HASIL DAN PEMBAHASAN
Kegiatan rekayasa genetik tanaman keberhasilannya tergantung pada beberapa hal, diantaranya adalah gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi, sistem regenerasi tanaman dan seleksi, serta ekspresi dari gen yang dimasukkan ke dalam genom tanaman target.Gen asing yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman harus dapat diinsersikan ke genom tanaman, diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya (Herman 1999). 1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 Pada penelitian ini, konstruk yang dirakit adalah gen OsWRKY76. Gen ini dipilih berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Ryu et al. (2006), yang menunjukkan bahwa gen OsWRKY76 adalah salah satu gen-gen yang termasuk keluarga OsWRKY yang memperlihatkan peningkatan ekspresi pada tanaman padi yang tahan setelah diinokulasi dengan cendawan Pyricularia grisea. Gen OsWRKY76 ini terletak pada segmen di kromosom 9 yang oleh Wisser et al. (2005) diidentifikasi terkait dengan ketahanan penyakit spektrum luas. Pada kegiatan pertama ini dilakukan konstruksi gen kandidat OsWRKY76 di bawah kendali promotor 35SCaMV ke dalam vektor ekspresi pCAMBIA-1301 yang meliputi serangkaian kegiatan yaitu: 1.1. Amplifikasi dan purifikasi fragmen gen OsWRKY76 Penelitian perakitan vektor over-ekspresi diawali dengan mengamplifikasi DNA genom tanaman padi dengan primer untuk gen OsWRKY76 yang telah didisain sebelumnya, menggunakan mesin PCR. Primer yang didisain menambahkan situs pemotongan
enzim restriksi BamHI dan SalI ke produk
amplifikasi pada bagian 5’ dan 3’yang digunakan untuk keperluan ligasi. Penggunaan 2 situs pemotongan enzim restriksi yang berbeda dimaksudkan untuk memastikan kebenaran arah orientasi dari gen OsWRKY76 pada saat melekat pada promotor dan terminator. Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 yang diharapkan pada
tanaman padi varietas Nipponbare adalah ukuran pita sebesar
+
1.200 bp
(Gambar 4).
DNA Nipponbare
Kb
1200 bp
Gambar 4. Hasil amplifikasi 5 sampel DNA Nipponbare dengan primer untuk gen OsWRKY76. Ukuran Gen OsWRKY76 yang diharapkan adalah sebesar + 1200 bp ditandai dengan anak panah.
Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 dengan ukuran + 1.200 bp tersebut kemudian diisolasi dari gel agarose dengan menggunakan gel extraction kit (Qiagen) untuk mendapatkan fragmen gen. 1.2. Kloning gen OsWRKY76 ke dalam vektor kloning Fragmen gen OsWRKY76 kemudian diligasikan ke dalam plasmid pGEMT Easy dan ditransformasikan ke E. coli DH5α dengan metode heat-shock (Sambrook et al. 1989). Kegiatan ini dimaksudkan untuk menyimpan, memperbanyak dan selanjutnya untuk memastikan situs pemotongan yang tepat untuk keperluan kloning pada gen OsWRKY76. Hasil transformasi plasmid rekombinan ke dalam bakteri E.coli DH5 α tersebut kemudian ditumbuhkan pada media seleksi LB padat + ampisilin + IPTG dan X-Gal . Antibiotik ampisilin digunakan untuk menyeleksi sel-sel bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy, karena plasmid tersebut mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik ampisilin, sehingga koloni yang tumbuh pada media seleksi ampisilin dipastikan merupakan koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy. Sedangkan larutan IPTG (isoprophylthio-beta-D-galactoside) dan X-Gal
(5
bromo-4
chloro-3-indolyl-
β-D-galactoside)
digunakan
untuk
mendeteksi terjadinya peristiwa komplementasi-α. Dengan adanya IPTG di dalam
media, akan menginduksi aktivitas enzim β-galactosidase yang dikode oleh gen Lac Z sehingga mampu menghidrolisis/memotong substrat X-Gal sehingga akan memberikan warna biru. Koloni bakteri yang tumbuh apabila berwarna biru mengindikasikan koloni tersebut hanya mengandung plasmid pGEM-T Easy saja. Warna biru disebabkan adanya ekspresi gen Lac Z yang mengindikasikan bahwa pada plasmid pGEM-T Easy terjadi religasi. Sedangkan apabila koloni bakteri yang tumbuh berwarna putih, dipastikan plasmid pGEM-T Easy mengandung insert pada daerah Multi Cloning Sitenya, dimana daerah tersebut memotong gen Lac Z. Oleh karena itu dalam kegiatan ini IPTG dan X-Gal digunakan untuk menyeleksi koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy rekombinan dan koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy saja. Kb
1
2
3
4
5
6
3.000 bp 1.200 bp
Gambar 5. Hasil konfirmasi keberadaan fragmen gen OsWRKY76 pada plasmid pGEM-T easy yang dipotong dengan enzim BamHI dan SalI, menghasilkan fragmen dengan ukuran + 3.000 bp (fragmen pGEM-T Easy) dan 1.200 bp (fragmen OsWRKY76 sampel nomor 1, 2, 4, dan 5). Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan ukuran fragmen yang tidak sesuai.
Dari kegiatan transformasi plasmid rekombinan ke dalam bakteri E.coli DH5α ini didapatkan beberapa koloni bakteri berwarna putih. Dari koloni-koloni tersebut diambil 6 koloni bakteri untuk ditumbuhkan pada medium LB cair yang mengandung antibiotik ampisilin dan digoyang pada suhu 37oC selama semalam, selanjutnya koloni yang tumbuh diisolasi plasmidnya. Untuk konfirmasi keberhasilan ligasi, plasmid yang telah diisolasi kemudian dipotong menggunakan enzim BamHI dan SalI (Gambar 5). Kegiatan ini dilakukan selain untuk memastikan bahwa plasmid pGEM-T Easy yang diisolasi dari koloni bakteri yang berwarna putih adalah benar merupakan plasmid pGEM-T Easy rekombinan yang
mengandung gen OsWRKY76, juga untuk mendapatkan fragmen gen OsWRKY76 dengan ujung-ujung kohesif hasil pemotongan dengan enzim BamHI dan SalI. Dari hasil konfirmasi tersebut diperoleh 4 sampel plasmid rekombinan yang menghasilkan ukuran seperti yang diharapkan, yaitu sampel nomor 1, 2 , 4, dan 5 (Gambar 5). Sampel-sampel tersebut menghasilkan produk pemotongan dengan ukuran 3.000 bp yang merupakan ukuran plasmid pGEM-T Easy dan 1.200 bp yang merupakan ukuran dari fragmen gen OsWRKY76. Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan produk pemotongan dengan ukuran yang tidak semestinya, sehingga plasmid tersebut tidak digunakan untuk penelitian selanjutnya. 1.3. Kloning gen OsWRKY76 ke dalam vektor ekspresi Kegiatan
kloning
selanjutnya
adalah
meligasikan
fragmen
gen
OsWRKY76 dengan fragmen promotor, terminator dan plasmid biner pCAMBIA1301 sebagai vektor ekspresi/biner. Pada kegiatan ini pertama-tama gen OsWRKY76 dipotong dari plasmid pGEM-T Easy dengan enzim restriksi BamHI dan SalI kemudian diseparasi di gel agarose. Pita dengan ukuran 1.200 bp yang merupakan ukuran gen OsWRKY76 diisolasi dari gel agarose dan kemudian diekstraksi dengan menggunakan gel extraction kit dari Qiagen. Kegiatan ini bertujuan untuk mendapatkan fragmen gen OsWRKY76 yang ujung-ujung kohesifnya sesuai untuk keperluan kloning. Promoter 35SCaMV merupakan jenis promoter yang diekspresikan secara kuat, terus menerus, dan diekspresikan
di semua bagian tanaman bila telah
terintegrasi di dalam genom tanaman. Fragmen promoter 35SCaMV diperoleh dengan memotong plasmid pSP13 dengan enzim HindIII dan BamHI. Seperti diharapkan dari pemotongan dua enzim ini dihasilkan fragmen promoter 35SCaMV yang berukuran 550 bp dan ukuran 3.000 bp yang merupakan ukuran plasmid pBS-SK+ (Gambar 6A). Fragmen terminator 35SCaMV diperoleh dengan memotong plasmid pST8 dengan enzim SalI dan EcoRI. Seperti yang diharapkan dari hasil pemotongan dengan menggunakan 2 macam enzim restriksi ini didapatkan fragmen terminator 35SCaMV berukuran 210 bp (Gambar 6B). Fragmen promotor dan terminator dengan ukuran yang tepat diisolasi dari gel agarose dan kemudian diekstraksi menggunakan gel extraction kit (Qiagen).
Kegiatan ini bertujuan untuk mendapatkan fragmen promotor dan terminator 35SCaMV yang mempunyai ujung kohesif yang sesuai untuk keperluan kloning. Kb pSP13
(A)
pST8
(B)
3.000
3.000 bp
550 bp 210 bp
Gambar 6. (A) Hasil pemotongan plasmid pSP13 dengan enzim HindIII dan BamHI menghasilkan fragmen promotor 35SCaMV dengan ukuran 550 bp dan fragmen plasmid pBS-SK+ (3.000 bp), (B) Hasil pemotongan plasmid pST8 dengan enzim SalI dan EcoRI menghasilkan fragmen terminator 35SCaMV dengan ukuran 210 bp dan fragmen plasmid pBS-SK+ (3.000 bp).
Pada kegiatan ini digunakan plasmid biner pCAMBIA-1301 sebagai vektor biner/ekspresi.
Plasmid tersebut dipilih karena selain terdapat enzim
restriksi yang sesuai pada daerah MCS (Multi Cloning Site) yang cocok untuk kegiatan kloning (Gambar 10), juga pada daerah T-DNAnya mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin yang sesuai untuk seleksi pada kalus padi. Untuk tanaman padi saat ini sudah diketahui dosis semi letalnya terhadap antibiotik tersebut yaitu 50 mg/L (Hiei et al. 1994). Plasmid biner pCAMBIA-1301 yang digunakan sebagai vektor dalam konstruk ini dipotong dengan menggunakan enzim restriksi HindIII dan EcoRI. Pemotongan tersebut bertujuan untuk mendapatkan fragmen pCAMBIA-1301 yang ujungnya sesuai untuk keperluan kloning. Enzim-enzim tersebut memotong pada daerah MCS dari plasmid pCAMBIA-1301. Hasil pemotongan tersebut kemudian diseparasi pada gel agarose dan fragmen berukuran 11.837 (Gambar 7) diisolasi dari gel menggunakan gen extraction kit (Qiagen).
Kb pCAMBIA1301
11.837 bp
Gambar 7. Hasil pemotongan plasmid biner pCAMBIA-1301 dengan enzim HindIII dan EcoRI menghasilkan fragmen berukuran 11.837 bp.
Selanjutnya ke-4 fragmen (pCAMBIA-1301, promotor dan terminator 35SCaMV, dan gen OsWRKY76) dicampur untuk diligasikan bersama-sama dalam satu reaksi. Setelah diligasikan selama 3 hari pada suhu 4oC, plasmid rekombinan tersebut di transformasikan ke E. coli DH5α, dengan menggunakan metode heat shock (Sambrook et al. 1989). Suspensi bakteri yang telah ditransformasi kemudian ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung antibiotik kanamisin. Antibiotik tersebut digunakan karena pada plasmid pCAMBIA-1301 mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin yang bisa bekerja di dalam sel bakteri. Sehingga apabila koloni bakteri yang tumbuh di media seleksi yang mengandung antibiotik kanamisin dipastikan mengandung plasmid pCAMBIA-1301 yang mengandung gen kimera OsWRKY76. Dari hasil transformasi tersebut diperoleh 6 koloni bakteri yang tumbuh di media seleksi. Koloni-koloni tersebut ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung antibiotik kanamisin 100 mg/L, digoyang semalam pada suhu 37oC. Dari 6 koloni yang ditumbuhkan, koloni nomor 4 tidak tumbuh, sehingga hanya 5 koloni yang diisolasi plasmidnya. Plasmid yang diperoleh kemudian dipotong dengan enzim restriksi EcoRI untuk memastikan koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Dari 5 koloni bakteri yang diuji hanya 3 koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan yang benar, yaitu koloni nomor 1, 3, dan 5 (Gambar 8). Sedangkan koloni nomor 2 menghasilkan fragmen dengan ukuran
tidak seperti yang diharapkan dan koloni nomor 6 tidak mengandung plasmid, karena tidak dihasilkan fragmen dari hasil pemotongan. Kesimpulan tersebut diperoleh dengan melihat ukuran fragmen yang didapatkan setelah dilakukan pemotongan plasmid dengan enzim EcoRI, yaitu 210 bp yang merupakan ukuran terminator 35SCaMV, 710 bp merupakan ukuran sebagian dari potongan gen OsWRKY76, 1040 bp merupakan ukuran dari gabungan antara promotor 35SCaMV (550 bp) dan sebagian potongan gen OsWRKY76 (490 bp), dan 11.837 bp merupakan ukuran fragmen dari pCAMBIA-1301. Untuk konfirmasi lebih lanjut keberhasilan konstruksi plasmid dari koloni nomor 1 dan 3 dipotong dengan menggunakan 3 enzim restriksi yaitu HindIII, BamHI dan SalI. Hasil pemotongan dengan menggunakan 3 enzim restriksi diperoleh 3 fragmen dengan ukuran + 550, 1.200, dan 13047 bp (Gambar 9B). Ukuran-ukuran tersebut secara berurutan merupakan fragmen 35SCaMV promotor, OsWRKY76, dan gabungan antara pCAMBIA-1301 (11837 bp) dan terminator 35SCaMV (220 bp). Hasil ini sudah sesuai dengan ukuran yang diharapkan (Gambar 3), dan dapat dikatakan bahwa konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 telah berhasil dirakit (Gambar 3 dan 10).
KB
1
2
3
5
6
11.837 bp 1.040 bp 710 bp 210 bp
Gambar 8 . Hasil pemotongan plasmid pCAMBIA 1301-OsWRKY76 dengan enzim restriksi EcoRI.Ukuran yang dihasilkan dari pemotongan tersebut adalah: 210 bp yang merupakan ukuran terminator 35SCaMV, 710 bp merupakan ukuran sebagian potongan gen OsWRKY76, 1040 bp merupakan ukuran dari gabungan promotor 35SCaMV dan sebagian potongan gen OsWRKY76, dan 11.837 bp merupakan ukuran fragmen pCAMBIA 1301.
3
1
Kb
(A)
1
3 (B)
11.837 bp
13.047 bp
1.040 bp 710 bp
1.200 bp 550 bp
210
Gambar 9. Hasil konfirmasi dari 2 sampel plasmid untuk mengetahui keberadaan gen kimera (promoter 35SCaMV, gen OsWRKY76, dan terminator 35SCaMV) pada plasmid biner pCAMBIA-1301, dengan menggunakan 2 cara pemotongan (A) pCAMBIA1301 rekombinan dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI menghasilkan produk hasil pemotongan dengan ukuran 210, 710, 1040, dan 11837 bp, dan (B) pCAMBIA-1301 rekombinan dipotong menggunakan 3 enzim restriksi HindIII, BamHI dan SalI, menghasilkan produk dengan ukuran 550, 1200, dan 13047 bp. Ket.: Kb = marker 1 Kb plus (Invitrogen), 1,3 = plasmid dari koloni bakteri nomor 1 dan 3.
1.4. Transformasi vektor biner rekombinan ke dalam A. tumefaciens Vektor ekspresi rekombinan pCAMBIA-1301::OsWRKY76 yang telah berhasil dirakit kemudian ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 dengan metode ‘freeze-thaw’. Penggunaan kedua strain bakteri
tersebut
dikarenakan
keduanya
merupakan
strain
bakteri yang
supervirulen. Hasil transformasi kemudian ditumbuhkan pada media seleksi LB padat yang mengandung carbenicilin dan kanamisin
untuk Agl-1 dan media
seleksi LB padat yang mengandung kanamisin untuk EHA 105. Jenis antibiotik carbenicilin untuk menyeleksi keberadaan bakteri Agrobacterium strain Agl-1 dan kanamisin untuk menyeleksi plasmid rekombinan pCAMBIA-1301::OsWRKY76. Dari hasil transformasi ini, diperoleh 3 koloni Agrobacterium dari strain Agl-1 dan 7 koloni dari strain EHA 105 yang tumbuh pada media seleksi. Dari koloni yang tumbuh kemudian dilakukan isolasi plasmid, dan dilakukan konfirmasi plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan untuk mengetahui keberhasilan transformasi plasmid rekombinan pCAMBIA 1301::OsWRKY76 ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. Konfirmasi dilakukan
dengan mentransformasikan kembali plasmid rekombinan tersebut (hasil isolasi dari Agrobacterium) ke E. coli (DH5α) dengan metode heat shock. Dari hasil transformasi tersebut diperoleh 6 koloni dari strain EHA 105 dan 4 koloni dari strain Agl-1. Dari koloni yang tumbuh tersebut kemudian dilakukan isolasi plasmid dan konfirmasi plasmid dengan melakukan pemotongan plasmid pCAMBIA-1301::OsWRKY76 dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI (Gambar 11).
pCAMBIA::35S::OsWRKY76 13797
A
B
Gambar 10. A. Plasmid pCAMBIA -1301dengan daerah MCS (Multi Clonning Site) dan B. Plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 hasil kloning.
EHA 105
Agl-1
11.837 bp
1.040 bp 710 bp 210 bp
Gambar 11. Hasil konfirmasi pemotongan plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 yang diisolasi dari E.coli dengan enzim restriksi EcoRI, menghasilkan fragmen dengan ukuran 210 (terminator 35SCaMV), 710 (potongan gen OsWRKY76), 1040 (potongan gen OsWRKY76 + promotor 35SCaMV), dan 11.837 bp (plasmid pCAMBIA-1301).
Dari hasil pemotongan tersebut dihasilkan 4 fragmen baik plasmid yang berasal dari Agrobacterium strain Agl-1 maupun dari EHA 105. Fragmen-fragmen tersebut masing-masing dengan ukuran 210, 710, 1040, dan 11.837 bp (Gambar 11). Ukuran tersebut sesuai dengan peta plasmid yang telah berhasil dikonstruk (Gambar 3). Dengan melihat ukuran fragmen yang dihasilkan tersebut, menunjukkan bahwa transformasi plasmid pCAMBIA- 1301::OsWRKY76
ke
dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 telah berhasil. Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 yang telah mengandung plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan tersebut kemudian akan digunakan untuk kegiatan transformasi pada tanaman padi Nipponbare. 2. Transformasi padi dengan Agrobacterium tumefaciens Untuk
mengetahui
ekspresi
gen
over-ekspresi
OsWRKY76
ada
hubungannya dengan ketahanan padi terhadap cendawan blas maka pertama-tama dilakukan introduksi konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 ke dalam genom tanaman padi melalui kegiatan transformasi melalui Agrobacterium tumefaciens. Alasan penggunaan varietas Nipponbare (Japonica) adalah karena varietas Nipponbare merupakan tanaman model yang mempunyai kompetensi regenerasi dan transformasi yang cukup tinggi. Sedangkan metode transformasi mengacu
pada metode Greco et al. (2001) karena metode tersebut telah cukup mapan digunakan dalam kegiatan transformasi pada tanaman padi Japonica. Kedua alasan ini akan sangat membantu dan mempermudah di dalam memperoleh tanaman transgenik. Dalam proses transformasi Acetosiringon ditambahkan dalam media kokultivasi cair dan padat. Acetosiringon merupakan senyawa fenolik yang dapat menginduksi gen vir sehingga transfer T-DNA ke sel tanaman akan terjadi dan akan membantu meningkatkan transformasi yang stabil (Gelvin 2003; Opabode 2006). Dalam media co-cultivasi juga ditambahkan hormon 2,4-D yang berfungsi untuk merangsang pembelahan sel-sel kalus. Pada saat sel aktif membelah kemungkinan terjadi rekombinasi non-homolog antara T-DNA dan kromosom sel tanaman akan sangat besar, sehingga gen target akan tersisip di dalam genom tanaman (Gelvin 2003). Tabel 1. Hasil transformasi kalus padi varietas Nipponbare dengan konstruk overekspresi gen OsWRKY76 melalui A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA105 Strain Agrobacterium
Transformasi ke
∑ kalus
∑ kalus di media EIM
∑ kalus di media regenerasi
∑ galur independen
∑ tanaman
Agl-1
1
277
52 (19 %)
31 (11,2 %)
27 (10 %)
117
2
385
135 (35 %)
73 (19 %)
71 (18 %)
313
3
377
37 (10 %)
34 (9 %)
2 (0,5 %)
2
1039
224 (21,6 %)
138 (13,3 %)
100 (9,6 %)
432
1
370
28 (7,5 %)
9 (2,4 %)
8 (2 %)
15
2 3
222 417 1009
31 (14 %) 157 (38 %) 216 (21,4 %)
5 (2,3 %) 14 (3,4 %) 28 (2,8 %)
4 (2 %) 14 (3 %) 26 (2,6 %)
15 30 60
Total EHA-105
Total
Ket.: nilai di dalam kurung adalah nilai persentase dari jumlah kalus awal.
Hasil transformasi kalus setelah diperlakukan di media kokultivasi, secara umum dapat dilihat bahwa jumlah kalus dari awal yang dapat lolos sampai ke tahap regenerasi semakin menurun (Tabel 1). Kalus yang tidak tahan pada medium seleksi yang mengandung antibiotik higromisin akan mati, ditunjukkan dengan kalus berwarna hitam, sedangkan kalus yang tahan pada medium seleksi
akan terus tumbuh, dicirikan dengan terjadinya pertumbuhan kalus yang berwarna putih kekuningan (Gambar 12). Kalus yang tidak tahan tersebut tidak mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang ditransfer oleh Agrobacterium. Bagian T-DNA dari plasmid rekombinan yang digunakan untuk transformasi selain mengandung konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 juga mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin. Konsentrasi antibiotik higromisin yang digunakan pada tahap seleksi adalah sebanyak 50 mg/L mengikuti yang telah dilakukan oleh Hiei et al. (1994) dan Greco et al. (2001). Pada media seleksi ini selain ditambahkan antibiotik untuk sel eukariot juga ditambahkan antibiotik untuk mengurangi atau meniadakan kehadiran bakteri. Hal ini bertujuan untuk mengurangi stres eksplan (kalus) terhadap over-growth bakteri sehingga dapat melakukan recovery, dan dapat terus berkembang apabila kaluskalus tersebut mengandung gen target. Pemberian antibiotik higromisin dilakukan pada setiap tahapan perlakuan, hal ini bertujuan untuk menghindari diperolehnya transforman yang escape, yaitu transforman yang tumbuh tetapi sebenarnya transforman tersebut tidak mengandung gen yang diinginkan. Higromisin adalah suatu antibiotik yang dapat membunuh bakteri, fungi dan sel-sel eukariot yang lebih tinggi lainnya karena dapat menghambat sintesis protein. Dalam
penelitian
ini
digunakan
2
strain
Agrobacterium
yang
dikelompokkan pada strain yang supervirulen yaitu Agl-1 dan EHA 105. Hasil penelitian selama ini menunjukkan bahwa tingkat virulensi dari strain bakteri Agrobacterium yang digunakan dapat mempengaruhi dalam mendapatkan transforman. Dengan sifat virulensi strain Agrobacterium yang tinggi diharapkan dapat menginfeksi eksplan lebih kuat dibanding strain kurang virulen. Apabila dilihat dari nilai efisiensi transformasi yang diperlihatkan dari keberhasilan dalam mendapatkan
galur
independen,
transformasi
yang
menggunakan
strain
Agrobacterium Agl-1 nilai efisiensi transformasi mencapai 9,6 % dengan 100 galur independen. Sedangkan transformasi menggunakan strain EHA 105 nilai efisiensi transformasi mencapai 2,6 % dengan 26 galur independen (Tabel 1). Hal ini mengindikasikan bahwa strain Agrobacterium Agl-1 lebih kompatibel di dalam menginfeksi kalus padi Nipponbare dibandingkan dengan strain EHA 105. Dalam tulisannya Opabode (2006) mengutarakan bahwa efisiensi transformasi
sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah faktor Agrobacterium dan jaringan tanaman. Di dalamnya termasuk genotipe, jenis eksplan, vektor plasmid, strain bakteri, komposisi media kultur, dan pengurangan dari tekanan infeksi Agrobacterium setelah kokultivasi. Dari hasil pengamatan kalus-kalus yang berhasil lolos di media seleksi dan dipindahkan ke media penginduksian embrio (EIM) (Lampiran 1) akan membentuk spot hijau
pada +
7-21 hari setelah kalus di pindah ke media
regenerasi (Gambar 12). Kemudian tunas-tunas akan muncul dari spot-spot hijau tersebut dan akhirnya membentuk tunas. Tunas berukuran + 2 cm dipindahkan ke media perakaran yang mengandung higromisin 40 mg/L. Pemindahan ini bertujuan selain untuk pertumbuhan akar juga untuk seleksi pada tingkat planlet. Planlet transgenik di media perakaran akan membentuk akar secara sempurna dan akarnya berwarna putih. Namun apabila ada planlet yang escape, maka akar yang tumbuh di media perakaran akan berwarna coklat dan lama-kelamaan planlet akan mati (gambar tidak ditampilkan).
B
A
D
C
E
Gambar 12. Hasil transformasi kalus padi Nipponbare melalui Agrobacterium tumefaciens yang mengandung vector biner pCAMBIA1301::35S::OsWRKY76. Ket.: A. kalus pada media seleksi yang mengandung higromisin 50 mg/L, B. kalus yang tumbuh di media EIM (induksi embrio) yang mengandung antibiotik higromisin 50 mg/L, C. kalus yang berhasil beregenerasi di media regenerasi yang mengandung antibiotik higromisin 30 mg/L, D. plantlet di media perakaran yang mengandung
antibiotik higromisin 40 mg/L, E. populasi tanaman padi Nipponbare transgenik hasil aklimatisasi di rumah kawat.
3. Analisis molekuler tanaman transgenik dengan PCR Untuk mengetahui secara cepat apakah suatu transforman mengandung gen target yang diintroduksikan ke dalam jaringan tanaman, dapat dilakukan analisis menggunakan teknik PCR. Teknik PCR adalah suatu teknik untuk mengamplifikasi sekuaen DNA tertentu dengan menggunakan primer spesifik secara in vitro. Proses PCR melalui suatu rangkaian tahapan reaksi yaitu denaturasi, penempelan primer, dan pemanjangan dari DNA yang berbentuk double helix. Dari reaksi PCR dapat dihasilkan suatu amplikon yang spesifik dengan melihat ukuran dari produk amplifikasi tersebut. Analisis yang terkait dengan pengujian tanaman transgenik dengan memanfaatkan teknik PCR ini hanya dapat menginformasikan keberadaan suatu gen atau sekuen spesifik tertentu di dalam tanaman berdasarkan primer spesifik yang digunakan.
KB 1 2 3 4 5
6 7 8
9 10 11
KB 23 24 25 Nip A P KB
500 bp KB 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
500 bp 500 bp
Gambar 13. Hasil amplifikasi DNA padi Nipponbare transgenik generasi T0 yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dengan menggunakan primer untuk gen hptII (gen untuk ketahanan terhadap antibiotik higromisin). Pita dengan ukuran + 500 bp merupakan ukuran fragmen gen hptII. Ket.: KB=Marker 1 Kb Plus (Invitrogen), 1-25= sampel tanaman transgenik generasi T0, Nip=tanaman Nipponbare nontransgenik, A=Air, P=Plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76
Pada penelitian ini dari 126 galur independent tanaman transgenik Nipponbare yang berhasil didapatkan, DNA diisolasi dari daun 25 galur independent tanaman transgenik generasi T0 yang ditransformasi dengan A.
tumefaciens strain Agl-1. DNA tersebut digunakan sebagai template dalam PCR menggunakan primer untuk gen penanda seleksi higromisin (hptII). Pada kegiatan ini tidak digunakan primer spesifik untuk gen OsWRKY76, dikarenakan gen OsWRKY76 secara alami juga terdapat pada tanaman padi non-transgenik (tipe liarnya), sehingga untuk membedakan antara tanaman transgenik dan nontransgenik harus digunakan primer spesifik untuk gen yang tidak terdapat di dalam tanaman non-transgenik. Gen hptII dan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 terdapat di daerah T-DNA dari plasmid/vektor biner pCAMBIA1301. Sedangkan T-DNA adalah bagian dari plasmid vektor biner yang ditransfer oleh Agrobacterium ke dalam genom tanaman. Sehingga dalam hal ini, apabila dengan uji PCR sampel DNA menunjukkan hasil positif mengandung gen hptII yang ditandai dengan terbentuknya amplikon dengan ukuran 500 bp, maka dapat disimpulkan bahwa sampel tersebut juga mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Dari hasil analisis PCR menunjukkan bahwa 25 galur independen yang diuji, semua mengandung gen penanda seleksi higromisin yang diperlihatkan dengan terbentuknya amplikon berukuran sekitar 500 bp (Gambar 13). Maka dapat disimpulkan bahwa 25 galur tanaman trasgenik generasi T0 yang diuji semua mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Dari hasil tersebut juga dapat mengindikasikan bahwa metode transformasi yang digunakan (metode Greco et al. 2001) sangat efektif digunakan untuk transformasi kalus tanaman padi Nipponbare.
