KLONING GEN PDI-LIKE DARI BAKTERI TERMOFILIK Bacillus acidocaldgrius Ry,
TESIS F
Oleh: RISA NOFIANI
BIDANG KI USUS BIOKEMA PROGRAM PASCASARJANA KIMIA PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2002
BIDANG KHUSUS BIOKIMIA PROGRAM PASCASARJANA KIMIA PROGRAM PASCASARJANA INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2002
; Dr. Muliawati Sindumarta)
(Dessy Natalia, Ph.D)
ABSTRAK
Ikatan disulfida dibutuhkan untuk stabilitas struktur dan fungsi beberapa protein. Pada organisme prokariot, enzim yang berperan dalam mengkatalisis pembentukan ikatan disulfida adalah PDI (protein disulfida isomerase). Pada organisme prokariot juga ditemukan enzim yang mempunyai aktivitas mirip dengan PDI (PDI-like). Penelitian ini bertujuan untuk membuat perpustakaan genom B. acidocaldarius RP1. Selanjutnya perpustakaan genom yang diperoleh digunakan untuk memperoleh gen PDI-like. Perpustakaan genom yang diperoleh mengandung sekitar 2,5 x 10 3 sampai 3,0 x 104
sel transforman.
Penapisan gen PDI-like yang digunakan berdasarkan pada sistem komplementasi yaitu kemampuan gen PDI-like dari B. acidocaldarius RP1 untuk menggantikan fungsi dsbA pada E. coli HK229 yang telah diinaktivasi. Tiga puluh sel transforman yang diduga mengandung gen PDI-like diperoleh dari hasil transformasi E. coli HK229 (dsbA::Kan).
Hasil analisis restriksi beberapa DNA plasmid menunjukkan variasi ukuran fragmen DNA sisipan yaitu sekitar 0,35 sampai 1,75 kb. Hasil analisis
kesamaan menunjukkan tiga DNA plasmid rekombinan
mempunyai kesamaan tertinggi dengan promotor gen superoksida dismutase dari Bacillus termoleovarans dan beberapa urutan nukleotida dari genomik bakteri genus Bacillus.
ABSTRACT Disulfide bonds is needed in the stabilization of proteins structure and proteins functions. The formation of disulfide bonds in eucaryotes is catalysed by protein disulfide. isomerase (PDI). Procaryotes organisms also contain PDI-like enzymes, such as Dsb (disulfide bond) from Escherichia coli and Bdb (Bacillus disulfide bond) from Bacillus brevis
and Bacillus subtilis. The aim of this research is to construct a genomic library of Bacillus acidocaldarius RP1 and to fish out a gene encoding PDI-like from the library. The resulted genomic library contained about
2,5 x 103 to 3,0 x 104 independent recombinants. The PDI-like gene was screened based on the ability of the recombinant plasmid to complement the DsbA activity of E. coli HK229 (dsbA::Kan). There were about 30 groups of E. coli HK229 (dsbA::Kan) with recombinant plasmid which restored the DsbA activity. Restriction analysis of several recombinant plasmids showed that the recombinant plasmid had insert in a range of 0,35 kb to 1,75 kb. Nucleotide sequence analysis of three different recombinant plasmids indicated that the DNA fragments had a highest similarity with a promoter of superoxide dismutase gene from B. termoleovarans and nucleotide sequence of Bacillus genomic.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 1.
Perpustakaan genom B. acidocaldarius RP1 di E. coli DH5a mengandung 2,5 x 10 3 sampai 3,0 x 10 4 sel transforman.
2.
Sebanyak
30
kelompok sel transforman yang diduga
mengandung gen PDI-like diperoleh dari perpustakaan genom B. acidocaldarius RP I. 3.
Analisis restriksi beberapa DNA plasmid kelompok sel transforman menunjukkan ukuran fragmen DNA sisipan sekitar 0,35 kb sampai 1,75 kb.
4.
Analisis kesamaan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan RNl dengan metode tblastx dan blastn menunjukkan kesamaan tertinggi dismutase dari B.
5.
dengan
promotor
gen
superoksida
termoleovarans
Anafisis kesamaan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan RN9 dan RN10 dengan metode tblastx menunjukkan kesamaan dengan beberapa urutan nukleotida genom bakteri genus Bacillus.
5.2 Saran Untuk memperoleh gen PDI-like dari perpustakaan genom Bacillus acidocaldarius RP1 maka perlu dilakukan seleksi lebih lanjut 30 kelompok sel transforman yang diduga mengandung gen PDI-like. Seleksi 30 kelompok sel transforman diawali dengan mencari koloni
tunggal yang diduga membawa gen PDI-like dan diikuti dengan melakukan penentuan aktivitas fosfatase alkalis. Penentuan aktivitas fosfatase alkalis bertujuan untuk menghindari perbaikan kerusakan perakitan flagela tetapi tidak diikuti perbaikan pembentukan ikatan disulfida diperiplasma.
Fosfatase alkalis mengandung dua ikatan
disulfida. Koloni yang memiliki aktivitas fosfatase alkalis yang paling tinggi digunakan untuk penentuan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan.
