PRODUKSI, PEMURNIAN PARSIAL, DAN KARAKTERISASI L-ASPARAGINASE DARI BAKTERI TERMOFILIK Bacillus licheniformis STRAIN HSA3-1a
PRODUCTION, PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF L-ASPARAGINASE FROM THE THERMOPHILIC BACTERIA Bacillus licheniformis STRAIN HSA3-1a
Abdul Muis Patta1, Ahyar Ahmad2 dan Hasnah Natsir3
1
Mahasiswa Program Magister Kimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar 2Biokimia dan Bioorganik, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar 3 Biokimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar
Alamat Korespondensi: Abdul Muis Patta Jl. Tamalate 3 Stapak 51 No. 2 Perumnas Makassar, 90222 HP : 081342993996 Email :
[email protected]
Abstrak L-Asparaginase memberikan manfaat yang besar pada terapi kanker terutama pada leukemia limfoblastik akut. L-Asparaginase juga terbukti dapat menurunkan kandungan akrilamida di dalam makanan. Banyak penelitian dilakukan untuk menelusuri sumber potensial produksi L-Asparaginase dari bakteri termofilik untuk memperoleh L-Asparaginase dengan aktivitas dan stabilitas yang tinggi. Tujuan penelitian adalah melakukan isolasi, pemurnian, dan karakterisasi L-Asparaginase yang diproduksi dari Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a. Penelitian ini diawali dengan menguji B. licheniformis HSA3-1a dalam medium skrining produksi L-Asparaginase. L-Asparaginase yang telah diisolasi dan dimurnikan lalu dilakukan uji aktivitas dan karakterisasi. Aktivitas L-Asparaginase ditentukan secara kolorimetri dengan mengukur jumlah amoniak yang dihasilkan dari katalisis asparaginase menggunakan reagen Nessler. Satu unit L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis pembentukan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler secara maksimum pada konsentrasi asam amino L-Asparagin 2% dalam medium fermentasi dan waktu inkubasi 48 jam. L-Asparaginase memiliki aktivitas yang optimum pada pH 8 suhu 50oC dengan aktivitas spesifik 616,26 IU/mg protein serta stabil pada suhu dan pH optimum selama 60 menit. Kata Kunci : L-Asparaginase, Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a, aktivitas spesifik
Abstract L-Asparaginase gives a great benefit in the cancer treatment, especially in acute lymphoblastic leukemia. L-Asparaginase is also proven to reduce the acrylamide content in the foods. The objective of this study was to perform the isolation, purification, and characterization L-Asparaginase produced from Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a. This study begins by examining B. licheniformis HSA3-1a in the medium screening L-Asparaginase production. L-asparaginase that has been isolated and purified and then tested the activity and characterization. L-Asparaginase activity is determined by the colorimetric method by measuring the amount of ammonia produced from L-Asparaginase catalysis using Nessler reagent. One unit of L-Asparaginase (IU) is defined as the amount of the L-Asparaginase enzyme that catalyzes the release of one μmol of ammonia per minute at the essay conditions. The results showed that B. licheniformis HSA3-1a can produce maximum extracellular L-Asparaginase enzyme with 2% L-Asparagine concentration in fermentation medium and 48 hours incubation. L-Asparaginase has optimum activity at pH 8 and 50oC temperature with a specific activity of 616.26 IU/mg protein. and stabilized at the optimum temperature and pH for 60 minutes. Keywords
: L-Asparaginase, Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a, specific activity
PENDAHULUAN L-Asparaginase memberikan manfaat yang besar pada terapi kanker, terutama pada leukemia limfoblastik akut. Pemberian L-Asparaginase pada sel kanker dapat menguraikan L-Asparagin sebagai salah satu komponen nutrisi sel kanker, sehingga dapat menghambat pertumbuhan sel tersebut (E-Moharam dkk., 2010). L-Asparaginase juga
terbukti
dapat
menurunkan
kandungan
akrilamida
di
dalam
makanan.
L-Asparaginase dapat mencegah pembentukan akrilamida dengan mengkonversi asam amino L-Asparagin sebagai prekursornya menjadi bentuk asam amino lain yaitu asam aspartat yang umum terdapat dalam makanan (Antara, 2009). L-Asparaginase dapat dijumpai pada banyak jaringan hewan, bakteri, tanaman, dan dalam serum tikus, namun tidak pada manusia. L-Asparaginase dihasilkan dengan jumlah yang besar oleh beberapa mikroorganisme; E. coli, Erwinia cartova, Enterobacter aerogenes, Corynebacterium glutamicum, Candida utilities, Bacillus sp, dan Pisum sativum (El-Bessoumy dkk., 2004; E-Moharam dkk., 2010). Produksi enzim dari bakteri termofilik semakin digemari untuk ditelaah lebih jauh karena bakteri termofilik dapat menghasilkan enzim yang memiliki stabilitas pada suhu tinggi. Bakteri termofil sering ditemukan pada lingkungan ekstrim sumber air panas suhu 60–80oC antara lain Thermus, Bacillus, Clostridium, Thermoanaerabacter, dan Desulfomaculum (Tika dkk., 2007; Ahmed dkk., 2007). Bakteri Bacillus sp dapat digunakan dalam produksi enzim L-Asparaginase telah dipublikasikan oleh E-Moharam dkk., (2010). Salah satu Bakteri termofil yang diisolasi dari sumber air panas di Sulawesi Selatan adalah Bacillus licheniformis (Natsir dkk., 2010). Penelitian ini bertujuan menguji kemampuan B. licheniformis HSA3-1a memproduksi L-Asparaginase, menentukan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a untuk memperoleh aktivitas L-Asparaginase maksimum dan mengkarakterisasi L-Asparaginase dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a. BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Penelitian Penelitian ini menggunakan beberapa bahan yaitu; B. licheniformis HSA3-1a diperoleh dari Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin Makassar yeast ekstrak, pepton, NaCl, L-Asparagin p.a, KH2PO4 p.a, MgSO4.7H2O p.a,
CaCl2.2H2O, bakto agar, indikator fenol merah, (NH4)2SO4 p.a, NH4Cl, kantung selofan, tris(hidroksimetil)-aminometan p.a, bovine serum albumin, KI, MgCl2 p.a , NaOHp.a, folin-ciocalteus, Na2CO3, CuSO4.5H2O, natrium kalium tartart, trikloroasetat, karbon aktif, kertas saring, akuades, dan akuabides. Peralatan penelitian ini adalah spektrofotomer serapan UV-Vis (Spectronic 20D), neraca digital analitik, sentripuge dingin, shaker inkubator, inkubator (Memmert), autoclave (All American Model No. 1925X), cawan petri, tabung reaksi, ose, pipet mikro, dan alat gelas lainnya yang umum di laboratorium. Desain Penelitian dan Metode Pengumpulan Data Penelitian ini diawali dengan pengujian kemampuan B. licheniformis HSA3-1a memproduksi L-Asparaginase dalam medium pertumbuhan menggunakan indikator fenol merah. Kemudian ditentukan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a untuk memperoleh aktivitas L-Asparaginase maksimum. L-Asparaginase yang diproduksi kemudian diisolasi, pemurnian parsial dan dikarakterisasi terhadap pengaruh pH, suhu, dan waktu pre inkubasi terhadap stabilitas L-Asparaginase. Pengumpulan data penelitian berdasarkan metode kuantitatif eksperimental laboratorium. Pemurnian Bakteri Bacillus licheniformis Peremajaan dilakukan dengan menumbuhkan stok bakteri B. licheniformis koleksi Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Hasanuddin Makassar ke dalam medium plate pertumbuhan. Koloni yang tumbuh kemudian dibiakkan dalam medium skrining produksi
L-Asparaginase. Komponen Medium yaitu Yeast Ekstrak
0,05%, Pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%, L-Asparagin 1,0%, CaCl2 0,01% Amonium Sulfat 0,7%, Bakto Agar 1,5% dan Indikator Fenol Merah 0.005%. Larutan stok fenol merah dibuat 2,5% dalam etanol pH 7 kemudian disaring dengan kertas saring selulosa 0,2 µm lalu ditambahkan ke dalam medium. L-Asparagin digunakan sebagai sumber nitrogen. Bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 50oC. Produksi L-Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan amoniak sehingga meningkatkan pH medium pembiakan. Perubahan pH membentuk warna pink disekitar koloni yang memproduksi L-Asparaginase. Koloni yang tumbuh kemudian diisolasi, dimurnikan, dan dibiakkan dalam medium kultur produksi L-Asparaginase (Gulati dkk., 1997; Moorthy dkk., 2010; Ghasemi dkk., 2008; Natsir dkk., 2010).
Penentuan Konsentrasi Substrat L-Asparagin dan Waktu Inkubasi Optimum Produksi L-Asparaginase Penentuan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi L-Asparaginase dilakukan dengan menginokulasi koloni B. licheniformis HSA3-1a ke dalam medium cair produksi enzim L-Asparaginase dengan variasi konsentrasi asam amino L-Asparagin 0.75%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% terhadap volume medium. Kemudian diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 50oC. Setiap 24 jam dilakukan sampling untuk mengukur aktivitas L-Asparaginase tiap variasi konsentrasi substrat L-Asparagin. Produksi L-Asparaginase Produksi L-Asparaginase dilakukan dengan membiakkan isolat ke dalam 45 mL medium produksi dalam labu Erlenmeyer 250 mL. Erlenmeyer diinkubasi pada suhu 50oC dalam inkubator berpenggoyang selama 24 jam 200 rpm. Kemudian 45 mL inokulum dicampurkan dengan medium produksi steril 500 mL lalu diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 50oC. Komposisi medium produksi yaitu; Yeast Ekstrak 0,05%, Pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%, L-Asparagin 2,0%, CaCl2 0,01% Amonium Sulfat 0,7%. (Gulati dkk., 1997; Moorthy dkk., 2010; Ghasemi dkk., 2008; Natsir dkk., 2010).. Isolasi dan Pemurnian L-Asparaginase Cairan medium hasil kultur sel dipisahkan dari massa sel dengan cara penyaringan. Filtrat yang mengandung enzim selanjutnya ditambahkan amonium sulfat sedikit demi sedikit sambil diaduk berdasarkan tingkat kejenuhan amonium sulfat (0-20%, 20-40%, 40-60%, dan 60-80% setelah didiamkan semalam. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada 10000 rpm selama 30 menit suhu 4oC. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam masing-masing 10 mL buffer Tris-HCl pH 8. Larutan enzim hasil fraksinasi ammonium sulfat dimasukkan ke dalam kantung selofan kemudian dicelupkan ke dalam suatu bejana yang berisi akuades secukupnya. Bejana dialisis ditempatkan di atas pengaduk magnet yang dipasang dengan kecepatan rendah. Dialisis dilakukan selama 48 jam dengan cara mengganti larutan beberapa kali dengan larutan buffer tris-HCl pH 8 hingga menunjukkan tidak ada lagi amoniak dalam larutan buffer hasil dialisis. Pengujian dilakukan pereaksi Nessler yang akan bereaksi membentuk warna coklat jika terdapat amoniak dalam larutan buffer.
Penentuan Kadar Protein Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode termodifikasi Lowry, dengan menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin. Uji Aktivitas Enzim L-Asparaginase Aktivitas L-Asparaginase ditentukan secara kolorimetri berdasarkan metode Wriston dkk. (1973) pada suhu 50oC menggunakan spektrofotometer UV-Visible dengan mengukur jumlah amoniak yang dihasilkan dari katalisis L-asparaginase menggunakan reagen nessler. Campuran reaksi terdiri atas 0,1 mL enzim, 0,2 mL buffer Tris-HCl 0,05 M pH 8,6 dan 1,7 mL L-Asparagin 0,01 M diinkubasi pada suhu optimum selama 10 menit. Reaksi dihentikan oleh penambahan 0,5 mL larutan trikloroasetat 1,5 M. Setelah sentrifugasi 10.000 rpm, 0,5 mL supernatan diencerkan dengan 8,5 mL akuabides kemudian ditambahkan 1 mL reagen Nessler. Amonia yang dilepaskan oleh hidrolisis enzim L-Asparaginase bereaksi dengan reagen Nessler. Lalu ditentukan kadarnya menggunakan standar ammonium klorida. 1 unit L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis pelepasan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian. Karakterisasi Pengaruh pH terhadap aktivitas Enzim L-Asparaginase Aktivitas L-Asparaginase dievaluasi pada pH yang beragam. Enzim bebas dan teramobilisasi masing-masing diinkubasi pada buffer 0,05 M dari pH 6-10. Pada setiap kondisi, jumlah ammonia yang dilepaskan masing-masing diukur. Buffer yang digunakan adalah kalium fosfat (pH 6,0-7,0). Tris HCl (pH 8,0-9,0) dan Glisin-NaOH (pH 10-11). Karakteriasasi Pengaruh temperatur terhadap aktivitas Enzim L-Asparaginase Aktivitas L-Asparaginase dievaluasi pada temperatur yang beragam pada pH optimum. Enzim bebas dan teramobilisasi masing-masing diinkubasi pada temperatur antara 37oC, 40-70oC dengan interval 10oC. Karakterisasi Penentuan Stabilitas L-Asparaginase terhadap pH dan Suhu Stabilitas pH dan suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase ditentukan dengan melakukan pre inkubasi enzim dan buffer pada pH optimum. Pre inkubasi dilakukan selama 2 jam dan diuji aktivitas L-Asparaginase setiap selang 30 menit pada suhu optimum (E-Moharam dkk., 2010 dan Natsir dkk., 2010).
Analisis Data Aktivitas Enzim (IU/mL) Dimana : y a b V. Total V. Analisis V. Enzim T. Inkubasi
=
= = = = = = =
Aktivitas Spesifik
=
Aktivitas Relatif
=
(
)
.
.
(1)
.
Absorbansi slope Intersept Volume enzim + substrat + buffer + TCA (2,5 mL) Volume total yang dianalisis (0,5 mL) Volume enzim yang dianalisis (0,1 mL) 10 menit
Aktivitas Enzim (IU) Kadar Protein (mg/mL)
(2)
Aktivitas L-Asparaginase Inkubasi “x” menit -------------------------------------------------------- x 100 % Aktivitas L-Asparaginase Inkubasi 0 menit
(3)
HASIL Pemurnian dan Skrining B. licheniformis untuk Produksi L-Asparaginase B.
licheniformis
yang
dibiakkan
dalam
medium
skrining
produksi
L-Asparaginase menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi enzim L-Asparaginase ekstraseluler ditandai oleh pembentukan warna pink di sekitar koloni yang memproduksi L-Asparaginase. Penentuan Konsentrasi Substrat L-Asparagin dan Waktu Inkubasi Optimum Produksi L-Asparaginase Aktivitas tertinggi L-Asparaginase 31.51 IU/mL pada konsentrasi substrat asam amino L-Asparagin dalam medium fermentasi adalah 2,0% dengan waktu inkubasi 48 jam seperti yang tampak pada Gambar 1. Penetapan Kadar Protein Tiap Fraksi Pengendapan Amonium Sulfat Pengukuran kadar protein tiap fraksi tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-20%, 20-40%, 40-60%, dan 60-80% masing-masing secara berurutan adalah; 0.0110 mg/mL, 0.075 mg/mL, 0.0070 mg/mL, dan 0.1140 mg/mL sedangkan kadar protein ekstrak kasar adalah 0.027 mg/mL.
Penentuan Aktivitas L-Asparaginase Tiap Fraksi Pengendapan Tiap fraksi pengendapan setelah dialisis ditentukan aktivitasnya. Aktivitas tertinggi L-Asparaginase tiap fraksi pengendapan amonium sulfat setelah dialisis berada pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 20-40% memiliki aktivitas 42,95 IU/mL seperti tampak pada Gambar 2. Karakterisasi pengaruh pH terhadap aktivitas L-Asparaginase Gambar 3 menunjukkan bahwa aktivitas L-Asparaginase meningkat seiring dengan peningkatan pH hingga optimum pada pH 8. Aktivitas spesifik L-Asparaginase pada pH 6 adalah 345.8 IU/mg protein kemudian 506.64 IU/mg pada pH 7 dan optimum pada pH 8 dengan aktivitas spesifik 543.19 IU/mg protein yang selanjutnya menurun pada pH 9 dan 10. Karakterisasi Pengaruh suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase Gambar 4 menunjukkan aktivitas
L-Asparaginase berbanding lurus dengan
meningkatnya suhu dari 30oC hingga optimum pada suhu 50oC yang kemudian menurun pada suhu 60oC dan 70oC. Aktivitas spesifik L-Asparaginase pada suhu optimumnya yakni 50oC adalah 616.26 IU/mg protein. Karakterisasi Stabilitas L-Asparaginase terhadap pH dan suhu Gambar 5 menunjukkan kestablilan L-Asparaginase terhadap pre inkubasi pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50oC) dapat stabil hingga 60 menit dengan aktivitas relatif hingga 82.9%. Aktivitas relatifnya kemudian terus menurun pada pre inkubasi 90 menit dan 120 menit secara berurutan yaitu 59,9% dan 45,32%. PEMBAHASAN B. licheniformis
dibiakkan dalam medium skrining produksi L-Asparaginase
menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler. Hal ini ditunjukkan oleh terjadinya perubahan warna medium yang mengandung indikator fenol merah dari coklat menjadi pink. Pembentukan warna pink menunjukkan terbentuknya amoniak sebagai hasil hidrolisis subtrat L-Asparagin menjadi asam aspartat dan melepaskan molekul amoniak. Amoniak yang bersifat basa akan merubah pH medium menjadi basa sehingga terjadi perubahan warna medium dari coklat menjadi pink (Gashemi dkk., 2008). Produksi enzim oleh bakteri secara maksimum dipengaruhi oleh substrat sebagai komponen medium pertumbuhan pada konsentrasi dan waktu inkubasi tertentu.
Penentuan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi L-Asparaginase dilakukan dengan menumbuhkan B. licheniformis dalam medium cair produksi L-Asparaginase dengan variasi konsentrasi substrat asam amino L-Asparagin 0.75%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% terhadap volume medium. Waktu inkubasi optimum ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas L-Asparaginase setiap 24 jam waktu inkubasi. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas tertinggi L-Asparaginase 31.51 IU/mL pada konsentrasi substrat L-Asparagin dalam medium fermentasi adalah 2,0% dengan waktu inkubasi 48 jam. Tiap fraksi pengendapan amonium sulfat setelah dialisis, diukur kadar proteinnya dan dibandingkan dengan kadar protein ekstrak kasar. Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry. Protein yang terkandung dalam tiap fraksi akan bereaksi dengan molekul komponen reagen Lowry membentuk larutan berwarna biru. Kadar protein dihitung berdasarkan nilai absorbansi yang sebanding dengan kadar protein pada panjang gelombang optimum (680 nm) terhadap kurva standar bovine serum albumin. Hasil pengukuran kadar protein tiap fraksi tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-20%, 20-40%, 40-60%, dan 60-80% masing-masing secara berurutan adalah; 0.0110 mg/mL, 0.075 mg/mL, 0.0070 mg/mL, dan 0.1140 mg/mL sedangkan kadar protein ekstrak kasar adalah 0.027 mg/mL. Aktivitas L-Asparaginase ditentukan dengan metode Nessler. Banyaknya amoniak yang dihasilkan dari katalisis substrat asam amino L-Asparagin oleh enzim L-Asparaginase dinyatakan sebagai aktivitasnya (Siddalingeshwara dkk., 2011). Amonia yang dilepaskan oleh hidrolisis enzim L-Asparaginase bereaksi dengan reagen Nessler. Lalu ditentukan kadarnya menggunakan standar ammonium klorida. Satu unit L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis pembentukan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian (Basha dkk., 2009). Tiap fraksi pengendapan setelah dialisis ditentukan aktivitasnya. Aktivitas L-Asparaginase tertinggi berada pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 20-40% memiliki aktivitas 42,95 IU/mL. Beberapa karakteristik enzim L-Asparaginase dalam bentuk bebas dan teramobilisasi yang dipelajari dalam penelitian ini antara lain : pengaruh pH, suhu, stabilitas pH dan stabilitas suhu enzim L-Asparaginase.
Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH enzim pada saat gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingat ionisasi yang diinginkan. Aktivitas L-Asparaginase meningkat seiring dengan peningkatan pH hingga optimum pada pH 8 dengan aktivitas spesifik 543.19 IU/mg protein. Reaksi kimia termasuk reaksi katalisis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Disamping itu, karena enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi yang merusak sisi aktif enzim dan menurunkan
aktivitasnya.
Aktivitas
L-Asparaginase
o
berbanding
lurus
dengan
o
meningkatnya suhu dari 30 C hingga optimum pada suhu 50 C dengan aktivitas spesifik 616.26 IU/mg protein. Kestabilan enzim terhadap pH dan suhu adalah kemampuan enzim menjaga konformasinya, sehingga sisi aktif enzim sesuai dengan substrat dan mampu mempertahankan aktivitasnya pada kondisi tertentu. Kestablilan L-Asparaginase terhadap pre inkubasi pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50oC) pada pre inkubasi hingga 60 menit memiliki aktivitas relatif hingga 82.9%. Aktivitas relatifnya kemudian terus menurun pada pre inkubasi 90 menit dan 120 menit secara berurutan yaitu 59,9% dan 45,32%. Hal ini menunjukkan bahwa L-Asparaginase dapat mempertahankan sisi aktif enzim dan masih dapat bekerja dengan baik meskipun telah dilakukan penyimpanan selama 1 jam pada suhu optimumnya KESIMPULAN DAN SARAN B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler secara maksimum pada konsentrasi asam amino L-Asparagin 2% dalam medium fermentasi dan waktu inkubasi 48 jam. L-Asparaginase memiliki aktivitas yang optimum pada pH 8 suhu 50oC dengan aktivitas spesifik 616,26 IU/mg protein serta stabil pada suhu dan pH optimum selama 60 menit. Pengembangan hasil penelitian ini penulis sarankan untuk melakukan penelitian lanjutan tentang optimasi produksi L-Asparaginase dari bakteri
B. licheniformis dan pembuatan enzim amobil L-Asparaginase yang
menggunakan berbagai jenis karier pengamobilisasi.
DAFTAR PUSTAKA Ahmed, S.A., Shireen, A.S., dan Abdel-Fattah, A.F., (2007), Stabilization of Bacillus Licheniformis ATCC 21415 Alkaline Protease by Immobilization and Modification, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 1(3) 313-322. Antara, N.S., (2009), Mengurangi Pembentukan Akrilamida dengan Menggunakan Enzim dan Mikroba pada Produk Pangan, FTP, UNUD. Basha, N.S., Rekha, R., Komala, M., dan Ruby, S., (2009), Production of Extracellular Anti-Lukaeia Enzyme L-asparaginase from Marine Actinomycetes by Solid-State and Submerged Fermentation : Purification and Characterization, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8(4) 353-360. El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., dan Mansour, J., (2004), Pruduction, Isolaton, and Purification of L-Asparaginase from Pseudomonas Aeruginosa 50071 Using Solid-state Fermentation, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 4(37) 387-393. E-Moharam, M., Gamal-Eldeen, A.M., dan El-Sayed, S.T., (2010), Production, Immobilization and Anti-Tumor Activity of L-Asparaginase of Bacillus sp R36, Journal of American Science, 6(8) 157-165. Ghasemi, Y., Ebrahimi, A., Rasoul-Amini, S., Zarrini, G., dan Ghoshoon, MB., (2008), An Optimized Medium for Screening of L-Asparaginase Production by Escherichia coli, American Journal of Biochemistry an Biotechnology, 4(4) 422424. Gulati R., Saxena, R.K., dan Gupta, R., (1997), A Rapid Plate Assay for Screening LAsparaginase, Producing Microorganisms, Lett. Appl Microbiol, 24, 23-26. Moorthy, V., Ramalingam, A., Sumantha, A., dan Shankaranaya, R.T., (2010), Production, Purification, and Characterisation of Extacellular L-Asparaginase from a Soil isolate of Bacillus sp., African Journal of Microbiology Research, 4(18) 1862-1867. Natsir, H., Patong, A.R., Suhartono, M.T., dan Ahmad, A., (2010), Production and Characterization of Chitinase Enzymes from Sulili Hot Spring in South Sulawesi, Bacillus sp. HSA3-1a, Indo.J.Chem., 10(2) 263 - 267. Siddalingeshwara, dan Lingappa, (2011), Production and Characterization of L-Asparaginase–A Tumour inhibitor, International Journal PharmTech Research, 1(3) 314-319. Tika I.N., Redhana, I.W., dan Ristiati, N.P., (2007), Isolasi Enzim Lipase Termostabil dari bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang Kecamatan Gerobak, Buleleng Bali, Akta Kimia Indonesia, (2), 2, 109-112. Wriston, J.C, dan Yellin, (1970), Asparaginase, Method Enzymol, 16, 732-742.
Aktivitas L-Asparaginase (IU/mL)
Gambar 1. Aktivitas L-Asparaginase Asparaginase tiap variasi konsentrasi substrat asam amino L-asparagin dalam medium
50
42.95 24.28
12.83
22.47
19.46
0 Ekstrak Kasar
F.0-20 %
F.20-40 %
F.40-60 %
F.60-80%
Ekstrak Kasar dan Fraksi Tiap Kejenuhan Amonium Sulfat (%)
Gambar 2. Aktivitas L-Asparaginase Asparaginase tiap fraksi pengendapan kejenuhan amonium sulfat setelah dialisis
Aktivitas Spesifik (IU/mg Protein)
600
543.19
500 400 300 200 100 0 4
5
6
7
pH
8
9
10
11
Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas L-Asparaginase
Aktivitas Spesifik (IU/mg Protein)
700 616.26
600 500 400 300 200 100 0 20
30
40
50
60
70
80
Suhu (°C)
Gambar 4. Pengaruh suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase
Aktivitas Relatif (%)
120 100
100
95.14
80 82.99
60
59.9
40
45.32
20 0 0
Gambar 5.
30 60 90 120 Waktu Pre Inkubasi L-Asparaginase (Menit)
150
Pengaruh waktu pre inkubasi terhadap stabilitas L-Asparaginase pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50°C)
