J. Sains Tek., April 2006, Vol. 12, No. 1, Hal.: 9 - 13 ISSN 0853-733X
AMPLIFIKASI FRAGMEN PELACAK GEN LIPASE BAKTERI TERMOFILIK YANG DIISOLASI DARI KOMPOS Agus Hery Susanto, Adi Amurwanto, Daniel Joko Wahyono, dan Saefuddin ’Aziz Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Diterima 6 Februari 2006, perbaikan 24 Maret 2006, disetujui untuk diterbitkan 31 Maret 2006
ABSTRACT A study on amplification of a lipase gene probe of a thermophilic bacterial isolated from compost by the use of PCR technique was conducted at the Laboratory of Genetics, Biology Faculty, Jenderal Soedirman University, from October 2005 to January 2006. Bacillus sp strain ITB-A1, a thermophilic bacterial of compost origin showing lipase activity, was used in this study which could basically be divided into two main steps, i.e. chromosomal DNA isolation and in vitro amplification of a lipase gene probe. The primers used were upper primer (5’ GAG AGS RTG ATG AAA KGC TG 3’) and lower primer (5’ GAC AAG CAT GCG GGC CGT CTG 3’), respectively designed on the basis of conserved areas of lipase sequences of nine Bacillus genera and two Pseudomonas genera. Chromosomal DNA isolation indicated that the DNA was sufficiently good to be used as a PCR template due to no physical fragmentation observed. The PCR resulted in a thick band of approximately 500 bp, two thin bands assumed as a mispriming product, and a thin band assumed as a primer dimer. It could be concluded that an about 500 bp lipase gene probe of a thermophilic bacterial of compost origin was successfully in vitro amplified. Keywords: thermophilic bacterial, compost, DNA probe, PCR
1. PENDAHULUAN Lipase atau asilgliserol hidrolase (E.C. 3.1.1.3) merupakan enzim yang mengatalisis hidrolisis trigliserida menjadi diasilgliserida, monogliserida, gliserol, dan asam lemak bebas pada interface lemak - air. Selain itu, lipase juga mempunyai kemampuan untuk mengatalisis reaksi esterifikasi, alkoholisis, dan asidolisis 1,2. Dalam bioteknologi industri, lipase digunakan untuk mengatalisis reaksi-reaksi pemrosesan lemak dan minyak, deterjen, pemrosesan makanan, sintesis zat kimia dan obat-obatan, pabrik kertas, dan produksi kosmetik. Oleh karena sebagian besar proses industri tersebut dilakukan pada suhu di atas 45°C 3 , maka diperlukan adanya lipase yang tahan suhu tinggi atau lipase termostabil. Beberapa keuntungan dilakukannya proses enzimatik pada suhu tinggi di dalam proses industri adalah berkurangnya peluang kontaminasi mikroba, peningkatan laju reaksi, dan penurunan biaya produksi 4,5,6. Enzim lipase termostabil dihasilkan oleh mikroorganisme termofilik, khususnya bakteri termofilik. Bakteri semacam ini mampu tumbuh pada habitat dengan suhu tinggi seperti sumber air panas di sekitar gunung berapi. Beberapa bakteri termofilik telah diisolasi dari beberapa sumber air
2006 FMIPA Universitas Lampung
panas di Indonesia seperti sumber air panas Sileri, Dieng, Jawa Tengah7 dan sumber air panas Cimanggu, Cibuni, dan Tangkuban Perahu, Jawa Barat 8,9. Di samping itu, kompos juga merupakan habitat potensial bakteri termofilik penghasil enzim termostabil. Upaya untuk memperoleh enzim lipase termostabil melalui pendekatan teknologi DNA rekombinan dapat ditempuh dengan dua cara, yaitu konstruksi perpustakaan genom dan teknik PCR bertahap (walking PCR). Kedua cara tersebut memerlukan adanya fragmen pelacak gen lipase, yang dikonstruksi secara in vitro menggunakan teknik PCR. Pada pendekatan perpustakaan genom, fragmen pelacak gen lipase digunakan sebagai alat skrining terhadap klon-klon rekombinan yang ada. Sementara itu, pada pendekatan PCR bertahap, fragmen pelacak digunakan sebagai acuan awal dalam perancangan primer-primer oligonukleotida berikutnya. Dalam melakukan konstruksi fragmen pelacak gen lipase diperlukan pasangan primer oligonukleotida yang dirancang atas dasar daerah konservatif berbagai sekuens lipase. Penentuan daerah konservatif dapat dilakukan, baik pada tingkat sekuens asam amino maupun pada tingkat sekuens DNA. Sehubungan dengan hal tersebut, penelitian ini bertujuan untuk melakukan amplifikasi
9
Agus Hery Susanto, dkk…Amplifikasi Fragmen Pelacak Gen
fragmen pelacak gen lipase bakteri termofilik yang diisolasi dari kompos menggunakan sepasang primer oligonukleotida yang dirancang atas dasar daerah konservatif berbagai sekuens lipase. Fragmen pelacak gen lipase yang diperoleh dari hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai sarana dalam upaya mengeksplorasi gengen lipase dari berbagai sumber genetik.
2. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman dari bulan Oktober 2005 hingga Januari 2006. Bakteri termofilik asal kompos Bacillus sp strain ITB-A1 digunakan sebagai sumber DNA kromosom untuk templat PCR. Strain bakteri ini merupakan koleksi Laboratorium Biokimia Departemen Kimia FMIPA ITB, yang telah diketahui memperlihatkan aktivitas lipase. Bahan-bahan yang diperlukan meliputi medium NB, larutan untuk ekstraksi DNA kromosom (bufer STE pH 8; lisozim; bufer lisis; kloroformisoamilalkohol 24 : 1; Na asetat pH 5,2; etanol p.a. dingin), pelarut DNA (TE pH 8), larutan untuk elektroforesis (agarosa, bufer TAE 50x, loading buffer 6x, etidium bromid), kit PCR (bufer PCR 10X, enzim Taq Pol I, dNTP), sepasang primer oligonukleotida (primer atas: 5’ GAG AGS RTG ATG AAA KGC TG 3’ dan primer bawah: 5’ GAC AAG CAT GCG GGC CGT CTG 3’). Primer tersebut merupakan hasil perancangan atas dasar daerah konservatif sekuens lipase sembilan genus Bacillus dan dua genus Pseudomonas. Basa S, R, dan K pada primer atas masing-masing cenderung mendekati basa C, G, dan T 10. Adapun peralatan yang digunakan terdiri atas mikrosentrifuga merek eppendorf tipe 5415D, seperangkat alat elektroforesis, UV transiluminator, serta thermocycler manual yang terdiri atas penangas air tipe Jeio Tech WB-20E untuk penempelan dan polimerisasi primer dan tipe Grant Y6 untuk denaturasi. Secara garis besar penelitian ini dapat dibagi dalam dua tahap, yaitu isolasi DNA kromosom bakteri termofilik Bacillus sp strain ITB-A1 dan amplifikasi fragmen pelacak gen lipase. 2.1. Isolasi DNA Kromosom DNA kromosom Bacillus sp strain ITB-A1 diisolasi menurut 11 dengan sedikit modifikasi. Koloni tunggal strain tersebut diinokulasikan ke dalam 100 mL medium NB dan dikocok 200 rpm pada suhu 50oC selama 12 jam menggunakan shaker-bath. Sebanyak 1,5 mL kultur cair
10
disentrifugasi 5.000 rpm pada suhu ruang selama 5 menit. Pelet sel yang diperoleh diresuspensi dengan 1 mL bufer STE, divorteks, lalu disentrifugasi 5.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan 200 µL lisozim dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama satu jam. Kemudian, ditambahkan 200 µL bufer lisis (preparasi segar), dibolak-balik perlahan selama satu menit. Ditambahkan 200 µL kloroform-isoamilalkohol (24 : 1), dibolak-balik perlahan selama satu menit untuk selanjutnya disentrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit. Lapisan atas yang diperoleh dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga baru, kemudian ditambah lagi dengan 200 µL kloroform-isoamilalkohol dan diperlakukan kembali dengan cara di atas. Lapisan atas dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga baru, ditambah dengan larutan TE hingga mencapai volume 400 µL. Selanjutnya, ditambahkan 40 µL Na asetat pH 5,2 dan 800 µL etanol p.a dingin, dibolak-balik perlahan selama 30 detik untuk kemudian diinkubasi pada suhu -20ºC selama dua jam. Dilakukan sentrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet DNA yang diperoleh dikeringkan dengan cara membalikkan tabung mikrosentrifuga di atas kertas tisu. Pelet DNA dilarutkan dalam 50 µL larutan TE. Sebanyak 10 µL sampel DNA divisualisasikan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. 2.2. Amplifikasi Fragmen Pelacak Gen Lipase DNA kromosom hasil isolasi digunakan sebagai templat dalam reaksi PCR untuk mengamplifikasi fragmen pelacak gen lipase. Reaksi PCR dilakukan dalam volume total 50 µL yang mengandung 5 ng DNA kromosom, 10 pmol masing-masing primer, campuran dNTP dengan konsentrasi akhir 200 µM, 5 µL bufer PCR, 1,25 U enzim Taq Pol I, dan ddH2O untuk memenuhi volume 50 µL. Proses PCR dilakukan dalam 25 siklus reaksi, yang masing-masing terdiri atas tahap denaturasi pada 95oC selama 1 menit, tahap penempelan primer pada 40oC selama 1 menit, dan tahap polimerisasi pada 72oC selama 1 menit. Sebelum memasuki siklus reaksi, campuran dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 95oC selama 5 menit. Begitu pula, setelah siklus reaksi terakhir proses polimerisasi dilanjutkan pada suhu 72oC selama 5 menit. Hasil PCR divisualisasikan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Amplikon yang diperoleh dianalisis secara deskriptif berdasarkan atas ukuran fragmen pelacak gen lipase yang seharusnya diperoleh, yaitu sekitar 500 pb.
2006 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., April 2006, Vol. 12, No. 1
3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Isolasi DNA Kromosom Pada tahap isolasi DNA kromosom ini dilakukan lisis enzimatik menggunakan lisozim. Lisozim mempunyai pengaruh yang sangat nyata dalam proses lisis sel sehingga paling sering digunakan dalam proses ekstraksi DNA 12. Metode ekstraksi DNA yang terlalu lembut hanya akan melisis sel bakteri gram negatif saja. Sebaliknya, ekstraksi yang terlalu kasar dapat melisis sel bakteri baik gram negatif maupun gram positif, tetapi DNA yang dihasilkan dapat mengalami fragmentasi 13. Hasil isolasi DNA kromosom Bacillus sp ITB-A1 memperlihatkan bahwa DNA yang diperoleh cukup baik kualitasnya untuk digunakan sebagai templat PCR. Hal ini karena DNA tersebut tidak nampak terfragmentasi secara fisik seperti dapat dilihat pada Gambar 1.
1
2 pb 23.130 9.416 6.557 2.322 2.027
Gambar 1. Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom Bacillus sp ITB-A1
Meskipun demikian, untuk dapat digunakan sebagai templat PCR, DNA kromosom tidak perlu mempunyai tingkat kemurnian yang terlalu tinggi karena PCR merupakan teknik yang sangat peka. Artinya, sepasang primer oligonukleotida yang dirancang dengan baik akan mampu mengenali sekuens target meskipun terdapat materi kontaminan seperti protein dan RNA. 3.2. Amplifikasi Fragmen Pelacak Gen Lipase DNA kromosom Bacillus sp ITB A-1 selanjutnya digunakan sebagai templat PCR untuk diamplifikasi fragmen pelacak gen lipasenya. Pada proses amplifikasi ini digunakan enzim Taq DNA polimerase. Enzim yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus ini merupakan salah satu enzim DNA polimerase termostabil yang mempunyai aktivitas eksonuklease 5’→ 3’ (non-proofreading) dengan produk polimerisasi yang memperoleh tambahan basa adenin (A) pada ujung 3’nya. Oleh karena itu, fragmen hasil PCR menggunakan Taq DNA polimerase mempunyai ujung yang runcing (sticky ends), yang dengan sendirinya akan memudahkan proses ligasinya dengan vektor T untuk keperluan karakterisasi/sekuensingnya 20.
pb
1 2
1419 517 396
Lajur 1 DNA kromosom Bacillus sp ITB-A1 Lajur 2 marker DNAλ /HindIII
DNA yang terfragmentasi secara fisik kurang baik untuk digunakan sebagai templat PCR karena ada kemungkinan bahwa sekuens target yang akan diamplifikasi berada dalam kondisi yang tidak utuh. Jika hal ini terjadi, maka tidak akan diperoleh produk PCR yang diinginkan, atau sebaliknya, akan diperoleh produk PCR yang tidak diinginkan 14. Pada Gambar 1 terlihat bahwa DNA kromosom Bacillus sp ITB-A1 masih terkontaminasi oleh RNA, yang ditunjukkan oleh adanya pita melebar (smear) di bawah pita DNA kromosom. Pita smear ini dapat muncul akibat perlakuan selama ekstraksi dan pemurnian DNA. Beberapa faktor yang dapat mengganggu proses dan hasil ekstraksi DNA antara lain lisis sel yang tidak sempurna 15, koekstraksi dengan inhibitor enzimatik 16, dan keberadaan substansi asam humat 17,18. Hasil ekstraksi dan pemurnian DNA juga dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti bufer dan reagen yang digunakan, waktu inkubasi minimum, dan optimasi homogenisasi dalam proses lisis19.
2006 FMIPA Universitas Lampung
Gambar 2. Elektroforesis hasil PCR Lajur 1 marker DNA pUC19/HinfI Lajur 2 fragmen hasil PCR
Hasil amplifikasi fragmen pelacak gen lipase dapat dilihat pada Gambar 2, yang menunjukkan adanya pita tebal berukuran sekitar 500 pb. Pita ini diduga sebagai fragmen gen lipase dari Bacillus sp ITB A1 karena pasangan primer yang digunakan dirancang untuk dapat mengamplifikasi fragmen gen lipase sepanjang lebih kurang 500 pb. Pada Gambar 2 terlihat bahwa selain pita fragmen 500 pb terdapat pula pita yang lebih tipis baik di atas maupun di bawah pita fragmen tersebut. Pita dengan ukuran sekitar 1,4 kb diduga merupakan hasil salah tempel (mispriming) akibat adanya homologi yang relatif tinggi antara primer dan sekuens di luar gen lipase. Mispriming dapat
11
Agus Hery Susanto, dkk…Amplifikasi Fragmen Pelacak Gen
purification, and biochemical properties. Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 763-781.
diatasi dengan menaikkan suhu penempelan primer hingga 68°C dan memperpanjang tahap polimerisasi hingga 5 menit 21. 3.
Sharma, R., Chisti, Y., and Banerjee, U.C. 2001. Production, purification, characterization, and application of lipases. Biotechnol. Adv. 19: 627-662.
4.
Bruins, M.E., Janssen, A.E., and Boom, R.M. 2001. Thermozymes and their applications: a review of recent literature and patents. Appl. Biochem. Biotechnol. 90 (2): 155-186.
5.
Vieille, C. and Zeikus, G.J. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 1-43.
4. KESIMPULAN DAN SARAN
6.
Dari hasil penelitian yang diperoleh dan pembahasannya dapat ditarik kesimpulan bahwa fragmen pelacak gen lipase putatif berukuran sekitar 500 pb dari bakteri termofilik asal kompos dapat diamplifikasi menggunakan sepasang primer oligonukleotida yang dirancang atas dasar daerah konservatif berbagai sekuens lipase.
Haki, G.D. and Rakshit, S.K. 2003. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresour. Technol. 89 (1): 17-34.
7.
Karakterisasi terhadap fragmen putatif yang diperoleh tersebut perlu dilakukan melalui sekuensing dan analisis homologi dengan sejumlah sekuens gen lipase lainnya yang telah dipublikasikan.
Kim, B.C., Grote, R., Lee, D.W., Antranikian, G., and Pyun, Y.R. 2001. Thermoanaerobacter yonseiensis sp. nov., a novel extremely thermophilic, xylose-utilizing bacterium that grows at up to 85 degrees C. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51 (Pt 4): 1539-1548.
8.
Akhmaloka, Pramono, H., Tika, I.N., Suharto, A., Retnoningrum, D.S., Sindumarta, M., Padmawinata, K., dan Oei, B.L. 2000. Eksplorasi potensi bakteri termofilik isolat lokal: studi kasus DNA polimerase termostabil. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi III, Cibinong 7-9 Maret 2000: 31-39.
9.
Baker, G.C., Gaffar, S., Cowan, D.A., and Suharto, A.R. 2001. Bacterial community analysis of Indonesian hot springs. FEMS Microbiol. Lett. 200 (1): 103-109.
Mispriming diduga juga telah menyebabkan terbentuknya salah satu pita di bawah fragmen 500 pb yang berukuran sekitar 300 pb. Sementara itu, fragmen tipis lainnya yang jauh lebih pendek diduga merupakan akibat terjadinya primer dimer. Primer dimer terjadi apabila suatu primer menjadi templat bagi primer sejenisnya atau pasangannya sehingga keduanya akan saling menempel dan membentuk produk amplifikasi yang berukuran sangat pendek. Penempelan antarprimer ini dapat disebabkan baik oleh self- maupun cross-homology pada ujung 3’ primer, yang berkaitan dengan ketidakcermatan dalam analisis perancangannya 22.
UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kepala Laboratorium Biokimia Departemen Kimia FMIPA ITB atas isolat Bacillius sp strain ITB A-1 yang diberikan. Demikian juga, ucapan terima kasih disampaikan kepada Proyek DIPA Fakultas Biologi Unsoed tahun anggaran 2005 selaku penyandang dana dan kepada Dr. Hendro Pramono, M.S. atas dukungan teknis dan fasilitas melalui Proyek Hibah Pekerti yang sedang berlangsung di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Unsoed.
DAFTAR PUSTAKA 1.
Gupta, R., Rathi, P., Gupta, N, and Bradoo, S. 2003. Lipase assays for conventional and molecular screening: an overview. Biotechnol. Appl. Biochem. 37: 63-71.
2.
Gupta, R., Gupta, N., and Rathi, P. 2004. Bacterial lipases: an overview of production,
12
10. Herlambang, T.T., Pramono, H., Susanto, A.H. 2005. Perancangan primer konsensus untuk amplifikasi fragmen gen lipase Bacillus. Biosfera (in press). 11. Klijn, N., Weerkamp, A.H., and de Vos, W.M.. 1991. Identification of mesophilic lactic acid bacteria by using PCR-amplified regions of 16s rRNA genes directly amplified from a hypersalin environment. Syst. Appl. Microbiol. 18: 574-581. 12. Treusch, A.A., Kletzin, A., Raddatz, G., Ochsenreiten, T., Quaiser, A., Meurer, G., Schuster, S.C,.and Schlener, C.. 2004.
2006 FMIPA Universitas Lampung
J. Sains Tek., April 2006, Vol. 12, No. 1
Characterization of large insert DNA libraries from soil for environmental genomic studies of Archaea. Environ. Microbiol. 18: 1-11. 13. Kirk, J.L., Beaudette, L.A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.N., Lee, H., Trevors, J.T. 2004. Review: methods of studying soil microbial diversity. J. Microbiol. Methods 58: 169-188. 14. Singleton, P. 1999. Bacteria in Biology, Biotechnology, and Medicine 5th Ed. John Wiley and Sons Inc., NewYork. 15. Miller, D.N., Bryant, J.E., Madsen, E.L., and Ghiorse, W.C. 1999. Evolution and optimation of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2): 4715-4724. 16. Yeates, C., Gillings, M.R., Davidson, A.D., Altavilla, N., and Veal, D.A. 1997. PCR amplification of crude microbial DNA extracted from soil. Lett. App. Microbiol. 25: 303-307.
18. Wechter, P., Williamson, J., Robertson, A., and Kluepfel, D. 2002. A rapid, cost-effective procedure fot the extraction of microbial DNA from soil. World J. Microbiol. Biotechnol. 19: 85-91. 19. Kruske, C.R., Banton, K.L.,. Adorada, D.L., Stark, P.C., Hill, K.K., and Jackson, P.J. 1998. Small-scale DNA sample preparation method for field PCR detection of microbial cells and spores in soil. Appl. Environ. Microbiol. 56: 2463-2472. 20. Bassetti, J. 2002. Crossing the Ts of cloning: T-vector cloning. Promega Cooperation. www.promega.com. 21. Bradner, J.R., Bell, P.J.L., Junior Teo, V.S., and Nevalainen, K.M.. 2003. The application of PCR for the isolation of a lipase gene from genomic DNA of an Aractic microfungus. Curr. Genet. 44: 224-230. 22. Newton, C.R. and Graham, H.B. 1994. PCR. BIOS Scientific Publ.Ltd, London.
17. Henne, A., Daniel, R., Schmitz, R.A., and Gottschalk, G. 1999. Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate. Appl. Environ. Microbiol. 65 (9): 3901-3907.
2006 FMIPA Universitas Lampung
13
