, dan AGUS PURWANTARA. Penyakit gugur daun yang disebabkan cendawan Corynespora cassiicola merupakan penyakit penting di perkebuana karet. Penelitian bertujuan untuk mendapatkan transkrip/gen/bagian gen yang berperan dalam respon pertahanan tanaman karet terhadap patogen tersebut. Beberapa tahap penelitian dilakukan, yaitu: (1) mengidentifikasi gejala dan menetapkan tingkat resistensi klon karet serta mengidentifikasi kemiripan genetik klon karet untuk penentuan klon resisten dan rentan yang digunakan dalam studi ekspresi gen, (2) mengembangkan metode cDNA-AFLP pada tanaman karet, (3) mengidentifikasi transkrip yang diekspresikan secara diferensial pada klon karet resisten dan rentan selama terjadi interaksi tanaman-patogen melalui metode cDNA-AFLP serta kloning dan sekuensing fragmen asal transkrip , dan (4) konstruksi pustaka cDNA dari daun klon karet resisten. Aplikasi metode cDNA-AFLP dilakukan dengan memberikan tekanan berupa infeksi patogen pada daun untuk menginduksi ekspresi transkrip/gen/bagian gen yang berperan dalam res pon pertahanan. Hasil penelitian menunjukkan gejala bercak mulai terlihat hari kedua setelah daun diinokulasi, baik pada klon resisten maupun rentan. Perkembangan gejala berlanjut pada klon rentan, setelah 12 hari hampir seluruh bagian daun rusak, namun pada klon resisten gejala penyakit tidak berkembang. Klon BPM 1 menunjukkan respon sangat resisten, klon IRR 100, RRIC 100, AVROS 2037, PR 255 adalah resisten dan klon RRIC 103, PPN 2444, IAN 873 adalah sangat rentan. Klon resisten AVROS 2037 dan klon rentan PPN 2444, yang memiliki kemiripan genetik 88,0%, dipilih untuk studi ekspresi gen. Konstruksi pustaka cDNA berhasil mendapatkan koloni transforman, 93% di antaranya mengandung sisipan fragmen cDNA dengan panjang antara 200 - 2000 bp, namun fragmen terbanyak antara 500 – 800 bp. Analisis cDNA-AFLP pada cDNA asal daun klon AVROS 2037 dan PPN 2444 yang diinfeksi C. cassiicola menghasilkan 35 fragmen asal transkrip (TDF) dengan pola ekspresi berbeda. Seluruh fragmen diklon dan disekuen. Pengelompokan berdasarkan homologi sekuennya menghasilkan 19 contigs dan 9 macam sekuen individu. Beberapa contig dan sekuen terlalu pendek, terdiri atas beberapa nukleotida saja. Sebanyak 10 contigs dan 5 sekuen memiliki homologi dengan gen yang telah dikenal ya ng terdapat di data base gene bank, seperti putative Ran binding protein , protein transporter, regulator transkripsi pada beberapa organisme; arginase, GTP-binding protein, heat shock protein (HSP) dan aconitase pada beberapa spesies tanaman. Ran binding protein , GTP-binding protein , dan protein transporter mer upakan protein yang terdapat pada membran sedangkan aconitase merupakan enzim yang ekspresinya diregulasi oleh nitric oxide (NO). Transkrip lainnya seperti arginase diregulasi oleh pelukaan dan fitotoksin. Keberadaan enzim yang berhubungan dengan NO menimbulkan dugaan bahwa respon pertahanan tanaman karet terhadap C. cassiicola kemungkinan diperantarai oleh NO. Kata kunci: Hevea brasiliensis, Corynespora cassiicola, kemiripan genetik, cDNA tanaman karet, cDNA-AFLP, gen responsif .

ABSTRACT NURHAIMI. Expression of pathogen responsive genes toward Corynespora cassiicola in rubber plant (Hevea brasiliensis Muell. Arg.). HAJRIAL ASWIDINNOOR, MAGGY T. SUHARTONO, ANTONIUS SUWANTO, NURITA TORUAN-MATHIUS, and AGUS PURWANTARA. Leaf fall disease caused by Corynespora cassiicola fungus is an important disease in rubber plantation. This research aims to identify and isolate genes or part of genes involved in plant defense response in rubber clones. There were several research activities, (1) selection resista nt and susceptible clones for gene expression study which consist of identification of disease symptons, examination of the resistance level of rubber clones to the pathogen, and analysis of genetic similarity of several rubber clones, (2) establishment of cDNA-AFLP method for rubber plant, (3) identification of transcripts differentially expressed in response to the pathogen infection in both resistant and susceptible clones, and (4) construction of the cDNA library from Hevea leaf of resistant clone. Application of cDNA-AFLP method in gene expression study started by pathogen infection of the leaves to induce the expression of genes involved in resistance mechanism. The results showed that disease symptons visually observed two days after pathogen inoculation, both in resistant and susceptible clones. In susceptible clones, 12 days after inoculation most of surface of the leaves damaged. In contrary, no significant development of symptons were observed on resistant clones. Among these clones, BPM 1 showed the strongest resistance; IRR 100, RRIC 100, AVROS 2037, and PR 255 were resistance; and RRIC 103, PPN 2444, IAN 873 were susceptible. AVROS 2037 and PPN 2444 clones with have 88% genetic similar ity were choosen for gene expression study. The cDNA library construction resulted in many colonies, 93% of which contained cDNA insert with size 200 – 2000 bp. Most of the fragments, however, were 500 - 800 bp. The cDNA-AFLP analysis of cDNA from leaves of AVROS 2037 and PPN 2444 clones infected with C. cassiicola resulted in 35 transcript-derived fragments (TDFs) with have different ial expression patterns. All of these fragments were cloned and sequenced. The homology-based grouping of these sequences resulted in 19 contigs and 9 individual sequences. Some contigs and sequences were very short, only contain several few nucleotides. Among these, 10 contigs and 5 sequences have significant sequence homology with known genes in gene bank data base, such as Ran binding protein, protein transporter and transcriptional regulators of some organisms; arginase, GTP -binding protein, heat shock protein (HSP) and aconitase of some plants species. Among these, Ran binding protein , GTP-binding protein and protein transporter were known as a membrane protein, while aconitase included in nitric oxide (NO) -regulated enzyme. The other such as arginase were regulated by wounding and phytotoxin. The presence of enzyme related to NO emerge speculation that rubber plant defense could be mediated by NO. Key word: Hevea brasiliensis , Corynespora cassiicola, genetic similarity, rubber tree cDNA, cDNA-AFLP, responsive genes.

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Ekspresi Gen-gen Responsif terhadap Corynespora cassiic ola pada Tanaman Karet (Hevea brasiliensis, Muell. Arg.) adalah karya saya sendiri dengan bimbingan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Bogor, Juni 2006

Nurhaimi P03600007

 Hak cipta milik Nurhaimi, tahun 2006 Hak Cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam Bentuk apapun, baik cetak, fotocopi, mikrofilm, dan sebagainya

EKSPRESI GEN-GEN RESPONSIF TERHADAP Corynespora cassiicola PADA TANAMAN KARET (Hevea brasiliensis Muell.Arg.)

NURHAIMI

Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Agronomi Institut Pertanian Bogor

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006

Judul Disertasi

:

Ekspresi Gen-Gen Responsif terhadap Corynespora cassiicola pada Tanaman Karet (Hevea brasiliensis, Muell. Arg.)

Nama

:

Nurhaimi

Nomor Pokok

:

P03600007

Program Studi

:

Agronomi

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc. Ketua

Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Anggota

Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. Anggota

Dr. Nurita Toruan-Mathius, M.S.

Dr. Ir. Agus Purwantara

Anggota

Anggota

Diketahui Ketua Program Studi Agronomi

Dr. Ir. Satriyas Ilyas, M.S.

Tanggal Ujian: 25 April 2006

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.S.

Tanggal Lulus: ……………………

PRAKATA Puji dan syukur yang tak terhingga penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Disertasi ini memuat 6 bab, beberapa bab merupakan pengembangan dari naskah artikel yang diajukan ke jurnal ilmiah. Terdapat 2 bab yang telah diterbitkan di jurnal ilmiah, yaitu bab 3 dengan judul “Kemiripan Genetik Klon Karet (Hevea brasiliensis) Berdasarkan Metode Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLP)” (Menara Perkebunan No. 1, 2003) dan Bab 4 dengan judul “Konstruksi Pustaka cDNA dari Daun Klon Karet AVROS 2037 yang Diinfeksi Corynespora cassiicola” (Menara Perkebunan No 2, 2005). Ucapan terima kasih dan penghargaan disampaikan kepada Komisi Pembimbing, Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor, M.Sc. selaku Ketua serta Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., Dr. Nurita ToruanMathius, M.S. dan Dr. Ir. Agus Purwantara, masing-masing sebagai Anggota, yang memberikan arahan dan dorongan sehingga disertasi ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada: 1. Ketua Komisi Pembinaan Tenaga Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian dan Pimpinan beserta Staf Proyek PAATP Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian atas kesempatan dan dukungan dana yang diberikan kepada penulis selama mengikuti pendidikan S3. 2. Direktur Eksekutif Lembaga Riset Perkebunan Indonesia, Kepala Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia atas izin yang diberikan kepada penulis untuk menempuh pendidikan S3. 3. Dekan Sekolah Pascasarjana beserta staf, Ketua Program Studi Agronomi Sekolah Pascasarjana IPB, dan seluruh staf pengajar yang telah membekali dan memperkaya penulis dengan berbagai ilmu. 4. Dr. Pascal Montoro dan Dr. Valerie Pujade-Renaud (CIRAD-Montpellier, Perancis) atas bantuan serta supervisi bagian akhir penelitian yang dilaksanakan di laboratorium CIRAD Montpelier. 5. Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup serta Dr. Ir. Didiek Hadjar Goenadi, M.Sc, APU dan Dr. Ir. Suharsono DEA, selaku Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka. 6. Rekan-rekan mahasiswa S3 Program Studi Agronomi, Sekolah Pascasaarjana IPB atas kerjasamanya dalam proses penyelesaian studi dan disertasi ini. 7. Dr. Aron Situmorang (Balai Penelitian Karet Sembawa) dan rekan-rekan di laboratorium Biologi Molekuler BPBPI yang senantiasa memberikan perhatian dan dukungan penuh selama penelitian dan penulisan berlangsung. Penghargaan dan terima kasih penulis sampaikan kepada suami tercinta Dr. Ir. Uhendi Haris, M.Si., ananda Pramita Fitri, Risa Guntari dan Farid Rahman Permana atas segala pengertian, kesabaran dan dorongan yang diberikan selama penulis menempuh pendidikan. Terima kasih kepada adik-adik tersayang yang senantiasa menunjukkan toleransi selama penulis menghadapi masa -masa berat penyelesaian pendidikan. Terima kasih tak terhingga penulis sampaikan kepada ayahanda Nursad Sutan Mangkuto dan ibunda Hainah Karim, berkat didikan beliaulah penulis mampu menempuh pendidikan formal hingga jenjang tertinggi. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juni 2006 Nurhaimi

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Padang Panjang, Sumatera Barat pada tanggal 15 Mei 1958 sebagai anak pertama dari tujuh bersaudara, dari pasangan Nursad Sutan Mangkuto dan Hainah Karim. Menikah dengan Dr. Ir. Uhendi Haris, M.Si., peneliti di Balai Penelitian Teknologi Karet Bogor, penulis dikarunia 3 orang anak yakni Pramita Fitri (19), Risa Guntari (16) dan Farid Rahman Permana (10). Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Negeri No. 1 Padang Panjang pada tahun 1970, sekolah menengah pertama di SMP Negeri No. 1 Padang Panjang pada tahun 1973, dan sekolah menegah atas di SMA Negeri 1 Bukittinggi (Sumatera Barat) pada tahun 1976. Pada tahun 1977 melalui saringan ujian masuk SKALU (Sistem Kerjasama Antar Lima Universitas), penulis diterima di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan lulus sebagai Sarjana Biologi pada tahun 1983. Tahun 1991 penulis mendapat kesempatan mengikuti International Training Course in Biotechnology of Tropical Crops di South China Academy of Tropical Crops (SCATC), Hainan, RRC. Dua tahun kemudian penulis mendapat kesempatan yang sama untuk mengikuti Plant Tissue Culture Training Program di Queensland University of Technology, Brisbane, Australia. Dengan dana beasiswa dari Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, pada tahun 1996 penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan pascasarjana S2 pada Program Studi Bioteknologi di Institut Pertanian Bogor dan lulus tahun 1999. Pada tahun 2000 penulis melanjutkan pendidikan S3 di Program Studi Agronomi, Institut Pertanian Bogor, dengan pendalaman minat pada Biologi Molukuler melalui pendanaan dari proyek PAATP, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Melalui proyek yang sama penulis mendapat kesempatan untuk melakukan bagian akhir penelitian ini di laboratorium CIRAD, Montpellier, Perancis dari awal September sampai akhir November 2005. Penulis mulai bekerja tahun 1984 di Pusat Penelitian Karet yang lokasinya berada di Sungei Putih, Sumatera Utara. Setelah terjadi re-organisasi Balai-Balai Penelitian Perkebunan, mulai tahun 1993 penulis bertugas sebagai staf peneliti dalam kelompok Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika Tanaman di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia yang berkedudukan di Bogor.

DAFTAR ISI Halaman DAFTA R TABEL …………………………………………………………..

xi

DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………….

xiii

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………..

xv

1. PENDAHULUAN ……………………………………………………….. Latar Belakang ………………………………………………………. Tujuan Penelitian ……………………………………………………. Ruang Lingkup Penelitian ………………………………………….. Manfaat Penelitian …………………………………………………..

1 1 8 9 11

2. PERKEMBANGAN GEJALA PENYAKIT DAN PENGUJIAN TINGKAT RESISTENSI KLON KARET (Hevea brasiliensis) TERHADAP INFEKSI Corynespora cassiicola ………………………… Abstrak ……………………………………………………………… Pendahuluan ………………………………………………………… Bahan dan Metode …………………………………………………... Hasil …………………………………………………………………. Perkembanga n Gejala Penyakit Gugur Daun …………………….. Tingkat Resistensi Sepuluh Klon Karet terhadap Infeksi C. cassiicola ……………………………………………………… Pembahasan …………………………………………………………. Kesimpulan …………………………………………………………..

12 12 12 16 19 19 20 21 26

3. ISOLASI DNA DAN KEMIRIPAN GENETIK SEPULUH KLON KARET BERDASARKAN METODE AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP) ………………………………….... Abstrak ……………………………………………………………... Pendahuluan ……………………………………………………….. Bahan dan Metode ………………………………………………….. Hasil ………………………………………………………………… DNA daun karet …………………………………………………. Modifikasi visua lisasi produk AFLP ……………………………. AFLP dari DN A asal daun karet ………………………………... Pembahasan ………………………………………………………… Kesimpulan ………………………………………………………….

27 27 27 30 36 36 37 39 42 48

4. KONSTRUKSI PUSTAKA cDNA DARI DAUN KARET KLON AVROS 2037 YANG DIINFEKSI DENGAN CENDAWAN PATOGEN Corynespora cassiicola ………………………………………………… Abstrak …………………………………………………………….. Pendahuluan ………………………………………………………... Bahan dan Metode …………………………………………………..

50 50 50 53

ix

Hasil ………………………………………………………………… RNA dan cDNA dari daun karet klon AVROS 2037 ……………. Fraksinasi cDNA ………………………………………………… Waktu kultur dan seleksi vektor modifikasi …………………… Konstruksi pustaka cDNA pada vektor pGEM-T Easy-Oligo Sfi . Pembahasan ………………………………………………………… Kesimpulan …………………………………………………………. 5. PENGUJIAN METODE cDNA-AFLP NON-RADIOAKTIF UNTUK IDENTIFIKASI TRANSKRIP ASAL DAUN KARET ………………… Abstrak …………………………………………………………….. Pendahuluan ……………………………………………………….. Bahan dan Metode ………………………………………………….. Hasil ………………………………………………………………… Isolasi RNA total dan mRNA serta sintesis cDNA dari daun karet ………………………………………………………... cDNA-AFLP menggunakan pasangan enzim restriksi EcoRI-MseI ………………………………………………………. cDNA-AFLP menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI ………………………………………………………… Seleksi primer selektif untuk cDNA-AFLP menggunakan enzim restriksi VspI-Taq I ………………………………………………. Pembahasan ………………………………………………………… Kesimpulan …………………………………………………………. 6. IDENTIFIKASI TRANSKRIP PADA TANAMAN KARET YANG DIEKSPRESIKAN DALAM INTERAKSI DENGAN CENDAWAN PATOGEN Corynespora cassiicola MELALUI ANALISIS cDNAAFLP …………………………………………………………………….. Abstrak ……………………………………………………………... Pendahuluan ………………………………………………………... Bahan dan Metode ………………………………………………….. Hasil …………………………………………………………… ….. Optimasi isolasi RNA dan sintesis cDNA dari daun karet ………. Analisis cDNA-AFLP …………………………………………… Isolasi dan kloning fragmen asal transkrip ………………………. Analisis sekuen terhadap fragmen cDNA yang diisolasi ………... Pembahasan ………………………………………………………... Kesimpulan …………………………………………………………

64 64 66 66 68 73 76 77 77 77 80 86 86 88 89 92 93 98

99 99 100 102 112 112 118 120 124 128 134

7. PEMBAHASAN UMUM ………………………………………………... 135 8. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………………..

144

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………….. 146

x

DAFTAR TABEL Halaman 1 Perkembangan gejala penyakit gugur daun pada klon karet PR 300, AVROS 2037 dan PPN 2444 ………………………………………….

19

2 Gejala dan intensitas penyakit pada pengujian terkontrol klon karet terhadap cendawan patogen C. cassiicola ……………………………..

21

3 Asal dan tetua sepuluh klon karet ………………………………………

31

4 Pasangan primer EcoRI dan MseI untuk amplifikasi selektif DNA asal daun karet ………………………………………………………………

34

5 Program PCR untuk reaksi amplifikasi selektif pada analisis AFLP ….

35

6 Komposisi 6% poliakrilamid gel untuk dua macam ukuran gel ………..

35

7 Jumlah fragmen DNA teramplifikasi dengan 10 pasang primer AFLP pada 10 klon karet …………………………………………………….

41

8 Perbandingan a ntara vektor dengan cDNA sisipan …………………….

63

9 Jumlah koloni E. coli DH5α selama waktu kultur …………………….

67

10 Perbandingan molaritas vektor dan cDNA sisipan dalam proses ligasi ..

68

11 Jumlah koloni hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media seleksi serta titernya …………………………………………………………….

69

12 Susunan oligonukleotida adapter, primer preselektif dan primer selektif untuk cDNA yang dipotong dengan enzim restriksi EcoRI-MseI ……...

82

13 Susunan oligonukleotida adapter, primer preselektif dan primer selektif untuk cDNA yang dipotong dengan enzim restriksi Vsp I-Taq I ………

84

14 Konsentrasi dan kemurnian RNA total hasil isolasi dari daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444 ………………………………………….

87

15 Pasangan primer selektif untuk amplifikasi cDNA-AFLP klon PPN 2444 …………………………………………………………………….

93

16 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA dari daun klon AVROS 2037 dan PPN 24 pada beberapa waktu setelah inokulasi dengan Corynespora cassiicola menggunakan kit Plant RNA Reagent ..

xi

116

17 Kombinasi sekuen primer VspI dan TaqI dalam amplifikasi selektif cDNA asal daun karet menggunakan metode cDNA-AFLP …………...

118

18 Pola ekspresi dan ukuran fragmen cDNA pada gel poliakrilamid ……... 123 19 Analisis sekuen TDF yang diperoleh melalui analisis cDNA-AFLP dari daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444 ………………………….

xii

127

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Alir penelitian, tujuan dan hasil yang diharapkan pada setiap tahapan penelitian ……………………………………………………

10

2 Pembentukan miselia Corynespora cassiicola pada media ASK dan pembentukan konidia pada permukaan daun ………………………..

17

3 Penampakan gejala penyakit gugur daun pada klon karet resisten (AVROS 2037) dan rentan (PPN 2444) akibat infeksi C. cassiicola …

20

4 Sensitivitas DNA hasil isolasi terhadap pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI …………………………………………………………

37

5 Pola AFLP pada gel poliakrilamid ukuran 7 x 9 cm (I) dan 12 x 14,5 cm (II) dengan pewarnaan perak nitrat ……………………………….

38

6 Produk AFLP dengan primer EACC-MCTA dan EACT -MCAG pada DNA daun 10 klon karet ………………………………………………

40

7 Dendrogram kemiripan genetik 10 klon karet berdasarkan analisis AFLP menggunakan 10 pasang primer selektif ………………………

41

8 Peta vektor pGEM-T Easy …………………………………………….

61

9 RNA total dan cDNA dari daun karet klon AVROS 2037 ……………

65

10 Fraksinasi fragmen cDNA pada 1,1% gel agarose menggunakan klom CHROMA SPIN-400 …………………………………………………

66

11 Pemotongan plasmid pGEM -T Easy-Oligo Sfi dengan enzim restriksi Rsa I dan Sfi I …………………………………………………………

67

12 Replika contoh koloni hasil transformasi vektor rekombinan pada bakteri E. coli DH5α …………………………………………………

70

13 Amplifikasi contoh koloni dengan primer T7 dan SP6 pada 2% gel agarose dengan pewarnaan etidium bromida ………………………....

71

14 Distribusi ukuran cDNA sisipan pada pustaka cDNA dari daun klon karet AVROS 2037 ……………………………………………………

72

15 RNA total dan cDNA dari daun karet …………………………………

87

16 Hasil cDNA-AFLP klon PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi EcoRI-MseI dengan 20 kombinasi pasangan primer selektif ..

88

xiii

17 Hasil cDNA-AFLP klon AVROS 2037 dan PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI dengan 4 kombinasi pasangan primer selektif …………………………………………………………

90

18 Hasil cDNA-AFLP klon AVROS 2037 dan PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI dengan variasi pada pengenceran hasil preamplifikasi dan Taq DNA polimerase ………………………

91

19 Hasil cDNA-AFLP klon PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI dengan 45 kombinasi pasangan primer selektif …

94

20 RNA total dari daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444 ……….

113

21 RNA dari daun klon AVROS 2037 dan PPN 2444 yang diisolasi dengan Plant RNA Reagent pada beberapa waktu setelah inokulasi petogen ………………………………………………………………...

115

22 Hasil preamplifikasi cDNA menggunakan primer standar VspI dan TaqI dengan tiga cara penyiapan RNA ………………………………..

117

23 Pola transkrip klon karet resisten terhadap C. cassiicola (AVROS 2037, A) dan rentan (PPN 2444, P) berdasarkan analisis cDNA-AFLP dengan 4 kombinasi primer (V16/T16, V16/T17, V16/T19, V16/T20)..

121

24 Pola transkrip klon karet resisten terhadap C. cassiicola (AVROS 2037, A) dan rentan (PPN 2444, P) berdasarkan analisis cDNA-AFLP dengan 2 kombinasi primer (V16/T21, V16/T24)……………………..

122

25 Hasil re -amplifikasi fragmen cDNA menggunaka n primer yang sesuai untuk masing-masing fragmen (V16/T21)……………………………..

124

26 Hasil PCR koloni 35 fragmen cDNA dengan primer SP6/T7, 5 sampel untuk setiap fragmen …………………………………………………..

125

27 Hasil PCR koloni 35 fragmen cDNA dengan primer SP6/T7, 5 sampel untuk setiap fragmen …………………………………………………..

126

xiv

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Pengelompokan Transcript-Deriv ed Fragment (TDF) asal daun karet berdasarkan kesamaan sekuennya ……………………………………..

157

2 BlastX fragmen cDNA asal daun karet ………………………………..

160

xv

BAB 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Karet (Hevea brasiliensis Muell.Arg.) adalah salah satu tanaman tahunan penting, karena di antara spesies Hevea yang ada hanya spesies tersebut menghasilkan getah (lateks) dengan kualitas baik, yang dikenal sebagai karet alam. Bagi Indonesia, tanaman karet memiliki arti ekonomi dan sosial yang amat penting ditinjau dari luasnya areal pertanaman serta banyaknya petani, tenaga kerja dan pengusaha yang terlibat di dalam pengusahaan karet alam. Sampai tahun 2004, total areal perkebunan karet di Indonesia tercatat seluas ± 3,3 juta hektar dengan produksi mencapai hampir 2,1 juta ton. Sebagian besar produksi tersebut diekspor dalam bentuk bahan mentah atau setengah jadi, dengan nilai mencapai sekitar 2,2 milyar US dolar (Ditjenbun 2004; Gapkindo 2005). Dengan produksi seperti di atas maka Indonesia tercatat sebagai negara penghasil karet alam nomor dua terbesar di dunia, setelah Thailand. Di dalam budidayanya, tanaman karet dihadapkan pada serangan patogen yang berperan besar dalam penurunan produksi serta dapat meningkatkan biaya produksi.

Oleh karena itu tujuan pemuliaan tanaman karet di samping

menghasilkan genotipe unggul dari segi produksi juga untuk menghasilkan genotipe tahan penyakit. Salah satu cendawan patogen pada tanaman karet adalah Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei penyebab penyakit gugur daun. Pentingnya penyakit tersebut ditandai oleh kemampuan patogen untuk menyerang pada berbagai tingkat perkembangan daun dan tingkat perkembangan tanaman (Chee 1988).

Apabila kondisi lingkungan mendukung, serangan dapat terjadi

sepanjang tahun sehingga sangat mempengaruhi pertumbuhan serta produksi tanaman. Patogen tersebut memiliki kisaran inang cukup luas karena terdapat pada tanaman lain seperti kedelai, ubi jalar dan pepaya. Gambaran kerugian ekonomis yang nyata akibat gangguan C. cassiicola nampak dari banyaknya tanaman karet yang telah dibongkar. Di Indonesia saja,

2 dalam kurun waktu 1980 – 1988 sekitar 1.200 ha tanaman karet terserang berat, 400 ha di antaranya dibongkar dan dimusnahkan (Sinulingga et al. 1996). Di Sri Lanka pembongkaran tanaman karet yang terserang oleh patogen yang sama mencapai 4.600 ha (Jayasinghe dan Silva 1996).

Dari penelitian terdahulu

(Situmorang dan Budiman 1984) diperkirakan bahwa serangan C. cassiicola dapat menurunkan produksi hingga 20%. Dengan produksi 2,1 juta ton per tahun maka secara nasional penyakit ini berpotensi menyebabkan kehilangan produksi sekitar 420.000 ton. Membaiknya harga karet dunia belakangan ini, yaitu mencapai sekitar 2 US dolar per kg menyebabkan potensi kerugian tersebut setara dengan nilai sekitar 840 juta US dolar per tahun. Dari berbagai laporan diketahui bahwa klon karet memiliki kisaran respon yang sangat luas terhadap serangan patogen tersebut, mulai dari yang terinfeksi berat sampai sama sekali tidak terinfeksi. Klon RRIC 103, KRS 21 dan RRIM 725 yang masuk ke Indonesia melalui Pertukaran Klon Internasional pada tahun 1974 tercatat sebagai klon yang sangat rentan, demikian juga klon seri PPN seperti PPN 2058, PPN 2444, dan PPN 2447 yang merupakan hasil seleksi lokal (Sinulingga et al. 1996; Suwarto et al. 1996). Hadi (2003) melaporkan bahwa beberapa klon seperti AVROS 2037, BPM 24, PPN 2058, PPN 2447, PR 300, PR 303, RRIC 110, RRIM 600 dan RRIM 712 memperlihatkan respon yang berbeda terhadap masing-masing isolat virulen. Akan tetapi beberapa klon seperti BPM 1, PB 260, PR 261, RRIC 100 dan RRIM 712 selalu menunjukkan respon ketahanan yang tinggi sedangkan klon PPN 2444 dan RRIC 103 selalu memberikan respon sangat rentan terhadap setiap isolat C. cassiicola yang diuji. Di samping jenis klon karet dan isolat patogen, tingkat keparahan penyakit juga ditentukan oleh kondisi lingkungan.

Situmorang (2002) mengemukakan bahwa berdasarkan

kondisi iklim, Sumatera dan Kalimantan Selatan merupakan daerah yang kondusif bagi berkembangnya penyakit gugur daun Corynespora. Salah satu cara mencegah kerugian yang ditimbulkan oleh Corynespora adalah dengan menanam klon resisten pada pertanaman karet komersial. Masalahnya adalah terjadinya kecenderungan perubahan resistensi tanaman di lapang. Contoh sangat nyata terdapat pada klon RRIM 600 di Malaysia, yang awalnya diketahui terinfeksi ringan kemudian dilaporkan terinfeksi sangat berat

3 oleh C. cassiicola (Tan et al. 1992). Klon RRIM 600 yang ditanam di Sumatera, Riau dan Jambi juga mengalami kerusakan berat akibat serangan patogen tersebut (Situmorang 2002). Di Indonesia, kasus serupa ditemukan pada klon GT 1 yang merupakan klon anjuran skala besar dan telah ditanam secara luas, namun ternyata tingkat resistensinya berubah terhadap infeksi patogen tersebut (Sinulingga et al. 1996; Situmorang et al. 1996). Oleh karena itu untuk mengontrol penyakit secara lebih terarah, upaya untuk mengetahui hal yang mendasari resistensi klon-klon tertentu terhadap infeksi Corynespora perlu dilakukan. Dalam interaksi H. brasiliensis/C. cassiicola dilaporkan bahwa penetrasi cendawan terjadi dalam waktu 12 jam setelah inokulasi dan tidak terdapat perbedaan kecepatan penetrasi pada klon resisten dan rentan (Breton et al. 2000). Patogen berarti mampu menembus lapisan epidermis daun, baik pada klon resisten maupun klon rentan, namun respon selanjutnya berbeda antara kedua jenis klon tersebut. Serangan pada klon rentan menyebabkan kerusakan pada sel epidermis, nukleus dan organel lain sehingga menimbulkan kerusakan parah pada daun. Pada klon resisten kolonisasi cendawan terbatas hanya pada beberapa sel di sekitar hifa cendawan. Sejauh ini dilaporkan bahwa C. cassiicola menghasilkan toksin, pertama kali diketahui melalui perlakuan filtrat kultur pada daun tomat (Onesirosan et al. 1975). Hal yang sama juga dikemukakan oleh Liyanage dan Liyanage (1986), Purwantara (1987), Suwarto (1989), dan Breton et al. (1996). Toksin ini kemudian disebut sebagai ‘cassiicoline’ yang merupakan host-selective toxins (HST), hanya toksik terhadap tanaman tertentu (rentan), namun tidak toksik terhadap tanaman resisten atau tanaman bukan inang (Breton et al. 2000). Cassiicoline yang dihasilkan oleh C. cassiicola merupakan glikoprotein , larut dalam air , memiliki berat molekul sekitar 6,5 kDa dan tersusun ata s 23 residu asam amino (Breton et al. 1996).

Seperti kebanyakan HST lainnya,

cassiicolin e diduga merupakan faktor penentu utama patogenisita s C. cassiicola . Hal ini didukung oleh fakta bahwa kerentanan terhadap toksin sejalan dengan kerentanan terhadap cendawan penghasil toksin, dan sebaliknya, resistensi terhadap toksin sejalan dengan resistensi terhadap cendawannya (Breton et al. 2000). Belum pernah dilaporkan klon Hevea resisten terhadap cendawan namun rentan terhadap toksin yang diproduksi oleh cendawan tersebut, atau sebaliknya.

4 Di samping C. cassiicola, sejauh ini telah dikenal sebanyak 20 jenis cendawan lain penghasil HST, dan HST tersebut bervariasi mulai dari senyawa dengan berat molekul rendah sampai dengan protein.

Toksin yang demikian

dikenal sebagai ‘agen kompatibilitas’ karena merusak tanaman dan kerusakan tersebut memfasilitasi patogenesis yang ditunjukkan melalui induksi kematian sel inang (Walton 1996).

Pada sebagian besar kasus, sensitivitas tanaman inang

terhadap suatu HST ditentukan oleh gen tunggal, dan penyakit tidak akan muncul apabila tidak ada sensitivitas terhadap toksin tersebut (Wolpert et al. 2002). Sebagai contoh adalah sensitivitas tanaman gandum terhadap viktorin, suatu HST yang dihasilkan oleh cendawan Cochliobolus victoriae, penyebab penyakit Victoria blight pada tanaman tersebut. Adanya sensitivitas yang ditunjukkan oleh kerentanan tanaman terhadap patogen dikendalikan oleh alel dominan pada lokus Vb. Semua genotipe Vb dominan, sensitif terhadap viktorin dan rentan terhadap patogennya, sedangkan semua genot ipe homozigot resesif (vb vb) tidak sensitif terhadap viktorin dan tanaman resisten.

Dengan demik ian penyakit Victoria

blight hanya tejadi apabila isolat C. victoriae menghasilkan viktorin dan tanaman gandum membawa alel dominan pada lokus Vb. Demikian juga pada AAL toksin, yaitu suatu HST yang diproduksi oleh Alternaria alternate f. sp. lycopersici, suatu cendawan patogen penyebab kanker batang pada tanaman tomat (Gilchrist dan Grogan 1976). Lokus Asc menentukan resistensi terhadap penyakit maupun sensitivitas terhadap toksin.

Genotipe

homozigot dominan memiliki sifat resisten, genotipe homozigot resesif sangat sensitif dan genotipe heterozigot bersifat intermediet (Clouse dan Gilchrist 1987). Penelitan yang lebih rinci telah dilakukan pada interaksi tanaman jagung dengan cendawan patogen Cochliobolus carbonum ras 1 yang menghasilkan HCtoksin, penyebab penyakit ‘leaf spot’ dan ‘ear rot’ pada jagung. Resistensi tanaman jagung terhadap patogen tersebut ditentukan oleh alel dominan pada lokus Hm1. Gen Hm1 menyandikan suatu karbonil reduktase, yaitu HC-toksin reduktase (HCTR) (Johal dan Briggs 1992) yang memiliki kemampuan untuk menginaktivasi toksin melalui reaksi enzimatik dengan cara reduksi (Meeley et al. 1992; Meeley dan Walton 1991). Dari serangkaian penelitian telah dibuktikan bahwa HCTR langsung disandikan oleh gen Hm1 yang terdapat pada genotipe

5 jagung resisten sedangkan pada tanaman rentan toksin menginduksi gejala penyakit melalui penghambatan histon deasetilase (Brosch et al. 1995). Inaktivasi toksin yang diproduksi oleh patogen juga telah dilaporkan pada bakteri Pantoea dispersa SB1403, yang mampu mendetoksifikasi albicidin, suatu toksin yang dihasilkan oleh Xanthomonas albilineans penyebab penyakit ‘leaf scald ’ pada tanaman tebu.

Produk gen albD pada P. dispersa yaitu protein AlbD,

menunjukkan aktivitas esterase yang sangat kuat dan mampu mendetoksifikasi albicidin (Zhang dan Birch 1997). Molekul atau gen yang berperan dalam resistensi klon karet terhadap C. cassiicola sampai sejauh ini belum diketahui, namun berdasarkan penelitian Breton et al. (2000), terdapat indikasi bahwa resistensi kemungkinan diperoleh melalui detoksifikasi toksin seperti pada kasus HC-toksin dan albicidin. Hal ini diperkuat oleh hasil penelitian Suwarto (2003), yang menginformasikan bahwa toksin asal C. cassiicola dapat diinaktifkan secara in vitro oleh beberapa senyawa pereduksi seperti N2 S2 O4 dan 2-merkaptoetanol serta oleh serum B lateks asal klon rentan IAN 873. memiliki

senyawa

Hal ini mengindikasikan bahwa klon karet tertentu

yang

bersifat

sebagai

antitoksin

sehingga

mampu

menginaktifkan toksin yang dip roduksi oleh patogen. Oleh karena itu dengan mempelajari transkrip/gen yang diekspresikan secara diferensial pada saat terjadinya interaksi inang-patogen akan membuka peluang untuk mengidentifikasi transkrip/gen yang berperan dalam resistensi tanaman. cDNA-Amplified

Fragment

Length

Polymorphism

(cDNA-AFLP)

(Bachem et al. 1996; Bachem et al. 1998) yang didasarkan pada metode AFLP (Vos et al. 1995) adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi transkrip/gen yang diekspresikan secara diferensial.

Metode

tersebut melibatkan penggunaan kombinasi dua macam enzim restriksi, yaitu satu enzim yang mengenal enam sekuen (memotong jarang) dan enzim lainnya mengenal empat sekuen (memotong sering) pada genom target. Sekuen adapter diligasikan ke cDNA yang telah dipotong dan populasi cDNA diseleksi melalui amplifikasi dengan metode Polymerse Chain Reaction (PCR). Keistimewaan metode cDNA-AFLP di samping hasilnya dapat diulang dan stabil, adalah kemampuannya untuk mengidentifikasi gen yang terinduksi maupun tertekan

6 ekspresinya pada suatu percobaan yang sama. Selain itu metode tersebut menjadi populer untuk mengidentifikasi gen-gen baru karena tidak diperlukan informasi tentang sekuen genom tanaman. Pada interaksi Hevea/Corynespora, identifikasi transkrip dengan metode cDNA-AFLP dapat dilakukan dengan membandingkan pola ekspresi transkrip pada tanaman karet resisten maupun rentan selama beberapa waktu interaksi. Pemanfaatan metode cDNA-AFLP dalam studi ekspresi gen diawali dengan memberikan suatu tekanan berupa infeksi C. cassiicola virulen pada daun sehingga menginduksi ekspresi transkrip/gen yang berperan dalam resistensi maupun kerentanan tanaman karet. Daun tersebut merupakan sumber RNA serta mRNA, dan selanjutnya cDNA disintesis dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan.

Untuk mengidentifikasi transkrip yang terinduksi maupun tertekan

ekspresinya selama terjadi interaksi Hevea/Corynespora, digunakan daun yang diambil dari beberapa periode waktu setelah inokulasi. Strategi tersebut di atas telah banyak digunakan untuk mengidentifikasi gen-gen yang diekspresikan secara diferensial selama terjadi interaksi antara beberapa tanaman dengan patogennya (Cooper 2001; Durrant et al. 2000; Neveau et al. 2003; Petters et al. 2002; Santaella et al. 2004; Zhang et al. 2003). Di samping itu, gen-gen yang berperan dalam patogenisitas juga dapat diidentifikasi dengan metode yang sama, seperti pada Erwinia carotovora dan Xanthomonas campestris (Dellagi et al. 2000; Noel et al. 2001).

Beberapa transkrip asal

cendawan mirip dengan kitinase dan arabinitol dehidrogenase sedangkan transkrip asal tanaman menyerupai katanin dan cell enlargement protein (Zhang et al. 2003). Beberapa transkrip lain diinformasikan menyerupai heat shock protein seperti hsp 60, hsp 70, hsp 90 dan hsp 100 (Avrora et al. 2003). Walaupun metode cDNA-AFLP memiliki ke lebihan untuk digunakan dalam identifikasi gen, namun biasanya transkrip atau fragmen cDNA yang diperoleh tidak lengkap.

Ukuran transkrip/fragmen cDNA pada interaksi

kompatibel antara tanaman gandum dengan cendawan Puccinia triticina adalah antara 90 – 430 bp (Zhang et al. 2003) , sedangkan pada interaksi tanaman ubi kayu dengan Xanthomonas axonopodis pv. manihotis adalah antara 100 – 400 bp (Santaella et al. 2004). Beberapa strategi dapat digunakan untuk memperoleh full

7 length cDNA, di antaranya adalah melalui skrining tehadap pustaka (library) cDNA (Zhang et al. 2003), atau dengan metode Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) (van der Biezen 2000). Dalam rangkaian penelitian ini konstruksi pustaka cDNA yang berasal dari daun klon karet resisten yang diberi perlakuan patogen dilaksanakan dengan pertimbangan pada tahap lanjut pustaka tersebut dapat digunakan untuk memperoleh full length cDNA. Pustaka cDNA terdapat dalam bentuk klon-klon cDNA dan merupakan bank yang mengandung informasi genetik tanaman karet. Pustaka tersebut merepresentasikan gen-gen yang diekspresikan dalam suatu jaringan, waktu, atau kondisi tertentu.

Pustaka cDNA umumnya diperoleh

melalui proses kloning sehingga ratusan gen berbeda memungkinkan untuk dikoleksi dan diperbanyak secara terus menerus.

Selanjutnya cDNA spesifik

diseleksi dan ditapis (screening) melalui proses hibridisasi (Cowel 1998; Glick dan Pasternak 1994; Kleinsmith dan Kish 1995). Dalam konstruksi pustaka cDNA, DNA polimerase yang memerlukan RNA (RNA-dependent DNA polymerase ) yakni reverse transcriptase (RT) digunakan untuk meng-copy messenger RNA (mRNA) menjadi molekul complementary DNA (cDNA) utas ganda. Berbeda dengan mRNA yang dengan mudah terdegradasi dan menggambarkan proses transkripsi dari gen-gen yang aktif pada suatu jaringan atau sel tertentu, cDNA merupakan molekul yang lebih stabil sehingga sesuai untuk disisipkan ke dalam vektor kloning, baik berupa plasmid, cosmid, atau bakteriofage. Populasi mRNA yang telah di copy menjadi cDNA tersebut apabila diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang bersifat permanen. Keuntungan pustaka cDNA adalah hanya mengandung sekuen-sekuen yang terekspresi dalam bentuk mRNA dalam suatu kondisi atau waktu tertentu (Kleinsmith dan Kish 1995). Di samping itu, pustaka cDNA merupakan koleksi informasi genetik tanaman sehingga ketersediaannya akan sangat bermanfaat dalam studi ekspresi gen lainnya. Metode cDNA-AFLP maupun skrining pustaka cDNA berpelua ng untuk digunakan dalam mengidentifikasi dan mengisolasi transkrip yang diekspresikan secara diferensial dalam interaksi Hevea/Corynespora. Pendekatan penelitian ini diharapkan dapat membantu mengungkap transkrip atau bagian gen yang berperan

8 dalam sistem pertahanan klon karet tertentu terhadap cendawan C. cassiicola, penyebab penyakit gugur daun karet. Berdasarkan informasi tersebut diharapkan dapat diketahui mekanisme resistensi atau kerentanan pada tanaman karet sehingga dapat dijadikan landasan penyusunan strategi untuk mengontrol penyakit secara lebih terarah.

Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan transkrip/gen atau bagian gen yang diekspresikan secara diferensial pada klon karet resisten atau klon rentan sebagai respon terhadap infeksi cendawan C. cassiicola. Untuk mencapai tujuan tersebut dilakukan beberapa tahap penelitian sebagai berikut : (1)

Mengidentifikasi perkembangan gejala penyakit dan menetapkan tingkat resistensi beberapa klon karet melalui pengujian inokulasi cendawan C. cassiicola secara terkontrol menggunakan isolat patogen tertentu, sebagai salah satu dasar untuk penetapan waktu pengambilan sampel serta penentuan klon resisten dan rentan yang akan digunakan dalam studi ekspresi gen.

(2)

Menetapkan kemiripan genetik beberapa klon karet dengan tingkat resistensi berbeda melalui aplikasi metode AFLP untuk mengetahui latar belakang genetik klon karet yang diuji dan sebagai data pendukung untuk penentuan klon karet resisten dan rentan yang dipilih .

(3)

Mengembangkan metode cDNA-AFLP untuk tanaman karet, isolasi fragmen cDNA spesifik dan proses kloningnya pada vektor yang sesuai untuk digunakan dalam identifikasi transkrip pada tanaman karet.

(4)

Mengidentifikasi

dan

mengisolasi

fragmen

cDNA

spesifik

yang

diekspresikan secara diferensial pada saat terjadi interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola dalam upaya mendapatkan kandidat transkrip/gen atau bagian gen yang berperan dalam mekanisme resistensi tanaman karet terhadap patogen tersebut. (5)

Melakukan konstruksi pustaka cDNA dari daun karet sebagai sumber informasi genetik yang terkandung pada daun.

9 Ruang Lingkup Penelitian Berdasarkan tujuan penelitian yang akan dicapai, maka kegiatan penelitian untuk pengujian terkontrol tingkat resistensi klon karet dilaksanakan dengan menggunakan sepuluh klon karet (Hevea brasiliensis) yang di lapang telah diketahui tingkat resistensinya terhadap infeksi C. cassiicola. Sebagai patogen digunakan satu isolat virulen C. cassiicola yang telah teruji tingkat virulensinya terhadap berbagai klon karet yang ada. Selanjutnya analisis kemiripan genetik berdasarkan metode Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) dilaksanakan terhadap sepuluh klon karet yang sama.

Beberapa pelaksanaan

prosedur AFLP dimodifikasi terlebih dahulu untuk mendapatkan kondisi optimal yang sesuai bagi DNA tanaman karet. Dari analisis ini akan diperoleh informasi tentang tingkat kemiripan genetik klon karet resisten, moderat dan rentan yang diuji serta dapat ditentukan satu klon karet resisten dan satu klon rentan untuk digunakan dalam studi ekspresi gen. Untuk mengidentifikasi transkrip yang berperan dalam resistensi atau kepekaan klon karet terhadap C. cassiicola , digunakan analisis cDNA-AFLP. Analisis cDNA-AFLP dilakukan dengan membandingkan pola ekspresi antara klon karet resisten dan rentan dalam beberapa waktu setelah perlakuan inokulasi patogen. Fragmen cDNA yang diekspresikan secara diferensial, baik antara klon karet resisten dan rentan ataupun antara perlakuan waktu inokulasi patogen pada klon yang sama , akan diisolasi dari gel kemudian diklon pada vektor kloning dan dirunut sekuennya melalui proses sekuensing.

Sekuen fragmen cDNA akan

dilacak homologinya dengan sekuen yang telah dipublikasi di pangkalan data (database) Genbank sehingga diperoleh gambaran tentang kemungkinan peran transkrip tersebut dalam interaksi inang-patogen.

Di samping itu, konstruksi

pustaka cDNA dilakukan untuk menyediakan berbagai cDNA asal daun karet yang digunakan untuk mendapatkan full length cDNA melalui proses hibridisasi dengan fragmen cDNA kandidat yang diperoleh melalui analisis cDNA-AFLP. Alir penelitian, tujuan dan hasil yang diharapkan disajikan pada Gambar 1.

10 Ekspresi gen-gen responsif terhadap Corynespora cassiicola pada tanaman karet (Hevea brasiliensis Muell.Arg.) Tujuan : Mendapatkan transkrip/gen/bagian gen yang berhubungan dengan proes pertahanan tanaman karet terhadap C. cassiicola. Out put : Kandidat transkrip/gen/bagian gen yang berkorelasi dengan resistensi klon karet.

Percobaan 1. Perkembangan gejala penyakit dan pengujian tingkat resistensi klon karet terhadap infeksi C. cassiicola Tujuan : M endapatkan informasi tentang perkembangan gejala penyakit dan tingkat resistensi beberapa klon karet untuk penetapan waktu pengambilan sampel serta penentuan klon resisten dan rentan yang akan digunakan lebih lanjut

Out put :

Percobaan 2. Keragaman genetik sepuluh klon karet berdasarkan metode Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Tujuan : Klasifikasi klon karet yang memiliki resistensi berbeda terhadap C. cassiicola berdasarkan kemiripan genetik sebagai data pendukung penentuan klon resisten dan rentan yang akan digunakan lebih lanjut

Informasi tentang perkembangan gejala penyakit, tingkat resistensi, dan kemiripan genetik klon karet yang diuji sehingga dapat ditentukan klon resisten dan rentan yang akan digunakan dalam studi ekspresi gen

Percobaan 3. Pengujian metode cDNA-AFLP nonradioaktif untuk identifikasi transkrip asal daun karet Tujuan : M endapatkan kondisi visualisasi produk cDNA-AFLP asal daun karet Out put : Kondisi optimum yang dapat diterapkan untuk analisis cDNA-AFLP asal daun karet

Percobaan 5. Identifikasi transkrip pada tanaman karet yang diekspresikan dalam interaksi dengan cendawan Corynespora cassiicola melalui analisis cDNA-AFLP Tujuan : Identifikasi transkrip/gen/bagian gen yang berhubungan dengan resistensi maupun sensitivitas klon karet terhadap infeksi C. cassiicola Out put : Kandidat transkrip.gen/bagian gen yang berhubungan dengan mekanisme resistensi klon karet terhadap cendawan C. cassiicola.

Percobaan 4. Konstruksi pustaka cDNA dari daun karet klon AVROS 2037 yang diinfeksi dengan C. cassiicola Tujuan : M enyediakan material genetik asal daun klon karet resisten Out put : D iperolehnya pustaka cDNA yang merepreseantasik an gen yang diekspresikan dalam kondisi tertentu

Gambar 1. Alir penelitian, tujuan dan output pada setiap tahap penelitian

11 Manfaat Penelitian Dalam beberapa tahun terakhir ini, terutama dengan berkembang pesatnya teknik-teknik dalam bidang biologi molekuler, berbagai penelitian untuk memahami mekanisme yang mendasari resistensi atau kerentanan tanaman tertentu terhadap infeksi suatu patogen telah banyak dilakukan. Pengetahuan tersebut digunakan sebagai dasar untuk mengatasi serangan patogen secara lebih terarah dan lebih efisien. Namun analisis molekul yang mendasari resistensi atau kerentanan klon karet terhadap infeksi cendawan C. cassiicola belum mendapat perhatian yang cukup sehingga sampai saat ini belum diperoleh informasi yang memadai tentang dasar variasi tingkat resistensi berbagai klon karet di lapang. Dengan adanya potensi kehilanga n produksi secara nasional yang mencapai sekitar 420.000 ton per tahun atau setara dengan nilai sekitar 840 juta US dolar maka pemahaman akan mekanisme resistensi tanaman akan sangat berarti di dalam menetapkan strategi penanggulangan penyakit secara efisie n dan lebih terarah sehingga timbulnya kerugian dapat dicegah. Di samping itu, sebagai negara penghasil karet alam nomor dua terbesar di dunia, Indonesia berkepentingan terhadap pengembangan pengetahuan dalam bidang perkaretan, termasuk dalam pengembangan ilmu-ilmu dasar, yang pada tahap lanjut diharapkan dapat diaplikasikan untuk peningkatan kualitas tanaman karet di masa yang akan datang. Hasil penelitian ini diharapkan dapat membuka minat para peneliti lain untuk meningkatkan pengetahuan tentang basis molekul yang mendasari interaksi inang-patogen pada tanaman karet dengan C. cassiicola . Sekuen transkrip/gen atau bagian gen yang diperoleh dalam penelitian ini dapat dimanfaatkan dalam merancang primer spesifik untuk mendapatkan gen utuh dari transkrip tersebut.

Apabila pada tahap lanjut terbukti bahwa gen

tersebut selalu berkorelasi dengan mekanisme resistensi klon karet terhadap infeksi C. cassiicola , maka dapat digunakan sebagai penanda (marka) resistensi dalam program pemuliaan karet.

Penggunaan marka genetik jauh lebih

menguntungkan karena marka diwariskan dan tingkat akurasinya lebih tinggi dibandingkan dengan marka fenotipik yang selama ini dipakai, serta seleksi dapat dilakukan pada tahap awal pertumbuhan tanaman. Dengan demikian maka siklus pemuliaan tanaman karet dapat diperpendek.

12 Di samping sebagai marka , gen tersebut juga dapat diintroduksikan ke berbagai klon karet yang memiliki potensi produksi tinggi namun rentan terhadap C. cassiicola , sehingga klon dengan produksi tinggi tersebut akan memiliki sifat positif lainnya yaitu resisten terhadap patogen. Secara keseluruhan penerapan hasil penelitian ini untuk riset-riset mendatang yang ditujukan untuk memperbaiki kualitas tanaman karet akan berdampak positif terhadap perkembangan indus tri perkaretan di tanah air.

BAB 2 PERKEMBANGAN GEJALA PENYAKIT DAN PENGUJIAN TINGKAT RESISTENSI KLON KARET (Hevea brasiliensis) TERHADAP INFEKSI Corynespora cassiicola ABSTRAK Corynespora cassiicola memiliki kemampuan menginfeksi daun tanaman karet dan menyebabkan penyakit gugur daun. Studi ekspresi gen untuk mempelajari transkrip atau gen yang berperan dalam resistensi klon karet terhadap C. cassiicola memerlukan informasi tentang perkembangan gejala penyakit serta tingkat resistensi klon. Oleh karena itu dalam percobaan ini evaluasi dilakukan terhadap kedua hal tersebut. Informasi yang diperoleh digunakan sebagai salah satu dasar untuk menentukan waktu pengambilan sampel serta jenis klon resisten dan rentan yang dapat dipilih untuk studi ekspresi gen selanjutnya. Penga matan perkembangan gejala penyakit dilakukan terhadap tiga klon, yaitu klon AVROS 2037, PR 300 dan PPN 2444, sedangkan pengujian tingkat resistensi klon dilakukan terhadap sepuluh klon yaitu klon AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873. Isolat C. cassiicola cGT1 SS yang telah teruji virulensinya digunakan untuk menginfeksi daun karet umur dua minggu pada bibit di polibeg yang pertumbuhannya telah memiliki dua unit daun. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gejala berupa bercak mulai terlihat hari kedua setelah daun diinokulasi dengan konidia C. cassiicola, baik pada klon resisten maupun rentan. Perkembangan gejala berlanjut pada klon rentan sampai akhirnya lebih dari setengah daun mengalami nekrosis, namun gejala terhenti atau tidak berlanjut pada klon resisten. Intensitas penyakit dari klon karet yang diuji berkisar antara 0%-86%. Berdasarkan intensitas penyakit tersebut, klon karet dapat dikelompokkan menjadi sangat resisten (BPM 1), resisten (IRR 100, RRIC 100, AVROS 2037, PR 255), moderat rentan (RRIM 600), dan sangat rentan (RRIC 103, PPN 2444, IAN 873). Kata kunci: Penyakit gugur daun, Corynespora cassiicola, intensitas penyakit, tingkat resistensi, Hevea brasiliensis.

PENDAHULUAN Corynespora cassiicola yang termasuk ke dalam famili Dematiaceae, kelas Deuteromycetes adalah cendawan patogen penyebab penyakit gugur daun pada tanaman karet. Penyakit tersebut pertama kali dideteksi di Indonesia pada tahun 1980-an, terdapat di kebun percobaan dan kebun komersil yang ada di

14 Sumatera dan Jawa (Soepena 1983; Situmorang dan Budiman 1984; Hadi et al. 1990). Belakangan dilaporkan bahwa patogen yang sama terdapat pada hampir semua wilayah pertanaman karet di Indonesia, karena juga ditemukan di Kalimantan Barat dan Kalimantan Selatan (Suwarto et al. 1996; Sinulingga et al. 1996; Situmorang 2002). Penyakit gugur daun dapat menimbulkan kerugian yang amat be sar pada perkebunan karet karena serangan pada klon rentan menyebabkan pengguguran daun secara terus menerus sehingga tajuk tanaman menjadi gundul. Keadaan yang demikian menyebabkan tanaman mengalami pertumbuhan yang sangat terhambat dan apabila serangan terjadi pada tanaman belum menghasilkan maka kriteria matang sadap sangat sulit dicapai sehingga lateks sebagai produk utama dari pohon karet tidak dapat dipanen.

Serangan pada tanaman dewasa

menyebabkan penurunan produksi lateks secara nyata, dapat mencapai 20 persen, dan apabila serangan berlanjut dapat menyebabkan kematian tanaman secara total (Sabu et al. 2000; Situmorang dan Budiman 1984; Soepena et al. 1996). Daun adalah organ utama yang diserang oleh C. cassiicola , meskipun dilaporkan juga bahwa infeksi dapat terjadi pada bagian lain tanaman seperti tangkai daun, pucuk serta ranting dan cabang tanaman (Wei 1950; Soepena 1983, Situmorang dan Budiman 1984). Gejala awal serangan terlihat berupa bercak coklat atau hitam pada helaian daun yang menandakan bahwa patogen telah melakukan penetrasi ke jaringan daun. Selanjutnya C. cassiicola mensekresikan toksin ‘cassiicoline’, yang merupakan suatu host-selective toxin (HST) (Breton et al. 1996; Liyanage dan Liyanage 1986). Kemampuan C. cassiicola berkembang secara efisien di dalam jaringan daun ditentukan oleh berbagai faktor, antara lain jenis klon yang ber korelasi dengan sifat genetik tanaman serta tingkat virulensi patogen yang berkorelasi dengan jenis isolat serta kondisi lingkungan. Pada klon karet resisten meskipun terjadi penetrasi patogen ke dalam jaringan daun, namun gejala bercak biasanya tidak berkembang lebih lanjut. Ada dua kemungkinan penyebab kondisi tersebut, yaitu tanaman resisten mampu menetralisir toksin sehingga patogen tidak dapat berkembang di dalam jaringan tanaman atau tanaman resisten tidak sensitif terhadap toksin yang disekresikan oleh C. cassiicola. Resistensi yang demikian

15 diduga lebih stabil karena hanya bisa diatasi oleh patogen melalui peningkatan fungsinya (gain of function) (Zhang dan Birch 1997).

Berbeda dengan klon

resisten, pada klon rentan bercak selanjutnya akan melebar sepanjang tulang daun sehingga terbentuk struktur yang menyerupai sirip tulang ikan.

Pada tahap

berikutnya sebagian besar daun mengalami nekrosis dan kemudian gugur. Menurut Breton et al. (1996), gejala kerusakan jaringan tanaman karena pengaruh toksin pada klon rentan terjadi dalam waktu relatif singkat, yaitu sekitar 24 jam setelah patogen menginfeksi daun. Berbagai klon karet yang tersedia saat ini memiliki tingkat resistensi yang berbeda terhadap infeksi C. cassiicola , mulai dari ya ng sangat resisten sampai sangat rentan. Ketersediaan klon karet dengan respon yang demikian memberi peluang untuk mempelajari transkrip atau gen yang diekspresikan secara diferensial oleh klon resisten maupun klon rentan selama terjadi interaksi dengan patogen tersebut. Metode yang relatif sederhana untuk mengamati perbedaan profil ekspresi gen adalah cDNA-amplified fragment length polymorphism (cDNA -AFLP), yang didasarkan pada reaksi amplifikasi terhadap populasi cDNA secara selektif (Bachem et al. 1996; Bachem et al. 1998).

Menurut Zhang et al. (2003)

keberhasilan analisis cDNA-AFLP dalam interaksi inang-patogen sangat ditentukan oleh proses pengambilan sampel yang tepat, yaitu sesuai dengan perkembangan gejala penyakit pada tanaman yang diinfeksi. Oleh karena itu, untuk mempelajari transkrip atau gen yang berperan dalam resistensi klon karet terhadap C. cassiicola diperlukan informasi tentang perkembangan gejala penyakit serta tingkat resistensi klon.

Informasi

perkembangan gejala penyakit aka n digunakan untuk menentukan waktu yang tepat dalam pengambilan sampel daun sebagai sumber RNA, sedangkan informasi tingkat resistensi klon diperlukan untuk me nentukan kelompok masing-masing klon berdasarkan responnya terhadap isolat C. cassiicola tertentu. Percobaan ini bertujuan untuk mengidentifikasi perkembangan gejala penyakit pada klon karet resisten dan rentan serta untuk mengevaluasi reaksi beberapa klon karet terhadap satu isolat C. cassiicola virulen.

16 BAHAN DAN METODE

Bahan tanam karet Untuk mengamati perkembangan gejala penyakit gugur daun Corynespora, digunakan dua klon karet resisten yaitu PR 300 dan AVROS 2037 serta satu klon rentan PPN 2444 yang dipilih secara acak berdasarkan informasi tingkat resistensinya di lapang. Bahan tanam karet yang digunakan untuk mengevaluasi respon ketahanan klon karet terhadap satu isolat C. cassiicola terdiri atas 10 klon yang ditanam dalam kantong plastik hitam (polibeg) dan diper sia pkan dengan cara okulasi. Kesepuluh klon tersebut adalah AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873. Okulasi dilaksanakan di kebun Cikasungka PT Perkebunan Negara VIII (Jawa Barat) dengan cara menempelkan mata tunas batang atas masing-masing klon ke batang bawah yang berasal dari biji klon GT 1. Duplikat setiap klon dibuat paling tidak sebanyak 10 tanaman. Semua bahan tanam ditumbuhkan di dalam kantong plastik hitam berisi campuran tanah dan pupuk kandang (3 : 1) dan dipelihara di rumah kaca. Tanaman disiram setiap hari, serta dipupuk dengan pupuk N, P, K dan Mg sekali dalam sebulan, dengan dosis 10 gr/tanaman. Untuk menginduksi pembentukan tunas-tunas baru dilakukan pemangkasan sedangkan untuk mencegah serangan hama dan patogen, terutama pada daun-daun muda yang baru tumbuh dilakukan penyemprotan dengan belerang dan obat anti hama.

Isolat C. cassiicola Isolat C. cassiicola cGT1 SS diperoleh dari Balai Penelitian Karet (BPK) Sembawa (Sumatera Selatan) yang telah teruji virulensinya dan mampu menyebabkan penyakit gugur daun Corynespora pada berbagai klon karet (Situmorang, 2002). Konidia sebagai sumber inokulum untuk diinokulasikan pada daun karet, diproduksi berdasarkan metode Situmorang (2002).

Isolat

cendawan dibiakkan pada media ASK (agar sukrosa kentang yang mengandung kentang 200 g, sukrosa 30 g dan agar 15 g dalam satu liter akuades) di dalam cawan Petri selama 4 - 7 hari, sehingga terbentuk lapisan miselia (Gambar 2 A).

17 Sebanyak 8 - 10 potong biakan isolat tersebut (diameter 5 mm) diletakkan dengan posisi terbalik pada permukaan bawah daun karet steril dalam cawan Petri sehingga bagian miselia dapat kontak secara langsung dengan permukaan daun. Daun yang digunakan adalah daun dari klon karet asal isolat agar patogenitas isolat dapat dipertahankan. Dengan demikian untuk memproduksi konidia dalam percobaan ini digunakan daun karet klon GT 1 karena isolat diisolasi dari daun klon tersebut. Setelah 3 - 4 hari daun dibalikkan dan 4 - 5 hari kemudian konidia akan terbentuk pada bagian atas permukaan daun (Gambar 2 B).

A

B

Gambar 2. (A) Pembentukan miselia Corynespora cassiicola pada media ASK, (B) Pembentukan konidia pada permukaan daun (tanda panah)

Untuk mengumpulkan konidia dari permukaan daun terlebih dahulu daun dikering-anginkan selama satu hari agar pelepasan konidia dari tangkainya lebih mudah. Konidia dilepaskan dari permukaan daun dengan menggunakan kuas, dimasukkan dalam erlenmeyer berisi air dan kemudian disaring dengan kasa nilon untuk memisahkan konidia yang menggumpal. Konsentrasi konidia di dalam air dibuat sekitar 4 x 104 konidia/ml, yang dihitung dengan menggunakan haemocytometer melalai pengamatan dengan mikroskop. Inokulasi, skoring gejala dan penentuan tingkat kerusakan daun

Daun umur ± 2 minggu yang terdapat pada bibit karet dengan stadia pertumbuhan dua unit daun diinokulasi dengan cara menyemprotkan suspensi yang mengandung konidia secara merata ke permukaan bawah daun. Dalam

18 kondisi pertumbuhan yang demikian pada masing-masing unit daun umumnya terdapat 9 tangkai daun dan setiap tangkai daun mendukung tiga daun (trifoliat). Inokula si konidia untuk masing-masing klon dilakukan pada 12 daun yang memiliki umur relatif sama . Daun yang telah diinokulasi kemudian disungkup dengan kantong plastik transparan sekitar 2-3 hari, sungkup plastik selanjutnya dilepas dan inkubasi diteruskan sampai hari ke dua belas.

Pengamatan gejala

penyakit dilakukan pada hari ke 0, 1, 2, 3, 4, 8 dan 12 hari setelah inokulasi sedangkan skoring gejala dilakukan pada hari ke-12. Penentuan tingkat kerusakan daun didasarkan pada empat skala, yaitu: 0 : tidak ada gejala klorosis/nekrosis, 1 : ada gejala bercak coklat kehitaman, 2 : 1 – 50% daun kuning kecoklatan, 3 : 51 – 100% daun kuning kecoklatan atau gugur. Hasil skala serangan dimasukkan ke rumus Towsendt dan Hueberger (Unterstenhover, 1963), sbb : Σ(n x v) I = --------------- x 100% ZxN dengan keterangan, I n v Z N

= = = = =

Indeks tingkat kerusakan daun/intensitas penyakit Banyaknya daun dalam setiap kategori kerusakan Nilai kategori kerusakan Nilai kategori kerusakan tertinggi Banyaknya daun yang diamati

Dari nilai di atas kemudian dapat ditentukan kelompok masing-masing klon, yaitu : 0% > 0 – 33% 34 – 67% 68 – 100%

= tanaman sangat resisten = tanaman resisten = tanaman moderat rentan = tanaman sangat rentan

Rancangan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Rancangan Acak Lengkap dengan empat ulangan. Setiap unit perlakuan terdiri atas tiga helaian daun yang diinokulasi dengan konidia C. cassiicola dan sebagai kontrol daun diberi perlakuan dengan menyemprotkan akuades steril.

19 HASIL

Perkembangan Gejala Penyakit Gugur Daun Pengamatan secara makroskopis pada permukaan daun klon AVROS 2037, PR 300 dan PPN 2444 pada hari pertama setelah inokulasi tidak menunjukkan adanya gejala penyakit. Gejala bercak seperti titik berwarna coklat tua dan kadang-kadang hitam mulai terlihat pada hari kedua setelah inokulasi, baik pada klon resisten AVROS 2037 dan PR 300, maupun pada klon rentan PPN 2444 (Tabel 1). Tabel 1. Perkembangan gejala penyakit gugur daun pada klon karet PR 300, AVROS 2037 dan PPN 2444. Hari setelah inokulasi 0 1

Klon resisten PR 300 AVROS 2037

Klon rentan PPN 2444

Pengamatan mikroskopis pada klon PPN 2444 *)

Tidak ada gejala Tidak ada gejala

Tidak ada gejala Tidak ada gejala

Tidak ada gejala Tidak ada gejala

Kerusakan pada sebagian kutikula dan epidermis bawah daun, miselium belum terlihat .

2

Bercak seperti titik

Bercak seperti titik

Bercak seperti titik

Kerusakan pada sebagian parenkim bunga karang, miselium terdapat pada ruang intraseluler.

3

Bercak seperti titik

Bercak seperti titik

Bercak seperti titik merata di daun

Parenkima bunga karang hancur, sebagian parenkima palisade rusak

4

Bercak seperti titik Bercak agak melebar

Bercak seperti titik Bercak seperti titik

Bercak melebar

Bercak tidak berkembang

Bercak tidak berkembang

Lebih dar 50% daun nekrosis

8

12

Bercak melebar, sebagian berbentuk sirip tulang ikan

*) Sumber Rouli (1987).

Setelah 3 – 4 hari, jumlah bercak terlihat semakin banyak dan melebar pada permukaan daun klon PPN 2444, namun tidak menunjukkan perkembangan

20 yang berarti pada klon AVROS 2037 dan PR 300. Dengan bertambahnya waktu, gejala bercak pada klon PPN 2444 semakin melebar, beberapa di antaranya berkembang di sekitar tulang daun sehingga menyerupai sirip tulang ikan dan setelah 12 hari lebih dari setengah permukaan daun mengalami gejala nekrosis dan kemudian daun menggulung (Gambar 3).

Umumnya dalam kondisi yang

demikian daun tidak mampu bertahan dan kemudian gugur. Sebaliknya gejala pada klon AVROS 2037 dan PR 300 hampir tidak berkembang, setelah 8 hari hanya terlihat sedikit bercak, beberapa bercak agak melebar, namun setelah itu tidak terjadi perkembangan lebih lanjut.

Gejala nekrotik AVROS 2037

PPN 2444

Gambar 3. Pe nampakan gejala penyakit gugur daun pada klon karet resisten (AVROS 2037) dan rentan (PPN 2444) akibat infeksi C. cassiicola pada permukaa n bawah daun karet, setelah 12 hari inokulasi. Tingkat Resistensi Sepuluh Klon Karet terhadap Infeksi C. cassiicola Secara umum klon yang dilaporkan memiliki resistensi tinggi di lapang ternyata juga menunjukkan respon yang sama dalam pengujian terkontr ol dengan isolat yang digunakan dalam penelitian ini. Demikian juga hal-nya klon yang digolongkan rentan di lapang juga memberikan respon kerentanan yang tinggi (Tabel 2). Di samping perbedaan dalam perkembangan gejala penyakit , klon karet yang diuji juga menunjukkan perbedaan dalam intensitas penyakit. Di antara 5

21 klon resisten, klon BPM 1 menunjukkan intensitas penyakit paling rendah (I = 0%), yang mengindikasikan bahwa klon tersebut memiliki resistensi paling tinggi karena tidak ditemukan adanya infeksi patogen pada permukaan daun. Kemudian diikuti oleh klon IRR 100, RRIC 100, AVROS 2037 dan PR 255 (0% klon moderat RRIM 600 (34%

I

I

33%),

67%), dan 3 klon sangat rentan yaitu RRIC

103, PPN 2444 dan IAN 873 (68%

I

100%) (Tabel 2).

Berdasarkan

persentase intensitas penyakit tersebut, maka klon karet yang diuji dapat digolongkan dalam kelompok sangat resisten (BPM 1), resisten (IRR 100, RRIC 100, AVROS 2037, PR 255), moderat rentan (RRIM 600), dan sangat rentan (RRIC 103, PPN 2444, IAN 873).

Tabel 2. Gejala dan intensitas penyakit pada pengujian terkontrol klon karet terhadap C. cassiicola . No.

Klon

Tingkat resistensi di lapang

D aun bergejala (%)

Gejala pada daun

Ada bercak coklat/hitam, tidak berkembang Tidak ada bercak/tidak terinfeksi Ada bercak coklat/hitam, tidak berkembang Ada bercak coklat/hitam, tidak berkembang Ada bercak coklat/hitam, tidak berkembang Ada bercak coklat/hitam, melebar Lebih dari 50% helaian daun nekrosis Lebih dari 50% helaian daun nekrosis Lebih dari 50% helaian daun nekrosis

1.

AVROS 2037

Resisten

66

2. 3.

BPM 1 PR 255

Resisten Resisten

0 75

4.

RRIC 100

Resisten

50

5.

IRR 100

Resisten

41

6. 7. 8.

GT 1*) RRIM 600 RRIC 103

Moderat Moderat Rentan

91 100

9.

PPN 2444

Rentan

100

10.

IAN 873

Rentan

100

Intensitas penyakit (I) (%) 22,2 0 22,2 17,8 13,9 40,5 85,7 85,7 86,0

*) Tidak diinokulasi karena daun umur ± 2 minggu tidak tersedia

PEMBAHASAN Gejala penyakit pada permukaan daun klon rentan PPN 2444 belum terlihat pada hari pertama setelah inokulasi, namun pengamatan anatomi daun secara mikroskopis yang dilaporkan oleh Rouli (1987) menunjukkan kerusakan

22 telah mulai pada lapisan kutikula dan epidermis bawah daun (Tabel 1). Meskipun demikian miselium cendawan belum terlihat pada ruang sel. Pada hari kedua setelah inokulasi, kerusakan berlanjut pada sebagian parenkima bunga karang sedangkan miselium cendawan mulai terlihat pada ruang intraseluler.

Hari

berikutnya kerusakan lapisan jaringan daun semakin banyak, dimana lapisan parenkima bunga karang hancur dan kerusakan terjadi pada sebagian lapisan parenkima palisade. Hal tersebut sejalan dengan pengamatan secara visual yang dilakukan dalam penelitian ini. Pengujian tingkat resistensi menunjukkan bahwa 5 klon yaitu klon AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100 dan IRR 100 me miliki kemampuan untuk mengatasi infeksi C. cassiicola isolat cGT1 SS. Selain BPM 1, ke-empat klon lainnya dapat diinfeksi oleh patogen, yang ditandai dengan terbentuknya bercak coklat atau hitam pada helaian daun, namun bercak tidak berkembang lebih lanjut. Pada klon RRIM 600 bercak melebar yang menandakan terjadinya perkembangan patogen, namun masih terbatas pada beberapa bagian helaian daun. Perkembangan patogen yang sangat signifikan dengan kerusakan daun terjadi pada 3 klon, yaitu RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873, dimana hampir seluruh permukaan daun mengalami nekrosis. Pengelompokan 10 klon karet yang diuji berdasarkan intensitas penyakit pada masing-masing klon menunjukkan hasil yang sejalan dengan respon klon di lapang yang telah dilaporkan sebelumnya oleh sejumlah peneliti (Pusat Penelitian Karet 1992; Suwarto et al. 1996; Situmorang 2002). Dari pengamatan lapang di beberapa lokasi perkebunan karet di Indone sia seperti di Jambi dan Kalimantan Barat, klon BPM 1 serta klon seri BPM lainnya seperti BPM 24 dilaporkan tidak pernah menunjukkan gejala terserang atau hanya terserang ringan oleh C. cassiicola (Suwarto et al. 1996). Pusat Penelitian Karet (1992) juga melaporkan bahwa klon BPM 1 yang termasuk klon unggul anjuran memiliki tingkat resistensi tinggi terhadap infeksi cendawan tersebut. Pengamatan sebaran penyakit yang lebih luas di beberapa sentra perkebunan karet yang terdapat di Sumatera dan Kalimantan menunjukkan gejala serangan tidak terdapat pada klon BPM 1 (Situmorang 2002). Namun pada percobaan rumah kaca dilaporkan bahwa klon

23 BPM 1 terinfeksi ringan oleh tiga isolat C. cassiicola virulen yang diinokulasikan pada daun (Hadi 2003) . Laporan tentang tingkat resistensi klon AVROS 2037 di berbagai lokasi perkebunan karet tidak banyak ditemukan. Namun di Jambi dilaporkan bahwa klon tersebut tidak terserang oleh

C. cassiicola dan dalam klasifikasi tingkat

resistensi klon yang dilaporkan oleh Pusat Penelitian Karet (1992), klon AVROS 2037 termasuk klon yang sangat resisten.

Pada pengujian secara terkontrol

dengan menggunakan tiga macam isolat C. cassiicola , respon klon AVROS 2037 dilaporkan bervariasi (Hadi 2003).

Hal tersebut ditunjukkan dari intensitas

penyakit klon AVROS 2037 terhadap isolat Cc 1 (isolat dari Kalimantan Selatan) adalah 20%, terhadap isolat Cc 2 (isolat Jawa Tengah) adalah 30% dan terhadap isolat Cc 3 (isolat Sumatera Selatan) adalah 43%.

Hasil penelitian ini

menunjukkan klon AVROS 2037 memiliki intensitas penyakit sebesar 22,2%. Di berbagai sentra perkebunan karet dilaporkan bahwa klon PR 255 tidak terserang oleh C. cassiicola (Suwarto et al. 1996; Situmorang 2002). Dalam daftar klon anjuran, klon PR 255 tergolong dalam klon dengan resistensi tinggi terhadap infeksi C. cassiicola dan termasuk dalam klon anjuran skala besar (Pusat Penelitian Karet 1992). Hal yang sama juga dilaporkan pada klon RRIC 100 yang juga termasuk klon anjuran skala besar dengan tingkat resistensi tinggi terhadap infeksi patogen yang sama (Pusat Penelitian Karet 1992). Pengamatan di berbagai sentra perkebunan di Indonesia menunjukkan bahwa klon RRIC 100 tidak terserang C. cassiicola (Suwarto et al. 1996; Situmorang 2002). Hadi (2003) melaporkan bahwa klon RRIC 100 menunjukkan respon resistensi tinggi terhadap 3 isolat C. cassiicola yang berbeda.

Klon RRIM 600 meskpun sebelumnya

termasuk dalam klon anjuran skala besar (Pusat Penelitian Karet 1992), namun belakangan diketahui merupakan klon yang mengalami kerusakan cukup berat di beberapa sentra perkebunan karet (Sinulingga et al. 1996; Suwarto et al. 1996; Situmorang 2002). Data tentang respon klon rentan RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873 di berbagai lokasi perkebunan sulit ditemukan karena setelah kedua klon ter sebut terserang sangat berat oleh C. cassiicola pada tahun 1980-an, telah dilakukan pembongkaran dan pemusnahan.

Hal tersebut dilaksanakan untuk mencegah

24 perkembangan patogen ke areal tanaman sehat. Saat ini klon RRIC 103 dan beberapa seri PPN hanya dite mukan di lembaga penelitian dan penggunaannya terbatas hanya untuk aktivitas penelitian. Heath (1980) mengemukakan bahwa dari sisi tanaman, resistensi terhadap patogen umumnya diikuti oleh suatu reaksi yang dapat dideteksi. Reaksi tersebut dapat dibedakan atas dua kategori, pertama adalah perubahan tanaman secara morfologi dan kedua adalah perubahan fungsi yang berhubungan dengan proses metabolisme atau fisiologis tanaman. Perubahan morfologi biasanya hanya dapat diamati melalui penggunaan mikroskop karena gejala penyakit seperti yang terjadi pada tanaman rentan tidak muncul pada tanaman resisten. Salah satu perubahan morfologi tanaman setelah diinokulasi dengan cendawan patogen adalah tejadinya penebalan pada dinding sel akibat deposisi bahan yang terbentuk antara dinding sel dan membran sel, dan secara umum disebut sebagai papila. Komponen papila sangat bervariasi, antara lain bisa berupa kalose, selulose, pektin, suberin , tilose maupun lignin (Heath 1980; Ride dan Pearce 1979). Pembentukan papila dapat terjadi pada tanaman resisten dan rentan, namun juga dapat terjadi hanya pada tanaman resisten (Bushnell dan Berquist 1975; Vance dan Sherwood 1976). Perubahan pada tingkat fisiologi dan metabolisme sering berhubungan dengan sintesis suatu protein, enzim ataupun senyawa fenolik dan fitoaleksin. Dalam interaksi H. brasiliensis/C. cassiicola, antara klon resisten dan rentan tidak terdapat perbedaan kecepatan penetrasi cendawan. Artinya patogen yang sama memiliki kemampuan untuk menembus lapisan permukaan daun, baik pada klon resisten maupun klon rentan dan kemudian masuk ke dalam jaringan tanaman. Oleh karena itu dapat dipahami bahwa ketebalan kutikula, epidermis ataupun pembentukan lapisan lignin pada dinding sel bukan merupakan mekanisme yang digunakan klon karet resisten untuk bertahan terhadap serangan patogen tersebut (Breton et al. 2000). Perbedaan nyata antara respon klon resisten dan rentan terlihat pada invasi cendawan dalam jaringan tanaman.

Serangan pada klon rentan menyebabkan

kerusakan pada sel epidermis, nukleus dan organel lainnya sehingga akhirnya menimbulkan kerusakan parah pada daun.

Pada klon resisten kolonisasi

cendawan terbatas hanya pada beberapa sel di sekitar hifa.

Kondisi tersebut

25 menimbulkan dugaan bahwa klon resisten memiliki suatu molekul yang disandikan oleh suatu gen tertentu sehingga mampu mengenal atau langsung mengatasi perkembangan cendawan. Hal ini diperkuat oleh kenyataan bahwa ketika menginfeksi tanaman karet, C. cassiicola mengeluarkan toksin (Onesirosan et al., 1975; Liyanage dan Liyanage 1986; Purwantara 1987; Suwarto 1989; Breton et al. 1996; Breton et al. 2000) . Toksin yang disebut sebagai ‘cassiicolin’ diduga merupakan faktor penentu utama dalam patogenisitas C. cassiicola. Cassiicolin merupakan Host-selectiv e toxins (HST), termasuk dalam kelompok glikoprotein dengan berat molekul sekitar 21 kDa (Breton dan d’Auzac 1999). Kemampuan tanaman resisten mengatasi penyebaran toksin melalui aktivasi gen telah dilaporkan pada interaksi antara tanaman jagung yang memiliki alel dominan pada lokus Hm1 dengan cendawan patogen Cochliobolus carbonum ras 1. Gen Hm1 menyandikan karbonil reduktase, HC-toxin reductase (HCTR) (Johal dan Briggs 1992) yang meng-inaktifkan toksin yang diproduksi oleh C. carbonum melalui reduksi enzimatik (Meeley et al. 1992; Meeley dan Walton 1991). Genotipe homozigot hm1hm1 tidak memiliki aktivitas HCTR, ternyata rentan terhadap C. carbonum ras 1. Pada klon karet rentan yang terinfeksi, berlanjutnya gejala penyakit diduga berhubungan dengan ketidak mampuan klon tersebut mengatasi penyebaran toksin. Konidia C. cassiicola biasanya akan berkecambah dalam waktu 4 jam (Chee 1988) dan penetrasi fungi terjadi 12 jam setelah inokulasi (Breton et al. 2000).

Pada klon rentan, pengaruh toksin terjadi dalam waktu yang relatif

singkat, sekitar 24 jam setelah patogen diinfeksikan ke daun tanaman (Breton et al. 1996). Hal ini sejalan dengan pengamatan makroskopis pada hari ke-1 yaitu 24 jam setelah inokulasi tidak menunjukkan adanya gejala, namun secara mikroskopis melalui pengamatan anatomi daun telah terjadi kerusakan pada lapisan kutikula dan epidermis bawah daun (Rouli 1987). Kerusakan tersebut berlanjut pada sebagian parenkima bunga karang. Pada hari ketiga kerusakan lapisan jaringan daun semakin banya k, dimana lapisan parenkima bunga karang hancur dan kerusakan terjadi pada sebagian lapisan parenkima palisade. Di antara klon yang diuji, meskipun klon BPM 1 memiliki tingkat keparahan penyakit paling rendah, namun untuk studi ekspresi gen bahan tanam

26 dengan respon yang demikian kurang sesuai untuk digunakan karena dikhawatirkan tidak terjadi aktivasi mekanisme resistensi sebagai akibat tidak adanya infeksi patogen.

Berdasarkan tingkat keparahan penyakit serta

terbentuknya bercak hitam pada permukaan da un, maka empat klon resisten lainnya yaitu, AVROS 2037, PR 255, RRIC 100 dan IRR 100 lebih sesuai digunakan dalam mempelajari transkrip/gen yang berperan dalam resistensi tanaman karet terhadap C. cassiicola . Hal ini disebabkan adanya indikasi bahwa patogen mampu menginfeksi tanaman, namun tanaman tersebut dapat mencegah perkembangan patogen lebih lanjut. Sedangkan ketiga klon rentan, yakni RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873 dapat digunakan untuk penelitian studi transkrip atau gen yang tertekan atau terinduksi ekspresinya akibat adanya infeksi cendawan patogen C. cassiicola .

KESIMPULAN Berdasarkan perkembangan gejala penyakit pada klon karet resisten dan rentan, gejala berupa bercak mulai terlihat pada hari kedua setelah daun karet diinokulasi dengan konidia C. cassiicola , baik pada klon resisten maupun klon rentan.

Perkembangan gejala berlanjut pada klon rentan sehingga pada

pengamatan hari ke -12 hampir seluruh bagian daun rusak, sedangkan pada klon resisten gejala penyakit tidak berkembang. Berdasarkan perkembangan gejala tersebut pengambilan sampel daun sebagai sumber RNA dapat dilakukan mulai pada saat sebelum munculnya gejala penyakit dan pada beberapa titik waktu setelah inokulasi patogen. Pengambilan sampel daun dibatasi sampai hari ke-tiga setela h inokulasi, dengan pertimbangan bahwa dalam waktu tiga hari tersebut diduga transkrip yang terinduksi atau tertekan ekspresinya pada klon resisten maupun rentan akan dapat diamati. Intensitas penyakit dari klon karet yang diuji berkisar antara 0% - 86%, dan pengelompokan klon adalah sangat resisten (BPM 1), resisten (IRR 100, RRIC 100, AVROS 2037, PR 255), moderat rentan (RRIM 600), dan sangat rentan (RRIC 103, PPN 2444, IAN 873).

BAB 3 KERAGAMAN GENETIK KLON KARET DENGAN BERBAGAI TINGKAT RESISTENSI TERHADAP C. cassiicola BERDASARKAN METODE AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP) ABSTRAK Keragaman genetik sepuluh klon karet yang memiliki tingkat resistensi berbeda terhada p C. cassiicola dipelajari dengan menggunakan marka Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Informasi yang diperoleh dalam penelitian ini akan memberikan gambaran tentang latar belakang genetik klon karet yang diuji dan merupakan salah satu dasar dalam menetapkan klon resisten dan klon rentan untuk mempelajari ekspresi gen yang menyandikan ketahanan tanaman karet terhadap C. cassiicola. DNA diisolasi dari daun 10 klon karet dan teknik AFLP digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA. Fragmen hasil amplifikasi kemudian dipisahkan pada gel poliakrilamid dan untuk visualisasinya dilakukan modifikasi, yaitu gel langsung diwarnai dengan perak nitrat serta ukuran gel direduksi. Untuk memperoleh hasil yang optimal dalam pewarnaan perak nitrat dan reduksi ukuran gel tersebut dilakukan beberapa optimasi. Nilai kemiripan genetik kesepuluh klon karet dihitung berdasarkan semua marka AFLP yang diperoleh dan berdasarkan marka tersebut dibuat dendrogram dengan menggunakan Unweight Pair-Group Method Arithmetic (UPGMA) sesuai dengan Numerical Taxonomy and Multivariate System (NTSYS) version 1.8 pc. Da ri 10 pasang primer AFLP selektif diperoleh sebanyak 481 fragmen DNA, 233 fragmen (48,4 %) di antaranya polimorfik. Dendrogram dengan nyata menunjukkan bahwa 85,5% latar belakang genetik kesepuluh klon karet tersebut adalah sama. Pada tingkat kemiripan 88,0%, klon resisten RRIC 100 terpisah dari 4 klon resisten lainnya, yaitu klon AVROS 2037, PR 255, BPM 1 dan IRR 100. Klon moderat GT 1 dan RRIM 600 mengelompok pada kemiripan genetik 90%, sedangkan klon rentan RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873 mengelompok pada kemiripan genetik 89%. Kata kunci: Hevea brasiliensis, marka AFLP, fragmen polimorfik, resistensi klon, Corynespora cassiicola

PENDAHULUAN Baha n tanam karet yang dibudidayakan saat ini merupakan klon asal persilangan buatan dari berbagai tetua terpilih yang kemudian diperbanyak dengan cara okulasi. Masing-masing klon memiliki karakter ekonomi penting

28 seperti tingginya tingkat produksi, pertumbuhan sebelum dan setelah lateks disadap, ketebalan kulit, kandungan karet kering dan warna lateks, serta resistensi terhadap penyakit (Simmonds, 1989). Persilangan buatan untuk mendapatkan klon dengan sifat primer dan sekunder yang baik dilakukan oleh berba gai institusi penelitian yang umumnya terdapat di negara penghasil karet alam. Oleh karena itu dijumpai banyak sekali jenis klon yang ditanam secara komersial, baik di Indonesia maupun di negara penghasil karet alam lainnya. Beberapa klon seperti seri RRIM dan PB (asal Malaysia) serta seri RRIC (asal Sri Lanka), yang banyak digunakan sebagai tetua dalam persilangan buatan, masuk ke Indonesia melalui program pertukaran klon Internasional pada tahun 1974 (Madjid et al. 1977). Di samping klon juga terdapat koleksi plasma nutfah karet yang dikumpulkan dari lembah Amazon melalui ekspedisi internasional negara-negara penghasil karet alam dunia (International Rubber Research and Development Board = IRRDB) pada tahun 1981. Saat ini sebanyak lebih kurang 8.000 ge notipe duplikat ditanam di Kebun Percobaan Balai Penelitian Karet Sungei Putih (Sumatera Utara). Hubungan kekerabatan antar masing-masing klon karet, antar populasi plasma nutfah maupun antar populasi plasmanutfah dengan klon telah banyak dipelajari dengan analisis molekul. Marka isozim digunakan untuk mempelajari hubungan genetik pada 60 klon karet (Yeang et al. 1998) serta hubungan genetik masing-masing kelompok atau individu dalam populasi plasmanutfah (Chevallier 1988; Seguin et al. 1995).

Di samping itu hubungan genetik populasi

plasmanutfah dengan klon karet juga telah dipelajari melalui analisis RFLP (Besse et al. 1994; Luo et al. 1995), serta marka mikrosatelit (Lekawipat et al. 2003). Hubungan genetik yang didasarkan pada analisis Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al. 1990) pada 79 klon karet yang terdapat di Indonesia telah dilaporkan sebelumnya (Nurhaimi-Haris et al. 1998). Beberapa klon karet tersebut akan digunakan untuk mempelajari transkrip/gen atau bagian gen yang ekspresinya diregulasi akibat adanya interaksi antara tanaman karet dengan cendawan C. cassiicola , yaitu salah satu patogen penyebab penyakit gugur daun pada tanaman karet.

Untuk mempelajari ekspresi gen

tersebut diperlukan klon karet yang secara genetik sangat mirip, namun tingkat resistensinya terhadap C. cassiicola jauh berbeda. Oleh sebab itu perlu dilakukan

29 penajaman analisis dengan melibatkan sebanyak mungkin karakter genetik sehingga dapat mewakili sebagian besar genom tanaman karet. Di samping itu analisis kemiripan genetik klon karet dengan berbagai tingkat resistensi akan memberikan gambaran tentang latar belakang genetik klon-klon karet yang diuji. Salah satu teknik yang dapat digunakan untuk tujuan tersebut adalah Amplified Fragment Length Po lymorphism (AFLP) (Vos et al. 1995). Teknik AFLP didasarkan pada amplifikasi selektif menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) terhadap sekumpulan DNA genomik. Prosedur tersebut terdiri atas beberapa tahap, dimulai da ri pemotongan DNA dengan sepasang enzim restriksi, satu enzim memotong jarang (mengenal 6 situs basa DNA) dan satu enzim memotong sering (mengenal 4 situs basa DNA). Adapter oligonukleotida utas ganda kemudian diligasikan ke fragmen DNA yang telah dipotong untuk mendapatkan templat DNA yang akan digunakan dalam reaksi PCR.

Fragmen-fragmen DNA diseleksi melalui amplifikasi selektif

menggunakan primer yang mengandung sekuen adapter serta sekuen enzim restriksi yang sesuai dan komplemen dengan fragmen DNA serta dengan menambahkan dua atau tiga nukleotida selektif pada ujung 3’. Hasil amplifkasi kemudian dipisahkan dengan cara elektroforesis pada poliakrilamid gel. Berdasarkan metode tersebut di atas, polimorfisme akan terdeteksi berupa ada atau tidak adanya fragmen DNA pada ukuran tertentu sehingga marka yang diperoleh merupakan marka dominan. Umumnya sejumlah besar fragmen DNA dapat diamplifikasi dan divisualisasikan pada poliakrilamid gel tanpa memerlukan pengetahuan tentang sekuen nukleotida dari genom suatu organisme. Apabila poliakrilamid gel dijalankan pada alat sekuensing, sekitar 50 – 100 fragmen DNA dapat divisualisasikan untuk setiap pasangan primer. Oleh karena setiap fragmen dianggap mewakili satu karakter tertentu maka sejumlah besar karakter dapat divisualisasikan untuk setiap pasangan primer. Teknik AFLP telah banyak digunakan dalam mempelajari marka genetik untuk mendapatkan peta keterpautan atau untuk mengidentifikasi marka molekul yang terpaut dengan fenotipik tertentu. Marka molekul yang terpaut dengan gen Cf-9 yaitu gen yang memberikan ketahanan tanaman tomat terhadap patogen Cladosporium fulvum diperoleh melalui analisis AFLP (Thomas et al. 1995).

30 Pada tanaman kedelai dilakukan pemetaan marka molekul berdasarkan analisis AFLP, RAPD dan RFLP (Lin et al, 1996). Peta genetik pertama untuk tanaman karet berdasarkan marka AFLP, RFLP, mikrosatelit dan isozim telah dibuat oleh Lespinasse et al. (2000). Peta tersebut didasarkan pada 106 individu progeni yang berasal dari persilangan interspesies antara klon PB 260 Hevea brasiliensis dengan klon RO38 yang merupakan hasil persilangan antara H. brasiliensis X H. benthamiana.

Dari hasil yang diperoleh dikemukakan bahwa dengan marka

AFLP peta genetik jenuh (saturated map) dapat lebih cepat dikonstruksi. Dalam prosedur aslinya visualisasi produk AFLP dilakukan pada alat sekuensing menggunakan poliakrilamid gel (Vos et al. 1995). Karena salah satu primer dilabel dengan radioaktif maka fragmen DNA hasil amplifikasi akan tervisualisasi dengan mengeksposkan gel pada film sinar X. Sejumlah peneliti telah melakukan modifikasi terhadap visualisasi produk AFLP dengan beberapa pertimbangan, seperti ketersediaan fasilitas radioaktif ataupun keamanan dalam pelaksanaan visualisasi tersebut (Chalhoub et al. 1997; Murayama et al. 2002; Vrieling et al. 1997; Lin et al. 1997). Dalam penelitian ini, untuk analisis AFLP dari DNA asal daun tanaman karet dilakukan beberapa modifikasi berdasarkan ketersediaan peralatan serta kondisi laboratorium. Modifikasi tersebut melibatkan proses visualisasi produk AFLP serta reduksi ukuran gel. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui kemiripan genetik 10 klon karet yang memiliki resistensi berbeda terhadap infeksi C. cassiicola . Informasi yang diperoleh merupakan dasar untuk memilih satu klon resisten dan satu klon rentan yang memiliki kemiripan genetik tinggi untuk digunakan dalam studi ekspresi gen pada interaksi tanaman karet dengan C. cassiicola .

BAHAN DAN METODE

Bahan tanam karet dan isolasi DNA Bahan tanam yang digunakan dalam percobaan ini adalah daun karet dari 10 klon yang sebelumnya telah diuji tingkat resistensinya terhadap isolat C. cassiicola virulen cGT1-SS (Bab-2). Kesepuluh klon tersebut terdiri atas 5 klon resisten (AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100), 2 klon moderat

31 (GT 1, RRIM 600), dan 3 klon rentan (RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873). Asal klon serta tetua kesepuluh klon tersebut disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Asal dan tetua sepuluh klon karet. No.

Klon

1.

AVROS 2037

2. 3. 4.

BPM 1 PR 255 RRIC 100

5.

IRR 100

6. 7.

GT 1 RRIM 600

8.

RRIC 103

9. 10.

PPN 2444 IAN 873

Asal klon Algemene Vereninging Rubberplanters Oostkust Sumatra (Indonesia) Balai Penelitian Medan (Indonesia) Proefstation voor Rubber (Indonesia) Rubber Research Institute of Ceylon (Sri Lanka) Indonesian Rubber Research Institute (Indonesia) Godang Tapen (Indonesia) Rubber Research Institute of Malaysia (Malaysia) Rubber Research Institute of Ceylon (Sri Lanka) Perusahaan Perkebunan Negara (Indonesia) Instituto Agronomico do Norte (Brazil)

Tetua Betina x Jantan AV 256 x AV 352 AV 163 x AV 308 Tjir 1 x PR 107 RRIC 52 x PB 86 BPM 107 x IAN 717 Klon primer Tjir 1 x PB 86 RRIC 52 x PB 86 LCB 1320 ilegitim PB 86 x F 1717

DNA diisolasi dari daun muda yang warnanya telah berubah dari coklat menjadi hijau namun daun masih terasa lembut, dengan menggunakan metode Orozco-Castillo et al. (1994) dengan memodifikasi beberapa komponen dalam proses awal ekstraksi DNA. Sebanyak 0,2 g daun dicuci bersih, dikeringkan dan dimasukkan ke dala m mortar yang telah didinginkan, ditambah 0,02 g PVP dan daun digerus dengan menambahkan nitrogen cair sampai diperoleh serbuk halus. Serbuk

dimasukkan

ke

dalam tabung Eppendorf berisi 1 ml bufer ekstrak

[CTAB 10% (b/v) ; EDTA 0,5 M pH 8,0; Tris HCl 1 M pH 8,0; NaCl 5 M] dan 10 µl merkaptoetanol 1% (b/v). Campuran dikocok kuat menggunakan vorteks, dipanaskan 30 menit pada suhu 650 C, kemudian didinginkan sampai mencapai suhu kamar dan ditambahkan 750 µl larutan kloroform : isoamilalkohol (24 : 1), dan dikocok kuat.

Campuran disentrifus selama 10 menit pada 11.000 rpm.

Bagian atas dipipet ke dalam tabung Eppendorf lain dan diekstrak kembali dengan 1 ml larutan kloroform : isoamilalkohol (24 : 1) , disentrifus selama 10 menit pada 11.000 rpm. Cairan bagian atas dipipet ke tabung Eppendorf lain, ditambah 750 µl isopropanol dingin, dikocok perlahan hingga homogen dan disimpan dalam lemari es (40 C) selama 30 menit, kemudian disentrifus selama 10 menit pada

32 11.000 rpm. Cairan dibuang dan endapan dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Endapan DNA dilarutkan dalam 200 µl bufer TE (Tris-HCl 1M pH 8,0; EDTA 0,5 M pH 8,0). Untuk menghilangkan RNA, ke dalam 200 µl larutan DNA ditambahkan 10 µl RNase (10 mg/ml) dan campuran tersebut diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370 C. Selanjutnya ditambahkan 1/10 volume Na asetat 3 M pH 5,2 dan 2,5 volume alkohol absolut, dikocok hingga homogen dan disimpan pada - 200 C selama 30 menit.

Campuran disentrifus 10 menit pada 14.000 rpm, cairan

dibuang dan endapan dicuci dengan 500 µl alkohol 70%, disentrifus 10 menit pada 14.000 rpm. Cairan dibuang, endapan dikeringkan dan dilarutkan dengan 50 µl bufer TE. Larutan DNA disimpan pada - 200 C. Untuk pengujian kualitas DNA dilakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi EcoRI. Sebanyak 2 µl DNA dicampur dengan 2 µl bufer 10X, 0,5 µl EcoRI (10 unit/µl), dan 15,5 µl akuades. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370 C. Hasil restriksi kemudian dipisahkan melalui elektroforesis pada gel agarose 0,8%. DNA memiliki kualitas baik apabila enzim tersebut mampu memotong DNA menjadi potongan yang lebih kecil sehingga akan terlihat smear pada gel. Untuk pengujian kuantitas, digunakan DNA Arabidopsis sebagai pembanding. Sebanyak 2,5 µl DNA Arabidopsis (100 ng/µl) dicampur dengan 7,5 µl akuades dan 2 µl loading bufer. Setiap 5 µl DNA sampel ditambah 95 µl akuades, dihomogenkan, dan kemudian 10 µl campuran ditambah 2µl loading bufer. Elektroforesis menggunakan gel agarose 0,8%, pada 50 V selama ± 1 jam. DNA diwarnai dengan etidium bromida 0,1 µg/ml. Konsentrasi DNA sampel diperkirakan dengan cara membandingkan ketebalan dan intensitas antara pita DNA sampel dengan DNA Arabidopsis yang konsentrasinya diketahui.

Analisis AFLP Analisis AFLP dilakukan dengan kit AFLP Analysis System I, AFLP Starter Primer Kit (Gibco BRL, Cat. No. 10544-013, 10483-014) sesuai prosedur

33 yang direkomendasikan. Secara garis besar tahapan teknik AFLP adalah sebagai berikut : Restriksi DNA genomik dan ligasi adapter Restriksi DNA genomik dilakukan dengan enzim restriksi EcoRI dan MseI. Ke dalam tabung mikrosentrifus 0,5 ml dicampurkan 2,5 µl bufer reaksi 5X [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM Mg-asetat, 250 mM K-asetat), 2,5 µl DNA (50 ng/ µl), 1 µl EcoRI/MseI [masing-masing enzim 1,25 unit/µl dalam 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 50% (v/v) glyserol, 0,1% Triton X-100] dan 6,5 µl akuades. Campuran kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 370 C, yang diikuti dengan inkubasi selama 15 menit pada suhu 700 C untuk inaktiv asi enzim. Untuk ligasi adapter, ke dalam setiap tabung yang berisi campuran tersebut di atas ditambahkan campuran 12 µl larutan ligasi adapter dan 0,5 µl T4 DNA ligase (1 unit/µl), campuran kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 200 C. Hasil ligasi kemudian diencerkan 10X dengan bufer TE. Sekuen adapter yang diligasikan adalah sebagai berikut : Sekuen adapter EcoRI :

5’- CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA - 5’

Sekuen adapter MseI :

5’- GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT - 5’

Amplifikasi fragmen DNA Amplifikasi produk ligasi di atas dilakukan melalui reaksi PCR dalam dua tahap yaitu preamplifikasi dan amplifikasi selektif.

Primer AFLP untuk

preamplifikasi mengandung satu nukleotida tambahan dengan sekuen lengkap untuk primer EcoRI adalah 5’- GACTGCGTACCAATTCA - 3’ dan primer MseI adalah 5’- GATGAGTCCTGAGTAAC - 3’. Ke dalam setiap tabung Eppendorf volume 0,5 ml dicampurkan 2,5 µl DNA hasil ligasi yang telah diencerkan, 20 µl pre-amp primer mix , 2,5 µl PCR bufer 10X, dan 0,2 µl Taq DNA polimerase (5 unit/µl). Reaksi PCR dilakukan dalam 20 siklus pada 940 C (30 dt), 560 C (60 dt),

34 720 C (60 dt) dan suhu rendam 40 C.

Amplifikasi DNA menggunakan alat

Thermocycler dari Thermolin e II Amplithrone. Selanjutnya produk PCR diencerkan 50X dan merupakan DNA cetakan dalam amplifikasi selektif. Sepuluh pasang primer, masing-masing mengandung 3 nukleotida tambahan, digunakan dalam amplifikasi selektif.

Sekuen dari

pasangan primer disajikan pada Tabel 4. Tabel 4. Pasangan primer EcoRI dan MseI untuk amplifikasi selektif DNA asal daun karet. No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sekuen pasangan primer EcoRI dan MseI untuk amplifikasi selektif (5’ 3’) GACTGCGTACCAATTCACT (EACT) – GATGAGTCCTGAGTAACAT (MCAT) GACTGCGTACCAATTCACA (EACA) – GATGAGTCCTGAGTAACTG (MCTG) GACTGCGTACCAATTCACA (EACA) – GATGAGTCCTGAGTAACTT (MCTT) GACTGCGTACCAATTCAAC (EAAC) – GATGAGTCCTGAGTAACAG (MCAG) GACTGCGTACCAATTCACT (EACT) – GATGAGTCCTGAGTAACTA (MCTA) GACTGCGTACCAATTCACA (EACA) – GATGAGTCCTGAGTAA CAC (MCAC) GACTGCGTACCAATTCACC (EACC) – GATGAGTCCTGAGTAACAA (MCAA) GACTGCGTACCAATTCACC (EACC) – GATGAGTCCTGAGTAACTA (MCTA) GACTGCGTACCAATTCACA (EACA) – GATGAGTCCTGAGTAA CTA (MCTA) GACTGCGTACCAATTCACT (EACT) – GATGAGTCCTGAGTAACAG (MCAG)

Untuk deteksi nonradioaktif setiap 18 µl primer EcoRI dicampur dengan 32 µl akuabides. Sebanyak 5 µl campuran tersebut kemudian dicampur dengan 45 µl primer MseI dan diberi label “Mix 1” (volume 50 µl adalah untuk 10 reaksi).

Selanjutnya dibuat “Mix 2” dengan mencampurkan sebanyak 79 µl

akuabides, 20 µl PCR bufer 10X plus Mg dan 1 µl Taq DNA polimerase (5 unit/µl) di dalam tabung Eppendorf 1,5 ml. Setiap reaksi amplifikasi AFLP dilakukan dengan mencampurkan 5 µl DNA hasil preamplifikasi yang telah diencerkan, 5 µl “Mix 1”, dan 10 µl “Mix 2” di dalam tabung Eppendorf 0,5 ml. Kondisi amplifikasi terdapat pada Tabel 5.

Visualisasi fragmen hasil amplifikasi. Setelah reaksi PCR selesai, ke dalam setiap sampel ditambahkan loading bufer-formamid 2X (98% formamid (v/v), 10 mM EDTA, 0,025% (b/v) bromofenol biru, 0,025% silen sianol) dengan volume yang sama (20 µl).

Untuk

marker dicampurkan 1 µl 100-bp DNA Ladder, 19 µl akuades, dan 20 µl loading

35 Tabel 5.

Program PCR untuk reaksi amplifikasi selektif pada analisis AFLP (GibcoBRL-Life Technologies).

C 94

Waktu (detik) 60

C 65

Waktu (detik) 60

Waktu (detik) 90

Jumlah Siklus 1

Terkait ke 2

Tipe

C 72

2

94

60

64

60

72

90

1

3

Step

3

94

60

63

60

72

90

1

4

Step

4

94

60

62

60

72

90

1

5

Step

5

94

60

61

60

72

90

1

6

Step

6

94

60

60

60

72

90

1

7

Step

7

94

60

59

60

72

90

1

8

Step

8

94

60

58

60

72

90

1

9

Step

9

94

60

57

60

72

90

1

10

Step

10

94

60

56

60

72

90

1

11

Step

11

94

30

56

30

72

60

23

File 1

0

0

0

Step

Step

bufer-formamid 2X. Sampel dan marker dipanaskan pada 900 C, selama 3 menit, dan segera ditempatkan di es. Produk AFLP dipisahkan pada 6% poliakrilamid gel yang sudah didenaturasi. Untuk optimasi distribusi fragmen DNA pada gel, diuji dua macam ukuran gel, yaitu gel ukuran 7 x 9 cm dan 12 x 14,5 cm. Komposisi gel untuk masing-masing ukuran tersebut terdapat pada Tabel 6. Campuran larutan dituang ke plat kaca yang telah dipasang spacer (pengantara samping) dan diletakkan secara vertikal, dibiarkan selama 1 jam. Sebelum elektroforesis dijalankan, sekitar 200 ml TBE 0,5X ditambahkan pada wadah bawah peralatan elektroforesis. Plat kaca berisi gel dimasukkan ke wadah Tabel 6. Komposisi 6% poliakrilamid gel untuk dua macam ukuran gel Pereaksi

Volume (10 ml) (untuk dua gel)

Volume (22 ml) (untuk dua gel)

Konsentrasi akhir

Urea H2O Akrilamid/Bis (19:1) Bufer TBE (10x) APS (10%) TEMED

4,2 g 4,83 ml 1,5 ml 0,5 ml 67 µl 6,7 µl

9,24 g 10,63 ml 3,30 ml 1,10 ml 147,4 µl 14,74 µl

7M 6% 0,5 x 0,067%

36 elektroforesis kemudian ditambahkan TBE 0,5X pada bagian atas.

Pre-

elektroforesis dilakukan selama 20 menit (15 watt) supaya suhu permukaan gel mencapai sekitar 500 C. Permukaan gel dibersihkan dari kristal urea dengan bufer TBE menggunakan pipet 1 ml, kemudian comb dipasang pa da gel. Sebanyak 10 µl sampel dimasukkan ke sela -sela comb, elektroforesis dijalankan pada power konstan yaitu 12 W, selama kurang lebih 40 menit (sampai silen sianol mencapai 2/3 dari panjang gel). Plat kaca dikeluarkan dari peralatan elektroforesis, spacer dan satu sisi plat kaca dilepas, kemudian gel yang masih menempel pada plat kaca lainnya dilepas dan diletakkan pada wadah plastik yang diisi dengan larutan fiksasi (asam asetat glasial 10%) dan digoyang selama 20 menit. Larutan fiksasi dibuang dan dicuci 3 x masing-masing selama 2 menit dengan air bebas ion sambil digoyang. Pewarnaan gel dengan larutan perak nitrat (AgNO 3 6 mM, formaldehid 0,05%) dilakukan dengan cara perendaman selama 30 menit sambil digoyang. Kemudian larutan perak dibuang, dibilas cepat dengan air bebas ion dan ditambahkan larutan developer (Na2 CO 3 0,3 M, formaldehid 0,05%, Na 2 S2O3 2 µg/ml) dingin (40 C), digoyang sampai pita muncul. Larutan developer dibuang, gel direndam dalam larutan fiksasi selama 3 menit dan dicuci, kemudian gel diawetkan dalam cellophane membrane backing (BioRad). Setiap pita pada gel merepresentasikan fragmen DNA pada masing-masing individu tanaman, dan diberi nilai 1 apabila pita ada serta 0 bila pita tidak ada. Dendrogam dibuat menggunakan metode UPGMA (Unweighted-Pair Group Method Arithmetic ) melalui program NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate System) versi 1.80 (Rohlf 1993).

HASIL

DNA daun karet DNA dari klon AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873, memiliki kualitas dan kuantitas yang baik (Gambar 1). DNA total yang diperoleh adalah sekitar 2,5 –

37 10 µg yang setara dengan sekitar 12,5 – 50 ng DNA per mg berat jaringan daun karet segar. Sensitivitas DNA hasil isolasi diuji melalui pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI. DNA yang semula seperti pita setelah dipotong dengan enzim restriksi tersebut menjadi terlihat smear pada gel. Hal ini menunjukkan bahwa DNA dapat dipotong secara baik oleh enzim EcoRI yang berarti bahwa DNA tersebut me miliki kualitas yang baik (Gambar 4).

1

2

3 4

5 6

7

8 9 10

Gambar 4. Sensitivitas DNA hasil isolasi terhadap pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI. 1-10 = DNA klon AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873.

Modifikasi visualisasi produk AFLP Produk AFLP berupa fragmen DNA yang diperoleh melalui proses amplifikasi dengan primer selektif dipisahkan berdasarkan berat molekulnya pada poliakrilamid gel dengan ukuran gel sekitar 30 x 40 cm. Di dalam prosedur aslinya, visualisasi produk AFLP dilakukan dengan cara mentransfer gel ke suatu kertas khusus (Gel Blotting Paper) dan kemudian mengeksposnya dengan film sinar X sehingga akan terlihat sebagai pita yang diskrit pada film tersebut. Dalam penelitian ini, untuk mem-visualisasikan produk AFLP terdapat beberapa modifikasi dibandingkan dengan metode aslinya (Vos et al. 1995), yaitu produk AFLP langsung divisualisasikan pada gel melalui pewarnaa n dengan perak nitrat serta ukuran gel direduksi menjadi 12 x 14,5 cm dan 7 x 9 cm. Resolusi produk AFLP dengan pewarnaan perak nitrat pada gel dengan kedua ukuran gel tersebut di atas disajikan dalam Gambar 5.

38 I bp

M 1

II 2 3

bp

M 1

2

3

1500 A B

1500

A

250 C

B

250 D C

D

Gambar 5. Pola AFLP pada gel poliakrilamid ukuran 7 x 9 cm (I) dan 12 x 14,5 cm (II) dengan pewarnaan perak nitrat. DNA tanaman karet diisolasi dari tiga klon, yaitu (1) AVROS 2037, (2) BPM 1, (3) PR 255. Primer EcoRI yang digunakan untuk semua sampel adalah + AGC dan primer MseI adalah +CTG. M: 1 kb DNA Ladder. Pita polimorfik (A-B) dan monomorfik (C-D) yang sama ditandai pada masing-masing gel. Pola pita DNA, baik yang polimorfik maupun monomorfik pada gel ukuran 7 x 9 cm terlihat sama seperti pada gel ukuran 12 x 14,5 cm. Perbedaannya terletak pada jarak masing-masing pita yakni pada gel yang lebih panjang jarak antar pita DNA lebih jauh sehingga pengamatan relatif lebih mudah dilakukan. Hal ini terutama menjadi penting apabila masing-masing pita DNA diamati atau dihitung sebagai satu karakter yang akan turut menentukan di dalam hasil analisis selanjutnya. Gel ukuran 7 x 9 cm juga dapat digunakan terutama

39 untuk skrining secara umum adanya variasi antara satu individu tanaman dengan individu tanaman lain. Keuntungan penggunaan gel dengan ukuran kecil adalah kemudahan di dalam penanganannya, terutama apabila sistem visualisasi yang digunakan adalah melalui pewarnaan gel secara langsung dengan perak nitrat.

AFLP dari DNA asal daun karet Contoh profil AFLP sepuluh klon karet dengan dua pasang kombinasi primer AFLP yang divisualisasikan pada 6% poliakrilamid gel yang didenaturasi dan diwarnai dengan perak nitrat terdapat pada Gambar 6. Dengan menggunakan gel ukuran 12 x 14,5 cm jumlah fragmen DNA asal daun karet yang teramplifikasi untuk setiap pasangan primer berkisar antara 34 – 65 fragmen. Jumlah fragmen total yang diperoleh dari 10 pasang kombinasi primer tersebut adalah 481 fragmen.

Sebanyak 233 fragmen (48,4 %) merupakan fragmen polimorfis

sedangkan ukuran fragmen teramplifikasi berkisar antara kecil dari 100 – 1500 pasang basa. Jumlah fragmen terbanyak yaitu 65 fragmen diperoleh dari amplifikasi dengan primer EACT-MCAT dan paling sedikit yaitu 34 fragmen dengan primer EACA-MCTG.

Fragmen polimorfis terbanyak diperoleh melalui amplifikasi

dengan primer EACT-MCAG (Tabel 7).

Berdasarkan 481 fragmen tersebut

dibangun dendrogram kemiripan genetik pada sepuluh klon karet yang digunakan (Gambar 7). Kemiripan genetik antar klon relatif tinggi yaitu mencapai 85,5%. Pada kemiripan genetik 88,0% masing-masing individu memisah membentuk tiga kelompok, yaitu kelompok 1 terdiri atas 3 klon (AVROS 2037, PR 255, BPM 1), kelompok 2 terdiri atas 6 klon (IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, IAN 873), dan kelompok 3 hanya 1 klon, yaitu RRIC 100. Kemiripan genetik tertinggi mencapai 92,5%, terdapat antara klon RRIM 600 dan RRIC 103. Apabila diamati antar kelompok tingkat resistensi terhadap C. cassiicola diketahui bahwa klon resisten IRR 100 memiliki kemiripan genetik tertinggi dengan klon rentan RRIC 103, yakni mencapai 90,5%, sedangkan dengan klon rentan lainnya yaitu PPN 2444 dan IAN 873 masing-masing mencapai 89,5% dan 89,0%. Kemiripan genetik 3 klon resisten lainnya yakni AVROS 2037, PR 255 dan BPM 1 terhadap 3 klon rentan tersebut sama, yaitu 88,0%. Sedangkan klon

40 resisten RRIC 100 memiliki kemiripan genetik 85,5% denga n 3 klon rentan RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873. Di antara 5 klon resisten, klon IRR 100 memiliki kemiripan genetik tertinggi dengan 3 klon rentan yang diuji.

bp

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

1500

500 300

200

100

(A)

1500 500 300

200

100

(B)

Gambar 6. Produk AFLP dengan primer EACC–MCTA (A) dan EACT–MCAG (B) pada DNA daun 10 klon karet. Ukuran gel 12 x 14,5 cm. M = 100 bp DNA Ladder. 1-10 = DNA klon AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873.

41 Tabel 7. Jumlah fragmen DNA yang teramplifikasi dengan 10 pasang primer AFLP pada 10 klon karet (Hevea brasiliensis) Jumlah fragmen DNA teramplifikasi No.

Pasangan primer

P

M

Total

1.

EACT -MCAT

30

35

65

2.

EACA -MCTG

12

22

34

3.

EACA -MCTT

24

29

53

4.

EAAC-MCAG

10

37

47

5.

EACT -MCTA

21

23

44

6.

EACA -MCAC

23

18

41

7.

EACC-MCAA

27

19

46

8.

EACC- MCTA

28

16

44

9.

EACA -MCTA

21

30

51

10.

EACT -MCAG

37

19

56

TOTAL

481

Keterangan : P: Polimorfik M: Monomorfik

AV2037 90,0%

PR255 BPM1 IRR100

88,0%

GT1 RRIM600

92,5% 85,5%

RRIC103

85,5%

PPN2444 IAN873 RRIC100 0.80

0.85

0.90

0.95

1.00

Koefisien

Gambar 7. Dendrogram kemiripan genetik 10 klon karet berdasarkan analisis AFLP menggunakan 10 pasang primer selektif.

42 PEMBAHASAN Parameter keberhasilan ekstraksi DNA ditentukan berdasarkan jumlah DNA yang diperoleh serta kemudahan penggunaan DNA dalam analisis selanjutnya, seperti dalam proses restriksi, ligasi dan polimerasi (Rogers dan Bendich 1994). Jumlah DNA menjadi penting terutama apabila analisis yang akan dilakukan memerlukan ketepatan konsentrasi DNA dalam proses reaksinya atau DNA harus diisolasi dari sumber yang sangat terbatas. Namun kemudahan penggunaan DNA, yang menggambarkan sensitivitas DNA terhadap berbagai proses atau reaksi molekul, biasanya menjadi pertimbangan utama dalam berbagai analisis molekuler yang dilakukan.

Dalam penelitian ini keberhasilan isolasi

DNA dari daun tanaman karet ditetapkan berdasarkan dua parameter di atas, yaitu konsentrasi DNA yang diperoleh serta sensitivitas DNA terhadap pemotongan dengan salah satu enzim restriksi, yaitu EcoRI. Salah satu kelebihan metode isolasi DNA yang diaplikasikan dalam penelitian ini adalah penggunaan CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) dalam bufer ekstrak.

DNA yang dihasilkan umumnya menunjukkan tingkat

kemurnian yang lebih baik dibandingkan dengan beberapa metode lain yang tidak menggunakan CTAB dalam bufer ekstraknya (Doyle dan Doyle 1987; Kim et al. 1990; Murray dan Thompson 1980; Rogers dan Bendich 1988). Di samping itu keuntungan lain penggunaan CTAB adalah dimungkinkannya untuk memperoleh DNA dengan berat molekul tinggi, yaitu berkisar antara 50 – 150 kb (Rogers dan Bendich 1994).

Keberadaan CTAB dalam bufer ekstrak berfungsi untuk

memisahkan polisakarida yang sering terdapat bersama dengan asam nukleat sehingga menghambat dalam reaksi enzimatis. Namun kelemahan metode ini adalah konsentrasi DNA yang diperoleh biasanya lebih rendah dibandingkan dengan metode lain tanpa menggunakan CTAB. Pengujian kualitas DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain berdasarkan perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm, sensitivitas DNA dalam berbagai reaksi molekul seperti proses pemotongan DNA dengan enzim restriksi dan reaksi ligasi yang melibatkan penggunaan enzim ligase, ataupun keberhasilan dalam proses hibridisasi.

43 Dalam penelitian ini, pemilihan enzim EcoRI untuk pengujian kualitas DNA asal daun karet didasarkan pada pertimbangan bahwa enzim tersebut merupakan salah satu enzim yang digunakan pada proses penyiapan DNA dalam analisis AFLP. Di samping itu metode serupa juga telah berhasil baik untuk konfirmasi kemurnian DNA asal daun kakao yang diketahui mengandung polisakarida dan senyawa fenolik relatif tinggi. Keberhasilan pemotongan DNA kakao dengan enzim EcoRI atau MseI merupakan salah satu faktor yang turut menentukan keberhasilan analisis AFLP pada DNA asal daun kakao tersebut (Perry et al. 1998). DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik diperlukan dalam pelaksanaan metode AFLP (Vos et al. 1995). Hal ini disebabkan sebelum proses amplifikasi dilaksanakan, terdapat beberapa tahapan yang cukup kritis seperti pemotongan DNA genomik dengan dua macam enzim restriksi serta pemasangan adapter pada ujung-ujung fragmen yang telah terpotong yang dilaksanakan melalui proses ligasi. DNA dengan kualitas tinggi diperlukan untuk mencegah terjadinya pemotongan DNA secara tidak lengkap sehingga dapat menyebabkan kesala han dalam identifikasi fragmen polimorfis. Sedangkan konsentrasi DNA berdampak pada kualitas fragmen hasil amplifikasi. Konsentrasi DNA terlalu rendah dapat menghasilkan fragmen yang terlihat sebagai pita yang sangat tipis pada gel atau bahkan pita tidak teramati, sebaliknya konsentrasi DNA terlalu tinggi akan menyebabkan fragmen terlihat tebal sehingga sulit dibedakan antara satu pita dengan pita lainnya. Sistem kit AFLP Analysis System I (Gibco-BRL) yang digunakan dalam penelitian ini menghendaki konse ntrasi DNA antara 100 – 500 ng per reaksi. Menurut Vos et al. (1995), untuk visualisasi produk AFLP salah satu primer yang digunakan dalam reaksi amplifikasi dilabel secara radioaktif dengan isotop P (32P atau

33

P).

Selanjutnya fragmen-fragmen hasil amplifikasi

dipisahkan pada poliakrilamid gel ukuran 30 x 39 cm yang didenaturasi dan kemudian divisualisasikan pada film autoradiograf.

Cara tersebut seringkali

menyulitkan karena tidak semua laboratorium memiliki fasilitas untuk penggunaan radioisotop.

Sebagai alternatif salah satu metode non-radioaktif

dengan menggunakan poliakrilamid gel yang diwarnai dengan perak nitrat telah

44 dikembangkan untuk mem-visualisasikan produk AFLP (Chalhoub et al. 1997). Melalui perbandingan profil produk AFLP tanaman Pisum sativum yang divisualisasikan secara autoradiografi dengan yang langsung divisualisasikan pada gel poliakrilamid melalui pewarnaan perak nitrat telah dibuktikan bahwa sensitivitas dan resolusi yang diperoleh melalui kedua prosedur tersebut sama. Hasil serupa juga diperoleh pada produk AFLP tanaman wortel (Briard et al. 2000).

Berdasarkan hasil yang telah dilaporkan pada tanaman lain maka

visualisasi fragmen-fragmen AFLP asal daun karet dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan poliakrilamid gel yang diwarnai dengan perak nitrat. Prosedur visualisasi tersebut telah dioptimasi pada DNA tanaman karet dan berhasil memberikan resolusi pita-pita DNA yang baik (Gambar 6). Visualisasi produk AFLP melalui pewarnaan dengan perak nitrat tidak memerlukan transfer gel pada kertas blotting sehingga keseluruhan proses pewarnaan fragmen DNA langsung dilakukan pada gel. Dalam metode aslinya gel poliakrilamid yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA memiliki ukuran relatif besar, yakni sekitar 30 x 40 cm seperti yang digunakan untuk sekuensing gel. Ukuran gel yang demikian menyulitkan penanganan di dalam proses pewarnaan dengan perak nitrat. Oleh karena itu ukuran gel perlu direduksi dengan mempertimbangkan kemudahan dalam penanganan proses pewarnaa n, namun ukuran tersebut masih memungkinkan untuk memisahkan fragmen DNA dengan baik. Reduksi ukuran gel untuk visualisasi produk AFLP secara non-radioaktif telah dilaporkan oleh Lin et al. (1997) yang membandingkan profil AFLP pada gel ukuran 30 x 39 cm dengan profil AFLP pada gel ukuran 15 x 17 cm. Melalui pembandingan tersebut dibuktikan bahwa resolusi dan profil DNA pada kedua ukuran gel tersebut sama. Dari dua ukuran gel yang diaplikasikan dalam penelitian ini, yaitu 7 x 9 cm dan 12 x 14,5 cm, meskipun terlihat bahwa kedua ukuran gel tersebut memberikan hasil yang sebanding, namun fragmen DNA pada gel ukuran 12 x 14,5 cm dapat terpisah lebih baik.

Oleh karena itu dengan

mempertimbangkan kemudahan penanganan gel dalam proses pewarnaan, ketersediaan peralatan serta hasil yang diperoleh seperti pada Gambar 6, maka

45 untuk visualisasi produk AFLP dari DNA sepuluh klon karet dalam penelitian ini digunakan gel ukuran 12 x 14,5 cm. Setiap fragmen DNA yang diperoleh dalam reaksi amplifikasi dianggap mewakili satu karakter tertentu dari tanamannya. Banyaknya jumlah fragmen teramplifikasi yang diperoleh dalam analisis AFLP merupakan salah satu keunggulan teknik tersebut dibandingkan dengan teknik lainnya seperti Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al. 1990).

Amplifikasi

fragmen DNA asal daun tanaman karet dengan teknik RAPD hanya menghasilkan antara 5 – 11 fragmen per primer (Nurhaim-Haris et al. 1998). Demikian juga analisis RAPD beberapa tanaman perkebunan lainnya seperti DNA kopi mengha silkan 1 – 7 fragmen, dan DNA kakao menghasilkan 2 – 8 fragmen per primer (Toruan-Mathius dan Hutabarat 1996; Toruan-Mathius et al. 1997). Selanjutnya pada analisis RAPD tanaman kelapa diperoleh antara 4 – 10 fragmen DNA per primer (Matondang et al. 2001) atau rata-rata 11 fragmen per primer (Roslim et al. 2003). Dengan demikian secara keseluruhan metode AFLP dapat mencakup lebih banyak karakter per kombinasi pasangan primer yang digunakan. Akan tetapi teknik AFLP sedikit lebih rumit dibandingkan dengan teknik RAPD karena merupakan kombinasi antara teknik sidikjari yang didasarkan pada hibridisasi dengan sidikjari yang didasarkan pada PCR. Analisis

yang

dilakukan

sebelumnya

melalui

teknik

RAPD

menginformasikan bahwa kemiripan genetik antar 79 klon karet adalah sekitar 70% (Nurhaimi-Haris et al. 1998).

Dengan menggunakan marka isozim

diinformasikan bahwa rata-rata kemiripan genetik 60 klon yang dibudidayakan adalah 75% (Yeang et al. 1998).

Perbedaan tingkat kemiripan genetik yang

diperoleh berhubungan erat dengan jumlah karakter yang diamati. Pada analisis RAPD tersebut hanya digunakan sebanyak 85 karakter sedangkan pada analisis isozim digunakan 23 karakter, jauh lebih sedikit dibandingkan dengan 481 karakter yang digunakan untuk membangun dendrogram kemiripan genetik yang dilakukan dalam penelitian ini. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kemiripan genetik terendah adalah 85,5%. Tingginya kemiripan genetik antar klon karet dapat dimengerti karena tanaman karet yang dibudidayakan saat ini, baik di Indonesia maupun di

46 negara penghasil karet alam lainnya merupakan turunan dari 22 biji yang diintroduksikan oleh Wickham pada tahun 1877 ke Ceylon (Sri Lanka), Malaysia dan Indonesia (Baulkwill, 1989). Dengan demikian untuk menghasilkan klonklon unggul baru melalui persilangan buatan, lembaga penelitian karet, baik yang ada di Indonesia maupun di negara lain, menggunakan tetua yang berasal dari sejumlah biji tersebut. Dendrogram berdasarkan marka AFLP (Gambar 7) menunjukkan bahwa klon resisten memisah menjadi dua, yaitu empat klon dengan kemiripan genetik 88,0% (AVROS 2037, PR 255, BPM 1, IRR 100) dan satu klon (RRIC 100) dengan kemiripan genetik 85,5% dengan klon lainnya. Secara umum terlihat adanya konsistensi antara hasil pengujian menggunakan marka AFLP dengan hasil pengujian di rumah kaca dan lapang.

Klon-klon dengan respon serupa

dalam uji fenotipik yakni memberikan respon resisten atau rentan, ternyata terdapat dalam kelompok kemiripan genetik yang tinggi. Ke-empat klon dengan kemiripan genetik 88,0% (AVROS 2037, PR 255, BPM 1, IRR 100) diduga membawa marka AFLP yang sama sehingga berpeluang besar memiliki gen pengendali ketahanan yang juga sama terhadap C. cassiicola.

Kekecualian

ditemukan pada klon RRIC 100. Klon tersebut memiliki resistensi di lapang tetapi memperlihatkan kemiripan genetik yang lebih rendah dengan ke -empat klon resisten lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa klon RRIC 100 kemungkinan membawa marka atau gen pengendali resistensi yang berbeda. Marka genetik berbeda untuk resistensi terhadap C. cassiicola yang dimiliki oleh klon RRIC 100 diduga berhubungan erat dengan lingkungan tumbuh tetuanya. Klon RRIC 100 merupakan hasil persilangan antara tetua jantan RRIC 52 yang dikembangkan di Sri Lanka dan tetua betina PB 86 yang dikembangkan di Malaysia (Tabel 3). Sementara itu, ke -empat klon resisten lain merupakan hasil persilangan tetua jantan dan betina yang dikembangkan di Indonesia. Sebagai contoh klon AVROS 2037 dan BPM 1 berasal dari beberapa klon AVROS seri sebelumnya (Tabel 3) yang dikembangkan di wilayah Sumatera Utara dan klon PR 255 berasal dari persilangan Tjir 1 dan PR 107 yang dikembangkan di wilayah Jawa Barat. Perbedaan lingkungan tumbuh dari tetua menimbulkan perbedaan

47 adaptasi klon-klon yang diuji terhadap berbagai isolat C. cassiicola yang terdapat di lingkungan tersebut. Berdasarkan hasil tersebut di atas kuat dugaan bahwa sifat resistensi klon karet terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh lebih dari satu gen. Hal ini sejalan dengan beberapa hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa sifat ketahanan tanaman karet terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh dua pasang gen utama (Hadi 2003) atau pendapat lain yang mengemukakan bahwa sifat ketahanan kemungkinan dikendalikan secara poligenik (Tan dan Tan 1996). Di antara 5 klon resisten dan 3 klon rentan yang diuji, diketahui bahwa tingkat kemiripan genetik tertinggi terdapat antara klon resisten IRR 100 dengan klon rentan RRIC 103, yakni mencapai 90,5%. Namun karena klon IRR 100 relatif baru dibandingkan dengan 4 klon resisten lainnya, dan pengujian resistensinya terhadap C. casiicola relatif masih terbatas di beberapa lokasi saja, maka dipertimbangkan bahwa klon tersebut tidak dipilih untuk digunakan dalam studi ekspresi gen. Klon resisten AVROS 2037, PR 255 dan BPM 1 memiliki tingkat kemiripan genetik yang sama dengan 3 klon rentan yang diuji, yakni mencapai 88,0%. Akan tetapi klon BPM 1 dalam pengujian terdahulu tidak memperlihatkan adanya gejala berupa bercak coklat atau hitam yang mengindikasikan bahwa cendawan patogen tidak mampu menginfeksi daun klon tersebut. Bahan tanam dengan respon yang demikian dikhawatirkan kurang sesuai untuk digunakan dalam studi ekspresi gen, karena kemungkinan tidak terjadi aktivasi mekanisme pertahanan tana man sebagai akibat tidak adanya kemampuan patogen menginfeksi klon BPM 1 tersebut.

Sebagaimana

telah dikemukakan sebelumnya studi

ekspresi gen diawali dengan memberikan suatu tekanan berupa infeksi C. cassiicola virulen pada daun yang ditujukan untuk menginduksi ekspresi transkrip/gen yang berhubungan dengan mekanisme pertahanan tanaman. Berdasarkan hal tersebut di atas maka klon resisten AVROS 2037 maupun PR 255 merupakan klon yang sesuai untuk digunakan dalam penelitian lebih lanjut. Kedua klon tersebut merupakan klon yang terdistribusi cukup luas di sentra-sentra perkebunan karet serta dihasilkan melalui persilangan buatan yang dilakukan di Indonesia. Dalam penelitian yang dilakukan oleh Suwarto (2003),

48 dikemukakan bahwa serum B lateks klon AVROS 2037 dengan cepat berubah menjadi hitam yang mengindikasikan tingginya kandungan senyawa fenolik dalam serum B lateks klon tersebut.

Sementara ada dugaan bahwa senyawa

fenolik tersebut berperan dalam menginaktifkan toksin yang dihasilkan oleh isolat C. cassiicola virulen. Dengan pertimbangan bahwa penelitian pada tahap molekul telah dimulai pada klon AVROS 2037, maka klon tersebut dianggap lebih sesuai untuk digunakan dalam studi ekspresi gen selanjutnya. Tiga klon rentan yang diuji yaitu klon RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873 dapat digunakan dalam studi ekpresi gen selanjutnya.

Ketiga klon tersebut

memiliki kemiripan genetik sama, yakni mencapai 88,0% dengan klon resisten AVROS 2037.

Akan tetapi dengan pertimbangan bahwa klon PPN 2444

merupakan klon yang dihasilkan melalui persilangan buatan yang dilakukan di Indonesia, maka klon tersebut dipilih sebagai klon rentan yang akan digunakan dalam studi ekspresi gen, bersama dengan klon AVROS 2037 sebagai klon resisten.

KESIMPULAN Optimasi visualisasi produk AFLP dengan mempertimbangkan beberapa faktor seperti cara visualisasi dan reduksi ukuran gel telah berhasil dilakukan pada DNA asal daun karet.

Dengan demikian maka prosedur pelaksanaan analisis

AFLP untuk DNA tanaman karet telah dimantapkan sesuai dengan kondisi laboratorium yang tersedia.

Aplikasi metode tersebut pada 10 klon karet

(AVROS 2037, BPM 1, PR 255, RRIC 100, IRR 100, GT 1, RRIM 600, RRIC 103, PPN 2444, dan IAN 873) untuk mengetahui keragaman genetik antar klon menunjukkan bahwa 85,5% latar belakang genetik klon yang diuji adalah sama. Pada tingkat kemiripan 88,0%, klon resisten RRIC 100 terpisah dari 4 klon resisten lainnya, yaitu klon AVROS 2037, PR 255, BPM 1 dan IRR 100. Klon moderat GT 1 dan RRIM 600 mengelompok pada kemiripan genetik 90%, sedangkan klon rentan RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873 mengelompok pada kemiripan genetik 89%.

49 Apabila diamati kemiripan genetik setiap klon resisten terhadap setiap klon rentan, diketahui bahwa klon resisten AVROS 2037, PR 255 dan BPM 1 terdapat dalam satu kelompok, dimana 88,0% latar belakang genetiknya mirip dengan klon rentan RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873. Klon resisten IRR 100 terdapat pada kelompok lainnya dengan kemiripan genetik berturut-turut 90,5, 89,5 dan 85,0% terhadap klon rentan RRIC 103, PPN 2444 dan IAN 873. Sedangkan klon resisten RRIC 100 memiliki kemiripan genetik 85,5% dengan ketiga klon rentan yang sama. Hasil pengujian menggunakan marka AFLP dengan hasil pengujian in vivo tingkat resistensi klon terhadap C. cassiicola di rumah kaca memperlihatkan adanya konsistensi hasil antara kedua pengujian tersebut. Dalam hal ini klon dengan respon resisten dalam uji fenotipik terdapat dalam kelompok kemiripan genetik yang tinggi (AVROS 2037, PR 255, BPM 1 dan IRR 100 memiliki kemiripan genetik 88,0%), kecuali klon RRIC 100 memperlihatkan kemiripan genetik yang sedikit lebih rendah (85,5%) dengan ke-empat klon resisten lainnya. Hal ini mengindikasikan bahwa kemungkinan sifat resistensi klon karet terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh lebih dari satu gen.

Diduga klon RRIC 100

membawa marka atau gen pengendali resistensi yang berbeda dengan empat klon resisten yang diuji. Berdasarkan hasil penelitian ini dan dengan mempertimbangkan beberapa hasil penelitian terdahulu, asal serta distribusi klon, maka klon resisten AVROS 2037 dan klon rentan PPN 2444 yang memiliki kemiripan genetik 88,0% akan digunakan dalam studi ekspresi gen selanjutnya.

BAB 4 KONSTRUKSI PUSTAKA cDNA DARI DAUN KARET KLON RESISTEN AVROS 2037 YANG DIINFEKSI DENGAN CENDAWAN Corynespora cassiicola ABSTRAK Pustaka cDNA yang mengandung transkrip yang diekspresikan dalam kondisi tertentu merupakan material awal dalam berba gai studi biologi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi pustaka cDNA dari daun tanaman karet sebagai upaya penyediaan material genetik asal daun karet yang akan digunakan dalam studi ekspresi gen. Sebagai sumber RNA adalah daun karet klon AVROS 2037 yaitu salah satu klon karet resisten terhadap cendawan Corynespora cassiicola. RNA diisolasi dari daun setelah daun tersebut diinokulasi selama tiga hari dengan konidia C. cassiicola. Dari RNA total yang diperoleh dilakukan pemurnian mRNA, sintesis cDNA, ligasi fragmen cDNA utas ganda dengan vektor kloning serta introduksi hasil ligasi ke bakteri Escherichia coli DH5α kompeten. Dari setiap gram jaringan daun berhasil diisolasi RNA sekitar 300 µg, dan dari jumlah tersebut sekitar 0,25% mRNA dapat dimurnikan. Sintesis cDNA dilaksanakan dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan (template ), dan ligasi cDNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi SfiI ke vektor pGEM-T Easy yang dimodifikasi dengan menyisipkan situs enzim restriksi yang sama, telah berhasil dilakukan. Introduksi vektor rekombinan tersebut pada sel bakteri E. coli DH5α kompeten, telah menghasilkan pustaka yang mengandung 8.000 klon cDNA. PCR koloni yang dilakukan secara acak terhadap 250 koloni mengindikasikan bahwa sekitar 93% koloni tersebut membawa cDNA sisipan dengan ukuran fragmen cDNA yang menyisip berkisar antara 300 sampai 1.200 bp. cDNA sisipan terbanyak terdapat pada ukuran antara 500 – 800 bp. Dalam tulisan ini dibahas tahap demi tahap proses yang dilakukan untuk membuat pustaka cDNA asal daun karet klon AVROS 2037 serta beberapa modifikasi yang diperlukan untuk mendapatkan hasil yang optimal. Kata kunci: Hevea brasiliensis, pustaka cDNA, klon AVROS 2037, penyakit gugur daun, Corynespora cassiicola.

PENDAHULUAN Identifikas i gen yang diekspresikan pada tahap perkembangan atau kondisi tertentu suatu tanaman serta pengujian pola ekspresinya merupakan tahapan penting untuk mendapatkan informasi tentang fungsi gen, baik yang berhubungan dengan proses diferensiasi, perubahan morfologi dan metabolisme serta respon

51 terhadap infeksi patogen.

Salah satu cara yang dapat ditempuh untuk

mengidentifikasi gen atau bagiannya adalah melalui penapisan (screening) terhadap pustaka cDNA (complementary DNA) yaitu suatu pustaka yang merepresenta sikan gen-gen yang diekspresikan dalam suatu jaringan, waktu, atau kondisi tertentu.

Pustaka cDNA diperoleh melalui proses kloning sehingga

ratusan gen berbeda dimungkinkan untuk dikoleksi dan diperbanyak secara terus menerus. Identifikasi cDNA spesifik dilakukan me lalui proses hibridisasi (Cowel 1998; Glick dan Pasternak 1994; Kleinsmith dan Kish 1995) ataupun melalui proses amplifikasi PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk gen tertentu. Dalam konstruksi pustaka cDNA, DNA polimerase yang memerlukan RNA (RNA-dependent DNA polymerase ) yakni reverse transcriptase (RT) digunakan untuk meng-copy messenger RNA (mRNA) menjadi molekul cDNA utas ganda.

Berbeda dengan mRNA yang dengan mudah terdegradasi dan

menggambarkan proses transkripsi dari gen-gen yang aktif pada suatu jaringan atau sel tertentu, cDNA merupakan molekul yang lebih stabil sehingga sesuai untuk disisipkan ke dalam vektor kloning, baik berupa plasmid, cosmid, atau bakteriofage. Populasi mRNA yang telah di copy menjadi cDNA apabila diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang bersifat permanen. Keuntungan pustaka cDNA adalah hanya mengandung sekuen yang terekspresi dalam bentuk mRNA dalam suatu kondisi atau waktu tertentu (Kleinsmith dan Kish 1995). Pada tahun 1980-an, penyakit gugur daun tanaman karet (Hevea brasiliensis) yang disebabkan oleh Corynespora cassiicola yaitu suatu cendawan patogen, telah menimbulkan kerugian besar pada pertanaman karet komersil di Indonesia (Soepena 1983; Sinulingga et al. 1996). Kerugian terjadi terutama disebabkan oleh penanaman klon karet yang sangat rentan terhadap serangan patogen, seperti klon RRIC 103 dan klon seri PPN. Klon tersebut merupakan klon dengan produksi tinggi sehingga mulai banyak ditanam di perkebunan karet komersil. Akibatnya ratusan hektar tanaman karet dibongkar dan dimusnahkan untuk menjaga agar sebaran penyakit tidak meluas. Belakangan ini dari survei di berbagai sentra perkebunan karet di Sumatera dan Kalimantan dilaporkan bahwa patogen tersebut terdapat hampir di sebagian besar area l perkebunan karet dengan tingkat keparahan penyakit yang berbeda ( Situmorang, 2002).

52 Cendawan C. cassiicola mempunyai kemampuan menyerang daun karet muda maupun daun karet tua, terutama di sepanjang tulang daun (Chee 1988). Dari penelitian terdahulu telah diketahui bahwa gejala awal yang teramati secara visual sebagai tanda bahwa patogen telah menginfeksi daun karet dapat dilihat pada hari kedua setelah daun diinokulasi dengan konidia C. cassiicola . Berbeda dengan klon rentan dimana gejala meluas dan akhirnya menyebabkan daun nekrosis, pada klon resisten tidak terjadi perkembangan gejala lebih lanjut pada hari-hari berikutnya. Keberhasilan cendawan menginfeksi tanaman merupakan hasil dari suatu interaksi yang bersifat sangat komplek antara tanaman inang dan patogennya.

Saat terjadi kontak dengan tanaman, patogen mengaktifkan

mekanisme untuk melakukan penetrasi ke jaringan tanaman. Pada kebanyakan cendawan patogen, perkecambahan konidia dan kemudian diferensiasinya menjadi apresoria, yaitu suatu struktur yang berfungsi untuk melakukan penetrasi ke jaringan tanaman, memerlukan sinyal fisik ataupun kimia dari tanaman inang (Emmett dan Parbery 1975).

Namun respon tanaman selanjutnya sangat

ditentukan oleh latar belakang genetik masing-masing tanaman. Respon

terhadap

infeksi

patogen

biasanya

terjadi

dengan

cara

mengaktifkan sistem pertahanan tanaman untuk melawan infeksi patogen (Lamb et al. 1989). Hal ini dicapai melalui aktivasi dan ekspresi sejumlah gen yang diyakini memiliki peran dalam sistem pertahanan (Collinge dan Slusarenki 1987; Dixon dan Harrison 1990).

Secara umum diketahui bahwa tanaman

menggunakan mekanisme konstitutif dan indusibel (aktif) untuk mencegah terjadinya kolonisasi patogen (Kombrink et al. 1993). Mekanisme konstitutif melibatkan pembatas struktural seperti pembentukan papila, deposisi kalose, atau melalui peningkatan kandungan lignin pada dinding sel. Mekanisme indusibel melibatkan respon hipersensitif, akumulasi fitoaleksin, sintesis dan deposisi senyawa fenolik dan protein pada dinding sel, sintesis protein PR (pathogenesisrelated protein), serta sintesis enzim hidrolitik seperti 1,3-β-glucanase dan kitinase. Di samping itu, respon pertahanan tanaman tidak hanya diaktifkan oleh infeksi patogen, tetapi juga dapat dipicu oleh stimulus eksternal seperti elisitor, bahan kimia, pelukaan atau sinar UV.

Respon terhadap stimulus eksternal

tersebut juga dikontrol melalui aktivasi sinyal internal.

53 Pada jaringan tanaman, perubahan ekspresi gen telah terjadi mulai dari saat invasi patogen.

Gen-gen tanaman yang secara spesifik terinduksi atau

meningkat ekspresinya selama terjadi interaksi dengan

patogen diduga

merupakan gen yang diperlukan oleh tanaman untuk respon pertahanannya . Pada tahap ini analisis molekuler akan menghasilkan suatu informasi berharga tentang jenis gen serta proses metabolik yang diaktifkan pada level transkripsi gen selama terjadinya interaksi antara inang dan patogen. Untuk mengidentifikasi gen-gen yang berperan dalam mekanisme pertahanan serta untuk mengetahui jalur yang terlibat dalam resistensi tanaman karet terhadap infeksi C. cassiicola , diperlukan ketersediaan pustaka cDNA sebagai sumber gen tanaman karet. Identifikasi transkrip/gen atau bagian gen target dilakukan melalui skrining terhadap pustaka cDNA dengan menggunakan pelacak (probe), baik yang bersifat homologus ataupun heterologus. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi pustaka cDNA dari daun tanaman karet sebagai upaya penyediaan material genetik asal daun karet tersebut.

BAHAN DAN METODE Bahan tanam dan isolat C. cassiicola Klon karet resisten AVROS 2037 pada stadia dua unit daun yang ditanam dalam polibeg dan dipelihara di rumah kaca digunakan sebagai bahan tanam, dimana daunnya digunakan sebagai sumber RNA. Sedangkan sebagai cendawan patogen adalah isolat C. cassiicola cGT1 SS virulen yang diperoleh dari Balai Penelitian Karet (BPK) Sembawa.

Konidia dari isolat tersebut diproduksi

berdasarkan metode Situmorang (2002).

Perlakuan tanaman Daun karet yang akan digunakan sebagai sumber RNA ditandai pada tanaman, pada saat daun mulai muncul. Inokulasi dilakukan pada daun umur sekitar 14 hari dengan menggunakan suspensi konidia yang disemprotkan secara merata ke permukaan bawah daun. Konsentrasi konidia di dalam suspensi adalah sekitar 4 x 104 konidia/ml. Perlakuan inokulasi diberikan pada ketiga daun dalam

54 satu tangkai daun, kemudian daun disungkup dengan kantong plastik. Tiga hari setelah perlakuan inokulasi, semua daun yang diberi perlakuan patogen diambil untuk digunakan sebagai sumber RNA.

Isolasi total RNA RNA diisolasi dari jaringan daun berdasarkan metode Pawlowski et al. (1994) yang dimodifikasi.

Peralatan dan larutan yang akan digunakan untuk

mengisolasi RNA direndam dalam larutan DEPC 0,1%. Ke da lam Erlenmeyer 100 ml dipipet 10 ml buffer ekstrak SDS (200 mM Tris-HCl pH 8,5, 300 mM LiCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 3% SDS) dan 100 mM β-merkaptoetanol, kemudian distirer dalam keadaan dingin. Daun karet dicuci dengan air steril, kemudian tulang daunnya dibuang dan dikeringkan dengan kertas tisu. Antara 2 – 2,5 g daun ditimbang, dimasukkan ke dalam lumpang porselen yang telah didinginkan, kemudian ditambahkan 0,2 g PVP dan nitrogen cair, lalu digerus sampai terbentuk serbuk halus. Serbuk halus yang diperoleh dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan bufer ekstrak dan β-merkaptoetanol, distirer dalam keadaan dingan selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 8 ml ammonium asetat 3 M dan dihomogenkan. Larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 30 ml dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 25 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus lain dan ditambahkan 1/10 volume Na asetat 3 M (pH 5,2) dan 1 volume isopropanol dingin, campuran dihomogenkan perlahan-lahan dan kemudian diinkubasi pada suhu -20 0C selama 30 menit. Selanjutnya campuran disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 25 menit. Cairan dibuang, endapan dilarutkan dengan 5 ml akuades steril (yang telah diberi perlakuan dengan DEPC 0,1%) dan ditambahkan 5 ml fenol:kloroform (1:1), divortex, kemudian disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas (supernatan) dipipet ke dalam tabung sentrifus lain dan dipurifikasi kembali dengan 5 ml fenol:kloroform (1:1). Untuk menghilangkan fenol, supernatan diekstrak dengan 5 ml kloroform, campuran dikocok kuat dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipipet ke dalam tabung sentrifus lain, ditambahkan ¼ volume LiCl 10 M, dihomogenkan

55 dan diinkubasi pada suhu 40 0 C selama 3 aj m. Campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit, cairan dibuang, endapan RNA dilarutkan dengan 500 µl akuades steril kemudian larutan dipipet ke dalam tabung 2 ml. Ke dalam tabung ditambahkan 1/10 volume natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 2,5 volume alkohol absolut, kemudian diinkubasi pada suhu –20 0C satu malam. Selanjutnya campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang, endapan dicuci dengan 500 µl alkohol 70% kemudian dikeringanginkan . Endapan dilarutkan dengan 500 µl akuades steril. Hasil isolasi RNA diamati melalui elektroforesis pada gel agarose 1% yang ditambah dengan 0,5 mg/l etidium bromida, pada tegangan 50 Volt selama sekitar 1 jam.

RNA diamati dengan menggunakan UV transiluminator.

Penetapan konsentrasi RNA dilakukan dengan spektrofotometer UV melalui nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al.1989).

Pemurnian mRNA dari RNA total Untuk mengisolasi mRNA dari RNA digunakan Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega Cat. Z5300) sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan dalam petunjuk teknisnya. Pelaksanaan isolasi tersebut terdiri atas beberapa tahap sebagai berikut: Penyiapan larutan 0,5 x SSC dan 0,1 x SSC (dari larutan 20 x SSC). Untuk pembuatan 0,5 x SSC, sebanyak 50 µl (20 x SSC) dipipet ke dalam tabung mikro 2 ml, kemudian ditambahkan 1950 µl Nuclease free water dan campuran dihomogenkan. Untuk pembuatan 0,1 x SSC, sebanyak 10 µl (20 x SSC) dipipet ke dalam tabung mikro 2 ml kemudian ditambahkan 1990 µl Nuclease free water dan campuran dihomogenkan. Pencucian Streptavidin-Paramagnetic Particle (SA-PMPs). Partikel SA-PMPs disuspensikan dengan hati-hati sehingga endapan dan larutan tercampur rata, kemudian diletakan pada MagneSphere Magnetic Separation Stand (MSMSS), dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung. Supernatan dibuang dengan menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan.

Ke dalam

endapan ditambahkan sebanyak 300 µl (0,5 x SSC) kemudian disuspensikan.

56 Tabung diletakkan kembali pa da MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung dan supernatan dibuang dengan menggunakan pipet. Proses pencucian endapan diulang kembali sampai tiga kali dan pada tahap akhir ditambahkan sebanyak 100 µl (0,5 x SSC). Penyiapan sampel RNA. Sebanyak 100-1000 µg RNA total, dipipet ke dalam tabung mikro 0,5 ml. Jika volume RNA total kurang dari 500 µl maka ditambahkan Nuclease free water hingga mencapai volume 500 µl, kemudian diinkubasi di alat PCR pada suhu 65 0C selama 10 menit. Dalam keadaan panas ditambahkan 3 µl Biotinylated Oligo (dT) Probe (50 pmol/µl) dan 13 µl (20 x SSC). Campuran dihomogenkan dengan hati-hati dan kemudian dibiarkan dingin sampai mencapai temperatur ruang. Penangkapan dan pencucian hibrid oligo(dT)-mRNA. Sampel RNA yang telah disiapkan seperti di atas, dipipet ke dalam tabung yang berisi SA-PMPs yang telah dicuci sebelumnya. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, setiap 1-2 menit sekali dikocok perlahan. Untuk menangkap SA-PMPs, tabung diletakkan pada MSMSS dan dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung, kemudian supernatan dibuang dengan menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan. Ke dalam tabung ditambahkan 300 µl (0,1 x SSC) kemudian disuspensikan dan diletaka n kembali pada MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung dan supernatan dibuang dengan menggunakan pipet. Penambahan 300 µl (0,1 x SSC) diulang hingga 4 kali. Pada tahap akhir diusahakan membuang sebanyak mungkin cairan yang ada tanpa menyentuh partikel. Elusi mRNA.

Untuk meng-elusi mRNA, endapan SA-PMP diresuspensikan

dengan 100 µl RNase- free water secara hati-hati. Campuran diletakkan pada MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung. Supernatan dipipet ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru. Ke dalam tabung SA-PMP ditambahkan kembali 150 µl RNase- free water kemudian disuspensikan dengan hati-hati. Campuran diletakkan kembali pada MSMSS, dibiarkan beberapa saat sampai endapan terkumpul di sisi tabung. Supernatan dipipet dan digabungkan

57 dengan hasil sebelumnya ke dalam tabung mikro 1,5 ml sehingga diperoleh total volume 250 µl mRNA. Jika ada partikel yang terbawa, larutan disentrifugasi 10.000 g selama 5-10 menit pada suhu 4 0C. Supernatan yang merupakan stok mRNA dipindah ke dalam tabung lain dan disimpan pada –70 0 C. Penetapan kemurnian dan konsentrasi mRNA dan pengambilan kembali mRNA. Ke dalam 250 µl mRNA ditambahkan 250 µl Nuclease free water, kemudian konsentrasi mRNA ditetapkan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan kemurniannya ditentukan melalui perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (Sambrook et al., 1989). Untuk mengambil kembali mRNA, dilakukan pengendapkan dengan menambahkan 1/10 volume Na asetat 3M (pH 5,2) dan 2,5 volume alkohol absolut, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu –20 0C selama satu malam. Larutan disentrifus pada 14.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Cairan dibuang, endapan mRNA dicuci dengan 500 µl alkohol 70% , disentrifus kembali pada 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 0C. Cairan dibuang, endapan mRNA dikeringanginkan beberapa saat, kemudian dilarutkan dengan deionized H2O steril hingga didapatkan konsentrasi mRNA 0,25µg– 0,5µg.

Sintesis cDNA Sintesis dan fraksinasi cDNA dilakukan dengan “SMART cDNA Library Construction Kit” dari Clontech (Cat. No. K1051-1), dengan tahapan sebagai berikut : Sintesis cDNA utas pertama . Ke dalam tabung mikro 0,5 ml dicampurkan 1-3 µl mRNA (0,25 µg-0,5 µg), 1 µl SMART IV oligonukleotida, 1 µl CDS III/3’ PCR primer, dan deionized H2O (milli Q filter) sampai

volume 5 µl. Campuran

dihomogenkan, diputar sesaat, dan diinkubasi pada suhu 72 0 C selama 2 menit, kemudian didinginkan di dalam es selama 2 menit, dan dip utar sesaat. Selanjutnya ke dalam tabung ditambahkan 2 µl (5 X First-stand buffer), 1 µl DTT (20 mM), 1 µl DNTP mix (10 mM), dan 1 µl Power Script Reverse Transcriptase. Campuran dihomogenkan menggunakan pipet, diputar sesaat, ditambahkan 10 µl

58 minyak mineral dan diinkubasi pada suhu 42 0 C selama 1 jam. Setelah selesai campuran diletakkan di es dan disimpan pada suhu –20 0C. Sintesis cDNA utas kedua melalui Amplifikasi dengan cara Long-Distance PCR (LD-PCR). Mesin PCR diprogram pada suhu 95 0C. Sementara itu ke dalam tabung mikro 0,5 ml yang telah didinginkan di es, dicampurkan 2 µl cDNA utas pertama, 80 µl deionized H2O (milli Q filter), 10 µl Advantage 2 PCR Buffer 10 X, 2 µl DNTP mix (50 X), 2 µl 5’ PCR primer, 2 µl DS III/3’ PCR primer, dan 2 µl 50 X Advantage 2 Polymerse mix. Campuran dihomogenkan perlahan, diputar sesaat, dan ditambahkan 50 µl minyak mineral, kemudian diamplifikasi dengan program PCR, 95 0C 1 menit, serta 22 siklus yang terdiri atas (95 0C 15 detik dan 68 0C 6 menit). Sebanyak 5 µl hasil PCR dicek di gel agaros 1,1 % dan sisanya disimpan pada suhu –20 0 C. Untuk marker DNA digunakan 1 Kb DNA Ladder.

Perlakuan Proteinase K Untuk menghentikan aktivitas DNA polimerase yang terdapat dalam 50x Advantage 2 Polymerase Mix digunakan Proteinase K dengan cara inkubasi pada 45 0C selama 20 menit. Ke dalam tabung mikro 0,5 ml dicampurkan 50 µl hasil PCR dan 2 µl proteinase K (20 µg/µl). Campuran dihomogenkan, diputar sesaat, dan diinkubasi pada suhu 45 0C selama 20 menit, kemudian diputar sesaat. Ke dalam campuran ditambahkan 50 µl deionized H2O (milli-Q filter ), dan 100 µl phenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), tabung dibolak-balik selama 1-2 menit.

Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit.

Bagian atas dipipet ke tabung lain, dan ditambahkan 100 µl kloroform : isoamilalkohol (24:1), tabung dibolak-balik kembali selama 1-2 menit dan disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Bagian atas dipipet ke tabung lain, dan ditambahkan 10 µl Sodium asetat 3 M, 1,3 µl Glikogen (20 µg/µl), dan 260 µl Etanol 95 % (RT). Campuran dihomogenkan dengan membolak-balik tabung, disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 20 menit (RT).

Cairan dibuang dengan

menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan, kemudian endapan dicuci dengan

59 100 µl etanol 80%, dan disentrifus kembali pada 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang menggunakan pipet dan endapan dikering-anginkan (±10 menit), kemudian dilarutkan dengan 79 µl deionized H2 O (milli-Q filter). Digesti dengan enzim Sfi I Ke dalam tabung mikro 0,5 ml dicampurkan 79 µl cDNA, 10 µl (10 X Sfi buffer), 10 µl enzim Sfi I, dan 1 µl BSA 100 X. Campuran dihomogenkan, kemudian diinkubasi pada suhu 50 0C selama 2 jam.

Fraksinasi cDNA dengan CHROMA SPIN-400 Sebanyak 16 tabung mikro dengan volume 1,5 ml dilabel dan disusun di rak. Kemudian Chroma Spin -400 Coloum dibiarkan pada suhu kamar selama 1 jam, dibolak-balik beberapa kali sampai matrik gel tersuspensi sempurna. Gelembung udara pada kolom dihilangkan menggunakan pipet 1.000 µl. Matrik diresuspensi perlahan untuk menghindari terbentuknya gelembung udara, kemudian tutup kolom bagian bawah dibuka dan cairan dibiarkan menetes. Selanjutnya kolom diletakkan pada ring stand, dan storage buffer dibiarkan mengalir sampai terlihat lapisan atas gel berada di dalam kolom. Bagian atas matrik diupayakan berada di garis 1,0 ml dan apabila kurang ditambahkan matrik dari kolom ekstra yang disediakan. Laju pengaliran (flow rate) yang baik adalah kira-kira satu tetes/40-60 detik dan volume satu tetes kirakira 40 µl. Apabila laju pengaliran terlalu lambat dan volume sat tetes terlalu sedikit, maka matrik harus diresuspensikan kembali dan prosedur diulang sampai didapat laju pengaliran dan volume satu tetes seperti yang direkomendasikan. Pada saat storage buffer sudah berhenti menetes, perlahan ditambahkan 700 µl bufer kolom melewati dinding kolom dan dibiarkan mengalir keluar dari kolom. Apabila bufer sudah berhenti menetes (15-20 menit), dimasukkan 100 µl cDNA yang telah dipotong dengan enzim SfiI melewati dinding kolom dan sampel dibiarkan terserap seluruhnya ke lapisan atas matrik (sampai tidak ada cairan di lapisan atas). Tabung bekas sampel dicuci dengan 100 µl bufer kolom dan dimasukkan ke kolom (menggunakan pipet, melewati kolom).

Bufer

60 dibiarkan mengalir ke dalam kolom sampai lapisan atas tidak terdapat cairan. Pada tahap ini pewarna telah masuk beberapa mm. Rak yang telah berisi 16 tabung diletakkan di bawah kolom, tabung pertama tepat di bawah kolom. Kemudian ditambahkan 600 µl bufer kolom ke atas kolom dan pada saat itu tetesan fraksi (setiap tetes) ditampung ke dalam tabung ke -1 sampai tabung ke-16.

Setelah selesai kolom ditutup kembali

kemudian profil fraksinasi dicek pada agarosa 1,1 % melalui pewarnaan dengan etidium bromida 0,5 mg/l, dengan cara memipet 3 µl dari setiap tabung, ditambah loading bufer, kemudian dielektroforesis pada 150 V selama 10 menit. Fraksi dikumpulkan dalam tabung yang sama (maksimum berasal dari 3-4 tabung). Ke dalam tabung yang mengandung fraksi cDNA ditambahkan 1/10 volume Sodium asetat 3 M (pH 4,8), 1,3 µl Glikogen (20 mg/ml), dan 2,5 volume Etanol 95 %. Campuran dihomogenkan perlahan dan diinkubasi pada suhu –20 0

C (semalam).

Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14.000 rpm selama 20

menit pada suhu kamar, cairan dibuang menggunakan pipet tanpa menyentuh endapan dan tabung disentrifus sesaat supaya semua cairan turun ke bawah. Cairan dibuang, endapan yang merupakan cDNA dikering-anginkan 10 menit dan dilarutkan dengan 7 µl deionized H2 O dan dis impan pada suhu –20 0 C.

Penyiapan vektor kloning, sel bakteri kompeten dan transformasi vektor modifikasi Konstruksi pustaka cDNA meliputi kloning fragmen cDNA hasil fraksinasi ke vektor kloning sehingga menghasilkan vektor rekombinan serta introduksi vektor rekombinan ke sel inang E. coli DH5α kompeten. Kloning fragmen cDNA menggunakan pGEM-T Easy Vector Systems (Promega, Cat. No. A1360), dengan ukuran 3015 bp (Gambar 8). Karena vektor pGEM -T Easy tidak memiliki situs enzim restriksi Sfi I sedangka n sistem yang digunakan untuk menyiapkan cDNA melibatkan penggunaan enzim tersebut maka diperlu kan modifikasi terhadap vektor. Modifikasi vektor pGEM -T Easy dilakukan dengan menambahkan suatu oligo utas ganda ke vektor tersebut. Oligo Sfi 1 dan Sfi 2 masing-masing terdiri atas 38 nukleotida, dengan sekuen Sfi 1 dan Sfi 2 oligo adalah sebagai berikut :

61 5’ GGCCATTATGGCCTGCAGGATCCGGCCGCCTCGGCC GA 3’ dan 5’ CGGCCGAGGCGGCCGGATCCTGCAGGCCATAATGGCCA 3’. Sekuen oligonukleotida tersebut disisipkan pada bagian overhang-T di daerah Multiple Cloning Site (MCS) melalui proses ligasi.

Gambar 8. Peta vektor pGEM-T Easy (Promega Cat.A1360)

Oligo Sfi dipersiapkan dengan cara membuat konsentrasi kedua macam oligo menjadi 1 µg / µl dengan menambahkan akuades bebas ion.

Proses

annealing kedua oligo dilakukan dengan mencampurkan secara homogen sebanyak 5 µl oligo Sfi 1, 5 µl oligo Sfi 2, 2 µl MgCl2 (25 mM), ditambah 36 µl minyak mineral, kemudian dipanaskan di alat PCR pada suhu 100 0C selama 5 menit. Setelah itu suhu mesin PCR dibiarkan turun dengan sendirinya sampai pada 40 0C. Untuk meligasikan vektor dengan oligo Sfi, sebanyak 1 µl vektor pGEM T Easy (50 ng/µl) dicampurkan secara homogen dengan 1 µl oligo Sfi (1 ng/µl), 5 µl 2x Rapid Ligation Buffer T4 DNA ligase, 1 µl T4 DNA ligase (3 u/ µl) dan 2 µl H2O Milli-Q sehingga volume total adalah 10 µl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 4 0 C selama satu malam, dan diintroduksikan ke sel inang bakteri E. coli DH5α.

62 Introduksi vektor pGEM -T Easy hasil modifikasi dilakukan untuk mendapatkan koloni bakteri yang teruji memiliki vektor modifikasi, yakni yang telah mempunyai sisipan oligo Sfi. Untuk transformasi tersebut digunakan sel bakteri E. coli DH5α kompeten yang dipersiapkan sesuai prosedur standar (Sambrook et al. 1989) dengan melakukan optimasi pada lamanya waktu kultur. Waktu kultur yang diuji dalam pembuatan sel kompeten adalah 1,5, 2,5 dan 3 jam dengan parameter uji adalah jumlah koloni/ml medium. Sebanyak 2 µl campuran hasil ligasi antara vektor pGEM -T Easy dengan oligo Sfi dicampurkan dengan 200 µl sel bakteri kompeten, dihomogenkan dan diinkubasi di es selama 20 menit. Perlakuan panas dilaksanakan pada suhu 42 0C selama 45 – 50 detik, diletakkan di es selama minimal 2 menit (lebih baik 20 – 30 menit), kemudian ditambahkan 800 µl media SOC (100 ml mengandung 2 g tripton, 0,5 g yeast ekstrak, 1 ml NaCl 1 M, 0,25 ml KCl 1 M, 1 ml Mg

2+

2 M, 1

ml glukosa 2 M, pH 7,0) dan dihomogenkan perlahan. Campuran diinkubasi pada shaker dengan kecepatan putaran 150 rpm, 37 0 C, selama 1,5 jam. Sebanyak masing-masing 100 µl campuran disebar pada media padat LA/ampisilin/IPTG/Xgal dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama kurang lebih 16 jam. Koloni putih yang tumbuh diduga membawa vektor yang telah disisipi sekuen oligo.

Konfirmasi penyisipan sekuen oligo pada vektor dan pemurnian vektor modifikasi dari gel Untuk konfirmasi penyisipan sekuen oligo pada plasmid pGEM -T Easy dilakukan isolasi

plasmid dari empat koloni putih dan satu koloni biru yang

dipilih secara acak dari koloni yang tumbuh.

Isolasi plasmid dilakukan

berdasarkan metode standar (Sambrook et al. 1989).

Selanjutnya plasmid

dipotong ganda (double digest) dengan enzim restriksi Sfi I dan Rsa I, sesuai prosedur yang direkomendasikan.

Pemotongan plasmid dengan enzim Sfi I

dilakukan untuk konfirmasi penyisipan sekuen oligo utas ganda sedangkan pemotongan dengan enzim Rsa I adalah untuk konfirmasi jumlah fragmen hasil pemotongan. Plasmid pGEM -T Easy memiliki satu situs enzim restriksi Rsa I pada posisi 1890 bp sehingga apabila plasmid hasil modifikasi dipotong dengan kedua enzim tersebut akan menghasilkan dua fragmen, masing-masing dengan

63 ukuran sekitar 1920 bp dan 1130 bp.

Penentuan plasmid rekombinan dilakukan

berdasarkan ukuran kedua fragmen tersebut. Hasil restriksi kemudian divisualisasikan pada UV transiluminator pada gel agarose 1% melalui pewarnaan dengan etidium bromida (0,5 mg/l). Berdasarkan hasil visualisasi tersebut dipilih satu koloni yang membawa plasmid modifikasi, kemudian plasmid diisolasi dengan cara yang sama seperti di atas. Selanjutnya plasmid dilinearkan melalui pemotongan dengan enzim restriksi Sfi I dan dielektroforesis pada gel agarose 1%.

Pemurnian plasmid modifikasi

pGEM -T Easy-Oligo Sfi dari gel agarose dilakukan dengan menggunakan S.N.A.P

Gel

Purification

Kit

(Invitrogen),

sesuai

prosedur

yang

direkomendasikan. Plasmid modifikasi yang telah dilinearkan dan dimurnikan selanjutnya digunakan sebagai vektor untuk diligasikan dengan fragmen cDNA yang diperoleh melalui proses fraksinasi dengan CHROMA SPIN -400. Ligasi fragmen cDNA ke vektor pGEM -T Easy-Oligo Sfi linear dan introduksi vektor rekombinan Untuk ligasi fragmen cDNA ke vektor pGEM -T Easy-Oligo Sfi linear, dilakukan optimasi perbandingan molaritas antara vektor dengan cDNA sisipan, yaitu pada perbandingan 1 : 1, 1 : 2, dan 1 : 3. Dalam hal ini diasumsikan bahwa ukuran rata-rata cDNA sisipan adalah 1,5 kb. Reaksi ligasi dipersiapkan se perti yang disajikan pada Tabel 8.

Tabel 8. Perbandingan antara vektor dengan cDNA sisipan A (1 : 1) µl  3 Vektor pGEM -T Easy-Oligo Sfi (10 ng/µl; 0,005 pmol/µl) 1,5 cDNA sisipan (10 ng/µl; 0,01 pmol/µl) 10 T4 DNA ligase buffer (2x) 4,5 Air bebas nuklease 1 T4 DNA ligase (3 unit/ µl)

B (1 : 2) µl 3

C (1 : 3) µl 3

3 10 3 1

4,5 10 1,5 1

Masing-masing campuran di atas diinkubasi pada suhu 4 0 C selama satu malam.

Transformasi dilakukan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989)

64 menggunakan bakteri E. coli DH5α kompeten. Selanjutnya untuk setiap koloni yang diperoleh dibuat replikanya pada media LA/ampisilin, dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama kurang lebih 16 jam. Untuk penyimpanan replika jangka pendek dapat dilakukan pada suhu 4 0C, namun untuk penyimpanan jangka panjang mas ing-masing koloni disimpan di dalam media LB yang dicampur dengan 15% gliserol dan kemudian disimpan pada suhu -20 0C.

Konfirmasi koloni transforman yang membawa cDNA sisipan Untuk konfirmasi penyisipan fragmen cDNA pada vektor plasmid pGEM -T Easy-Oligo Sfi, dilakukan PCR koloni menggunakan primer T7 dan SP6, yaitu primer yang secara langsung dapat mengidentifikasi adanya sisipan pada vektor karena sekuennya mengapit daerah sisipan tersebut. Pasangan primer T7 dan SP6 mengamplifikasi plasmid pada daerah yang meliputi tempat penyisipan DNA target, sepanjang kurang lebih 200 bp. Plasmid rekombinan yang membawa cDNA sisipan adalah plasmid yang hasil amplifikasinya dengan pasangan primer tersebut lebih dari 200 bp. Koloni bakteri yang tumbuh dipilih secara acak, diambil dengan pipet tip dan dimasukkan ke dalam tabung PCR yang telah diisi dengan 10 µL akuades dan dicampur dengan larutan PCR yang mengandung bufer reaksi 1X, dNTPs 0,2 mM, Taq DNA polimerase 1 unit serta primer SP6 dan T7 masing-masing 10 pmol. Reaksi PCR dilaksanakan pada suhu denaturasi 94 0C selama 1 menit, annealing 56 0 C selama 1 menit, extension 72 0C selama 2 menit, yang diulang sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dan marker DNA dielektroforesis pada 2% gel agarose dengan tegangan 50 V sela ma kurang lebih 1 jam, diwarnai dengan 0,5 mg/l etidium bromida dan divisualisasikan menggunakan UV transiluminator.

HASIL

RNA dan cDNA dari daun karet klon AVROS 2037 Hasil isolasi RNA dari daun karet klon AVROS 2037 terdapat pada Gambar 9.

Berdasarkan pengukuran dengan spektrofotometer UV diketahui

bahwa RNA yang diperoleh memiliki kualitas yang baik, ditunjukkan oleh

65 perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm, yakni sekitar 1,80. Hal tersebut diperkuat oleh hasil elektroforesisnya dimana pita 28 S dan 18 S rRNA terlihat tajam sedangkan RNA yang terdegradasi hampir tidak teramati pada gel agarose tersebut (Gambar 9 A). Konsentrasi RNA berdasarkan pengukuran dengan spektrofotometer UV adalah sekitar 300 µg/g daun segar. Kualitas mRNA yang diperoleh juga cukup tinggi, ditunjukkan oleh keberhasilan dalam proses sintesis cDNA dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan (Gambar 9 B).

Tahapan paling kritis dalam sintesis cDNA adalah

konversi mRNA menjadi cDNA utas pertama yang melibatkan aktivitas enzim reverse transcriptase (RT).

bp

28 S 18 S

M

1

2

4072 1636 506

A

Gambar 9.

B

(A) RNA total dari daun kare t klon AVROS 2037, dipisahkan pada 0,8% gel agarose. (B) cDNA dari daun karet klon AVROS 2037 pada 1% gel agarose. M: 1 kb DNA ladder; (1) cDNA dari daun klon AVROS 2037, (2) kontrol positf.

Dengan menggunakan RT yang berasal dari Moloney murine leukimia virus (MMLV), cDNA utas ganda dari daun klon AVROS 2037 berhasil diperoleh dengan penampakan smear pada gel agarose, mulai dari ukuran kurang dari 500 bp sampai sekitar 4 kb (Gambar 9 B). Sedangkan kontrol positif juga terlihat smear dengan intensitas yang lebih tinggi pada daerah dengan ukuran sekitar 1500 bp.

Berdasarkan petunjuk teknisnya, keunggulan sistem sintesis cDNA yang

diaplikasikan dalam penelitian ini adalah kemampuannya untuk mengeliminasi transkrip yang tidak lengkap disebabkan ter hentinya (terminate) aktivitas enzim RT sebelum sekuen mRNA ditranskripsi seluruhnya.

66 Fraksinasi cDNA Untuk mendapatkan fragmen cDNA dilakukan fraksinasi dengan menggunakan kolom CHROMA SPIN -400, yang prinsipnya didasarkan pada pengeluaran cDNA dengan cara kromatografi. Hasil elektroforesis 3 µl masingmasing fraksi pada gel agarose 1,1 % berdampingan dengan marka DNA terdapat pada Gambar 10. M 1 2 3 4 5 6 7 8

9 10 11 M 12 13 14 15 16

bp 4072

506

Gambar 10. Fraksinasi fragmen cDNA pada 1,1% gel agarose menggunakan kolom CHROMA SPIN-400. M: 1 kb DNA Ladder, 1-16 adalah tetesan pertama sampai tetesan ke-16 pada fraksinasi. Fragmen cDNA yang dapat diamati secara visual mulai dari tetesan ke-9 sampai tetesan ke -15 dengan ukuran sekitar 500 bp sampai 4 kb (Gambar 10). Setiap tiga fraksi dikumpulkan dalam satu tabung, kemudian dipekatkan sesuai prosedur yang disarankan sehingga akhirnya diperoleh sebanyak 7 µl cDNA dengan konsentrasi sekitar 100 ng/µl.

Konsentrasi tersebut ditetapkan

berdasarkan hasil elektroforesis 1 µl cDNA berdampingan dengan marka DNA yang telah diketahui konsentrasinya.

Fragmen cDNA pada tahap berikutnya

diligasikan dengan vektor pGEM -T

Easy-Oligo Sfi

I dan kemudian

diintroduksikan ke bakteri E. coli DH5α kompeten.

Waktu kultur dan seleksi vektor modifikasi Tiga tahapan waktu kultur yang diuji dalam optimasi pembuatan sel bakteri E. coli DH5α kompeten terdapat pada Tabel 9. Jumlah optimal bakteri diperoleh pada waktu kultur 2,5 jam, dengan OD pada panjang gelombang 600

67 nm adalah 0,549. Penambahan waktu kultur menjadi 3 jam dapat meningkatkan nilai OD namun tidak meningkatkan jumlah koloni. Berdasarkan hasil tersebut maka untuk pembuatan sel bakteri kompeten dilakukan kultur selama 2,5 jam dengan OD sekitar 0,5.

Tabel 9. Jumlah koloni E. coli DH5α selama waktu kultur Waktu kultur (Jam)

OD λ 600 nm

Jumlah koloni/ ml

1,5 2,5 3,0

0,170 0,549 0,668

1,1 x 108 3,0 x 108 2,1 x 108

Introduksi plasmid pGEM -T Easy yang telah diligasikan dengan 38 bp oligonukleotida ke bakteri E. coli DH5α kompeten menghasilkan koloni putih dan koloni biru pada media LA/ampisilin. Sebanyak 4 koloni putih dan satu koloni biru dipilih secara acak dan ditumbuhkan pada media cair LB/ampisilin. Plasmid yang diisolasi dari masing-masing koloni dan kemudian dipotong ganda dengan enzim restriksi SfiI dan RsaI terdapat pada Gambar 11. 1 7 B 9 8 M a b a b a b a b a b bp 2036 1018

Gambar 11. Pemotongan plasmid pGEM -T Easy-Oligo Sfi dengan enzim restriksi Rsa I dan Sfi I. M: 1 kb DNA Ladder. 1, 7, 8, 9 adalah plasmid dari koloni putih no. 1, 7, 8 dan 9. B adalah plasmid dari koloni biru. (a) plasmid tidak dipotong, (b) plasmid dipotong. Plasmid dari koloni nomor 1, 7, 8 dan 9 yang dipotong dengan kedua enzim restriksi tersebut (b) menghasilkan dua fragmen dengan ukuran sekitar

68 1920 bp dan 1130 bp, sedangkan yang tidak dipotong (a) menghasilkan fragmen dengan ukuran sekitar 3000 bp lebih.

Jumlah fragmen lebih dari satu pada

plasmid yang tidak dipotong diduga disebabkan topologi plasmid, yaitu adanya plasmid berbentuk sirkuler, linear dan supercoil. Plasmid asal koloni biru (B) yang dipotong dengan kedua enzim restriksi tersebut (b) hanya menghasilkan satu fragmen dengan ukuran sekitar 3000 bp. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid tersebut dipotong oleh enzim RsaI tetapi tidak dipotong oleh enzim SfiI sehingga menghasilkan pla smid dalam bentuk linear. Berdasarkan hasil tersebut plasmid yang berasal dari empat koloni putih dimurnikan dan dikoleksi sebagai vektor modifikasi, dan untuk ligasi fragmen cDNA dalam penelitian ini digunakan plasmid asal koloni nomor 7 sebagai vektor. Konstruksi pustaka cDNA pada vektor pGEM -T Easy-Oligo Sfi Hasil ligasi antara fragmen cDNA sisipan dengan vektor pGEM -T EasyOligo Sfi masing-masing pada perbandingan vektor dan cDNA terdapat pada Tabel 10. Titer tertinggi diperoleh pada perbandingan molaritas vektor dan cDNA 1 : 3 sehingga untuk selanjutnya ligasi vektor dengan fragmen cDNA dilakukan pada perbandingan tersebut. Tabel 10. Perbandingan molaritas vektor dan cDNA sisipan dalam proses ligasi Molaritas Vektor : cDNA

Titer Cfu/ µg cDNA

1:1 1:2 1:3

2,96 x 103 2,48 x 104 2,87 x 104

Ligasi seluruh fragmen cDNA dengan vektor pGEM-T Easy-Oligo Sfi dan kemudian introduksinya pada sel bakteri E. coli DH5α kompeten menghasilkan sekitar 8000 koloni. Sebagai gambaran, dari satu kali transformasi dengan menggunakan perbandingan molaritas vektor dan cDNA 1 : 3 seperti tersebut di atas, diperoleh 1325 koloni dengan titer rata -rata 2,70 x 104 (Tabel

69 11). Masing-masing koloni dibuat replikanya (Gambar 12) dan disimpan pada suhu 4 0 C. Sedangkan untuk penyimpanan dalam waktu lama digunakan media LB yang mengandung 15% gliserol, dan disimpan pada suhu –20 0C.

Tabel 11. Jumlah koloni hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media seleksi serta titernya. Jumlah koloni No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

94 66 68 38 74 68 71 73 62 65 71 72 74 68 58 78 61 61 75 55 1352 (total koloni)

Titer Cfu*)/µg DNA 3,76 x 104 2,64 x 104 2,72 x 104 1,52 x 104 2,96 x 104 2,72 x 104 2,84 x 104 2,92 x 104 2,48 x 104 2,60 x 104 2,84 x 104 2,88 x 104 2,96 x 104 2,72 x 104 2,32 x 104 3,12 x 104 2,44 x 104 2,44 x 104 3,00 x 104 2,20 x 104 2,70 x 104 (rata-rata titer)

*) cfu = colony forming unit

Pada proses konstruksi pustaka cDNA yang dilakukan dalam penelitian ini, kandidat transforman tidak ditentukan melalui seleksi biru-putih pada media yang mengandung IPTG dan X-gal. Hal ini disebabkan vektor yang digunakan adalah vektor modifikasi dimana daerah operon lac Z telah disisipi oleh oligo Sfi sehingga baik transforman maupun non-transforman akan menghasilkan koloni berwarna putih pada media tersebut. Oleh karena itu keberhasilan kloning atau penyisipan cDNA ke vektor dikonfirmasi melalui amplifikasi PCR, menggunakan

70 primer T7 dan SP6.

Pasangan primer tersebut akan mengamplifikasi DNA

plasmid sepanjang 200 bp apabila tidak terdapat cDNA sisipan. Namun apabila fragmen hasil amplifikasi lebih dari 200 bp, maka kelebihan tersebut merupakan fragmen cDNA yang menyisip pada vektor plasmid. Kondisi demikian dapat diperoleh karena vektor pGEM -T Easy telah dirancang dengan menempatkan daerah sisipan di antara kedua primer (T7 dan SP6). Keuntungan lain menggunakan sistem vektor tersebut adalah tahapan isolasi plasmid tidak diperlukan karena dapat langsung dilakukan amplifikasi PCR terhadap masing-masing koloni yang diuji. Oleh karena itu cara ini merupakan cara cepat untuk konfirmasi keberadaan DNA sisipan pada vektor (koloni transforman) ya ng sekaligus dapat menunjukkan ukuran DNA sisipan.

Gambar 12. Replika contoh koloni hasil transformasi vektor rekombinan pada bakteri E. coli DH5α.

Sebanyak 285 koloni dari 8000 koloni yang ada dipilih secara acak untuk seleksi koloni transforman melalui PCR dan dari jumlah tersebut sebanyak 270 koloni menghasilkan produk PCR.

Hasil sebagian PCR koloni terdapat pada

Gambar 13. Ukuran fragmen cDNA yang diperoleh dari PCR berkisar antara 200 bp sampai 2200 bp. Fragme n dengan ukuran 200 bp dapat dipastikan bukan merupakan cDNA sisipan tapi adalah hasil amplifikasi dari bagian vektornya sendiri, sehingga koloni yang membawa fragmen dengan ukuran tersebut bukan merupakan koloni transforman.

71 Dari 270 koloni yang telah diuji melalui PCR koloni, hanya 17 koloni yang plasmid-nya tidak memiliki sisipan cDNA atau bukan koloni transforman, sedangkan sebagian besar (253 koloni) memiliki cDNA sisipan. Berdasarkan gambaran yang diperoleh dari PCR koloni tersebut maka dapat diperkirakan bahwa sebanyak kurang lebih 93% koloni yang telah diperoleh dalam konstruksi pustaka cDNA membawa plasmid yang telah tersisipi dengan fragmen cDNA asal daun karet klon AVROS 2037.

bp

bp

2036

2036

506

506

(A) koloni no. 11-26 bp

(B) koloni no. 48-62 bp

2036 2036 506

506

(C) koloni no.80-98 bp

(D) koloni no.192-209 bp 2036

2036 506 506

(E) koloni no.224-239

(F) koloni no.1275 -1290

Gambar 13. Amplifikasi contoh koloni dengan primer T7 dan SP6 pada 2% gel agarose dengan pewarnaan etidium bromida. M: 1 kb DNA Ladder. (A) DNA dari koloni nomor 11–26, (B) DNA dari koloni nomor 4862, (C) DNA dari koloni nomor 80-98, (D) DNA dari koloni nomor 192-209, (E) DNA dari koloni nomor 224-239, (F) DNA dari koloni nomor 1275-1290.

72 Ukuran fragmen cDNA yang menyisip pada vektor kloning (pGEM-T Easy-Oligo Sfi) berkisar antara 200 bp sampai sekitar 2000 bp dengan kisaran ukuran fragmen terbanyak adalah antara 500 – 800 bp (Gambar 14). Pada saat dilakukan fraksinasi fragmen cDNA, ukuran fragmen terkecil yang teramati pada gel agarose adalah sekitar 500 bp sedangkan ukuran terbesar adalah sekitar 4000 bp.

Adanya fragmen dengan ukuran di bawah 500 bp yang diperoleh dari

amplifikasi ini mengindikasikan bahwa fraksinasi juga menghasilkan fragmen cDNA lebih kecil dari 500 bp, namun diduga karena jumlahnya tidak mencukupi maka tidak bisa diamati pada gel agarose. Dari 270 koloni yang diamati tersebut belum diperoleh koloni yang membawa plasmid dengan ukuran fragmen cDNA sisipan di atas 2000 bp. Hal ini diduga berhubungan dengan kemudahan penyisipan fragmen pada vektor kloning, dimana fragmen dengan ukuran lebih kecil akan lebih mudah menyisip

Jumlah Koloni

dibandingkan dengan fragmen dengan ukuran yang lebih besar.

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 100 300 500 700 900 1100 1300 1500 1700 1900 Panjang Fragmen Sisipan (bp)

Gambar 14. Distribusi ukuran cDNA sisipan pada pustaka cDNA dari daun klon karet AVROS 2037. Sampel terdiri atas 270 koloni yang dipilih secara acak dari pustaka cDNA.

73 PEMBAHASA N Dalam penelitian ini, kemurnian RNA yang diperoleh cukup baik, demikian juga konsentrasinya cukup tinggi, yakni sekitar 300 µg/g daun segar. Konsentrasi tersebut lebih rendah apabila dibandingkan dengan hasil isolasi RNA daun karet yang dilakukan oleh Thomas et al. (2002), yang menggunakan guanidinium thiocyanate sebagai denaturan dimana dari setiap gram jaringan daun berhasil diisolasi RNA antara 420 – 500 µg. Sedangkan metode Pawlowski et al. (1994) yang diaplikasikan dalam penelitian ini menggunakan fenol sebagai denaturan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk mendapatkan RNA tanaman dengan kualitas yang baik serta jumlah yang memadai untuk digunakan dalam analisis selanjutnya (Pawlowski et al. 1994; Tesniere dan Vayda 1991). Pada sebagian besar spesies tanaman, terutama tanaman berkayu, senyawa fenolik dan polisakarida sering sulit dipisahkan dari asam nukleat.

Senyawa fenol dapat

membentuk komplek tidak terlarut dengan asam nukleat sedangkan polisakarida dapat mengendap bersama dengan asam nukleat pada saat dilakukan pengendapan dengan etanol. Oleh karena itu, biasanya prosedur isolasi RNA bersifat spesifik tergantung jenis tanaman dan jaringan. Di samping itu, konsentrasi RNA yang dihasilkan dalam suatu proses isolasi berhubungan erat dengan metode isolasi yang digunakan serta bagian tanaman yang diambil sebagai sumber RNA.

Secara umum pendekatan yang

dilakukan untuk mengisolasi RNA adalah melalui lisis sel atau jaringan dan kemudian memisahkan makromolekul dengan menggunakan larutan denaturasi. Sejauh ini dilaporkan bahwa garam guanidium lebih efisien sebagai denaturan dibandingkan dengan fenol (Das et al. 2001). Namun seringkali prosedur isolasi yang dipilih disesuaikan dengan kondisi laboratorium dan ketersediaan bahan, terutama apabila kualitas serta kuantitas RNA memenuhi syarat untuk analisis selanjutnya. Dari beberapa kali pelaksanaan pemurnian mRNA menggunakan Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega) diketahui bahwa mRNA yang bisa dimurnikan berkisar antara 0,25 – 1,00 %. Umumnya dari setiap 1000 µg RNA

74 total, mRNA yang diperoleh adalah sekitar 2,5 µg, yakni 0,25% dari total RNA. Dengan metode yang sama Thomas et al. (2002) memperoleh mRNA dalam jumlah yang lebih banyak yakni sebesar 1% dari total RNA.

Perbedaan

konsentrasi mRNA yang diperoleh diduga berhubungan erat dengan umur tanaman yang digunakan sebagai sumber RNA.

Thomas et al. (2002)

menggunakan tanaman semaian umur 8 minggu sebagai sumber RNA sedangkan penelitian ini menggunakan tanaman hasil okulasi yang memilik i sifat sebagai tanaman dewasa. Penggunaan tanaman okulasi yang merupakan klon sebagai sumber RNA didasarkan pada pertimbangan bahwa resistensinya terhadap C. cassiicola telah teruji, baik di lapangan maupun di rumah kaca. Kelebihan metode sintesis cDNA yang diaplikasikan dalam penelitian ini adalah kemampuannya untuk menghasilkan berbagai cDNA yang panjang dan utuh (full-length cDNAs) dari RNA total atau mRNA. Pada prinsipnya kit ini menginkorporasikan situs enzim restriksi Sfi I asimetrik (Sfi IA dan Sfi IB) pada ujung 5’ dan 3’ cDNA sehingga setelah pemotongan dengan enzim restriksi Sfi I dan fraksinasi berdasarkan ukuran dengan kolom CHROMA SPIN , cDNA tersebut dapat diligasikan ke vektor kloning yang juga dipotong dengan enzim yang sama. Secara keseluruhan, keberhasilan konstruksi pustaka cDNA sangat tergantung pada banyak faktor, baik pada tahap isolasi RNA, pemurnian mRNA, sintesis cDNA, kloning fragmen pada vektor, maupun introduksi vektor transforman ke sel bakteri inang. Berbagai metode untuk setiap tahapan tersebut telah dilaporkan, namun pemilihan metode yang akan diaplikasikan sangat tergantung pada kebutuhan serta tujuan penelitian.

Pada tahap isolasi RNA,

masalah yang sering dijumpai adalah sulitnya menghilangkan aktivitas RNase yang menyebabkan degradasi RNA. Hal ini biasanya diatasi melalui perlakuan dietilpirokarbonat (DEPC), baik pada larutan yang digunakan untuk mengisolasi RNA maupun pada peralatan (Raha et al. 1998). Sedangkan pada sintesis cDNA kesulitan utama adalah mendapatka n cDNA yang utuh (full-length cDNAs) karena seringkali aktivitas enzim reverse transcriptase (RT) terhenti sebelum seluruh sekuen mRNA ditranskripsi.

75 Enzim RT yang umum digunakan berasal dari avian myeloblastosis virus (AMV) dan Moloney murine leukimia virus (MMLV), namun telah dibuktikan bahwa laju kesalahan konversi dengan AMV lebih tinggi dibanding MMLV (Ji dan Loeb 1992; Roberts et al. 1989). Oleh karena itu, sistem yang digunakan untuk meng-konversi mRNA asal daun karet menjadi cDNA utas pertama mengaplikasikan RT yang berasal dari MMLV. Sedangkan sintesis utas kedua didasarkan pada metode klasik yang menggabungkan aktivitas E. coli RNase H dan DNA polimerase I untuk mengkatalisis sintesis utas kedua dari hibrid mRNAcDNA (Gubler dan Hoffman 1983; Okayama dan Berg 1982). Faktor lain yang juga berperan dalam keberhasilan konstruksi pustaka cDNA adalah pemilihan vektor yang sesuai. Pustaka cDNA dapat diklon pada vektor plasmid ataupun bakteriofage, dimana masing-masing sistem memiliki kelebihan dan kekurangan (Das et al., 2001).

Namun hal utama yang perlu

diperhatikan adalah vektor tersebut harus mudah dimanipulasi, memungkinkan untuk eksisi cDNA sisipan secara mudah serta sesuai dengan metode sekuensing atau hibridisasi yang tersedia saat ini. Dengan mempertimbangkan berbagai faktor di atas maka untuk kloning fragmen cDNA digunakan vektor plasmid pGEMT-Easy.

Kelebihan vektor

tersebut adalah manipulasinya mudah dan verifikasi penyisipan fragmen dapat dilakukan melalui PCR dengan menggunakan primer universal SP6 dan T7. Namun kelemahannya, vektor tersebut tidak memiliki situs pemotongan enzim restriksi Sfi I seperti yang digunakan untuk menyiapkan cDNA. Oleh karena itu dilakukan modifikasi terhadap vektor dengan menambahkan suatu oligo utas ganda sepanjang 38 nukleotida yang mengandung situs pemotongan Sfi I di bagian overhang-T di daerah Multiple Cloning Site (MCS), yang dilakukan melalui proses ligasi.

Modifikasi terhadap vektor kloning berhasil baik dan

penggunaan vektor tersebut dalam proses kloning berjalan cukup efisien karena sekitar 93% koloni yang diperoleh membawa plasmid yang telah tersisipi dengan fragmen cDNA asal daun karet. Pustaka cDNA asal daun karet klon AVROS 2037 yang diperoleh dalam penelitian ini pada tahap selanjutnya akan diidentifikasi untuk mendapatkan informasi mengenai keragaman fragmen cDNA yang menyisip.

Berdasarkan

76 pengertian pustaka cDNA yang mengarah pada koleksi cDNA yang berbeda, maka tingkat keragaman cDNA yang tinggi akan mencerminkan semakin baiknya pustaka yang dimiliki. Di samping itu pustaka cDNA yang diperoleh juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi transkrip/cDNA yang berperan dalam resistensi klon AVROS 2037 terhadap cendawan C. cassiicola , penyebab penyakit gugur daun pada tanaman karet.

KESIMPUL AN

Dari setiap gram jaringan daun karet dari klon AVROS 2037 yang diberi perlakuan patogen C. cassiicola, dapat diisolasi RNA sekitar 300 µg, dan dari jumlah tersebut mRNA dapat dimurnikan sebanyak 0,25%. Kombinasi antara sistem sintesis cDNA dengan sistem kloning menggunakan vektor modifikasi, telah menghasilkan pustaka cDNA asal daun karet klon AVROS 2037 dengan jumlah 8000 koloni. PCR koloni menggunakan pasangan primer SP6 dan T7 yang dilakukan terhadap 270 koloni yang dipilih secara acak mengindikasikan bahwa sekitar 93% dari koloni tersebut mengandung sisipan cDNA, dengan panjang cDNA sisipan antara 200 - 2000 bp. Ukuran fragmen cDNA terbanyak berkisar antara 500 – 800 bp. Dengan demikian maka material genetik asal daun karet klon resisten AVROS 2037 telah tersedia sehingga dapat digunakan sebagai salah satu sumber untuk mengisolasi kandidat transkrip yang berperan dalam mekanisme pertahanan tanaman karet terhadap infeksi C. cassiicola .

BAB 5 OPTIMASI METODE cDNA-AFLP DAN PENGUJIAN VISUALISASI NON-RADIOAKTIF PADA cDNA ASAL DAUN KARET ABSTRAK Aplikasi metode AFLP dan visualisasi produk AFLP langsung pada gel poliakrilamid melalui pewarnaan dengan perak nitrat telah terbukti dapat digunakan untuk DNA genomik asal daun tanaman karet. Metode serupa digunakan dalam percobaan ini untuk mem-visualisasikan produk cDNA-AFLP dari cDNA tanaman yang sama. Tujuan percobaan adalah untuk mendapatkan kondisi cDNA-AFLP optimum, baik dari segi tahapan prosesnya, pemisahan fragmen cDNA pada gel maupun dari proses visualisasinya secara langsung pada gel tersebut tanpa menggunakan primer yang dilabel secara radio aktif. Optimasi diperlukan untuk memperoleh kondisi ideal untuk digunakan dalam studi ekspresi gen pada saat terjadi interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola. Untuk mencapai tujuan tersebut digunakan daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444 sebagai sumber RNA. Optimasi dilakukan dengan mempertimbangkan beberapa faktor seperti pasangan enzim restriksi untuk memotong cDNA dalam proses preparasi sampel, tingkat pengenceran produk preamplifikasi, kombinasi primer pada amplifikasi selektif, serta jenis DNA polimerase. Dengan menggunakan pasangan enzim restriksi EcoRI-MseI, jumlah fragmen cDNA yang diperoleh adalah antara 0 – 6 fragmen, sedangkan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI menghasilkan fragmen antara 0 – 20 fragmen. Kombinasi primer selektif Vsp (Vsp-CC dan Vsp-GC) dengan berbagai primer selektif Taq (Taq-CC, Taq-CG, Taq-GC, Taq-GG, Taq-GA, Taq-GT, Taq-TC, Taq-TG) memberikan hasil amplifikasi yang lebih baik dibandingkan dengan kombinasi antara primer VspGG, Vsp-AC dan Vsp-GA dengan primer Taq yang sama . Namun secara keseluruhan visualisasi produk cDNA-AFLP secara langsung pada gel dengan cara mewarnai gel dengan larutan perak nitrat belum memberikan hasil yang memuaskan karena pewarnaan fragmen tidak merata sehingga fragmen dengan ukuran molekul lebih besar tidak dapat diamati dengan baik. Kata kunci: Kombinasi primer, cDNA-AFLP , non-radioaktif, Hevea brasiliensis

PENDAHULUAN Berbagai teknik telah dikembangkan untuk mempelajari dan mendapatkan transkrip atau gen yang diekspresikan secara temporal (dalam suatu waktu tertentu) atau secara spatial (dalam suatu jaringan tertentu).

Teknik in vitro

78 pertama untuk mengetahui pola ekspresi suatu transkrip adalah differential display reverse transcription PCR (DDRT-PCR) yang dikembangkan oleh Liang dan Pardee (1992).

Setelah itu berkembang beberapa teknik lain seperti serial

analysis of gene expression (SAGE) (Velculescu et al. 1995) , microarray (Schena et al. 1995), serta cDNA amplified length polymorphism (cDNA-AFLP) (Bachem et al. 1996). Dibanding DDRT-PCR, teknik cDNA-AFLP mempunyai kelebihan karena menghasilkan fragmen dua kali lebih banyak perkombinasi primer (Gellatly et al. 2001). cDNA-AFLP merupakan teknik sidik jari RNA yang dikembangkan dari metode AFLP (Vos et al. 1995) yang digunakan untuk mengidentifikasi sidik jari DNA genomik.

Oleh karena itu prosedur cDNA-AFLP mengikuti prosedur

AFLP, yang terdiri atas 3 tahapan utama, yaitu (1) restriksi cDNA dan ligasi adapter oligonukleotida, (2) amplifikasi selektif terhadap fragmen cDNA hasil restriksi menggunakan primer yang ditambahkan 1-3 nukleotida selektif, serta (3) visualisasi fragmen hasil amplifikasi pada gel.

Pemotongan cDNA dengan

kombinasi dua macam enzim restriksi, yaitu enzim yang memotong masingmasing pada empat dan enam sekuen pengenalan (tetracutter dan hexacutter), memungkinkan untuk memperoleh fragmen cDNA yang akan terlihat diskrit pada poliakrilamid gel. Berbeda dengan AFLP genomik yang umumnya memerlukan tiga nukleotida selektif agar DNA terlihat diskrit pada gel, cDNA-AFLP biasanya hanya memerlukan dua nukleotida selektif karena kompleksitas cDNA lebih rendah dibandingkan DNA. Ukuran fragmen cDNA terbesar yang terlihat pada gel umumnya adalah sekitar 1000 bp dan yang terkecil adalah sekitar 100 bp. Sesuai dengan prosedur aslinya (Vos et al. 1995), umumnya deteksi fragmen-fragmen AFLP memerlukan pelabelan salah satu primer dengan radioisotop (32P atau

33

P). Fragmen hasil amplifikasi kemudian dipisahkan pada

gel poliakrilamid yang didenaturasi (sekuensing gel) dan visualisasi fragmen dilakukan dengan cara mengekspos gel pada film autoradiografi.

Namun

penggunaan radioisotop kadang menyulitkan karena tidak semua laboratorium dilengkapi dengan fasilitas untuk penggunaan bahan radioisotop tersebut. Di samping itu teknik tersebut relatif mahal serta penanganannya harus sangat hatihati karena dapat membahayakan kesehatan.

79 Deteksi fragmen AFLP secara non-radioisotop dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain melalui pelabelan primer secara fluorescent, chemiluminescent ataupun secara in situ menggunakan pewarna perak nitrat (Lin et al. 1997; Chalhoub et al. 1996).

Masing-masing metode tersebut dengan

modifikasi yang sesuai telah dibuktikan memberikan hasil yang sebanding, baik sensitivitas maupun resolusinya, dengan deteksi fragmen AFLP menggunakan primer yang dilabel secara radioisotop. Deteksi produk AFLP langsung pada gel menggunakan pewarna perak nitrat pertama kali dilaporkan oleh Chalhoub et al. (1996). Metode tersebut diaplikasikan pada DNA asal daun tanaman Pisum sativum yang dipotong dengan enzim restriksi MseI dan EcoRI. Perbandingan antara produk AFLP radioaktif yang divisualisasikan melalui autoradiografi dengan produk AFLP non-radioaktif yang divisualisasikan langsung pada gel poliakrilamid melalui pewarnaan dengan perak nitrat menunjukkan sensitivitas dan resolusi yang sama. Perbedaan terletak pada ketebalan serta intensitas fragmen.

Pada gel poliakrilamid yang

didenaturasi, utas ganda fragmen DNA akan bermigrasi sebagai pita ganda karena perbedaan da lam mobilitas elektroforesisnya sehingga seringkali teramati sebagai pita yang tebal atau sebagai pita ganda. Dengan prosedur radioaktif hanya satu utas fragmen teramplifikasi yang divisualisasikan pada film autoradiografi karena hanya satu primer yang dilabel.

Di samping itu intensitas pita yang berbeda

seringkali ditemukan pada gel poliakrilamid yang diwarnai dengan perak nitrat. Umumnya pita dengan berat molekul tinggi yang terletak di bagian atas gel, intensitasnya lebih tinggi dibandingkan dengan pita ber berat molekul rendah yang terdapat di bagian bawah gel. Namun dilaporkan melalui beberapa modifikasi masalah tersebut dapat diatasi. Salah satu keuntungan visualisasi produk AFLP langsung pada gel adalah kemudahan di dalam mengisolasi fragmen DNA spesifik yang diinginkan. Chalhoub et al. (1996) telah mengembangkan metode sederhana untuk mengisolasi fragmen spesifik hanya melalui rehidrasi fragmen dengan menggunakan akuades.

Metode tersebut dapat digunakan untuk mengisolasi

fragmen DNA dari gel yang telah disimpan selama lebih dari satu tahun.

80 Untuk mengidentifikasi gen-gen yang diekspresikan secara diferensial melalui teknik cDNA-AFLP, visualisasi produk AFLP langsung pada gel poliakrilamid yang didenaturasi melalui pewarnaan dengan perak nitrat telah dilaporkan pada tanaman ubi kayu (Manihot esculenta) (Santaella et al. 2004). Melalui teknik tersebut berhasil diperoleh sebanyak 32 transcript-derived fragments (TDFs) yang memiliki kesamaan dengan protein-protein yang berhubungan dengan mekanisme pertahanan tanaman. Pada DNA genomik asal daun karet telah dibuktikan bahwa modifikasi metode visualisasi produk AFLP melalui pewarnaan dengan perak nitrat serta reduksi ukuran gel tetap dapat menghasilkan fragmen-fragmen yang terlihat diskrit pada gel poliakrilamid yang didenaturasi (Bab 3). Namun belum diketahui apa kah metode visualisasi yang sama juga dapat diaplikasikan untuk mengidentifikasi fragmen cDNA spesifik yang diinginkan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi optimum aplikasi metode cDNA-AFLP pada tanaman karet serta visualisasi produk cDNA-AFLP secara langsung melalui pewarnaan dengan perak nitrat.

Apabila kondisi

optimum diperoleh maka pelabelan primer selektif dengan bahan radio aktif dapat dihindarkan.

BAHAN DAN METODE Bahan tanam karet Bahan tanam karet yang digunakan sebagai sumber RNA adalah daun da ri klon AVROS 2037 dan PPN 2444, yang ditanam dalam polibeg dan dipelihara melalui penyiraman serta pemupukan.

Untuk mendapatkan tunas-tunas baru

dilakukan pemangkasan tanaman secara teratur.

Daun diambil setelah bahan

tanam karet berada pada fase pertumbuhan dua unit daun dan daun berumur sekitar dua minggu.

Isolasi total RNA dan pemurnian mRNA RNA diisolasi dari jaringan daun berdasarkan metode Pawlowski et al. (1994) yang dimodifikasi sedangkan mRNA dimurnikan dari RNA dengan

81 menggunakan Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega).

Prosedur

isolasi RNA serta pemurnian mRNA dilakukan sama seperti yang terdapat pada Bab 4.

Sintesis cDNA Universal Riboclone  cDNA Synthesis System (Promega) digunakan untuk sintesis cDNA dari mRNA cetakan sesuai prosedur yang direkomendasikan. Sebanyak 2 µg mRNA dicampurkan dengan 1 µg oligo(dT) primer, kemudian volumenya dijadikan 15 µl dengan menambahkan air bebas nuklease. Sebagai kontrol positif digunakan 1,2-kb kanamisin dengan konsentrasi sama (2 µg). Campuran contoh maupun kontrol positif dihomogenkan, kemudian dipanaskan pada suhu 700 C selama 5 menit, didinginkan dalam es selama 5 menit dan diputar sebentar pada alat sentrifus untuk mengumpulkan larutan di dasar tabung. Untuk sintesis cDNA utas pertama ditambahkan First Strand 5X Buffer, RNasin Ribonuclease Inhibitor , Sodium Piropospat, AMV Riverse Transcriptase dan air bebas nuklease sampai volumenya mencapai 25 µl. Campuran dihomogenkan secara perlahan, diinkubasi pada 420 C selama 1 jam dan didinginkan dalam es.

Untuk sintesis utas kedua sebanyak 20 µl

campuran dari reaksi utas pertama dicampurkan secara homogen dengan Second Strand 2.5X Buffer, DNA Polymerase I, RNase H, dan air bebas nuklease sampai mencapai volume 100 µl. Campuran diinkubasi pada suhu 140 C selama 2 jam, kemudian dipanaskan pada 700 C selama 10 menit, diputar sesaat, dan diletakkan dalam es. Ke dalam campuran ditambahkan T4 DNA Polymerase dan diinkubasi pada suhu 370 C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 10 µl EDTA 200mM.

cDNA diekstrak melalui penambahan (fenol : kloroform :

isoamilalkohol) jenuh TE dengan volume sama, dikocok kuat, disentrifus pada kecepatan putaran 11.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang. Cairan bagian atas dipipet dan ditambah dengan 1/10 volume natrium asetat 3M pH 5,2 serta 2,5 volume alkohol absolut dingin, kemudian dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu –200 C selama semalam.

Larutan

disentrifus pada 11.000 rpm selama 10 menit, cairan dibuang, endapan mRNA dicuci dengan 500 µl alkohol 70%, disentrifus kembali pada 11.000 rpm, 10

82 menit.

Cairan dibuang, endapan cDNA dikering-anginkan, kemudian sampel

dilarutkan dengan 18 µl deionized H2 O steril, sedangkan kontrol positif dilarutkan dengan 15 µl deionized H2O steril. Untuk visualisasi hasil sintesis cDNA hanya digunakan cDNA kontrol karena cDNA contoh akan digunakan dalam proses selanjutnya. Ke dalam 15 µl campuran kontrol positif ditambahkan sebanyak 3 µl loading buffer, kemudian campuran tersebut dimasukkan ke dala m sumur gel agarose 1,4% yang mengandung 0,5 µg/ml etidium bromida, dan dielektroforesis pada tegangan 50 Volt selama sekitar 1 jam.

RNA diamati dengan menggunakan UV

transiluminator.

cDNA-AFLP Pasangan enzim restriksi yang diuji untuk memperoleh hasil yang optimal pada pola cDNA-AFLP tanaman karet adalah EcoRI-MseI (Vos et al. 1995) dan VspI-TaqI (Bachem et al. 1996). Pasangan kedua enzim restriksi tersebut akan menentukan sekuen oligonukleotida adapter serta primer.

Pemotongan cDNA dengan enzim res triksi EcoRI-MseI Fragmen cDNA yang dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dan MseI menggunakan adapter, primer preselektif serta primer selektif seperti terdapat pada Tabel 12.

Tabel 12. Susunan oligonukleotida adapter, primer preselektif dan primer selektif untuk cDNA yang dipotong dengan enzim restriksi EcoRI-MseI Primer

Susunan Oligonukleotida

adapter utas atas EcoRI adapter utas bawah EcoRI adapter utas atas MseI adapter utas bawah MseI primer preselektif EcoRI primer preselektif MseI primer selektif EcoRI primer selektif MseI

5’- CTC GTA GAC TGC GTA CC- 3’ 5’- AAT TGG TAC GCA GTC TAC – 3’ 5’- GAC GAT GAG TCC T GA G – 3’ 5’- TAC TCA GGA CTC AT – 3’ 5’- GACTGCGTACC AATTC A – 3’ 5’- GATGAGTCC TGAG TAA C – 3’ 5’- GACTGCG TACCAATTC ANN– 3’ 5’- GATGAGTCC TGAG TAA CNN – 3’

Proses pemotongan cDNA dilakukan dalam 25 µl campuran yang mengandung 450 ng cDNA, 1X bufer reaksi dan 2,5 unit masing-masing enzim

83 EcoRI dan MseI [terdapat sebagai campuran dalam 10 mM tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 50% (v/v) gliserol, dan 0,1% Triton X-100].

Setelah campuran tersebut dihomogenkan kemudian

diinkubasi pada suhu 370C selama 2 jam.

Untuk inaktivasi enzim dilakukan

0

pemanasan pada suhu 70 C selama 15 menit. Ligasi adapter. Seluruh campuran di atas (25 µl) dicampurkan dengan 24 µl larutan adapter/ligation [EcoRI/MseI adapters, 0,4 mM ATP, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg-asetat, 50 mM K-asetat] dan 1µl T4 DNA ligase (1 unit/ µl) [terdapat dalam 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 50% (v/v) gliserol]. Setelah campuran tersebut dihomogenkan kemudian diinkubasi pada suhu 200C selama 2 jam.

Preamplifikasi.

Pengenceran hasil ligasi dilakukan dengan mencampurkan

sebanyak 10 µl hasil ligasi dengan 40 µl bufer TE.

Sebanyak 5 µl hasil

pengenceran dicampur dengan 40 µl pre-amp primer mix, 5 µl PCR bufer 10X, dan 0,2 µl Taq DNA polimerase (5 unit/µl). Campuran dihomogenkan kemudian ditambahkan 50 µl minyak mineral dan diputar seaat. Reaksi amplifikasi dengan PCR dilaksanakan dengan kondisi 94 0C selama 30 detik, 560 C selama 60 detik dan 720 C selama 60 detik, yang diulang sampai 20 siklus.

Amplifikasi selektif . Deteksi hasil amplifikasi dilakukan secara nonradioaktif, oleh karena itu primer untuk amplifikasi selektif tidak dilabel secara radioaktif. Sebanyak 18 µl primer selektif EcoRI (27,8 ng/µl) dicampurkan dengan 32 µl akuades dan dihomogenkan.

Untuk setiap reaksi dicampurkan 0,5 µl primer

selektif EcoRI yang telah diencerkan dengan 4,5 µl primer selektif MseI (6,7 ng/µl, dNTPs) dan disebut sebagai ‘Mix 1’. Sementara itu dibuat ‘Mix 2’, untuk setiap reaksinya yang mengandung 2,9 µl akuades, 2,0 µl PCR bufer dan 0,1 µl Taq DNA polimerase. Selanjutnya 5 µl Mix 1 dicampur dengan 5 µl Mix 2 dan 10 µl hasil preamplifikasi. Setelah dihomogenkan dan diputar sesaat, kemudian

84 ditambahkan 20 µl minyak mineral. Reaksai amplifikasi dengan PCR dilakukan sesuai prosedur yang direkomendasikan. Visualisasi produk amplifikasi Produk hasil amplifikasi dipisahkan pada poliakrilamid gel yang didenaturasi ukuran 12 x 14,5 cm dan visualisasinya dilakukan melalui pewarnaan dengan perak nitrat.

Prosedur elektroforesis dan visualisasi dilakukan sama

seperti pada Bab 3.

Pemotongan cDNA dengan enzim restriksi VspI-TaqI Penyiapan fragmen cDNA dengan menggunakan enzim restriksi VspITaqI dilaksanakan dengan menggunakan sekuen primer seperti disajikan pada Tabel 13. Tabel 13. Susunan oligonukleotida adapter , primer preselektif dan primer selektif untuk cDNA yang dipotong dengan enzim restriksi VspI-TaqI Primer adapter utas atas Vsp I adapter utas bawah VspI adapter utas atas TaqI adapter utas bawah TaqI primer standar VspI primer standar TaqI primer selektif VspI primer selektif Taq I (*) adapter yang dilabel biotin

Susunan Oligonukleotida 5’- CTC GTA GAC TGC GTA CC- 3’ (*) 5’- TAG GTA CGC AGT C – 3’ 5’- GAC GAT GAG TCCT GAC – 3’ 5’- CGG TCA GGA CTC AT – 3’ 5’- CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT – 3’ 5’- GAC GAT GAG TCC TGA CCG A – 3’ 5’- GAC TGC GTA CCT AAT NN – 3’ 5’- GAT GAG TCC TGA CCG ANN – 3’

Proses pemotongan cDNA dengan kedua macam enzim restriksi tersebut dilakukan secara bertahap. Campuran 20 µl larutan yang mengandung 125 ng cDNA, 5 unit enzim restriksi Taq I, 1x 1,4 all bufer dan akuades diinkubasi pada suhu 650 C selama 2 jam, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Ke dalam campuran tersebut selanjutnya ditambahkan 1x 1,4 all bufer, 5 unit enzim restriksi VspI dan akuades sehingga volumenya menjadi 25 µl. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi pada suhu 370 C selama 2 jam.

85 Ligasi adapter. Optimasi pada tahap ini dilakukan dengan mempertimbangkan penggunaan adapter VspI yang tanpa biotin oligo dan yang dengan biotin oligo. Adapter utas atas VspI dilabel dengan biotin. Penggunaan adapter yang berbeda tersebut akan mempengaruhi prosedur preamplifikasi pada tahap berikutnya. Ke dalam 25 µl hasil restriksi ditambahkan 0,5 µl TaqI adapter (50 mM), 0,5 µl VspI adapter (5 mM) tanpa biotin oligo atau dengan biotin oligo, 0,25 µl ATP (10 mM), 0,25 µl 1,4 all bufer (10x), 0,5 µl T4 DNA ligase, 0,5 µl akuades sehingga volume total menjadi 27,5 µl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 370 C selama 3 jam.

Preamplifikasi. Khusus untuk campuran yang menggunakan adapter VspI dengan biotin oligo diperlukan tahap pemurnian cDNA yang dilakukan sebagai berikut. Sebanyak 0,6 ml SA-PMPs (kit PolyATract mRNA Isolation System III, Promega) dihomogenkan kemudian dipipet 20 µl ke tabung 1,5 ml dan diletakkan pada Magnetic Stand sampai SA-PMPs terkumpul pada sisi tabung, supernatan dibuang. Pencucian dilakukan 3 x dengan 100 µl SSC 0,5x, kemudian endapan disuspensikan dalam 80 µl SSC 0,5x. Ke dalam campuran tersebut dimasukkan 20 µl hasil ligasi, diinkubasi 30 menit pada suhu ruang sambil sesekali dikocok, kemudian diletakkan pada Magnetic Stand sampai endapan menempel pada sisi tabung, supernatan dibuang.

Endapan dicuci 3x dengan 100 µl SSC 0,1x,

kemudian disuspensikan dalam 40 µl bufer TE. Ini merupakan templat I untuk proses preamplifikasi. Preamplifikasi dilaksanakan pada 50 µl campuran yang mengandung 10 µl templat I, 1 µl primer standar VspI (100 ng/µl), 1µl primer standar TaqI (100 ng/µl), 5 µl PCR bufer 10x, 1,25 µl dNTPs (10 mM), 0,4 µl Taq DNA Polimerase (5 unit/µl) dan 31,35 µl akuades. Untuk optimasi digunakan 2 macam Taq DNA Polimerase, yaitu Accuprime Taq DNA Polimerase dari Invitrogen dan Taq DNA Polimerase dari NEB. Ke dalam campuran ditambahkan minyak mineral dan reaksi amplifikasi dilakukan pada 940 C selama 20 detik, 550 C selama 30 detik, 720 C selama 60 detik, yang diulang sebanyak 25 siklus. Hasil preamplifikasi kemudian diencerkan 10x dan 20x, ini merupakan templat II.

86 Amplifikasi selektif .

Untuk amplifikasi selektif disiapkan 20 µl larutan yang

mengandung 5 µl templat II, 0,2 µl primer selektif VspI (100 ng/µl), 0,6 µl primer selektif TaqI (100 ng/ µl), 0,8 µl dNTPs (10 mM), 2 µl PCR bufer 10x, 0,1 µl Taq DNA Polimerase (5 unit/µl) dan 11,3 µl akuades.

Ke dalam campuran

ditambahkan minyak mineral dan reaksi amplifikasi dilaksanakan sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan.

Visualisasi hasil amplifikasi. Untuk visualisasi hasil amplifikasi dilaksanakan sama seperti pada percobaan sebelumnya.

HASIL

Isolasi RNA total dan mRNA serta sintesis cDNA dari daun karet Daun karet yang digunakan sebagai sumber RNA adalah daun muda yang warnanya baru saja berubah dari warna tembaga ke warna hijau sehingga jaringan daun masih terasa lembut. Gambar 15 (A) adalah elektroforesis hasil isolasi RNA total dari daun klon AVROS 2037 (resisten) dan PPN 2444 (rentan), sedangkan Gambar 15 (B) adalah cDNA yang disintesis dari mRNA klon yang sama. Konsentrasi dan kemurnian RNA untuk kedua klon karet tersebut ditetapkan dengan spektrofotometer pada rasio panjang gelombang 260/280 nm, terdapat pada Tabel 14.

Dengan menggunakan metode Pawlowski et al (1994)

untuk mengisolasi RNA dari daun karet, konsentrasi RNA yang diperoleh berkisar antara 268 (pada klon AVROS 2037) sampai 325 µg/g daun (pada klon PPN 2444). Kemurnian RNA sekitar 2,1 yang mengindikasikan bahwa RNA yang diperoleh memiliki kualitas yang baik. Hal ini diperkuat oleh visualisasi hasil isolasi RNA dengan adanya dua pita berjarak sangat dekat pada gel yang merupakan pita 28S dan 18S RNA (Gambar 15 A), yaitu komponen RNA terbanyak yang terdapat di dalam sel. Dari sekitar 1000 µg RNA total berhasil dimurnikan 4 – 6 µg mRNA dengan perbandingan A260/A280 adalah 2,1 yang menunjukkan bahwa mRNA yang diperoleh juga memiliki kualitas baik. Kualitas RNA dan mRNA merupakan salah satu faktor penting pada tahap awal yang turut menentukan keberhasilan analisis selanjutnya. Dalam penelitian

87 ini dengan menggunakan 2 µg mRNA, baik mRNA dari klon AVROS 2037 maupun mRNA dari klon PPN 2444 telah berhasil disintesis cDNA (Gambar 15 B).

Dibandingkan dengan cDNA kontrol, intensitas cDNA dari kedua klon

tersebut yang teramati pada gel agarose lebih rendah. Demikian juga cDNA PPN 2444 terlihat lebih tipis dibanding cDNA AVROS 2037, meskipun konsentrasi mRNA yang digunaka n untuk mensintesis cDNA adalah sama. cDNA terdapat pada ukuran antara 500- sampai 2000-bp. Metode sintesis cDNA yang digunakan menerapkan sistem transkriptase balik (reverse transcriptase) yang berasal dari Avian Myeloblastosis Virus (AMV) serta primer oligo(dT) untuk mentranskripsi mRNA menjadi utas tunggal DNA.

1

2

(A)

M

1

2

3

(B)

Gambar 15. (A) RNA total dari daun karet, dipisahkan pada 1% gel agarose dan divisualisasi melalui pewarnaan etidium bromida (0,5 ppm). Lajur 1 dan 2 adalah RNA dari klon AVROS 2037 dan klon PPN 2444. (B) cDNA dari daun karet pada gel agarose 1%. (M) 1-kb DNA Ladder; (1) 1,2 kb cDNA kanamycin sebagai kontrol (+), (2) cDNA klon AVROS 2037, (3) cDNA klon PPN 2444 Tabel 14. Konsentrasi dan kemurnian RNA total hasil isolasi dari daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444. Rasio (A260/A280)

Konsentrasi RNA dalam larutan (µg/µl)

Konsentrasi RNA (µg/g daun)

AVROS 2037

2,1131

2,1420

268

PPN 2444

2,1287

2,5980

325

Klon

88 cDNA-AFLP menggunakan pasangan enzim restriksi EcoRI-MseI Proses AFLP dimulai dengan melakukan pemotongan fragmen cDNA dengan menggunakan dua macam enzim restriksi yang ber beda, yaitu satu enzim memotong sering (mengenal 4 situs basa) dan satu enzim memotong jarang (mengenal 6 situs basa). Dengan pertimbangan bahwa kit AFLP yang terdapat di pasaran telah berhasil baik untuk analisis AFLP genomik (DNA) pada tanaman karet (Bab 3), maka kit yang sama yaitu AFLP Analysis System I (GibcoBRL) dicoba diaplikasikan dalam percobaan ini. Pada kit tersebut, pasangan enzim restriksi untuk memotong DNA adalah EcoRI-MseI sehingga sekuen pada adapter, primer preselektif dan primer selektif yang tersedia di dalam kit sesuai dengan situs pengenalan kedua enzim tersebut (sekuen terdapat pada Bahan dan Metode). Hasil cDNA-AFLP klon PPN 2444 dengan 20 kombinasi primer selektif terdapat pada Gambar 16. Semua kombinasi primer selektif hanya mampu

E-AT M1 1 2

3 4 5

E-AA 1 2

3

E-AG

4 5 M2

M1 1 2 3

E-AC 4 5

1

2

3 4 5 M2

1000

350

100

50

Gambar 16. Hasil cDNA-AFLP klon PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi EcoRI-MseI dengan 20 kombinasi pasangan primer selektif. (M1) 100-bp DNA Ladder; (M2) 10-bp DNA Ladder; (1) M-CTG, (2) M-CTA, (3) M-CAC, (4) M-CAG, (5) M-CTC. Elektroforesis pada gel ukuran 12 x 14,5 cm.

89 mengamplifikasi antara 0 – 6 fragmen cDNA. Jumlah tersebut jauh di bawah hasil AFLP genomik tanaman karet yang mampu mendapatkan 40 – 60 fragmen untuk setiap pasangan primer yang digunakan (Bab 3). Ukuran fragmen cDNA yang teramplifikasi berkisar antara 60- sampai < 1000-bp. Dari hasil visualisasi terlihat jelas bahwa meskipun jumlah fragmen cDNA yang teramplifikasi tidak banyak, namun sistem visualisasi dengan pewarnaan perak nitrat memberikan hasil yang memuaskan. Sedikitnya jumlah fragmen cDNA yang diperoleh diduga disebabkan oleh pasangan primer selektif kurang sesuai untuk amplifikasi cDNA asal daun karet. Hal ini terjadi karena jumlah fragmen teramplifikasi akan sangat ditentukan oleh pasangan primer selektif yang digunakan.

cDNA-AFLP menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI Bachem et al (1996; 1998) menggunakan pasangan enzim AseI-TaqI dalam analisis cDNA-AFLP untuk mempelajari gen yang die kspresikan pada beberapa tahap perkembangan tuber kentang. Pasangan enzim yang sama, yaitu VspI (isoschizomer AseI)-TaqI serta sekuen adapter (anchor), primer untuk preamplifikasi dan amplifikasi selektif digunakan dalam percobaan ini.

Pada

metode Bachem et al (1996) adapter AseI (VspI) berikatan dengan biotin oligo sehingga terdapat beberapa tahap tambahan prosedur sebelum reaksi amplifikasi dilaksanakan (Bahan dan Metode). Dengan pertimbangan supaya tahapan dalam metode cDNA-AFLP dapat lebih disederhanakan maka dilakukan modifikasi, yaitu adapter dalam reaksi ligasi tidak mengandung biotin oligo. Dengan mengaplikasikan metode di atas ternyata hasil yang diperoleh belum optimal karena jumlah fragmen teramplifikasi sangat sedikit, terutama pada cDNA klon AVROS 2037 (1). Di samping itu distribusi fragmen pada gel belum merata. Fragmen hanya diperoleh pada bagian atas gel dengan intensitas yang cukup tinggi sedangkan pada bagian bawah hanya terdeteksi sejumlah kecil fragmen cDNA dengan intensitas rendah (Gambar 17). Oleh karena itu untuk mengoptimalkan hasil amplifikasi maka pada tahap berikutnya dalam proses ligasi adapter digunakan adapter VspI yang berikatan dengan biotin oligo. Dengan adanya biotin oligo tersebut maka pemisahan hasil ligasi dari komponen-komponen lain seperti bufer ligasi dapat dilakukan dengan

90 lebih baik.

Di samping itu juga dilakukan variasi pengenceran hasil

preamplifikasi serta penggunaan produk Taq DNA polimerase yang berbeda. Hasil cDNA-AFLP klon AVROS 2037 dan PPN 2444 dengan beberapa optimasi seperti disebutkan di atas disajikan pada Gambar 18.

A M

1

B 2

1

C 2

1

D 2

1

2

bp 500

100

Gambar 17.

Hasil cDNA-AFLP klon AVROS 2037 (1) dan PPN 2444 (2) menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI dengan 4 kombinasi pasa ngan primer selektif. (M) 100-bp DNA Ladder; (A) primer VCC-TCG, (B) primer VCGTCG, (C) primer VGC-TGG, (D) primer VGG-TGA. Elektroforesis pada gel poliakrilamid ukuran 9 x 6 cm.

Pengenceran hasil preamplifikasi sampai 20X pada klon AVROS 2037 (Gambar 18, II - lajur 1,2) menyebabkan penampakan fragmen pada gel lebih tipis dibanding pengenceran 10X (Gambar 18, I - lajur 1,2). Namun pada klon PPN 2444 tidak terdapat perbedaan yang signifikan karena fragmen yang teramati memiliki intensitas dan pola yang sama (Gambar 18, I – lajur 3,4 dan II – lajur 3,4). Jumlah pengenceran yang diperlukan untuk memperoleh hasil amplifikasi yang baik dipengaruhi oleh banyaknya cDNA yang dapat disintesis dari setiap sampel. Dala m hal ini penentuan konsentrasi cDNA menjadi penting. Penggunaan Taq DNA Polymerase memberikan perbedaan yang cukup nyata dimana reaksi amplifikasi menggunakan AccuPrime Taq DNA Polymerase

91 (Invitrogen) menghasilkan pita yang lebih banyak dibanding yang dihasilkan dengan Taq DNA Polymerase (NEB). Di samping itu dengan menggunakan AccuPrime Taq DNA Polymerase pita terlihat merata pada gel. AccuPrime Taq DNA Polymerase merupakan enzim yang dirancang untuk meningkatkan spesifitas hasil PCR dan bersifat hot start, karena memiliki antibodi yang mencegah aktivitas polimerase pada suhu yang tidak sesuai pada setiap siklus. Dalam hal ini berarti bahwa reaksi polimerisasi hanya akan berlangsung pada suhu yang tepat.

I M1 1

2

II 3 4

1

A

2

I 3

4

M2

M1 1

2

II 3

4

1

2

3

4 M2

B

Gambar 18. Hasil cDNA-AFLP klon AVROS 2037 dan PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI dengan variasi pada pengenceran hasil preamplifikasi dan Taq DNA polimerase. (I) Pengenceran 10X, (II) Pengenceran 20X. Primer selektif adalah V-CC/T-CG. (A,B) Variasi waktu dalam developer. (M1) 100-bp DNA Ladder; (M2) 10-bp DNA Ladder. Elektroforesis pada gel ukuran 12 x 14,5 cm. (1) AVROS 2037 (AccuPrime Taq DNA Polymerase/Invitrogen) (2) AVROS 2037 (Taq DNA Polymerase/NEB) (3) PPN 2444 (AccuPrime Taq DNA Polymerase/Invitrogen) (4) PPN 2444 (Taq DNA Polymerase/NEB)

92 Intensitas pita pada gel yang diwarnai dengan perak nitrat terlihat tidak sama. Pita-pita dengan berat molekul tinggi (terdapat pada bagian atas gel) memiliki intensitas lebih tinggi dibandingkan dengan pita -pita dengan berat molekul lebih rendah (terdapat pada bagian bawah gel).

Di dalam proses

pewarnaan pita dengan berat molekul tinggi dengan cepat terwarna i sementara pita dengan berat molekul rendah belum terlihat.

Penambahan waktu

memungkinkan untuk mendapatkan pita dengan berat molekul rendah, namun pita pada bagian atas menjadi hitam dan terlihat menyatu.

Dengan hasil yang

demikian masih perlu dilakukan strategi tertentu untuk mendapatkan pita dengan berat molekul tinggi maupun rendah dengan intensitas yang sama.

Seleksi primer selektif untuk cDNA -AFLP menggunakan enzim restriksi VspI-TaqI Untuk menentukan pasangan primer selektif yang sesuai dalam mengamplifikasi cDNA yang berasal dari daun karet klon PPN 2444 dilakukan seleksi terhadap 45 kombinasi pasangan primer selektif, dimana masing-masing primer memiliki dua basa tambahan (Tabel 15). Hasil elektroforesis produk cDNA-AFLP dengan ke -45 pasangan primer tersebut terdapat pada Gambar 19. Dari Tabel 15 dan Gambar 19 dapat diketahui bahwa pasangan antara primer Vsp (dengan 2 basa selektif CC) dengan primer Taq (dengan 8 kombinasi basa selektif , yaitu Taq-CC, Taq-CG, Taq-GC, Taq-GG, Taq-GA, Taq-GT, Taq-TC, Taq-TG) menghasilkan fragmen amplifikasi yang relatif baik (Gambar 19; lajur 1 – 8). Kecuali lajur 4 semuanya menampilkan fragmen hasil amplifikasi. Pita terlihat dari ukuran terkecil sekitar 60-bp sampai ukuran besar sekitar 1000-bp.

Pita dengan berat molekul tinggi, > 500-bp,

memiliki intensitas yang tinggi sehingga terlihat gelap pada gel dan sulit untuk dibedakan antara satu pita dengan pita lainnya.

Dengan demikian diketahui

bahwa masalah dalam proses pewarnaan gel secara langsung dengan menggunakan larutan perak nitrat belum berhasil diatasi. Di samping primer di atas, primer Vsp-GC/Taq (dengan berbagai kombinasi basa selektif) juga menunjukkan hasil amplifikasi yang relatif baik (Gambar 19; lajur 17 – 24). Namun, apabila primer Vsp-menggunakan basa

93 selektif CG, GG, AC dan GA (Gambar 19; lajur 9 – 16; 25 – 32; 33 – 45) amplifikasi terjadi pada fragmen dengan berat molekul tinggi saja sehingga pita hanya terdapat di bagian atas gel.

Tabel 15. Pasangan primer selektif untuk amplifikasi cDNA-AFLP klon PPN 2444. No.

Pasangan primer

No.

Pasangan primer

No.

Pasangan primer

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Vsp-CC/T aq-CC Vsp-CC/Taq-CG Vsp-CC/Taq-GC Vsp-CC/Taq-GG Vsp-CC/Taq-GA Vsp-CC/T aq-GT Vsp-CC/T aq-TC Vsp-CC/T aq-TG Vsp-CG/T aq-CC Vsp-CG/T aq-CG Vsp-CG/T aq-GC Vsp-CG/T aq-GG Vsp-CG/T aq-GA Vsp-CG/T aq-GT Vsp-CG/T aq-TC

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Vsp-CG/T aq-TG Vsp-GC/T aq-CC Vsp-GC/T aq-CG Vsp-GC/T aq-GC Vsp-GC/T aq-GG Vsp-GC/T aq-GA Vsp-GC/T aq-GT Vsp-GC/T aq-TC Vsp-GC/T aq-TG Vsp-GG/T aq-CC Vsp-GG/T aq-CG Vsp-GG/T aq-GC Vsp-GG/T aq-GG Vsp-GG/T aq-GA Vsp-GG/T aq-GT

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Vsp-GG/Taq-TC Vsp-GG/Taq-TG Vsp-AC/T aq-CC Vsp-AC/T aq-CG Vsp-AC/T aq-GC Vsp-AC/T aq-GG Vsp-AC/T aq-GA Vsp-AC/T aq-GT Vsp-AC/Taq-T C Vsp-AC/T aq-TG Vsp-GA/Taq-CC Vsp-GA/Taq-CG Vsp-GA/Taq-GC Vsp-GA/T aq-GG Vsp-GA/T aq-GA

Berdasarkan hasil yang diperoleh di atas maka dari 45 kombinasi primer tersebut, hanya kombinasi antara primer Vsp-CC dan Vsp-GC dengan primer TaqCC, Taq-CG, Taq-GC, Taq -GG, Taq -GA, Taq -GT, Taq-TC, dan Taq-TG yang direkomendasikan untuk digunakan dalam analisis cDNA-AFLP tanaman karet selanjutnya.

PEMBAHASAN Dalam percobaan ini senyawa fenolik yang terdapat pada daun karet dihilangkan melalui pengendapan dengan etanol, sedangkan protein dan karbohidrat dihilangkan melalui ekstraksi dengan fenol. Pemisahan RNA dari DNA dilakukan melalui pengendapan dengan litium klorida.

Dengan metode

tersebut, dari satu gram jaringan daun yang masih muda dapat diperoleh RNA

94 M1 1

2

3 4

5 6 7 8

9 10 11 12 M2

A

M122 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 M2

C

M1 13 14 15 16 17 18 19 20 21

M2

B

M1 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 M2

D

Gambar 19. A, B, C, D adalah hasil cDNA-AFLP klon PPN 2444 menggunakan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI dengan 45 kombinasi pasangan primer selektif (Tabel 11). (M1) 100-bp DNA Ladder; (M2) 10-bp DNA Ladder. Elektroforesis pada gel ukuran 12 x 14,5 cm.

95 antara 268 – 325 µg (Tabel 14) dengan kualitas yang baik (Gambar 15 A). RNA tersebut merupakan materi awal untuk me ndapatkan mRNA dan dengan menggunakan mRNA tersebut sebagai cetakan dapat disintesis cDNA. Kualitas dan kuantitas RNA yang diekstraksi dari jaringan tanaman yang berbeda sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti kandungan sitoplasma, tingkat pembelahan sel serta jumlah senyawa seperti polisakarida dan polifenolik yang terdapat pada suatu jaringan.

Parameter tersebut di atas menentukan

prosedur dan jumlah jaringan yang diperlukan dalam ekstraksi RNA untuk mendapatkan sejumlah cDNA yang diperlukan dalam penyiapan templat untuk analisis cDNA-AFLP (Bachem et al. 1996). Pemurnian mRNA dari RNA merupakan tahapan yang cukup kritis dimana prosedur yang dipilih akan mempengaruhi kemurnian atau kualitas mRNA yang dihasilkan sehingga pada tahap berikutnya juga akan mempengaruhi penyiapan templat.

Untuk mendapatkan mRNA dengan kualitas tinggi maka

pemurnian mRNA dilakukan dengan cara menempelkan mRNA ke ‘magnetic beads’ melalui pengikatan dengan streptavidin/biotin oligo d(T) sehingga komponen yang bukan mRNA akan tertinggal dalam larutan.

Dengan cara

tersebut di atas cDNA dengan kualitas yang baik dapat dihasilkan (Gambar 15 B). Pada prinsipnya, teknik cDNA-AFLP menggunakan protokol AFLP standar, hanya templatnya adalah cDNA.

Pada AFLP standar (DNA), untuk

menyiapkan templat digunakan dua macam enzim restriksi yang ditentukan berdasarkan kompleksitas genom yang diteliti serta beberapa faktor lain seperti status metilasi DNA (Vos et al. 1995). Namun untuk cDNA-AFLP pemilihan pasangan enzim restriksi ditentukan melalui frekuensi pemotongan. Idealnya satu jenis enzim restriksi memotong setiap cDNA satu kali dan enzim yang satunya memotong cDNA yang sama pada satu atau dua sisi yang berdekatan sehingga diperoleh fragmen dengan ukuran 100- sampai 1000-bp (Bachem et al. 1996). Fragmen cDNA tanaman karet yang dihasilkan melalui primer EcoRI/ MseI sangat sedikit jumlahnya. Dari 20 kombinasi pasangan primer selektif yang telah dicoba untuk mengamplifikasi fragmen cDNA, masing-masing kombinasi hanya menghasilkan 0 - 6 fragmen (Gambar 16). Jumlah fragmen tersebut sangat jauh berbeda apabila DNA genomik sebagai templat, yakni dapat menghasilkan

96 antara 40 – 60 fragmen DNA per pasang primer (Bab 3). Sedikitnya jumlah fragmen pada cDNA -AFLP karet diduga dapat disebabkan oleh beberapa faktor, seperti ketidaksesuaian enzim restriksi yang digunakan atau penggunaan primer selektif yang kurang tepat. Menurut Bachem et al. (1996) jumlah basa selektif yang ditambahkan pada primer, berbeda antara AFLP genomik dengan cDNA -AFLP. Pada AFLP genomik diperlukan tiga basa selektif pada ujung masing-masing primer, namun pada cDNA-AFLP yang kompleksitasnya rendah hanya diperlukan dua basa selektif. Dalam percobaan ini kit yang tersedia memiliki primer MseI dengan tiga basa selektif dan ternyata kurang sesuai digunakan untuk cDNA-AFLP pada tanaman karet.

Solusi yang memungkinkan adalah merancang primer MseI

dengan dua basa selektif atau menggunakan pasangan enzim restriksi lain yang lebih sesuai untuk cDNA tanaman karet. Bachem et al. (1996; 1998) mengemukakan bahwa analisis cDNA-AFLP pada tanaman kentang menggunakan kombinasi enzim restriksi AseI dan TaqI didasarkan pada review terhadap cDNA kentang yang tersedia. Sekitar 45% dari semua cDNA yang dianalisis memiliki situs AseI dan sekitar 87% di antaranya memiliki juga situs TaqI.

Dengan menggunakan kombinasi enzim tersebut

diperkirakan hampir setengah dari semua gen kentang yang diekspresikan pada setiap sampel dapat divisualisasikan. Review terhadap cDNA karet berdasarkan sekuen di data base (pangkalan data) menunjukkan bahwa sekitar 37,5% cDNA yang dianalisis memiliki situs VspI (isoschizomer AseI) dan semua yang memiliki situs VspI juga memiliki situs Taq I.

Oleh karena itu pasangan enzim ini

digunakan dalam percobaan berikutnya untuk mengoptimalkan hasil cDNA-AFLP pada tanaman karet. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dengan menggunakan primer VspI / Taq I masing-masing dengan dua basa selektif, jumlah fragmen cDNA yang teramplifikasi jauh lebih banyak (Gambar 19; lajur 1-8; lajur 17-24), hampir mendekati jumlah fragmen pada AFLP genomik. Hanya saja kelemahannya, tidak semua pasangan primer memberikan hasil amplifikasi yang baik.

Dari 45

kombinasi pasangan primer, hanya 16 kombinasi yang menghasilkan fragmen dengan jumlah lebih dari sepuluh fragmen. Oleh karena itu, apabila sebagian

97 besar cDNA karet akan divisualisasikan maka masih diperlukan seleksi primer yang dikombinasikan dengan penggunaan pasangan enzim restriksi lain yang juga sesuai untuk cDNA tanaman karet. Penggunaan biotin oligo pada adapter tidak berperan penting terhadap distribusi fragmen cDNA teramplifikasi.

Hal ini dapat diketahui dari hasil

elektroforesis pada Gambar 17 (adapter tanpa biotin oligo) dan Gambar 19 (adapter dengan biotin oligo) yang menunjukkan bahwa pada beberapa kombinasi pasangan primer, fragmen yang tervisualisasi hanya pada bagian atas gel. Dalam hal ini kelihatannya sekuen primer lebih menentukan jumlah dan distribusi fragmen cDNA yang teramplifikasi.

Pengenceran hasil preamplifikasi

menentukan intensitas pita pada gel sehingga pengenceran untuk setiap sampel perlu disesuaikan dengan banyaknya cDNA yang berhasil disintesis.

Dalam

percobaan ini, untuk cDNA AVROS 2037 pengenceran yang lebih sesuai adalah 10X sedangkan pada cDNA PPN 2444 adalah 20X (Gambar 18). Pada cDNA kentang umumnya pengenceran dilakukan sampai 10X (Bachem et al. 1998). Potensi

teknik

cDNA-AFLP

untuk

mendeteksi

transkrip

yang

diekspresikan secara diferensial yang didasarkan pada reaksi amplifikasi dengan menggunakan PCR telah dibuktikan oleh Bachem et al (1996; 1998). Kinetik ekspresi melalui analisis cDNA-AFLP dilaporkan sebanding dengan yang dihasilkan melalu i analisis Northern. Bahkan fragmen asal transkrip yang hanya terdapat dalam copy rendah pada genom kentang dapat diidentifikasi dengan teknik cDNA-AFLP. Sehubungan dengan hal tersebut dengan mengoptimalkan semua kondisi yang disesuaikan untuk cDNA tanaman karet diduga dapat dideteksi fragmenfragmen cDNA yang diekspresikan secara diferensial antara klon karet yang diberi perlakuan patogen pada beberapa waktu setelah inokulasi dengan kontrolnya serta antara klon karet resisten dan rentan terhadap C. cassiicola. Namun, berdasarkan hasil yang dicapai dalam tahapan penelitian ini kelihatannya prosedur visualisasi produk amplifikasi secara non-radioaktif dengan pewarna perak nitrat kurang memberikan hasil yang baik.

Dengan demikian perlu

dipertimbangkan untuk melakukan visualisasi produk cDNA-AFLP sesuai dengan prosedur aslinya, yakni dengan cara mengekspos gel pada film sinar -X. Apabila

98 prosedur tersebut yang dipilih maka pelabelan primer secara radioaktif tidak dapat dihindari.

KESIMPULAN Pemurnian mRNA dari RNA asal daun karet telah menghasilkan mRNA dengan kuantitas dan kualitas yang baik se hingga mRNA tersebut dapat digunakan sebagai cetakan dalam sintesis cDNA.

Dengan mengaplikasikan

pasangan enzim restriksi EcoRI-MseI, jumlah fragmen cDNA ya ng diperoleh adalah antara 0 – 6 fragmen, sedangkan pasangan enzim restriksi VspI-TaqI menghasilkan fragmen antara 0 – 20 fragmen. Kombinasi primer selektif Vsp (Vsp-CC dan Vsp-GC) dengan berbagai primer selektif Taq (Taq-CC, Taq-CG, Taq-GC, Taq-GG, Taq-GA, Taq-GT, Taq-TC, Taq-TG) memberikan hasil amplifikasi yang lebih baik dibandingkan dengan kombinasi primer Vsp-GG, VspAC dan Vsp-GA dengan primer Taq yang sama. Secara keseluruhan visualisasi produk cDNA-AFLP secara langsung melalui pewarnaan dengan perak nitrat belum memberikan hasil yang memuaskan karena hasil yang diperoleh tidak stabil. Di samping itu pewarnaan fragmen tidak merata sehingga fragmen dengan ukuran molekul lebih besar tidak terpisah dengan baik.

Oleh karena itu analisis cDNA-AFLP untuk tahap selanjutnya

memerlukan cara visualisasi yang lebih sesuai, misalnya dengan mengekspos gel yang mengandung fragmen cDNA pada film sinar X seperti yang dilakukan pada prosedur aslinya.

BAB 6 IDENTIFIKASI TRANSKRIP TANAMAN KARET YANG DIEKSPRESIKAN DALAM INTERAKSI DENGAN CENDAWAN PATOGEN Corynespora cassiicola MELALUI ANALISIS cDNA-AFLP ABSTRAK Salah satu teknik yang dapat diaplikasikan untuk mengidentifikasi transkrip tertentu adala h cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNA-AFLP). Teknik tersebut digunakan pada tanaman karet dengan tujuan mengidentifikasi transkrip asal daun karet yang diekspresikan secara diferensial selama terjadi interaksi antara tanaman karet dengan cendawan C. cassiicola. Untuk mencapai tujuan tersebut digunakan klon AVROS 2037 dan PPN 2444, masing-masing memiliki sifat resisten dan rentan terhadap C. cassiicola. Daun diinfeksi dengan konidia C. cassiicola dan kemudian contoh daun diambil pada waktu 0, 24, 36, 48 dan 72 jam setelah inokulasi. Beberapa metode isolasi RNA diterapkan untuk mendapatkan RNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik sehingga cDNA yang diperoleh juga memiliki kualitas tinggi. Analisis cDNAAFLP dilaksanakan dengan menggunakan pasangan enzim restriksi VspI dan TaqI, dengan demikian adapter dan primer memiliki sekuen pengenalan kedua enzim restriksi tersebut. Produk cDNA-AFLP yang diperoleh melalui reaksi amplifikasi dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dipisahkan pada gel poliakrilamid dan divisualisasikan pada film sinar-X. Fragmen cDNA target diisolasi dari gel, dimurnikan dan diklon pada vektor pGEMT Easy, kemudian diintroduksikan ke sel bakteri E. coli DH5á. Perunutan sekuen fragmen cDNA dilaksanakan melalui proses sekuensing. Dari analisis cDNA-AFLP tersebut diperoleh sebanyak 35 fragmen asal transkrip (transcript-derived fragment, TDF) dengan pola ekspresi berbeda, baik antar klon maupun antar perlakuan pada masing-masing klon. Ke-35 fragmen tersebut dikelompokkan berdasarkan homologi sekuennya dan menghasilkan 19 contigs serta 9 macam sekuen yang tidak dapat dikelompokkan dalam contig yang sama. Sisanya merupakan sekuen yang terlalu pendek hanya terdiri atas beberapa nukleotida saja. Sebanyak 10 dari 19 contigs dan 5 dari 9 sekuen tersebut memiliki homologi dengan produk gen yang telah dikenal yang terdapat di database GenBank, seperti putative Ran binding protein , protein transporter, regulator transkripsi, arginase, GTP-binding protein, heat shock protein (HSP) dan aconitase. Beberapa di antaranya seperti putative Ran binding protein, protein transporter dan GTP-binding protein dikenal sebagai protein membran, sedangkan arginase dan HSP merupakan protein atau enzim yang ekspresinya pada tanaman antara lain dipengaruhi oleh adanya pelukaan dan perlakuan toksin. Keberadaan arginase sering berhubungan dengan ketersediaan nitric oxide (NO) pada jaringan tanaman. NO dikenal sebagai salah satu sinyal molekul dalam mekanisme pertahanan tanaman. Kata kunci: cDNA-AFLP, identifikasi transkrip, ekspresi diferensial, Hevea brasiliensis, C. cassiicola .

100 PENDAHULUAN Resistensi tanaman berhubungan dengan kemampuan tanaman mencegah perkembangan patogen yang menyerang. Kemampuan tersebut diperoleh melalui berbagai strategi pertahanan pasif maupun aktif. Mekanisme pertahanan pasif merupakan pembatas struktural seperti lapisan lilin pada kutikula atau lapisan lignin yang tebal sehingga penetrasi patogen terhambat. Mekanisme pertahanan aktif me libatkan ekspresi gen yang diinduksi oleh adanya interaksi antara tanaman dengan patogen (Keen 1992). Respon pertahanan aktif dicirikan oleh interaksi inkompatibel antara tanaman dengan patogen dan keberhasilan respon per tahanan aktif terletak pada kemampuan tanaman mengenali adanya infeksi oleh patogen. Pengenalan melibatkan molekul reseptor berupa protein yang biasanya terletak pada membran plasma dan disandikan oleh suatu gen resisten (Gabriel dan Rolfe 1990). Reseptor berinteraksi dengan protein dari patogen dan interaksi tersebut berfungsi sebagai stimulus untuk mengaktifkan respon pertahanan tanaman. Identifikasi dan isolasi gen dalam interaksi inang-patogen telah banyak dilaporkan (Heath 1998; Kombrink dan Somssic h 1997; Lin et al. 1997; Sugui dan Deising 2002). Respon ketahanan ada yang berhubungan dengan ekspresi gen penyandi enzim hidrolitik seperti kitinase dan β-1,3-glukanase, protein antifungal dan enzim dalam biosintesis senyawa antimikroba seperti fitoaleksin (Lin et al. 2003). Respon ketahanan juga dapat disebabkan oleh adanya gen resisten seperti gen Hm1 yang memberikan ketahanan tanaman jagung terhadap cendawan patogen Cochliobolus carbonum (Johal dan Briggs 1992). Hm1 adalah kelompok gen resisten penyandi enzim detoksifikasi.

Penemuan berikutnya

menunjukkan sebagian besar gen resisten menyandikan protein yang berperan dalam transduksi sinyal, dan dibedakan satu sama lain berdasarkan struktur proteinnya (Baker et al. 1997; Ellis dan Jones 1998; Richter dan Ronald 2000). Pada umumnya gen resisten yang telah diidentifikasi menyerupai reseptor intraseluler dan mengandung situs pengikatan nukleotida (nucleotide binding site = NBS) yang diikuti oleh domain leucine-rich repeat (LRR) pada ujung Cterminal (Martin et al. 1993; Baker et al. 1997; Ellis dan Jones 1998). Berdasarkan motif pada ujung N-terminal, kelompok gen resisten NBS-LRR

101 dapat dibedakan atas dua macam yakni yang mengandung motif leucine zipper (LZ) seperti gen Rps2 dan Rpm1 (Bent et al. 1994; Grant et al. 1995; Mindrinos et al. 1994) dan mengandung motif yang homologi dengan domain sitoplasmik pada gen Toll Drosophila serta reseptor interleukin-1 (TIR) seperti gen N (Whitman et al. 1994), gen L6 (Lawrence et al. 1995) dan gen Rpp5 (Parker et al. 1997). Beberapa gen resisten lainnya menyerupai reseptor ekstraseluler, seperti kelompok gen Cf (Parniske et al. 1997) dan gen Xa21 (Shalev dan Levy 1997). Kemiripan yang dimiliki oleh protein yang disandikan oleh gen resisten mengindikasikan bahwa tanaman berbeda menggunakan strategi yang hampir sama dalam mencegah timbulnya penyakit (Richter dan Ronald 2000). Takken dan Joosten (2000) mengemukakan, mekanisme resistensi melalui ekspresi protein yang disandikan oleh gen resisten, dapat terjadi melalui empat macam cara yaitu : (1) Produk gen resisten meng-inaktivasi toksin yang dilepas oleh patogen dengan cara menginduksi terjadinya nekrosis atau menghambat induksi respon pertahanan aktif. Mekanisme seperti ini dijumpai pada interaksi tanaman jagung yang memiliki gen resisten Hm1 penyandi NADPH-dependent reductase dengan Cochliobolus carbonum ras 1 penghasil HC-toksin (Johal dan Briggs 1992); (2) Produk gen resisten menyandikan target patogenisitas sehingga keberadaan gen menyebabkan tanaman rentan, seperti gen mitokondrial T-urf13 jagung memberikan kerentanan terhadap Bipolaris maydis ras T (Braun et al. 1989). Varietas jagung yang kehilangan gen T-urf13, resisten terhadap patogen serupa; (3) Produk gen resisten menghambat respon pertahanan tanaman seper ti pada interaksi barley dengan Erysiphe graminis f.sp. hordei. Kerentanan tanaman disebabkan oleh gen mlo. Mutagenesis pada gen mlo memberikan resistensi yang bersifat durable serta aktif melawan infeksi cendawan dalam spektrum luas; (4) Produk gen resisten memperantarai pengenalan patogen yang mengekspresikan gen avirulen (Avr) yang sesuai sehingga mengaktivasi aliran sinyal transduksi pada tanaman yang melibatkan fosforilasi protein, aliran ion, pembentukan spesies oksigen reaktif dan sinyal-sinyal lainnya.

Sinyal segera memicu

transkripsi gen-gen untuk pertahanan tanaman yang menyandikan berbagai protein seperti glutathion-S-transferase, peroksidase, protein-protein dinding sel, proteinase inhibitor, enzim-enzim hidrolitik seperti kitinase dan 1,3-β-glucanase,

102 serta berbagai PR protein (Zhu et al. 1996). Umumnya, sel-sel tanaman yang kontak langsung dengan patogen akan mati, disebut sebagai respon hipersensitif (HR), dan fenomena seperti ini merupakan ciri resistensi yang didasarkan pada konsep gene-for-gene (Hammond-Kosack dan Jones 1996). Salah satu teknik yang dapat digunakan untuk identifikasi dan isolasi transkrip/ gen adalah cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism (cDNAAFLP) (Bachem et al. 1996).

Kepekaan teknik tersebut telah dibuktikan

sebanding dengan analisis Northern sehingga banyak diaplikasikan untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan dalam interaksi inang-patogen, baik gen yang berasal dari tanaman maupun dari patogen (Avrora et al. 2003; Biezen et al. 2000; Durrant et al. 2000; Petters et al. 2002; Santaella et al. 2004, Sugui dan Deising 2002; Zhang et al. 2003).

Keistimewaan teknik cDNA-AFLP adalah

kemampuannya untuk mengidentifikasi gen yang terinduksi maupun tertekan ekspresinya pada satu percobaan yang sama.

Teknik cDNA-AFLP memiliki

sensitivitas tinggi, dapat diulang dan didasarkan pada reaksi amplifikasi dengan PCR serta tidak memerlukan pengetahuan tentang sekuen DNA dari genom target. Penelitian

ini

bertujuan

untuk

mengidentifikasi

transkrip

atau

gen/bagiannya yang berhubungan dengan resistensi maupun kerentanan klon karet terhadap infeksi C. cassiicola, dengan mengaplikasikan teknik cDNA-AFLP. Dengan menggunakan RNA yang diisolasi dari klon resisten dan klon rentan dalam suatu rentang waktu selama terjadi interaks i antara tanaman dengan patogen, perubahan pola ekspresi transkrip tertentu dapat diamati.

Untuk

menampilkan profil transkrip dengan baik, diperlukan RNA dan cDNA dengan kualitas tinggi dan seragam. Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan juga pemantapan prosedur isolasi RNA dan sintesis cDNA untuk daun karet sehingga sesuai untuk digunakan dalam analisis cDNA-AFLP .

BAHAN DAN METODE

Bahan tanam dan isolat patogen Klon karet resisten AVROS 2037 dan klon rentan PPN 2444 yang ditanam dalam polibeg digunakan dalam penelitian ini. Bahan tanam tersebut pada fase

103 pertumbuhan dua unit daun. Sebagai patogen adalah isolat C. cassiicola cGT1 SS virulen yang diperoleh dari Balai Penelitian Karet (BPK) Sembawa. Konidia isolat diproduksi berdasarkan metode Situmorang (2002).

Perlakuan tanaman Daun umur sekitar 14 hari diinokulasi dengan menggunakan suspensi konidia yang disemprotkan secara merata ke permukaan bawah daun de ngan menggunakan botol semprot, kemudian daun disungkup dengan kantong plastik. Konsentrasi konidia di dalam suspensi adalah 4 x 104 konidia/ml. Sampel diambil dari daun yang tidak diinokulasi sebagai kontrol dan dari daun yang diinokulasi masing-masing 24, 36, 48 dan 72 jam setelah inokulasi. Sampel daun disimpan dalam nitrogen cair sebelum isolasi RNA dilaksanakan.

Preparasi sampel RNA dan cDNA untuk analisis cDNA-AFLP Dalam penelitian ini diuji tiga cara preparasi sampel RNA untuk analisis cDNA-AFLP. Pertama, adalah preparasi sampel secara bertahap melalui isolasi RNA yang ke mudian digabung dengan pemurnian mRNA menggunakan Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega) serta sintesis cDNA menggunakan Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega).

Kedua, adalah

preparasi sampel melalui isolasi RNA dengan kit Plant RNA Reagent (Invitrogen) yang kemudian digabung dengan metode satu tabung (one-tube method) menggunakan mRNA Capture Kit (Roche). Sedangkan teknik preparasi sampel yang ketiga adalah menggunakan mRNA Capture Kit (Roche) tanpa melalui isolasi RNA.

Preparasi sampel secara bertahap Isolasi RNA dari daun tanaman karet dilakukan dengan dua cara yaitu menggunakan metode Pawlowski et al. (1994) dan metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993), dengan beberapa modifikasi.

Prosedur

isolasi RNA dengan metode Pawlowski et al. (1994) terdapat pada Bab 4, sedangkan prosedur isolasi RNA berdasarkan metode Taylor dan Powel dilaksanakan sebagai berikut.

104 Peralatan dan larutan yang akan digunakan untuk mengisolasi RNA direndam dalam larutan DEPC 0,1%. Daun karet dicuci dengan air mengalir, kemudian tulang daunnya dibuang dan dikeringkan dengan kertas tisu. Daun ditimbang 2 – 2,5 g, dimasukkan ke dalam lumpang porselen yang telah didinginkan, kemudian ditambahkan 0,2 g PVPP dan nitrogen cair, lalu digerus sampai terbentuk serbuk halus.

Serbuk halus yang diperoleh dimasukkan ke

dalam tabung sentrifus 15 ml yang telah diisi dengan 5 ml bufer ekstrak (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8,0, 2% CTAB) dan 2% βmerkaptoethanol, dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 0C selama 30 menit, dikocok setiap 5 menit sekali. Larutan bufer ekstrak didinginkan hingga suhu kamar, kemudian ditambahkan 5 ml fenol:kloroform (1:1) dan dikocok kuat. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Cairan bagian atas (supernatan) dipipet ke dalam tabung sentrifus lain dan ditambah dengan 5 ml fenol:kloroform (1:1). Fenol dihilangkan dengan cara mengekstrak supernatan dengan 5 ml kloroform, campuran dikocok kuat dan disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipipet ke dalam tabung sentrifus lain, ditambahkan 5 ml isopropanol dingin dan dihomogenkan perlahan-lahan, kemudian diinkubasi pada suhu –20 0 C selama 30 menit. Campuran disentrifus pada kecepatan 6.000 rpm selama 25 menit. Cairan dibuang,

endapan

dikering-anginkan

dengan

cara

membalikkan

tabung.

Selanjutnya endapan dilarutkan dengan 500 µl akuades steril (yang telah diberi perlakuan dengan DEPC 0,1%), larutan dipipet ke dalam tabung 2 ml dan ditambahkan ¼ volume LiC l 10 M, kemudian diinkubasi pada suhu 40C selama 3 jam. Campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit, cairan dibuang, endapan RNA dilarutkan dengan 500 µl akuades steril kemudian larutan dipipet ke dalam tabung 2 ml.

Ke dalam tabung ditambahkan 1/10 volume

natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 2,5 volume alkohol absolut, diinkubasi pada suhu – 20 0C satu malam. Selanjutnya campuran disentrifus pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang, endapan dicuci dengan 500 µl alkohol 70% kemudian dikering-anginkan. Endapan dilarutkan dengan 500 µl akuades steril. Hasil isolasi RNA diamati melalui elektroforesis pada gel agarose 1% yang diwarnai dengan 0,5 mg/l etidium bromida, pada tegangan 50 Volt selama

105 sekitar 1 jam.

RNA diamati dengan menggunakan UV transiluminator.

Penetapan konsentrasi RNA dilakukan dengan spektrofotometer UV melalui nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al. 1989).

Pemurnian mRNA dengan Poly ATract mRNA Isolation System III Untuk memurnika n mRNA dari RNA digunakan kit Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega) , prosedur pemurnian mRNA terdapat da lam Bab 4. Sintesis cDNA menggunakan Universal Riboclone  cDNA Synthesis System Sintesis cDNA menggunakan Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega)

dilaksanakan sesuai prosedur yang direkomendasikan.

Tahapan sintesis tersebut secara rinci terdapat dalam Bab 5.

Pemotongan cDNA dengan enzim restriksi TaqI dan VspI Untuk memotong cDNA dengan enzim restriksi Taq I, sebanyak 20 µl cDNA (250 ng) dicampur dengan 4 µl 1,4 All Buffer (10X), 1 µl enzim Taq I (10 unit/µl), dan ditambahkan H2O (MilliQ) hingga volume 40 µl. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 65 0C selama 2 jam, didinginkan sampai suhu ruang, kemudian diputar sesaat.

Pemotongan cDNA dengan enzim VspI dilakukan

dengan cara menambahkan 10 µl campuran yang mengandung 1 µl 1,4 All Buffer (10X), 1 µl enzim VspI (10 unit/µl) dan 8 µl H2 O (MilliQ), sehingga total volume adalah 50 µl. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2 jam. Ligasi fragmen cDNA dengan sekuen adapter Sekuen adapter yang digunakan adalah adapter utas atas Vsp I (5’- CTC GTA GAC TGC GTA CC- 3’), adapter utas bawah Vsp I (5’- TAG GTA CGC AGT C – 3’), adapter utas atas Taq I (5’- GAC GAT GAG TCCT GAC – 3’) dan adapter utas bawah Taq (5’- CGG TCA GGA CTC AT – 3’). Adapter Vsp I disiapkan dengan cara mencampurkan sebanyak 2,6 µl adapter utas atas Vsp I (1 µg/µl), 2 µl adapter utas bawah Vsp I (1 µg/µl), dan 95,4 µl H2 O (MilliQ) sehingga konsentrasi akhir adalah 5 µM. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 10 menit, dan didinginkan sampai mencapai suhu ruang.

Untuk

106 menyiapkan adapter Taq I, dicampurkan sebanyak 25 µl adapter utas atas Taq I (1 µg/µl), 22 µl adapter utas bawah Taq I (1 µg/µl), dan 53 µl H2 O (MilliQ) sehingga konsentrasi akhir adalah 50 µM.

Campuran kemudian diinkubasi

dengan suhu dan waktu yang sama seperti di atas. Ligasi antara fragmen cDNA dengan sekuen adapter dilaksanakan dengan menambahkan ke dalam 50 µl produk restriksi sebanyak 5,5 µl campuran yang mengandung 1 µl adapter Vsp I (5 µM), 1 µl adapter Taq I (50 µM), 0,5 µl ATP (10 mM), 0,5 µl 1,4 All Buffer (10X), 2,5 µl T4 DNA Ligase. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 22 0C selama 2 jam.

Preamplifikasi Pramplifikasi dilaksanakan dengan primer standar Vsp dan Taq yang tidak mengandung nukleotida selektif. Sekuen primer standar untuk Vsp adalah 5’CTC GTA GAC TGC GTA CCT AAT – 3’ dan sekuen primer standar untuk Taq adalah 5’- GAC GAT GAG TCC TGA CCG A – 3’.

Setiap campuran

preamplifikasi terdiri atas 5 µl produk ligasi, 1 µl Vsp primer (100 ng/ µl), 1 µl Taq primer (100 ng/µl), 5 µl PCR bufer (10X), 5 µl dNTPs (10X, 2,5 mM), 2 µl Taq DNA Polimerase, 5 µl MgCl2 , dan ditambahkan H2 O hingga volume 50 µl. Ke dalam setiap tabung ditambahkan 2 tetes minyak mineral. Reaksi amplifikasi dilaksanakan dengan kondisi 94 0C, 3 menit kemudian diikuti 25 siklus, setiap siklusnya terdiri atas 94 0 C (45 detik), 55 0C (45 detik), dan 72 0C (60 detik). Produk PCR kemudian dielektroforesis pada agarose 1% dengan tegangan 70 V selama kurang lebih 30 menit. Gel kemudian diwarnai dengan etidium bromida (0,5 mg/l ) dan produk amplifikasi diamati dengan UV transiluminator. Amplifikasi selektif Untuk pelaksanaan amplifikasi selektif, dilakukan pengenceran terhadap produk preamplifikasi sebanyak 10X. Di samping itu primer Vsp selektif dilabel dengan radioisotop

33

P. Proses pelabelan dilaksanakan dengan mencampurkan 5

µl primer Vsp (100 ng/µl), 10 µl bufer kinase (bufer A) 5X, 10 µl γ 33 ATP, 2 µl T4 kinase dan ditambahkan H2O hingga volume 50 µl. Campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam, dan kemudian dipanaskan pada suhu 70 0 C selama 10

107 menit untuk menginaktifkan enzim. Primer yang telah dilabel disimpan pada suhu 4 0 C dalam wadah khusus, sampai akan digunakan. Primer untuk amplifikasi selektif mengandung 2 nukleotida tambahan dengan sekuen primer Vsp adalah 5’ - GAC TGC GTA CCT AAT NN – 3’ dan sekuen primer Taq I adalah 5’- GAT GAG TCC TGA CCG ANN – 3’. Preparasi sampel dilakukan dengan mencampurkan 5 µl produk preamplifikasi yang telah diencerkan, 0,2 µl Vsp primer (100 ng/µl) yang telah dilabel, 0,6 µl Taq primer (100 ng/µl), 3,2 µl dNTPs (10X, 2,5 mM), 2 µl PCR bufer, 2 µl MgCl 2 10X, 1 µl Taq DNA Polimerase dan H2 O hingga volume 20 µl. Kemudian ditambahkan 1 tetes minyak mineral. Reaksi amplifikasi dilaksanakan sebanyak 13 siklus dengan kondisi 94 0C (30 detik), 65 0 C [- 0,7

0

C/siklus] (30 detik), 72 0C (60 detik) dan

23 siklus dengan kondisi 94 0C (30 detik), 56 0C (30 detik), 72 0C (60 detik).

Visualisasi produk PCR Produk PCR dicampur dengan pewarna formamid dengan volume yang sama dan didenaturasi pada 94 0C selama 3 menit, sebelum dielektroforesis pada 5% poliakrilamid gel.

Gel kemudian ditransfer ke Gel Blotting Paper,

dikeringkan dengan Gel Dryer dan diekspos dengan film sinar X (Life Ray  XDA Plus UTL G) selama ± 7 hari. Preparasi sampel melalui isolasi RNA dan metode satu tabung (one-tube method) Isolasi RNA menggunakan Plant RNA Reagent (Invitrogen) Daun yang telah diinokulasi dengan C. cassiicola dimasukkan ke dalam RNAlater (Ambion) yaitu reagen yang berfungsi untuk melindungi RNA dari kerusakan, terutama apabila isolasi RNA tidak bisa langsung dilaksanakan dan penyimpanan dalam nitrogen cair tidak memungkinkan. Sebelum dilaksanakan isolasi RNA, daun terlebih dulu di-liopilisasi untuk menghilangkan semua cairan dari jaringan daun sehingga daun menjadi kering.

Liopilisasi dila ksanakan

dengan menggunakan alat Lyophilisator , selama 48 jam. Untuk mengisolasi RNA, daun yang telah kering digerus hingga berbentuk serbuk halus kemudian serbuk ditimbang sebanyak 100 mg dan ditambahkan 0,5

108 ml Plant RNA Reagent dingin (4 0C), dikocok menggunakan vortex sehingga serbuk tercampur sempurna dengan larutan.

Campuran kemudian diinkubasi

selama 5 menit pada suhu ruang, disentrifus dengan kecepatan 12.000 g selama 4 menit pada suhu ruang. RNase.

Supernatan dipindahkan ke tabung baru yang bebas

Ke dalam supernatan ditambahkan 100 µl NaCl 5 M dan 300 µl

kloroform, kemudian tabung di bolak-balik untuk mencampurkan semua larutan. Selanjutnya sampel disentrifus pada kecepatan 12.000 g selama 10 menit pada suhu 4 0 C. Fase cair bagian atas dipindahkan ke tabung baru bebas RNase da n ditambahkan isopropil alkohol dengan volume yang sama, kemudian tabung dibolak-balik untuk mencampurkan larutan.

Campuran diinkubasi selama 10

menit pada suhu ruang, kemudian disentrifus pada kecepatan 12.000 g selama 10 menit pada suhu 4 0C. Supernata n dibuang dan ke dalam tabung yang berisi endapan ditambahkan 1 ml etanol 75%, tabung diketuk pelan untuk melepaskan endapan dari dinding tabung, disentrifus pada kecepatan 12.000 g selama 1 menit pada suhu ruang. Cairan dibuang dan endapan dikeringkan de ngan menggunakan vakum (Univapo Concentrator Centrifuge, tipe MC2L - UniEquip ). RNA kemudian dilarutkan dalam 20 µl air yang diberi perlakuan DEPC dan disimpan pada – 20 0C. Untuk mengetahui kualitas RNA, sebanyak 1 µl RNA dicampur dengan 5 µl H2O dan 1 µl bromofenol biru kemudian dielektroforesis. Kuantitas RNA diukur dengan spektrofotometer UV (UV/Vis Spectrophotometer - Beckman) dengan menggunakan 1 µl RNA. Pemurnian mRNA dan sintesis cDNA dengan mRNA Capture Kit Sebanyak 5 µg total RNA dicampur dengan 40 µl lisis bufer dan 1 µl oligo(dT)20 terlabel biotin, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit. Larutan dipindahkan ke streptavidin-coated PCR tube dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 5 menit, kemudian dibiarkan dingin sampai suhu ruang dan diletakkan pada kotak berisi es. Cairan dibuang dari tabung dan tabung dicuci tiga kali, masing-masing menggunakan 250 µl washing buffer. Untuk sintesis cDNA utas pertama, ke dalam tabung dimasukkan 50 µl campuran yang mengandung 10 µl bufer ligasi 5X, 0,5 µl RNase inhibitor, 5 µl DTT 100 mM, 10 µl dNTP 10X (2,5 mM), 1 µl Reverse Transcriptase Expand

109 dan 22,5 µl H2 O. Campuran kemudian diinkubasi pada suhu 42 0C selama 2 jam. Sebanyak 10 µl campuran di atas dibuang, dan ke dalam 40 µl campuran yang terdapat dalam streptavidin-coated PCR tube ditambahkan 120 µl larutan yang mengandung 16 µl bufer ligasi, 12 µl dNTP 10X (2,5 mM), 6 µl DTT 100 mM, 1,5 µl enzim ligase, 4,3 µl DNA Polimerase I (E. coli), 1,6 µl RNase H dan 78,6 µl H2 O, untuk sintesis cDNA utas kedua. Campuran diinkubasi 15 0 C selama 45 menit dan kemudian 22 0C selama 50 menit. Larutan dibuang dari tabung dan tabung dicuci tiga kali, masing-masing menggunakan 200 µl bufer pencuci. Pemotongan cDNA tahap satu dengan enzim restriksi Taq I Ke dalam tabung yang telah dicuci ditambahkan 50 µl campuran yang mengandung 5 µl 1,4 All Buffer 10X, 2 µl enzim restriksi Taq I dan 43 µl H2O, kemudian ditambahkan 2 tetes minyak mineral dan diinkubasi pada suhu 65 0 C selama 2 jam.

Selanjutnya larutan dibuang dari tabung dan tabung dicuci tiga

kali, masing-masing menggunakan 100 µl bufer pencuci. Pemotongan cDNA tahap dua dengan enzim restriksi Vsp I Ke dalam tabung yang telah dicuci ditambahkan 50 µl campuran yang mengandung 5 µl 1,4 All Buffer 10X, 1 µl enzim restriksi Vsp I dan 44 µl H2O, kemudian campuran diinkubasi pada suhu 37 0C selama 2 jam. Larutan kemudian dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml.

Ligasi fragmen cDNA,

Preamplifikasi, Amplifikasi selektif dan Visualisasi

fragmen Proses ligasi fragmen cDNA dengan adapter, preamplifikasi, amplifikasi selektif dan visualisasi produk cDNA-AFLP sama seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Preparasi sampel dengan metode satu menggunakan mRNA Capture Kit (Roche)

tabung

(one-tube

method)

Daun yang telah berbentuk serbuk (hasil liopilisasi) ditimbang sebanyak 20 mg di dalam tabung mikro 1,5 ml, kemudian ditambahkan 200 µl lysis buffer,

110 di-vortek agar tercampur sempurna dan disimpan dalam kotak berisi es selama 5 menit.

Sela njutnya campuran tersebut disentrifus dengan kecepatan 11.000 g

selama 1 menit pada suhu 4 0C. Semua supernatan dipindahkan ke tabung mikro yang baru, kemudian disentrifus kembali dengan kondisi sama seperti di atas dan dipindahkan ke tabung mikro yang ba ru. Sementara itu campuran oligo(dT)20 terlabel biotin disiapkan dengan cara mencampurkan 2 µl oligo (dT)20 yang telah terlabel biotin (mRNA Capture Kit) dengan 38 µl H2 O (mRNA Capture Kit).

Sebanyak 4 µl campuran tersebut

ditambahkan ke dalam setiap sampel, dihomogenkan dan disimpan dalam kotak berisi es selama 5 menit. Sebanyak 50 µl campuran dipindahkan ke tabung PCR yang dilapisi streptavidin (streptavidin-coated PCR tube) (mRNA Capture Kit) dan diinkubasi selama 5 menit pada 37 0C. Selanjutnya larutan dibuang, tabung dicuci 3X, masing-masing dengan 250 µl washing buffer (mRNA Capture Kit). Sintesis cDNA utas satu dan dua serta pemotongan cDNA dengan enzim restriksi Taq I dan Vsp I dilakukan langsung di dalam streptavidin-coated PCR tube dengan cara sama seperti yang telah dijelaskan dalam metode di atas. Demikian juga proses preamplifikasi dan amplifikasi selektif serta visualisasi produk PCR, dilakukan sama seperti yang telah dijelaskan di atas.

Isolasi fragmen dari gel poliakrilamid dan amplifikasinya Fragmen target ditandai pada film kemudian bagian film sebesar ukuran fragmen dipotong dengan menggunakan pisau bedah (scalpel) sehingga terbentuk lubang seukuran fragmen. Film ditempelkan di atas gel pada posisi yang sesuai, kemudian gel dipotong melalui lubang yang telah dibuat pada film.

Setiap

potongan gel dimasukkan ke masing-masing tabung PCR 500 µl dan ditambahkan 100 µl Tris (10 mM) pH 7,5. Inkubasi dilakukan selama 4 jam pada suhu 37 0 C, kemudian larutan dikocok kuat (vorteks) dan inkubasi dilanjutkan selama 5 menit pada suhu 95 0 C dan dikocok kuat kembali. Larutan disentrifus sesaat, bagian larutan (sekitar 90 µl) dipindahkan ke tabung yang baru dan ke dalam masingmasing tabung ditambahkan 10 µl glikogen, 1/10 volume sodium asetat (3M, pH 5,2), dan 2 volume etanol absolut. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu – 20 0

C selama satu malam.

111 Setelah inkubasi, campuran disentrifus pada kecepatan 12.000 g pada suhu 4 0 C selama 20 menit. Supernatan dibuang, endapan dicuci dengan 1 ml etanol 70%, kemudian disentrifus 12.000 g dengan suhu 4 0 C selama 10 menit. Larutan dibuang dan endapan dikeringkan, kemudian endapan dilarutkan dalam 10 µl Tris 10 mM (pH 8,0). Amplifikasi fragmen cDNA dilakukan pada volume 20 µl dengan menggunakan primer yang sesuai dan konsentrasi masing-masing komponen sama seperti pada saat melakukan preamplifikasi.

Sedangkan kondisi PCR adalah

0

sebagai berikut: 94 C selama 3 menit; kemudian 35 siklus , masing-masing siklus terdiri atas 94 0 C, 45 detik, 56 0C, 45 detik, 72 0C, 60 detik; dan 72 0C selama 7 menit. Untuk konfirmasi hasil, produk PCR dipisahkan pada 2% agarose gel melalui elektroforesis pada voltase 70 Volt selama sekitar 50 menit.

Pemurnian fragmen cDNA Untuk pemurnian fragmen cDNA, produk PCR di atas dipisahkan dengan cara yang sama pada 2% low melting agarose (Qbiogene). Selanjutnya fragmen dimurnikan dengan QIAquick Gel Extraction Kit, sesuai dengan prosedur yang direkomendasikan dalam petunjuk teknisnya, yaitu sebagai berikut. Fragmen cDNA dipotong dari gel dengan menggunakan pisau bedah (scalpel), kemudian gel ditimbang dan ditambahkan 3 volume bufer QG. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 500C selama 10 menit atau sampai gel larut sempurna. Kelarutan dapat dibantu dengan cara mengocok (vortex) sampel setiap 2 – 3 menit selama masa inkubasi. Setelah gel larut ditambahkan isopropanol sesuai dengan berat gel pada saat awal. Sebagai contoh, kalau berat gel adalah 100 mg maka isopropanol yang ditambahkan adalah sebanyak 100 µl.

Spin

column QIAquick diletakkan di atas collection tube 2 ml kemudian campuran larutan isopropanol dituang ke spin column dan disentrifus 1 menit. Larutan yang terdapat pada collection tube dibuang. Untuk proses pencucian ditambahkan 0,75 ml bufer PE ke spin column dan disentrifus selama 1 menit. Setelah larutan pada collection tube dibuang, dilakukan sentrifus ulang selama 1 menit. Selanjutnya spin column diletakkan di atas tabung mikro 1,5 ml dan untuk meng-elusi DNA ditambahkan 50 µl bufer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) di bagian tengah membran

112 spin column dan disentrifus selama 1 menit pada 12.000 g. Larutan dari spin column yang mengandung DNA yang telah murni dan telah berada di tabung mikro disimpan pada -200 C.

Kloning fragmen cDNA pada vektor Kloning fragmen cDNA dilakukan pada vektor pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) yang memiliki ukuran 3015 bp.

Proses kloning dimulai

dengan meligasikan fragmen cDNA ke vektor tersebut menggunakan enzim ligase, sesuai rekomendasi. Hasil ligasi diintroduksikan ke sel bakteri E. coli DH5α kompeten yang tela h dipersiapkan dan dilaksanakan berdasarkan metode Sambrook et al. (1989). Sebanyak 5 koloni dari setiap cawan dibuat replikanya dan digunakan dalam PCR koloni untuk konfirmasi fragmen cDNA yang diperoleh, maupun untuk digunakan dalam proses sekuensing.

Sekuensing fragmen cDNA Sekuensing fragmen cDNA dilakukan oleh perusahan komersil GATC Biotech, Constance, Germany. Program Contig Express (Vector NTI Suite 6) digunakan untuk membersihkan sekuen vektor dan adapter dan kemudian mengelompokkan sekuen contigs.

Sekuen yang telah diedit tersebut kemudian

dibandingkan dengan yang terdapat di pangkalan data (data base) GenBank menggunakan algoritma BLASTX (Altschul et al. 1997).

HASIL

Optimasi isolasi RNA dan sintesis cDNA dari daun karet Isolasi RNA yang dilakukan berdasarkan metode Pawlowski et al. (1994) dan metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993) memberikan hasil yang kurang konsisten. RNA dari beberapa contoh daun dapat diisolasi dengan hasil yang cukup baik, namun isolasi dari sampel lainnya menghasilkan RNA dengan konsentrasi yang rendah atau RNA terdegradasi (Gambar 20). Pada prinsipnya, prosedur isolasi RNA dengan kedua metode tersebut di atas hampir sama . Perbedaan utamanya te rletak pada komposisi bahan yang

113 terdapat dalam bufer ekstraksi.

Bufer ekstrak pada metode Pawlowski et al.

(1994)

cetyltrimethylammonium

mengandung

deterjen

bromide

(CTAB)

sedangkan pada metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993) mengandung (SDS). Jenis deterjen akan mempengaruhi penggunaan suhu dalam proses ekstraksi RNA.

Prosedur yang menggunakan CTAB pada bufer

ekstraknya memerlukan suhu 65 0 C sedangkan dengan SDS memerlukan suhu dingin sehingga proses ekstraksi dilakukan dalam lingkungan es.

1

2

3

4

5

6

7

1

2

28S 18S

28S 18S

A

B

C

Gambar 20. RNA total dari daun karet. (A) RNA diisolasi dari daun klon AVROS 2037 (lajur 1 dan 2) dan PPN 2444 (lajur 3 dan 4) menggunakan metode Pawlowski et al. (1994) . (B) RNA dengan konsentrasi berbeda dan terdegradasi, diisolasi dari daun klon AVROS 2037 menggunakan metode Pawlowski et al. (1994) . (C) RNA diisolasi dari daun klon AVRO S

2037 (lajur 1 dan 2) menggunakan metode Taylor dan Powel (dalam Spiers dan Longhurst 1993).

RNA yang diperoleh dalam kondisi baik akan menghasilkan fragmen 28S dan 18S yang terlihat tajam (Gambar 20 C). Kelemahan metode tersebut adalah hasilnya yang tidak stabil karena dengan mengaplikasikan metode yang sama ada kalanya RNA yang diperoleh terdegradasi (Gambar 20 B).

Di samping itu,

kelemahan lain kedua metode isolasi RNA di atas adalah pelaksanaannya kurang efisien karena untuk mendapatkan RNA diperlukan waktu yang relatif lama, yakni mencapai sekitar 3 hari.

Kondisi ini sering kurang menguntungkan terutama

apabila sampel yang dianalisis cukup banyak. Oleh karena itu diperlukan metode lain yang lebih efisien sehingga RNA dapat diperoleh dalam waktu relatif singkat serta dengan kualitas dan kuantitas yang baik.

114 Tahap pemurnian mRNA dari RNA menggunakan kit Poly ATract mRNA Isolation System III (Promega) serta sintesis cDNA dari templat mRNA menggunakan kit Universal Riboclone cDNA Synthesis System (Promega), dilakukan terhadap RNA yang diperoleh melalui isolasi dengan metode Pawlowski et al. (1994).

Dengan menggunakan kit di atas, mRNA dapat

diperoleh antara 0,1 – 1%. Namun secara keseluruhan, penggunaan kit tersebut dalam rangkaian tahapa n ini kurang efisien karena untuk pemurnian mRNA diperlukan RNA dalam jumlah relatif banyak sehingga sulit dipenuhi. Kit Plant RNA Reagent (Invitrogen) memberikan peluang untuk melakukan isolasi RNA dalam waktu kurang dari 1 jam dan hampir semua tahapan, kecuali sentrifus, dilaksanakan pada suhu ruang. Umumnya RNA yang diperoleh memiliki kualitas baik seperti terlihat pada hasil elektroforesis yang dipisahkan pada gel agarose, dengan penampakan diskrit dan tajam fragmen 28S dan 18S rRNA (Gambar 21).

Meskipun demikian, beberapa di antaranya

menunjukkan adanya degradasi RNA. Pengukuran kualitas dan kuantitas masingmasing RNA dengan spektrofotometer UV memberikan hasil yang bervariasi (Tabel 16).

Dari hasil tersebut diketahui bahwa kemurnian RNA memenuhi

standar, berkisar antara 1,8 – 2,0, namun konsentrasi RNA terdapat dalam rentang yang cukup besar yakni antara 0,035 – 1,327 µg/µl. Pemurnian mRNA dan sintesis cDNA menggunakan mRNA Capture Kit (Roche) dilakukan terhadap sampel yang diisolasi dengan kit Plant RNA Reagent. Keuntungan penggunaan mRNA Capture Kit adalah seluruh proses, mulai dari pemurnian mRNA sampai dengan sintesis cDNA utas kedua dilakukan dalam tabung yang sama sehingga jauh lebih praktis. Di samping itu, untuk mengurangi resiko hilangnya RNA dalam setiap tahapan proses isolasi, juga diuji pelaksanaan sintesis cDNA tanpa melalui proses isolasi RNA ataupun pemurnian mRNA dengan menggunakan mRNA Capture Kit. Dalam hal ini, sampel yang telah berbentuk serbuk langsung dilisis dalam buffer yang terdapat dalam kit. Prinsip utama dari mRNA Capture Kit adalah penggunaan tabung yang dilapisi dengan streptavidin. mRNA yang telah dilisis dari sel dan memiliki ujung 3’- poli(A) dihibridisasikan dengan oligo (dT)20 yang dilabel biotin sehingga

115 sewaktu dimasukkan ke dalam tabung berlapis streptavidin, hanya mRNA yang akan terikat pada tabung sedangkan ribosomal RNA atau transfer RNA dapat dipisahkan langsung dalam proses pencucian. Feron et al. (2004) memodifikasi teknik tersebut untuk diaplikasikan dalam analisis cDNA-AFLP sehingga seluruh tahap, mulai dari sintesis cDNA sampai dengan pemotongan cDNA dengan dua macam enzim restriksi dilakukan dalam satu tabung yang sama.

Modifikasi

serupa diaplikasikan dalam penelitian ini untuk mendapatkan populasi fragmen cDNA asal daun karet.

Pemotongan cDNA dilaksanakan dengan kombinasi

enzim restriksi VspI dan TaqI sedangkan primer selektif dipilih berdasarkan hasil seleksi yang dilakukan sebelumnya (Bab 5).

M

AVROS 2037 24 36 48

0

72

bp 500

A

A

350 220

B B

M

0

24 36 PPN 2444

(+)

72

Gambar 21. RNA dari daun klon AVROS 2037 dan PPN 2444 yang diisolasi dengan Plant RNA Reagent pada beberapa waktu setelah inokulasi petogen. (A) RNA klon AVROS 2037, berturut-turut 0, 24, 36, 48, 72 jam setelah inokulasi (masing-masing duplo). (B) RNA klon PPN 2444, berturut -turut 0, 24, 36, kontrol positif, 72 jam setelah inokulasi (masing-masing duplo). (M) Marker DNA.

116 Tabel 16. Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA dari daun klon AVROS 2037 dan PPN 2444 pada beberapa waktu setelah inokulasi dengan C. cassiicola menggunakan kit Plant RNA Reagent Klon

Inokulasi (Jam)

Absorbansi (260 nm)

A260/A280

Konsentrasi (µg/µl)

AVROS 2037

0 0 (duplo) 24 24 (duplo) 36 36 (duplo) 48 48 (duplo) 72 72 (duplo)

0,207 0,405 0,172 0,365 0,217 0,190 0,286 0,237 0,249 0,320

1,894 1,982 2,019 1,975 2,009 2,019 2,041 2,019 1,985 1,997

0,414 0,810 0,343 0,729 0,434 0,379 0,572 0,474 0,498 0,640

PPN 2444

0 0 (duplo) 24 24 (duplo) 36 36 (duplo) 72 72 (duplo)

0,663 0,623 0,354 0,391 0,017 0,213 0,090 0,309

2,031 1,981 2,031 2,025 1,856 1,995 1,961 1,856

1,327 1,246 0,708 0,782 0,035 0,426 0,181 0,618

Fragmen cDNA yang diperoleh dari beberapa prosedur di atas selanjutnya di-preamplifikasi menggunakan primer standar VspI dan TaqI sehingga dapat divisualisasikan pada gel agarose. Penampakan cDNA pada gel tersebut adalah smear , bukan merupakan fragmen atau pita yang diskrit. Pembandingan hasil visualisasi cDNA berdasarkan penampakan tersebut serta intensitasnya pada gel menunjukkan secara jelas bahwa sintesis cDNA secara langsung dengan menggunakan mRNA Capture Kit menghasilkan cDNA yang jauh lebih seragam antar masing-masing sampel di bandingkan dengan cDNA yang dipe roleh dari kedua metode lainnya (Gambar 22).

Hal ini menguntungkan karena untuk

aplikasi teknik cDNA-AFLP , diperlukan cDNA dengan kualitas dan kuantitas yang sama, terutama apabila pengamatan yang dilakukan berhubungan dengan pola ekspresi suatu transkrip.

117 AVROS 2037 M 0 24 36 48 72

PPN 2444 24 36 48 72

0

bp 500 A 220

M 0

AVROS 2037 24 36 48 72

PPN 2444 0 24 36 48 72

bp 500 B 220

M

0

AVROS 2037 24 36 48 72

0

PPN 2444 24 36 48 72 M

bp 500 C 220

Gambar 22. Hasil preamplifikasi cDNA menggunakan primer standar VspI dan TaqI dengan tiga cara penyiapan RNA. (A) – cDNA disintesis dari RNA yang diisolasi secara bertahap. (B) – cDNA disintesis dari RNA yang diisolasi dengan Plant RNA Reagent. (C) – cDNA disintesis tanpa melalui isolasi RNA (langsung menggunakan mRNA Capture Kit). (M) 1 Kb DNA ladder. (1 – 5) cDNA dari daun klon AVROS 2037, dan (6-10) cDNA dari daun klon PPN 2444, pada 0, 24, 36, 48, 72 jam setelah inokulasi dengan C. cassiicola.

118 Analisis cDNA-AFLP Analisis cDNA-AFLP asal daun karet dilaksanakan dengan menggunakan 29 kombinasi primer (Tabel 17). Produk amplifikasi yang diperoleh memiliki berat molekul antara sekitar 50 sampai 600 pasang basa (pb). Rata -rata jumlah fragmen per kombinasi pasangan primer adalah 50 fragmen sehingga total diperoleh sekitar 1450 fragmen. Sebagian besar fragmen memiliki pola ekspresi sama, namun beberapa fragmen menunjukkan pola ekspresi berbeda, baik antar klon AVROS 2037 dengan klon PPN 2444 pada setiap waktu setelah daun diinokulasi dengan patogen maupun antar waktu pengambilan sampel setelah inokulasi patogen pada masing-masing klon. Tabel 17. Kombinasi sekuen primer VspI dan TaqI dalam amplifikasi selektif cDNA asal daun karet menggunakan metode cDNA -AFLP. No.

Kombinasi primer

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

Vsp16/Taq16 Vsp16/ Taq17 Vsp16/ Taq19 Vsp16/ Taq20 Vsp16/ Taq21 Vsp16/ Taq22 Vsp16/ Taq24 Vsp16/ Taq25 Vsp17/ Taq16 Vsp17/ Taq17 Vsp17/ Taq19 Vsp17/ Taq20 Vsp17/ Taq21 Vsp17/ Taq22 Vsp17/ Taq24 Vsp17/ Taq25 Vsp20/ Taq16 Vsp20/ Taq17 Vsp20/ Taq19 Vsp20/ Taq20 Vsp20/ Taq21 Vsp20/ Taq22 Vsp20/ Taq24 Vsp20/ Taq25 Vsp25/ Taq16 Vsp25/ Taq17 Vsp25/ Taq19 Vsp25/ Taq20 Vsp25/ Taq21

Sekuen pasangan primer (5’

3’)

GACTGCGTACCTAAT-CC/GATGAGTCCTGACCGA -CC GACTGCGTACCTAAT-CC/GATGAGTCCTGACCGA -CG GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GG GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-GT GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-TC GACTGCGTACCTAAT-CC/ GATGAGTCCTGACCGA-TG GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGA CCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GG GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-GT GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-TC GACTGCGTACCTAAT-CG/ GATGAGTCCTGACCGA-TG GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GG GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-GT GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-TC GACTGCGTACCTAAT-GC/ GATGAGTCCTGACCGA-TG GACTGCGTACCTAAT-T G / GATGAGTCCTGACCGA-CC GACTGCGTACCTAAT-T G / GATGAGTCCTGACCGA-CG GACTGCGTACCTAAT-T G / GATGAGTCCTGACCGA-GA GACTGCGTACCTAAT-T G / GATGAGTCCTGACCGA-GC GACTGCGTACCTAAT-T G / GATGAGTCCTGACCGA-GG

119 Untuk mengamati transkrip asal tanaman karet yang diregulasi ekspresinya akibat infeksi C. cassiicola , dilakukan analisis pada empat periode waktu setelah inokulasi (24, 36, 48 dan 72 jam) serta kontrol (tanpa inokulasi patogen) sebagai pembanding. Analisis cDNA-AFLP dimulai dengan pemotongan cDNA masingmasing sampel dengan enzim restriksi VspI dan TaqI. Dengan demikian maka sekuen adapter yang diligasikan dengan masing-masing fragmen cDNA hasil restriksi memiliki sekuen pengenalan basa dari kedua enzim tersebut (Bab 4, Bahan dan Metode). Proses preamplifikasi cDNA yang telah diligasikan dengan adapter menggunakan primer standar yang juga memiliki sekuen pengenalan basa enzim VspI dan TaqI. Penggunaan berbagai kombinasi primer dilakukan pada tahap amplifikasi selektif, setelah primer Vsp dilabel dengan radio isotop γ33P. Primerprimer pada tahap amplifikasi selektif memiliki dua basa tambahan, baik pada primer Vsp maupun primer Taq (Tabel 17). Fragmen cDNA hasil amplifikasi dengan masing-masing primer, baik yang berasal dari klon AVROS 2037 maupun PPN 2444 yang diinfeksi patogen serta kontrol dipisahkan secara bersamaan melalui proses elektroforesis pada gel poliakrilamid. Proses visualisasi fragmen cDNA dilaksanakan dengan cara mengekspos gel poliakrilamid tersebut pada film sinar X selama periode waktu tertentu.

Contoh visualisasi hasil amplifikasi

selektif dengan beberapa primer terdapat pada Gambar 23 dan 24. Beberapa fragmen memperlihatkan pola ekspresai berbeda, baik antar klon AVROS 2037 dan PPN 2444 maupun antar periode waktu pengambilan sampel daun pada masing-masing klon.

Sebagai contoh pada klon AVROS 2037,

fragmen 1 tidak terdapat pada waktu 0, 24 dan 36 jam setelah inokulasi, kemudian muncul setelah 48 dan 72 jam inokulasi, namun intensitas fragmen lebih tinggi pada 48 jam dibandingkan dengan 72 jam (Gambar 23). Fragmen yang sama pada klon PPN 2444 hanya terlihat pada waktu 36 jam setelah inokulasi. Ekspresi yang sangat kuat terdapat pada fragmen 2 (AVROS 2037) dan 3 (PPN 2444), namun dengan pola ekspresi berbeda antara periode waktu pengambilan sampel. Pada kedua klon tersebut fragmen tidak terdapat pada kontrol, namun pada klon AVROS 2037 ekspresi yang sangat kuat terjadi 24 jam setelah inokulasi dan meningkat terus sampai 72 jam setelah inokulasi. Pola yang agak be rbeda untuk

120 fragmen pada posisi yang sama ditemukan pada klon PPN 2444, dimana ekspresi yang sangat kuat terjadi 36 jam setelah inokulasi dan ekspresi menurun setelah itu. Pola ekspresi yang demikian juga ditemukan pada fragmen 10 dan 11. Kondisi sebaliknya terdapat pada fragmen 8 (AVROS 2037) dan 9 (PPN 2444). Ekspresi yang kuat dari fragmen tersebut pada klon AVROS 2037 terdapat pada waktu 36 jam setelah inokulasi dan kemudian ekspresi menurun, namun pada klon PPN 2444 ekspresi meningkat sampai 72 jam setelah inokulasi. Pola ekspresi yang hampir serupa ditemukan pada fragmen 6. Fragmen dengan pola ekspresi yang kuat pada kontrol dan kemudian ekspresinya menurun setelah diinokulasi dengan patogen ditemukan pada fragmen 20 dan 24 (AVROS 2037) (Gambar 24). Di samping itu juga diperoleh dua fragmen yaitu fragmen 25 dan 26 yang hanya terekspresi pada klon AVROS 2037 pada periode waktu 48 jam setelah inokulasi. Beberapa fragmen yang terekspresi sangat kuat memiliki pola ekspresi yang sama selama periode wa ktu setelah inokulasi, baik pada klon AVROS 2037 maupun PPN 2444.

Sebagai contoh

adalah fragmen 27 dan 28. Isolasi dan kloning fragmen asal transkrip (Transcripts-derived fragment = TDFs ). Dari seluruh fragmen yang diperoleh, sebanyak 35 fragmen (Tabel 18) menunjukkan pola ekspresi yang menarik, baik disebabkan pola ekspresi yang berbeda maupun ekspresi yang sangat kuat. Fragmen yang demikian diisolasi dari gel poliakrilamid dengan menggunakan film sinar X sebagai patronnya. Dari ke35 fragmen tersebut, 22 fragmen berasal dari klon resisten AVROS 2037 dan 13 fragmen dari klon rentan PPN 2444. Pada tahap awal, re-amplifikasi dilakukan terhadap fragmen-fragmen hasil amplifikasi menggunakan primer Vsp16/Taq21 dengan pertimbangan bahwa sebagian besar fragmen yang diperoleh berasal dari amplifikasi dengan primer tersebut. Ukuran fragmen cDNA telah dikonfirmasi dan diperoleh hasil bahwa fragmen hasil re-amplifikasi memiliki ukuran yang sesuai dengan ukuran fragmen hasil cDNA-AFLP yang diisolasi dari gel. Beberapa contoh fragmen hasil reamplifikasi dengan kombinasi primer Vsp16/Taq21 terdapat pada Gambar 25.

121 V16/T16 A

V16/T17 P

A

M1 2 3 45 12 3 4 5

V16/T19

P

12 345 12 345

A

V16/T20

P

1 2 3 4 51 2 3 4 5

A

P

1 2 3 4 5 12 3 4 5

1

4 6

7

8

5

2

9

3 10

11

Gambar 23. Pola transkrip klon karet resisten terhadap C. cassiicola (AVROS 2037, A) dan rentan (PPN 2444, P) berdasarkan analisis cDNAAFLP dengan 4 kombinasi primer (V16/T16, V16/T17, V16/T19, V16/T20). Setiap lajur adalah templat cDNA dari (1) daun sehat, (2) daun diinokulasi, 24 jam setelah inokulasi (jsi), (3) 36 jsi, (4) 38 jsi, dan (5) 72 jsi. Tanda panah adalah contoh fragmen yang menunjukkan ekspresi berbeda . Panah biru untuk klon AVROS 2037 dan merah untuk klon PPN 2444.

122

V16/T21 A P M

1 2 3 45 1 2 3 4

18 20 22

V16/T24 A P 12 3 4 5 123 4

19 21 23

24

25 26 27

28

29 31

30 32

33

34

Gambar 24. Pola transkrip klon karet resisten terhadap C. cassiicola (AVROS 2037, A) dan rentan (PPN 2444, P) berdasarkan analisis cDNAAFLP dengan 2 kombinasi primer (V16/T21, V16/T24). Setiap lajur adalah templat cDNA dari (1) daun sehat, (2) daun diinokulasi, 24 jam setelah inokulasi (jsi), (3) 36 jsi, (4) 38 jsi, dan (5) 72 jsi. Tanda panah adalah contoh fragmen yang menunjukkan ekspresi berbeda. Panah biru untuk klon AVROS 2037 dan merah untuk klon PPN 2444.

123 Tabel 18. Pola ekspresi dan ukuran fragmen cDNA pada gel poliakrilamid No

AVROS (A)/ PPN 2444 (P) A A A P A A A A A P A P A P A P A P A P A

Ukuran fragmen (pb)

Kombinasi Primer

Pola ekspresi fragmen

Ekspresi tinggi di 0 & 36 jsi*), ↓**) di 48 & 72 jsi Ekspresi tinggi di 48 jsi, ↓ di 72 jsi Ekspresi ↑***) di 24 jsi, > kuat di 48 & 72 jsi Ekspresi kuat di 36 jsi, ↓ di 48 jsi , hilang di 72 jsi Ekspresi hanya pada 0, A kuat darip ada P Ekspresi kuat di 0, > kuat 36 jsi, ↓ di 48 & 72 jsi Ekspresi ↑ dan kuat di 36 jsi, ↓ di 48 jsi Ekspresi kuat pada 48 jsi, hilang pada 72 jsi Ekspresi ↑ dan kuat di 36 jsi, ↓ di 48 & 72 jsi Ekspresi ↑ dan kuat di 36, 48, 72 jsi Ekspresi sangat kuat di 24, 48, 72 jsi Ekspresi ↑ di 36 jsi, ↓ di 48, hilang di 72 jsi Ekspresi hanya di 0, hilang di 24, 36, 48, 72 jsi Ekspresi di 0 & 36 jsi, hilang di 48 & 72 jsi Ekspresi tidak ada di 0, mulai di 24 jsi, ↑ di 72 jsi Ekspresi tidak ada di 0, kuat di 24, ↓ di 36 jsi Ekspresi ↑ di 24 jsi, ↓ di 48 dan 72 jsi Ekspresi tidak ada di 0, kuat di 24 jsi, kmd hilang Ekspresi ↑ di 24 jsi, ↓ di 36, 48, 72 jsi Ekspresi tidak ada di 0, kuat di 24 jsi, kmd hilang Ekspresi kuat di 0, ↓ di 24, 48, 72 jsi 21 P 280 Vsp16/Taq21 Ekspresi sama di 0, 24, 72 jsi 22 A 260 Vsp16/Taq21 Ekspresi di 0, ↓ di 24 & 48 jsi, ↑ di 72 jsi 23 P 260 Vsp16/Taq21 Ekspresi kuat di 0, hilang setelah itu 24 A 240 Vsp16/Taq21 Ekspresi di 0, secara bertahap ↓ 25 A 195 Vsp16/Taq21 Ekspresi hanya di 48 jsi 26 A 185 Vsp16/Taq21 Ekspresi hanya di 48 jsi 27 A 175 Vsp16/Taq21 Ekspresi kuat di 0 & 24, ↓ di 48, agak ↑ di 72 jsi 28 P 175 Vsp16/Taq21 Ekspresi tidak ada di 0, sangat kuat di 24 jsi 29 A 120 Vsp16/Taq21 Ekspresi sangat kuat di 0, selanjutnya ↓ 30 P 120 Vsp16/Taq21 Ekspresi sangat kuat di 0, selanjutnya hilang 31 A 115 Vsp16/Taq21 Ekspresi sangat kuat di 0 s.d 48 jsi, ↓ di 72 jsi 32 P 115 Vsp16/Taq21 Ekspresi ↑ mulai 24 s.d 72 jsi 33 A 90 Vsp16/Taq24 Ekspresi tidak ada di 0, mulai di 24, kemudian ↓ 34 P 90 Vsp16/Taq24 Ekspresi tidak ada di 0, mulai di 24, kemudian ↓ *) jsi = jam setelah inokulasi; **) ↓ = menurun; ***) ↑ = meningkat 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

280 200 90 90 155 140 145 150 145 145 85 85 145 145 105 110 280 280 290 290 280

Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq17 Vsp16/Taq17 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq20 Vsp16/Taq20 Vsp16/Taq20 Vsp16/Taq20 Vsp16/Taq21 Vsp16/Taq21 Vsp16/Taq21 Vsp16/Taq16 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq19 Vsp16/Taq21 Vsp16/Taq21 Vsp16/Taq21

Berdasarkan hasil tersebut di atas, selanjutnya re-amplifikasi dilakukan terhadap seluruh fragmen yang diperoleh melalui amplifikasi dengan kombinasi pasangan primer lainnya.

Seluruh fragmen hasil reamplifikasi (35 fragmen)

selanjutnya di klon untuk mem-fasilitasi proses sekuensing terhadap masingmasing fragmen. Dari hasil kloning setiap fragmen diambil 5 klon sehingga total klon adalah 175, dan ukurannya dikonfirmasi melalui elektroforesis yang

124 divisualisasikan pada gel agarose. Hasil PCR koloni untuk setiap sampel terdapat pada Gambar 26 dan 27. Sebagian fragmen yang berasal dari setiap 5 klon sesuai dengan perkiraan, yakni memiliki ukuran yang sama dan konsisten dengan ukuran pada gel akrilamid, namun sebagian lagi ternyata memiliki ukuran berbeda.

Diduga

adanya fragmen yang berbeda berasal dari fragmen ganda yang diperoleh sewaktu fragmen diisolasi dari gel. Berdasarkan hal tersebut maka sekuensing dilakukan terhadap seluruh klon sehingga jumlah total fragmen cDNA yang disekuen adalah 175 fragmen. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

bp

A

500 220

B 500 220

Gambar 25.

Hasil re-amplifikasi fragmen cDNA menggunakan primer yang sesuai untuk masing-masing fragmen (V16/T21). M adalah 1 kb DNA ladder. (A) 1 – 9, berturut-turut adalah fragmen no. 12, 13, 14, 18, 19, 21, 22, 23, kontrol negatif. (B) 1 – 9 , berturut-turut adalah fragmen no. 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, kontrol negatif.

Analisis s ekuen terhadap fragmen cDNA yang diisolasi Dari 175 klon yang disekuen, hanya 128 klon yang memiliki sekuen cDNA sisipan, sedangkan 47 klon yang lain hanya membawa vektor kosong atau vektor dengan beberapa tambahan sekuen basa saja.

Ke-128 sekuen setelah

dibersihkan dari kontaminan yang berasal dari sekuen vektor serta dikelompokkan

125

Gambar 26. Hasil PCR koloni 35 fragmen cDNA dengan primer SP6/T7, 5 sampel untuk setiap fragmen. M adalah marker DNA (1 Kb DNA Ladder). (A) Gel atas, berturut-turut setelah M adalah fragmen no. 0.1, 2.3, 0.2, 2.4, 0.3, 2.5, 0.4, 3.1, 0.5, 3.2, 1.1, 3.3, 1.2, 3.4, 1.3, 3.5, 1.4, 4.1, 1.5, 4.2, 2.1, 4.3, 2.2, 4.4, 4.5, 7.2, 5.1, 7.3, 5.2, 7.4, 5.3, 7.5, 5.4, 8.1, 5.5, 8.2, 6.1, 8.3, 6.2, 8.4, M, 17.1, 17.2, 17.3. Gel bawah, berturut-turut setelah M adalah fragmen no. 6.3, 8.5, 6.4, 9.1, 6.5, 9.2, 7.1, 9.3, 9.4, 11.2, 9.5, 11.3, 10.1, 11.4, 10.2, 11.5, 10.3, 12.1, 10.4, 12.2, 10.5, 12.3, 11.1, 12.4, 13.1, 12.5, 13.2, 14.1, 13.3, 14.2, 13.4, 14.3, 13.5, 14.4, 15.1, 14.5, 15.2, 16.1, 15.3, 16.2, 15.4, 16.3, 15.5, 16.4, 16.5

berdasarkan kemiripan sekuen menggunakan program Contig Ex press (Vector NTI Suite 6), diperoleh sebanyak 20 contigs serta 9 sekuen yang tidak mengelompok ke salah satu contig (Lampiran 1).

Di antara contig tersebut

terdapat satu contig yang hanya mengandung sekuen vektor, terdiri atas 13 fragmen. Oleh karena it u sekuen contig tersebut tidak dianalisis sehingga analisis lanjut dilakukan terhadap 19 contigs dan 9 sekuen. Jumlah anggota masing-masing contig bervariasi, mulai dari 2 sampai 15 TDF. Beberapa contig anggotanya bahkan memiliki sekuen yang persis sama, baik dari susunan maupun panjang nukleotida sehingga diyakini bahwa anggota contig tersebut sesungguhnya berasal dari fragmen yang sama. Hal ini dapat terjadi karena untuk setiap fragmen dari 35 fragmen yang diisolasi dari gel dan kemudian di-klon pada vektor kloning, diambil sebanyak 5 klon sehingga jumlah

126 fragmen yang disekuen adalah 175. Dengan demikian peluang untuk memperoleh fragmen dengan ukuran dan susunan nukleotida sama relatif tinggi.

Gambar 27.

Hasil PCR koloni 35 fragmen cDNA dengan primer SP6/T7, 5 sampel untuk setiap fragmen. M adalah marker DNA (1 Kb DNA Ladder). (A) Gel atas, berturut-turut setelah M adalah fragmen no. 18.1, 19.1, 18.2, 19.2, 18.3, 19.3, 18.4, 19.4, 18.5, 19.5, 30.1, 30.2, 32.1, 32.2, 34.1, 34.2, 20. 1, 21.1, 20.2, 21.2, 20.3, 21.3, 20.4, 21.4, 20.5, 21.5, 30.3, 30.4, 32.3, 32.4, 34.3, 34.4, 22.1, 23.1, 22.2, 23.2, 22.3, 23.3, 22.4, 23.4, 22.5, 23.5, 30.5, 32.5, 34.5, M. Gel bawah, berturut-turut setelah M adalah fragmen no. 24.1, 25.1, 24.2, 25.2, 24.3, 25.3, 24.4, 25.4, 24.5, 25.5, 31.1, 31.2, 33.1, 33.2, 26.1, 27.1, 26.2, 27.2, 26.3, 27.3, 26.4, 27.4, 26.5, 27.5, 31.3, 31.4, 33.3, 33.4, 28.1, 29.1, 28.2, 29.2, 28.3, 29.3, 28.4, 29.4, 28.5, 29.5, 31.5, 33.5, M.

Identifikasi homologi fragmen cDN A daun karet dengan produk gen yang telah diketahui fungsinya berdasarkan informasi yang terdapat di database GenBank (BLAST-X, Altschul et al. 1997), dilakukan terhadap 19 contig s dan 9 sekuen yang tidak mengelompok dalam contig. Dari analisis tersebut 10 contigs dan 5 sekuen memiliki homologi dengan sekuen gen di database sedangkan 9 contigs dan 4 sekuen lainnya tidak ada homologinya. Sebagian besar fragmen yang tidak memiliki homologi merupakan sekuen yang relatif pendek, terdiri antara 18 – 43 basa, namun beberapa memiliki sekuen yang cukup panjang,

127 seperti contig 11 dngan ukuran 113 bp. Ringkasan daftar TDF serta kemiripannya dengan produk gen organisme lain yang telah diidentifikasi sebelumnya terdapat pada Tabel 19, sedangkan daftar lengkap kemiripannya terdapat pada Lampiran 2.

Tabel 19. Analisis sekuen TDF yang diperoleh melalui analisis cDNA-AFLP dari daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444 No

TDF

Ukuran (pb)

1

Contig 1

108

2

Contig 2

270

3

Contig 5

259

4

Contig 8

153

5

Contig 12

251

6

Contig 13

115

7

Contig 14

145

8

Contig 15

86

9 10 11

Contig 18 Contig 19 aflp-14.5

231 251 55

12

aflp-20.5

235

13

aflp-22.3

236

14

aflp-26.3

163

15

aflp-26.4

161

Kemiripan

Nilai E

putative Ran binding protein 11-like [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] protein transporter [Arabidopsis thaliana] hypothetical protein [Oryza sativa (japonica cultivargroup)] COG3391: Uncharacterized conserved protein [Escherichia coli F11] Transcriptional Regulator, MarR family [Pseudomonas fluorescens PfO-1] arginase 2 [Lycopersicon esculentum] arginase [Brassica napus] putative arginase [Arabidopsis thaliana] agmatinase/ catalytic [Arabidopsis thaliana] arginase [Glycine max] GTP-binding-like protein [Arabidopsis thaliana] putative GTP-binding protein DRG [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] hypothetical protein PP2606 [Pseudomonas putida KT2440] selenium-binding protein -like [Arabidopsis thaliana] ornithine carbamoyltransferase [Canavalia lineata] putative pyocin S2 (partial) [Yersinia pseudotuberculosis IP 32953] heat shock protein-like protein [Cucumis melo] heat shock protein-like protein [Cucumis melo] nicotinate-nucleotide adenyltransferase [Leifsonia xyli subsp. xyli conserved hypothetical protein [Pseudomonas fluorescens PfO-1] transcriptional regulator, putative [Pseudomonas fluorescens Pf-5] Unknown protein [Arabidopsis thaliana] Sugar transferases involved in lipopolysaccharide synthesis [Pseudomonas aeruginosa C3719] conserved hypothetical protein [Pseudomonas fluorescens Pf-5] Aconitate hydratase-like [Pseudomonas fluorescens PfO -1] putative aconitase [Prunus avium] aconitase [Lycopersicon pennellii] cytosolic aconitase [Nicotiana tabacum] putative Aconitate hydratase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]

8e-05 1e-04 0.69 2e-10 8e-18 1e-06 2e-06 5e-06 5e-06 2e-05 5e-14 6e-13 2e-13 4.4 9.7 4e-05 1e-10 3e-08 0.044 3e-16 7e-14 0.70 6e-32 1e-23 1e-24 2e-12 4e-12 4e-12 4e-12

128 Sepuluh contigs dan lima sekuen memiliki homologi dengan produk gen yang telah dikenal yang terdapat di database GenBank, seperti putative Ran binding protein , protein transporter, regulator transkripsi, arginase, GTP-binding protein, heat shock protein (HSP), sugar transferase dan aconitase. Beberapa di antara protein tersebut dikenal sebagai protein membran, seperti protein transporter, GTP-binding protein dan sugar transferase.

Protein transporter

terdapat pada contig 1 berasal dari TDF 4 (Tabel 18, Gambar 23), GTP-binding protein pada contig 13 berasal dari TDF 12 dan 13, sedangkan sugar transferase berasal dari TDF 22 (Tabel 18, Gambar 24). TDF yang memiliki kemiripan dengan arginase yang berasal dari tanaman Lycopersicon esculentum, Brassica napus, Arabidopsis thaliana dan Glycine max terdapat pada contig 12, yang berasal dari fragmen 16 dan 17. Fragmen dari dua contig lainnya, yakni contig 18 dan 19 memiliki homologi dengan protein yang menyerupai heat shock protein (HSP) dari tanaman Cucumis melo .

HSP

merupakan kelompok protein yang ekspresinya diinduksi dalam kondisi sel terpapar panas atau adanya cekaman lingkungan, seperti infeksi atau toksin. Contig 18 dan 19 terdiri atas fragmen 21, 22 dan 23 (Gambar 24). Fragmen 26 (Gambar 24) yang hanya terekspresi pada klon AVROS 2037, yakni 48 jam setelah daun diinokulasi dengan patogen memiliki homologi yang tinggi dengan aconitase, baik yang berasal dari Pseudomonas fluorescens maupun dari tanaman Prunus avium, Lycopersicon pennlellii, Nicotiana tabacum dan Oryza sativa (Tabel 18). Beberapa transkrip yang diperoleh diduga ikut berperan dalam mekanisme pertahanan tanaman karet sehingga merupakan kandidat transkrip yang berasosiasi dengan resistensi klon karet terhadap infeksi C. cassiicola .

PEMBAHASAN Dari berbagai penelitian sebelumnya pada interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola telah diketahui bahwa patogen tersebut mensekresikan suatu toksin yang disebut cassiicoline (Breton et al. 1996; Breton et al. 2000; Liyanage dan Liyanage 1986; Ones irosan et al. 1975; Purwantara 1987; Suwarto 1989). Di

129 samping itu juga telah diketahui bahwa toksin yang dihasilkan merupakan agen kompatibilitas dan bersifat spesifik, hanya merusak klon karet yang rentan. Penelitian lainnya menyebutkan bahwa sistem pertahanan tanaman secara pasif yang melibatkan lapisan permukaan daun dapat diatasi oleh patogen, baik pada klon resisten maupun klon rentan, sedangkan kitinase, glukanase dan skopoletin yang merupakan salah satu fitoaleksin pada tanaman karet, akumulasinya tidak berbeda antara klon resisten dan klon rentan yang diinfeksi patogen (Breton et al. 1996; Breton et al. 2000). Sejauh ini pengetahuan lainnya tentang resistensi klon pada tahap molekul masih sangat terbatas. Oleh karena itu dalam penelitian ini dicoba untuk mengidentifikasi transkrip/gen atau bagian gen yang diekspresikan secara diferensial pada klon karet resisten dan rentan pada saat tanaman diinfeksi oleh C. cassiicola . Transkrip tersebut diduga merupakan kandidat yang berperan dalam mekanisme pertahanan tanaman karet terhadap infeksi C. cassiicola. Untuk tujuan tersebut diaplikasikan metode cDNA-AFLP (Bachem et al. 1996), yang memerlukan tahap penyediaan RNA dan cDNA dalam aplikasinya. Metode ekstraksi RNA yang efisien serta dapat menghasilkan RNA dari daun tanaman karet dengan kualitas baik merupakan tahap awal dalam keberhasilan analisis cDNA-AFLP.

Padahal preparasi RNA dengan kualitas

tinggi yang berasal dari daun tanaman berkayu seperti tanaman karet, sering merupakan tahapan yang sulit disebabkan oleh tingginya kandungan senyawa fenol, karbohidrat dan komponen lainnya yang sering terikat dan terendapkan bersama dengan RNA. Oleh karena itu dalam penelitian ini dibandingkan tiga cara untuk mempersiapkan RNA dan cDNA dari sampel daun karet. Metode Pawlowski et al. (1994) mengkombinasikan penggunaan CTAB sebagai deterjen dengan kloroform di dalam tahap ekstraksinya, sedangkan metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993) menggunakan SDS sebagai deterjen. Aplikasi kedua metode tersebut untuk mengisolasi RNA dari daun tanaman karet memberikan hasil yang kurang konsisten karena RNA tidak selalu dapat diperoleh dengan kualitas dan kuantitas yang baik.

Sintesis cDNA

menggunakan RNA yang dipersiapkan dengan cara di atas menghasilkan cDNA dengan konsentrasi yang bervariasi antar sampel (Gambar 22 A). Meskipun setelah itu konsentrasi setiap sampel diupayakan sama melalui proses

130 pengenceran untuk sampel yang memiliki konsentrasi lebih tinggi, namun cDNA hasil preamplifikasi tetap terlihat bervariasi.

Kondisi yang demikian kurang

menguntungkan karena relatif sulit untuk menterjemahkan hasil cDNA-AFLP. Rendahnya kualitas RNA diperkirakan sebagai akibat banyaknya tahapan yang harus dilalui selama proses isolasi. Padahal setiap tahap memiliki resiko penurunan kuantitas maupun kualitas RNA. Di samping itu kelemahan lain yang perlu dipertimbangkan adalah lamanya waktu yang diperlukan untuk mengisolasi RNA dengan menggunakan kedua prosedur isolasi tersebut di atas. Penggunaan kit Plant RNA Reagent untuk isolasi RNA dapat mempersingkat waktu secara signifikan dan RNA yang diperoleh umumnya memiliki kualitas dan kuantitas yang baik. Namun konsentrasi RNA antar sampel masih tetap bervariasi sehingga cDNA yang dihasilkan juga masih terlihat bervariasi (Gambar 22 B).

Penerapan

prosedur

mRNA

Capture

Kit

menghasilkan cDNA dengan konsentrasi relatif seragam pada berbagai sampel yang berbeda (Gambar 22 C). Kelebihan metode mRNA Capture Kit di samping mudah, cepat dan efisien, hanya memerlukan sedikit sampel daun, yaitu sekitar 20 mg jaringan dalam bentuk serbuk atau 5 µg dalam bentuk RNA. Kelebihan metode tersebut adalah penggunaan tabung yang dilapisi dengan streptavidin. Karena hibridisasi dilakukan dengan primer oligo(dT)20 yang dilabel biotin maka mRNA dapat langsung terikat ke dinding tabung sehingga terpisah dari komponen lain seperti ribosomal RNA, transfer RNA maupun kontaminan lainnya. Dengan demikian mRNA dapat diperoleh dengan kualitas dan kuantitas relatif seragam sehingga cDNA yang disintesis juga lebih seragam. Prosedur dengan mRNA Capture Kit memberikan hasil yang lebih konsisten antar sampel. Hal ini merupakan tahap awal yang sangat penting karena akan menentukan keberhasilan dalam analisis cDNA-AFLP untuk studi ekspresi gen pada tanaman tersebut. Keunggulan lain penggunaan mRNA Capture Kit adalah dapat dikombinasikan langsung dengan tahap awal proses cDNA-AFLP. Hal ini telah diinformasikan melalui studi ekspresi gen pada ovul tanaman tomat yang diberi perlakuan gibberellic acid (GA3) serta gen-gen yang diekspresikan pada tahap perkembangan ovul tersebut (Feron et al. 2004).

Preamplifikasi

cDNA memberikan hasil yang sebanding pada sampel yang berasal dari berbagai

131 jaringan dan perlakuan, sedangkan pola ekspresi gen setelah dilakukan amplifikasi selektif dapat dibedakan dan hasil tersebut dibuktikan dapat berulang (reproducible ). Hasil dari ke-tiga metode di atas telah memberikan dasar dalam penyiapan sampel RNA dan cDNA untuk analisis cDNA-AFLP tanaman karet. Analisis cDNA -AFLP awalnya dikembangkan untuk mempelajari gen-gen yang diekspresikan secara diferensial selama pembentukan tuber tanaman kentang (Bachem et al. 1996). Belakangan metode cDNA-AFLP yang didasarkan pada amplifikasi PCR, menjadi semakin populer untuk mengidentifikasi gen-gen baru karena tidak diperlukan pengetahuan tentang sekuen genom target terlebih dahulu. Di samping itu kelebihan lainnya adalah gen-gen yang terinduksi atau tertekan ekspresinya dapat diketahui dalam suatu percobaan yang sama. Sejauh ini metode cDNA-AFLP telah diterapkan untuk mempelajari profil gen pada organisme prokariot (Dellagi et al. 2000) maupun pada interaksi berbagai patogen dan tanaman (Durrant et al. 2000; Santaella et al. 2004; Van der Biezen et al. 2000). Dalam

penelitian

ini

metode

cDNA-AFLP

diaplikasikan

untuk

mengidentifikasi profil transkrip cDNA yang berasal dari daun tanaman karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444 pada beberapa selang waktu setelah daun diinfeksi dengan konidia C. cassiicola.

Ke-dua klon tersebut memiliki tingkat

resistensi yang sangat jauh berbeda terhadap infeksi C. cassiicola dimana klon AVROS 2037 adalah resisten sedangkan klon PPN 2444 sangat rentan. Pengamatan terhadap pola ekspresi produk cDNA -AFLP menunjukkan bahwa beberapa fragmen terlihat memberikan pola ekspresi yang berbeda, baik dalam hal intensitas maupun ukurannya .

Perbedaan tersebut terdapat antara

sampel yang berasal dari 0, 24, 36, 48 dan 72 jam setelah daun diinokulasi dengan C. cassiicola pada masing-masing klon serta antara klon AVROS 2037 dan PPN 2444 itu sendiri. Beberapa fragmen terlihat sangat tinggi intensitasnya yang menggambarkan tingginya ekspresi dari transkrip tersebut (Gambar 23 dan 24) sedangkan beberapa fragmen lain hanya diekspresikan pada klon AVROS 2037 atau klon PPN 2444 saja. Berdasarkan profil cDNA-AFLP yang dihasilkan, diperoleh gambaran bahwa kombinasi primer dengan dua tambahan basa selektif sesuai untuk analisis

132 cDNA-AFLP asal daun karet. Hal ini ditunjukkan oleh jumlah fragmen yang diper oleh per kombinasi primer yaitu rata-rata sekitar 50 fragmen. Perbedaan ekspresi beberapa transkrip pada klon AVROS 2037 dan PPN 2444 dapat dideteksi selama terjadi interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola. Sebanyak 35 fragmen (TDF) diseleksi, baik yang terekspresi pada klon resisten AVROS 2037 maupun klon rentan PPN 2444, namun jumlah TDF asal klon resisten lebih banyak (21 fragmen) dibandingkan dengan TDF asal klon rentan (14 fragmen). Keseluruhan fragmen yang diseleksi adalah 35 fragmen, yang kemudian diklon dan disekuen urutan nukleotidanya. Berdasarkan deduksi kemiripan sekuen asam amino, diperoleh beberapa sekuen TDF yang memiliki homologi tinggi dengan protein yang memiliki fungsi berbeda. Di antaranya adalah protein yang terdapat pada membran sel, seperti protein transporter, GTP-binding protein, Ran binding protein dan sugar transferase.

Protein yang terdapat pada membran diketahui banyak berperan

dalam persepsi sinyal sehingga perubahan yang terjadi di lingkungan sel segera dapat dideteksi.

Dalam interaksi inang-patogen, kemampuan sel untuk

mendeteksi secara cepat perubahan kondisi yang tidak menguntungkan di lingkungannya, termasuk adanya infeksi oleh patogen tertentu, merupakan salah satu hal yang membedakan respon tanaman resisten dan tanaman rentan. Beberapa TDF juga memiliki homologi dengan arginase dan heat shock protein (HSP).

Arginase berperan dalam hidrolisis arginin menjadi urea dan

ornitin. Urea kemudian akan diubah menjadi CO2 dan amonium oleh enzim urease, sedangkan ornitin merupakan prekursor dalam biosintesis poliamin, prolin dan glutamat. Di dalam sel, arginin oleh enzim nitric-oxyde synthase (NOS) juga diubah menjadi nitric oxide (NO). NO diperlukan dalam pembentukan cGMP (cyclic guanylate cyclase) yang berperan dalam sinyal transduksi dan pengaturan ion channel (Durner et al. 1998). Disebabkan arginase dan NOS berkompetisi untuk penggunaan substrat yang sama, maka peningkatan ekspresi arginase dapat secara efektif mengurangi aktivitas NOS sehingga produksi NO berkurang. Apabila sistem pertahanan inang diperantarai oleh NO yang umumnya berperan sebagai molekul sinyal untuk mengaktifkan mekanisme pertahanan, maka kekurangan NO berdampak pada menurunnya kemampuan inang untuk bertahan.

133 NO diperlukan sepenuhnya untuk mengaktivasi ketahanan tanaman terhadap penyakit dan untuk memprogram kematian sel yang diperlukan dalam sistem pertahanan tanaman seperti dilaporkan pada tanaman Arabidopsis dan kedelai (Delledonne et al. 1998). Umumnya arginase tanaman selama ini diketahui lebih banyak berperan dalam tahap perkembangan biji (Goldraij dan Polacco 1999). Namun, belakangan Chen et al. (2004) melaporkan bahwa pada daun, ekspresi gen LeARG2 penyandi arginase pada tanaman tomat ternyata juga meningkat tajam oleh adanya pengaruh pelukaan dan toksin koronatin yang disekresikan oleh bakteri patogen Pseudomonas syringae. Pelukaan maupun toksin tersebut mengaktifkan sinyal cekaman pada tanaman inang berupa akumulasi jasmonic acid (JA). Telah lama diketahui bahwa akumulasi JA sebagai respon terhadap pelukaan pada tanaman akan segera mengaktifkan ekspresi sejumlah gen yang responsif terhadap pelukaan tersebut (Creelman dan Mullet 1997). HSP termasuk dalam kategori protein yang berperan dalam mekanisme pertahanan dan telah diidentifikasi keberadaannya dalam interaksi antara beberapa tanaman dengan patogennya, seperti antara cassava dengan Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Santaella et al. 2004) dan Arabidopsis thaliana dengan Peronospora parasitica (Van der Biezen et al. 2000). HSP merupakan kelompok protein yang akan terakumulasi dalam jumlah tinggi apabila sel terpapar pada temperatur yang meningkat. Namun, produksi HSP dalam jumlah tinggi juga dapat dipicu oleh berbagai macam cekaman lingkungan, seperti adanya infeksi ataupun toksin.

HSP merupakan molekul chaperones bagi protein, umumnya

merupakan protein sitoplasma dan memainkan peran penting dalam interaksi protein-protein seperti dalam pelipatan untuk menjaga konformasi serta mencegah agregasi dengan protein yang tidak diinginkan. Di samping arginase dan HSP, dalam penelitian ini juga diperoleh transkrip yang memiliki homologi tinggi dengan enzim aconitase , baik yang berasal dari bakteri Pseudomonas fluorescens maupun tanaman Prunus avium, Lycopersicon pennellii, Nicotiana tabacum, dan Oryza sativa. Aconitase dikenal sebagai salah satu enzim yang ekspresinya diregulasi oleh NO dan merupakan enzim yang mengandung iron-sulfur (4Fe-4S), mengkatalis isomerisasi sitrat

134 menjadi isositrat. Gen penyandi aconitase yang berasal dari tembakau (Nicotiana tabacum), yaitu NtACO1 telah diklon (Navarre et al. 2000). NtACO1 berpotensi meningkatkan level iron bebas sebagai respon terhadap NO.

Dalam kondisi

adanya NO yang merupakan salah sa tu reactive oxygen species (ROS), peningkatan level iron bebas mengakibatkan peningkatan kerusakan oksidatif yang diduga berperan dalam reaksi hipersensitif (HR) serta kematian patogen. Adanya kemiripan beberapa TDF asal daun karet dengan enzim atau protein yang telah dikenal berperan dalam mekanisme pertahanan pada tanaman lain menimbulkan dugaan bahwa TDF tersebut juga ikut berperan dalam mekanisme resistensi klon karet terhadap infeksi C. cassiicola .

KESIMPULAN Melalui penelitian ini metode isolasi RNA dan sintesis cDNA untuk analisis cDNA-AFLP pada tanaman karet telah dimantapkan. Dengan demikian studi ekspresi gen pada tanaman karet diharapkan dapat dilakukan dengan lebih cepat dan efisien. Metode

cDNA-AFLP

juga

telah

berhasil

digunakan

untuk

mengidentifikasi dan mengisolasi transkrip yang diekspresikan secara diferensial pada daun klon karet resiten AVROS 2037 dan klon rentan PPN 2444 yang diinfeksi dengan cendawan patogen C. cassiicola. Sebanyak 35 fragmen asal transkrip (TDF) telah diisolasi, diklon, dan disekuen.

Pengelompokan

berdasarkan homologi sekuennya menghasilkan 19 contigs dan 9 macam sekuen yang tidak dapat dikelompokkan dalam contig yang sama. Beberapa contig dan sekuen terlalu pendek, terdiri atas beberapa nukleotida saja. Sebanyak 10 contigs dan 5 sekuen memiliki homologi dengan produk gen yang telah dikenal yang terdapat di data base gene bank, seperti putative Ran binding protein , protein transporter, regulator transkripsi yang berasal dari beberapa organisme, serta arginase, GTP-binding protein, heat shock protein (HSP) dan aconitase yang berasal dari beberapa spesies tanaman. Beberapa di antaranya seperti arginase, HSP dan aconitase serta protein membran diduga ikut berperan dalam respon pertahanan tanaman karet terhada p infeksi C. cassiicola .

BAB 7

PEMBAHASAN UMUM

Pemahaman tentang mekanisme molekuler yang mengontrol resistensi tanaman terhadap infeksi patogen merupakan salah satu syarat penting untuk menanggulangi serangan patogen secara efektif dan efisien. Pada tanaman karet, cendawan pa togen C. cassiicola penyebab penyakit gugur daun karet telah dikenal cukup lama dan diketahui dapat menimbulkan kerugian yang sangat nyata pada pertanaman karet komersil di berbagai negara produsen karet alam (Jayasinghe dan Silva 1996; Sinulingga et al. 1996; Shukor dan Hidir 1996). Pengamatan terhadap tanaman di lapang maupun di rumah kaca menunjukkan bahwa klon karet yang ada saat ini memiliki tingkat resistensi yang berbeda terhadap infeksi C. cassiicola , mulai dari sangat resisten sampai sangat rentan. Perbedaan tingkat resistensi klon tersebut tidak dapat dijelaskan melalui mekanisme pertahanan struktural karena dalam hal ini tidak terdapat perbedaan nyata antara klon resisten dan klon rentan. Nampaknya interaksi antara tanaman karet dengan C. cassiicola terjadi melalui mekanisme yang lebih spesifik dan relatif komplek pada tahap molekul serta dikontrol secara genetik. Ketersediaan klon karet resisten merupakan koleksi yang sangat berharga dan dapat digunakan sebagai material dasar untuk pengembangan bahan tanam secara luas guna mengatasi serangan patogen.

Namun hal ini tetap

mengkhawatirkan karena adanya kecenderungan kemampuan patogen untuk mematahkan resistensi tanaman. Fenomena tersebut ditemukan pada klon GT 1 dan RRIM 600 yang di masa lalu merupakan klon unggulan yang cukup populer sehingga ditanam di berbagai perkebunan karet di Indonesia. Namun survei yang dilakukan tahun 1999 – 2000 menunjukkan bahwa di sembilan sentra perkebunan karet yang tersebar di Sumatera, Jawa dan Kalimantan penampilan kedua klon tersebut akibat infeksi patogen mulai memburuk dan penurunan produksi dapat mencapai 40% (Situmorang 2002). Dengan demikian diperlukan pengetahuan tentang landasan mekanisme molekuler interaksi inang-patogen sehingga dapat digunakan dalam penyusunan strategi penanggulangan penyakit di masa depan.

136 Sampai sejauh ini disadari bahwa sangat sedikit informasi yang tersedia tentang mekanisme molekuler yang menyebabkan klon karet tertentu resisten terhadap infeksi C. cassiicola . Oleh karena itu pengungkapan kandidat gen yang berhubungan dengan sistem pertahanan tanaman karet terhadap patogen ter kait merupakan salah satu jalan yang dapat ditempuh untuk memahaminya. Dalam hal ini, pemilihan klon, teknik inokulasi dan periode waktu setelah inokulasi patogen untuk

pengambilan

sampel

daun

merupakan

hal

penting

yang

harus

dipertimbangkan. Klon karet AVROS 2037 memiliki resistensi tinggi terhadap berbagai isolat C. cassiicola sedangkan klon PPN 2444 sangat rentan, baik di lapang maupun pada pengujian di rumah kaca secara terkontrol (Bab 2; Hadi 2003; Situmorang 2002; Soepena et al. 1996). Sedangkan teknik inokulasi patogen melalui inokulasi konidia pada permukaan bawah daun merupakan teknik yang sesuai untuk me ngetahui tingkat resistensi klon karet karena sejalan dengan proses infeksi patogen secara alami di lapang (Situmorang 2002). Dalam hal ini dapat diketahui sekaligus lamanya waktu yang diperlukan sampai terlihat gejala awal pada daun karet. Penampakan gejala awal berupa bercak coklat yang tidak meluas pada klon resisten dan bercak yang meluas sehingga akhirnya daun mengalami nekrosis dan menggulung pada klon rentan, mulai terlihat secara visual sekitar 2 hari setelah proses inokulasi. Oleh karena itu pengambilan sampel sebagai sumber RNA dib atasi pada beberapa periode waktu, mulai dari 24 sampai 72 jam setalah inokulasi, dengan asumsi bahwa dalam rentang waktu tersebut telah terjadi respon pada tanaman. Pengelompokan klon karet berdasarkan marka AFLP menunjukkan bahwa klon resisten memisah menjadi dua, yaitu empat klon dengan kemiripan genetik 88,0% (AVROS 2037, PR 255, BPM 1, IRR 100) dan satu klon (RRIC 100) dengan kemiripan genetik 85,5%. Ke-empat klon dengan kemiripan genetik sama diduga membawa marka AFLP yang sama sehingga berpeluang besar memiliki gen pengendali ketahanan yang juga sama terhadap C. cassiicola . Kekecualian ditemukan pada klon RRIC 100. Klon tersebut memiliki resistensi di lapang tetapi memperlihatkan kemiripan genetik yang lebih rendah dengan ke -empat klon resisten lainnya. Diduga klon RRIC 100 membawa marka atau gen pengendali

137 resistensi yang berbeda dengan ke -empat klon resisten yang lain. Secara umum terdapat konsistensi antara hasil pengujian menggunakan marka AFLP dengan hasil pengujian in vivo di rumah kaca. Marka genetik berbeda untuk resistensi terhadap C. cassiicola yang dimiliki oleh klon RRIC 100 diduga berhubungan erat dengan lingkungan tumbuh tetuanya. Klon RRIC 100 merupakan hasil persilangan antara tetua jantan RRIC 52 yang dikembangkan di Sri Lanka dan tetua betina PB 86 yang dikembangkan di Malaysia .

Sementara itu, ke -empat klon resisten lain merupakan hasil

persilangan tetua jantan dan betina yang dikembangkan di Indonesia. Sebagai contoh klon AVROS 2037 dan BPM 1 berasal dari beberapa klon AVROS seri sebelumnya yang dikembangkan di wilayah Sumatera Utara dan klon PR 255 berasal dari persilangan Tjir 1 dan PR 107 yang dikembangkan di wilayah Jawa Barat. Perbedaan lingkungan tumbuh dari tetua dapat menimbulkan perbedaan adaptasi klon-klon yang diuji terhadap berbagai isolat C. cassiicola yang terdapat di lingkungan tersebut. Berdasarkan hasil yang diperoleh dalam penelitian ini kuat dugaan bahwa sifat resistensi terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh lebih dari satu gen. Hal ini sejalan dengan beberapa hasil penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa sifat ketahanan tanaman karet terhadap C. cassiicola dikendalikan oleh dua pasang gen utama (Hadi 2003) atau pendapat lain yang mengemukakan bahwa sifat ketahanan kemungkinan dikendalikan secara poligenik (Tan dan Tan 1996). Untuk mengidentifikasi gen atau bagian gen yang secara langsung maupun tidak langsung terlibat di dalam mekanisme molekuler resistensi tanaman melawan patogen, diperlukan pembandingan pola ekspresi transkrip atau gen dalam kondisi tanaman diinfeksi patogen dan tanpa infeksi, baik pada klon resisten maupun klon rentan. Berbagai metode tersedia untuk tujuan tersebut, antara lain DDRT-PCR (Liang dan Pardee 1992), subtractive hybridization (Hara et al. 1991), serial analysis of gene expression (SAGE) (Velculescu et al. 1995), microarray (Schena et al. 1995), serta cDNA amplified length polymorphism (cDNA-AFLP) (Bachem et al. 1996). Di antara teknik tersebut di atas, cDNAAFLP merupakan teknik yang cukup efisien karena didasarkan pada amplifikasi menggunakan PCR serta dalam satu percobaan yang sama langsung dapat

138 dideteksi transkrip yang diindukasi atau ditekan ekspresinya sebagai respon terhadap kondisi tertentu.

Oleh karena itu teknik cDNA-AFLP dipilih untuk

digunakan dalam mengidentifikasi transkrip yang memiliki pola ekspresi berbeda pada suatu kinetik waktu setelah inokulasi patogen, baik pada klon resisten AVROS 2037 maupun klon rentan PPN 2444. Aplikasi teknik cDNA-AFLP (Bachem et al. 1996) yang dikembangkan berdasarkan teknik AFLP genomik (Vos et al. 1995), pada cDNA asal daun karet ternyata mengalami banyak hambatan. Hal ini berbeda dengan aplikasinya pada DNA genomik asal daun karet yang digunakan dalam rangkaian penelitian ini untuk mengetahui kemiripan genetik antara klon karet yang diuji. Modifikasi dalam proses visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi dengan primer AFLP selektif melalui pewarnaan dengan perak nitrat serta reduksi ukuran gel telah memberikan hasil yang baik pada analisis AFLP yang berasal dari DNA daun karet. Fragmen-fragmen DNA dapat terpisah dengan baik pada gel poliakrilamid sehingga metode tersebut dapat diaplikasikan.

Sedangkan optimasi analisis

cDNA-AFLP melalui perbaikan pada prosedur penyiapan sampel cDNA serta penggunaan enzim restriksi dan primer selektif yang sesuai be lum memberikan hasil yang baik, terutama dalam visualisasi produk cDNA-AFLP. Masalah utama dalam aplikasi teknik cDNA-AFLP adalah mendapatkan RNA dengan kualitas baik dan seragam. Hal ini penting karena pembandingan pola ekspresi dilakukan antar sampel. Sehubungan dengan hal tersebut maka beberapa metode isolasi RNA telah diuji untuk mendapatkan kondisi yang paling sesuai. Pada prinsipnya setiap metode isolasi RNA ditujukan untuk memecahkan dinding sel, menghambat degradasi RNA dengan cara menghambat aktivitas RNAase serta memisahkan RNA dari kontaminan seperti DNA, protein dan polisakarida (Strommer et al. 1993). Pemecahan dinding sel umumnya dilakukan dengan cara menghaluskan organ tanaman yang digunakan sebagai sumber RNA di dalam nitrogen cair. Bahan tanaman yang telah halus (menyerupai serbuk) kemudian dilarutkan dalam bufer ekstrak yang mengandung deterjen seperti SDS, CTAB atau sarkosil. Deterjen selain berfungsi untuk merusak membran sel juga berfungsi menghambat aktivitas ribonuklease. Beberapa metode menambahkan β-merkaptoetanol pada tahap ekstraksi tersebut, untuk membatasi pencoklatan

139 oleh senyawa fenolik dan juga untuk merusak ikatan disulfida yang terdapat pada molekul ribonuklease. Untuk memisahkan RNA dari komponen lain, umumnya dilakukan melalui ekstraksi phenol, sentrifugasi dan pengendapan, atau kombinasi dari ketiganya. Isolasi RNA berdasarkan metode Pawlowski et al. (1994) pada prinsipnya menggunakan SDS sebagai deterjen dalam bufer ekstrak dan LiCl untuk memisahkan RNA dengan DNA. Aplikasi metode tersebut untuk mengisolasi RNA dari daun karet dilakukan dengan beberapa modifikasi, seperti penambahan β-merkaptoetanol serta penggunaan kondisi dingin dalam proses ekstraksi. Sedangkan metode Taylor dan Powel (dalam Speirs dan Longhurst, 1993) yang diaplikasikan sedikit berbeda, yaitu menggunakan CTAB dalam bufer ekstrak sehingga proses ekstraksi dilakukan dalam kondisi suhu 650 C. Hasil yang kurang stabil dengan penerapan kedua metode tersebut yang ditunjukkan oleh tingginya variasi dalam kualitas maupun kuantitas RNA antar sampel, diduga disebabkan oleh panjangnya proses isolasi sehingga memerlukan waktu yang cukup lama . Pada setiap tahapan terdapat resiko menurunnya kualitas dan kuantitas RNA. Isolasi RNA dengan kit Plant RNA Reagent (Invitrogen) dapat mempersingkat waktu pelaksanaan, namun masih terdapat variasi RNA antar sampel.

Variasi tersebut berdampak pada kualitas cDNA yang dapat diamati

setelah proses preamplifikasi.

Penggunaan mRNA Capture Kit (Roche) yang

merupakan metode satu tabung (one tube method) memiliki kelebihan karena proses isolasi RNA tidak diperlukan. Dalam hal ini mRNA dipisahkan dengan cara yang lebih efisien. Pada tahap awal poli(A) mRNA yang terdapat dalam campuran larutan yang masih mengandung RNA lain seperti ribosomal RNA dan transfer RNA serta DNA, dihibridisasikan dengan oligo(dT) 20 yang dilabel biotin kemudian ditrasfer ke tabung mikro yang dindingnya dilapisi dengan streptavidin (streptavidin-coated PCR tube).

Karena mRNA memiliki molekul biotin yang

diperoleh dari oligo(dT) maka hanya mRNA yang akan terikat ke dinding tabung sedangkan RNA lain dan DNA tetap terdapat dalam larutan sehingga dengan mudah dapat dipisahkan dari mRNA. Metode satu ta bung pada awalnya didisain untuk pelaksanaan RT-PCR dimana proses sintesis cDNA utas pertama dan transkripsi balik dilakukan pada

140 tabung yang sama (Instruction manual mRNA Capture Kit). Metode tersebut oleh Feron et al. (2004) dikembangkan untuk digunakan dalam proses cDNA-AFLP. Pemisahan mRNA, sintesis cDNA utas pertama dan kedua, restriksi cDNA dengan enzim restriksi pertama dan kedua dilakukan dalam tabung yang sama. Dengan

menggunakan

berbagai

sampel

dengan

perlakuan

dan

tahap

perkembangan berbeda dibuktikan bahwa cDNA setelah proses preampilfikasi memiliki kuantitas dan kualitas yang seragam. Produk preamplifikasi tersebut memberikan pola ekspresi berbagai transkrip yang dapat dibedakan secara diskrit pada gel poliakrilmid dan bersifat reproducible . Hasil yang sebanding dalam penelitian ini diperoleh pada proses preamplifikasi dengan mengaplikasikan mRNA Capture Kit pada cDNA asal daun karet klon AVROS 2037 dan PPN 2444. Dengan menggunakan produk preamplifikasi tersebut, pola ekspresi berbagai transkrip asal cDNA daun karet yang diperoleh melalui amplifikasi selektif dengan dua basa tambahan pada primer Vsp dan primer Taq memberikan hasil yang memuaskan. Perubahan pola transkrip selama beberapa waktu setelah terjadi interaksi antara tanaman kare t dengan patogen C. cassiicola dapat dideteksi.

Perubahan pola tersebut bisa berupa peningkatan atau penurunan

ekspresi sepanjang waktu pengamatan pada masing-masing klon resisten AVROS 2037 atau klon rentan PPN 2444, bisa juga berupa perbedaan pola ekspresi pada kedua klon tersebut. Meskipun pengamatan lebih difokuskan pada transkrip yang terinduksi pada klon resisten, namun perubahan ekspresi pada klon rentan tetap menarik perhatian karena diduga dapat memberikan informasi tentang aspek molekuler respon penyakit pada tanaman karet. Sekitar 1450 fragmen (TDF) diperoleh dari amplifikasi selektif menggunakan 29 kombinasi pasangan primer Vsp dan Taq , 35 di antaranya menunjukkan pola ekspresi yang menarik. Hasil isolasi fragmen tersebut dan kloningnya pada vektor kloning menunjukkan bahwa dalam satu pita bisa terdapat beberapa fragmen yang berbeda. Oleh karena itu untuk masing-masing fragmen diambil 5 klon sehingga jumlah total fragmen yang disekuen adalah 175 fragmen. Namun setelah dilakukan pengelompokan sekuen berdasarkan homologinya, keseluruhan sekuen tersebut mengelompok dalam 19 contigs dan 9 sekuen yang tidak dapat dikelompokkan dalam contig yang sama. Dari jumlah tersebut, 10

141 contigs dan 5 sekuen setelah dibandingkan dengan sekuen yang ada di database (BLAST-X, Altschul et al. 1997), memiliki sekuen homologi dengan berbagai produk gen yang telah dikenal.

Berdasarkan fungsinya, paling tidak terdapat

transkrip yang termasuk dalam kategori transduksi sinyal seperti Ran binding protein dan putative auxin efflux carrier, GTP binding protein, protein transport, regulator transkripsi dan protein yang berhubungan dengan cekaman pada tanaman, seperti arginase, heat shock protein (HSP) dan aconitase. Beberapa transkrip seperti Ran binding protein, protein transpor, GTP binding protein merupakan protein membran. Protein yang terdapat pada membran diketahui banyak berperan dalam persepsi sinyal sehingga perubahan yang terjadi di lingkungan sel segera dapat dideteksi.

Dalam interaksi inang-patogen, kema mpuan sel untuk mendeteksi

secara cepat adanya kondisi yang tidak menguntungkan di lingkungannya merupakan salah satu hal yang membedakan respon antara tanaman resisten dan tanaman rentan. Pemahaman tentang regulasi enzim arginase jauh lebih berkembang pada sel mamalia dibandingkan dengan sel tanaman (Chen et al. 2004).

Induksi

ekspresi arginase pada sel mamalia yang merupakan respon terhadap trauma pelukaan serta infeksi patogen berperan penting dalam mengatur metabolisme Larginin. Paling tidak terdapat dua jalur utama metabolisme arginin, yaitu dikatalis oleh enzim arginase dan lainnya oleh nitric-oxide synthase (NOS). Aktivitas arginase akan mengubah arginin menjadi urea dan ornithin, dimana ornithin merupakan prekursor dalam biosintesis poliamine.

Sedangkan aktivitas NOS

akan mengubah arginin menjadi nitric -oxide (NO).

NO berperan dalam

pembentukan cGMP (cyclic guanylate cyclase) yang diperlukan dalam sinyal transduksi dan pengaturan ion channel (Durner et al. 1998). Jalur mana yang akan ditempuh sangat tergantung pada ekspresi arginase dan ketersediaan arginin di dalam sel. Adanya dua jalur pembentukan arginin dapat menimbulkan kompetisi dalam penggunaan arginin. Apabila ekspresi arginase meningkat di dalam sel, maka arginin akan lebih banyak digunakan untuk menghasilkan urea dan ornitin sehingga produksi NO berkurang. Pada berbagai mekanisme pertahanan hewan

142 dan tanaman telah banyak dilaporkan bahwa NO merupakan sinyal molekul untuk mengaktifkan mekanisme pertahanan.

Dengan demikia n penurunan level NO

dapat mengakibatkan penurunan resistensi inang yang diperantarai NO. Dari penelitian yang dilakukan oleh Chen et al. (2004) dilaporkan bahwa pada daun tomat ekspresi gen LeARG2 penyandi arginase meningkat tajam oleh adanya pengaruh pelukaan dan toksin coronatine yang disekresikan oleh bakteri patogen Pseudomonas syringae sewaktu menginfeksi tanaman tomat. Pelukaan maupun toksin tersebut mengaktifkan sinyal stres pada tanaman inang berupa akumulasi asam jasmonat (jasmonic acid = JA). Telah lama diketahui bahwa akumulasi JA sebagai respon terhadap pelukaan pada tanaman akan segera mengaktifkan ekspresi sejumlah gen yang responsif terhadap pelukaan tersebut (Creelman dan Mullet 1997). Bahkan dilaporkan bahwa JA seperti halnya asam salisilat (salicylic acid = SA) dan etilen merupakan regulator utama di dalam respon pertahanan tanaman (Dong 1998). Di samping arginase, TDF lain yang diperoleh juga memiliki homologi tinggi dengan enzim aconitase. Aconitase diketahui merupakan salah satu enzim yang ekspresinya diregulasi oleh NO, dimana aktivitasnya menyebabkan peningkatan level ion bebas di dalam sel. Pada tanaman tembakau, peningkatan iron bebas berhubungan dengan fungsi pertahanan setelah terjadi serangan patogen (Klessig et al. 2000). Di samping itu juga dilaporkan bahwa peningkatan level iron bebas melalui pengrusakan kluster iron-sulfur aconitase oleh NO, berimplifikasi terhadap kerusakan DNA (Keyer dan Imley 1996). Kuat dugaan bahwa NO berkontribusi dalam respon hipersensitif (HR) melalui peningkatan iron bebas dan melalui destabilisasi kluster iron-sulfur (Navarre et al. 2000). Dalam penelitian ini dengan teridentifikasinya beberapa enzim yang berhubungan secara langsung ataupun tidak langsung dengan ketersediaan NO di dalam sel, menimbulkan dugaan bahwa kemungkinan mekanisme resistensi pada tanaman karet diperantarai oleh NO.

Sejauh ini telah diketahui bahwa NO

merupakan molekul sinyal pada respon pertahanan, dimana NO diperlukan untuk mengaktivasi sepenuhnya resistensi tanaman terhadap penyakit serta program kematian sel pada tanaman kedelai, Arabidopsis dan tembakau (Delledonne et al. 1998; Durner et al. 1998). Program kematian sel melalui respon hipersensitif

143 diaktivasi setelah terjadi interaksi antara NO dengan H2 O2, dimana H2 O2 dihasilkan dari O2 - oleh aktivitas enzim superoxide dismutase (Delledonne et al. 2001). Di samping homolog dengan beberapa enzim seperti tersebut di atas, beberapa TDF juga memiliki homologi tinggi dengan HSP.

Meskipun HSP

merupakan kelompok protein yang terakumulasi dalam jumla h tinggi apabila sel terpapar suhu tinggi, namun ekspresi HSP juga dapat dipicu oleh berbagai macam stres lingkungan, seperti adanya infeksi ataupun toksin. HSP adalah molekul chaperones bagi protein, umumnya merupakan protein sitoplasma dan memainkan peran penting dalam interaksi protein-protein seperti dalam pelipatan untuk menjaga konformasi serta mencegah agregasi dengan protein yang tidak diinginkan. Bahwa HSP termasuk dalam kategori protein yang berperan dalam mekanisme pertahanan, telah dibuktikan melalui identifikasi keberadaannya dalam interaksi antara tanaman dengan patogennya, seperti antara cassava dengan Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Santaella et al. 2004) dan Arabidopsis thaliana dengan Peronospora parasitica (Van der Biezen et al. 2000). Meskipun keterlibatan berbagai TDF tersebut dalam mekanisme resistensi tanaman karet masih memerlukan pembuktian lebih lanjut melalui serangkaian penelitian untuk mengamati pola ekspresinya pa da berbagai klon karet resisten dan rentan yang ada, namun paling tidak informasi di atas diharapkan dapat mengawali penelitian molekuler berikutnya untuk membantu mengungkap transkrip atau bagian gen yang berperan dalam mekanisme resistensi tersebut.

BAB 8

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan pemaparan serangkaian hasil penelitian di atas dapat disimpulkan bahwa aplikasi cDNA-AFLP telah berhasil diterapkan untuk mengidentifikasi dan mendapatkan fragmen asal transkrip (transcript-derived fragment, TDF) dari cDNA tanaman karet.

Fragmen tersebut diekspresikan

secara diferensial, baik antar klon karet resisten AVROS 2037 dan PPN 2444 maupun antar waktu setelah inokulasi daun dengan C. cassiicola pada masingmasing klon. Hasil yang diperoleh dengan kuat menunjukkan bahwa beberapa TDF memiliki homologi tinggi dengan protein membran, seperti putative Ran binding protein , protein transporter, GTP-binding protein dan sugar transferase. Beberapa TDF lain memiliki homologi dengan enzim yang regulasi ekspresinya berhubungan dengan ketersediaan nitric oxide (NO) dalam sel, seperti aconitase dan arginase. Di samping itu juga diperoleh TDF yang ekspresinya meningkat dalam kondisi adanya cekaman, baik berupa toksin maupun suhu tinggi, seperti heat shock protein (HSP). Keterlibatan enzim yang berhubungan dengan NO yang diperoleh dalam penelitian ini mengindikasikan bahwa kemungkinan besar NO berperan penting dalam interaksi tanaman karet dengan C. cassiicola , seperti yang telah dilaporkan pada beberapa tanaman lain, misalnya kedelai, tembakau dan Arabidopsis. Dalam interaksi tersebut NO bersama dengan spesies oksigen lainnya seperti H2 O2 merupakan molekul sinyal yang mengaktifkan mekanisme pertahanan melalui kontribusinya dalam respon hipersensitif penye bab kematian sel yang terlokalisir sehingga patogen tidak berkembang ke jaringan sehat.

Situasi tersebut

kelihatannya sejalan dengan yang terjadi pada tanaman karet, dimana perkembangan gejala pada klon resisten tidak ber kembang lebih lanjut, sehingga kematian sel hanya terbatas di sekitar daerah infeksi.

145 Berdasarkan hasil tersebut, kelihatannya TDF yang memiliki homologi dengan aconitase dan arginase merupakan kandidat transkrip yang berperan dalam sistem pertahanan tanaman karet terhadap serangan C. cassiicola .

Saran Hasil penelitian ini merupakan tahap awal untuk memahami mekanisme resistensi klon karet terhadap infeksi cendawan C. cassiicola. Oleh karena itu disarankan penyempurnaannya dengan penelitian lebih lanjut, antara lain adalah sebagai berikut : 1. Menggunakan kandidat TDF sebagai pelacak untuk dihibridisasikan dengan pustaka cDNA asal daun karet klon resisten AVROS 2037 yang diberi perlakuan C. cassiicola . Hal ini merupakan salah satu cara untuk memperoleh cDNA yang lebih lengkap dan utuh dari TDF tersebut. 2. Sekuen sebagian nukleotida TDFs telah dimiliki, termasuk transkrip yang memiliki homologi tinggi dengan arginase, aconitase dan HSP. Untuk memperoleh cDNA lengkap dan utuh informasi tersebut dapat digunakan untuk mendisain primer gen spesifik untuk mengamplifikasi kedua daerah ujung 5’ dan 3’ yang saling overlap. Dalam hal ini teknik teknik RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends ) dapat diaplikasikan. 3. Kajian pola ekspresi arginase, aconitase dan HSP pada berbagai klon karet resisten dan rentan yang tersedia diperlukan untuk mengevaluasi akumulasi kandidat transkrip tersebut pada berbagai klon karet. Untuk tujuan tersebut dapat digunakan teknik RT-PCR atau hibridisasi. 4. Apabila arginase, aconitase atau HSP turut berperan dalam meka nisme resistensi klon karet terhadap C. cassiicola , maka keduanya dapat digunakan sebagai marka resistensi dalam program pemuliaan tanaman karet. Di samping itu gen penyandi protein tersebut dapat diintroduksikan ke klon karet lainnya yang memiliki sifat-sifat unggul yang diinginkan, namun rentan terhadap serangan C. cassiicola .

DAFTAR PUSTAKA Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucl. Acids Res. 25: 3389–3402. Avrova AO, Venter E, Birch PRJ, Whisson SC. 2003. Profiling and quantifying differential gene transcription in Phytophthora infestans prior to and during the early stages of potato infection. Fungal Genetics and Biology 40: 4-14. Bachem CWB, van der Hoeven RS, de Bruijn SM, Vreugdenhil D, Zabeau M, Visser RGF. 1996. Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP : Analysis of gene expression during potato tuber development. Plant J. 9: 745-753. Bachem CWB, Oomen RJFJ, Visser RGF. 1998. Transcript imaging with cDNA-AFLP: A step by step protocol. Plant Mol. Biol. Reporter 16: 157173. Baker B, Zambryski P, Staskawicz B, Kumar DSP. 1997. Signaling in plantmicrobe interactions. Sciences 276: 726-733. Baulkwill WJ. 1989. The history of natural rubber production. Di dalam: Webster CC, Baulkwill WJ, editor. Rubber. Longman Scientific and Technical. hlm 1-56. Bent AF, Kunkel BN, Dahlbeck D, Brown KL, Schmidt R, Giraudat J, Leung J, Staskawicz BJ. 1994. RPS2 of Arabidopsis thaliana : a leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. Science 265: 1856-1859. Besse P, Seguin M, Lebrun P, Chevallier MH, Nicolas D, Lanaud C. 1994. Genetic Diversity among Wild and Cultivated Populations of Hevea brasiliensis Assessed by Nuclear RFLP Analysis. Theor Appl Genet, 88: 199-207. Breton F, d’Auzac J. 1999. Cassiicolin, a host-selective toxin produced by Corynespora cassiicola, causal agent of Hevea leaf fall disease. International Rubber Research Development Board Meeting, Haicau, Chinese People’s Republic, 18-22 October 1999. CIRAD-CP, Hevea Programme, France. 5p. Breton F, d’Auzac J, Garcia D, Sanier C, Esbach JM. 1996. Recent research on Corynespora cassiicola. Di dalam: Proceeding of workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, December 16-17, 1996. Indonesian Rubber Research Institute, hlm 49-78.

147 Breton F, Sanier C, d’Auzac AJ. 2000. Role of cassiicolin, a host-selective toxin, in pathogenicity of Corynespora cassiicola, causal agent of a leaf fall disease of Hevea. J. Rubb.Res. 3(2): 115-128. Briard M, Le Clerc V, Grzebelus D, Senalik D, Simon PW. 2000. Modified Protocols for Rapid Carrot Genomic DNA Extraction and AFLP Analysis using Silver Stain or Radioisotopes. Plant. Mol. Biol. Rep. 18: 235-241. Brosch G, Ransom R, Lechner T, Walton JD, Loidl P. 1995. Inhibition of maize histone deacetylases by HC toxin, the host-selective toxin of Cochliobolus carbonum. Plant Cell 7: 1941-1950. Bushnell WR, Berquist SE. 1975. Aggregation of host cytoplasm and the formation of papillae and haustoria in powdery mildew of barley. Phytopathology 65: 310-318. Chalhoub BA, Thibault S, Laucou V, Rameau C, Hofte H, Cousin R. 1996. Silver staining and recovery of AFLP amplification products on large denaturing polyacrylamide gels. BioTechniques 22: 216-220. Chee KH. 1988. Studies on sporulation, pathogenicity and epidemiology of Corynespora cassiicola on Hevea rubber. J. Nat. Rubb. Res. 3(1): 21-29. Chen H, McCaig BC, Melotto M, He SY, Howe GA. 2004. Regulation of plant arginase by wounding, jasmonate, and the phytotoxin coronatine. The J of Biol Chem. 279: 45998-46007. Chevallier MH. 1988. Genetic Variability of Hevea brasiliensis Germplasm Using Isozymes Markers. J. Nat. Rubb. Res., 3(1): 42-53. Clouse SD, Gilchrist DG. 1987. Interaction of the asc locus in F8 paired lines of tomato with Alternaria alternata f. sp. Lycopersici and AAL-toxin. Phytopathology 77: 80–82. Collinge DB, Slusarenki AJ. 1987. Plant gene expression in response to pathogenes. Plant Mol. Biol. 8: 389-414. Cooper B. 2001. Collateral gene expression changes induced by distinct plant vuruses during the hypersensitive resistance reaction in Chenopodium amaranticolor. Plant Journal 26: 339-349. Cowel IG. 1998. cDNA Libraries. Di dalam: Rapley R, Walker JM, editor. Molecular Biomethods Handbook. New Jersey: Humana Press. hlm: 131143. Creelman RA, Mullet JE. 1997. Oligosaccharins, barassinolides and jasmonates: Nontraditional regulators of plant growth, development and gene expression. Plant Cell 9:1211-1223.

148 Das M, Harvey I, Chu LL, Sinha M, Pelletier J. 2001. Full-length cDNAs: more than just reaching the ends. Physiol Genomics 6: 57-80. Dellagi A, Birch PRJ, Heilbronn J, Lyon GD, Toth IK. 2000. cDNA-AFLP analysis of differential gene expression in the prokaryotic plant pathogen Erwinia carotovera. Microbiology 146: 165-171. Delledonne M, Xia Y, Dixon RA, Lamb C. 1998. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature 394: 585–588. Delledonne M, Zeier J, Marocco A, Lamb C. 2001. Signal interaction between notric oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 13454-13459. Ditjenbun (Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan) 2004. Perkebunan Indonesia 2001 -2003. Karet. Jakarta: Ditjenbun.

Statistik

Dixon RA, Harrison MJ. 1990. Activation, structure and organisation of genes involved in microbial defence in plants. Adv. Genet. 28: 165-234. Dong X. 1998. SA, JA, ethylene and disease resistance. Curr. Opin. Plant Biol. 1, 316–323. Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 19: 11-15. Durner J, Wendehenne D, Klessig DF. 1998. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 10328-10333. Durrant WE, Rowland O, Piedras P, Hammond-Kosack KE, Jones JDG. 2000. cDNA-AFLP reveals a striking overlap in race-specific resistance and wound response gene expression profiles. The Plant Cell 12: 963-977. Ellis J, Jones D. 1998. Structure and function of proteins controlling strain spesific pathogen resistance in plants. Curr Opin Plant Biol 1: 288-293. Emmet RW, Parbery DG. 1975. Appressoria. Annu. Rev. Phytopathol. 13: 147167. Feron R, Mariani C, Vriezen WH. 2004. Application of the mRNA Capture Kit in cDNA-AFLP. Biochemica 3: 23-24. Gabriel DW, Rolfe BG. 1990. Working models of specific recognition in plantmicrobe interaction. Annu. Rev. Phytopathol. 28: 365-391.

149 Gapkindo (Gabungan Perusahaan Karet Indonesia). 2005. Indonesian natural rubber statistic yearbook 2005. Jakarta: Gapkindo Gilchrist DG, Grogan RG. 1976. Production and nature of a host-specific toxin from Alternaria alternata f. sp. lycopersici. Phytopathology 66: 165–171. Glick BR, Pasternak JJ. 1994. Molecular Biotechnology. Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press Washington DC. Goldraij A, Polacco JC. 1999. Arginase is inoperative in developing soybean embryos. Plant Physiol. 119: 297-303. Grant MR, Godiard L, Straube E, Ashfield T, Lewald J, Sattler A, Innes RW, Dangle JL. 1995. Structure of the Arabidopsis Rpm1 gene enabling dual specifcity disease resistance. Science 269: 843-846. Gubler U, Hoffman BJ. 1983. A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25: 263-269. Hadi H. 2003. Analisis genetik sifat ketahanan tanaman karet terhadap penyakit gugur daun Corynespora. Ringkasan Disertasi. Institut Pertanian Bogor. 25 hal. Hammond-Kosack KE, Jones JDG. 1996. Resistance gene-dependent plant defense responses. Plant Cell 8: 1773-1791. Heath MC. 1980. Reaction of nonsuscepts to fungal pathogenes. Ann. Rev. Phytopathol. 18: 211-236. Jayasinghe CK, Silva WPK. 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember. Indonesian Rubber Research Institute. Pp : 15–19. Ji JP, Loeb LA. 1992. Fidelity of HIV-1 reverse transcriptase copying RNA in vitro. Biochemistry 31: 954-958. Johal GS, Briggs SP. 1992. Reductase activity encoded by the Hm1 disease resistance gene in maize. Science 258: 985-987. Keen NT. 1992. The molecular biology of disease resistance. Plant Mol. Biol. 19: 109-122. Keyer K, Imlay JA. 1996. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 13635–13640

150 Kim WK, Mauthe W, Hausner G, Klassen GR. 1990. Isolation of high molecular weight DNA and double -stranded RNAs from fungi. Canad. J. Bot. 68: 1898-1902. Kleinsmith LJ, Kish VM. 1995. Principles of Cell and Molecular Biology. Second Edition. Harper Collins College Publishers, New York. 810 pp. Klessig DF, Durner J. Noad R. Navarre DA, Wendehenne D, Kumar D, Zhou JM, Shah J, Zhang S, Kachroo P, Trifa Y, Pontier D, Lam E, Silva H. 2000. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 8849-8855. Kombrink E, Beerhues L, Garcia -Garcia F, Hahlbrock K, Muller M, Schroder M, Witte B, Schmelzer E. 1993. Expression patterns of defense-related genes in infected and uninfected plants. In: B. Fritig and M. Legrand (Eds.). Mechanisms of Plant Defense Responses: 236-249. Kluwer Academic Publishers. Netherlands. Lamb CJ, Lawton MA, Dron M, Dixon RA. 1989. Signals and transduction mechanisms for activation of plant defence against microbial attack. Cell 56: 215-224. Lawrence GJ, Finnegan EJ, Ayliffe MA, Ellis JG. 1995. The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPS2 and the tobacco viral resistance gene N. Plant Cell 7: 1195-1206. Lekawipat N, Teerawatanasuk K, Rodier-Goud M, Seguin M, Vanavichit A, Toojinda T, Tragoonrung S. 2003. Genetic Diversity Analysis of Wild Germplasm and Cultivated Clones of Hevea brasiliensis Muell.Arg. by using Microsatellite Markers. J. Rubb. Res. 6(1): 36-47. Lespinasse D, Rodier-Goud M, Grivet L, Leconte A, Legnate H, Seguin M. 2000. A Saturated Genetic Linkage Map of Rubber Tree (Hevea spp.) Based on RFLP, AFLP, microsatellite, and isozyme markers. Theor Appl Genet, 100: 127-138. Liang P, Pardee AB. 1992. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257: 967-971. Lin J-J, Kuo J, Ma J, Saunders JA, Beard HS, MacDonald MH. 1996. Identification of Molecular Markers in Soybean-comparing RFLP, RAPD, and AFLP DNA Mapping Techniques. Plant Mol Biol Rep. 14: 156-169. Lin J-J, Ma J, Ambrose M, Kuo J. 1997. Chemiluminescent detection of AFLP fingerprints. Focus 19: 36-38. Liyanage NIS, Liyanage AS. 1986. A study on the production of a toxin in Corynespora cassiicola. J. Rubb. Res. Inst. Sri Lanka 65: 51-53.

151 Luo H, Coppenolle BV, Seguin M, Boutry M. 1995. Mitochondrial DNA Polymorphism and Phylogenetic Relationships in Hevea brasiliensis. Molecular Breeding 1, 51-63. Madjid A, Saleh M, Suwitoutomo S. 1977. Report on the 1974 Exchange Clones. Workshop on International Collaboration in Hevea Breeding and The Collection and Establishment of Material from Neotropics, Kuala Lumpur, 12-16 April, 1977. Martin GB, Brommonschenkel SH, Chunwongse J, Spivey R, Wu T, Earle ED, Tanksley SD. 1993. Map-based cloning of protein kinase gene conferring disease resistance in tomato. Science 262: 1432-1436. Meeley RB, Johal GS, Briggs SP, Walton JD. 1992. A biochemical phenotype for a disease resistance gene of maize. Plant Cell 4: 71-77. Meeley RB, Walton JD. 1991. Enzymatic detoxification of HC-toxin, the hostselective cyclic peptide from Cochliobolus carbonum. Plant Physiol. 97: 1080-1086. Mindrinos M, Katagiri F, Yu GL, Ausubel FM. 1994. The A. thaliana disease resistence gene RPS2 encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine-rich repeats. Cell 78: 1089-1099. Murayama S, Habuchi T, Yamagishi H, Terachi T. 2002. Identification of a sequence-tagged site (STS) marker link to a restorer gene for Ogura cytoplas mic male sterility in radish (Raphanus sativus L.) by nonradioactive AFLP analysis. Euphytica 129: 61-68. Murray MG, Thompson WF. 1980. Rapid isolation of high molecular weight DNA. Nucl. Acids. Res. 8: 4321-4323. Navarre DA, Wendehenne D, Durner J, Noad R, Klessig DF. 2000. Nitric oxide modulate the activity of tobacco aconitase. Plant Physiology, 122: 573582. Neveau C, Jaubert S, Abad P, Castagnone-Sereno P. 2003. A set of genes differentially expressed between avirulent and virulent Meloidogyne incognita near -isogenic lines encode secreted proteins. Mol. PlantMicrobe Interact. 16: 1077-1084. Noel L, Thieme F, Nennstiel D, Bonas U. 2001. cDNA-AFLP analysis unravels a genome -wide hrpG-regulon in the plant pathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Molecular Microbiology 41(6): 1271-1281.

152 Nurhaimi-Haris, Woelan S, Darussamin A. 1998. RAPD Analysis of Genetic Variability in Plant Rubber (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) Clones. Menara Perkebunan 66: 9 – 19. Okayama H, Berg P. 1982. High-efficiency cloning of full-length cDNA. Mol. Cell Biol. 2, 161-170. Onesirosan PT, Mabuni CT, Durbin RD, Morin RB, Rich DH, Arny DC. 1975. Toxin production by Corynespora cassiicola. Physiological Plant Pathology , 5: 289-295. Orozco-Castillo, Chalmera KJ, Waugh R, Powell W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD marker. Theor. Appl. Genet. 87 : 934-038. Parker JE, Coleman MJ, Szabo V, Frost LN, Schmidt R, van der Biezen EA, Moores T, Dean C, Daniels MJ, Jones JDG. 1997. The Arabidopsis downy mildew resistance gene Rpp5 shares similarity to the Toll and interleukin-1 receptors with N and L6. Plant Cell 9: 879-894. Parniske M, Hammond-Kosack KE, Golstein C, Thomas CM, Jones DA, Harrison K, Wulff BB, Jones JD. 1997. Novel disease resistance specificities result from sequence exchange between tandemly repeated genes at the Cf-4/9 locus of tomato. Cell 91: 821-832. Pawlowski K, Kunze R, De Vries S, Bisseling T. 1994. Isolation of total, poly(A) and polysomal RNA from plant tissues. In: Plant Molecular Biology Manual (Eds. SB Gelvin and RA Shilperoort). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 1 – 13. Perry MD, Davey MR, Power JB, Lowe KC, Bligh HFJ, Roach PS, Jones C. 1998. DNA Isolation and AFLP Genetics Fingerprinting of Theobroma cacao (L.). Plant Mol. Biol. Rep., 16: 49 – 59. Petters J, Gobel C, Scheel D, Rosahl S. 2002. A pathogen-responsive cDNA from potato encodes a protein with homology to a phosphate starvationinduced phosphatase. Plant Cell Physiol. 43(9): 1049-1053. Purwantara A. 1987. Studi histologi daun karet yang terserang Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. Menara Perkebunan 55: 47-49. Pusat Penelitian Karet. 1992. Hasil rumusan Lokakarya Nasional Pemuliaan Karet. Di dalam: Prosiding Lokakarya Nasional Pemuliaan Tanaman Karet. Medan, 7-9 Desember 1992. Pusat Penelitian Karet. Richter TE, Ronald PC. 2000. The evolution of disease resistance genes. Plant Molecular Biology 42: 195-204.

153 Ride JP, Pearce RB. 1979. Lignification and papilla formation at sites of attempted penetration of wheat leaves by non-pathogenic fungi. Physiol. Plant Pathol. 15: 79-92. Roberts JD, Preston BD, Johnston LA, Soni A, Loeb LA, Kunkel TA. 1989. Fidelity of two retroviral reverse transcriptase during DNA-dependent DNA synthesis in vitro. Mol. Cell Biol. 9, 469-476. Rogers SO, Bendich AJ. 1994. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In : Plant Molecular Biology Manual. Second Edition. S.B. Gelvin & R. A. Schilperoort (Eds.). Section D1. Rohlf, JR. 1993. NTSYS-pc. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Version 1.80. Exeter Software. New York. Roslim DI, Hartana A, Suharsono 2003. Kemir ipan Genetika Tiga Populasi Kelapa Tipe Dalam Berdasarkan Tiga Metode Analisis Data Penanda RAPD. Hayati 10: 12 – 18. Rouli Y. 1987. Studi jaringan terserang cendawan Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei pada daun tanaman karet Hevea brasiliensis Muell. & Arg. klon PPN 2444. Laporan masalah khusus, 31 hal. Jurusan Hama dan Penyakit tumbuhan, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spr ing Harbor Laboratory Press. Santaella M, Suarez E, Lopez C, Gonzalez C, Mosquera G, Restrepo S, Tohme J, Badillo A, Verdier V. 2004. Identification of genes in cassava that are differentially expressed during infection with Xanthomonas axonopodis pv. manihotis. Molecular Plant Pathology 5(6): 549-558. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270: 467-470. Seguin M, Besse P, Lebrun P, Chevallier MH. 1995. Hevea Germplasm Characterization using Isozymes and RFLP Markers. In: Population Genetics and Genetic Conservation of Forest Trees. Baradat WT Adams & Muller-Starck (eds). 129-133. Shalev G, Levy AA. 1997. The transposable elements Ac induces recombination between the donor site and a homologous ectopic sequence. Genetics 146: 1143-1151. Shukor SKA, Hidir SM. 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Malaysia. Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember. Pp: 21 – 28.

154 Simmonds NW. 1989. Rubber Breeding. In: Webster CC, Baulkwill WJ (ed). Rubber. Longman Scientific & Technical. John Wiley & Sons. New York. hlm: 85 – 124. Sinulingga W, Suwarto, Soepena H. 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia. Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember. Pp: 29 – 36. Situmorang A. 2002. Sebaran Penyakit Gugur Daun, Virulensi dan Genetika Corynespora cassiicola Asal Sentra Pe rkebunan Karet Indonesia. Disertasi, Program Pascasarjana IPB, 115 hal. Situmorang A, Budiman A. 1984. Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei penyebab penyakit gugur daun pada karet. Kumpulan makalah Lokakarya Karet 1984 PN/PT Perkebunan Wilayah I dan P4TM. Medan. 10 hal. Situmorang A, Budiman A, Pawirosoemardjo S, Lasminingsih M. 1996. Epidemic of Corynespora leaf fall disease and its preventive methods on Hevea rubber. Di dalam: Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember, hlm: 111-132. Soepena H. 1983. Gugur daun Corynespora pada tanaman karet di Sumatera Utara. Kongres Nasional ke VII dan Seminar Perhimpunan Fitopatologi Indonesia, Medan 21-23 September 1983. 7 hlm. Soepena H, Suwarto, Sinulingga W. 1996. Pengendalian penyakit gugur daun Corynespora secara kimiawi. Di dalam: Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember, hlm: 215224. Speirs J, Longhurst T. 1993. RNA extraction and fractination. Meth. Plant Biochem. 10: 1-30. Strommer J, Gregerson R, Vayda M. 1993. Isolation and characterization of plant mRNA. Di dalam: Glick BR, Thompson JE (eds.). Methods in plant molecular biology and biotechnology. CRC Press. hlm: 49-65. Sugui JA, Deising HB. 2002. Isolation of infection-specific sequence tags expressed during early stages of maize anthracnose disease development. Mol. Plant Pathol. 3: 197-203. Suwarto 1989. Patogenisitas dan pembentukan toksin isolat Corynespora cassiicola dari tanaman karet (Hevea brasiliensis) dan kedelai. Risalah Seminar Latihan/Magang Penelitian Pertanian dan Bioteknologi III, Sukamandi, 13-14 Desember 1989. Halaman 55-59. Suwarto 2003. Produksi dan inaktivasi in vitro toksin isolat Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei asal daun karet. Ringkasan Disertasi, Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, 37 hal.

155 Suwarto, Pawirosoemardjo S, Sinulingga W. 1996. Responses of recommended Hevea rubber clones to Corynespora leaf fall in Indonesia. Di dalam: Proc. Workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber. Medan, 16 – 17 Desember, hlm: 149-162. Takken FLW, Joosten MHAJ. 2000. Plant resistance genes: Their structure, function and evolution. European Journal of Plant Pathology 106: 699713. Tan AM, Loo TP, Vadivel G, Bachik MR, Yoon KF. 1992. Survey of major leaf diseases of rubber in Peninsular malaysia. Plrs’Bull. Rubb. Res. Inst. Malaysia. No.211: 51-62. Tan H, Tan AM. 1996. Genetic studies of leaf disease resistance in Hevea. J. Nat. Rub. Res. 11(2): 108-114. Tesniere C, Vayda ME. 1991. Method for the isolation of high-quality RNA from grape berry tissues without contaminating tannins and carbohydrates. Plant Mol. Bio. Reporter 9: 242-251. Thomas MKG, Raghotha ma, Jacob J. 2002. A simple and efficient method for the isolation of total RNA and mRNA from mature leaves of Hevea brasiliensis. Indian Journal of Nat. Rubb. Res. 15: 93-95. Thomas CM, Vos P, Zabeau M, Jones DA, Norcott KA, Chadwick BP, Jones JAG. 1995. Plant Journal 8: 785-794. Toruan-Mathius N, Hutabarat T. 1996. Penanda RAPD dan polimorfisme genetik tanaman kopi robusta (Coffea canephora) toleran terhadap cekaman air. Menara Perkebunan, 64: 45 –55. Toruan-Mathius N, Hutabarat T, Suhendi D. 1997. The use of RAPD to evaluate genetic variability of hybrid parent in Theobroma cacao L. plants. Menara Perkebunan, 65: 53 –63. Unterstenhover G. 1963. The basic principles of crop protection field trial. Pflanzenschulz -Nachrichten Bayer AG. Laverkusen p. 169-170. Vance CP, Sherwood RT. 1976. Regulation of lignin formation in reed canarygrass in relation to disease resistance. Plant Physiol. 57: 915-919. Van der Biezen EA, Hedyani J, Parker JE, Jones JDG. 2000. cDNA-AFLP display for the isolation of Peronospora parasitica genes expressed during infection in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant Microbe Interaction 13: 895-898.

156 Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995. Serial analysis of gene expression. Science 270: 484-487. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414. Vrieling K, Peters J, Sandbrink H. 1997. Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLPs) detected with non-radioactive digoxigenine labelled primers in three plant species. Plant Mol. Biology Reporter 15: 255-262. Walton JD. 1996. Host-selective toxins: Agents of compatibility. The Plant Cell 8: 1723-1733. Wei CT. 1950. Notes of Corynespora. Mycological Papers , 34: 1-10. Whitman S, Dinesh-Kumar SP, Choi D, Hehl R, Corr C, Baker B. 1994. The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to Toll and the interleukin-1 receptor. Cell 78: 1101-1115. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV. 1990. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers. Nucleic Acid Research 18: 6531-6535. Wolpert TJ, Dunkle LD, Ciuffetti LM. 2002. Host-selective toxins and avirulence determinants: What’s in a name ? Ann. Rev. Phytopathol. 40: 251-285. Yeang HY, Sunderasan E, Wickneswari R, Napi D, Zamri ASM. 1998. Genetic Relatedness and Identities of Cultivated Hevea Clones Determined by Isozymes. J. Rubb. Res. 1(1): 35-47. Zhang L, Birch RG. 1997. The gene for albicidin detoxification from Pantoea dispersa encodes an esterase and attenuates pathogenicity of Xanthomonas albilineans to sugarcane. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9984-9989. Zhang L, Meakin H, Dickinson M. 2003. Isolation of genes expressed during compatible interactions between leaf rust (Puccinia triticina) and wheat using cDNA-AFLP. Molecular Plant Pathol. 4: 469-477. Zhu Q, Droge-Laser W, Dixon RA, Lamb C. 1996. Transcriptional activation of plant defense genes. Curr Opin Gen Dev 6: 624-630.

157 Lampiran 1.

Pengelompokan Transcript -Derived Fragments (TDFs) asal daun karet berdasarkan kemiripan sekuennya

>Contig \1 cctgggacaatgggtttctgagattaaagatgacataaagaggccagtatactgtggattgatcag actgctacaagatagagacctgtctgtgaggctggcagctcg >Contig \2 ccgctgcacctgg cccacaacgtagcgactgctgccaaggtcattcgtcaactctgatgccgccga cgcggccgaccccgtcgcaagaaggagccgacatgccgcgaacactcataagaaaaaaccccagca actttaaaacactgccgctgcacgtcgaagccacccccgaaggcctgagctaccagagcgtcggca tgccgctcaatttcgcgcagaccctgcagcgacgcaaacccgtagacgtgccagacgctgagcgct tcgccc >Contig \3 grggaatcttttatagttctgattttggttccttcaaactttgwacccaaatgg >Contig \5 ggctgataaccttgccggattcacgctgggagatataaatttcattgcgtttcgggttgaacagca ccgccaaagagtcccccacctccagctgcttaatcactttgccgctgtgaatatccagcaccaggg tggttttcgcctttgagttatcggtcacaaacaggcgcccggtct cgctgtcttcggcgatgttca gcagcagagccggtttgtcgcccagcggtttccagcgctgttcaatccggttgctgcgcgg >Contig \7 cggcaagtaagccgcttgccttggagaagcggaatgtagcaaatgggattgttaatgtttgctagc tattaccatcccccagctgcatgg >Contig \8 cccgggtatatacacgctctatgcttgcttcccaatgtttatgcaccaacctgcgtcgcgccgctc gtggcgtcagcaggcattacgacggcgctctcgacggcttcgggatcaacgttgcccagtattctt tgctgtgtaacttgcagcgcc >Contig \9 cctagnttctacaatcttatccttatc >Contig \10 ccaagctaaccagtgactctaggtcaatggtactaggtcgttc >Contig \11 ccagctcaagatacaaatgaatggtacaattccagcctggacagagtagtaccct agacgactcaa atcaacctcacaaaactcaagcacagtaaacagaagccggcaagagc

158 >Contig \12 gaaccccctcttccacggcgcggcgaaacggggtgccgtgggtaaagcgctcaccgccaaaatagc tgtcgttggtgtccgaatgggcatcaaaatggatcatgcccagcggcttattccgtcccagcgccc gcaaaatcggcaaggtggtgagatggtcgccccccgcggttaacggcat tacctgctgctgattaa gggcgtgataccaggcctcaatgcgcgccaggctatcctgcagatccancggg >Contig \13 ggcaataaagctgatcactcacaagcgtctgatagaaaaagagcttgagggatttggcataagatt gaacaaggaacctcctaatatttcatttaggaagaaagacaagggtggg >Contig \14 ccgctgaaaatggccgactggctggcgctgtacaaaagcgatgct tacgccgtccagaccgagcat ctcggtaagctgatcggctttttcttcaccgaaatcggcgtggtgaatcaggtggtgcatatctgg gcttacgaaagcc >Contig \15 cccctgcttttttcgaatgaatctcaatgtgccgcttcggagttaaaattcggatattgtcaatat cgtaaacgggaccattgtcc >Contig \16 gaattaacattagtagaaacatttgattgataactccagccattgttaaattggtgcttattgaag aacaaagctgtgtgcaactattttgtgatggattatcttttgtgg >Contig \17 cctaaggatctataggattggtgtattcttttatattccctagtttcggtcatggc >Contig \18 ggttcaacctctcaacagtgtgccttacattagttcacctgcaccagttggtgattatgactcatt gcaaactgaaagtgatgcccaacctgttgaaaaagttggac catgtatggtctttctcccatctaa cacaactaaaaaggaatgggataacatagtggtctctgcgaaaagtgcagttgtgctgactgggac tgcagctatgggacaggtgggaccaattgtggg >Contig \19 ggttcaacctctcaacactgtgccttacatcggttcacctgcacaagttggtgattatgactcatt gcaaactgaaagtgtcaaagtgatgcccaccctgctgaaacggttggcccatg tatggtctttctc ccatctaacacaactaaaaaggaatgggataacatagtggtctctgcaaaaagtgcagttgtgctg actgggactacagctatgggactggtgggaccaattgtgggaccaattgtggg >1.2-T7 gaaggtggcgtgtgttgg >2.5-T7 gaaggtggcgtgtgttgg

159 >7.1-T7 cctgggaaggaagtgtacacaccatcagaggaggattccttgtatccatgctggcagagagcatgc gtggaatttgtgcttcaggtaatgcccctc >14.3-T7 ccatgcattgaccgagttagactaatccgacagatgaatgccctgatcagctccttacc >14.5-T7 ggccgaaggactgcgccacctcgctggctgcgacgaggtgtccgtgatggatggg >20.5-T7 cggaggctataaccgtactcggcaagcaaagcccgcagcttagtttcgaattcaacttcttttttc aggccttcgtcgcctttcacggcttcaagggcagcgagttgttcggccaagtgttttccgagttga cggaactcagcaagacgggacatgaggtgacctttataaaatgattgagcagtatacgaattgaca aatctagcgcaacaactgagatcttagaaatatcagg >22.3-T7 ggtggccgtgagcgaatacagctcgcgtcaccgggtaaaaccgggcatcaccggctgggcgcaaat caatgggtaccgg ggtgaaaccgacaccctgttcaagattcaaaaacgtgttgagtacgacctgga gtacatctccaagtggtcagtgtggtttgacctgtacatcgtcttcatgacggtcccggccgtcct ttccaccaaggaagtctattgatgaataccctcaacgg >26.3-T7 ggacaccagcgttgagtggaaagagagtgatgcgccgtttgagacggtggccaaggtggtgattcc ggcgcaggattttgatacgccggcgttgaatctggcttgtgataatcagtcgtttaatccgtggtt tggggtggaggcgcatcggccgattgggggg >26.4-T7 ggccgccgacgccgatggcgatcacgccaagggcatccacatggggggtgtggctgtcggtgccga cgcaggtatccgggaaggccacgccgtcgcgcacctggatcaccggggacattttctccaggttga tctggtgcatgatgccgttgccgggcggg

160 Lampiran 2. BlastX fragmen cDNA asal daun karet Contig 1 (108) (plant): Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|34898230|ref|NP_910461.1|

putative Ran binding protein 11 -...

48.5

8e-05

gi|15231992|ref|NP_187508.1| protein transporter [Arabidopsis... gi|7023116|dbj|BAA91843.1| unnamed protein product [Homo sapiens

47.8 33.9

1e-04 1.9

gi|26336531|dbj|BAC31948.1| unnamed protein product [Mus musculu gi|82952440|ref|XP_908619.1| PREDICTED: similar to importin 11 i

33.5 33.5

2.5 2.5

gi|21707128|gb|AAH33776.1|

Ran binding protein 11 [Homo sapie...

gi|55624268|ref|XP_517742.1| gi|73949599|ref|XP_535251.2| gi|26352750|dbj|BAC40005.1| gi|21595190|gb|AAH31900.1|

33.5

2.5

PREDICTED: similar to Ran binding p

33.5

2.5

PREDICTED: similar to Ran bindin...

33.5

2.5

unnamed protein product [Mus musculu

33.5

2.5

33.5

2.5

33.5 33.5 33.5 33.1

2.5 2.5 2.5 3.3

(Bits)

Value

Ipo11 protein [Mus musculus]

gi|20987296|gb|AAH29746.1| Importin 11 [Mus muscul us] >gi|315... gi|21618798|gb|AAH31694.1| Unknown (protei n for IMAGE:5116230) [ gi|82952442|ref|XP_908857.1| PREDICTED: similar to importin 11 i gi|76646160|ref|XP_618434.2| PREDICTED: similar to Ran binding p

Contig 2 (270)(plant) : Sequences producing significant alignments: gi|50907187|ref|XP_465082.1| hypothetical protein [Oryza sati... gi|38605787|emb|CAD39983.3| OSJNBb0045P24.1 [Oryza sativa (japon gi|49035698|gb|AAT48629.1| putative auxin efflux carrier protein

31.6 31.2 30.4

0.69 0.90 1.5

161 gi|50726519|dbj|BAD34126.1| replication protein-like [Oryza s... gi|46360126|gb|AAS88886.1| SPU [Ostreococcus tauri] gi|53689747|gb|AAU89759.1| hypothetical protein [Solanum tuberos gi|47824928|gb|AAT38703.1| hypothetical protein PG EC446J10.7 [So

30.4 29.6 28.5 28.5

1.5 2.6 5.8 5.8

gi|50923999|ref|XP_472360.1| OSJNBb0014D23.15 [Oryza sativa (... gi|63003186|dbj|BAD97870.1| LHY homologue1 [Lemna gibba] gi|23198328|gb|AAN15691.1| putative protein [Arabidopsis thal... gi|4512695|gb|AAD21748.1| unknown protein [Arabidopsis thaliana]

28.1 28.1 28.1 28.1

7.6 7.6 7.6 7.6

gi|18395926|ref|NP_566149.1| unknown protein [Arabidopsis tha... gi|56785165|dbj|BAD81841.1| unknown protein [Oryza sativa (ja... gi|50252879|dbj|BAD29110.1| hypothetical protein [Oryza sativa (

28.1 28.1 28.1

7.6 7.6 7.6

gi|30 680980|ref|NP_179630.2|

DNA binding / transcription fact...

28.1

7.6

gi|15239414|ref|NP_200879.1| protein binding / ubiquitin -prot... gi|34907950|ref|NP_915322.1| B1088C09.23 [Oryza sativa (japonica gi|51535731|dbj|BAD37748.1| hypothetical protein [Oryza sativa ( gi|20687|emb|CAA45359.1| chitinase [Pisum sativum] >gi|544015...

28.1 28.1 27.7 27.7

7.6 7.6 10.0 10.0

Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|19750|emb|CAA37880.1|

unnamed protein product [Nicotiana s...

31.2

0.88

gi|34912924|ref|NP_917809.1| putative HSPC058 [Oryza sativa (jap gi|22327621|ref|NP_199453.2| unknown protein [Arabidopsis tha... gi|26449836|dbj|BAC42041.1| unknown protein [Arabidopsis thalian gi|51090748|dbj|BAD35228.1| putative chaperonin 21 precursor ... gi|51090747|dbj|BAD35227.1| putative chaperonin 21 precursor ...

29.3 28.5 28.5 27.7 27.7

3.3 5.7 5.7 9.7 9.7

gi|50910271|ref|XP_466624.1| gi|34905754|ref|NP_914224.1|

27.7 27.7

9.7 9.7

Contig 5 (259) (plant):

putative salt tolerance protein ... OJ1294_F06.19 [Oryza sativa (japoni

162 Contig 8 (153) (all): Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|77381881|gb|ABA73394.1|

Transcriptional Regulator, MarR fa...

91.7

8e-18

gi|68346066|gb|AAY93672.1|

transcriptional regulator, MarR fa...

82.0

6e-15

gi|26988415|ref|NP_743840.1| transcriptional regulator, MarR ... gi|82738619|ref|ZP_00901447.1| regulatory protein, MarR [Pseu... gi|9947220|gb|AAG04674.1| probable transcriptional regulator ... gi|49075942|gb|AAT49511.1| PA1285 [synthetic construct] gi|32041323|ref|ZP_00138906.1| COG1846: Transcriptional regul... gi|67158194|ref|ZP_00419244.1| Helix-turn-helix, Fis-type [Az... gi|17741568|gb|AAL44009.1| transcr iptional regulator, MarR fa...

73.6 73.6 59.3 59.3 59.3 58.9 44.3

2e-12 2e-12 4e-08 4e-08 4e-08 6e-08 0.001

gi|23348425|gb|AAN30478.1|

transcriptional regulator, MarR fa...

43.5

0.002

gi|77389540|gb|ABA80724.1| transcriptional regulator, MarR fa... gi|69933625|ref|ZP_00628827.1| regulatory protein, MarR [Para... gi|69929983|ref|ZP_00626860.1| regulatory protein, MarR [Nitr... gi|48763882|ref|ZP_00268435.1| COG1846: Transcriptional regulato

43.5 42.7 42.4 42.4

0.002 0.004 0.005 0.005

gi|21113835|gb|AAM41931.1| gi|17739228|gb|AAL41866.1|

transcriptional regulator [Xanthom... transcriptional regulator, MarR fa...

41.6 41.6

0.009 0.009

gi|74421936|gb|ABA06135.1|

Transcriptional regulatory protein...

41.6

0.009

Bacterial regulatory protein, Mar...

40.0

0.027

gi|23463831|gb|AAN33672 .1| transcriptional regulator, MarR fa... gi|15075860|emb|CAC47 414.1| PUTATIVE TRANSCRIPTION REGULATOR ... gi|67662928|ref|ZP_ 00460214.1| regulatory protein, MarR [Burk... gi|67547262|ref|ZP_00425167.1| regulatory protein, MarR [Burk...

38.5 38.1 37.7 37.7

0.077 0.10 0.13 0.13

gi|77971291|gb|ABB12670.1| transcriptional regulator, MarR fa... gi|74015258|ref|ZP_00685886.1| regulatory protein, MarR [Burk... gi|67665480|ref|ZP_00462743.1| regulatory protein, MarR [Burk...

37.7 37.7 37.4

0.13 0.13 0.17

gi|39650182|emb|CAE28705. 1|

163 gi|77971073|gb|ABB12452.1| transcriptional regulator, MarR fa... gi|71544084|ref|ZP_00665135.1| regulatory protein, MarR [Synt... gi|66856694|ref|ZP_00400756.1| Helix-turn-helix, Fis-type [An... gi|47574279|ref|Z P_00244315.1| COG1846: Transcriptional regul... gi|53686917|ref|ZP_00106916.2| COG1846: Transcriptional regul... gi|48783412|ref|ZP_00279864.1| COG1846: Transcriptional regul...

37.4 37.0 36.6 36.6 36.6 35.8

0.17 0.23 0.29 0.29 0.29 0.50

gi|14022547|dbj|BAB49156.1|

probable transcriptional regulato...

35.8

0.50

MarR ... [Rhod... regul... [Burk... [Clostri [Rhod...

35.4 35.4 34.7 34.3 33.1 32.7

0.66 0.66 1.1 1.5 3.3 4.3

gi|83654092|gb|ABC38155.1| transcriptional regulator, MarR fa... gi|67758716|ref|ZP_00497472.1| COG1846: Transcriptional regul... gi|67650623|ref|ZP_00448053.1| COG1846: Transcriptional regul... gi|67641013|ref|ZP_00439801.1| COG1846: Transcriptional regul... gi|67754973|ref|ZP_00493873.1| COG1846: Transcriptional regul... gi|67671101|ref |ZP_00467894.1| COG1846: Transcriptional regul...

32.7 32.3 32.3 32.3 32.3 32.3

4.3 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6

gi|52428051|gb|AAU48644.1| transcriptional regulator, MarR fa... gi|76578131|gb|ABA47606.1| MarR family regulatory protein [Bu... gi|76785306|ref|ZP_00772478.1| COG1846: Transcriptional regul...

32.3 32.3 31.6

5.6 5.6 9.5

Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|54648782|gb|AAV36809.1|

50.4

1e-06

50.1 49.7 48.5

2e-06 2e-06 5e-06

gi|53803001|ref|YP_115207.1| transcriptional regulator, gi|83368983|ref|ZP_00913842.1| regulatory protein, MarR gi|48783413|ref|ZP_00279865.1| COG1846: Transcriptional gi|67546456|ref|ZP_00424369.1| regulatory protein, MarR gi|82745757|ref |ZP_00908267.1| regulatory protein, MarR gi|74022564|ref|ZP_00693146.1| regulatory protein, MarR

Contig 12 (251) (plant) :

arginase 2 [Lycopersicon esculentum]

gi|15236640|ref|NP_192629.1| agmatinase/ arginase [Arabidopsi... gi|13182957|gb|AAK15006.1| arginase [Brassica napus] gi|21592908|gb|AAM64858.1| putative arginase [Arabidopsis thalia

164 gi|79325029|ref|NP_001031599.1|

agmatinase/ catalytic [Arabidops

48.5

5e-06

agmatinase/ catalytic [Arabidops... OSJNBb0004G23.10 [Oryza sativa (...

48.5 48.1

5e-06 7e-06

47.8 47.4

9e-06 1e-05

gi|3334122|sp|O49046|ARGI_SOYBN Arginase >gi|2661128|gb|AAC04613 gi|50284480|dbj|BAD29721.1| UDP-glucose glucosyltransferase [Cat gi|296594|emb|CAA48592.1| pZE40 [Hordeum vulgare subsp. vulgare] gi|50428705|gb|AAT77056.1| putative GTP-binding protein [Oryz...

46.6 33.1 31.2 28.5

2e-05 0.23 0.89 5.8

gi|50937559|ref|XP_478307.1| hypothetical protein [Oryza sati... gi|51854345|gb|AAU10725.1| hypothetical protein [Oryza sativa...

28.5 28.1

5.8 7.5

gi|50922977|ref|XP_471849.1| OSJNBa0054D14.3 [Oryza sativa (j... gi|15011441|gb| AAK77552.1| LCI5 [Chlamydomonas reinhardtii] gi|50905127|ref|XP_464052.1| hypothetical protein [Oryza sati... gi|77553297|gb|ABA96093.1| retrotransposon protein, putative,...

28.1 28.1 28.1 28.1

7.5 7.5 7.5 7.5

Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|15235111|ref|NP_195662.1|

GTP binding [Arabidopsis thalian...

75.1

5e-14

gi|50939391|ref|XP_479223.1|

putative GTP-binding protein DRG...

71.6

6e-13

gi|79321186|ref|NP_001031270.1| GTP binding [Arabidopsis thal... gi|2345148|gb|AAB67829.1| developmentally regulated GTP binding gi|13877991|gb|AAK44073.1| putative developmentally regulated... gi|8778457|gb|AAF79465.1| F1L3.17 [Arabidopsis thaliana]

44.7 44.7 44.3 44.3

8e-05 8e-05 1e-04 1e-04

gi|15220113|ref|NP_173190.1| ATDRG1 (ARABIDOPSIS THALIANA DEV... gi|2058456|gb|AAB53256.1| GTP-binding protein [Arabidopsis th... gi|55167981|gb|AAV43849.1| putative GTP binding protein [Oryz...

44.3 44.3 43.5

1e-04 1e-04 2e-04

gi|15236635|ref|NP_192626.1| gi|50921241|ref|XP_470981.1| gi|54648780|gb|AAV36808.1| gi|12802155|gb|AAK07744.1|

arginase 1 [Lycopersicon esculentum] arginase [Pinus taeda]

Contig 13 (115) (plant) :

165 Contig 14 (145) (plant): Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|15239745|ref|NP_199702.1| unknown protein [Arabidopsis tha... gi|15428286|gb|AAK97813.1| ornithine carbamoyltransferase OOC...

28.9 27.7

4.4 9.7

Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|28558785|gb|AAO45756.1| heat shock protein-like protein [Cucu gi|28558784|gb|AAO45755.1| heat shock protein-like protein [Cucu gi|49176600|gb|AAT52227.1| Hsp2 [Cucumis melo] gi|3776577|gb|AAC64894.1| T22H22.24 [Arabidopsis thaliana] >g... gi|30695845|ref|NP_175882.2 | unknown protein [Arabidopsis tha... gi|49176598|gb|AAT52226.1| Hsp1 [Cucumis melo]

67.8 62.8 59.7 57.0 57.0 56.2

1e-10 4e-09 3e-08 2e-07 2e-07 4e-07

Sequences producing significant alignments:

Score Bits)

E Value

gi|28558785|gb|AAO45756.1| heat shock protein-like protein [Cucu gi|49176600|gb|AAT52227.1| Hsp2 [Cucumis melo] gi|28558784|gb|AAO45755.1| heat shock protein-like protein [Cucu gi|49176598|gb|AAT52226.1| Hsp1 [Cucumis melo] gi|3776577|gb|AAC64894.1| T22H22.24 [Arabidopsis thaliana] >g...

55.8 55.8 53.1 51.6 43.5

5e-07 5e-07 3e-06 9e-06 0.002

gi|30695845|ref|NP_175882.2|

43.5

0.002

Contig 18 (231) (all):

Contig 19 (251) (all):

unknown protein [Arabidopsis tha...

166 gi|7321287|emb|CAB82065.1|

putative integral membrane protein...

32.0

7.2

Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|28558785|gb|AAO45756.1| heat shock protein-like protein [Cucu gi|49176600|gb|AAT52227.1| Hsp2 [Cucumis melo] gi|28558784|gb|AAO45755.1| heat shock protein-like protein [Cucu gi|49176598|gb|AAT52226.1| Hsp1 [Cucumis melo] gi|3776 577|gb|AAC64894.1| T22H22.24 [Arabidopsis thaliana] >g...

55.8 55.8 53.1 51.6 43.5

3e-08 3e-08 2e-07 6e-07 2e-04

gi|30695845|ref|NP_175882.2| unknown protein [Arabidopsis tha... gi|46200529|gb|AAS82603.1| putative glycerol 3 -phosphate permeas

43.5 28.9

2e-04 4.4

gi|50942489|ref|XP_480772.1|

hypothetical protein [Oryza sati...

28.1

7.6

gi|50919009|ref|XP_469901.1 |

unknown protein [Oryza sativa (j...

27.7

9.9

gi|50919011|ref|XP_469902.1|

unknown protein [Oryza sativa ( j...

27.7

9.9

Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|50951017|gb|AAT88718.1| nicotinate-nucleotide adenyltransf... gi|66967417|ref|ZP_00414954.1| Cytidyltransferase-related:Pro... gi|23494099|dbj|BAC19067.1| putative nicotinate mononucleotid... gi|38258132|sp|Q8FN90|NADD_COREF Probable nicotinate -nucleoti... gi|84498612|ref|ZP_00997375.1| nicotinate-nucleotide adenyltr... gi|29609139|dbj|BAC73190.1| putative nicotinate-nucleotide ad...

38.9 37.4 35.8 35.8 35.4 35.0

0.044 0.13 0.37 0.37 0.49 0.64

Contig 19 (251) (plant):

14.5 (all)

167 gi|54014851|dbj|BAD56221.1|

hypothetical protein [Nocardia fa...

35.0

0.64

gi|6714685|emb|CAB66257.1| putative nicotinate -nucleotide ade... gi|10720115|sp|Q9RDK7|NADD_STRCO Probable nicotinate -nucleoti... gi|50839924|gb|AAT82591.1| probable nicotinate -nucleotid e ade...

35.0 35.0 34.7

0.64 0.64 0.83

gi|41408342|ref|NP_961178.1|

nicotinic acid mononucleotide ad...

34.7

0.83

gi|38200609|emb|CAE50305.1| Putative nicotinate-nucleotide ad... gi|67984831|gb|EAM72825.1| Cytidyltransferase-related:Probabl... gi|62423864|ref|ZP_00379019.1| COG1057: Nicotinic acid mononu...

34.7 34.7 33.9

0.83 0.83 1.4

gi|28410584|emb|CAD66970.1| nicotinate-nucleotide adenylyltra... gi|28476477|gb|AAO44566.1| nicotinate-nucleotide adenylyltran... gi|77416547|sp|Q83G58|NADD_TROWT Probable nicotinate -nucleoti...

33.5 33.5 33.5

1.9 1.9 1.9

gi|13093315|emb|CAC30404. 1| conserved hypothetical protein [M... gi|76783725|ref|ZP_00770915.1| COG1057: Nicotinic acid mononu...

32.7 32.3

3.2 4.1

gi|31619193|emb|CAD97305.1| PROBABLE NICOTINATE-NUCLEOTIDE AD... gi|71366290|ref|ZP_00656834.1| Cytidyltransferase-related:Pro... gi|68197951|gb|EAN12242.1| Cytidyltransferase-related domain:... gi|6817 2650|ref|ZP_00545932.1| Cytidyltransferase-related:Pro...

32.3 32.0 31.2 31.2

4.1 5.4 9.2 9.2

20.5 (all) Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|38201477|emb|CAD98777.1| H-NS [Pseudomonas sp. Y1000] gi|77383023|gb|ABA74536.1| conserved hypothetical protein [Ps...

86.3 86.3

3e-16 3e-16

gi|28867513|ref|NP_790132.1|

hypothetical protein PSPTO0281 [...

83.2

3e-15

gi|66043398|ref|YP_233239.1|

hypothetical protein Psyr_0128 [...

81.3

1e-14

gi|71556555|gb|AAZ35766.1| gi|68346603|gb|AAY94209.1|

H-NS [Pseudomonas syringae pv. pha... transcriptional regulator, putativ...

80.5 78.6

2e-14 7e-14

gi|77383239|gb|ABA74752.1|

conserved hypothetical protein [Ps...

76.3

3e-13

168 gi|68637877|emb|CAI36082.1| MvaT-like transcriptional regulat... gi|82736524|ref|ZP_00899382.1| transcriptional reg ulator MvaT...

73.6 72.4

2e-12 5e-12

gi|28871871|ref|NP_794490.1|

hypothetical protein PSPTO4755 [...

70.9

1e-11

gi|26990401|ref|NP_745826.1| transcriptional regulator MvaT, ... gi|26986762|ref|NP_742187.1| transcriptional regulator MvaT, ... gi|82738273|ref|ZP_00901109.1| conserved hypothetical protein...

70.1 70.1 70.1

2e-11 2e-11 2e-11

gi|26989666|ref|NP_745091.1|

transcriptional regulator MvaT, ...

69.3

4e-11

gi|28870276|ref|NP_792895.1| transcriptional regulator, putat... gi|82735262|ref|ZP_00898125.1| conserved hypothetical protein...

64.3 63.9

1e-09 2e-09

gi|66046202|ref|YP_ 236043.1| transcriptional regulator, putat... gi|71555308|gb|AAZ34519.1| transcriptional regulator, putativ...

63.5 63.5

2e-09 2e-09

gi|683450 54|gb|AAY92660.1| gi|60326835|gb|AAX18931.1|

transcriptional regulator, putativ... MvaV [Pseudomonas fluorescens]

63.2 62.8

3e-09 4e-09

gi|77383149|gb|ABA74662.1|

transcriptional regulator, putativ...

60.5

2e-08

gi|26990470|ref|NP_745895.1| transcriptional regulator MvaT, ... gi|32037705|ref|ZP_00135977.1| hypothetical protein Paer03000... gi|49074262|gb|AAT49391.1| PA2667 [synthetic construct] gi|58003974|gb|AAW62375.1| putative transcriptional regulator [C gi|82735427|ref|ZP_00898289.1| transcriptional regulator MvaT...

58.5 57.8 57.8 57.4 57.0

7e-08 1e-07 1e-07 2e-07 2e-07

gi|27228562|ref|NP_758612.1| gi|26988100|ref|NP_743525.1|

transcriptional regulator [Pseud... transcriptional regulator MvaT, ...

48.9 42.4

6e-05 0.006

transcriptional regulator, putativ...

41.2

0.012

gi|30721839|gb|AAP33788.1| MvaT [Pseudomonas aeruginosa PAO1]... gi|84316844|ref|ZP_00965303.1| hypothetical protein PaerC_010...

40.0 40.0

0.027 0.027

gi|77384661|gb|ABA76174.1| transcriptional regulator, putativ... gi|1184831|gb|AAC46083.1| heteromeric transcriptional activat...

39.3 39.3

0.047 0.047

gi|83643498|ref|YP_431933.1| hypothetical protein HCH_00605 [... gi|67156341|ref|ZP_00417934.1| transcriptional regulator, put... gi|71554972|gb|AAZ34183.1| transcriptional regulator, putativ...

38.9 38.5 38.5

0.061 0.080 0.080

gi|68346411|gb|AAY94017.1|

169 gi|83644368|ref|YP_432803 .1|

hypothetical protein HCH_01520 [...

38.1

0.10

gi|83645185|ref|YP_433620.1| hypothetical protein HCH_02377 [... gi|28871296|ref |NP_793915.1| hypothetical protein PSPTO4154 [... gi|20148743|gb|AAM10262.1| unknown protein [Arabidopsis thali... gi|15240586|ref|NP_199806.1| catalytic [Arabidopsis thaliana]...

35.0 33.5 31.6 31.6

0.88 2.6 9.7 9.7

Score (Bits)

E Value

gi|9948256|gb|AAG05619.1| probable glycosyl transferase [Pseu... gi|84321103|ref|ZP_00969466.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|68345858|gb|AAY93464.1| capsular polysaccharide biosynthes...

138 138 120

6e-32 6e-32 1e-26

gi|66046530|ref|YP_236371.1|

Undecaprenyl-phosphate galactose...

120

2e-26

gi|28870690|ref|NP_793309.1|

22.3 (all) Sequences producing significant alignments:

capsular polysaccharide biosynth...

120

2e-26

gi|71554020|gb|AAZ33231.1| gi|24052457|gb|AAN43649.1|

capsular polysaccharide biosynthes... putative colanic acid biosynthsis ...

120 101

2e-26 8e-21

gi|26108824|gb|AAN81027.1|

Putative colanic biosynthes is UDP-...

101

8e-21

gi|13362320|dbj|BAB36275.1|

putative colanic acid biosynthsis...

101

8e-21

gi|30041751|gb|AAP17478.1| putative colanic acid biosynthsis ... gi|75514077|ref|ZP_00736407.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75259185|ref|ZP_00730533.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75242869|ref|ZP_00726575.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75229101|ref|ZP_00715676.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75186845|ref|ZP_00700112.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75177167|ref|ZP_00697265.1| COG2148: Sugar transferases in...

101 101 101 101 101 101 101

8e-21 8e-21 8e-21 8e-21 8e-21 8e-21 8e-21

gi|1788360|gb|AAC75108.1| putative colanic acid biosynthsis U... gi|83588040|ref|ZP_0092 6665.1| COG2148: Sugar transferases in...

101 101

8e-21 8e-21

170 gi|83571249|ref|ZP_00922690.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|1407618|gb|AAC77848.1| putative UDP-glucose lipid carrier ... gi|75856637|ref|Z P_00764262.1| COG2148: Sugar transferases in...

101 101 100

8e-21 1e-20 1e-20

gi|27359501|gb|AAO08445.1|

Sugar transferase involved in lipo...

100

2e-20

gi|37200595|dbj|BAC96421.1| putative capsular polysaccharide ... gi|28975414|gb|AAO61842.1| CpsA [Vibrio parahaemolyticus]

100 100

2e-20 2e-20

gi|9655392|gb|AAF94096.1| capsular polysaccharide biosynthesi... gi|28809771|dbj|BAC62746.1| putative capsular polysaccharide ... gi|75830703|ref|ZP_00759976.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75824261|ref|ZP_00753721.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|75820294|ref|ZP_00750345.1| COG2148: Sugar transferases in...

100 100 100 100 100

2e-20 2e-20 2e-20 2e-20 2e-20

gi|16420636|gb|AAL21007.1|

putative UDP-glucose lipid carrier...

99.8

3e-20

gi|16503332|emb|CAD02466.1|

putative extracellular polysaccha...

99.8

3e-20

gi|74420474|gb|ABA04673.1| sugar transferase [Nitrobacter wi n... gi|67158201|ref|ZP_00419251.1| Undecaprenyl-phosphate galacto... gi|68191562|gb|EAN06218.1| Undecaprenyl-phosphate galactoseph...

98.2 97.8 97.1

8e-20 1e-19 2e-19

gi|27361771|gb|AAO10678.1|

Capsular polysaccharide biosynthes...

96.7

2e-19

gi|37198974|dbj|BAC94807.1| putative capsular polysaccharide ... gi|69949435|ref|ZP_00637432.1| sugar transferase [Shewanella ... gi|78492430|ref|ZP_00844667.1| sugar transferase [Rhodopseudo...

96.7 95.1 94.7

2e-19 7e-19 9e-19

gi|39649670|emb|CAE28192.1|

probable glycosyl transferase [Rh...

94.4

1e-18

bacterial sugar transferase [Bru...

94.4

1e-18

PUTATIVE COLANIC BIOSYNTHESIS UDP -... bacterial sugar transferase [Bruce...

94.4 94.4

1e-18 1e-18

gi|62289732|ref|YP_221525.1| gi|17983155|gb|AAL52358.1| gi|23347589|gb|AAN29710.1|

gi|66046460|ref|YP_236301.1|

sugar transferase [Pseudomonas s...

94.4

1e-18

gi|28870610|ref|NP_793229.1|

capsular polysaccharide biosynth...

94.4

1e-18

gi|78364302|gb|ABB42267.1| Undecaprenyl-phosphate galactoseph... gi|71557378|gb|AAZ36589.1| capsular polysaccharide biosynthes... gi|85716245|ref|ZP_01047219.1| sugar transferase [Nitrobacter...

94.4 94.4 94.4

1e-18 1e-18 1e-18

171 gi|77690743|ref|ZP_00805919.1| gi|28199278|ref|NP_779592.1|

sugar transferase [Rhodopseudo...

93.6

2e-18

GumD protein [Xylella fastidiosa...

93.2

3e-18

gi|9107543|gb|AAF85166.1| GumD protein [Xylella fastidiosa 9a... gi|71898373|ref|ZP_00680546.1| sugar transferase [Xylella fas... gi|76792372|ref|ZP_00774872.1| sugar transferase [Pseudoalter... gi|56312318|emb|CAI06963.1| colanic biosynthesis UDP-glucose . .. gi|77740221|ref|ZP_00808709.1| Undecaprenyl-phosphate galacto... gi|67675802|ref|ZP_00472556.1| Undecaprenyl-phosphate galacto... gi|69926988|ref|ZP_00624459.1| sugar transferase [Nitrobacter... gi|53987120|gb|AAV27334.1| glycosyl transferase [Klebsiella pneu gi|71900079|ref|ZP_00682222.1| sugar transferase [Xylella fas... gi|57753925|dbj|BAD86780.1| probable CPS biosynthesis glycosy...

93.2 93.2 92.8 92.4 92.4 92.0 92.0 91.7 91.7 91.7

3e-18 3e-18 4e-18 5e-18 5e-18 6e-18 6e-18 8e-18 8e-18 8e-18

gi|53756326|gb|AAU90617.1| putative polysaccharide biosythesi... gi|2499148|sp|Q48460|YC14_KLEPN Probable CPS biosynthesis gly... gi|1361282|pir||C56146 rfbP protein homolog - Klebsiella pneumon gi|78489896|ref|ZP_00842146.1| probable glycosyl transferase ... gi|48541|emb|CAA49577.1| gumD [Xanthomonas campestris]

91.7 91.7 91.7 91.3 90.9

8e-18 8e-18 8e-18 1e-17 1e-17

gi|21108856|gb|AAM37433.1| GumD protein [Xanthomonas axonopod... gi|733145|gb|AAA86372.1| GumD [Xanthomonas campestris] gi|58582800|ref|YP_201816.1| GumD [Xanthomonas oryzae pv. ory...

90.9 90.9 90.9

1e-17 1e-17 1e-17

gi|21113611|gb|AAM41729.1| GumD protein [Xanthomonas campestr... gi|78695290|ref|ZP_00859802.1| polysaccharide biosynthesis gl...

90.9 90.9

1e-17 1e-17

gi|78036771|emb|CAJ24 464.1|

xanthan biosynthesis glycosyltran...

90.9

1e-17

gi|84368614|dbj|BAE69772.1| GumD protein [Xanthomonas oryzae ... gi|34223843 |gb|AAQ63089.1| GumD [Xanthomonas axonopodis pv. mani

90.9 90.1

1e-17 2e-17

gi|59710959|ref|YP_203735.1|

undecaprenyl-phosphate beta-gluc...

90.1

2e-17

gi|14027724|dbj|BAB54317.1| probable glycosyl transferase [Me... gi|68214152|ref|ZP_00565978.1| sugar transferase [Methylobaci...

89.7 89.7

3e-17 3e-17

gi|84779484|dbj|BAE74261.1| putative extracellular polysaccha... gi|47572603|ref|ZP_00242646.1| COG2148: Sugar transferases in...

89.7 89.7

3e-17 3e-17

172 gi|76875634|emb|CAI86855.1|

UDP-glucose lipid carrier transfe...

89.4

4e-17

gi|21106085|gb|AAM34935.1| UDP-glucose lipid carrier transfer... gi|49529364|emb|CAG67076.1| putative UDP-glucose lipid carrie...

87.8 87.4

1e-16 1e-16

gi|82701373|ref|YP_410939.1| sugar transferase [Nitrosospira ... gi|84712033|ref|ZP_01020059.1| colanic biosynthesis UDP-gluco...

87.4 87.0

1e-16 2e-16

gi|77384054|gb|ABA75567.1|

sugar transferase [Pseudomonas flu...

86.3

3e-16

gi|27350613|dbj|BAC47623.1| blr2358 [Bradyrhizobium japonicum... gi|67547855|ref|ZP_00425753.1| sugar transferase [Burkholderi... gi|71482203|ref|ZP_00661901.1| sugar transferase [Prosthecoch... gi|49609976|emb|CAG73414.1| putative capsular polysaccharide ...

86.3 86.3 85.5 84.7

3e-16 3e-16 6e-16 1e-15

gi|78166540|gb|ABB23638.1| putative lipopolysaccharide biosyn... gi|20086339|dbj|BAB88843.1| putative glucosyltransferase [Glucon

84.7 84.3

1e-15 1e-15

gi|74057314|gb|AAZ97754.1|

undecaprenyl-phosphate galactoseph...

84.0

2e-15

gi|27353239|dbj|BAC50239.1| polysaccharide biosynthesis glyco... gi|48781838|ref|ZP_00278420.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|26005748|dbj|BAC41337.1| glucosyltransferase EpsB [Methylobac

84.0 84.0 83.6

2e-15 2e-15 2e-15

gi|27354589|dbj|BAC51575.1| bll6310 [Bradyrhizobium japonicum... gi|17739640|gb|AAL42245.1| polysaccharide biosynthesis glycos...

83.6 83.6

2e-15 2e-15

gi|15156281|gb|AAK87033.1|

AGR_C_2280p [Agrobacterium tumefac...

83.6

2e-15

gi|83646150|ref|YP_434585.1| Sugar transferase involved in li... gi|1321693|emb|CAA63648.1| phospho -prenol glucose-1-phosphate... gi|48787156|ref|ZP_00283238.1| COG2148: Sugar transferases in... gi|48788800|ref|ZP_00284779.1| COG2148: Sugar transferases in...

83.6 82.8 82.8 82.4

2e-15 4e-15 4e-15 5e-15

Score (Bits)

E Value

26.3 (all) Sequences producing significant alignments:

173 gi|68346050|gb|AAY93656.1|

conserved hypothetical protein [Ps...

111

1e-23

gi|77381899|gb|ABA73412.1| conserved hypothetical protein [Ps... gi|9947936|gb|AAG05328.1| hypothetical protein PA1940 [Pseudo... gi|53727983|ref|ZP_00139608.2| COG0753: Catalase [Pseudomonas ae gi|84321399|ref|ZP_00969757.1| COG0753: Catalase [Pseudomonas ae gi|84327772|ref|ZP_00975788.1| COG0753: Cata lase [Pseudomonas ae

101 87.8 87.8 87.8 87.4

8e-21 1e-16 1e-16 1e-16 1e-16

gi|45656449|ref|YP_000535.1|

hypothetical protein LIC10551 [L...

65.9

5e-10

conserved hypothetical protein [Le...

65.9

5e-10

gi|71558461|gb|AAZ37672.1| conserved hypothetical protein [Ps... gi|6460511|gb|AAF12217.1| conserved hypothetical protein [Dei...

48.5 48.1

8e-05 1e-04

gi|66044641|ref|YP_234482.1| hypothetical protein Psyr_1393 [... gi|53687590|ref|ZP_00108362.2| COG0753: Catalase [Nostoc punctif

48.1 48.1

1e-04 1e-04

gi|29607253|dbj|BAC71312.1|

hypothetical protein [Streptomyce...

47.4

2e-04

gi|29605419|dbj|BAC69485.1| gi|29605027|dbj|BAC69095.1|

putative peroxidase [Streptomyces... hypothetical protein [Streptomyce...

47.4 46.6

2e-04 3e-04

hypothetical protein PSPTO3994 [...

46.6

3e-04

Y4iL [Rhizobium sp. NGR234] >gi|249...

44.7

0.001

gi|82701665|ref|YP_411231.1| hypothetical protein Nmul_A0531 ... gi|77688247|ref|ZP_00803432.1| conserved hypothetical protein... gi|48855510|ref|ZP_00309669.1| hypothetical protein Chut02001852

44.7 43.1 42.4

0.001 0.003 0.006

gi|77388900|gb|ABA80085.1| Catalase [Rhodobacter sphaeroides ... gi|83372629|ref|ZP_00917409.1| conserved hypothetical protein... gi|30180534|emb|CAD85143.1| conserved hypothetical protein [N... gi|53688157|ref|ZP_00110014.2| COG0753: Catalase [Nostoc punctif

41.6 41.6 41.2 41.2

0.009 0.009 0.012 0.012

gi|56678784|gb|AAV95450.1| conserved domain protein [Siliciba... gi|83745586|ref|ZP_00942644.1| Catalase [Ralstonia solanacear... gi|13425331|gb|AAK25549.1| ribosomal protein S1 [Caulobacter ...

40.0 35.8 33.5

0.027 0.52 2.6

gi|24197642|gb|AAN50861.1|

gi|28871139|ref|NP_793758.1| gi|2182449|gb|AAB91707.1|

174 26.4 (plant) Sequences producing significant alignments:

Score (Bits)

E Value

gi|34851120|gb|AAL13084.1| gi|30407706|gb|AAP30039.1| gi|11066033|gb|AAG28426.1|

putative aconitase [Prunus avium] aconitase [Lycopersicon pennellii] cytosolic aconitase [Nicotiana tabacu

69.7 68.9 68.9

2e-12 4e-12 4e-12

gi|50941891|ref|XP_480473.1| putative Aconitate hydratase [Or... gi|54291503|dbj|BAD62409.1| putative aconitate hydratase [Ory... gi|599625|emb|CAA58046.1| aconitase [Arabidopsis thaliana]

68.9 67.8 66.6

4e-12 9e-12 2e-11

gi|15233349|ref|NP_195308.1| RNA binding / aconitate hydratas... gi|29027432|gb|AAO62410.1| aconitase [Lycopersicon pennellii] gi|3309243|gb|AAC26045.1| aconitase-iron regulated protein 1 [Ci gi|599723|emb|CAA58047.1| aconitase [Cucumis melo] >gi|249263... gi|1351856|sp|P49608|ACOC_CUCMA Aconitate hydratase, cytoplas...

66.6 66.2 66.2 66.2 65.9

2e-11 3e-11 3e-11 3e-11 3e-11

gi|30678219|ref|NP_178634.2| RNA binding / aconitate hydratas... gi|4586021|gb|AAD25640.1| cytoplasmic aconitate hydratase [Arabi gi|7269550|emb|CAB79552.1| putative aconitase [Arabidopsis th... gi|23308183|gb|AAN18061.1| At4g26970/F10M23_310 [Arabidopsis ...

65.5 65.5 64.7 64.7

4e-11 4e-11 7e-11 7e-11

gi|18416900|ref|NP_567763.1|

RNA binding / aconitate hydratas...

64.7

7e-11

gi|30684163|ref|NP_180484.2| unknown protein [Arabidopsis tha... gi|3980411|gb|AAC95214.1| putative proline-rich protein [Arabido gi|9843651|emb|CAC03679.1| SRM102 [Arabidopsis thaliana]

31.2 31.2 31.2

0.91 0.91 0.91

gi|50906609|ref|XP_464793.1| hypothetical protein [Oryza sati... gi|18404252|ref|NP_030235.1| amino acid binding [Arabidopsis ... gi|21536685|gb|AAM61017.1| unknown [Arabidopsis thaliana]

30.8 30.4 30.4

1.2 1.6 1.6

gi|50945827|ref|XP_482441.1| hypothetical protein [Oryza sati... gi|57900284|dbj|BAD87117.1| putative Ser/Arg-related nuclear ...

29.6 29.3

2.6 3.5

gi|50937277|ref|XP_478166.1|

putative glucosyltransferase-2 [...

29.3

3.5

gi|50944351|ref|XP_481703.1| gi|50944265|ref|XP_481660.1|

hypothetical protein [Oryza sati... BKRF1 encodes EBNA-1 protein-lik...

29.3 29.3

3.5 3.5

175 gi|50932603|ref|XP_475829.1| unknown protein [Oryza sativa (j... gi|21594762|gb|AAM66041.1| unknown [Arabidopsis thaliana]

28.9 28.9

4.5 4.5

gi|18404446|ref|NP_566761.1| RALFL26 (RALF -LIKE 26) [Arabidopsis gi|34905768|ref|NP_914231.1| P0401G10.10 [Oryza sativa (japonica gi|77550866|gb|ABA93663.1| retrotransposon protein, puta tive,... gi|77554956|gb|ABA97752.1| retrotransposon protein, putative,... gi|56202265|dbj|BAD73706.1| hypothetical protein [Oryza sativ... gi|54290990|dbj|BAD61669.1| hypothetical protein [Oryza sativa ( gi|55296804|dbj|BAD68148.1| hypothetical protein [Oryza sativ... gi|38707408|dbj|BAD04027.1| Myb protein [Oryza sativa (indica cu gi|34915038|ref|NP_918866.1| putative multi resistance protei...

28.9 28.9 28.9 28.9 28.5 28.1 28.1 28.1 28.1

4.5 4.5 4.5 4.5 5.9 7.7 7.7 7.7 7.7

gi|34908980|ref|NP_9158 37.1| P0003D09.28 [Oryza sativa (japonica gi|77550814|gb|ABA93611.1| hypothetical protein LOC_Os11g2882... gi|77548320|gb|ABA91117.1| hypothetical protein LOC_Os11g0167...

28.1 28.1 28.1

7.7 7.7 7.7