IDENTIFIKASI SPESIES ISOLAT BAKTERI S1 DENGAN METODE ANALISA SEKUEN FRAGMEN GEN 16S rdna

JURNAL TEKNIK POMITS Vol. 1, No. 1, (2012) 1-6

1

IDENTIFIKASI SPESIES ISOLAT BAKTERI S1 DENGAN METODE ANALISA SEKUEN FRAGMEN GEN 16S rDNA Thoyibatun Nuroniyah dan Surya Rosa Putra* Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 E-mail: [email protected] *dosen pembimbing

Abstrak— Telah dilakukan identifikasi spesies isolat bakteri S1 dengan menggunakan pendekatan analisa genotip. Isolat bakteri S1 merupakan bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber mata air panas Songgoriti, Malang. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi spesies bakteri S1 dengan metode analisa sekuen fragmen 16SrDNA yang telah diakui sebagai metode identifikasi yang akurat untuk berbagai spesies organisme. DNA kromosom bakteri diisolasi dan diamplifikasi menggunakan instumen PCR dan primer yang digunakan adalah primer universal. Selanjutnya dilakukan analisa sekuen fragmen gen 16S rDNA teramplifikasi. Hasil analisa dibandingkan dengan sekuen 16S rDNA bakteri yang telah terdaftar di BankGen untuk diketahui homologinya dengan bakteri yang lain. Hasil analisa menunjukkan bahwa sekuen fragmen gen 16S rDNA bakteri teridentifikasi memiliki kecocokan 99,12% dengan Bacillus thuringiensis galur IAM 14077. Kata Kunci—identifikasi spesies, bakteri termofilik, analisa fragmen gen 16S rDNA

I. PENDAHULUAN ndonesia merupakan negara kepulauan yang beriklim tropis sehingga memiliki banyak daerah pegunungan berapi dengan aktivitas vulkanik yang tinggi. Kondisi geografis ini mendukung untuk dilakukannya eksplorasi bakteri termofilik yang merupakan bakteri penghasil enzim termostabil[1]. Di Indonesia, penelitian mengenai bakteri termofilik mulai mendapatkan perhatian. Beberapa bakteri termofilik isolat lokal telah berhasil diisolasi dari sejumlah tempat. Beberapa bakteri termofilik yang berhasil diisolasi dari berbagai sumber air panas di Indonesia antara lain Geobacillus thermoleovorans yang tumbuh pada suhu 43 – 75 °C dari sumber air panas kawah Wayang, Pangelangan [2]. Selain itu bakteri Geobacillus thermoleovorans juga ditemukan di sumber air panas Gunung Pancar, Bogor dengan suhu tumbuh antara 42 – 70 °C[3]. Penelitian mengenai pemetaan bakteri termofilik di Indonesia juga dilakukan oleh Muharni [4] yang menemukan bakteri Bacillus sp dalam sampel air panas Danau Ranau Sumatera Selatan dan Asnawi [5] yang menemukan 8 genus bakteri dalam sampel air panas Pacet, yaitu Bacillus sp, Acetogenium sp, Thermus sp, Pseudomonas sp, Thermodesulfobacterium sp, Thermotrix sp, Sulfobacillus sp, dan Thermomicrobium sp. Biodiversitas ini dipengaruhi oleh perbedaan kondisi seperti pH, temperatur, ketersediaan air,

I

cahaya dan oksigen, serta jenis dan jumlah nutrien dalam suatu habitat [6]. Bakteri termofilik dapat dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi. Hal ini berkaitan dengan kemampuan bakteri termofilik menghasilkan enzim termostabil. Enzim termostabil yang dihasilkan oleh bakteri termofilik mampu mengakatalisis reaksi biokimia pada suhu tinggi dan umumnya lebih stabil dari enzim yang dihasilkan oleh bakteri mesofilik. Beberapa enzim termostabil tersebut adalah enzim amylase dari Geobacillus sp [7], enzim lipase dari Pseudomonas sp [8], dan selulase dari Anoxybacillus flavithermus [9]. Eksplorasi pemanfaatan bakteri termofilik dalam berbagai bidang industri mendorong dilakukannya pemetaan dan identifikasi bakteri termofilik dari berbagai sumber mata air panas. Salah satu sumber mata air panas yang diduga memiliki tingkat biodiversitas bakteri termofilik yang tinggi adalah Sumber Mata Air Panas Songgoriti. Penelitian mengenai bakteri termofilik dari Sumber Mata Air Panas Songgoriti pertama kali dipublikasikan oleh Karina [10]. Dalam penelitiannya, Karina telah melakukan identifikasi isolat S1. Identifikasi bakteri termofilik yang dilakukan oleh Karina didasarkan pada metode analisa fenotipik meliputi morfologi sel, pewarnaan gram, uji oksidasi, dan uji fermentasi. Berdasarkan serangkaian identifikasi fenotipik tersebut, dilaporkan bahwa isolat S1 termasuk bakteri Gram negatif, sel berbentuk batang, positif terhadap uji oksidasi, dan negatif terhadap uji fermentasi. Berdasarkan karakter fenotipik tersebut, Karina menyimpulkan bahwa isolat bakteri S1 merupakan bakteri genus Pseudomonas. Meski demikian, identifikasi bakteri dengan berdasarkan karakter fenotip memiliki kelemahan utama, yaitu kerapnya terjadi kesalahan dalam pembedaan spesies dan galur bakteri. Kesalahan tersebut disebabkan hadirnya karakter fenotipik bakteri yang tidak biasa. Terlebih karakter fenotipik bakteri tidak bersifat statis dan dapat berubah seiring dengan perubahan kondisi organisme dan lingkungan hingga menyebabkan evolusi [11]. Identifikasi bakteri berdasarkan karakter fenotipik juga memiliki reprodusibilitas yang rendah karena tergantung pada kondisi kultur di laboratorium yang berbeda. Kekurangakuratan identifikasi isolat bakteri S1 melalui analisa fenotipik mendorong dilakukannya identifikasi bakteri dengan metode lain yang lebih akurat. Metode identifikasi bakteri yang banyak direkomendasikan adalah analisa genotip

JURNAL TEKNIK POMITS Vol. 1, No. 1, (2012) 1-6 bakteri melalui pembacaan sekuen basa nitrogen pada nukleotida penyusun fragmen gen 16S rDNA bakteri. Dinilai dari beberapa pertimbangan, metode ini dinilai lebih baik dibandingkan dengan metode analisa fenotipik. Pertimbangan yang pertama adalah gen 16S rDNA dari hampir seluruh spesies bakteri telah ditentukan urutan basa nitrogennya sehingga dapat dijadikan pedoman jika ditemukan spesies baru[12]. Pertimbangan yang kedua adalah urutan basa nitrogen gen 16S rDNA memiliki keragaman intraspesifik yang lebih rendah dibandingkan gen pengkode protein yang lain, serta sifat dari fragmen 16S rDNA yang lestari[13]. Pada penelitian ini, dilakukan identifikasi spesies isolat bakteri S1 dengan metode analisa sekuens basa nitrogen pada nukleotida penyusun fragmen gen 16S rDNA isolat bakteri S1. Identifikasi dilakukan dengan pertama kali melakukan isolasi DNA isolat bakteri S1 dan selanjutnya diamplifikasi fragmen gen 16S rDNAnya menggunkan instrumen Polymerase Chain Reaction. Fragmen gen teramplifikasi selanjutnya di analisa sekuen basa nitrogen pada nukleotida penyusun fragmen untuk diketahui homologinya dengan sekuen basa nitrogen fragmen gen 16S rDNA bakteri lain yang telah terdata pada bankgen. Melalui metode ini, juga akan diketahui kekerabatan isolat bakteri S1 dengan bakteri lain melalui pohon filogenetik. II. METODOLOGI PENELITIAN A. Isolasi DNA Isolat S1 10 mL kultul cair bakteri isolat S1 disentrifus dalam tabung ependorf 1000µL selama dua menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapannya diresuspensi dengan menambahkan buffer STE sebanyak 500µL. Larutan dihomogenkan menggunakan vortex hingga homogen dan disentrifus kembali selama 2 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang diperoleh kembali dibuang dan endapan diresuspensi dengan 500 µL buffer TE dan SDS 10% 100 µL. Larutan dihomogenkan dengan mengeluar-masukkan larutan dengan mikropipet. Setelah homogen, ditambahkan 10µL enzim proteinase K kedalam larutan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Ketika inkubasi berjalan, tabung eppendorf diketuk-diketuk dengan jari setiap 15 menit sekali. Setelah inkubasi, kedalam tabung eppendorf ditambahkan 500µL larutan PCI. Kemudian tabung eppendorf disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Dari hasil sentrifus diambil larutan bagian atas tabung sebanyak 400µL dan dipindahkan ke tabung eppendorf steril yang lain. Kedalam larutan yang dipindahkan ini ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 800µL. Selanjutnya tabung eppendorf difreezer dengan suhu 4°C selama 30 menit. Setelah difreezer, tabung eppendorf disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang diperoleh dibuang dan endapan diresuspensi dengan etanol 70%. Tabung eppendorf kemudian disentrifuse kembali dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan endapan yang diperoleh dikeringkan menggunakan evaporator. Endapan yang telah kering diresuspendi dengan menambahkan ddH2O 50µL.

2

selanjutnya, untuk memeriksa hasil isolasi DNA, dilakukan analisa menggunakan gel elektroforosis agarosa. B. Pembuatan Gel Agarosa Sebanyak 0.4 gram bubuk agarosa dilarutkan dalam 40 mL buffer TAE. Pelarutan dilakukan dengan bantuan microwave selama 2 menit. Sesudah larut, larutan agarosa didiamkan hingga suam-suam suku. Selanjutnya, larutan agarosa dituangkan kedalam alat pencetak gel agarosa. Didiamkan larutan agarosa hingga membeku. Setelah membeku, dimasukkan gel agarosa yang telah mengeras kedalam loyang elektroforesis. Kemudian dituangkan buffer TAE kedalam loyang hingga gel terendam. C. Elektroforesis Disiapkan 3 µL loading buffer pada lembaran parafilm. Ditambahkan 7 µL sampel hasil isolasi DNA ke loading buffer dan dihomogenkan. Sesudah homogen (ditandai dengan perubahan warna campuran menjadi biru tua) dimasukkan campuran sampel dan loading buffer kedalama lubang-lubang sumur pada gel agarosa. Dimasukkan marka DNA ukuran 1 kb kedalam lubang sumur paling ujung. Setelah itu dilakukan elektroforesis selama 30 menit dengan tegangan 5 V/cm.. Setelah proses elektroforesis, diambil gel agarosa dari chamber dan direndam dalam larutan EtBr selama 10 menit untuk proses pewarnaan. Seusai pewarnaan selama 10 menit, gel agarosa direndam dalam air selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan pengamatan migrasi DNA pada gel agarosa menggunakan lampu UV transiluminator. D. Amplifikasi Fragmen 16S rDNA Kedalam tabung PCR dimasukkan larutan DNA cetakan sebanyak 5 µL, reagen multimix PCR 25 µL, primer forward (5’-CAC GGA TCC AGA GTT TGA TC(A/C) TGG CTC AG-3’) 5 µL, primer reverse (3’-GTG AAG CTT ACG GYT ACC TTG TTA CGA CTT-5’) 5µL (Promega Corporation, USA) dan ddH2O 10 µL. Selanjutnya campuran dimasukkan kedalam PCR dengan pengaturan suhu prapemisahan 95°C selama 5 menit, suhu pemisahan 95°C selama 30 detik, suhu penempelan 60°C selama 30 menit dan suhu polimerisasi 72°C selama 1 menit. Reagen multimix PCR merupakan reagen campuran yang mengandung enzim i-Taq DNA polymerase 5U/µL, 4 macam dNTP (dTTP, dCTP, dATP dan dGTP) masing-masing 2.5 mM, buffer PCR dan buffer loading gel. Setelah amplifikasi, dilakukan analisa gel elektroforesis kembali. E. Purifikasi Produk Amplifikasi Diambil 30 µL produk amplifikasi dan dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1000µL. kedalamnya ditambahkan 70µL ddH2O dan 500µL binding buffer dan dikocok perlahan. Dipipet seluruh campuran kedalam filter tube disentrifus selama 1 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Dibuang liquidyang terpisah. Kemudian ditambahkan 500 µL wash buffer kedalam filter tube dan disentrifus selama 1 menit dengan kecepatan 10000 rpm, dibuang liquidyang terpisah.

JURNAL TEKNIK POMITS Vol. 1, No. 1, (2012) 1-6 Pencucian dengan wash buffer dilakukan dua kali. Langkah terakhir, dimasukkan filter tube kedalam tabung eppendorf, ditambahkan 25µL ddH2O dan disentrifus selama 1 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Liquid yang didapat pada dasar eppendorf merupakan hasil purifikasi. Hasil purifikasi diuji dengan gel elektroforesis. F. Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA Analisa sekuen fragmen gen 16S rDNA dilakukan dalam satu reaksi dan primer yang digunakan adalah primer forward yang juga dipakai pada proses amplifikasi fragmen 16S rDNA. Urutan sekuesn fragmen gen yang diperoleh selanjutnya diupload ke bankGen melalui program BLAST pada website www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui kemiripannya dengan fragmen gen 16S rDNA bakteri lain serta pohon filogenetik bakteri isolat S1.

3 Keberadaan RNA dalam larutan DNA disebabkan karena pada prosedur ini tidak ditambahkan enzim RNAse. Keberadaan plasmid serta RNA yang tidak diinginkan pada larutan DNA bisa ditolerir karena pada proses amplifikasi fragmen DNA menggunakan instrumen PCR, primer oligonukleotida universal yang digunakan hanya akan menempel secara spesifik pada basa nitrogen komplementer pada nukleotida penyusun fragmen gen 16S rDNA bakteri yang ada pada DNA kromosom, bukan pada RNA atau DNA plasmid. Hasil elektroforesis yang sama juga dilaporkan oleh Noer [17] yang melakukan isolasi DNA sel epitel. Berdasarkan hasil penelitiannya, protein serta molekul kontaminan yang masih terkandung dalam larutan DNA tidak mengganggu proses amplifikasi DNA sel epitel.

III. HASIL DAN DISKUSI A. Isolasi DNA Isolat Bakteri S1 Hasil elektroforesis DNA kromosom bakteri isolat S1 tersaji dalam gambar 3.1. Pada gambar tersebut terlihat beberapa jalur migrasi DNA. Jalur migrasi DNA isolat bakteri S1 berada pada jalur 1. Pada jalur 1 terlihat adanya beberapa pita yang terseparasi berdasarkan ukuran molekul masing – masing. Pita pertama terpisah diatas wilayah 10000bp. Hal ini menunjukkan bahwa terdeteksi adanya molekul dengan ukuran lebih dari 10000bp. Ukuran pita yang jelas dan tebal mengindikasikan bahwa konsentrasi molekul yang terseparasi pada wilayah ini tinggi. Tertahannya laju migrasi molekul pada daerah 10000 bp mengindikasikan bahwa molekul tersebut adalah molekul DNA kromosom bakteri, karena berdasarkan penelitian Demerdash[14], molekul DNA kromosom bakteri memiliki ukuran lebih dari 10000 bp, yakni 21000 bp – 23000 bp. Wang juga melaporkan bahwa pola pita elektroforesis DNA kromosom bakteri dengan menggunakan marka DNA 250bp – 10000bp terpisah pada daerah diatas 10000bp. Faktor lain selain ukuran molekul yang menyebabkan DNA kromosom tertahan diatas 10000bp dan tidak jauh dari sumur gel adalah karena konformasi DNA kromosom bakteri. DNA kromosom bakteri memiliki konformasi sirkular yang menyebabkan molekul DNA susah melewati pori dalam agarosa. Akibat konformasi tersebut, kromosom DNA memiliki laju migrasi yang rendah dan tertahan di daerah diatas 10000bp . Pada gambar tersebut juga terlihat adanya 2 pita tipis yang berada sedikit dibawah lini marka 2500bp dan 1500bp dan pita tebal dibawah lini marka 250bp. Hal ini menginformasikan bahwa terdapat molekul lain dengan ukuran molekul yang berbeda – beda dalam larutan DNA[15]. Pita tipis dan samar yang tertahan sedikit dibawah lini marka 2500bp dan 1500bp diduga merupakan DNA plasmid[16]. Visualisasi pita memperlihatkan kedua pita merupakan pita samar dan kecil yang menginformasikan bahwa konsentrasi plasmid DNA dalam larutan DNA rendah. Adapun pita tebal dan melebar yang tertahan sedikit dibawah lini marka 250bp diduga merupakan RNA.

Gambar 3.1 pola elektroforesis DNA kromosom bakteri S1

B. Amplifikasi Fragmen Gem 16S rDNA Gambar 3.2 adalah gambar gel elektroforesis hasil amplifikasi fragmen gen 16S rDNA. Dari hasil elektroforesis diketahui terdapat pita yang terseparasi dan sejajar dengan marka 1500bp. Hal ini mengindikasikan bahwa fragmen gen yang teramplifikasi memiliki ukuran ±1500 bp. Hasil elektroforesis ini sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa molekul fragmen gen 16S rDNA bakteri memiliki ukuran 1500 bp, sehingga dapat disimpulkan bahwa proses amplifikasi fragmen gen 16S rDNA bakteri berhasil dilakukan. Hasil amplifikasi

Marka 1500 bp

Gambar 3.2 pola elektroforesis fragmen gen 16S RDNA

C. Purifikasi produk Amplifikasi Gambar 3.3 adalah gambar uji elektroforesis produk amplifikasi pasca purifikasi.

JURNAL TEKNIK POMITS Vol. 1, No. 1, (2012) 1-6

4 Bacillus thuringiencis. Bacillus thuringiensis yang diisolasi dari sumber air panas Himalaya ini diketahui memiliki gen pengkode enzim DNA gyrase. Enzim DNA gyrase merupakan salah satu enzim topoisomerase yang berperan dalam mengontrol susunan suatu sel dan memiliki peranan penting dalam proses replikasi dan transkipsi DNA. Enzim ini dapat menginduksi terjadinya supercoiling positif pada molekul DNA dan mempengaruhi mekanisme perbaikan melalui pelapisan protein tertentu pada daerah yang rusak.

Gambar 3.3 pola elektroforesis produk amplifikasi pasca purifikasi Informasi yang didapat dari gambar diatas adalah bahwa proses purifikasi berhasil dilakukan dengan terlihatnya pita tunggal pada daerah sedikit diatas 1500 bp. Pita tunggal yang jelas dan tidak melebar pada daerah 1500 bp menunjukkan bahwa produk amplifikasi fragmen gen 16S rDNA telah bersih dari protein dan molekul pengotor.

IV. KESIMPULAN Berdasarkan analisa yang telah dilakukan, fragmen gen 16S rDNA bakteri memiliki homologi 99,12% dengan fragmen gen 16S rDNA Bacillus thuringiensis galur IAM 12077. Hasil tersebut mengindikasikan bahwa bakteri teridentifikasi merupakan bakteri Bacillus thuringiensis galur baru. DAFTAR PUSTAKA [1]

[2]

D. Analisa Sekuen Fragmen Gen 16S rDNA Informasi yang diperoleh dari prosedur ini adalah bahwa sekuen fragmen gen 16S rDNA bakteri isolat S1 memiliki homologi 98 - 99% dengan fragmen gen 16S rDNA dari 4 galur bakteri, yakni Bacillus thuringiensis galur IAM 12077, Bacillus Weihanstephanensis galur D5M 11821, Bacillus mycoides galur 273, dan Bacillus anthracis galur ATCC 14578. Dari keempat galur bakteri tersebut, fragmen gen 16S rDNA isolat bakteri S1 memiliki homologi paling besar dengan Bacillus thuringiensis galur IAM 12077. Homologi sekuen fragmen 16S rDNA kedua jenis bakteri mencapai 99,12%. Perbedaan sekuen fragmen gen 16S rDNA bakteri S1 dan Bacillus thuringiensis galur IAM 12077 disebabkan adanya ketidaksesuaian 6 basa diantara 1241 sekuen basa yang terbaca. Ketidaksesuaian tersebut terjadi pada sekuen basa ke 48 (A/G), 62 (T/C), 64 (T/A), 1158 (A/G), 1237 (T/C) dan 1243 (A/G). Besarnya persentase keidentikan fragmen gen 16S rDNA isolat bakteri S1 dan Bacillus thuringiensis galur IAM 12077, menginformasikan bahwa bakteri teridentifikasi memiliki kekerabatan yang dekat dengan Bacillus thuringiensis galur IAM 12077, namun bukan merupakan Bacillus thuringiensis galur IAM 12077 karena tidak memiliki homologi 100%. Tidak adanya kecocokan 100% antara fragmen gen 16S rDNA sampel dengan fragmen gen 16S rDNA bakteri yang telah terdaftar di genBank mengindikasikan bahwa bakteri teridentifikasi merupakan bakteri Bacillus thuringiensis galur baru. Alam [18] melaporkan bahwa Bakteri Bacilus thuringiensis juga berhasil diisolasi dari sumber air panas di Himalaya timur. Dalam penelitiannya, Alam melakukan identifikasi fenotip, genotip serta perbandingan proteoma terhadap beberapa isolat bakteri termofilik yang diduga merupakan Bacillus anthracis. Berdasarkan pendekatan tersebut, diketahui isolat bakteri termofilik teridentifikasi tidak menunjukkan karakteristik Bacillus anthracis, melainkan

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11] [12] [13] [14]

[15] [16] [17] [18]

Christina, Dessy.”Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara”. Jurusan Biologi Universitas Sumatera Utara. Medan. 2008. Indrajaya, Madayanti F., dan Akhmaloka. “Isolasi dan Identifikasi Mikroorganisme Termofil Isolat Kawah Wayang”. Jurnal Mikrobiologi Indonesia . 2003. 8, 67-71. Dirnawan , H.A, Suwanto., Purwadaria T., “Eksplorasi Bakteri Termofil Penghasil Enzim Hidrolitik-Ekstraseluler dari Sumber Air Panas Gunung Pancar”. Hayati, 2000. 7,52-57. Muharni. “Isolasi dan Identifikasi Bakteri penghasil Kitinase dari Sumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan”. Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Utara. 2010 Asnawi, Hafid., “Keanekaragaman Bakteri Termofilik yang Terdapat Dalam Sumber Mata Air Panas di Taman Wisata Padusan Pacet, Kabupaten Mojokerto, Jawa Timur”. Jurusan Biologi FMIPA, UM, Malang. 2006. Madigan, M.T. Martinko, J.M. Parker, J. ”Brock Biology of Microorganisms”, Prentice-Hall International (UK) Limited, London. 1998. Tayyab, Muhammad . “Isolation and identification of lipase producing thermophilic Geobacillus sp. SBS-4S:Cloning and characterization of the lipase “. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2010. Vol. 111 No. 3, 272–278. Ghosh.”Production of Lipase and Phospholipase Enzymes from Pseudomonas sp and Their Action on Phospholipids.” Journal of Oleo Science.2005.Vol 54, No 7, 407-411. Ibrahim, “Isolation and Identification of New Cellulases Producing Thermophilic Bacteria from an Egyptian Hot Spring and Some Properties of the Crude Enzym”, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2007. 473-478. Buditianingsih, Karina. “Isolasi Bakteri Termofilik dari Sumber Air Panas di Songgoriti ,”.Jurusan Kimia FMIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember , Surabaya. 2011. Ochman, H. “Genomes on The Shrink.” Proc.Natl.Acad.Sci USA. 2005. 102.11959 – 11960. Acinas S.G., Marcelino L., Klepac-Ceraj V. POLZ M.F., J. Bacteriol., 2004. 186. 2629 - 2635. Oren A.The Royal Society.2004.359. 623-638 Demerdash, Hassan A,M,El.,”A Simple and Inexpensive Procedure for Chromosomal DNA Extraction from Streptococcus thermophilus Strains”. Middle-East Journal of Scientific Research . 2012.11 ,1,13-18 Faatih, Mukhlissul.”Isolasi dan Digesti DNA Kromosom.” Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. 2009. 10.1. 61 – 67. Anam, Khoirul.“DNA Sekolah Pascasarjana Rekombinasi”. Bioteknologi,Institut Pertanian Bogor. 2009. Noer, A. Saifuddin ., Gustiananda, Marcia. “PCR Tanpa Isolasi DNA dari Sel Epitel Rongga Mulut”. JMS. 1997. 2. 1. 35 – 45. Alam, SI., Bansod,S., Goel, AK., Singh, L. “Characterization of an environmental strain of Bacillus thuringiensis from a hot spring in Western Himalayas.”, . 2010. 62(2). 547-56.

JURNAL TEKNIK POMITS Vol. 1, No. 1, (2012) 1-6

5